BR112013015797B1 - Organismo microbiano e método de produzir um derivado de acil-coa graxo - Google Patents

Abstract

ORGANISMO MICROBIANO E MÉTODO DE PRODUZIR UM DERIVADO DE ACIL-CoA GRAXO Esta invenção fornece organismos microbianos, particularmente leveduras tal como Yarrowia lipolytica , que apresentam um ou mais genes interrompidos. A(s) interrupção(s) do gene pode(m) render uma melhor produção de derivados de acil-CoA graxo.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do pedido provisório U.S. 61/427.032, depositado em 23 de dezembro de 2010, e do pedido provisório U.S. 61/502.697, depositado em 29 de junho de 2011, cujo conteúdo total é aqui incorporado pela referência. REFERÊNCIA A UMA “LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS”, UMA TABELA, OU UM APÊNDICE DE LISTAGEM DE PROGRAMA DE COMPUTADOR SUBMETIDO COMO UM ARQUIVO DE TEXTO ASCII.

[002] A listagem de sequências escrita no arquivo 90834- 824523_ST25.TXT, criada em 19 de dezembro de 2011, 188.336 bytes, formato de máquina IBM-PC, sistema operacional MS-Windows, é aqui incorporada pela referência na sua íntegra e com todos os propósitos.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] Esta invenção diz respeito aos organismos microbianos modificados que exibem melhores propriedades, especialmente melhor produção de derivados de acil-CoA graxo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004] Os organismos microbianos produzem acil-CoA graxo e derivados de acil-CoA graxo, tais como alcoóis graxos, ácidos graxos, aldeídos graxos, ésteres graxos, acetatos graxos, ésteres de cera, alcanos e alcenos. Tais derivados de acil-CoA graxo podem ser usados para produzir uma ampla variedade de produtos, incluindo combustíveis de aviação e diesel (por exemplo, biodiesel), agentes tensoativos químicos, polímeros, suplementos nutricionais, compostos farmacêuticos, aditivos alimentares, cosméticos e produtos de cuidado pessoal.

[005] Os ácidos graxos são um componente principal de membranas celulares e são usados por organismos para armazenamento de energia. Os ácidos graxos são metabolizados por e-oxidação de acil-CoA graxo, ou ao contrário, os ácidos graxos são sintetizados a partir de acetyl-CoA por complexos de multi-enzimas de ácido graxo sintase. Os alcoóis graxos são os produtos de redução de substratos de acil-tioéster graxo (por exemplo, acil- CoA graxo ou acil-ACP graxo), e assim como os ácidos graxos podem ser produzidos de maneira enzimática por células cultivadas. As enzimas que convertem os substratos de acil-tioéster graxo (por exemplo, acil-CoA graxo ou acil-ACP graxo) em alcoóis graxos são comumente referidas como “acil- CoA redutases que forma álcool graxo” ou “acil graxo redutases” (“FARs”).

[006] A produção comercial e recuperação de alcoóis graxos a partir de organismos microbianos é um desafio, em parte por que os alcoóis graxos não são muito estáveis em vários microrganismos. Os alcoóis graxos (por exemplo, hexadecanol) podem ser usados como uma fonte de carbono para o microrganismo e, assim, podem ser metabolizados pelo microrganismo antes da recuperação com propósitos comerciais. Os alcoóis graxos são provavelmente degradados por enzimas que catalisam a oxidação de alcanos em ácidos graxos (por meio de alcoóis graxos). Os ácidos graxos podem ser então adicionalmente degradados em acetyl-CoA por enzimas na via da β- oxidação, ou convertidos em lipídeos de armazenamento por um conjunto de acetiltransferases.

[007] Dessa maneira, existe uma necessidade de organismos microbianos para a produção eficiente de derivados de acil-CoA graxo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Esta invenção fornece organismos microbianos modificados que exibem melhores propriedades, incluindo melhor produção de derivados de acil-CoA graxo. Em alguns aspectos, os organismos microbianos modificados apresentam um gene interrompido que confere melhor produção de derivados de acil-CoA graxo, comparado a um organismo controle do mesmo tipo em que o gene não é interrompido. Em uma modalidade o organismo é Yarrowia lipolytica.

[009] Em um aspecto, a invenção diz respeito a um organismo microbiano em que um ou mais genes endógenos são interrompidos, em que o gene endógeno é YALI0C17545 ou um homólogo deste, e/ou YALI0E28336 ou um homólogo deste, e que compreende um gene exógeno que codifica uma proteína acil graxo redutase funcional (FAR) operavelmente ligado a um promotor. Em um outro aspecto, tanto o gene endógeno YALI0C17545 ou homólogo deste, quanto o gene endógeno YALI0E28336 ou homólogo deste são interrompidos. Em um outro aspecto, o organismo microbiano compreende adicionalmente uma interrupção de um ou mais de gene endógeno YALI0E11099 ou um homólogo deste, e gene endógeno YALI0E28534 ou um homólogo deste. Em um outro aspecto, tanto o gene endógeno YALI0E11099 ou homólogo deste, quanto o gene endógeno YALI0E28534 ou homólogo deste são interrompidos. Em um outro aspecto, o organismo microbiano compreende adicionalmente uma interrupção de um ou mais genes endógenos selecionados de YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, ALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0E18568, YALI0E22781, YALI0E25982, YALI0E28314, YALI0E32417, YALI0F01320, YALI0F06578, YALI0F07535, YALI0F14729, YALI0F22121, YALI0F25003, YALI0E14729, YALI0B17512, e homólogos destes. Em um outro aspecto, o gene endógeno YALI0B17512 é interrompido.

[0010] Em um outro aspecto, dois ou mais dos genes endógenos são interrompidos. Em um outro aspecto, três ou mais dos genes endógenos são interrompidos. Em um outro aspecto, quatro ou mais dos genes endógenos são interrompidos.

[0011] Em um outro aspecto, o organismo microbiano compreende: uma eliminação de toda ou uma porção da sequência codificante do gene endógeno, uma mutação no gene endógeno de maneira tal que o gene codifique um polipeptídeo com atividade reduzida, RNA antissenso ou RNA pequeno de interferência que inibe a expressão do gene endógeno, ou uma sequência regulatória modificada que reduz a expressão do gene endógeno. Em uma modalidade, o organismo microbiano compreende uma eliminação de toda ou uma porção da sequência codificante do gene endógeno.

[0012] Em um aspecto, o gene exógeno codifica uma proteína FAR funcional que compreende uma sequência de polipeptídeos com pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com uma proteína FAR de Marinobacter algicola que compreende SEQ ID NO:2. Em um outro aspecto, o gene exógeno codifica uma proteína FAR funcional que compreende uma sequência de polipeptídeos com pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com uma proteína FAR de Marinobacter aquaeolei que compreende SEQ ID NO:4. Em um outro aspecto, o gene exógeno codifica uma proteína FAR funcional que compreende uma sequência de polipeptídeos com pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com uma proteína FAR de Oceanobacter sp. RED65 que compreende SEQ ID NO:6. Em um aspecto, o gene exógeno inclui uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos 80 % de identidade de sequência, frequentemente pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de FAR_Maa (SEQ ID NO:1), FAR_Maq (SEQ ID NO:3), ou FAR_Ocs (SEQ ID NO:5). Em uma modalidade, a acil graxo redutase apresenta um gene com pelo menos 80 % de identidade de sequência, frequentemente pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de FAR_Maa (SEQ ID NO:1).

[0013] Em um aspecto, a proteína FAR funcional é um variante de FAR que compreende uma ou mais substituições de aminoácido relacionadas à SEQ ID NO:2, 4 ou 6, respectivamente, em que uma célula na qual o variante de FAR é expresso produz pelo menos 1,5 vez mais derivados de acil-CoA graxo do que uma célula correspondente do mesmo tipo, em que uma proteína FAR tipo selvagem é expressa, a partir da qual o variante de FAR é derivado. Em um outro aspecto, o gene exógeno de FAR codifica um variante de FAR que compreende de 1 a cerca de 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ou 40 substituições de aminoácido com relação a FAR_Maa (SEQ ID NO:2), FAR_Maq (SEQ ID NO:4), ou FAR_Ocs (SEQ ID NO:6). Em uma modalidade, o gene exógeno de FAR codifica um variante de FAR que compreende de 1 a cerca de 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ou 40 substituições de aminoácido com relação a FAR_Maa (SEQ ID NO:2).

[0014] Em um outro aspecto, o organismo microbiano apresenta múltiplas cópias do gene endógeno (por exemplo, um número diploide) e mais de uma cópia do gene endógeno é interrompido. Em um outro aspecto, o organismo microbiano expressa múltiplas cópias do gene exógeno. Em um outro aspecto, o gene exógeno é integrado no genoma do organismo microbiano.

[0015] Em um outro aspecto, o organismo microbiano compreende adicionalmente um segundo gene exógeno que codifica uma ácido graxo sintase (FAS), uma éster sintase, uma acil-ACP tioesterase (TE), uma acil- CoA graxo sintase (FACS), uma acetil-CoA carboxilase (ACC), uma xilose isomerase ou uma invertase.

[0016] Em um aspecto, o organismo microbiano é representado por algas, bactérias, mofo, fungo filamentoso ou levedura, tal como uma levedura oleaginosa. Em um aspecto, o organismo microbiano é uma levedura. Em um aspecto, a levedura é Yarrowia, Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Endomycopsis, Hansenula, Kluyveromyces, Lipomyces, Pachysolen, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon ou Trigonopsis. Em um aspecto, a levedura é uma levedura oleaginosa, tal como Yarrowia lipolytica, Yarrowia paralipolytica, Candida revkauji, Candida pulcherrima, Candida tropicalis, Candida utilis, Candida curvata D, Candida curvataR, Candida diddensiae, Candida boldinii, Rhodotorula glutinous, Rhodotorula graminis, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula minuta, Rhodotorula bacarum, Rhodosporidium toruloides, Cryptococcus (terricolus) albidus var. albidus, Cryptococcus laurentii, Trichosporon pullans, Trichosporon cutaneum, Trichosporon cutancum, Trichosporon pullulans, Lipomyces starkeyii, Lipomyces lipoferus, Lipomyces tetrasporus, Endomycopsis vernalis, Hansenula ciferri, Hansenula saturnus ou Trigonopsis variabilis. Em um aspecto, a levedura é Yarrowia lipolytica.

[0017] Em um outro aspecto, o organismo microbiano exibe pelo menos um aumento de 1 vez, pelo menos de 1,2 vez, pelo menos de 1,5 vez, pelo menos de 4 vezes, ou pelo menos de 20 vezes na produção de um derivado de acil-CoA graxo comparado a um organismo controle do mesmo tipo (por exemplo, um organismo microbiano controle de outra maneira idêntico, em que o um ou mais genes não são interrompidos).

[0018] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um organismo microbiano que compreende um ou mais genes endógenos interrompidos, em que pelo menos um dos genes interrompidos é YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, ALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0E18568, YALI0E22781, YALI0E25982, YALI0E28314, YALI0E32417, YALI0F01320, YALI0F06578, YALI0F07535, YALI0F14729, YALI0F22121, YALI0F25003, YALI0E14729, YALI0B17512, ou um homólogo de qualquer um destes, e um gene exógeno que codifica uma acil graxo redutase funcional operavelmente ligado a um promotor, em que o organismo microbiano exibe pelo menos um aumento de 1 vez, pelo menos de 1,2 vez, pelo menos de 1,5 vez, pelo menos de 4 vezes, ou pelo menos de 20 vezes na produção de um derivado de acil-CoA graxo comparado a um organismo controle do mesmo tipo (por exemplo, um organismo microbiano controle de outra maneira idêntico, em que o um ou mais genes não são interrompidos).

[0019] Ainda em um outro aspecto, pelo menos um dos genes endógenos interrompidos é YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E14729, YALI0B17512 ou um homólogo de qualquer um destes.

[0020] Em um aspecto, YALI0C17545 ou um homólogo deste é interrompido. Em um outro aspecto, YALI0E28336 ou um homólogo deste é interrompido. Ainda em um outro aspecto, tanto YALI0C17545 ou um homólogo deste, quanto YALI0E28336 ou um homólogo deste são interrompidos.

[0021] Ainda em um outro aspecto, o organismo microbiano compreende adicionalmente um segundo gene interrompido que é YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, ALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0E18568, YALI0E22781, YALI0E25982, YALI0E28314, YALI0E32417, YALI0F01320, YALI0F06578, YALI0F07535, YALI0F14729, YALI0F22121, YALI0F25003, YALI0E14729, YALI0B17512 ou um homólogo de qualquer um destes.

[0022] Em um aspecto, o organismo microbiano compreende dois genes endógenos interrompidos. Quando dois genes são interrompidos, YALI0C17545 ou um homólogo deste, e/ou YALI0E30283 ou um homólogo deste podem ser interrompidos. Em um outro aspecto, o organismo microbiano compreende três genes endógenos interrompidos. Ainda em um outro aspecto, o organismo microbiano compreende quatro ou mais genes endógenos interrompidos.

[0023] Em um outro aspecto, o organismo microbiano compreende uma combinação de genes endógenos interrompidos ou homólogos destes. A combinação pode ser: a. YALI0C17545 e YALI0E28336; b. YALI0C17545 e YALI0B10406; c. YALI0C17545 e YALI0E28534; d. YALI0C17545 e YALI0E30283; e. YALI0E28336 e YALI0E30283; f. YALI0E11099 e YALI0E30283; g. YALI0A19536 e YALI0E30283; h. YALI0A19536 e YALI0E28534; i. YALI0E30283 e YALI0E12463; j. YALI0B10406 e YALI0E14729; k. YALI0C17545 e YALI0E14729; l. YALI0E11099 e YALI0E14729; m. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E11099; n. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0B10406; o. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0A19536; p. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E28534; q. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E32769; r. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E12463; s. YALI0C17545, YALI0E11099 e YALI0B10406; t. YALI0C17545, YALI0B10406 e YALI0A19536; u. YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0B10406; v. YALI0E11099, YALI0B10406 e YALI0A19536; w. YALI0C17545, YALI0E28534 e YALI0B17512; x. YALI0E11099, YALI0A19536, YALI0B10406 e YALI0B17512; y. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0B10406; z. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0A19536; aa. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0E28534; bb. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0E32769; cc. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0B10406 e YALI0A19536; dd. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0B10406 e YALI0E32769; ee. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0A19536 e YALI0E28534; ff. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E28534 e YALI0E32769; gg. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E28534 e YALI0E12463; hh. YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406 e YALI0E32769; ou ii. YALI0E11099, YALI0E28336, YALI0C17545 e YALI0E14729.

[0024] Em um aspecto, uma célula de Yarrowia lipolytica compreende um ou mais genes endógenos interrompidos, em que pelo menos um gene interrompido é YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E14720, YALI0B17512, ou um homólogo de qualquer um destes, e um gene exógeno que codifica uma acil graxo redutase funcional operavelmente ligado a um promotor, em que a célula de Yarrowia lipolytica exibe pelo menos um aumento de 1 vez, pelo menos de 1,2 vez, pelo menos de 1,5 vez, pelo menos de 4 vezes, ou pelo menos de 20 vezes na produção de um derivado de acil-CoA graxo comparado a um organismo controle do mesmo tipo (por exemplo, um organismo microbiano controle de outra maneira idêntico, em que o um ou mais genes não são interrompidos). Em um aspecto, o gene exógeno inclui uma sequência de ácidos nucleicos com pelo menos 80 % de identidade de sequência, frequentemente pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos de FAR_Maa (SEQ ID NO:1), FAR_Maq (SEQ ID NO:3), ou FAR_Ocs (SEQ ID NO:5), ou codifica um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80 % de identidade de sequência, frequentemente pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com um polipeptídeo de FAR_Maa (SEQ ID NO:2), FAR_Maq (SEQ ID NO:4), ou FAR_Ocs (SEQ ID NO:6); ou codifica um variante de polipeptídeo FAR que compreende de 1 a cerca de 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ou 40 substituições de aminoácido com relação a FAR_Maa (SEQ ID NO:2), FAR_Maq (SEQ ID NO:4), ou FAR_Ocs (SEQ ID NO:6). Em uma modalidade, o gene exógeno de FAR codifica um variante de FAR que compreende de 1 a cerca de 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ou 40 substituições de aminoácido com relação a FAR_Maa (SEQ ID NO:2).

[0025] Em um outro aspecto, a invenção fornece um organismo microbiano em que um ou mais genes endógenos são interrompidos, em que o gene endógeno é selecionado de YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, ALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0E18568, YALI0E22781, YALI0E25982, YALI0E28314, YALI0E32417, YALI0F01320, YALI0F06578, YALI0F07535, YALI0F14729, YALI0F22121, YALI0F25003, YALI0E14729, YALI0B17512 e homólogos destes. Em um outro aspecto, o gene endógeno YALI0B17512, ou homólogo deste, é interrompido. Em um outro aspecto, YALI0B17512 codifica um polipeptídeo que compreende um domínio citoplasmático e a interrupção compreende uma eliminação de pelo menos uma porção do domínio citoplasmático. Em um outro aspecto, um ou mais do gene endógeno YALI0C17545, ou homólogo deste, e o gene endógeno YALI0E28336, ou homólogo deste, é interrompido.

[0026] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir um derivado de acil-CoA graxo que compreende fornecer um organismo microbiano da maneira aqui descrita; e cultivar o organismo microbiano em condições nas quais os derivados de acil-CoA graxo são produzidos. O método pode incluir adicionalmente recuperar (por exemplo, isolar) o derivado de acil-CoA graxo. Em um aspecto, pelo menos 5 g/L ou pelo menos 15 g/L de derivados de acil-CoA graxo por litro de meio de cultura são produzidos.

[0027] Em um outro aspecto, um método para produzir um derivado de acil-CoA graxo pode incluir colocar uma biomassa contendo celulose em contato com uma ou mais celulases para render açúcares fermentáveis; e colocar os açúcares fermentáveis em contato com o organismo microbiano. Em um outro aspecto, o método para produzir um derivado de acil-CoA graxo pode incluir colocar os açúcares fermentáveis que compreendem sacarose em contato com o microrganismo da maneira aqui descrita.

[0028] Em um aspecto, o derivado de acil-CoA graxo é um álcool graxo, ácido graxo, aldeído graxo, éster graxo, acetato graxo, éster de cera, alcano ou alceno. Em um outro aspecto, o derivado de acil-CoA graxo é um álcool graxo. Em um aspecto, o derivado de acil-CoA graxo apresenta um tamanho de cadeia de carbono de 8 a 24 átomos de carbono, tal como um álcool graxo com 8 a 24 átomos de carbono.

[0029] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende o(s) derivado(s) de acil-CoA graxo(s) produzido(s) por um método da maneira aqui descrita.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0030] A figura 1 ilustra vias para a biossíntese de derivados de acil- CoA graxo em Y. lipolytica. As vias naturais para a biossíntese de acil-CoA graxo a partir de glicose (reações 1-3) e para a degradação de alcanos e produtos de oxidação de alcano em acil-CoA graxo são mostradas (reações 47). As vias naturais e exógenas para a produção de produtos derivados de acil- CoA graxo também são mostradas e incluem: aciltransferases (triacilglicerídeos), tioesterases (ácidos graxos), éster sintases (ésteres), acil- CoA redutases (“FARs”) (aldeídos graxos e alcoóis graxos), e aldeído decarbonilases (alcanos).

[0031] A figura 2 ilustra o plasmídeo pCEN411 para a expressão dos genes FAR em Y. lipolytica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES

[0032] A menos que de outra forma definida, todos os termos técnicos e científicos aqui usados apresentam em geral o mesmo significado da maneira comumente entendida pelos versados na técnica, para a qual esta invenção pertence. Em geral, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos em laboratório em química analítica, cultura de células, genética molecular, química orgânica e química de ácido nucleico, e hibridização descritos a seguir são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Observa-se que da maneira aqui usada, “um”, “uma”, “o” e “a” incluem as referências plurais, a menos que de outra forma indicada claramente no contexto. O termo “que compreende” e seus cognatos são usados em seu sentido inclusivo; isto é, equivalente ao termo “incluindo” e seus cognatos correspondentes.

[0033] As técnicas e procedimentos são realizados em geral de acordo com os métodos convencionais na técnica e várias referências gerais. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed.; Ausubel, ed., 1990-2008, Current Protocols in Molecular Biology. As técnicas padrões, ou modificações destas, são usadas para a síntese de ácido nucleico e polipeptídeo, e para a síntese química e análises químicas. Em geral, as reações enzimáticas e as etapas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante. Para as técnicas relacionadas às tecnologias recombinantes de levedura, nutrição e crescimento, ver, por exemplo, Walker, 1998, Yeast Physiology and Biotechnology.

