BR112016012371B1

BR112016012371B1 - Célula bacteriana recombinante para a produção de uma amina graxa, cultura de células e método de produção de uma amina graxa

Info

Publication number: BR112016012371B1
Application number: BR112016012371-9A
Authority: BR
Inventors: Stephen B. Del Cardayre; Louis G. Hom
Original assignee: Genomatica, Inc
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2023-03-28
Also published as: ES2772774T3; US20190032097A1; WO2015085271A1; JP2016538870A; BR122020001956B1; BR112016012371A2; MY180645A; KR20210134820A; US11814660B2; US20210164002A1; JP7152365B2; CA2932017A1; AU2014360086B2; JP6553610B2; EP3077526B1; MX2016007054A; EP4163383A1; US10900057B2; KR102321813B1; EP3647430B1

Abstract

PRODUÇÃO MICROBIAL DE AMINAS GRAXAS. A presente invenção refere-se a microrganismos recombinantes para a produção de aminas graxas e os seus derivados. Ainda são contempladas as células hospedeiras recombinantes em cultura, bem como métodos de produção de aminas graxas empregando estas células hospedeiras.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/912.184 depositado em 5 de dezembro de 2013, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a microrganismos recombinantes para a produção de aminas graxas e os seus derivados. Adicionalmente são contempladas células hospedeiras recombinantes que expressam proteínas biossintéticas que convertem aldeídos graxos em aminas graxas in vivo. Ainda estão abrangidos métodos de produção de aminas graxas empregando as células hospedeiras que expressam estas proteínas biossintéticas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Aminas graxas são derivados nitrogenados de ácidos graxos, olefinas ou álcoois. Elas são feitas a partir de gorduras e óleos naturais ou a partir de matérias primas sintéticas ou petroquímicas. Hoje em dia, estes compostos são produzidos principalmente através da modificação química de triglicerídeos, tais como óleos de sebo ou de vegetais (por exemplo, óleo de coco, de canola, e de colza).

[004] Aminas graxas comercialmente disponíveis são feitas de uma mistura de cadeias de carbono ou uma cadeia de comprimento específico que varia de C8 a C22. De um modo geral, elas são classificadas em aminas primárias, secundárias e terciárias dependendo do número de átomos de hidrogênio de uma molécula de amônia substituídos por grupos alquila ou metila graxos. Aminas graxas são conhecidas por serem compostos de superfície ativa catiônica que aderem fortemente a superfícies tanto através de ligação química quanto física. Muitos produtos comerciais são preparados utilizando aminas graxas como intermediários reativos. Por exemplo, elas são úteis como tensoativos e como componentes de produtos de cuidados pessoais, tais como shampoos e condicionadores. O maior mercado para aminas graxas está na fabricação de amaciantes e detergentes. Aminas graxas também são utilizadas como agentes umectantes e espumantes, agente anti-estático na indústria têxtil e de plásticos, lubrificantes, espessantes de tintas, produtos químicos no campo petrolífero, emulsionantes de asfalto, aditivos de petróleo, inibidores de corrosão, aditivos de gasolina e de combustível, agentes de flotação, agentes de pigmento umectantes, agentes de cura epóxi, herbicidas e outros (veja Visek K. (2003) Aminas graxas; Kirk-Othmer Enciclopédia de Tecnologia química).

[005] A produção de aminas graxas através de fermentação microbiana fornece uma série de vantagens, tais como o fornecimento de uma composição mais consistente, fabricação a um custo inferior, e redução do impacto ambiental. Além disso, ela geraria diversas novas matérias- primas que estão além das gorduras e óleos naturais e matérias primas sintéticas ou petroquímicas utilizadas hoje em dia. Não há atualmente nenhum método eficiente para a produção microbiana de aminas graxas. A presente invenção refere-se a esta necessidade.

SUMÁRIO

[006] Um aspecto da presente invenção fornece um microrganismo recombinante para a produção de uma amina graxa, incluindo uma via metabólica manipulada para a conversão de um aldeído graxo para uma amina graxa. Aqui, o microrganismo recombinante tem uma via metabólica manipulada para a conversão de um aldeído graxo para uma amina graxa que inclui uma enzima biossintética exógena que tem atividade de aminodesidrogenase ou aminotransferase. Em uma forma de realização, a enzima biossintética exógena é uma aminotransferase putrescina como YgjG. Em uma outra forma de realização, a enzima biossintética exógena é uma aminotransferase GABA, tais como PuuE. YgjG é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene ygjG que é expresso no microrganismo recombinante ou em uma célula microbiana recombinante. Similarmente, PuuE é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene puuE que é expresso no microrganismo recombinante ou em uma célula microbiana recombinante. Em uma outra forma de realização, a enzima biossintética exógena é uma aminodesidrogenase, tal como ametilamina desidrogenase de Paracoccus denitrificans. O microrganismo recombinante ou a célula microbiana recombinante produz a amina graxa in vivo ou no interior da célula. A amina graxa é liberada em um meio de cultura pelo microrganismo recombinante ou pela célula microbiana recombinante. Em uma forma de realização, o microrganismo recombinante ou a célula microbiana é uma célula bacteriana recombinante.

[007] Outro aspecto da presente invenção fornece um microrganismo recombinante para a produção de uma amina graxa que inclui uma primeira via metabólica manipulada para a conversão de um aldeído graxo para uma amina graxa. O microrganismo recombinante tem uma primeira via metabólica manipulada para a conversão de um aldeído graxo para uma amina graxa que inclui uma enzima biossintética exógena que tem atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase (supra). Em uma forma de realização, o microrganismo recombinante tem uma outra ou segunda via metabólica manipulada para a conversão de um acil-ACP ou um acil-CoA para um ácido graxo. A segunda via metabólica manipulada é opcional. Aqui, o acil-ACP ou acil-CoA é convertido a um ácido graxo por uma enzima biossintética tendo atividade tioesterase. Em uma forma de realização, a enzima biossintética tendo atividade tioesterase é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene tesA que é expresso no microrganismo recombinante ou em uma célula microbiana. O microrganismo recombinante ou a célula microbiana recombinante produz a amina graxa in vivo ou no interior da célula. A amina graxa é liberada em um meio de cultura pelo microrganismo recombinante ou pela célula microbiana recombinante. Em uma forma de realização, o microrganismo recombinante ou a célula microbiana é uma célula bacteriana recombinante.

[008] Outro aspecto da presente invenção fornece um microrganismo recombinante para a produção de uma amina graxa que inclui uma primeira via metabólica manipulada para a conversão de um aldeído graxo para uma amina graxa. O microrganismo recombinante tem uma primeira via metabólica manipulada para a conversão de um aldeído graxo para uma amina graxa que inclui uma enzima biossintética exógena que tem atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase (supra). Em uma forma de realização, o microrganismo recombinante tem uma outra ou segunda via metabólica manipulada para a conversão de um acil-ACP ou um acil-CoA para um ácido graxo (supra). Em uma outra forma de realização, o microrganismo recombinante tem ainda uma outra ou terceira via metabólica manipulada para a conversão de um ácido graxo para um aldeído graxo. Esta terceira via metabólica manipulada é opcional e independente da segunda via metabólica manipulada. Aqui, o ácido graxo é convertido a um aldeído graxo por uma enzima biossintética tendo atividade de ácido carboxílico redutase (CAR). Em uma forma de realização, a enzima biossintética tendo atividade CAR é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene carB que é expresso no microrganismo recombinante ou em uma célula microbiana. O microrganismo recombinante ou a célula microbiana recombinante produz a amina graxa in vivo ou no interior da célula. A amina graxa é liberada em um meio de cultura pelo microrganismo recombinante ou pela célula microbiana recombinante. Em uma forma de realização, o microrganismo recombinante ou a célula microbiana é uma célula bacteriana recombinante.