[0034] O termo “interrompido”, da maneira aplicada a um gene, refere-se a qualquer modificação genética que diminui ou elimina a expressão do gene e/ou a atividade funcional do produto de gene correspondente (RNAm e/ou proteína). As modificações genéticas incluem a inativação, supressão, eliminação, interrupção, bloqueio ou infrarregulação completa ou parcial de um gene. Isto pode ser realizado, por exemplo, por “neutralização”, inativação, mutação de gene (por exemplo, inserção, eliminação, mutações pontuais ou por deslocamento de quadro que interrompem a expressão ou atividade do produto de gene), ou pelo uso de RNAs inibitório (por exemplo, tecnologia de RNA sentido, antissenso ou RNAi). Uma interrupção pode incluir toda ou parte de uma sequência codificante de gene.

[0035] O termo “neutralizado” apresenta seu significado convencional na técnica, e refere-se a um organismo ou célula na qual um gene específico foi inativado por manipulação genética, em geral por um evento de recombinação em que todo ou uma porção de gene é eliminado ou um DNA heterólogo é inserido, de maneira que a célula ou organismo não produzam um produto funcional codificado pelo gene. Neutralizado também refere-se ao processo de preparar um organismo ou célula com um gene inativado, em geral substituindo pelo menos uma porção de uma sequência codificante de um gene por um pedaço artificial de DNA (por exemplo, que codifica um marcador de seleção) e/ou eliminando pelo menos uma porção da sequência codificante do gene, de maneira que um produto funcional de gene não seja expresso na célula ou organismo. Em algumas modalidades a sequência codificante completa do gene é excisada.

[0036] “Sequência codificante” refere-se àquela porção de um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de uma proteína.

[0037] O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacional e secreção.

[0038] O termo “derivado de acil-CoA graxo” é um composto que pode ser metabolicamente derivado de acil-CoA graxo, acil-ACP graxo, ou outro acil graxo tioéster similar em um microrganismo. Os derivados incluem, mas sem limitação, alcoóis graxos, ácidos graxos, aldeídos graxos, ésteres graxos, acetatos graxos, ésteres de cera, alcanos e alcenos. Os derivados de acil-CoA graxo saturados ou insaturados podem ser descritos usando a observação “Ca:b”, onde “a” é um número inteiro que representa o número total de átomos de carbono, e “b” é um número inteiro que se refere ao número de ligações duplas na cadeia de carbono. Os derivados insaturados de acil graxo CoA podem ser referidos como “cisΔx” ou “transΔx”, em que “cis” e “trans” referem-se à configuração da cadeia de carbono em torno da ligação dupla. O “x” indica o número do primeiro carbono da ligação dupla, onde o carbono 1 é, por exemplo, o carbono do ácido carboxílico do ácido graxo ou a ligação de carbono ao grupo OH do álcool graxo. Em relação aos derivados descritos a seguir, “R” é um hidrocarboneto C8 a C24 saturado, insaturado, linear, ramificado ou cíclico (ou “C7 a C23” em fórmulas de derivado que articulam expressamente o carbono terminal).

[0039] O termo “álcool graxo”, da maneira aqui usada, refere-se a um álcool alifático da fórmula R-OH, onde “R” é da maneira definida anteriormente. Em algumas modalidades, um álcool graxo produzido de acordo com os métodos aqui revelados é um álcool graxo C8-C24 saturado ou insaturado (isto é, um álcool graxo C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22 ou C24). Em algumas modalidades, um ou mais dos seguinte alcoóis graxos são produzidos: 1-octanol (C8:0), 1- decanol (C10:0), 1-dodecanol (C12:0), 1-tetradecanol (C14:0), 1-hexadecanol (C16:0), 1-octadecanol (C18:0), 1-icosanol (C20:0), 1-docosanol (C22:0), 1- tetracosanol (C24:0), cis Δ9-1-hexadecenol (C16:1), e cis Δ11-1-octadecenol (C18:1). Entende-se que, a menos que de outra forma especificada, uma referência a um “álcool graxo Cx” inclui tanto os alcoóis graxos saturados quanto insaturados com “x” átomos de carbono.

[0040] O termo “ácido graxo”, da maneira aqui usada, refere-se a um composto da fórmula O

[0041] O termo “aldeído graxo”, da maneira aqui usada, refere-se a um composto da fórmula jj

[0042] jj O termo “ésteres graxos” inclui compostos da fórmula

onde R' é um hidrocarboneto de cadeia curta, por exemplo, C1 a C6, preferivelmente C1 a C4. Por exemplo, o acil-CoA graxo pode ser reagido com um álcool de cadeia curta (por exemplo, metanol ou etanol) para formar ésteres graxos convencionais. Ao contrário, os alcoóis graxos podem ser reagidos com tioésteres de cadeia curta (por exemplo, acetil CoA) para formar ésteres. Ambos os tipos de éster são incluídos pelo termo “ésteres graxos”.

[0043] O termo “acetatos graxos”, da maneira aqui usada, refere-se a o um composto da fórmula 11

[0044] O termo “ésteres de cera”, da maneira aqui usada, refere-se a um éster derivado de um ácido graxo de cadeia longa e um álcool de cadeia longa.

[0045] A referência aqui aos genes endógenos particulares por nome é para ilustração e não para limitação. Entende-se que os nomes do gene variam de organismo para organismo e não pretende-se que a referência a um nome de gene seja limitante, mas pretende-se que inclua homólogos (isto é, que podem ser endógenos a um organismo microbiano relacionado) e variantes polimórficos. Os homólogos e variantes podem ser identificados com base na identidade de sequência e/ou atividade biológica similar (por exemplo, enzimática). Em certas modalidades, a invenção inclui uma sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos com pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % de identidade com o gene denominado ou com o produto de gene.

[0046] “Identidade” ou “identidade percentual”, no contexto de duas ou mais sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos, refere-se a duas ou mais sequências ou sub-sequências que são as mesmas ou apresentam um percentual especificado de nucleotídeos ou resíduos de amino ácidos, respectivamente, que são os mesmos. A identidade percentual pode ser determinada comparando duas sequências alinhadas de maneira ideal em uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, intervalos) comparado à sequência de referência (que também pode conter intervalos para otimizar o alinhamento) para o alinhamento das duas sequências. Por exemplo, a sequência pode apresentar uma identidade percentual de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % com uma região especificada em uma sequência de referência, quando comparada e alinhada para correspondência máxima com uma janela de comparação, ou região determinada, medida usando algoritmos de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspeção visual.

[0047] O alinhamento das sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, pela pesquisa por método de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no pacote de software GCG Wisconsin), ou por inspeção visual (ver, em geral, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) (Ausubel)).

[0048] Os exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a identidade percentual de sequência e a similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 33893402, respectivamente. O software para realizar a análise BLAST é disponível publicamente por meio da página da internet National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro identificar os pares de sequência com alta similaridade (HSPs) identificando palavras curtas de tamanho W na sequência de entrada, que tanto combina quanto satisfaz alguma pontuação limite de valor positivo T quando alinhada com uma palavra do mesmo tamanho em uma sequência de base de dados. T é referido como o limite de pontuação de palavra mais próxima (Altschul et al, supra). Estes acertos iniciais de palavra próxima agem como peças chaves para iniciar pesquisas e encontrar HSPs mais longos contendo as mesmas. Os acertos de palavra são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, para tão longe quanto a pontuação do alinhamento cumulativo possa ser maior. As pontuações cumulativas são calculadas usando, em relação às sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de fidelidade para um par de resíduos que combinam; sempre >0) e N (pontuação de penalidade para resíduos que não combinam; sempre <0). Para as sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação do alinhamento cumulativo diminui pela quantidade X a partir de seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa vai a zero ou menos em virtude do acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo com pontuação negativa; ou a extremidade de cada sequência é atingida. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para as sequências de nucleotídeos) usa como padrões um tamanho de palavra (W) de 11, um expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as fitas. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um tamanho de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915). A determinação exemplar de alinhamento de sequência e o % de identidade de sequência podem empregar os programas BESTFIT ou GAP no pacote de software GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI), usando os parâmetros padrões fornecidos.

[0049] A “sequência de referência” refere-se a uma sequência definida e usada como uma base para uma comparação de sequência. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, um segmento de um gene de tamanho completo ou sequência de polipeptídeos. Em geral, uma sequência de referência apresenta pelo menos 20 nucleotídeo ou resíduos de aminoácidos em tamanho, pelo menos 25 resíduos em tamanho, pelo menos 50 resíduos em tamanho, pelo menos 100 resíduos em tamanho ou o tamanho completo do ácido nucleico ou polipeptídeo. Uma vez que os dois polinucleotídeos ou polipeptídeos podem cada qual (1) compreender uma sequência (isto é, uma porção da sequência completa) que é similar entre as duas sequências, e (2) podem compreender adicionalmente uma sequência que é divergente entre as duas sequências, as comparações de sequência entre dois (ou mais) polinucleotídeos ou polipeptídeo são realizadas tipicamente comparando as sequências dos dois polinucleotídeos com uma “janela de comparação” para identificar e comparar as regiões locais de similaridade de sequência.

[0050] A “janela de comparação” refere-se a um segmento conceitual de pelo menos cerca de 20 posições de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos contíguos, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência de pelo menos 20 nucleotídeos ou aminoácidos contíguos, e em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, intervalos) de 20 por cento ou menos, comparada à sequência de referência (que não compreende adições ou eliminações) para o alinhamento ideal das duas sequências. A janela de comparação pode ser maior que 20 resíduos contíguos e inclui, opcionalmente 30, 40, 50, 100 ou mais janelas.

[0051] Da maneira aqui usada, “polinucleotídeo” refere-se a um polímero de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos tanto na forma de fita simples quanto de fita dupla, e complementos destes.

[0052] Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são aqui usados indiferentemente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos.

[0053] A “melhor produção” refere-se a um aumento na quantidade mensurável de derivados de acil-CoA graxo produzidos por um organismo microbiano modificado (isto é, um organismo microbiano em que um ou mais genes endógenos são interrompidos), comparado à quantidade produzida por um organismo microbiano controle do mesmo tipo, em que os genes não são interrompidos quando cultivados nas mesmas condições. O “organismo controle do mesmo tipo” significa um organismo da mesma espécie com um genoma que é essencialmente idêntico ao genoma do organismo microbiano modificado, exceto por um gene interrompido ou combinação de genes aqui descritos. Por exemplo, uma cepa de Y. lipolytica (por exemplo, DSMZ 1345), em que uma ácido graxo sintase é superexpressa, pode ser um “organismo controle do mesmo tipo” para a mesma cepa de Y. lipolytica (por exemplo, DSMZ 1345), em que uma ácido graxo sintase é superexpressa e em que o gene especificado ou combinação de genes é interrompido. O termo “organismo de outra forma idêntico” é usado indiferentemente com “organismo controle do mesmo tipo”. A melhor produção pode ocorrer por qualquer mecanismo, por exemplo, maior produção e/ou menor degradação ou utilização.

[0054] O termo “funcional”, da maneira usada na referência a um polipeptídeo, significa que o polipeptídeo exibe atividade catalítica in vivo. O termo “funcional” pode ser usado indiferentemente com o termo “biologicamente ativo”.

[0055] Os termos “tipo selvagem” ou “natural” usados em referência a um polipeptídeo ou proteína significam um polipeptídeo ou proteína expresso por um microrganismo encontrado na natureza. Quando usado em referência a um microrganismo, o termo significa um microrganismo de ocorrência natural (não modificado geneticamente).

[0056] Um “FAR” (também conhecido como “acil-CoA redutase que forma álcool graxo” ou “acil graxo redutase”), da maneira aqui usada, refere- se a uma enzima que converte substratos de acil-tioéster graxo (por exemplo, acil-CoA graxo ou acil-ACP graxo) em alcoóis graxos. “CoA” é um fator carreador de acil não proteico (ou fração) envolvido na síntese e oxidação de ácidos graxos. “ACP” é uma subunidade de polipeptídeo ou proteína de ácido graxo sintase usada na síntese de ácidos graxos.

[0057] O termo “tipo selvagem FAR”, da maneira aqui usada, refere- se a um polipeptídeo de FAR que é produzido na natureza. Em algumas modalidades, um FAR tipo selvagem é produzido por uma gamaproteobactéria incluindo, mas sem limitação, cepas de Marinobacter, Oceanobacter e Hahella. Os polipeptídeos FAR de ocorrência natural são descritos, por exemplo, no pedido de patente U.S. 2011/0000125, aqui incorporado pela referência. Em algumas modalidades, um FAR tipo selvagem é um polipeptídeo FAR de ocorrência natural que é produzido pela cepa Marinobacter algicola DG893 (SEQ ID NO:2). Em algumas modalidades, um FAR tipo selvagem é um polipeptídeo FAR de ocorrência natural que é produzido pela cepa Marinobacter aquaeolei VT8 (SEQ ID NO:4) Em algumas modalidades, um FAR tipo selvagem é um polipeptídeo FAR de ocorrência natural que é produzido por Oceanobacter sp. RED65 (SEQ ID NO:6).

[0058] O termo “variante de FAR”, da maneira aqui usada, refere-se aos polipeptídeos FAR de tamanho completo com substituições em uma ou mais posições de aminoácidos com relação a um polipeptídeo FAR tipo selvagem, e fragmentos funcionais destes, em que uma célula (por exemplo, um micróbio) em que o variante é expresso, e é capaz de catalisar maior produção de alcoóis graxos comparado a uma célula na qual o polipeptídeo FAR tipo selvagem é expresso. Em algumas modalidades, um variante de FAR compreende pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com um polipeptídeo FAR de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:6, e também compreende uma ou mais substituições de aminoácido que dão origem a uma maior produção de derivado de acil-CoA graxo (por exemplo, álcool graxo), comparada à produção do derivado de acil-CoA graxo que pode ser atingida com o polipeptídeo FAR tipo selvagem a partir do qual é derivado. Os variantes de FAR são descritos, por exemplo, no pedido U.S. 13/171.138, aqui incorporado pela referência. Da maneira aqui usada, exceto onde de outra forma seja claro no contexto, a referência a um “FAR”, “proteína FAR”, “variante de FAR”, ou “fragmento de FAR” é pretendida para se referir a uma proteína FAR funcional, variante funcional de FAR, ou fragmento funcional FAR, mesmo se não for explicitamente indicado.

[0059] O termo “endógeno” refere-se a um gene ou proteína que está originalmente contido em um organismo (isto é, codifica uma sequência encontrada no organismo tipo selvagem). Ao contrário, os termos “exógeno” ou “heterólogo”, da maneira usada em referência a um gene, referem-se indiferentemente a um gene que se origina fora do microrganismo, tal como um gene de uma outra espécie, ou um gene modificado ou recombinante. Um gene exógeno ou heterólogo pode ser introduzido no microrganismo por métodos conhecidos na técnica.

[0060] As sequências de ácidos nucleicos podem ser “introduzidas” em uma célula por transfecção, transdução, transformação ou qualquer outro método. Uma sequência de ácidos nucleicos introduzida em uma célula eucariótica ou procariótica pode ser integrada em um cromossomo, ou pode ser mantida em um epissomo.

[0061] Os termos “transformar” ou “transformação”, da maneira usada em referência a uma célula, significa uma célula que apresenta uma sequência não natural de ácidos nucleicos integrada em seu genoma ou como um epissomo (por exemplo, plasmídeo), que é mantida por meio de várias gerações.

[0062] “Vetor” refere-se a um construto de DNA que compreende um sequência codificante de DNA proteico. Um vetor pode ser um vetor de expressão que compreende uma sequência codificante de proteína operavelmente ligado a uma sequência controle adequada (isto é, promotor), capaz de realizar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado.

[0063] “Operavelmente ligado” significa que os segmentos da sequência de DNA são arranjados de maneira tal que funcionem em combinação com seus propósitos pretendidos, por exemplo, um promotor controla a transcrição de uma sequência de gene na qual é operavelmente ligado.

[0064] A “sequência promotora” é uma sequência de ácidos nucleicos que é reconhecida por uma célula para a expressão da região codificante. A sequência controle pode compreender uma sequência promotora apropriada. A sequência promotora contém sequências controles transcricionais, que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer sequência de ácidos nucleicos que exibe a atividade transcricional na célula de escolha, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelular ou intracelular tanto endógeno quanto exógeno (heterólogo) à célula hospedeira.

[0065] O termo “cultivar” refere-se ao crescimento de uma população de células microbianas em condições adequadas, em um meio líquido ou sólido. Mais frequentemente, um meio líquido é usado. Em algumas modalidades, cultivar refere-se à bioconversão fermentativa de um substrato em um produto final.

[0066] O termo “colocar em contato” refere-se a combinar uma enzima e um substrato em condições nas quais a enzima pode agir no substrato. Os versados na técnica entenderão que misturar uma solução contendo uma enzima (por exemplo, uma celulase) com um substrato (por exemplo, uma biomassa contendo celulose) afetará o “colocar em contato”. De maneira similar, no contexto de cultivar microrganismos, cultivar microrganismos em um meio que contém um substrato (por exemplo, um açúcar fermentável) afetará o “colocar” o microrganismo em contato com o substrato.

[0067] O termo “celulase” refere-se a uma categoria de enzimas capazes de interromper a estrutura cristalina da celulose, e hidrolisar a celulose (ligações β-1,4-glucano ou β-D-glicosidicas) em oligossacarídeos, dissacarídeos (por exemplo, celobiose) e/ou monossacarídeos menores (por exemplo, glicose). As celulases incluem endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases.

[0068] Os termos “biomassa contendo celulose”, “biomassa celulósica” e “substrato celulósico” referem-se aos materiais que incluem celulose. A biomassa pode ser derivada de plantas, animais ou microrganismos, e pode incluir resíduos agrícolas, industriais e florestais, resíduos sólidos municipais, resíduos industriais e culturas terrestres e aquáticas crescidas com propósitos de energia. Os exemplos de biomassa incluem, mas sem limitação, madeira, polpa de madeira, polpa de papel, fibra de milho, grão de milho, espigas de milho, resíduos de culturas agrícolas tais como cascas de milho, resíduos milho, gramíneas, trigo, palha de trigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, grama de crescimento rápido, papel residual, resíduo de processamento de polpa e papel, plantas lenhosas ou herbáceas, polpa de frua ou vegetal, grão para destilação, cascas de arroz, algodão, cânhamo, linho, sisal, bagasso de cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos da moagem de grãos, árvores, ramos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem, arbustos e moitas, vegetais, frutas, flores, excremento de animal e misturas destes.

[0069] O “açúcar fermentável” significa açúcares simples (monossacarídeos, dissacarídeos e oligossacarídeos pequenos) incluindo, mas sem limitação, glicose, frutose, xilose, galactose, arabinose, manose e sacarose.

[0070] O termo “derivado de acil-CoA graxo recuperável” refere-se à quantidade de derivados de acil-CoA graxo que pode ser isolada de uma mistura de reação que rende os derivados de acil-CoA graxo, de acordo com métodos conhecidos na técnica. II. INTRODUÇÃO

[0071] Descobriu-se, surpreendentemente, que a interrupção de certos genes endógenos e combinações de genes em um organismo microbiano, por exemplo, Yarrowia lipolytica, que expressam uma acil graxo redutase (FAR) resulta em maior produção de derivados de acil-CoA graxo. Uma FAR (também conhecida como “acil-CoA redutase que forma álcool graxo” ou “acil graxo redutase”) refere-se a uma enzima que catalisa a redução de um acil-CoA graxo, um acil-ACP graxo, ou outro complexo de acil graxo tioéster NAD(P)+, da maneira mostrada no esquema 1 a seguir:

em que “R” representa uma cadeia de hidrocarboneto C7 a C23 saturado, insaturado, linear, ramificado ou cíclico, e “R1” representa CoA, ACP ou outros substratos de acil graxo tioéster. CoA é um fator do grupo carreador acil não proteico (ou fração) envolvido na síntese e oxidação de ácidos graxos. “ACP” é um polipeptídeo ou subunidade de proteína de ácido graxo sintase usada na síntese de ácidos graxos. Em algumas modalidades, um intermediário de aldeído graxo pode ser produzido na reação representada no esquema 1.

[0072] As FARs proteicas tipo selvagem foram descritas em WO 2011/008535 (publicado em 20 de janeiro de 2011), aqui incorporado pela referência com todos os propósitos. Certas enzimas FAR isoladas dos gêneros da classe de bactérias marinhas, tais como gamaproteobactérias encontradas na água do mar (e particularmente FARs obtidas das cepas de Marinobacter e Oceanobacter, ou equivalentes taxonômicos destas), são capazes de gerar altos rendimentos de alcoóis graxos quando os genes que codificam estas enzimas são expressos em células heterólogas. Da maneira descrita na seção de exemplos a seguir, descobriu-se atualmente que os organismos microbianos em que certos genes ou combinações de genes são interrompidos, e que expressam um gene que codifica uma proteína FAR, apresentam maior produção de derivados de acil-CoA graxo comparado aos organismos microbianos de outra forma idênticos, que expressam o gene exógeno que codifica a proteína FAR na qual os genes não foram interrompido. Assim, em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um organismo microbiano que exibe maior produção de derivados de acil-CoA graxo, em que o organismo microbiano compreende um ou mais genes endógenos interrompidos e um gene exógeno que codifica uma proteína FAR. Estes organismos microbianos modificados podem ser usados na produção comercial de derivados de acil-CoA graxo.

[0073] Vários aspectos da invenção são descritos nas seções a seguir. III. INTERRUPÇÃO DE GENES ENDÓGENOS Genes endógenos para interrupção

[0074] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito aos organismos microbianos recombinantes, tais como leveduras, em que um ou mais genes endógenos são interrompidos, e que exibem melhor produção de derivados de acil-CoA graxo e métodos de usar tais organismos microbianos.

[0075] Os genes endógenos aqui descritos são denominados com referência ao genoma de Yarrowia lipolytica. Dujon, et al., 2004, “Genome evolution in Yeasts” Nature 430:35-44. O nome abreviado do gene (por exemplo, “C17545”) e o nome completo do gene (por exemplo, “YALI0C17545”) são usados indiferentemente, e ambos incluem os variantes polimórficos do gene. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é sem ser Y. lipolytica, e o gene endógeno é um homólogo do gene de Y. lipolytica. Da maneira observada anteriormente, os nomes do gene variam de organismo para organismo e qualquer nome de gene aqui usado não é pretendido que seja limitante, mas é pretendido para incluir homólogos igualmente. A tabela 1 fornece uma listagem de sequências de nucleotídeos para os genes interrompidos exemplares de Y. lipolytica, bem como as atividades da proteínas codificadas. As atividades biológicas são determinadas com base na referência à literatura científica, e/ou com base na caracterização funcional e de sequência. Embora as atividades biológicas conhecidas ou previstas possam ser usadas para identificar homólogos, uma sequência de nucleotídeos e/ou proteínas para uso na presente invenção não é limitada a estas sequências de nucleotídeos e/ou proteínas, as quais foram previamente identificadas como estando envolvidas na produção do derivado de acil-CoA graxo.

[0076] Em algumas modalidades, um organismo microbiano da presente invenção (por exemplo, algas, bactérias, mofo, fungo filamentoso, ou levedura, por exemplo, Yarrowia lipolytica) apresenta um ou mais genes endógenos interrompidos selecionados dos genes listados na tabela 1, e homólogos destes.

[0077] Tabela 1. Sequências de nucleotídeos para genes interrompidos em Yarrowia lipolytica

[0078] Em algumas modalidades, o organismo microbiano, por exemplo, Yarrowia lipolytica, apresenta um ou mais genes endógenos interrompido, em que pelo menos um dos genes interrompidos é YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, ALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0E18568, YALI0E22781, YALI0E25982, YALI0E28314, YALI0E32417, YALI0F01320, YALI0F06578, YALI0F07535, YALI0F14729, YALI0F22121, YALI0F25003, YALI0E14729, YALI0B17512 ou um homólogo de qualquer um destes.

[0079] Em algumas modalidades, o gene endógeno interrompido é C17545 (SEQ ID NO:7) ou um homólogo deste. Em algumas modalidades, o gene endógeno interrompido é E28336 (SEQ ID NO:8) ou um homólogo deste. Em algumas modalidades, o gene endógeno interrompido é E11099 (SEQ ID NO:9) ou um homólogo deste. Em algumas modalidades, o gene endógeno interrompido é E28534 (SEQ ID NO:12) ou um homólogo deste. Em algumas modalidades, o gene endógeno interrompido é B17512 (SEQ ID NO:54) ou um homólogo deste.

[0080] Em algumas modalidades, o organismo microbiano, por exemplo, Yarrowia lipolytica, é aquele em que um, dois, três, quatro, ou cinco genes endógenos no organismo microbiano são interrompidos. Em algumas modalidades, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais genes endógenos são interrompidos. Os organismos microbianos com múltiplos genes endógenos interrompidos podem exibir vantajosamente efeitos sinergísticos, da maneira observada em levedura (ver os exemplos a seguir). A presente invenção inclui, mas sem limitação, modalidades exemplares mostradas na seção de exemplos. Em algumas modalidades, o organismo microbiano apresenta dois, três, ou quatro genes endógenos interrompidos.

[0081] Em uma outra modalidade, o organismo microbiano apresenta pelo menos dois genes endógenos interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o primeiro gene interrompido quanto o segundo gene interrompido são selecionados a partir dos seguintes: YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, ALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0E18568, YALI0E22781, YALI0E25982, YALI0E28314, YALI0E32417, YALI0F01320, YALI0F06578, YALI0F07535, YALI0F14729, YALI0F22121, YALI0F25003, YALI0E14729, YALI0B17512, ou um homólogo de qualquer um destes. Em algumas modalidades três, quatro, cinco, ou mais de cinco genes desta lista são interrompidos.

[0082] Em modalidades com dois genes interrompidos, os genes particularmente usados para interrupção incluem, mas sem limitação, o gene C17545 (ou homólogo deste), e/ou o gene E30283 (ou homólogo deste), e/ou o gene E28336 (ou homólogo deste), e/ou o gene E11099 (ou homólogo deste), e/ou o gene E28534 (ou homólogo deste), e/ou o gene B17512 (ou homólogo deste). Em algumas modalidades, tanto o gene C17545 (ou homólogo deste) quanto o gene E28336 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o gene C17545 (ou homólogo deste) quanto o gene E11099 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o gene C17545 (ou homólogo deste) quanto o gene E28534 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o gene C17545 (ou homólogo deste) quanto o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o gene E28336 (ou homólogo deste) quanto o gene E11099 são interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o gene E28336 (ou homólogo deste) quanto o gene E28534 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o gene E28336 (ou homólogo deste) quanto o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o gene E11099 (ou homólogo deste) quanto o gene E28534 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o gene E11099 (ou homólogo deste) quanto o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, tanto o gene E38534 (ou homólogo deste) quanto o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos.

[0083] Em uma modalidade, o organismo microbiano, por exemplo, Yarrowia lipolytica, apresenta pelo menos um gene interrompido endógeno que é YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E14729, YALI0B17512 ou um homólogo de qualquer um destes. Em uma outra modalidade, o organismo microbiano apresenta um primeiro gene interrompido e um segundo gene interrompido, ambos selecionados deste grupo de genes. Nesta modalidade, o organismo microbiano pode apresentar genes interrompidos adicionais (por exemplo, um terceiro, quarto, ou quinto gene interrompido também selecionado deste grupo), ou pode paresentar apenas dois genes interrompidos.

[0084] Em algumas modalidades, o organismo microbiano, por exemplo, Yarrowia lipolytica, apresenta dois genes interrompidos ou homólogos destes. Em algumas modalidades, os organismos microbianos que exibem melhor produção de derivados de acil-CoA graxo compreendem qualquer das seguintes combinações de dois genes endógenos interrompidos: a. YALI0C17545 e YALI0E28336; b. YALI0C17545 e YALI0B10406; c. YALI0C17545 e YALI0E28534; d. YALI0C17545 e YALI0E30283; e. YALI0E28336 e YALI0E30283; f. YALI0E11099 e YALI0E30283; g. YALI0A19536 e YALI0E30283; h. YALI0A19536 e YALI0E28534; i. YALI0E30283 e YALI0E12463; j. YALI0E14729 e YALI0B10406; k. YALI0E14729 e YALI0C17545; e l. YALI0E14729 e YALI0E11099; e homólogos de (a) - (l).

[0085] Em uma outra modalidade, o organismo microbiano, por exemplo, Yarrowia lipolytica, apresenta três ou mais (por exemplo, 3) genes interrompidos ou homólogos destes. Em algumas modalidades, os organismos microbianos que exibem melhor produção de derivados de acil-CoA graxo compreendem qualquer das seguintes combinações de três genes endógenos interrompidos: m. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E11099; n. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0B10406; o. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0A19536; p. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E28534; q. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E32769; r. YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E12463; s. YALI0C17545, YALI0E11099 e YALI0B10406; t. YALI0C17545, YALI0B10406 e YALI0A19536; u. YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0B10406; v. YALI0E11099, YALI0B10406 e YALI0A19536; e w. YALI0C17545, YALI0E28534 e YALI0B17512; e homólogos de (m)-(w).

[0086] Em algumas modalidades, em que o organismo microbiano, por exemplo, Yarrowia lipolytica, apresenta três ou mais (por exemplo, 3) genes interrompidos, dois ou mais dos genes interrompidos são selecionados do gene C17545, do gene E28336, do gene E11099, do gene E28534, do gene B17512 de homólogos destes. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste) e o gene E28336 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste) e o gene E11099 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste) e o gene E28534 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste) e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E28336 (ou homólogo deste) e o gene E11099 são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E28336 (ou homólogo deste) e o gene E28534 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E28336 (ou homólogo deste) e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E11099 (ou homólogo deste) e o gene E28534 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E11099 (ou homólogo deste) e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E38534 (ou homólogo deste) e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, todos os três genes interrompidos são selecionados do gene C17545, do gene E28336, do gene E11099, do gene E28534, do gene B17512 e homólogos destes. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste), o gene E28336 (ou homólogo deste), e o gene E11099 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste), o gene E28336 (ou homólogo deste), e o gene E28534 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste), o gene E28336 (ou homólogo deste) e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste), o gene E11099 (ou homólogo deste), e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste), o gene E28534 (ou homólogo deste), e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E28336 (ou homólogo deste), o gene E11099 (ou homólogo deste), e o gene E28534 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E28336 (ou homólogo deste), o gene E11099 (ou homólogo deste), e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E28336 (ou homólogo deste), o gene E28534 (ou homólogo deste), e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E11099 (ou homólogo deste), o gene E28534 (ou homólogo deste), e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos.

[0087] Ainda em uma outra modalidade, o organismo microbiano apresenta quatro ou mais (por exemplo, 4) genes interrompidos ou homólogos destes. Em algumas modalidades, os organismos microbianos que exibem melhor produção de derivados de acil-CoA graxo compreendem qualquer das seguintes combinações de quatro genes endógenos interrompidos: x. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0B10406; y. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0A19536; z. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0E28534; aa. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0E32769; bb. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0B10406 e YALI0A19536; cc. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0B10406 e YALI0E32769; dd. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0A19536 e YALI0E28534; ee. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E28534 e YALI0E32769; ff. YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E28534 e YALI0E12463; gg. YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406 e YALI0E32769; hh. YALI0E11099, YALI0EA19536, YALI0B10406 e YALI0B17512; e ii. YALI0E11099, YALI0E28336, YALI0C17545 e YALI0E14729; e homólogos de (x)-(ii).

[0088] Em algumas modalidades, em que o organismo microbiano, por exemplo Yarrowia lipolytica, apresenta quatro ou mais (por exemplo, 4) genes interrompidos, dois ou mais dos genes interrompidos são selecionados do gene C17545, do gene E28336, do gene E11099, do gene E28534, do gene B17512 e homólogos destes. Em algumas modalidades, três ou mais dos genes interrompidos são selecionados do gene C17545, do gene E28336, do gene E11099, do gene E28534, do gene B17512 e homólogos destes. Em algumas modalidades, todos os quatro genes interrompidos são selecionados do gene C17545, do gene E28336, do gene E11099, do gene E28534, do gene B17512 e homólogos destes. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste), o gene E28336 (ou homólogo deste), o gene E11099 (ou homólogo deste) e o gene E28534 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene C17545 (ou homólogo deste), o gene E28336 (ou homólogo deste), o gene E11099 (ou homólogo deste), e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos. Em algumas modalidades, o gene E28336 (ou homólogo deste), o gene E11099 (ou homólogo deste), o gene E28534 (ou homólogo deste), e o gene B17512 (ou homólogo deste) são interrompidos.

[0089] Em algumas modalidades, qualquer um dos genes endógenos ou combinações específicas de genes endógenos listados na tabela 3 ou tabela 4 são interrompidos no organismo. Em algumas modalidades, o organismo compreende genes interrompidos adicionais. Os genes citados na tabela 3 e na tabela 4 são denominados com referência ao genoma de Yarrowia lipolytica; entretanto, os versados na técnica entenderão que as interrupções equivalentes podem ser realizadas em um organismo microbiano sem ser Y. lipolytica (por exemplo, em algas, bactérias, mofo, fungo filamentoso, ou levedura) interrompendo um(s) homólogo(s) de um gene listado na tabela 3 ou na tabela 4, neste organismo microbiano.

[0090] Além de qualquer das interrupções de gene endógeno aqui descritas, um ou mais genes adicionais podem ser opcionalmente interrompidos (por exemplo, por “neutralização”, inativação, mutação ou inibição da maneira aqui descrita), introduzidos, e/ou modificados em um organismo microbiano da presente invenção. Estes genes adicionais podem ser, mas não precisam ser, genes que foram previamente identificados como aqueles que estão envolvidos na produção de derivado de acil-CoA graxo. Métodos de interrupção

[0091] Da maneira descrita nas definições, o termo “interrompido”, da maneira aplicada a um gene, refere-se a uma modificação genética que diminui ou elimina a expressão do gene e/ou a atividade biológica do produto de gene correspondente (RNAm e/ou proteína) (por exemplo, para os genes listados na tabela 1, atividade biológica conhecida ou prevista listada na tabela 1). Em algumas modalidades, a interrupção elimina ou reduz substancialmente a expressão do produto de gene determinado, por exemplo, por imunoensaios. “Reduz substancialmente”, neste contexto, significa a quantidade de proteína expressa que é reduzida em pelo menos 50 %, frequentemente pelo menos 75 %, algumas vezes pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %, comparada à expressão do gene não interrompido. Em algumas modalidades, um produto de gene (por exemplo, proteína) é expresso a partir do gene interrompido, mas a proteína é mutada (por exemplo, uma eliminação de um ou mais aminoácidos, ou uma inserção de uma ou mais substituições de aminoácido), de maneira tal que a atividade biológica (por exemplo, atividade enzimática) da proteína seja completamente eliminada ou substancialmente reduzida. Da maneira aqui usada, “completamente eliminada” significa o que produto de gene não apresenta nenhuma atividade mensurável. “Substancialmente reduzida”, neste contexto, significa que a atividade biológica da proteína é reduzida em pelo menos 50 %, frequentemente pelo menos 75 %, algumas vezes pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %, comparada à proteína não mutada. A atividade biológica de um produto de gene (por exemplo, proteína) pode ser avaliada por um ensaio funcional tal como um ensaio enzimático. Por exemplo, em algumas modalidades, o organismo microbiano apresenta uma eliminação de toda ou uma porção da sequência codificante proteica do gene endógeno, uma mutação no gene endógeno de maneira tal que o gene codifique um polipeptídeo sem nenhuma atividade ou com atividade reduzida (por exemplo, inserção, eliminação, mutação pontual ou por deslocamento de quadro), expressão reduzida em virtude do RNA antissenso ou RNA pequeno de interferência que inibe a expressão do gene endógeno, ou uma sequência regulatória modificada ou eliminada (por exemplo, promotora) que reduz a expressão do gene endógeno, qualquer dos quais pode resultar em um gene interrompido. Em algumas modalidades, todos os genes interrompidos no microrganismo são interrompidos por eliminação.

[0092] Será entendido que os métodos para interrupção de gene em levedura e outros microrganismos são bem conhecidos, e o método particular usado para reduzir ou eliminar a expressão do gene endógeno não é importante para a invenção. Em uma modalidade, a interrupção pode ser realizada por recombinação homóloga, por maio da qual o gene a ser interrompido é interrompido (por exemplo, pela inserção de um gene marcador selecionável) ou se torna inoperante (por exemplo, “gene neutralizado”). Os métodos para neutralizar gene e neutralizar múltiplos genes são bem conhecidos. Ver, por exemplo, o exemplo 5 infra; Rothstein, 2004, “Targeting, Interruption, Replacement, and Alelle Rescue: Integrative DNA Transformation in Yeast” Em: Guthrie et al., Eds. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part A, p. 281-301; Wach et al., 1994, “New heterologus modules for classical or PCR-based gene interruptions in Saccharomyces cerevisiae” Yeast 10:1793-1808. Os métodos para mutagênese insercional também são bem conhecidos. Ver, por exemplo, Amberg et al., eds., 2005, Methods in Yeast Genetics, p. 95-100; Fickers et al., 2003, “New interruption cassettes for rapid gene interruption and marker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica” Journal of Microbiological Methods 55:727-737; Akada et al., 2006, “PCR-mediated seamless gene elimination and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae” Yeast 23:399-405; Fonzi et al., 1993, “Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans” Genetics 134:717-728.

[0093] A inibição antissenso é bem conhecida na técnica. Os genes endógenos podem ser interrompido inibindo a transcrição, estabilidade e/ou tradução usando métodos antissenso. Em relação à tecnologia antissenso, uma fita de ácido nucleico (DNA, RNA, ou análogo) complementar ao RNAm do gene é introduzida na célula. Esta fita complementar se ligará ao RNAm do gene e, assim, interrompe eficientemente o gene.

[0094] O método de interrupção pode ser aplicado independentemente para cada gene interrompido. Assim, quando múltiplos genes são interrompidos, os genes não precisam ser interrompidos da mesma maneira. Por exemplo, um organismo microbiano pode apresentar um gene que é interrompido ou substituído por um fragmento artificial de DNA (“neutralizado”), um gene que é interrompido por uma mutação por inserção, e um outro gene cujo promotor é alterado para diminuir a expressão. Em algumas modalidades, dois ou mais genes são interrompidos da mesma maneira. Em algumas modalidades, dois ou mais genes são interrompidos pelo mesmo evento de interrupção (por exemplo, evento de recombinação). Em uma modalidade, todos os genes interrompidos são interrompidos da mesma maneira ou pelo mesmo evento de interrupção. Em uma modalidade, todos os genes interrompidos são genes “neutralizados”, isto é, genes que são inativados interrompendo ou substituindo pelo menos uma porção da sequência codificante. Em uma outra modalidade, todos os genes interrompidos são genes neutralizados que são interrompidos pelo mesmo evento de interrupção.

[0095] Em uma modalidade, as cópias múltiplas de gene são interrompidas. Uma “cópia de gene”, da maneira aqui usada, refere-se ao mesmo gene alvo (por exemplo, um gene endógeno da maneira aqui descrita) em um cromossomo homólogo, em um organismo diploide ou poliploide. Por exemplo, um organismo microbiano pode apresentar múltiplos conjuntos de cromossomos e, assim, possuem múltiplas cópias de cada gene alvo. Em algumas modalidades, um organismo microbiano é diploide (isto é, com dois conjuntos de cromossomos e, assim, duas cópias de cada gene alvo). Em algumas modalidades, um organismo microbiano é poliploide (isto é, com mais de dois conjuntos de cromossomos). Em algumas modalidades, um organismo microbiano é triploide (isto é, com três conjuntos de cromossomos e, assim, três cópias de cada gene alvo). Em algumas modalidades, um organismo microbiano é tetraploide (isto é, com quatro conjuntos de cromossomos e, assim, quatro cópias de cada gene alvo). Em algumas modalidades, um organismo microbiano apresenta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais cópias de um gene alvo. Em algumas modalidades, o organismo microbiano possui 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais cópias interrompidas de um gene alvo endógeno. Em uma modalidade, todas as cópias do gene alvo endógeno são interrompidas no organismo microbiano.

[0096] O termo “uma ou mais cópias de gene” refere-se ao número de cópias do mesmo gene alvo, embora “um ou mais genes interrompidos” refere-se a um ou mais genes individuais. Por exemplo, um organismo microbiano pode apresentar duas cópias de gene interrompido cópias, apresentando ao mesmo tempo apenas um gene interrompido.

[0097] Onde dois ou mais genes endógenos são interrompidos, o número de cópias a serem interrompidas pode ser selecionado independentemente para cada gene interrompido. As múltiplas cópias de um gene podem ser interrompidas, por exemplo, realizando ciclos múltiplos de recombinação com um marcador recuperável. IV. EXPRESSÃO DE SEC62 TRUNCADA

[0098] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito aos organismos microbianos recombinantes, tal como levedura, em que um gene endógeno que codifica uma proteína Sec62, ou um homólogo ou variante alélico deste, foi modificado. Sec62 é uma proteína que está envolvida na translocação de proteínas no retículo endoplasmático nas leveduras. Sec62 de Yarrowia é codificada por YALI0B17512, apresenta a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO:64, e contém um domínio citoplasmático (aminoácidos 207 a 396 de SEQ ID NO:64). Ver também número de acesso ao GenBank CAA67878.1 e Swennen et al., 1997, “Cloning the Yarrowia lipolytica homologue of the Saccharomyces cerevisiae SEC62 gene,” Curr Genet 31(2):128-132. Da maneira descrita no exemplo a seguir, descobriu-se que as células de levedura que expressam uma proteína Sec62 truncada, que não apresenta um domínio citoplasmático completo, apresentam maior produção de derivados de acil-CoA graxo comparadas a uma célula de levedura controle na qual a proteína Sec62 não é truncada.