[009] Outro aspecto da presente invenção fornece uma célula bacteriana recombinante para a produção de uma amina graxa que inclui um ou mais genes expressos que codificam uma enzima biossintética exógena tendo atividade de tioesterase; um ou mais genes expressos que codificam uma enzima biossintética exógena tendo atividade de ácido carboxílico redutase; e um ou mais genes expressos que codificam uma enzima biossintética exógena tendo uma atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase, em que a célula bacteriana recombinante produz uma amina graxa in vivo ou no interior da célula bacteriana. A amina graxa é liberada em um meio de cultura pela célula bacteriana recombinante. Aqui, a enzima biossintética exógena tendo atividade de tioesterase converte um acil-ACP ou acil-CoA em um ácido graxo. A enzima biossintética exógena tendo atividade de ácido carboxílico redutase (CAR) converte o ácido graxo em um aldeído graxo. A enzima biossintética exógena tendo atividade de aminotransferase ou aminodesidrogenase converte o aldeído graxo em uma amina graxa. Em uma forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade de tioesterase é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene tesA. Em outra forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade de CAR é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene carB. Em ainda outra forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade aminotransferase é uma aminotransferase putrescina, tal como YgjG, ou uma aminotransferase GABA, tal como PuuE. YgjG é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene ygjG. PuuE é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene puuE. Em ainda outra forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade de aminodesidrogenase é uma metilamina desidrogenase, tal como uma metilamina desidrogenase de Paracoccus denitrificans.

[0010] Outro aspecto da presente invenção fornece uma célula bacteriana recombinante para a produção de uma amina graxa que inclui um ou mais genes expressos que codificam uma enzima biossintética exógena tendo atividade de tioesterase para converter um acil-ACP ou um acil-CoA em um ácido gordo; um ou mais genes expressos que codificam uma enzima biossintética exógena tendo atividade ácido carboxílico redutase (CAR) para converter o ácido graxo em um aldeído graxo; e um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética exógena tendo atividade de aminotransferase ou aminodesidrogenase para converter o aldeído graxo em uma amina graxa, em que a célula bacteriana recombinante produz a amina graxa in vivo ou no interior da célula. Em uma forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase é uma aminotransferase putrescina, tal como YgjG. Em uma outra forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase é uma aminotransferase GABA, tal como PuuE. YgjG é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene ygjG que é expresso na célula bacteriana recombinante. Da mesma forma, PuuE é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene puuE que é expresso na célula bacteriana recombinante. Em uma outra forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase é uma aminodesidrogenase, tal como metilamina desidrogenase de Paracoccus denitrificans. Em uma forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade de tioesterase é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene tesA. Em outra forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade CAR é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene carB. A célula bacteriana recombinante produz a amina graxa in vivo ou no interior da célula. A amina graxa é liberada em um meio de cultura pela célula bacteriana recombinante.

[0011] A presente invenção contempla ainda uma célula bacteriana recombinante para a produção de uma amina graxa que inclui uma primeira via manipulada para a conversão de um acil-ACP ou um acil-CoA em um ácido graxo; uma segunda via metabólica manipulada para converter o ácido graxo em um aldeído graxo; e uma terceira via metabólica manipulada para converter o aldeído graxo em uma amina graxa, em que a célula bacteriana recombinante produz a amina graxa in vivo ou no interior da célula. Em uma forma de realização, o acil-ACP ou o acil-CoA é convertido em um ácido graxo por uma enzima biossintética expressa de forma exógena tendo atividade tioesterase; o ácido graxo é convertido em um aldeído graxo por uma enzima biossintética expressa de forma exógena tendo atividade de ácido carboxílico redutase (CAR); e o aldeído graxo é convertido em uma amina graxa por uma enzima biossintética expressa de forma exógena tendo atividade de aminotransferase ou aminodesidrogenase. Em uma forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase é uma aminotransferase putrescina, tal como YgjG. Em uma outra forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase é uma aminotransferase GABA, tal como PuuE. YgjG é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene ygjG que é expresso na célula bacteriana recombinante. Da mesma forma, PuuE é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene puuE que é expresso na célula bacteriana recombinante. Em uma outra forma de realização a enzima biossintética exógena tendo atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase é uma metilamina de Paracoccus denitrificans. Em uma forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade de tioesterase é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene tesA. Em outra forma de realização, a enzima biossintética exógena tendo atividade de CAR é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene carB. A célula bacteriana recombinante produz a amina graxa in vivo ou no interior da célula. A amina graxa é liberada em um meio de cultura pela célula bacteriana recombinante.

[0012] Outro aspecto da presente invenção fornece um microrganismo recombinante para a produção de uma amina graxa, incluindo mas não se limitando a, Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia, e Streptomyces. Em uma forma de realização, Escherichia é Escherichia coZi. Em uma outra forma de realização, Cyanophyta inclui, mas não está limitado a Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cyanothece e Nostoc punctiforme. Em ainda outra forma de realização, Cyanophyta inclui, mas não está limitado a Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7001.

[0013] Outro aspecto da presente invenção fornece um método de produção de uma amina graxa compreendendo a cultura de um microrganismo recombinante em um caldo de fermentação contendo uma fonte de carbono. O microrganismo abrange pelo menos uma via metabólica manipulada para a produção de uma amina graxa in vivo (supra). Outro aspecto da presente invenção fornece um método de produção de uma amina graxa em uma célula bacteriana recombinante incluindo a cultura de uma célula que expressa uma via metabólica manipulada para a produção de uma amina graxa (supra) em um caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono; e colheita das aminas graxas que se reúnem no caldo de fermentação.

[0014] A presente invenção abrange ainda uma cultura de células que inclui uma célula microbiana recombinante para a produção de aminas (supra). Em uma forma de realização, a cultura de células abrange uma célula bacteriana recombinante para a produção de aminas. Em uma outra forma de realização, a célula microbiana recombinante é uma célula bacteriana recombinante.

[0015] Outro aspecto da presente invenção fornece um microrganismo recombinante que tem uma via metabólica manipulada para a produção de aldeído graxo e uma enzima biossintética que converte um aldeído graxo em uma amina graxa, em que a enzima biossintética tem atividade aminotransferase /transaminase ou aminodesidrogenase. Em uma forma de realização, a enzima biossintética é uma aminotransferase putrescina ou uma aminotransferase GABA. Em uma outra forma de realização, a enzima biossintética é uma aminodesidrogenase ou uma aminooxidase.

[0016] Outro aspecto da presente invenção fornece um microrganismo recombinante que tem uma via metabólica manipulada para a produção de aldeído graxo e uma via metabólica manipulada para a produção de uma amina graxa incluindo uma enzima biossintética que converte um aldeído graxo em uma amina graxa, em que o microrganismo recombinante é uma célula microbiana. Em um aspecto, a célula microbiana é uma célula recombinante. A célula microbiana inclui, mas não está limitada a, Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia, e Streptomyces. Em uma forma de realização, Escherichia é Escherichia coZi. Em uma outra forma de realização, Cyanophyta inclui, mas não está limitado a Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cyanothece, e Nostoc punctiforme. Em uma outra forma de realização particular, Cyanophyta é Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803, ou Synechococcus sp. PCC7001.

[0017] Outro aspecto da presente invenção fornece um microrganismo recombinante que tem uma via metabólica manipulada para a produção de aldeído graxo e uma via metabólica manipulada para a produção de uma amina graxa. Em uma forma de realização, a via metabólica manipulada para a produção de aldeído graxo inclui uma tioesterase e/ou uma ácido carboxílico redutase (CAR) que convertem um ácido graxo em um aldeído graxo, enquanto que a via metabólica manipulada para a produção de uma amina graxa inclui um aminotransferase/transaminase ou aminodesidrogenase, que converte um aldeído graxo em uma amina graxa. Em algumas formas de realização, a tioesterase é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene tesA com ou sem sequência líder enquanto que a ácido carboxílico redutase (CAR) é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene carB, ambos os quais são expressos no microrganismo. Em uma forma de realização, a aminotransferase/transaminase é uma aminotransferase putrescina ou uma aminotransferase GABA. Em uma forma de realização, a aminotransferase putrescina é YgjG que é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene ygjG que é expresso no microrganismo. Em uma outra forma de realização, a aminotransferase GABA é PuuE que é codificada por uma sequência de ácido nucleico que codifica para um gene puuE que é expresso no microrganismo. Em ainda outra forma de realização, a aminodesidrogenase é uma metilamina desidrogenase de Paracoccus denitrificans. Em uma forma de realização, a amina graxa é liberada no sobrenadante ou no meio de cultura pelo microrganismo. Em uma outra forma de realização, a amina graxa é recolhida a partir do interior do microrganismo, onde pode ser extraída durante ou depois de um processo de fermentação.

[0018] A presente invenção abrange ainda um método de produção de uma amina graxa incluindo a cultura de um microrganismo recombinante em um caldo de fermentação contendo uma fonte de carbono, em que o microrganismo recombinante contém uma via metabólica manipulada para a produção de aldeído graxo e uma enzima biossintética que converte um aldeído graxo em uma amina graxa, em que a enzima biossintética tem atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase, e em que o microrganismo produz uma amina graxa in vivo.

[0019] A presente invenção abrange ainda uma célula microbiana recombinante que inclui a expressão de uma ou mais enzimas tendo atividade tioesterase e ácido carboxílico redutase (CAR); e expressão de uma enzima tendo atividade de aminotransferase ou aminodesidrogenase, em que a célula microbiana produz aminas graxas. Em uma forma de realização, a enzima biossintética é uma aminotransferase putrescina, tal como YgjG ou uma aminotransferase GABA, talcomo PuuE. Emuma outra forma de realização, a enzima biossintética é uma aminodesidrogenase, tal como uma metilamina desidrogenase de Paracoccus denitrificans. Em ainda outra forma de realização, a enzima biossintética é uma aminooxidase.

[0020] Ainda, um outro aspecto da presente invenção fornece um método para a produção de uma amina graxa em um microrganismo recombinante. O método inclui a cultura de uma célula microbiana (supra) em um meio de fermentação na presença de uma fonte de carbono; e colheita das aminas graxas que se reúnem no sobrenadante ou no meio de fermentação. A célula microbiana recombinante expressa uma via metabólica manipulada para a produção de um aldeído graxo e uma enzima biossintética que converte um aldeído graxo em uma amina graxa, em que a enzima biossintética tem atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase. Em um outro aspecto, a célula microbiana recombinante expressa uma via metabólica manipulada para a produção de aldeído graxo e uma via metabólica manipulada para a produção de amina graxa incluindo uma enzima biossintética que converte um aldeído graxo em uma amina graxa, em que a enzima biossintética tem atividade de aminotransferase ou aminodesidrogenase.

[0021] Outro aspecto da presente invenção fornece uma amina graxa derivada a partir de uma fonte de carbono que não é uma matéria-prima petroquímica. Por exemplo, a presente invenção fornece aminas graxas derivadas a partir de matérias-primas renováveis, tais como CO2, CO, glicose, sacarose, xilose, arabinose, glicerol, manose ou misturas dos mesmos. Outras matérias-primas fornecidas aqui, a partir das quais as aminas graxas podem ser derivadas incluem amidos, biomassa celulósica, melaço e outras fontes de carboidratos incluindo misturas carboidratos derivados da hidrólise da biomassa celulósica, ou os materiais residuais derivados do processamento de óleo natural ou planta.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0022] A presente invenção é melhor entendida quando lida em conjunto com as figuras anexas, que servem para ilustrar as formas de realização preferidas. É entendido, contudo, que a presente invenção não é limitada às formas de realização específicas divulgadas nas figuras.

[0023] A Figura 1 é um cromatógrafo de MS/CG a partir de extratos de células microbianas que mostram um pico de amina graxa único (ver painel do meio em 7,61 minutos, marcado com uma seta) produzido via expressão de uma tioesterase, uma ácido carboxílico redutase, e uma aminotransferase/transaminase (linha do meio). A linha superior é o controle negativo Fl6; a linha do meio é a amostra Fl6-YG; e a linha inferior é o controle negativo YG. Picos adicionais nas linhas superior e do meio são álcoois graxos.

[0024] A Figura 2 representa um outro cromatógrafo MS/CG que mostra o perfil de eluição da amostra Fl6-YG (linha superior), em comparação com o padrão de referência l-dodecilamina (linha inferior). Picos adicionais nas linhas superior e do meio são álcoois graxos.

[0025] A Figura 3 mostra o padrão de fragmentação do íon do pico 7,6 minutos a partir da amostra Fl6- YG (linha superior) e o padrão de referência l-dodecilamina (linha inferior). A estrutura molecular dos fragmentos de íons característicos de l-dodecilamina, incluindo C11H24N, C10H22N, C9H20N, também são mostrados na linha superior.

DESCRIÇÃO DETALHADA Visão geral

[0026] A presente invenção refere-se à produção microbiana de aminas graxas, as quais representam uma nova classe de produtos químicos renováveis. As aminas graxas são produzidas através de um microrganismo que expressa uma via metabólica manipulada para converter aldeídos graxos em aminas graxas. Como tal, o microrganismo expressa pelo menos uma enzima biossintética exógena afim de produzir aminas graxas in vivo. A enzima biossintética exógena pode ter atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase; ou atividade ácido carboxílico redutase (CAR); ou atividade tioesterase ou uma combinação das mesmas. Formas alternativas da atividade enzimática estão também abrangidas aqui.

Definições

[0027] Tal como é usado neste relatório e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula hospedeira" inclui dois ou mais de tais células hospedeiras, a referência a "uma amina graxa" inclui uma ou mais aminas graxas, ou misturas de aminas, a referência a "uma sequência de ácido nucleico" inclui uma ou mais sequências de ácido nucleico, a referência a "uma enzima" inclui uma ou mais enzimas, e similares.

[0028] O termo "via metabólica manipulada" refere- se a uma ou mais reações geneticamente manipuladas ou quimicamente optimizadas catalisadas por pelo menos uma enzima biossintética expressa em uma célula de modo a produzir (ou aumentar a produção de) uma determinada substância (isto é, um precursor, um intermediário ou um produto final) no interior dessa célula. Em uma forma de realização, a enzima é uma enzima biossintética de biossíntese exógena. Em uma outra forma de realização, a via metabólica manipulada permite a produção da célula de um produto final desejado. Em uma outra forma de realização, a via metabólica manipulada permite a produção da célula de um precursor desejado. Em uma outra forma de realização, a via metabólica manipulada permite a produção da célula de um intermediário desejado.

[0029] O termo "in vivo" refere-se a "dentro da célula", quando usado no contexto de produção de um produto específico. Por exemplo, a produção de aminas graxas in vivo, significa a produção de aminas graxas no interior da célula.

[0030] Os números de acesso de sequência como aqui referidos foram obtidos a partir de bases de dados fornecidos pelo NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantidos pelos Institutos Nacionais de Saúde, EUA (que são identificados aqui como "Números de acesso NCBI" ou alternativamente como "números de acesso GenBank"), e da Base de Conhecimento UniProt (UniProtKB) e bases de dados Swiss-Prot fornecidas pelo Instituto suíço de Bioinformática (que são identificadas aqui como "Números de Acesso UniProtKB").

[0031] Números de classificação de enzima (CE) são estabelecidos pelo Comité de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB), uma descrição do qual está disponível no site de Nomenclatura das Enzimas do IUBMB na World Wide Web. Números CE classificam enzimas de acordo com as reações enzima-catalisadas. Por exemplo, se enzimas diferentes (por exemplo, de diferentes organismos) catalisam a mesma reação, então elas são classificadas sob o mesmo número CE. Além disso, através da evolução convergente, dobras de proteínas diferentes podem catalisar reações idênticas e, portanto, são atribuídos números CE idênticos (ver Omelchenko et al. (2010) Biol. Direta 5:31). As proteínas que são evolutivamente relacionadas e podem catalisar as mesmas reações bioquímicas são por vezes referidas como enzimas análogas (i.e., ao contrário de enzimas homólogas). Números CE diferem de, por exemplo, identificadores de UniProt que especificam uma proteína pela sua sequência de aminoácidos.