[0099] Assim, a invenção fornece um organismo microbiano que expressa uma proteína Sec62 truncada ou homóloga. O organismo pode ser usado por qualquer dos métodos ou processos aqui descritos, e pode ser combinada com genes interrompidos aqui descritos e em combinações aqui descritas.

[00100] Assim, em algumas modalidades, o organismo, por exemplo, uma alga, uma bactéria, um mofo, um fungo filamentoso ou uma levedura (por exemplo, Yarrowia lipolytica), é aquele em que o gene endógeno que codifica Sec62 (YALI0B17512 ou um homólogo deste) compreende uma eliminação parcial da sequência que codifica pelo menos uma porção do domínio citoplasmático da proteína Sec62 codificada. Em algumas modalidades, a eliminação parcial da sequência codificante compreende uma eliminação do domínio citoplasmático completo da proteína Sec62 codificada.

[00101] Em algumas modalidades, a proteína Sec62 é SEQ ID NO:64 ou é um homólogo ou variante alélico substancialmente idêntico a SEQ ID NO:64 (por exemplo, apresenta uma identidade de sequência de pelo modalidades, a proteína Sec62 é isolada ou derivada a partir de um organismo selecionado do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae (número de acesso ao Genbank CAB56541.1; SEQ ID NO:77), Kluyveromyces lactis (número de acesso ao Genbank CAH00127.1; SEQ ID NO:78) e Schizosaccharomyces pombe (número de acesso ao Genbank CAB16220.1; SEQ ID NO:79).

[00102] Em algumas modalidades, o organismo microbiano (por exemplo, Y. lipolytica) expressa uma proteína Sec62 truncada ou homóloga, em que o domínio citoplasmático completo (que corresponde aos aminoácidos 207-396 de SEQ ID NO:64) foi eliminado. Em algumas modalidades, o organismo microbiano expressa uma proteína Sec62 truncada ou homóloga, em que uma porção do domínio citoplasmático é eliminada, por exemplo, a partir de cerca da posição 210 a cerca da posição 396; a partir de cerca da posição 250 a cerca da posição 396; a partir de cerca da posição 300 a cerca da posição 396; a partir de cerca da posição 330 a cerca da posição 396; a partir de cerca da posição 210 a cerca da posição 350; a partir de cerca da posição 210 a cerca da posição 300; a partir de cerca da posição 250 a cerca da posição 350; ou a partir de cerca da posição 300 a cerca da posição 350, em que os aminoácidos são numerados com referência à SEQ ID NO:64. Em algumas modalidades, o organismo microbiano expressa uma proteína Sec62 truncada ou homóloga, em que uma porção do domínio citoplasmático a partir de cerca da posição 267 a cerca da posição 396 é eliminada. Em algumas modalidades, o organismo microbiano expressa uma proteína Sec62 truncada ou homóloga, em que uma porção do domínio citoplasmático a partir de cerca da posição 302 a cerca da posição 396 é eliminada. Em algumas modalidades, o organismo microbiano expressa uma proteína Sec62 truncada ou homóloga em que uma porção do domínio citoplasmático a partir de cerca da posição 337 a cerca da posição 396 é eliminada.

[00103] Em algumas modalidades, um organismo microbiano é diploide (isto é, apresenta dois conjuntos de cromossomos e, assim, duas cópias do gene que codifica Sec62). Em algumas modalidades, um organismo microbiano é poliploide (isto é, apresenta mais de dois conjuntos de cromossomos e, assim, mais de duas cópias do gene que codifica Sec62). Em algumas modalidades, mais de uma cópia do gene de Sec62 é modificada para expressar uma proteína Sec62 truncada. Em algumas modalidades, todas as cópias do gene de Sec62 são modificadas para expressar uma proteína Sec62 truncada.

[00104] Será entendido que o método particular usado para eliminar toda ou uma porção do domínio citoplasmático de Sec62 não é importante para a invenção. Em algumas modalidades, a eliminação do domínio citoplasmático ou porção deste pode ser realizada substituindo a porção da sequência que codifica o domínio citoplasmático, ou porção deste, por um fragmento artificial de DNA (por exemplo, um marcador selecionável). Em algumas modalidades, a eliminação do domínio citoplasmático, ou porção deste, pode ser realizada removendo a porção da sequência codificante que codifica o domínio citoplasmático, ou porção deste. V. EXPRESSÃO DE FAR EXÓGENA Proteína FAR

[00105] Em um aspecto, o organismo microbiano modificado que exibe melhor produção de derivados de acil-CoA graxo (por exemplo, um organismo microbiano tal como Yarrowia lipolytica, em que um, dois, três, quatro, ou mais genes endógenos são interrompidos da maneira aqui descrita), expressa ou superexpressa uma FAR. Da maneira descrita na seção de exemplos, os organismos microbianos em que certos genes endógenos ou combinações de genes são interrompidos, e que expressam um gene exógeno que codifica uma proteína FAR, apresentam maior produção de derivados de acil-CoA graxo comparados aos organismos microbianos controle (por exemplo, organismos microbianos de outra forma idênticos), que expressam o gene exógeno que codifica a proteína FAR em que os genes endógenos correspondentes não foram interrompidos.

[00106] Em algumas modalidades, o organismo, por exemplo, uma alga, uma bactéria, um mofo, um fungo filamentoso, ou uma levedura (por exemplo, Yarrowia lipolytica), expressa uma proteína FAR exógena (isto é, uma FAR não expressa normalmente no organismo, tal como uma proteína derivada de uma espécie diferente). Em algumas modalidades, a proteína FAR exógena é uma proteína FAR tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína FAR exógena é selecionada ou geneticamente modificada para maior atividade ou rendimento de derivados de acil-CoA graxo, por exemplo, alcoóis graxos (isto é, um variante de FAR da maneira aqui descrita). Em algumas modalidades, a proteína FAR é uma proteína FAR ou variante da maneira descrita no pedido de patente U.S. 2011/0000125, ou no pedido de patente U.S. 13/171,138, depositado em 28 de junho de 2011, cujos conteúdos na íntegra de cada qual são aqui incorporados pela referência.

[00107] Em uma modalidade, a proteína FAR exógena é de um gênero de bactérias marinhas, tais como gamaproteobactérias (por exemplo, Marinobacter e Oceanobacter). Em uma modalidade, a proteína FAR exógena é de uma espécie do gênero Marinobacter incluindo, mas sem limitação, M. aquaeolei, M. arcticus, M. actinobacterium, e M. lipolyticus. Em uma modalidade, a proteína FAR exógena é de M. algicola (também referida aqui como “FAR_Maa”). Em uma modalidade, a proteína FAR exógena é de M. aquaeolei (também referida aqui como “FAR_Maq”). Em uma outra modalidade, a proteína FAR exógena é de uma espécie do gênero Oceanobacter incluindo, mas sem limitação, Oceanobacter sp. Red65 (renomeada como Bermanella marisrubi) (também referida aqui como “FAR_Ocs”), cepa Oceanobacter WH099 e O. kriegii. Em uma outra modalidade, a proteína FAR exógena é de Hahella incluindo, mas sem limitação, H. chejuensis e espécies equivalentes desta.

[00108] Em uma modalidade, o gene exógeno de FAR é FAR_Maa (FAR tipo selvagem da cepa Marinobacter algicola DG893, SEQ ID NO:1), FAR_Maq (FAR tipo selvagem de Marinobacter aquaeolei, SEQ ID NO:3), FAR_Ocs (FAR tipo selvagem de Oceanobacter sp. RED65, SEQ ID NO:5), ou um fragmento que codifica uma enzima FAR funcional. Em uma modalidade, o gene FAR apresenta uma identidade de sequência de DNA de pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % com qualquer de SEQ ID NOs:1, 3 ou 5. Em uma modalidade, o gene FAR apresenta uma identidade de sequência de DNA de pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % com SEQ ID NO:1.

[00109] Em uma outra modalidade, a proteína FAR exógena apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % com qualquer de SEQ ID NOs:2, 4 ou 6, que corresponde às sequências de polipeptídeos de FAR tipo selvagem_Maa, FAR tipo selvagem_Maq, e FAR tipo selvagem_Ocs, respectivamente. Em uma modalidade, a proteína FAR apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % com SEQ ID NO:2.

[00110] Em outras modalidades, a enzima FAR é FAR_Hch (Hahella chejuensis KCTC 2396, número no GenBank YP_436183.1, SEQ ID NO:65), FAR_Mac (da cepa marinha de actinobacterium PHSC20C1, SEQ ID NO:66), FAR_JVC (JCVI_ORF_1096697648832, número no GenBank EDD40059.1, SEQ ID NO:67), FAR_Fer (JCVI_SCAF_1101670217388, SEQ ID NO:68), FAR_Key (JCVI_SCAF_1097205236585, SEQ ID NO:69), FAR_Gal (JCVI_SCAF_1101670289386, SEQ ID NO:70), ou um variante ou fragmento funcional destes. A tabela 2 fornece a identidade de sequência aproximada de aminoácido desta proteína bacteriana FARs para FAR_Maa (SEQ ID NO:2) e FAR_Ocs (SEQ ID NO:6).

[00111] Tabela 2. Identidade de sequência de aminoácido dos homólogos com relação a FAR_Maa e FAR_Ocs

[00112] Em outras modalidades, a enzima FAR ou fragmento funcional é isolada ou derivada de um organismo selecionado do grupo que consiste em Vitis vinifera (número de acesso ao GenBank CAO22305.1, SEQ ID NO:71; ou CAO67776.1, SEQ ID NO:72), Desulfatibacillum alkenivorans (número de acesso ao GenBank NZ_ABII01000018.1), Stigmatella aurantiaca (NZ_AAMD01000005.1, SEQ ID NO:73) e Phytophthora ramorum (número de acesso ao GenBank: AAQX01001105.1). Variantes de FAR

[00113] Em algumas modalidades, os variantes das enzimas FAR são usados, tais como os fragmentos funcionais, e os variantes são selecionados usando a tecnologia da evolução molecular. Um “fragmento funcional”, da maneira aqui usada, refere-se a um polipeptídeo com uma eliminação aminoterminal e/ou carbóxi-terminal, e/ou eliminação interna, mas em que a sequência de aminoácidos restante é idêntica ou substancialmente idêntica às posições correspondentes na sequência com a qual está sendo comparada (por exemplo, uma proteína FAR tipo selvagem de tamanho completo ou variante de proteína FAR de tamanho completo), e que mantém substancialmente toda (por exemplo, mantém pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou mais) a atividade do polipeptídeo de tamanho completo (por exemplo, a proteína FAR tipo selvagem de tamanho completo ou o variante de proteína FAR de tamanho completo). Os fragmentos funcionais podem compreender até 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, e 99 % da proteína FAR de tamanho completo. Assim, um fragmento funcional neste contexto é um fragmento de um polipeptídeo FAR de ocorrência natural, ou variante deste, que apresenta atividade catalítica. Em algumas modalidades, o fragmento funcional apresenta pelo menos 50 % da atividade da FAR tipo selvagem de tamanho completo correspondente, a partir da qual é derivado (por exemplo, FAR_Maa, FAR_Maq, ou FAR_Ocs).

[00114] Em algumas modalidades, um variante de FAR compreende uma ou mais mutaçãos (por exemplo, substituições) comparadas a uma FAR tipo selvagem, de maneira tal que o variante de polipeptídeo FAR resultante apresente melhores características e/ou propriedades comparado à FAR tipo selvagem, por exemplo, tal como maior produção de álcool graxo quando o variante de FAR é expresso em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, um variante de proteína FAR pode apresentar de 1 a 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou mais substituições de aminoácido com relação a uma proteína FAR natural (tipo selvagem), tal como FAR_Maa (SEQ ID NO:2), FAR_Maq (SEQ ID NO:4) ou FAR_Ocs (SEQ ID NO:6). Em algumas modalidades, um variante da proteína FAR pode apresentar de 1 a 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou mais substituições de aminoácido com relação à proteína FAR natural de SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, um variante da proteína FAR pode apresentar de 1 a 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou mais substituições de aminoácido com relação à proteína FAR natural de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, um variante de proteína FAR pode apresentar de 1 a 50, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40 45, ou mais substituições de aminoácido com relação à proteína FAR natural de SEQ ID NO:6.

[00115] Em algumas modalidades, um variante de FAR compreende pelo menos cerca de 70 % (ou pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 %) de identidade de sequência com uma FAR tipo selvagem (por exemplo, um polipeptídeo FAR de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:6), e compreende adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácido (por exemplo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou mais substituições de aminoácido) com relação à FAR tipo selvagem, e é capaz de produzir pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes mais álcool graxo do que a FAR tipo selvagem, a partir da qual é derivada quando ensaiada nas mesmas condições.

[00116] Em certas modalidades, o organismo microbiano não expressa uma FAR endógena (isto é, o genoma do organismo tipo selvagem não codifica uma FAR). Em algumas modalidades, o organismo microbiano é um organismo que expressa uma proteína FAR endógena. Em certas modalidades, o organismo microbiano é um organismo que não expressa uma proteína FAR exógena. Em algumas modalidades, o organismo microbiano é um organismo que não expressa uma proteína FAR endógena nem uma proteína FAR exógena. Em algumas modalidades, o organismo microbiano expressa tanto a(s) FAR(s) endógena(s) quanto a(s) FAR(s) exógena(s).

[00117] Os métodos para introduzir gene exógenos (por exemplo, genes que codificam FAR) em um organismo hospedeiro e que expressam uma proteína exógena são conhecidos na técnica. Ver a seção VII a seguir. VI. ORGANISMOS MICROBIANOS Células hospedeiras

[00118] O organismo microbiano em que um ou mais genes endógenos são interrompidos, e que exibe maior produção de derivados de acil-CoA graxo, pode ser qualquer “célula hospedeira” que produz derivados de acil- CoA graxo. As células hospedeiras adequadas incluem, mas sem limitação, algas, bactérias, mofo, fungo filamentoso e levedura, incluindo levedura oleaginosa (por exemplo, Yarrowia lipolytica). Em algumas modalidades, o organismo microbiano é um organismo oleaginoso, por exemplo, um organismo que tende a armazenar sua fonte de energia na forma de óleo. A célula hospedeira pode ser de eucarioto ou procarioto.

[00119] Em uma modalidade, o organismo microbiano é um fungo. As células hospedeiras fúngicas adequadas incluem, mas sem limitação, Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota, Zygomycota, Fungi imperfecti. As células hospedeiras fúngicas particularmente preferidas são as células de levedura e células de fungo filamentoso.

[00120] Em uma modalidade, o organismo microbiano é uma levedura. Em uma modalidade, a levedura é de um dos gêneros: Yarrowia, Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Endomycopsis, Hansenula, Kluyveromyces, Lipomyces, Pachysolen, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon ou Trigonopsis. Em uma modalidade, a levedura é do gênero Yarrowia. Em algumas modalidades da invenção, a célula de levedura é Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Saccaromyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia metanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans e Yarrowia lipolytica.

[00121] Em uma modalidade, o organismo microbiano é uma levedura oleaginosa. As leveduras oleaginosas acumulam lipídeos tais como tri-acil gliceróis. Os exemplos de levedura oleaginosa incluem, mas sem limitação, Yarrowia lipolytica, Yarrowia paralipolytica, Candida revkauji, Candida pulcherrima, Candida tropicalis, Candida utilis, Candida curvata D, Candida curvataR, Candida diddensiae, Candida boldinii, Rhodotorula glutinous, Rhodotorula graminis, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula minuta, Rhodotorula bacarum, Rhodosporidium toruloides, Cryptococcus (terricolus) albidus var. albidus, Cryptococcus laurentii, Trichosporon pullans, Trichosporon cutaneum, Trichosporon cutancum, Trichosporon pullulans, Lipomyces starkeyii, Lipomyces lipoferus, Lipomyces tetrasporus, Endomycopsis vernalis, Hansenula ciferri, Hansenula saturnus e Trigonopsis variabilis.

[00122] Em uma modalidade, a levedura é Yarrowia lipolytica. As cepas exemplares de Yarrowia lipolytica incluem, mas sem limitação, DSMZ 1345, DSMZ 3286, DSMZ 8218, DSMZ 70561, DSMZ 70562, DSMZ 21175, disponíveis pelo Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, e também as cepas disponíveis pelo Agricultural Research Service (NRRL) tais como, mas sem limitação, NRRL YB-421, NRRL YB-423, NRRL YB-423-12 e NRRL YB-423-3.

[00123] Em uma modalidade, a célula hospedeira é um fungo filamentoso. As células hospedeiras de fungo filamentoso da presente invenção incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina e Oomycota (Hawksworth et al., 1995, em Ainsworth e Bisby's Dictionary do Fungi, 8a ed.). Os fungos filamentosos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede celular composta de quitina, celulose e outros complexos polissacarídicos. Da maneira aqui usada, as células hospedeiras de fungo filamentoso da presente invenção são morfologicamente distintas da levedura. As células de fungo filamentoso exemplares incluem, mas sem limitação, as espécies de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella, incluindo teleomorfos, anamorfos, sinônimos, basiônimos, e equivalentes taxonômicos destes.

[00124] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de alga tais como Chlamydomonas (por exemplo, C. Reinhardtii) e Phormidium (P. sp. ATCC29409).

[00125] As células adequadas de procarioto incluem células bacterianas Gram positivas, Gram negativas e Gram-variáveis. As células hospedeiras adequadas de eucarioto incluem, mas sem limitação, espécies de Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Acinetobacter, Acidothermus, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio, Buchnera, Campestris, Camplyobacter, Clostridium, Corynebacterium, Chromatium, Coprococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacter, Erwinia, Fusobacterium, Faecalibacterium, Francisella, Flavobacterium, Geobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Ilyobacter, Micrococcus, Microbacterium, Mesorhizobium, Methylobacterium, Methylobacterium, Mycobacterium, Neisseria, Pantoea, Pseudomonas, Prochlorococcus, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodopseudomonas, Roseburia, Rhodospirillum, Rhodococcus, Scenedesmus, Streptomyces, Streptococcus, Synecoccus, Saccharomonospora, Staphylococcus, Serratia, Salmonella, Shigella, Thermoanaerobacterium, Tropheryma, Tularensis, Temecula, Thermosynechococcus, Thermococcus, Ureaplasma, Xanthomonas, Xylella, Yersinia e Zymomonas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma espécie de Agrobacterium, Acinetobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Buchnera, Geobacillus, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Enterococcus, Erwinia, Flavobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Salmonella, Streptococcus, Streptomyces ou Zymomonas. Transformação e cultura de células

[00126] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método que compreende fornecer um organismo microbiano da maneira aqui descrita, e cultivar o organismo microbiano em condições nas quais os derivados de acil- CoA graxo são produzidos. Em algumas modalidades, o organismo microbiano com um ou mais genes endógenos interrompidos é capaz de melhor produção da maneira descrita anteriormente, por exemplo, com aumento de pelo menos uma 1 vez na produção de derivados de acil-CoA graxo comparado a um organismo controle do mesmo tipo (por exemplo, um organismo microbiano controle de outra maneira idêntico, em que o um ou mais genes não são interrompidos).

[00127] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo FAR (por exemplo, um polipeptídeo FAR tipo selvagem ou um variante de polipeptídeo FAR) é introduzido no organismo microbiano para a expressão do polipeptídeo FAR tipo selvagem ou variante de polipeptídeo FAR. O polinucleotídeo pode ser introduzido na célula como um epissomo auto-replicante (por exemplo, vetor de expressão) ou pode ser estavelmente integrado no DNA da célula hospedeira.