[0032] Tal como aqui utilizado, o termo "nucleotídeo" refere-se a uma unidade monomérica de um polinucleotídeo que é constituído por uma base heterocíclica, um açúcar, e um ou mais grupos fosfato. As bases de ocorrência natural (guanina, (G), adenina (A), citosina (C), timina (T) e uracila (U)) são tipicamente derivadas de purina ou pirimidina, embora deva ser entendido que, análogos de bases que ocorrem ou não ocorrem naturalmente, também estão incluídos. O açúcar que ocorre naturalmente é a pentose (açúcar com cinco carbonos) desoxirribose (que forma DNA) ou ribose (que forma RNA), embora deva ser entendido que, análogos de açúcares que ocorrem ou não ocorrem naturalmente, também estão incluídos. Os ácidos nucleicos são geralmente ligados através de ligações de fosfato de modo a formar ácidos nucleicos ou polinucleotídeos, embora muitas outras ligações são conhecidas no estado da técnica (por exemplo, fosforotioatos, boranofosfatos e semelhantes).

[0033] O termo "polinucleotídeo" refere-se a um polímero de ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA), que pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla e que pode conter nucleotídeos não naturais ou alterados. Os termos "polinucleotídeo", "sequência de ácido nucleico" e "sequência de nucleotídeos" são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento. Estes termos referem-se à estrutura primária da molécula e, portanto, incluem DNA duplo e de cadeia simples, e RNA duplo e de cadeia simples. Os termos incluem, como equivalentes, análogos tanto de RNA quanto de DNA feitos a partir de análogos de nucleotídeos e polinucleotídeos modificados, tais como, mas não limitados a polinucleotídeos metilados e/ou nivelados. O polinucleotídeo pode estar em qualquer forma, incluindo, mas não limitado a plasmídeo, viral, cromossômico, EST, cDNA, mRNA e rRNA.

[0034] Tal como aqui utilizados, os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados indiferentemente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. O termo "polipeptídeo recombinante" refere-se a um polipeptídeo que é produzido por técnicas recombinantes, em que geralmente cDNA ou RNA que codificam a proteína expressa é inserido em um vetor de expressão adequado que é por sua vez utilizado para transformar uma célula hospedeira para produzir o polipeptídeo. Similarmente, os termos "polinucletídeo recombinante" ou "ácido nucleico recombinante" ou "DNA recombinante" são produzidos por técnicas recombinantes que são conhecidas dos técnicos do assunto.

[0035] Tal como aqui utilizados, os termos "homólogo" e "homólogos" referem-se a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo que compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 50 por cento (%) idêntica à sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo correspondente. De preferência os polinucleotídeos homólogos ou polipeptídeos possuem sequências polinucleotídicas ou sequências de aminoácidos que possuem pelo menos cerca de 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou, pelo menos, cerca de 99 % de homologia com a sequência de aminoácidos ou a sequência de polinucleotídeos correspondente. Tal como aqui utilizados os termos "homologia de sequência" e "identidade de sequência" são utilizados indiferentemente.

[0036] Um técnico no assunto comum está bem ciente de métodos para determinar homologia entre duas ou mais sequências. Resumidamente, cálculos de "homologia" entre duas sequências podem ser realizados como se segue. As sequências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, as lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico para alinhamento ótimo e sequências não homólogas podem ser ignoradas para efeitos de comparação). Em uma forma de realização preferida, o comprimento de uma primeira sequência que está alinhada para fins de comparação é pelo menos cerca de 30 %, preferencialmente pelo menos cerca de 40 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 50 %, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 60 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 98 %, ou cerca de 100 % do comprimento de uma segunda sequência. Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeo da primeira e da segunda sequências correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou de nucleotídeos como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A percentagem de homologia entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tendo em conta o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que precisam de ser introduzidas para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação da percentagem de homologia entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático, tal como os programas BLAST (Altschul et al (1990) J. Mal Bial 215(3):403-410). A percentagem de homologia entre duas sequências de aminoácidos pode também ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch, que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, utilizando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso do comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 (Needleman e Wunsch (1970) J. Mal Bial. 48:444-453). A percentagem de homologia entre duas sequências de nucleotídeos também pode ser determinada utilizando o programa GAP no pacote de software GCG, utilizando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Um técnico no assunto comum pode efetuar cálculos de homologia iniciais e ajustar os parâmetros do algoritmo em conformidade. Um conjunto preferido de parâmetros (e que deve ser utilizado se o analista está incerto sobre quais os parâmetros que devem ser utilizados para determinar se uma molécula está dentro de uma limitação de homologia das reivindicações) são uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma extensão da penalidade de lacuna de 4, e uma penalidade de lacuna de quadro de leitura de 5. Métodos adicionais de alinhamento de sequências são conhecidos no estado da técnica biotecnológico (ver, por exemplo, Rosenberg (2005) BMC Biainfarmatics. 6:278; Altschul et al (2005) FEBS J.272(20):5101-5109).

[0037] O termo "hibridiza sob restringência baixa, restringência média, restringência alta, ou em condições de restringência muito alta" descreve as condições de hibridização e lavagem. Orientações para a realização de reações de hibridização podem ser encontradas em textos biotecnológicos (por exemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & amp; Sons, Nova Iorque (1989), 6.3.1-6.3.6, em que os métodos aquosos e não aquosos são descritos em detalhe e qualquer um dos métodos pode ser usado). Por exemplo, as condições de hibridização específicas são como se segue: (1) condições de hibridização de restringência baixa - 6 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguido de duas lavagens em 0,2 X SSC, 0,1% de SDS, pelo menos, em 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada para 55 °C durante condições de baixa restringência); (2) condições de hibridização de restringência média - 6 X SSC a cerca de 45 °C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 0,1% de SDS a 60 °C; (3) condições de hibridização de restringência alta - 6 X SSC a cerca de 45 °C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C; e (4) condições de hibridização de restringência muito alta - 0,5 M de fosfato de sódio, 7 % de SDS a 65 °C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 1 % SDS a 65 °C. Condições de restringência muito alta (4) são geralmente as condições preferidas, a menos que especificado de outra forma.

[0038] O termo "endógeno" significa "originário de dentro". Como tal, um polipeptídeo "endógeno" refere-se a um polipeptídeo que é codificado pelo genoma nativo da célula hospedeira. Por exemplo, um polipeptídeo endógeno pode referir-se a um polipeptídeo que é codificado pelo genoma da célula microbiana parental (por exemplo, a célula hospedeira parental) a partir da qual a célula recombinante é manipulada (ou derivada).

[0039] O termo "exógeno" significa "originário de fora". Como tal, um polipeptídeo "exógeno" refere-se a um polipeptídeo que não é codificado pelo genoma nativo da célula. Um polipeptídeo exógeno e/ou polinucleotídeo exógeno pode ser transferido para dentro da célula e pode ser clonado a partir de ou derivado de um tipo de célula ou espécie diferente; ou pode ser clonado a partir de ou derivado do mesmo tipo de célula ou espécie. Por exemplo, uma "enzima biossintética exógena" é um exemplo de um polipeptídeo exógeno, em que o polipeptídeo codifica para uma enzima tendo uma determinada atividade enzimática. Em um outro exemplo, uma variante (isto é, mutante ou alterado) polipeptídeo é um exemplo de um polipeptídeo exógeno. Da mesma forma, uma molécula de ácido nucleico de ocorrência não natural é considerada exógena a uma célula, uma vez introduzida na célula. O termo "exógeno" também pode ser usado com referência a um polinucleotídeo, polipeptídeo ou proteína que está presente em uma célula hospedeira recombinante em um estado não-nativo. Por exemplo, uma sequência "exógena" de polinucleotídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser modificada em relação à sequência de tipo selvagem presente naturalmente na célula hospedeira de tipo selvagem correspondente, por exemplo, uma modificação em no nível de expressão ou na sequência de um polinucleotídeo, polipeptídeo ou proteína. Ao longo destas mesmas linhas, uma molécula de ácido nucleico que é de ocorrência natural também pode ser exógena a uma célula particular. Por exemplo, uma sequência de codificação inteira isolada a partir da célula X é um ácido nucleico exógeno em relação à célula Y uma vez que esta sequência de codificação é introduzida na célula Y, mesmo que X e Y sejam o mesmo tipo de célula.

[0040] O termo "super expresso" significa que um gene é levado a ser transcrito a uma taxa elevada em comparação com a taxa de transcrição endógena para aquele gene. Em alguns exemplos, a super expressão inclui, adicionalmente, uma taxa elevada de tradução da proteína correspondente em comparação com a taxa de tradução para a proteína endógena. Em algumas formas de realização, o termo "super-expressar" significa expressar um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma célula a uma concentração maior do que é normalmente expresso em uma célula correspondente de tipo selvagem sob as mesmas condições. Os métodos de ensaio para a super expressão são bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, níveis de RNA transcrito podem ser avaliados através de rtPCR e níveis de proteína podem ser avaliados utilizando análise de gel de SDS-page.

[0041] O termo "heterólogo" significa "derivado de um organismo diferente, tipo de célula diferente, e/ou de espécies diferentes". Tal como aqui utilizado, o termo "heterólogo" é tipicamente associado com um polinucleotídeo ou um polipeptídeo ou uma proteína e refere-se a um polinucleotídeo, um polipeptídeo ou uma proteína que não está naturalmente presente num dado organismo, tipo de célula ou espécie. Por exemplo, uma sequência polinucleotídica a partir de uma planta pode ser introduzida em uma célula hospedeira microbiana através de métodos recombinantes e o polinucleotídeo da planta é então heterólogo em relação a célula hospedeira microbiana recombinante. Da mesma forma, uma sequência polinucleotídica a partir de cianobactéria pode ser introduzida em uma célula hospedeira microbiana do gênero Escherichia por métodos recombinantes e o polinucleotídeo de cianobactéria é então heterólogo em relação a célula hospedeira microbiana recombinante. Ao longo destas linhas, uma "enzima biossintética heteróloga" é um exemplo de um polipeptídeo heterólogo, em que o polipeptídeo codifica para uma enzima tendo uma determinada atividade enzimática.

[0042] Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento" de um polipeptídeo refere-se a uma porção menor de um polipeptídeo de comprimento completo ou proteína variando em tamanho a partir de dois resíduos de aminoácidos para a sequência de aminoácidos inteira menos um resíduo de aminoácido. Em certas formas de realização da presente invenção, um fragmento refere-se a toda a sequência de aminoácidos de um domínio de um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, um substrato de ligação de domínio ou um domínio catalítico).

[0043] O termo "mutagênese" refere-se a um processo pelo qual a informação genética de um organismo é alterada de uma forma estável. A mutagênese de uma proteína codificando uma sequência de ácido nucleico produz uma proteína mutante. Mutagênese refere-se também às mudanças em sequências não codificadoras de ácidos nucleicos que resultam em atividade de proteína modificada.

[0044] Uma "mutação", tal como aqui utilizado,refere-se a uma alteração permanente em uma posição de ácido nucleico de um gene ou de uma posição de aminoácido de um polipeptídeo ou proteína. As mutações incluem substituições, adições, inserções e/ou deleções. Por exemplo, uma mutação na posição de aminoácido pode ser uma substituição de um tipo de aminoácido com outro tipo de aminoácido (por exemplo, uma serina (S) pode ser substituída por uma alanina (A); uma lisina (L) pode ser substituída por uma T (treonina); etc.). Como tal, um polipeptídeo ou uma proteína pode ter uma ou mais mutações em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido. Por exemplo, um polipeptídeo ou proteína biossintético pode ter uma ou mais mutações na sua sequência de aminoácidos.

[0045] O termo "enzima biossintética" tal como aqui utilizado, refere-se a uma proteína que possui uma atividade enzimática que está relacionada com a biossíntese de derivados do ácido graxo (por exemplo, ácidos graxos, aldeídos graxos, álcoois graxos, aminas graxas, ésteres de ácidos graxos, etc.). Um exemplo de uma enzima biossintética, tal como aqui utilizado, é uma enzima que pode converter um precursor de aldeído graxo em uma amina graxa (por exemplo, uma enzima biossintética de produção de amina graxa). Outro exemplo de uma enzima biossintética, tal como aqui utilizado, é uma enzima que pode converter um ácido graxo em um aldeído graxo (por exemplo, uma enzima biossintética de produção de produção de aldeído graxo). Ainda outro exemplo de uma enzima biossintética, tal como aqui utilizado, é uma enzima que pode converter um derivado acil-ACP ou acil-CoA em um ácido graxo (por exemplo, uma enzima biossintética de produção de ácido graxo). Quando uma célula é transformada com uma enzima biossintética é uma célula que expressa a enzima biossintética (por exemplo, uma célula recombinante). Em uma forma de realização, o título e/ou rendimento de um composto relacionado a amina graxa produzido por uma célula que expressa uma enzima biossintética de produção de amina graxa é pelo menos duas vezes a de uma célula de tipo selvagem correspondente (isto é, uma célula correspondente que não expressa a enzima biossintética de produção de amina graxa). Em uma outra forma de realização, o título e/ou rendimento de um composto relacionado a amina graxa produzido por uma célula que expressa uma enzima biossintética de produção de amina graxa é pelo menos cerca de 1 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, ou pelo menos cerca de 1O vezes maior do que a de uma célula de tipo selvagem correspondente. Em uma forma de realização, o título e/ou rendimento de um composto relacionado a amina graxa produzido por uma célula que expressa uma enzima biossintética de produção de amina graxa é pelo menos cerca de 1 por cento, pelo menos cerca de 2 por cento, pelo menos cerca de 3 por cento, pelo menos cerca de 4 por cento, pelo menos cerca de 5 por cento, pelo menos cerca de 6 por cento, pelo menos cerca de 7 por cento, pelo menos cerca de 8 por cento, pelo menos cerca de 9 por cento, ou cerca de 10 por cento maior do que a de uma célula de tipo selvagem correspondente. Em uma outra forma de realização, o título e/ou rendimento devido à expressão de uma enzima biossintética de produção de amina graxa é pelo menos cerca de 20 por cento a pelo menos cerca de 100 por cento maior do que a da célula de tipo selvagem. Em outras formas de realização, o título e/ou rendimento de um composto relacionado a uma amina graxa produzido por uma célula devido à expressão de uma enzima biossintética de produção de amina graxa é pelo menos cerca de 20 por cento, pelo menos cerca de 25 por cento, pelo menos cerca de 30 por cento, pelo menos cerca de 35 por cento, pelo menos cerca de 40 por cento, pelo menos cerca de 45 por cento, pelo menos cerca de 50 por cento, pelo menos cerca de 55 por cento, pelo menos cerca de 60 por cento, pelo menos cerca de 65 por cento, pelo menos cerca de 70 por cento, pelo menos cerca de 75 por cento, pelo menos cerca de 80 por cento, pelo menos cerca de 85 por cento, pelo menos cerca de 90 por cento, pelo menos cerca de 95 por cento, pelo menos cerca de 97 por cento, pelo menos cerca de 98 por cento, ou pelo menos cerca de 100 por cento maior do que a da célula de tipo selvagem correspondente.

[0046] Tal como aqui utilizado, o termo "gene" refere-se a sequências de ácidos nucleicos que codificam um um produto de RNA ou um produto proteico, bem como sequências de ácido nucleico operativamente ligadas que afetam a expressão do RNA ou proteína (por exemplo, tais sequências incluem, mas não estão limitadas a sequências promotoras ou intensificadoras) ou sequências de ácido nucleico operativamente ligadas que codificam sequências que afetam a expressão do RNA ou proteína (por exemplo, tais sequências incluem, mas não estão limitadas aos locais de ligação de ribossomo ou sequências de controle da tradução).