[00128] Os métodos, reagentes e ferramentas para transformar os organismos microbianos aqui descritos, tais como bactérias, levedura (incluindo levedura oleaginosa) e fungos filamentosos são conhecidos na técnica. Os métodos, reagentes e ferramentas gerais para transformar, por exemplo, bactérias, podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque. Os métodos, reagentes e ferramentas para transformar levedura são descritos em “Guide to Yeast Genetics e Molecular Biology,” C. Guthrie e G. Fink, Eds., Methods in Enzymology 350 (Academic Press, San Diego, 2002). Os métodos, reagentes e ferramentas para transformar, cultivar, e manipular Y. lipolytica são encontrados em “Yarrowia lipolytica” C. Madzak, J.M. Nicaud e C. Gaillardin em “Prodution of Recombinant Proteins. Novel Microbial and Eucaryotic Expression Systems”, G. Gellissen, Ed. 2005, que são aqui incorporados pela referência com todos os propósitos. Em algumas modalidades, a introdução do construto de DNA ou vetor da presente invenção em uma célula hospedeira pode ser realizada por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE- Dextrano, transformação mediada por PEG, eletroporação ou outras técnicas comuns (Ver Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, que é aqui incorporado pela referência).

[00129] Os organismos microbianos podem ser cultivados em meios nutrientes convencionais, modificados da maneira apropriada para ativar promotores, selecionar transformantes ou amplificar o polinucleotídeo FAR. As condições de cultivo, tais como temperatura, pH e similares, serão evidentes para os versados na técnica. Da maneira observada, muitas referências são disponíveis para a cultura e produção de muitas células, incluindo células de origem bacteriana, vegetal, animal (especialmente mamífero) e arqueobactérias. Ver, por exemplo, Sambrook, Ausubel, e Berger (all supra), bem como Freshney (1994) Culture de Animal Cells, a Manual of Basic Technique, terceira edição, Wiley-Liss, Nova Iorque e suas as referências citadas; Doyle e Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley e Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, quarta edição W.H. Freeman e Company; e Ricciardelli, et al., (1989) In Vitro Cell Dev. Biol. 25:1016-1024, todos os quais são aqui incorporados pela referência. Em relação à cultura e regeneração de células de planta, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque, NY; Gamborg e Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nova Iorque); Jones, ed. (1984) Plant Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey e Plant Molecular Biology (1993) R.R.D.Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6, todos os quais são aqui incorporados pela referência. Os meios de cultura de células são em geral apresentados em Atlas e Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL, que é aqui incorporado pela referência. A informação adicional para a cultura de células é encontrada na literatura comercial disponível, tal como o Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) da Sigma- Aldrich, Inc (St Louis, MO) (“Sigma- LSRCCC”) e, por exemplo, The Plant Culture Catalogue e suplemento (1997) também da Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO) (“Sigma-PCCS”), todos os quais são aqui incorporados pela referência. VII. ENGENHARIA METABÓLICA ADICIONAL

[00130] Em uma modalidade, o organismo microbiano modificado que exibe melhor produção de derivados de acil-CoA graxo contém um gene exógeno operavelmente ligado a um promotor que é funcional no organismo microbiano. A incorporação de um gene exógeno (por exemplo, um gene FAR da maneira descrita anteriormente) pode ser realizada por técnicas bem conhecidas na tecnologia.

[00131] Em algumas modalidades, o organismo microbiano pode ser modificado para expressar ou superexpressar um ou mais genes que codificam enzimas, sem ser FAR, que estão envolvidas na biossíntese de derivado de acil-CoA graxo. Ver a figura 1. Em modalidades particulares, o gene codifica uma ácido graxo sintase (FAS), uma éster sintase, uma acil-ACP tioesterase (TE), uma acil-CoA graxo sintase (FACS), ou uma acetil-CoA carboxilase (ACC). Por exemplo, em uma modalidade, o organismo microbiano pode ser modificado para expressar uma éster sintase e produzir ésteres graxos. De maneira similar, em uma outra modalidade, o organismo microbiano pode ser modificado para expressar tioesterase e produzir ácidos graxos. Qualquer destes genes exemplares pode ser usado em vez de FAR, ou em adição a este. Quando múltiplos genes exógenos são expressos, em algumas modalidades, o vetor de expressão que codifica uma primeira enzima (por exemplo, FAR) e o vetor de expressão que codifica uma segunda enzima (por exemplo, uma FAS, éster sintase, TE, FACS, ou ACC) são ácidos nucleicos separados. Em outras modalidades, a primeiro enzima e a segundo enzima são codificadas no mesmo vetor de expressão, e a expressão de cada enzima é regulada independentemente por um promotor diferente.

[00132] Da maneira mostrada na figura 1, os vários derivados de acil- CoA graxo podem ser produzidos pelo organismo microbiano. Quando a recuperação de um derivado particular é desejada, a expressão ou atividade de um ou mais dos polipeptídeos envolvida nesta via metabólica pode ser alterada para render preferencialmente o derivado desejado. Por exemplo, pode-se modificar a expressão ou atividade de um ou mais de acetil-CoA carboxilase, piruvato decarboxilase, isocitrato desidrogenase, ATP-citrato liase, enzima málica, AMP-desaminase, glicose-6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogliconato desidrogenase, frutose 1,6 bisfosfatase, NADH quinase, transidrogenase, acil-CoA:diacilglicerol aciltransferase, fosfolipídeo:diacilglicerol aciltransferase, acil-CoA:colesterol aciltransferase, triglicerídeo lipase, e acil-coenzima A oxidase.

[00133] Como um outro exemplo, o organismo microbiano pode ser modificado para utilizar substratos desejados particulares. Por exemplo, embora a Y. lipolytica tipo selvagem não utilize preferivelmente a xilose como um substrato, esta pode ser geneticamente modificada de maneira a realizar isto. Ver, por exemplo, Brat et al., 2009, “Functional expression of a bacterial xylose isomerase in Saccharomyces cerevisiae” Applied and Environmental Microbiology 75:2304-11; Ho et al., 1998, “Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effective cofermentation of glucose and xylose” Applied and Environmental Microbiology 64:1852-59. De maneira similar, Y. lipolytica também pode ser geneticamente modificada para utilizar a sacarose. Ver, por exemplo, Nicaud et al., 1989, “Expression of invertase activity in Yarrowia lipolytica and its use as a selectable marker “ Current Genetics 16:253-260. Pode ser vantajoso modificar geneticamente os organismos microbianos a serem ajustados às condições de um ambiente particular, por exemplo, para utilizar matéria prima obtida de uma biomassa celulósica ou lignocelulósica em que a matéria prima pode ser colocada em contato com enzimas celulase para fornecer açúcares fermentáveis incluindo, mas sem limitação, glicose, frutose, xilose e sacarose.

[00134] Em algumas modalidades, um organismo microbiano da maneira aqui descrita (por exemplo, um organismo microbiano que compreende um ou mais genes endógenos interrompidos selecionados de YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, ALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0E18568, YALI0E22781, YALI0E25982, YALI0E28314, YALI0E32417, YALI0F01320, YALI0F06578, YALI0F07535, YALI0F14729, YALI0F22121, YALI0F25003, YALI0E14729, YALI0B17512, e homólogos destes, e um gene exógeno que codifica uma FAR exógena operavelmente ligado a um promotor) compreende adicionalmente um gene exógeno que codifica uma enzima que catalisa a hidrólise de um açúcar fermentável (por exemplo, sacarose, arabinose, ou manose). Os exemplos de enzimas que catalisam a hidrólise de um açúcar fermentável incluem, mas sem limitação, sacarases e invertases. Assim, em algumas modalidades, o gene exógeno codifica uma sacarase ou uma invertase. Em algumas modalidades, o gene exógeno é um gene SUC2 que codifica a invertase. As invertases (EC 3.2.1.26) catalisam a hidrólise de sacarose que resulta em uma mistura de glicose e frutose. As sacarases estão relacionadas às invertases, mas catalisam a hidrólise de sacarose por um mecanismo diferente.

[00135] O gene exógeno que codifica a enzima que catalisa a hidrólise de um açúcar fermentável pode ser derivado de qualquer organismo microbiano adequado, por exemplo, de algas, bactérias, mofo, fungo filamentoso ou levedura. Em algumas modalidades, o organismo microbiano que compreende um ou mais genes endógenos interrompidos é Y. lipolytica, e o gene exógeno que codifica uma enzima que catalisa a hidrólise de sacarose é de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, o gene exógeno é SUC2 invertase de Saccharomyces cerevisiae. Integração alvejada de um gene exógeno

[00136] Em algumas modalidades, a expressão de um gene exógeno no organismo microbiano é realizada introduzindo o gene exógeno no organismo em um plasmídeo epissomal. Em algumas modalidades, a expressão do gene exógeno é realizada integrando o gene no genoma do organismo microbiano. A integração do gene exógeno no genoma do organismo microbiano apresenta várias vantagens com o uso de plasmídeos incluindo, mas sem limitação, menos variação na expressão de proteína, melhor flexibilidade na escolha de meios de fermentação, e o potencial para os níveis elevados de expressão introduzindo múltiplas cópias de um único gene.

[00137] Assim, em algumas modalidades, um organismo microbiano com um ou mais genes endógenos interrompidos, da maneira aqui descrita, compreende adicionalmente um gene exógeno que codifica uma enzima que está envolvida na biossíntese do derivado de acil-CoA graxo (por exemplo, uma enzima FAR), em que o gene exógeno é integrado no genoma do organismo microbiano. Em algumas modalidades, o organismo microbiano compreende um gene exógeno que codifica uma proteína FAR (por exemplo, uma proteína FAR tipo selvagem que é idêntica ou substancialmente idêntica ao polipeptídeo FAR de qualquer de SEQ ID NOs:2,4, ou 6, ou um variante de proteína FAR da maneira aqui descrita) que é integrado no genoma do organismo microbiano.

[00138] Em algumas modalidades, o organismo microbiano compreende uma cópia do gene exógeno. Em algumas modalidades, o organismo microbiano compreende duas, três, quatro, cinco ou mais cópias do gene exógeno. Em algumas modalidades, as múltiplas cópias do gene exógeno (por exemplo, duas, três, quatro, cinco ou mais cópias) são integradas no genoma do organismo microbiano em uma estrutura de repetição direta, ou uma estrutura de repetição invertida.

[00139] Em algumas modalidades, a integração do gene exógeno no genoma do organismo microbiano pode ser alvejada em um ou mais regiões particulares do genoma microbiano. O genoma do organismo microbiano pode ser mapeado para identificar regiões em que a integração de um gene exógeno resulta em melhor expressão do gene, ou uma melhor propriedade (por exemplo, melhor produção de álcool graxo) com relação à expressão do gene exógeno em um organismo controle do mesmo tipo (por exemplo, um organismo de outra forma idêntico) por um plasmídeo (também denominado “pontos agitados” de expressão). Da maneira a seguir nos exemplos, após a integração de um gene exógeno que codifica a proteína FAR em uma cepa de Y. lipolytica, as cepas que foram identificadas mostraram melhoria particularmente boa na produção de álcool graxo com relação a uma cepa de Y. lipolytica, que expressou FAR por meio do plasmídeo. Estes pontos agitados de integração da expressão, uma vez mapeados, também podem ser alvejados para subsequente integração de um gene exógeno por meio de recombinação homóloga.

[00140] Assim, em algumas modalidades, o gene exógeno é integrado em um sítio cromossômico no genoma do organismo microbiano, que é um ponto agitado de expressão. Em algumas modalidades, em que o organismo microbiano é Y. lipolytica, o gene exógeno é integrado no genoma do organismo microbiano em um ou mais dos sítios cromossômicos aqui descritos, por exemplo, no exemplo 1.

[00141] A integração alvejada de um gene exógeno no genoma de um organismo microbiano da presente invenção também pode ser realizada por meio de reciclagem de marcador “contínuo”. Da maneira descrita na seção de exemplos a seguir, na reciclagem de marcador contínuo um marcador selecionável bifuncional é introduzido em um local genômico específico, tanto para interromper um gene natural quanto para introduzir um gene exógeno. Os integrantes são identificados usando o marcador selecionável (seleção positiva, por exemplo, usando um marcador que confere resistência a antibiótico). O marcador é então excisado, ou “reciclado”, por meio de recombinação homóloga entre duas repetições flanqueantes, e organismos que apresentam satisfatoriamente o marcador reciclado são identificados por contra-seleção (seleção negativa, por exemplo, usando um marcador que induz a toxicidade). O marcador selecionável pode então ser usado novamente para introduzir mais modificações no genoma do organismo. Este método é vantajoso em decorrência de permitir um número teoricamente ilimitado de modificações alvejadas (por exemplo, as eliminações alvejadas de genes ou integração alvejada de gene exógenos) a serem realizadas no genoma de um organismo, facilitando assim o desenvolvimento da cepa.

[00142] Assim, em algumas modalidades, um gene exógeno (por exemplo, um gene que codifica uma enzima que é envolvida na biossíntese do derivado de acil-CoA graxo, por exemplo, uma enzima FAR) é integrado no genoma de um organismo microbiano da presente invenção (por exemplo, um organismo microbiano com um ou mais genes endógenos interrompidos da maneira aqui descrita), usando um marcador selecionável reciclável bifuncional com um marcador selecionável positivo e um marcador selecionável negativo, em que a integração do gene exógeno no genoma é identificada usando o marcador selecionável positivo, e em que a reciclagem subsequente do marcador bifuncional é identificada usando o marcador selecionável negativo. Em algumas modalidades, o marcador selecionável bifuncional apresenta um marcador selecionável positivo para higromicina e um marcador selecionável negativo para timidina quinase. Vetores

[00143] Os vetores de expressão podem ser usados para transformar um organismo microbiano da presente invenção (por exemplo, um organismo microbiano que apresenta um ou mais genes endógenos interrompidos da maneira aqui descrita) com um gene que codifica uma enzima FAR, e/ou um gene que codifica uma enzima sem ser FAR que está envolvida na biossíntese do derivado de acil-CoA graxo, e/ou um gene que codifica uma enzima que catalisa a hidrólise de um açúcar fermentável. Um vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor, por exemplo, um plasmídeo ou um vírus, que pode ser manipulado por técnicas de DNA recombinante para facilitar a expressão do gene exógeno no organismo microbiano. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é estavelmente integrado no cromossomo do organismo microbiano. Em outras modalidades, o vetor de expressão é uma molécula de DNA extracromossomal replicativa, por exemplo, um plasmídeo linear ou circular fechado, que é encontrado tanto em um número pequeno de cópias (por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 10 cópias por genoma equivalente) quanto em um número elevado de cópias (por exemplo, mais de cerca de 10 cópias por genoma equivalente).

[00144] Os vetores de expressão para expressar o um ou mais genes exógenos são comercialmente disponíveis, por exemplo, da Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO e Stratagene, LaJolla, CA. Em algumas modalidades, os exemplos de vetores de expressão adequados são plasmídeos que são derivados de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pREP4, pCEP4 (Invitrogen) ou pPoly (Lathe et al., 1987, Gene 57:193-201).

[00145] Em algumas modalidades, um vetor de expressão contém opcionalmente um sítio de ligação de ribossomo (RBS) para início da tradução e um finalizador de transcrição, tal como PinII. O vetor também inclui opcionalmente sequências apropriadas para amplificar a expressão, por exemplo, um melhorador.

[00146] Em modalidades particulares, a presente revelação fornece um plasmídeo de replicação autônomo para a expressão de genes exógenos em Yarrowia, e particularmente em Y. lipolytica. Um plasmídeo exemplar é mostrado na figura 2 e descrito nos exemplos. Um plasmídeo como este pode ser modificado adicionalmente para a expressão de genes exógenos usados para a produção de derivado de acil-CoA graxo em levedura, inter alia, Y. lipolytica.

[00147] Em algumas modalidades, em que mais de um gene exógeno deve ser expresso no organismo microbiano (por exemplo, um primeiro gene exógeno que codifica um polipeptídeo FAR tipo selvagem ou um variante de polipeptídeo FAR, e um segundo gene exógeno que codifica uma enzima sem ser FAR que está envolvida na biossíntese do derivado de acil-CoA graxo ou uma enzima que catalisa a hidrólise de um açúcar fermentável), o vetor de expressão que codifica o polipeptídeo FAR e o vetor de expressão que codifica a segunda enzima são ácidos nucleicos separados. Em outras modalidades, o polipeptídeo FAR e a segunda enzima são codificados no mesmo vetor de expressão, e a expressão de cada enzima é independentemente regulada por um promotor diferente. Promotores

[00148] A sequência promotora é uma sequência de ácidos nucleicos que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo, tal como um polinucleotídeo contendo a região codificante. Em geral, a sequência promotora contém sequências controles transcricionais, s quais medeiam a expressão do polinucleotídeo. O promotor pode ser qualquer sequência de ácidos nucleicos que exibe atividade transcricional na célula hospedeira de escolha, incluindo os promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares, tanto homólogos quanto heterólogos para a célula hospedeira. Os métodos para o isolamento, identificação e manipulação dos promotores de concentrações variadas são disponíveis ou facilmente adaptados da técnica. Ver, por exemplo, Nevoigt et al. (2006) Appl. Environ. Microbiol. 72:5266-5273, cuja revelação é aqui incorporada pela referência na sua íntegra.

[00149] Em uma levedura hospedeira, os promotores usados incluem, mas sem limitação, aqueles doa genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GALl) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Os promotores exemplares de Y. lipolytica incluem, mas sem limitação, TEF1, RPS7 (Müller et al., 1998, “Comparison of expression systems in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Klyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe and Yarrowia lipolytica. Cloning of two novel promotors from Yarrowia lipolytica” Yeast 14:1267-1283), GPD, GPM (U.S. 7259255), GPAT (U.S. 7264949), FBA1 (U.S. 7202356), o promotor Leu2 e variantes deste (U.S. 5786212), o promotor proteico EF1alpha (WO 97/44470), Xpr2 (US4937189), Tefl, Caml (YALI0C24420g), YALI0DI6467g, Tef4 (YALI0BI2562g), Yef3 (YALI0E13277g), Pox2, Yat1(U.S. 2005/0130280), os promotores revelados em U.S. 2004/0146975 e U.S. 5952195, CYP52A2A (U.S. 2002/0034788); as sequências dos genes de fungos (por exemplo, C. tropicalis) como catalase, citrato sintase, 3-cetoacil-CoA tiolase A, citrato sintase, O-acetilhornserina sulfidrilase, protease, camitina O-acetiltransferase, hidratasedesidrogenase, epimerase; genes de Pox4 (U.S. 2004/0265980); e genes de Met2, Met3, Met6, Met25 e YALI0DI2903. Ver também WO 2008/042338. Outros promotores usados para as células hospedeiras do tipo são descritos por Romanos et al., 1992, “Foreign gene expression in yeast: a review” Yeast 8:423-488.

[00150] Em relação às células hospedeiras hospedeiras bacterianas, os promotores adequados incluem, mas sem limitação, promotores obtidos do lac operon de E. coli, gene de agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene de levansacarase de Bacillus subtilis (sacB), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene de alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene de penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, promotores de Bacillus megaterium, e gene de beta-lactamase procariotos (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 3727-3731(1978)), bem como o promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25(1993)). Os promotores adicionais incluem o promotor trp, o fago lambda PL, o promotor T7 e similares. Os promotores adequados para uso na invenção são descritos em Gilbert et al., 1980, “Useful proteins from recombinant bacteria” Sci Am 242:74-94, e Sambrook et al., supra.

[00151] Em relação às células hospedeiras de fungos filamentosos, os promotores adequados incluem, mas sem limitação, promotores obtidos a partir dos genes para TAKA amylase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), bem como o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae).

[00152] O promotor pode ser qualquer dos promotores listados no pedido de patente U.S. 13/330.324. Em particular, o promotor pode ser uma região promotora de uma porção do gene YALI0E12683 de Y. lipolytica, uma região promotora de uma porção do gene YALI0E19206 de Y. lipolytica, ou uma região promotora de uma porção do gene YALI0E34749 de Y. lipolytica. Em algumas modalidades, o promotor compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:74 (uma sequência de 0,25 kb de YALI0E12683), SEQ ID NO:75 (uma sequência de 0,25 kb de YALI0E19206), ou SEQ ID NO:76 (uma sequência de 0,25 kb de YALI0E34749). Em algumas modalidades, o promotor apresenta pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, e pelo menos 99 % de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75 ou SEQ ID NO:76. Outros elementos regulatórios

[00153] A expressão do gene exógeno pode ser melhorada também incorporando finalizadores de transcrição, sequências principais, sequências de poliadenilação, sinais secretórios, regiões codificantes pró-peptídeo, sequências regulatórias, e/ou marcadores selecionáveis que são evidentes aos versados na técnica. A escolha das sequências controles apropriadas para uso nos construtos de polinucleotídeo da presente revelação é realizada pelos versados na técnica e, em várias modalidades, é dependente da célula hospedeira recombinante usada e do método desejado de recuperar as composições de álcool graxo produzidas.

[00154] As sequências regulatórias usadas para Yarrowia incluem, mas sem limitação, fragmentos do promotor Xpr2 (U.S. 6083717). As sequências finalizadoras usadas incluem, mas sem limitação, as sequências finalizadoras Xpr2 (U.S. 4937189) e Pox2 (YALIOFI 0857g) de Y. lipolytica.