[0047] As sequências de controle de expressão são conhecidas no estado da técnica e incluem, por exemplo, promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores de transcrição, locais de entrada no ribossomo interno (IRES), e semelhantes, que proporcionam a expressão da sequência de polinucleotídeo em uma célula hospedeira. As sequências de controle de expressão interagem especificamente com proteínas celulares envolvidos na transcrição (Maniatis et al, Science, 236:1237-1245 (1987)). Exemplos de sequências de controle de expressão são descritos em textos biotecnológicos (por exemplo, ver Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990)). Nos métodos da presente invenção, uma ou mais sequências de controle de expressão estão operacionalmente ligadas a uma ou mais sequências polinucleotídicas. Por "operativamente ligadas" é entendido que uma sequência de polinucleotídeo e uma sequência de controle de expressão estão ligadas de tal maneira a permitir a expressão do gene quando as moléculas adequadas (e.g., proteínas ativadoras da transcrição) são ligadas à sequência de controle da expressão. Promotores operativamente ligados estão localizados a montante da sequência polinucleotídica selecionada em termos da direção de transcrição e tradução. Intensificadores operativamente ligados podem ser localizados a montante, dentro ou a jusante do polinucleotídeo selecionado.

[0048] Tal como aqui utilizado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico, isto é, uma sequência de polinucleotídeo, ao qual foi ligado. Um tipo de vetor útil é um epissoma (isto é, um ácido nucleico capaz de replicação extra-cromossômica). Os vetores úteis são aqueles capazes de replicação e/ou expressão autônoma de ácidos nucleicos aos quais estão ligados. Os vetores capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados são aqui referidos como "vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão com utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes na forma de "plasmídeos", que se referem em geral, a loops de cadeias duplas circulares de DNA que, na sua forma de vetor, não estão ligadas ao cromossoma. Outros vetores de expressão úteis são fornecidos na forma linear. Também estão incluídos, tais outras formas de vetores de expressão que servem funções equivalentes e que se tornaram conhecidos no estado da técnica subsequentemente aqui presente. Em algumas formas de realização, um vetor recombinante inclui ainda um promotor ligado operacionalmente à sequência de polinucleotídeo. Em algumas formas de realização, o promotor é um promotor desenvolvidamente regulado, um promotor específico de organela, um promotor específico de tecido, um promotor induzível, um promotor constitutivo, ou um promotor específico de células. O vetor recombinante compreende tipicamente pelo menos uma sequência selecionada a partir de uma sequência de controle de expressão operativamente acoplada à sequência polinucleotídica; um marcador de seleção acoplado operativamente à sequência de polinucleotídeo; uma sequência de marcador acoplada operativamente à sequência de polinucleotídeo; uma porção de purificação operacionalmente acoplada à sequência polinucleotídica; uma sequência de secreção acoplada operativamente à sequência de polinucleotídeo; e uma sequência de direcionamento acoplada operativamente à sequência de polinucleotídeo. Em certas formas de realização, a sequência de nucleotídeos é estavelmente incorporada no DNA genômico da célula hospedeira, e a expressão da sequência de nucleotídeos está sob o controle de uma região promotora regulável. Os vetores de expressão tal como aqui utilizados incluem uma sequência polinucleotídica particular, tal como aqui descrito numa forma adequada para a expressão da sequência de polinucleotídeo numa célula hospedeira. Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado, etc. Os vetores de expressão aqui descritos podem ser introduzidos em células hospedeiras para a produção de polipeptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão codificados pelas sequências de polinucleotídeos como aqui descritas.

[0049] Os termos "célula recombinante" e "célula hospedeira recombinante" são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a uma célula que tenha sido modificada para expressar de forma exógena pelo menos uma enzima biossintética. Em uma forma de realização particular, a enzima biossintética pode converter um precursor de aldeído graxo em uma amina graxa. Assim, em uma forma de realização, a célula recombinante abrange uma enzima biossintética que pode aumentar a atividade específica da célula recombinante para produzir aminas graxas ou compostos derivados de aminas graxas. Uma célula recombinante pode ser derivada de um microrganismo ou célula microbiana, tal como uma bactéria, um vírus ou um fungo. A célula recombinante pode ser utilizada para produzir as aminas graxas. Em algumas formas de realização, a célula recombinante expressa de forma exógena um ou mais polinucleotídeo (s), cada polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo a atividade da enzima biossintética, em que a célula recombinante produz uma composição relacionada a amina graxa, quando cultivada na presença de uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar o polinucleotídeo (s).

[0050] Tal como aqui utilizado, o termo "microrganismo" refere-se a um organismo microscópico. Exemplos de um microrganismo são uma bactéria, um vírus, ou um fungo. Em uma forma de realização, um microrganismo é uma célula bacteriana. Em outra forma de realização, um microrganismo é uma célula procariota ou procariótica. Em ainda outra forma de realização, um microrganismo é uma célula tal como uma célula de levedura. Em outra forma de realização, um microrganismo é uma célula viral. Em uma forma de realização relacionada, um "microrganismo recombinante" é um microrganismo que tenha sido geneticamente alterado e expressa ou abrange uma sequência de ácido nucleico exógeno e/ou heterólogo. Em outra forma de realização relacionada, um "microrganismo recombinante" é um microrganismo que tenha sido geneticamente alterado e expressa uma via metabólica modificada que inclui pelo menos uma proteína expressa de forma exógena (por exemplo, uma enzima biossintética exógena).

[0051] O termo "acil-ACP" refere-se a um acil tioéster formado entre o carbono do carbonila da cadeia alquila e o grupo sulfidrila da porção fosfopanteteinila de uma proteína transportadora de acil (ACP). A porção fosfopanteteinila é ligada pós-traducionalmente a um resíduo de serina conservado no ACP pela ação da sintase de proteína holo-acil transportadora (ACPS), uma fosfopanteteinila transferase. Em algumas formas de realização, um acil-ACP é um intermediário na síntese de acil-ACPs completamente saturados. Em outras formas de realização, um acil-ACP é um intermediário na síntese de acil-ACPs insaturados. Em algumas formas de realização, a cadeia de carbono terá cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 átomos de carbono. Cada um destes acil-ACPs são substratos para enzimas que os convertem em derivados de ácido graxo.

[0052] O termo "acil-CoA" é um composto temporário formado quando coenzima A (CoA) acopla à extremidade de um ácido graxo no interior de uma célula viva. Refere-se a um grupo de co-enzimas que estão envolvidas no metabolismo de ácidos graxos. Em algumas formas de realização, a cadeia de carbono terá cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 átomos de carbono. Cada um destes acil-CoA são substratos para enzimas que os convertem em derivados de ácido graxo.

[0053] O termo "via metabólica para a produção de aldeído graxo" significa qualquer via biossintética que produz aldeídos graxos. A via metabólica para a produção de aldeído graxo pode incluir qualquer número de enzimas para a produção de aldeídos graxos.

[0054] O termo "via metabólica para a produção de amina graxa" significa qualquer via biossintética que produz aminas graxas. A via metabólica para a produção de uma amina graxa pode incluir pelo menos uma enzima para produzir aminas graxas.