[00155] Em várias modalidades, o vetor de expressão inclui um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de células transformadas. Os marcadores selecionáveis para uso em um organismo hospedeiro da maneira aqui descrita incluem, mas sem limitação, genes que conferem resistência antibiótica (por exemplo, resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol, higromicina ou tetraciclina) ao organismo hospedeiro recombinante que compreende o vetor. VIII. MELHOR PRODUÇÃO DE DERIVADOS DE ACIL- COA GRAXO

[00156] Os organismos microbianos modificados aqui descritos exibem melhor produção de derivados de acil-CoA graxo. O rendimento de derivados de acil-CoA graxo do organismo microbiano modificado da invenção pode ser comparado a um organismo controle do mesmo tipo (por exemplo, um organismo microbiano controle de outra maneira idêntico, em que o gene endógeno não foi interrompido). Em uma modalidade, o organismo microbiano modificado apresenta pelo menos um gene interrompido endógeno que é YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, ALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0B17512, ou um homólogo de qualquer um destes, e um gene exógeno que codifica uma acil graxo redutase funcional operavelmente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, o organismo exibe pelo menos um aumento de 1,2 vez na produção de derivados de acil-CoA graxo comparado a um organismo controle do mesmo tipo (por exemplo, um organismo microbiano controle de outra maneira idêntico, em que o um ou mais genes endógenos não são interrompidos). Em outras modalidades, a melhor produção é pelo menos 1 vez, pelo menos 1,2 vez, pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2.5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes comparada ao organismo microbiano controle. Em algumas modalidades, o gene exógeno que codifica um acil graxo redutase é um gene com pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de FAR_Maa (SEQ ID NO:1), FAR_Maq (SEQ ID NO:3), ou FAR_Ocs (SEQ ID NO:5). Em algumas modalidades, o gene exógeno codifica um polipeptídeo FAR com pelo menos 80 % de identidade de sequência com FAR tipo selvagem_Maa (SEQ ID NO:2), FAR tipo selvagem_Maq (SEQ ID NO:4), ou FAR tipo selvagem_Ocs (SEQ ID NO:6). Em algumas modalidades, o gene exógeno codifica um variante de FAR derivado de FAR_Maa (SEQ ID NO:2), FAR_Maq (SEQ ID NO:4), ou FAR_Ocs (SEQ ID NO:6).

[00157] Em algumas modalidades, a invenção fornece um organismo microbiano (por exemplo, uma alga, uma bactéria, um mofo, um fungo filamentoso, uma levedura, ou uma levedura oleaginosa) que compreende um, dois, três, quatro, ou mais genes endógenos interrompidos, em que pelo menos um dos genes endógenos interrompidos é selecionado do gene C17545, do gene E28336, do gene E11099, do gene E28534 e homólogos destes, e um gene exógeno que codifica um gene de acil graxo redutase funcional operavelmente ligado a um promotor, em que o organismo microbiano exibe pelo menos um 1 vez, pelo menos um 1,2 vez, pelo menos um aumento de 1,5 vez, pelo menos de 2,5 vezes, pelo menos de 4 vezes, pelo menos de 10 vezes, pelo menos de 15 vezes, ou pelo menos de 20 vezes na produção de derivados de acil-CoA graxo comparado a um organismo microbiano controle (por exemplo, um organismo microbiano controle de outra maneira idêntico, em que o um ou mais genes não são interrompidos).

[00158] Em uma modalidade, a invenção fornece uma célula de Yarrowia lipolytica que compreende pelo menos um gene interrompido endógeno que é YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E14729, ou YALI0B17512, ou um homólogo de qualquer um destes, e um gene exógeno que codifica um gene de acil graxo redutase funcional operavelmente ligado a um promotor, em que a célula de Yarrowia lipolytica exibe pelo menos um aumento de 1 vez na produção de derivados de acil-CoA graxo comparado a um organismo microbiano controle (por exemplo, um organismo microbiano controle de outra maneira idêntico, em que o um ou mais genes não são interrompidos). Em certas modalidades, a invenção fornece uma célula de Yarrowia lipolytica que compreende um gene interrompido ou combinação de genes interrompidos apresentados na tabela 3 ou na tabela 4. Em certas modalidades, a invenção fornece uma célula de levedura que compreende um gene interrompido que é um homólogo, ou uma combinação de genes interrompidos que são homólogos, aos genes apresentados na tabela 3 ou na tabela 4.

[00159] O organismo microbiano controle pode ser, por exemplo, Y. lipolytica DSMZ 1345 (tipo selvagem) ou a cepa de Y. lipolytica CY-201 (um variante de Y. lipolytica DSMZ 1345 apresenta pouco crescimento em meios com hexadecano como a única fonte de carbono). Em algumas modalidades, o organismo microbiano controle é um organismo recombinante que apresenta os genes exógenos incorporados de maneira idêntica ao organismo microbiano com o(s) gene(s) interrompido(s). Por exemplo, tanto o organismo microbiano que apresenta um ou mais genes endógenos interrompidos quanto o organismo microbiano controle podem conter um gene exógeno de FAR.

[00160] Durante a comparação do organismo microbiano que apresenta um ou mais genes endógenos interrompidos com o organismo microbiano controle, os organismos podem ser cultivados em condições essencialmente idênticas, e os derivados de acil-CoA graxo podem ser avaliados ou recuperados usando procedimentos essencialmente idênticos. Produção de álcool graxo

[00161] Em algumas modalidades, o derivado de acil-CoA graxo que é produzido é um álcool graxo. Assim, em algumas modalidades, a invenção fornece um organismo microbiano modificado que exibe pelo menos um aumento de 1 vez, pelo menos de 1,2 vez, pelo menos de 1,5 vez, pelo menos de 2,5 vezes, pelo menos de 4 vezes, pelo menos de 10 vezes, pelo menos de 15 vezes, ou pelo menos de 20 vezes na produção de alcoóis graxos comparado a um organismo microbiano controle, em que o um ou mais genes não são interrompidos.

[00162] A produção de álcool graxo pode ser avaliada por métodos descritos na seção de exemplos (por exemplo, exemplos 3 e 6) e/ou usando qualquer outros métodos conhecidos na técnica. A produção de álcool por um organismo da presente invenção (por exemplo, um organismo microbiano que apresenta um gene endógeno interrompido) pode ser descrita como uma quantidade absoluta (por exemplo, mols/litro de cultura), ou como um aumento de vezes a melhoria na produção por um organismo controle (por exemplo, um organismo microbiano em que o gene endógeno não foi interrompido). A produção de álcool graxo por um organismo microbiano da presente invenção pode ser avaliada, por exemplo, usando cromatografia gasosa. Em geral, os micróbios são cultivados, os alcoóis graxos totais ou secretados são isolados, e a quantidade e/ou teor de álcool graxo são avaliados.

[00163] Qualquer número de ensaio pode ser usado para determinar se um organismo microbiano que compreende pelo menos um gene interrompido endógeno, da maneira aqui descrita, produz uma maior quantidade de alcoóis graxos (por exemplo, pelo menos 1 vez mais alcoóis graxos) comparado a um organismo microbiano controle, em que o um ou mais genes não são interrompidos, incluindo ensaios exemplares aqui descritos. Em um ensaio exemplar, os alcoóis graxos produzidos por cepas de Y. lipolytica produtivas são coletados por extração de culturas de células usando 1 mL de isopropanol:hexano (razão 4:6). A mistura da extração é centrifugada e a fase orgânica superior é transferida para uma placa de 96 poços, e analisada por cromatografia gasosa (GC) equipada com detector de ionização de chama (FID) e coluna HP-5 (tamanho de 30 m, I.D. 0,32 mm, filme 0,25 um), início a 100 °C, e aumento da temperatura em uma taxa de 25 °C/min para 246 °C, e manutenção a seguir por 1,96 minuto. IX. MÉTODOS DE PRODUZIR DERIVADOS DE ACIL- COA GRAXO

[00164] A presente revelação também fornece métodos de produzir derivados de acil-CoA graxo usando os organismos microbianos da maneira aqui descrita, bem como as composições de derivado de acil-CoA graxo resultantes produzidas pelos ditos métodos. Fermentação

[00165] A fermentação da célula hospedeira é realizada em condições adequadas e por um tempo suficiente para produzir derivados de acil-CoA graxo. As condições para a cultura e produção de células, incluindo células de fungos filamentosos, bactérias e de levedura, são facilmente disponíveis. Os meio de cultura de células são em geral apresentados em Atlas e Parks, eds., 1993, The Handbook of Microbiological Media. Os componentes individuais de tais meios são disponíveis a partir de fontes comerciais, por exemplo, a partir das marcas comerciais DIFCO™ e BBL™. Em algumas modalidades, o meio nutriente aquoso é um “meio rico” que compreende fontes complexas de nitrogênio, sais e carbono, tal como o meio YP, que compreende 10 g/L de peptona e 10 g/L de extrato de levedura em um meio como este. Em outras modalidades, o meio nutriente aquoso é base de nitrogênio para levedura (DIFCO™) suplementado com uma mistura apropriada de aminoácidos, por exemplo, meio SC. Em modalidades particulares, a mistura de aminoácido que não apresenta um ou mais aminoácidos, impondo por meio disso uma pressão seletiva para manutenção de um vetor de expressão na célula hospedeira recombinante.

[00166] O meio de cultura pode conter uma fonte assimilável de carbono. As fontes assimiláveis de carbono são disponíveis em muitas formas, e incluem fontes renováveis de carbono e os substratos de matéria prima celulósica e de amido obtidas das mesmas. As fontes assimiláveis de carbono adequadas incluem, mas sem limitação, monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos, ácidos graxos saturados e insaturados, succinato, acetato e misturas destes. As fontes de carbono adicionais incluem, mas sem limitação, glicose, galactose, sacarose, xilose, frutose, glicerol, arabinose, manose, rafinose, lactose, maltose, e misturas destes. Os meio de cultura podem incluir, por exemplo, matéria prima a partir de uma biomassa contendo celulose, uma biomassa lignocelulósica, ou uma biomassa contendo sacarose.

[00167] Em algumas modalidades, os “açúcares fermentáveis” são usados como a fonte assimilável de carbono. O “açúcar fermentável” significa açúcares simples (monossacarídeos, dissacarídeos, e oligossacarídeos curtos) incluindo, mas sem limitação, glicose, frutose, xilose, galactose, arabinose, manose e sacarose. Em uma modalidade, a fermentação é realizada com uma mistura de glicose e galactose como a fonte assimilável de carbono. Em uma outra modalidade, a fermentação é realizada apenas com glicose para acumular a biomassa, após o que a glicose é substancialmente removida e substituída por um indutor, por exemplo, galactose para indução de expressão de um ou mais genes exógenos envolvidos na produção de derivado de acil- CoA graxo. Ainda em uma outra modalidade, a fermentação é realizada com um fonte assimilável de carbono que não medeia a repressão de glicose, por exemplo, raffinose, para acumular a biomassa, após o que o indutor, por exemplo, a galactose, é adicionado para induzir a expressão de um ou mais genes exógenos envolvidos na produção de derivado de acil-CoA graxo. Em algumas modalidades, a fonte assimilável de carbono é de matéria prima celulósica e de amido derivada, mas sem limitação, de madeira, polpa de madeira, polpa de papel, grão, resíduo de milho, fibra de milho, arroz, resíduo de processamento de papel e polpa, plantas lenhosas ou herbáceas, polpa de fruta ou vegetal, grãos para destilação, gramíneas, cascas de arroz, palha de trigo, algodão, cânhamo, linho, sisal, espigas de milho, bagaço de cana de açúcar, gramíneo de crescimento rápido, e misturas destes.

[00168] Em uma modalidade, o método de preparar os derivados de acil-CoA graxo inclui adicionalmente as etapas de colocar uma biomassa contendo celulose em contato com uma ou mais celulases para render uma matéria prima de açúcares fermentáveis, e colocar os açúcares fermentáveis em contato com um organismo microbiano da maneira aqui descrita. Em uma modalidade, o organismo microbiano é Y. lipolytica, e os açúcares fermentáveis são glicose, sacarose e/ou frutose.

[00169] Os microrganismos podem ser crescidos em condições de fermentação em lote, em lote alimentado ou contínuo, que são todas conhecidas na técnica. A fermentação em lotes clássica é um sistema fechado, em que as composições do meio são ajustadas no início da fermentação e não são submetidas a alternativas artificiais durante a fermentação. Uma variação do sistema em lotes é uma fermentação em lote alimentado, onde o substrato é adicionado em incrementos como os processos de fermentação. Os sistemas de lote alimentado são usados quando a repressão de catabólitos é provavelmente para inibir o metabolismo das células, e onde é desejável apresentar quantidades limitadas de substrato no meio. A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente em um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removido simultaneamente para o processamento. A fermentação contínua mantém em geral as culturas em uma densidade elevada constante, onde as células estão principalmente na fase de crescimento log. Os sistemas de fermentação contínua se esforçam para manter as condições de crescimento no estágio estável. Os métodos para modular os nutrientes e os fatores de crescimento para os processos de fermentação contínua, bem como as técnicas para maximizar a taxa de formação de produto, são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

[00170] Em algumas modalidades, as fermentações são realizadas em uma temperatura de cerca de 10°C a cerca de 60°C, cerca de 15°C a cerca de 50°C, cerca de 20°C a cerca de 45°C, cerca de 20°C a cerca de 40°C, cerca de 20°C a cerca de 35°C, ou cerca de 25°C a cerca de 45°C. Em uma modalidade, a fermentação é realizada em uma temperatura de cerca de 28°C e/ou cerca de 30°C. Será entendido que, em certas modalidades onde as células hospedeiras termoestáveis são usadas, as fermentações podem ser realizadas em temperaturas mais elevadas.

[00171] Em algumas modalidades, a fermentação é realizada por um período de tempo de cerca de 8 horas a 240 horas, cerca de 8 horas a cerca de 168 horas, cerca de 8 horas a 144 horas, cerca de 16 horas a cerca de 120 horas, ou cerca de 24 horas a cerca de 72 horas. Em algumas modalidades, a fermentação será realizada em um pH de cerca de 3 a cerca de 8, cerca de 4,5 a cerca de 7,5, cerca de 5 a cerca de 7, ou cerca de 5,5 a cerca de 6,5.

[00172] Em uma modalidade, o método de produzir derivados de acil- CoA graxo compreende: a) fornecer um organismo microbiano (por exemplo, uma célula de Yarrowia lipolytica) que apresenta um ou mais genes endógenos interrompidos, em que pelo menos um gene interrompido é YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E28534, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, ALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0E18568, YALI0E22781, YALI0E25982, YALI0E28314, YALI0E32417, YALI0F01320, YALI0F06578, YALI0F07535, YALI0F14729, YALI0F22121, YALI0F25003, YALI0E14720, YALI0B17512, ou um homólogo de qualquer um destes, e um gene exógeno que codifica uma acil graxo redutase funcional, operavelmente ligado a um promotor; e b) cultivar o organismo microbiano (por exemplo, a célula de Yarrowia) para permitir a produção de um derivado de acil-CoA graxo, em que as condições de cultivo incluem uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 40°C, um período de tempo de cerca de 16 a cerca de 120 horas, e um meio de cultura contendo açúcares fermentáveis obtidos a partir de uma matéria prima celulósica.

[00173] Em uma outra modalidade, o método anterior é modificado para incluir um meio de cultura contendo sacarose. Em algumas modalidades, em que o meio de cultura contém a sacarose, o organismo microbiano (por exemplo, a célula de Yarrowia) compreende adicionalmente um gene exógeno que codifica uma invertase (por exemplo, invertase de Saccharomyces cerevisiae SUC2).

[00174] Em algumas modalidades, o método de produzir derivados de acil-CoA graxo rende pelo menos 0,5 g/L de derivados de acil-CoA graxo da maneira descrita a seguir. Níveis de produção

[00175] Os métodos aqui descritos produzem derivados de acil-CoA graxo em rendimento elevado. As condições de cultivo de rotina, por exemplo, cultivo de levedura, tal como para Yarrowia lipolytica, pode render cerca de 0,5 g a cerca de 35 g derivados de acil-CoA graxo, por exemplo, alcoóis graxos, por litro de meio de cultura (por exemplo, meio nutriente), dependendo do(s) gene(s) interrompido(s). Em algumas modalidades, a quantidade de derivados de acil-CoA graxo, por exemplo, alcoóis graxos, produzida pelos métodos aqui descritos é pelo menos 0,5 g/L, pelo menos 1 g/L, pelo menos 1,5 g/L, pelo menos 2 g/L, pelo menos 2,5 g/L, pelo menos 3 g/L, pelo menos 3,5 g/L, pelo menos 4 g/L, pelo menos 4,5 g/L, pelo menos cerca de 5 g/L, ou pelo menos 10 g/L, pelo menos 20 g/L, pelo menos 30 g/L, pelo menos 40 g/L, ou pelo menos 50 g/L de meio de cultura.

[00176] Em algumas modalidades, a quantidade de derivados de acil- CoA graxo, por exemplo, alcoóis graxos, produzida pelos métodos aqui descritos é cerca de 40 mg/g a cerca de 1 g/g, cerca de 40 mg/g a cerca de 5 g/g, cerca de 100 mg/g a cerca de 1 g/g, cerca de 100 mg/g a cerca de 5 g/g, cerca de 500 mg/g a cerca de 2 g/g, cerca de 1 g/g a cerca de 4 g/g, ou cerca de 2 g/g a cerca de 3 g/g de peso seco de célula por modificação das condições de cultivo de rotina.

[00177] Em certas modalidades, a quantidade de derivados de acil-CoA graxo, por exemplo, alcoóis graxos, produzida pelos métodos aqui descritos é cerca de 4 % a cerca de 20 %, cerca de 10 % a cerca de 20 %, cerca de 20 % a cerca de 30 %, cerca de 30 % a cerca de 40 %, cerca de 40 % a cerca de 50 %, cerca de 50 % a cerca de 60 %, cerca de 60 % a cerca de 70 %, ou cerca de 70 % a cerca de 80 % peso seco de célula por modificação de condições de cultivo de rotina. Recuperação de derivados de acil-CoA graxo

[00178] Os métodos podem incluir adicionalmente uma etapa de recuperação, por exemplo, isolar os derivados de acil-CoA graxo para render as composições de derivado de acil-CoA graxo. A recuperação ou isolamento dos derivados produzidos de acil-CoA graxo referem-se à separação de pelo menos uma porção dos derivados de acil-CoA graxo dos outros componentes do meio de cultura ou processo de fermentação. Os protocolos adequados para recuperar ou isolar os derivados de acil-CoA graxo a partir de células hospedeiras recombinantes e/ou meio de cultura (por exemplo, destilação, cromatografia) são conhecidos pelos versados na técnica. Em certas modalidades, os derivados são purificados (por exemplo, substancialmente livres de compostos orgânicos sem ser o(s) derivado(s)). Os derivados podem ser purificados usando métodos de purificação bem conhecidos na técnica.

[00179] Em algumas modalidades, os microrganismos hospedeiros recombinantes secretam os derivados de acil-CoA graxo no meio nutriente. Neste caso, os derivados de acil-CoA graxo podem ser isolados por extração de solvente do meio nutriente aquoso com um solvente imiscível em água. A separação de fase após a remoção do solvente fornece o derivado de acil-CoA graxo, que pode então ser purificado adicionalmente e fracionado usando métodos e equipamentos conhecidos na técnica. Em outras modalidades, os derivados secretados de acil-CoA graxo coalescem para formar uma fase imiscível em água, que pode ser separada diretamente a partir do meio nutriente aquoso tanto durante a fermentação quanto após sua finalização.

[00180] Em algumas modalidades, os derivados de acil-CoA graxo, por exemplo, alcoóis graxos, são isolados separando as células do meio nutriente aquoso, por exemplo, por centrifugação, ressuspensão e extração dos derivados de acil-CoA graxo a partir das células hospedeiras recombinantes, usando um solvente orgânico ou mistura de solvente.

[00181] Em relação aos microrganismos hospedeiros que não secretam os derivados de acil-CoA graxo no meio nutriente, os derivados de acil-CoA graxo podem ser recuperados lisando primeiro as células para liberar os derivados de acil-CoA graxo, e extraindo os derivados de acil-CoA graxo a partir do lisado usando meio convencional. Ver Clontech Laboratories, Inc., 2009, Yeast Protocols Handbook, 100:9156-9161. X. DERIVADOS DE ACIL-COA GRAXO

[00182] Da maneira descrita anteriormente, os derivados de acil-CoA graxo incluem vários compostos produzidos de maneira enzimática por vias metabólicas celulares, da maneira mostrada na figura 1. A modificação genética das enzimas envolvidas nestas vias pode render preferivelmente os derivados particulares, por exemplo, alcoóis graxos. Ver seção 0 anterior. Adicionalmente, ou alternativamente, os derivados particulares de acil-CoA graxo podem ser quimicamente modificados (na cultura ou após a recuperação) para render um derivado diferente.