[0055] Tal como aqui utilizado, "amina graxa" significa uma amina tendo a fórmula RNH2. Uma amina graxa, tal como aqui referida pode ser qualquer amina graxa feita a partir de, por exemplo, um ácido graxo ou aldeído graxo ou derivado de aldeído graxo a partir de um acil-ACP graxo. Em algumas formas de realização, o grupo R é pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, ou pelo menos 19 carbonos de comprimento. Alternativamente, ou em adição, o grupo R é 24 ou menos, 23 ou menos, 22 ou menos, 20 ou menos, 19 ou menos, 18 ou menos, 17 ou menos, 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos átomos de carbono de comprimento. Assim, o grupo R pode ter um grupo R delimitado por quaisquer dois dos pontos de extremidade acima. Por exemplo, o grupo R pode ser de 6-16 carbonos de comprimento, 10-14 carbonos de comprimento, ou 12-18 carbonos de comprimento. Em algumas formas de realização, a composição de amina graxa compreende um ou mais de uma amina graxa C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, 22, 23, e C24. Em outras formas de realização, a composição de amina graxa compreende um ou mais de uma amina graxa C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17 e C18. Em ainda outras formas de realização, a composição de amina graxa inclui aminas graxas C12, C14, C16 e C18; aminas graxas C12, C14 e C16; aminas graxas C14, C16 e C18; ou aminas graxas C12 e C14. O grupo R de uma amina graxa pode ser uma cadeia linear ou uma cadeia ramificada. Cadeias ramificadas podem ter mais do que um ponto de ramificação e podem incluir ramos cíclicos. Em algumas formas de realização, a amina graxa de cadeia ramificada é uma amina graxa ramificada C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23 ou C24. O grupo R de uma amina graxa ramificada ou não ramificada pode ser saturado ou insaturado. Se insaturado, o grupo R pode ter um ou mais do que um ponto de insaturação. Em algumas formas de realização, a amina graxa insaturada é uma amina graxa monoinsaturada. Em certas formas de realização, a amina graxa insaturada é uma amina graxa insaturada C6:1, C7:1, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1 ou um C24:1. Em certas formas de realização, a amina graxa insaturada é uma amina graxa insaturada C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 ou C18:1. Em outras formas de realização, a amina graxa insaturada é insaturada na posição omega-7. Em certas formas de realização, a amina graxa insaturada tem uma ligação dupla EIS. Aminas graxas são classificadas em aminas primárias, secundárias, terciárias e, dependendo do número de átomos de hidrogênio de uma molécula de amônia substituídos por grupos alquila ou metila graxas. Exemplos de aminas graxas que podem ser utilizadas como detergentes, em tratamentos de água, como agentes de flotação, em petróleo, como inibidores de corrosão, em têxteis, em borracha, e semelhantes, são as aminas terciárias, tais como dimetilalquilaminas (C10, C12, C14, C16 ou C18) e dialquilmetilaminas (C10); e misturas de amina terciária, tais como dimetilalquilaminas (C8-C18, C12-C18, C12-C14, ou C16-C18).

[0056] O termo "clone" refere-se tipicamente a uma célula ou grupo de células descendentes de e essencialmente geneticamente idênticas a um único antepassado comum, por exemplo, as bactérias de uma colônia bacteriana clonada surgiram a partir de uma única célula bacteriana.

[0057] Tal como aqui utilizado, o termo "cultura" refere-se tipicamente a um meio líquido compreendendo as células viáveis. Em uma forma de realização, uma cultura compreende reprodução de células em um meio de cultura predeterminado, sob condições controladas, por exemplo, uma cultura de células hospedeiras recombinantes cultivadas em meio líquido compreendendo uma fonte de carbono e nitrogênio selecionado. "Cultivar" ou "cultivo" refere-se ao crescimento de uma população de células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras recombinantes), sob condições adequadas em um meio líquido ou sólido. Em algumas formas de realização, cultivar refere-se a bioconversão fermentativa de um substrato para um produto final. Meios de cultura são bem conhecidos e os componentes individuais de tais meios de cultura estão disponíveis a partir de fontes comerciais (por exemplo, meios DIFCO e meios BBL). Em um exemplo, o meio nutriente aquoso é um "meio rico" incluindo fontes complexas de nitrogênio, sais, e de carbono, tal como o meio YP, incluindo 1O g/L de peptona e 1O g/L de extrato de levedura. Em outro exemplo, o meio nutriente é um "meio mínimo" composto de traços de elementos, nutrientes e sais.

[0058] Os termos, "uma atividade modificada" ou "um nível alterado de atividade", por exemplo, com respeito a uma atividade enzimática em uma célula hospedeira recombinante, refere-se a uma diferença de uma ou mais características da atividade da enzima tal como determinado em relação a célula hospedeira nativa ou parental. Tipicamente, essas diferenças de atividade são determinadas entre uma célula hospedeira recombinante (isto é, possuindo uma atividade modificada) e a célula hospedeira de tipo selvagem correspondente, particularmente comparando a cultura de uma célula hospedeira recombinante com a cultura da célula hospedeira de tipo selvagem correspondente. Atividades modificadas podem ser o resultado de, por exemplo, valores modificados da proteína expressa por uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, como resultado de um aumento ou diminuição do número de cópias de sequências de DNA que codificam a proteína, aumento ou diminuição do número de mRNA transcritos que codificam a proteína e/ou aumento ou diminuição da quantidade de tradução de proteína da proteína a partir de mRNA); alterações na estrutura da proteína (por exemplo, as alterações da estrutura primária, tais como, alterações à sequência de codificação da proteína que resultam em alterações na especificidade para o substrato, alterações nos parâmetros cinéticos observados); e alterações na estabilidade da proteína (por exemplo, aumento ou diminuição da degradação da proteína). Em certos casos, as sequências de codificação para os polipeptídeos aqui descritas são códons otimizadas para a expressão em uma célula hospedeira particular. Por exemplo, para expressão em E. coli, um ou mais códons podem ser otimizados de acordo (ver Grosjean et al (1982) Gene 18:199-209).

[0059] O termo "sequências reguladoras" como aqui utilizado tipicamente refere-se a uma sequência de bases de DNA, ligada operativamente a sequências de DNA que codificam uma proteína que finalmente controla a expressão da proteína. Exemplos de sequências reguladoras incluem, mas não estão limitadas a, sequências promotoras de RNA, sequências de ligação ao fator de transcrição, sequências de terminação da transcrição, moduladores de transcrição (tais como elementos intensificadores), sequências de nucleotídeos que afetam a estabilidade do RNA e sequências reguladoras translacionais (tais como, sítios de ligação de ribossomos (por exemplo, sequências de Shine-Dalgarno em procariotas ou sequências Kozak em eucariotas), códons de iniciação, códons de terminação). Tal como aqui utilizada, a frase "a expressão da referida sequência de nucleotídeos é modificada em relação à sequência do nucleotídeo de tipo selvagem," significa um aumento ou uma diminuição no nível de expressão e/ou atividade de uma sequência de nucleotídeos endógena ou a expressão e/ou atividade de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo heterólogo ou não nativo. Os termos "nível alterado de expressão" e "nível modificado de expressão" são utilizados indiferentemente e significam que um polinucleotídeo, polipeptídeo, ou hidrocarboneto está presente em uma concentração diferente em uma célula hospedeira, em comparação com a sua concentração em uma célula de tipo selvagem correspondente sob as mesmas condições. Tal como aqui utilizado, o termo "expresso" com respeito a um polinucleotídeo é para fazer com que o mesmo funcione. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo (ou proteína) será, quando expresso, transcrito e traduzido para produzir esse polipeptídeo (ou proteína).