[00183] As composições de derivado de acil-CoA graxo podem incluir os derivados de acil-CoA graxo saturados (por exemplo, monoinsaturados), insaturados e ramificados, por exemplo, alcoóis graxos. Em algumas modalidades, a quantidade de derivados de acil-CoA graxo insaturados (por exemplo, alcoóis graxos) pode ser menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 20 %, menor que 10 %, menor que 5 %, ou menor que 1 % do total de composição de derivado de acil-CoA graxo. Em algumas modalidades, a quantidade de saturado derivados de acil-CoA graxo pode ser menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 20 %, menor que 10 %, menor que 5 %, ou menor que 1 % do total de composição de derivado de acil-CoA graxo. Em algumas modalidades, a quantidade de derivados de acil-CoA graxo ramificados pode ser menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 20 %, menor que 10 %, menor que 5 %, ou menor que 1 % do total de composição de derivado de acil-CoA graxo.

[00184] Em algumas modalidades, os derivados de acil-CoA graxo (por exemplo, alcoóis graxos, ésteres graxos, alcanos, alcenos, etc.) que apresentam um tamanho de cadeia de carbono de C8 a C20, C10 a C18, C14 a C18, ou C16 a C18 compreendem pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % em peso da composição total de derivado de acil-CoA graxo. Em algumas modalidades, os alcoóis graxos que apresentam um tamanho de cadeia de carbono de C8 a C20, C10 a C18, C14 a C18, ou C16 a C18 compreendem pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou pelo menos 99 % em peso de uma composição total de álcool graxo. Em algumas modalidades, os derivados de acil-CoA graxo (por exemplo, alcoóis graxos) apresentam um tamanho de cadeia de carbono de C16 a C18. Tais derivados de C16 a C18 de acil-CoA graxo, por exemplo, alcoóis graxos, podem ser saturados, insaturados ou uma mistura de derivados saturados e insaturados. Quando o derivado é um alcano ou alceno, observa-se que os alcanos e/ou alcenos que apresentam tamanhos de cadeia de carbono particulares podem ser isolados de alcanos e/ou alcenos mais longos e/ou mais curtos, por exemplo, por HPLC.

[00185] Em algumas modalidades, o derivado de acil-CoA graxo é um álcool graxo. O álcool graxo pode ser um ou mais de 1-octanol (C8:0), 1- decanol (C10:0), 1-dodecanol (C12:0), 1-tetradecanol (C14:0), 1-hexadecanol (C16:0), 1-octadecanol (C18:0), 1-icosanol (C20:0), 1-docosanol, 1- tetracosanol, hexadecenol (C16:1) e octadecenol (C18:1). Composições de alcano e/ou alceno

[00186] Em algumas modalidades, o derivado de acil-CoA graxo é um alcano e/ou alceno. Os alcanos e/ou alcenos podem ser isolados a partir da mistura de reação (que pode conter alcoóis graxos não reduzidos) para render uma composição que compreende substancialmente todos os alcanos e/ou alcenos. Alternativamente, os alcanos/alcenos e os alcoóis graxos não reduzidos podem ser isolados a partir da mistura de reação para render uma composição que compreende alcanos e/ou alcenos e alcoóis graxos. Em algumas modalidades, as composições de derivado de acil-CoA graxo compreendem pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % de alcanos e/ou alcenos em peso da composição após a redução.

[00187] Em algumas modalidades, o alcano é octano, decano, dodecano, tetradecano, hexadecano, octadecano, icosano, docosano, tetracosano ou misturas destes. Em algumas modalidades, o alceno é octeno, deceno, dodeceno, tetradeceno, hexadeceno, octadeceno, icoseno, docoseno, tetracoseno ou misturas destes.

[00188] Em algumas modalidades, os alcoóis graxos produzidos de acordo com os métodos aqui descritos podem ser reduzidos para render alcanos e/ou alcenos, os quais apresentam o mesmo tamanho de cadeia de carbono dos materiais de partida com álcool graxo. Sem ficar preso a nenhuma teoria particular, o grupo hidroxila de um álcool é um grupo abandonador fraco e, portanto, a princípio, uma fração química que se liga ao átomo de oxigênio do grupo hidroxila para torná-lo um melhor grupo de partida pode ser usada para reduzir os alcoóis graxos aqui descritos.

[00189] Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para reduzir os alcoóis graxos. Em algumas modalidades, a redução de alcoóis graxos pode ser realizada quimicamente, por exemplo, por uma desoxigenação de Barton (ou desoxigenação de Barton-McCombie), uma reação de duas etapas em que o álcool é primeiro convertido em um metil xantato ou tioimidazoil carbamato, e o xantato ou tioimidazoil carbamato é reduzido com um hidreto de estanho ou reagente de trialquilsilano, em condições radicais, para produzir o alcano e/ou alceno. Ver Li et al., 2007, Modern Organic Synthesis in the Laboratory, p. 81-83.

[00190] Em uma outra modalidade, os alcanos podem ser produzidos por hidrogenação de alcoóis graxos ou ácidos graxos. Composições de éster

[00191] Em outras modalidades, os alcoóis graxos são reagidos com um ácido carboxílico para formar ésteres de ácido. As reações de esterificação de alcoóis graxos são bem conhecidas na técnica. Em certas modalidades, a reação de transesterificação é realizada na presença de um catalisador forte, por exemplo, um alcalino forte tal como hidróxido de sódio. Em outras modalidades, uma reação de esterificação é realizada de maneira enzimática usando uma enzima que catalisa a conversão de alcoóis graxos em ésteres de ácido, tal como lipoproteína lipase. Ver, por exemplo, Tsujita et al., 1999, “Fatty Acid Alcohol Ester-Synthesizing Activity of Lipoprotein Lipase” J. Biochem. 126:1074-1079. XI. COMPOSIÇÕES EXEMPLARES QUE COMPREENDEM DERIVADOS DE ACIL-COA GRAXO

[00192] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito ao uso do organismos microbianos, da maneira aqui descrita, para a produção de várias composições incluindo, mas sem limitação, composições de combustível (por exemplo, biodieseis e petrodieseis), composições detergentes (por exemplo, detergentes de lavanderia na forma líquida ou em pó, agentes de limpeza de superfícies duras, líquidos para lavar louças e similares); composições industriais (por exemplo, lubrificantes, solventes e agentes de limpeza industrial); e composições de cuidado pessoal (por exemplo, sabonetes, cosméticos, xampus e géis). Composições de combustível

[00193] Em certas modalidades, as composições de derivado de acil- CoA graxo aqui descritas podem ser usadas como componentes de composições de combustíveis. Em certas modalidades, os derivados de acil- CoA graxo produzidos pelos métodos descritos anteriormente podem ser usados diretamente em composições de combustíveis. As composições de combustíveis que contêm derivados de acil-CoA graxo, produzidas pelos métodos da presente invenção, incluem qualquer das composições usadas em máquinas de combustão de energia incluindo, mas sem limitação, combustíveis de biodiesel e combustíveis de petrodiesel (por exemplo, combustíveis de aviação e combustíveis de foguete).

[00194] Em algumas modalidades, a composição do combustível é o combustível diesel. O diesel combustível é qualquer combustível usado nas máquinas de diesel e inclui tanto o petrodiesel quanto o biodiesel. O petrodiesel é um destilado fracional específico de óleo combustível fóssil. É compreendido de cerca de 75 % de hidrocarbonetos saturados e 25 % de hidrocarbonetos aromáticos. O biodiesel não é derivado do petróleo, mas de óleo vegetal ou gorduras animais, e contém ésteres de alquila de cadeia longa. O biodiesel é preparado a partir da transesterificação de lipídeos (por exemplo, óleo vegetal consumido a partir de óleos de frituras ou semente) com um álcool e queima mais limpo que o petrodiesel. O biodiesel pode ser usado sozinho ou misturado com petrodiesel em qualquer quantidade para uso em máquinas modernas.

[00195] Em algumas modalidades, a composição do combustível é querosene. Querosene é um hidrocarboneto combustível que é também um destilado fracional específico de fóssil combustível, e contém hidrocarbonetos que apresentam 6 a 16 átomos de carbono. Querosene apresenta um calor de combustão comparável àquele do petrodiesel, e é amplamente usado em combustível de aviação para ligar motores de avião e para aquecimento em certos países. Os combustíveis a base de querosene também podem ser queimados com oxigênio líquido e usados como combustível de foguete (por exemplo, RP-1).

[00196] Em modalidades particulares, os ésteres graxos são usados como componentes de composição de combustível biodiesel. Em várias modalidades, os ésteres de ácido graxo são usados como combustível biodiesel sem ser misturado com outros componentes. Em certas modalidades, os ésteres de ácido graxo são misturados com outros componentes, tal como combustível petrodiesel. Em outras modalidades, os alcanos e/ou alcenos (por exemplo, C10 a C14) são usados como componentes de composições de combustível de aviação. Em outras modalidades, os alcanos e/ou alcenos são usados como componentes de combustível de foguete. Ainda em outras modalidades, os alcanos e/ou alcenos (por exemplo, C16 a C24) são usados como componentes em composição de combustível do tipo petrodiesel.

[00197] Em algumas modalidades, a composições de combustível compreende um alcano e/ou alceno. Em certas modalidades, os alcanos e/ou alcenos apresentam de 6 a 16 carbonos, e a composição de combustível é uma composição de combustível do tipo querosene. Em várias modalidades, as composições de combustível do tipo querosene são incluídas nas composições de combustível de aviação. Em modalidades particulares, as composições de combustível do tipo querosene são incluídas em vários graus de combustível de aviação incluindo, mas sem limitação, graus Avtur, Jet A, Jet A-1, Jet B, JP-4, JP-5, JP-7 e JP-8. Em outras modalidades, as composições de combustível do tipo querosene são incluídas em composições de combustível para aquecimento. Ainda em outras modalidades, as composições de combustível do tipo querosene são queimadas com oxigênio líquido para fornecer combustível de foguete. Em modalidades particulares, as composições de combustível do tipo querosene são usadas em combustível de foguete RP-1.

[00198] Em algumas modalidades, os alcanos e/ou alcenos são usados em composições de combustível que são similares às composições de combustível petrodiesel, por exemplo, combustíveis que contêm hidrocarbonetos saturados e aromáticos. Em certas modalidades, as composições de combustível compreendem apenas alcanos e/ou alcenos. Em outras modalidades, as composições de combustível compreendem alcanos e/ou alcenos misturados com outros componentes, tal como o combustível petrodiesel.

[00199] Em certas modalidades, os alcoóis graxos, ésteres graxos, alcanos, e/ou alcenos são combinados com outros combustíveis ou aditivos de combustível para produzir composições que apresentam as propriedades desejadas para seu uso pretendido. Os combustíveis e aditivos de combustível exemplares para aplicações particulares são bem conhecidos na técnica. Os combustíveis exemplares que podem ser combinados com as composições aqui descritas incluem, mas sem limitação, combustíveis tradicionais tais como combustíveis a base de etanol e petróleo. Os aditivos de combustível exemplares que podem ser combinados com as composições aqui descritas incluem, mas sem limitação, aditivos com baixo ponto de nebulosidade, agentes tensoativos, antioxidantes, desativadores de metal, inibidores de corrosão, aditivos anti-congelamento, aditivos anti-desgaste, aditivos de modificação de depósito e melhoradores de octano. Composições detergentes

[00200] Em algumas modalidades, as composições de derivado de acil- CoA graxo aqui descritas, e os compostos derivados destas, pode ser usadas como componentes de composições de detergente. As composições de detergente contendo derivados de acil-CoA graxo, produzidas pelos métodos da presente invenção, incluem composições usadas em aplicações de limpeza incluindo, mas sem limitação, detergentes para lavar roupas, agentes de limpeza manual, detergentes para lavar louças, detergentes que auxiliam na lavagem, detergentes domésticos e limpadores domésticos, na forma líquida, em gel, granular, em pó ou tablete. Em algumas modalidades, os derivados de acil-CoA graxo (por exemplo, alcoóis graxos) produzidos pelos métodos descritos anteriormente podem ser usados diretamente em composições de detergente. Em algumas modalidades, os derivados de acil-CoA graxo (por exemplo, alcoóis graxos) podem ser reagidos com um grupo de ácido sulfônico para produzir derivados de sulfato, os quais podem ser usados como componentes de composições de detergente. As composições de detergente que podem ser geradas usando os derivados de acil-CoA graxo, produzidas pelos métodos da presente invenção, incluem, mas sem limitação, xampus e condicionadores para cabelo, xampus para tapete, limpadores domésticos e ação rápida, detergentes domésticos de ação rápida, limpadores domésticos de ação demorada e detergentes domésticos de ação demorada. As composições de detergente em geral incluem, além dos derivados de acil-CoA graxo, um ou mais ou dos agentes de construção (por exemplo, carbonato de sódio, agentes de complexação, sabão e zeolitas), enzimas (por exemplo, uma protease, uma lipase e uma amilase); carboximetil celulose, branqueadores óticos, amaciantes de tecido, corantes e perfumes (por exemplo, salicilato de cicloexila).

[00201] Em algumas modalidades, os derivados de sulfato (por exemplo, C12-15) oriundo dos derivados de acil-CoA graxo são usados em produtos tais como xampus para cabelo, xampus para tapete, limpadores domésticos de ação rápida e detergentes domésticos de ação rápida. Em algumas modalidades, os derivados de sulfato (por exemplo, C16-C18) oriundos dos derivados de acil-CoA graxo são usados em produtos tais como xampus e condicionadores de cabelo. Em algumas modalidades, os derivados de sulfato (por exemplo, C16-18) oriundos dos derivados de acil-CoA graxo são usados em produtos tais como limpadores domésticos de ação demorada e detergentes domésticos de ação demorada. Composições de cuidado pessoal

[00202] Em algumas modalidades, as composições de derivado de acil- CoA graxo da maneira aqui descrita, e os compostos derivados destas, podem ser usadas como componentes de composições de uso pessoal. Em algumas modalidades, os derivados de acil-CoA graxo produzidos pelos métodos descritos anteriormente podem ser usados diretamente em composições de uso pessoal. As composições de uso pessoal que contêm derivados de acil- CoA graxo, produzidas pelos métodos da presente invenção, incluem as composições usadas para aplicação no corpo (por exemplo, para aplicação na pele, cabelo, unhas, ou cavidade oral) com os propósitos de cuidar da aparência, limpar, embelezar, ou cuidar do corpo, incluindo, mas sem limitação, loções, emplastros, cremes, géis, soros, limpadores, tintas, máscaras, filtros solares, sabonetes, xampus, condicionadores, géis de banho, produtos de finalização e composições cosméticas (por exemplo, maquiagem na forma líquida, creme, sólida, anidra ou lápis). Em algumas modalidades, os derivados de acil-CoA graxo (por exemplo, alcoóis graxos) podem ser reagidos com um grupo de ácido sulfônico para produzir derivados de sulfato que podem ser usados como componentes das ditas composições.

[00203] Em algumas modalidades, as composições de derivado de acil- CoA graxo (por exemplo, C12) produzidas pelos métodos aqui descritos, são usadas em produtos tais como óleos lubrificantes, produtos farmacêuticos e como um emoliente em cosméticos. Em algumas modalidades, as composições de derivado de acil-CoA graxo (por exemplo, C14), produzidas pelos métodos aqui descritos, são usadas em produtos tais como cosméticos (por exemplo, cremes frios) xom suas propriedades emolientes. Em algumas modalidades, as composições de derivado de acil-CoA graxo (por exemplo, C16), produzidas pelos métodos aqui descritos, são usadas em produtos tais como cosméticos (por exemplo, cremes e loções de pele) como um emoliente, emulsificante, agente de espessamento. Em algumas modalidades, as composições de derivado de acil-CoA graxo (por exemplo, C18), produzidas pelos métodos aqui descritos, são usadas em produtos tais como lubrificantes, resinas, perfumes e cosméticos, por exemplo, como um emoliente, emulsificante ou agente de espessamento. Em algumas modalidades, os derivados de sulfato (por exemplo, C12-14), derivados a partir das composições de derivado de acil-CoA graxo, produzidas pelos métodos aqui descritos, são usados em produtos tais como pastas de dente. Outras composições

[00204] Em algumas modalidades, os derivados de acil-CoA graxo (por exemplo, alcoóis graxos, especialmente álcool cetílico, álcool estearílico e álcool miristílico) podem ser usados como aditivos alimentares (por exemplo, adjuvantes e auxiliares de produção). XII. EXEMPLOS

[00205] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada. Exemplo 1: Expressão de FAR de M. algicola DG893 tipo selvagem em cepas de Y. lipolytica

[00206] A FAR tipo selvagem de M. algicola (FAR_Maa) foi expressa nas cepas de Y. lipolytica. A sequência do códon otimizado do gene de FAR de M. algicola DG893 corresponde à SEQ ID NO:1, e a sequência de polipeptídeos correspondente é determinada SEQ ID NO:2. Um plasmídeo replicante autônomo, pCEN354, foi construído para a expressão do gene FAR de M. algicola DG893 FAR nas cepas de Y. lipolytica. O plasmídeo replicante foi geneticamente modificado com dois cassetes de marcador de seleção de antibiótico para resistência à higromicina e fleomicina (HygB(R) ou Ble(R), respectivamente). A expressão de cada cassete é regulada independentemente por um promotor forte e constitutivo, isolado de Y. lipolytica: pTEF1 para a expressão de Ble(R), e pRPS7 para a expressão de HygB(R). O plasmídeo pCEN354 foi usado para montar os plasmídeos de expressão Y. lipolytica. Usando a metodologia de “clonagem sem restrição”, o gene Ble(R) foi substituído pelo gene FAR de M. algicola DG893 para fornecer o plasmídeo pCEN411 (figura 2). Em pCEN411, a expressão do gene FAR está no controle do promotor constitutivo TEF1, e o gene HygB(R) permite a seleção em meios contendo higromicina. Ars18 é uma sequência replicante autônoma isolada do DNA genômico de Y. lipolytica. O plasmídeo resultante foi transformado em cepas de Y. lipolytica usando os método de transformação de rotina. Ver, por exemplo, Chen et al., 1997, “One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica” Appl Microbiol Biotechnol 48:232-235.

[00207] FAR também foi expresso integrando um cassete de expressão em um local específico no genoma de Y. lipolytica. Neste caso, o DNA a ser integrado continha um cassete de expressão de FAR de M. algicola FAR, e um segundo cassete de expressão que codificou resistência à higromicina. O DNA que codifica estes cassetes de expressão foi flanqueado em ambos os lados por DNA de ~1 kb de Y. lipolytica, que agiu para alvejar este DNA em um sítio intergênico específico no cromossomo E. Este sítio foi identificado como uma expressão do tipo “ponto agitado” por integração aleatória de um cassete de expressão FAR, seguido por mapeamento dos sítios de integração da maioria dos transformantes ativos. Os construtos de integração foram amplificados por PCR e transformados em Y. lipolytica usando métodos de transformação de rotina.

[00208] Por meio da integração aleatória de um cassete de expressão de FAR de M. algicola no genoma de Y. lipolytica, inúmeras cepas foram identificadas com melhores titulações de álcool graxo com relação às cepas com expressão de FAR a base de plasmídeo. Os locais de integração em cinco das melhores cepas integrantes aleatórias foram determinados usando o método de PCR “vetorete”. Em cada uma destas cepas, existem duas cópias do gene FAR tanto na estrutura de repetição direta quanto na invertida.

[00209] Uma cópia de um cassete de expressão de FAR de M. algicola FAR foi introduzido por integração alvejada tanto na fita positiva quanto na menor de um dos cinco pontos agitados identificados no genoma da cepa Y. lipolytica CY-201. O sítio de integração tFARi-1 estava localizado no cromossomo E entre 1433493 bp e 1433495 bp na fita negativa. O sítio de integração tFARi-2 estava localizado no cromossomo C entre 2526105 bp e 2526114 bp na fita positiva. O sítio de integração tFARi-3 estava localizado no cromossomo B entre 2431420 bp e 2431425 bp na fita positiva. O sítio de integração tFARi-4 estava localizado no cromossomo D entre 1669582 bp e 1669588 bp na fita positiva. O sítio de integração tFARi-5 estava localizado no cromossomo D entre 518746 bp e 518789 bp na fita positiva. O sítio de integração tFARi-6 estava localizado no cromossomo B entre 2431420 bp e 231425 bp na fita negativa. O sítio de integração tFARi-7 estava localizado no cromossomo D entre 1669582 bp e 1669588 bp na fita negativa. O sítio de integração tFARi-8 estava localizado no cromossomo D entre 518746 bp e 518789 bp na fita negativa. Exemplo 2: Atividade in vivo de FAR exógeno de M. algicola em cepas recombinantes de Y. lipolytica

[00210] Duas cepas de Y. lipolytica foram usadas para construir genes neutralizados: 1) Y. lipolytica DSMZ 1345, obtida do German Resource Centre for Biological Material (DSMZ), e 2) Y. lipolytica CY-201, um hospedeiro com melhor produção obtido por mutagênese por UV de Y. lipolytica DSMZ 1345 e deficiente em crescimento nos meios com hexadecano como a única fonte de carbono. Quando transformada com pCEN411, Y. lipolytica CY-201 produziu 7 a 10 vezes mais alcoóis graxos comparada à Y. lipolytica DSMZ 1345, e também reduziu significativamente a taxa de degradação de 1-hexadecanol exógeno em meios YPD contendo 8 % de glicose e 500 μg/mL de higromicina. A expressão de genes FAR alternativos e variantes em cepas modificadas de Y. lipolytica pode ser avaliada usando metodologia similar. Exemplo 3: Análise da produção de álcool graxo em cepas de Y. lipolytica contendo FAR exógeno

[00211] As cepas de Y. lipolytica que compreendem um plasmídeo contendo um gene exógeno, que codifica FAR de M. algicola DG893, foram crescidas em placas de 96 poços da Axygen contendo 250 μL de YPD suplementado com 2 % de glicose e 500 μg/mL de higromicina. As placas foram incubadas em uma incubadora com agitação Kuhner por aproximadamente 40-48 horas a 30°C, 200 rpm e 85 % de umidade relativa. As culturas de células foram diluídas transferindo 50 μL de culturas crescidas por toda a noite nas placas de 96 poço da Axygen, contendo 250 μL de YPD suplementado com 2 % de glicose e 500 μg/mL de higromicina. As placas foram incubadas por aproximadamente 24-28 horas em uma incubadora com agitação Kuhner nas mesmas condições. 20 μL das culturas de células foram transferidos para as placas de 96 poços profundos contendo 380 μL de YPD, suplementado com 8 % de glicose e 500 μg/mL de higromicina. As placas foram incubadas por aproximadamente 22-26 horas nas mesmas condições. As células foram coletadas por centrifugação por 10 minutos a 3.500 rpm. Os precipitados celulares foram ressuspensos em 400 μL de meios de limitação de nitrogênio (1,7 g/L de base de nitrogênio para levedura, 1,4 g/L de (NH4)2SO4, 30 g/L de glicose), contendo 500 μg/mL de higromicina, e foram incubados por 22-26 horas em uma incubadora com agitação Kuhner a 30°C, 200 rpm e 85 % de umidade relativa. As culturas de células foram extraídas com 1 mL de isopropanol:hexano (razão de 4:6) por 2 horas. Os extratos foram centrifugados, e a fase orgânica superior foi transferida para placas de 96 poços de polipropileno. As amostras foram analisadas usando o método GC-FID a seguir.

[00212] Uma amostra de 1μL foi analisada por GC-FID com uma razão de separação de 1:10 usando as seguintes condições: GC-6890N da Agilent Technologies equipado com detecção FID e coluna HP-5 (tamanho 30 m, I.D. 0,32 mm, filme 0,25 um). Método GC: início a 100°C, aumento da temperatura com uma taxa de 25°C/min para 246°C, e esta foi mantida por 1,96 min. O tempo de corrida total, 7,8 minutos. Nas composições GC anteriores, os tempos de retenção aproximados (minutos) dos alcoóis e ácidos graxos produzidos são da maneira a seguir: 5,74, C16:1-OH; 5,93, C16:0-OH; 6,11, C16:0-OOMe (padrão interno); 6,16, C16:1-OOH; 6,29, C16:0-OOH; 6,80, C18:1-OH; 6,90, C18:0-OH; 7,3, C18:0- e C18:1-OOH. A identificação de alcoóis graxos individuais foi realizada por comparação com os padrões comerciais (Sigma Chemical Company). Nas condições testadas, a expressão de FAR de M. algicola DG893 nas cepas parentais de Y. lipolytica DSMZ 1345 e CY-201 resultou em produção de 5-20 mg/L e 100-200 mg/L de alcoóis graxos, respectivamente. Os alcoóis graxos foram produzidos: 70-80 % de C16:0 (1-hexadecanol), 10-15 % de 18:0 (1-octadecanol) e 10-15 % de C18:1 (cis Δ9-1-octadecenol). Exemplo 4: Identificação de genes alvos de Y. lipolytica para interrupção

[00213] Os genes selecionados para a interrupção foram identificados de várias maneiras. Alguns genes foram selecionados com base em seus papéis nas vias para assimilação de hidrocarboneto em levedura que utiliza alcano. Em decorrência do acil-CoA graxo ser um intermediário nestas vias, que resultam da oxidação de alcanos, a estabilidade de derivados de acil-CoA graxo pode ser melhorada interrompendo os genes responsáveis pela utilização de alcano. Outros genes para a interrupção foram selecionados com base em sua homologia com tais genes. Estes incluem genes cuja sequência determinava que eles poderiam funcionar como álcool desidrogenases ou aciltransferases envolvidas na biossíntese de lipídeo.

[00214] Os genes adicionais para interrupção incluem aqueles que codificam proteínas envolvidas na importação de proteínas recentemente sintetizadas no retículo endoplasmático. Estas incluem as subunidades do canal que conduz proteína trimérica (Sec61, Ssh1, Sbh1, e Sss1), o complexo tetramérico Sec62/Sec63 (Sec62, Sec63, Sec66, e Sec72), e outras proteínas encontradas no retículo endoplasmática (Kar2 e Sls1) (Boisrame A. et al., “Interaction of Kar2p and Sls1p IS Required for Efficient Co-translational Translocation of Secreted Proteins in the yeast Yarrowia lipolytica,” J. Biol. Chem. (1998) 273: 30903).

[00215] Outros genes para interrupção foram identificados por comparação da expressão global de gene em meios a base de glicose e glicerol. Em particular, os genes cuja expressão é reprimida por glicerol foram selecionados, uma vez que a utilização de alcano é reprimida em meios contendo glicerol. Os genes reprimidos por glicerol foram identificados por análise de microarranjo, usando RNA preparado a partir de Y. lipolytica DSMZ 1345 cultivada tanto em meio rico quanto em meio com acúmulo de lipídeo. Exemplo 5: Construção e análise de cepas que apresentam genes interrompidos

[00216] As cepas neutralizadas podem ser construídas transformando Y. lipolytica com um construto de DNA, determinado para substituir a maioria ou todo o quadro aberto de leitura de interesse por um marcador selecionável por recombinação homóloga. Como tal, os construtos de DNA podem compreender um marcador selecionável flanqueado por sequências de ~1 kb imediatamente à montante e à jusante do gene de interesse, as quais são necessárias para que a recombinação homóloga ocorra. Estes construtos de DNA estão contidos em plasmídeos montados usando métodos padrões para a construção de plasmídeo. Para a transformação, o construto de DNA de interesse é amplificado a partir do plasmídeo correspondente usando PCR para gerar ~1 μg de DNA linear. Este DNA é transformado em Y. lipolytica usando o método descrito em Madzak et al., 2003, “Yarrowia lipolytica.” Em Gellissen, ed. Production of Recombinant Proteins Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, p. 163-189. As cepas em que o gene de interesse é substituído pelo marcador selecionável são identificadas por sua capacidade de crescer em meios seletivos, e por genotipagem com PCR. Os marcadores seletivos típicos são familiares aos versados na técnica (ver, por exemplo, Fickers et al., 2003, “New interruption cassettes for rapid gene interruption and marker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica” Journal of Microbiological Methods 55:727-737).

[00217] Em uma segunda etapa, o marcador selecionável é excisado do cromossomo usando métodos que são familiares aos versados na técnica. Ver, por exemplo, Fickers et al., supra; Akada et al., 2006, “PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae” Yeast 23:399-405; Fonzi et al., 1993, “Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans” Genetics 134:717-728. As cepas com marcadores excisados podem ser identificadas facilmente por crescimento em meios de contra-seleção se o marcador selecionável usado for bifuncional, isto é, se codificar uma enzima cujo(s) produto(s) é(são) essencial(s) para o crescimento em meios de seleção positivos, e tóxicos em um outro meio de seleção. Tais marcadores bifuncionais são familiares aos versados na técnica.

[00218] Para a construção de cepas com múltiplas interrupções de genes, Y. lipolytica pode ser transformada sequencialmente com uma série de construtos de DNA determinados para neutralizar os genes de interesse. Cada transformação pode ser realizada pelo método descrito anteriormente, de maneira tal que o marcador selecionável seja excisado após cada etapa de interrupção. Assim, qualquer combinação de neutralizados pode ser criada em uma dada cepa usando a coleção de plasmídeos que carregam construtos de DNA descritos anteriormente. Exemplo 6: Análise da produção de álcool graxo em cepas modificadas de Y. lipolytica

[00219] Uma coleção de ~233 cepas que compreendem cepas com interrupções de único gene, e cepas com interrupções de 2 ou mais genes, foi criada tanto para ambas as cepas anteriores DSMZ1345 e CY-201. Estas cepas foram transformadas com o plasmídeo pCEN411 para a expressão de FAR de M. algicola DG893 tipo selvagem (ver figura 2), e foram selecionadas com relação à produção de álcool graxo da maneira descrita anteriormente. As tabelas 3 e 4 a seguir fornecem a produção relativa de álcool graxo para a interrupção alvejada de gene das cepas Y. lipolytica DSMZ 1345 e CY-201, as quais expressam o gene FAR de M. algicola DG893 tipo selvagem, com relação à cepa correspondente de Y. lipolytica sem nenhuma eliminação de gene alvejado e que expressa o gene FAR de M. algicola DG893 tipo selvagem. Os alcoóis graxos produzidos foram: 70-80 % de C16:0 (1-hexadecanol), 10-15 % de 18:0 (1-octadecanol), e 10-15 % de C18:1 (cis Δ9-1-octadecenol).

+ = melhoria de 0,0 a 0,99 vez Exemplo 7: Produção de álcool graxo na fermentação com uma cepa modificada de Y. lipolytica

[00220] Um derivado da cepa de CY-201 que compreende as eliminações de YALI0E11099g, YALI0E28336g, YALI0C17545, e YALI0E14729 e que carrega duas cópias integradas de M. algicola FAR (“o cepa CY-202”) foi usado para produzir álcool graxo em um fermentador em tanque agitado. A fermentação seguiu um protocolo de dois estágios, em que as células são propagadas em um meio nutriente rico e a seguir são transferidas para um meio nutriente limitado para a produção de álcool graxo. Em relação ao primeiro estágio, um cultivo de inoculação foi preparado crescendo a cepa CY-202 em meio YPD (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona, 20 g/L de dextrose) em um frasco de agitação com ranhuras no fundo a 30 °C por 24 horas. Esta cultura foi usada para inocular um fermentador contendo 10 L de meio de propagação (6,7 g/L de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 20,9 g/L de tampão Bis Tris, 80 g/L de glicose, 10 g/L de milhocina, e 0,22 mL/L de anti-espuma (uma mistura 1:1 de poli(propileno glicol) e anti-espuma B), ajustada em pH 6,5 com KOH. Esta cultura de propagação foi crescida a 30°C em um processo em lotes com taxa de transferência de oxigênio controlada (15-20 mM O2/hora), em uma OD600 final de 12-18. Em relação ao segundo estágio, as células em meio de propagação foram coletadas por centrifugação, a seguir foram ressuspensas em 1,1L de meio de produção de álcool graxo (200 g/L de glicose, 1 g/L de KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4. 2,5 mg/L de MgSO4*7H20 1 mg/L de FeSO4*7H20, 0,5 mg/L de H3BO3, 0,5 mg/L de MnSO4-H20, 0,5 mg/L de Na2MoO4-2H20, 0,5 mg/L de ZnSO4*7H20, 0,5 mg/L de CoCl2*H20, 0,1 mg/L de KI, 0,1 mg/L de CuCl2*2H20, 50 mg/L de tiamina HCl, e 50 mg/L de inositol e 0,8 mL/L de anti-espuma). O volume da ressuspensão celular foi ajustado para fornecer uma densidade celular inicial para o segundo estágio de 20 g/L (peso seco de célula), a seguir a ressuspensão foi colocada em um fermentador de tanque agitado. A fermentação foi realizada em um processo em lotes a 30° C com controle de oxigênio dissolvido (30 % de dO2). O pH foi controlado em 3,5 pela adição de KOH. A glicose foi adicionada da maneira necessária para prevenir a exaustão da glicose (35 g/L com o desenvolvimento da fermentação).

[00221] As amostras foram coletadas em 24 horas, 48 horas e 72 horas após a inoculação da cultura no estágio de produção. A titulação de álcool graxo foi analisada por GC-FID, essencialmente da maneira descrita no exemplo 3. Após 24 horas, uma titulação de álcool graxo 9 g/L foi observada. Após 48 horas, uma titulação de álcool graxo de 16 g/L foi observada. Após 72 horas, uma titulação de álcool graxo de 21 g/L foi observada. Exemplo 8: Eliminação parcial de gene Sec62

[00222] As cepas com uma eliminação parcial do gene Sec62 (YALI0B17512g; SEQ ID NO:54) foram construídas transformando Y. lipolytica com um construto de DNA determinado (1) para mutar o códon Trp235 em um códon de parada e (2) para substituir os códons 236-396 por um marcador selecionável por recombinação homóloga. Trinta nucleotídeos da região não traduzida 3' imediatamente após a sequência codificante de Sec62 também foram eliminados. Esta eliminação parcial corresponde a uma eliminação do domínio citoplasmático de Sec62, que começa imediatamente após o domínio transmembrana previsto em Leu206, e continua na extremidade da proteína em Glu396. Da maneira mostrada na tabela 3, esta cepa (identificada na tabela como “B17512”) forneceu uma produção ~10 vezes maior de álcool graxo com relação à cepa DSMZ 1345 correspondente, sem uma eliminação parcial do gene Sec62.

[00223] Três outras eliminações parciais do gene Sec62 (YALI0B17512g) foram realizadas transformando Y. lipolytica com um construto de DNA que (1) mutou tanto o códon que codifica Glu267, o códon que codifica Ala302, quanto o códon que codifica Ile337 em um códon de parada e (2) substituiu os códons subsequentes por um marcador selecionável usando recombinação homóloga. Estas cepas forneceram uma produção ~1,5 a 2 vezes maior de álcool graxo com relação à cepa DSMZ 1345 correspondente sem uma eliminação parcial do gene Sec62.

[00224] Os métodos usados para a construção e transformação de DNA são descritos no exemplo 4 e são familiares aos versados na técnica. Resumidamente, o construto de DNA transformante compreendia um marcador selecionável bifuncional, flanqueado por ~1 kb de sequências genômicas imediatamente à montante e à jusante dos nucleotídeos a serem eliminados. Após a transformação, as cepas com a modificação desejada foram selecionadas pelo crescimento em meios seletivos positivos. O marcador selecionável foi então excisado do genoma, e as cepas que apresentaram a perda do marcador foram identificadas por crescimento em meios de contra-seleção. A genotipagem por PCR foi usada para confirmar que as cepas apresentavam a modificação desejada.

[00225] Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritos são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à luz destes serão sugeridas pelos versados na técnica, e devem ser incluídas no espírito e competência deste pedido e escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporados pela referência na sua íntegra e com todos os propósitos.

Claims (13)

1. Organismo microbiano, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes endógenos são interrompidos, em que o gene endógeno é YAL1OC17545 ou um homólogo deste, e/ou YAL1OE28336 ou um homólogo deste, e que compreende um gene exógeno que codifica uma proteína acil graxo redutase (FAR) operavelmente ligado a um promotor, em que o dito organismo microbiano é uma alga, uma bactéria ou uma levedura.

2. Organismo microbiano de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais do gene endógeno YAL1OE11099 ou um homólogo deste, e o gene endógeno YAL1OE28534 ou um homólogo deste, é interrompido.

3. Organismo microbiano de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais genes endógenos selecionados a partir de YALI0B10406, YALI0A19536, YALI0E32769, YALI0E30283, YALI0E12463, YALI0E17787, YALI0B14014, YALI0A10769, YALI0A15147, YALI0A16379, YALI0A20944, YALI0B07755, YALI0B10175, YALI0B13838, YALI0C02387, YALI0C05511, YALI0D01738, YALI0D02167, YALI0D04246, YALI0D05291, YALI0D07986, YALI0D10417, YALI0D14366, YALI0D25630, YALI0E03212, YALI0E07810, YALI0E12859, YALI0E14322, YALI0E15378, YALI0E15400, YALI0E18502, YALI0E18568, YALI0E22781, YALI0E25982, YALI0E28314, YALI0E32417, YALI0F01320, YALI0F06578, YALI0F07535, YALI0F14729, YALI0F22121, YALI0F25003, YALI0E14729, YALI0B17512, e homólogos dos mesmos, interrompidos.

4. Organismo microbiano de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o gene endógeno YAL1OB17512 é interrompido.

5. Organismo microbiano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um segundo gene exógeno que codifica um ácido graxo sintase (FAS), um éster sintase, uma acil-ACP tioesterase (TE), um acil-CoA graxo sintase (FACS), um acetil-CoA carboxilase (ACC), uma xilose isomerase, ou uma invertase.

6. Organismo microbiano de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes endógenos são interrompidos e compreende um gene exógeno que codifica uma proteína funcional de acil redutase graxos (FAR) operacionalmente ligada a um promotor, em que um ou mais genes endógenos são selecionados a partir de: (a) YALI0G17545 e YALI0E28336; (b) YALI0G17545 e YALI0B10406; (c) YALI0G17545 e YALI0E28534; (d) YALI0G17545 e YALI0E30283; (e) YALI0E28336 e YALI0E30283; (f) YALI0E11099 e YALI0E30283; (g) YALI0A19536 e YALI0E30283; (h) YALI0A19536 e YALI0E28534; (i) YALI0E30283 e YALI0E12463; (j) YALI0B10406 e YALI0E14729; (k) YALI0C17545 e YALI0E14729; (l) YALI0E11099 e YALI0E14729; (m) YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E11099; (n) YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0B10406; (o) YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0A19536; (p) YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E28534; (q) YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E32769; (r) YALI0C17545, YALI0E28336 e YALI0E12463; (s) YALI0C17545, YALI0E11099 e YALI0B10406; (t) YALI0C17545, YALI0B10406 e YALI0A19536; (u) YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0B10406; (v) YALI0E11099, YALI0B10406 e YALI0A19536; (w) YALI0C17545, YALI0E28534 e YALI0B17512; (x) YALI0E11099, YALI0A19536, YALI0B10406 e YALI0B17512; (y) YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0B10406; (z) YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0A19536; (aa) YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0E28534; (bb) YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E11099 e YALI0E32769; (cc) YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0B10406 e YALI0A19536; (dd) YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0B10406 e YAL1I0E32769; (ee) YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0A19536 e YALI0E28534; (ff) YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E28534 e YALI0E32769; (gg) YALI0C17545, YALI0E28336, YALI0E28534 e YALI0E12463; (hh) YALI0E28336, YALI0E11099, YALI0B10406 e YALI0E32769; e (ii) YALI0E11099, YALI0E28336, YALI0G17545 e YALI0E14729.

7. Organismo microbiano de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que um ou mais genes endógenos é interrompido em que o gene endógeno é selecionado a partir de YALI0G17545 YALI0F25003, YALI0E14729, YALI0B17512, e homólogos dos mesmos.

8. Organismo microbiano de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o gene endógeno YAL10B17512, ou homólogo do mesmo, é interrompido, e em que YAL10B17512 opcionalmente codifica um polipeptídeo que compreende um domínio citoplasmático, e em que a interrupção compreende uma eliminação de pelo menos uma porção do domínio citoplasmático.

9. Método de produzir um derivado de acil-CoA graxo, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivar o organismo microbiano como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 em condições nas quais o derivado de acil-CoA graxo é produzido.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o derivado de acil-CoA graxo é um álcool graxo, ácido graxo, aldeído graxo, éster graxo, acetato graxo, éster de cera, alcano ou alceno.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o derivado de acil-CoA graxo é um álcool graxo.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar uma biomassa contendo celulose com uma ou mais celulases para produzir açúcares fermentáveis; e contatar o referido organismo microbiano com os açúcares fermentáveis sob condições em que o derivado de acil-CoA graxo é produzido.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os açúcares fermentáveis compreendem sacarose.

Images