[0060] Tal como aqui utilizado, o termo "título" refere-se à quantidade de uma amina graxa ou composto ou composição relacionada a amina graxa produzida por unidade de volume de cultura de células hospedeiras. Em qualquer aspecto das composições e métodos aqui descritos, uma amina graxa é produzida com um título de cerca de 25 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 75 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 125 mg/L, cerca de 150 mg/L, cerca de 175 mg/L, cerca de 200 mg/L, cerca de 225 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 275 mg/L, cerca de 300 mg/L, cerca de 325 mg/L, cerca de 350 mg/L, cerca de 375 mg/L, cerca de 400 mg/L, cerca de 425 mg/L, cerca de 450 mg/L, cerca de 475 mg/L, cerca de 500 mg/L, cerca de 525 mg/L, cerca de 550 mg/L, cerca de 575 mg/L, cerca de 600 mg/L, cerca de 625 mg/L, cerca de 650 mg/L, cerca de 675 mg/L, cerca de 700 mg/L, cerca de 725 mg/L, cerca de 750 mg/L, cerca de 775 mg/L, cerca de 800 mg/L, cerca de 825 mg/L, cerca de 850 mg/L, cerca de 875 mg/L, cerca de 900 mg/L, cerca de 925 mg/L, cerca de 950 mg/L, cerca de 975 mg/L, cerca de 1000 mg/L, cerca de 1050 mg/L, cerca de 1075 mg/L, cerca de 1100 mg/L, cerca de 1125 mg/L, cerca de 1150 mg/L, cerca de 1175 mg/L, cerca de 1200 mg/L, cerca de 1225 mg/L, cerca de 1250 mg/L, cerca de 1275 mg/L, cerca de 1300 mg/L, cerca de 1325 mg/L, cerca de 1350 mg/L, cerca de 1375 mg/L, cerca de 1400 mg/L, cerca de 1425 mg/L, cerca de 1450 mg/L, cerca de 1475 mg/L, cerca de 1500 mg/L, cerca de 1525 mg/L, cerca de 1550 mg/L, cerca de 1575 mg/L, cerca de 1600 mg/L, cerca de 1625 mg/L, cerca de 1650 mg/L, cerca de 1675 mg/L, cerca de 1700 mg/L, cerca de 1725 mg/L, cerca de 1750 mg/L, cerca de 1775 mg/L, cerca de 1800 mg/L, cerca de 1825 mg/L, cerca de 1850 mg/L, cerca de 1875 mg/L, cerca de 1900 mg/L, cerca de 1925 mg/L, cerca de 1950 mg/L, cerca de 1975 mg/L, cerca de 2000 mg/L (2 g/L), 3 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 2 0 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L , 90 g/L, 100 g/L ou uma faixa limitada por quaisquer dois dos valores acima referidos. Em outras formas de realização, uma amina graxa é produzida com um título superior a 100g/L, superior a 200 g/L, ou mais do que 300 g/L. Um título preferido de um amina graxa produzida por uma célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da presente invenção é de 5 g/L a 200 g/L, 10 g/L a 150 g/L, 20 g/L a 120 g/L e 30 g/L a 100 g/L. O título pode referir-se a uma amina graxa em particular ou uma combinação ou composição de aminas graxas, produzidas por uma determinada cultura de células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, a expressão da proteína biossintética que pode converter um aldeído graxo em uma amina graxa em uma célula hospedeira recombinante, tal como E. Coli, resulta na produção de um título mais elevado, em comparação com uma célula hospedeira recombinante que expressa o polipeptídeo do tipo selvagem correspondente que falta a expressão da proteína biossintética que pode converter um aldeído graxo em uma amina graxa. Em uma forma de realização, o maior título varia de pelo menos cerca de 5 g/L a cerca de 200 g/L.

[0061] Tal como aqui utilizado, o "rendimento de um composto relacionado a uma amina graxa incluindo aminas graxas produzidas por uma célula hospedeira" refere-se a eficiência pela qual uma fonte de carbono de entrada é convertida no produto em uma célula hospedeira. As células hospedeiras modificadas para produzir uma amina graxa ou um composto relacionado a uma amina graxa de acordo com os métodos da presente invenção tem um rendimento de pelo menos cerca de 3 %, pelo menos cerca de 4 %, pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 6 %, pelo menos cerca de 7 %, pelo menos cerca de 8 %, pelo menos cerca de 9 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 11 %, pelo menos cerca de 12 %, pelo menos cerca de 13 %, pelo menos cerca de 14 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 16 %, pelo menos cerca de 17 %, pelo menos cerca de 18 %, pelo menos cerca de 19 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 21 %, pelo menos cerca de 22 %, pelo menos cerca de 23 %, pelo menos cerca de 24 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 26 %, pelo menos cerca de 27 %, pelo menos cerca de 28 %, pelo menos cerca de 29 %, ou pelo menos cerca de 30 % ou uma faixa limitada por quaisquer dois dos valores acima descritos. Em outras formas de realização, uma amina graxa é produzida com um rendimento de mais do que cerca de 30 %, mais do que cerca de 35 %, mais do que cerca de 40 %, mais do que cerca de 45 %, mais do que cerca de 50 %, mais do que cerca de 55 %, mais do que cerca de 60 %, mais do que cerca de 65 %, mais do que cerca de 70 %, mais do que cerca de 75 %, mais do que cerca de 80 %, mais do que cerca de 85 %, mais do que cerca de 90 % ou superior. Em alternativa, ou em adição, o rendimento é de cerca de 30 % ou menos, cerca de 27 % ou menos, cerca de 25 % ou menos ou cerca de 22 % ou menos. Em uma outra forma de realização, o rendimento é de cerca de 50 % ou menos, cerca de 45 % ou menos ou cerca de 35 % ou menos. Em uma outra forma de realização, o rendimento é de cerca de 95 % ou menos, ou 90 % ou menos, ou 85 % ou menos, ou 80 % ou menos, ou 75 % ou menos, ou 70 % ou menos, ou 65 % ou menos, ou 60 % ou menos, ou 55 % ou menos ou 50 % ou menos. Assim, o rendimento pode ser limitado por quaisquer dos dois pontos de extremidade acima. Por exemplo, o rendimento de uma amina graxa ou um composto relacionado a uma amina graxa produzidos pela célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da invenção podem ser de cerca de 5 % a cerca de 15 %, cerca de 10 % a cerca de 25 %, cerca de 10 % a cerca de 22 %, cerca de 15 % a cerca de 27 %, cerca de 18 % a cerca de 22 %, cerca de 20 % a cerca de 28 %, cerca de 20 % a cerca de 30 %, cerca de 30 % a cerca de 40 %, cerca de 40 % a cerca de 50 % , cerca de 50 % a cerca de 60 %, cerca de 60 % a cerca de 70 %, cerca de 70 % a cerca de 80 %, cerca de 80 % a cerca de 90 % ou cerca de 90 % a cerca de 100 %. O rendimento pode referir-se a uma amina graxa particular ou um composto relacionado a uma amina graxa ou uma combinação de aminas graxas produzidos por uma determinada cultura de células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, a expressão de uma proteína biossintética que pode converter um aldeído graxo em uma amina graxa em uma célula hospedeira recombinante, tal como E. Coli, resulta na produção de um maior rendimento de aminas graxas ou compostos derivados de amina graxa incluindo composições ou misturas de aminas graxa quando comparado com uma célula hospedeira que expressa o polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Em uma forma de realização, o maior rendimento varia de cerca de 10 % a cerca de 100 % do rendimento teórico.

[0062] Tal como aqui utilizado, o termo "produtividade" refere-se à quantidade de a uma amina graxa ou um composto relacionado a uma amina graxa incluindo uma composição ou combinação de uma ou mais aminas graxas produzidos por unidade de volume de cultura de células hospedeiras por unidade de tempo. Em qualquer aspecto das composições e métodos aqui descritos, a produtividade de um composto relacionado a uma amina graxa incluindo uma composição ou combinação de aminas graxas produzidos por uma célula hospedeira recombinante é pelo menos 100 mg/L/hora, pelo menos 200 mg/L/hora, pelo menos 300 mg/L/hora, pelo menos 400 mg/L/hora, pelo menos 500 mg/L/hora, pelo menos 600 mg/L/hora, pelo menos 700 mg/L/hora, pelo menos 800 mg/L/hora, pelo menos 900 mg/L/hora, pelo menos 1000 mg/L/hora, pelo menos 1100 mg/L/hora, pelo menos 1200 mg/L/hora, pelo menos 1300 mg/L/hora, pelo menos 1400 mg/L/hora, pelo menos 1500 mg/L/hora, pelo menos 1600 mg/L/hora, pelo menos 1700 mg/L/hora, pelo menos 1800 mg/L/hora, pelo menos 1900 mg/L/hora, pelo menos 2000 mg/L/hora, pelo menos 2100 mg/L/hora, pelo menos 2200 mg/L/hora, pelo menos 2300 mg/L/hora, pelo menos 2400 mg/L/hora, 2500 mg/L/hora ou tão alto como 10 g/L/hora (dependendo da massa celular). Por exemplo, a produtividade de um composto de amina gorda relacionadas incluindo uma composição ou mistura de aminas gordas, produzidos por uma célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da presente invenção pode ser de 500 mg/L/hora a 2500 mg/L/hora, ou a partir de 700 mg/L/hora a 2000 mg/L/hora. A produtividade pode referir-se a um composto particular de amina gorda relacionadas incluindo uma composição de aminas gordas ou uma mistura de uma amina gorda ou uma combinação de aminas gordas, produzidos por uma determinada cultura de células hospedeiras. Por exemplo, a expressão de uma proteína biossintética que pode converter um aldeído graxo em uma amina graxa em uma célula hospedeira recombinante, tal como E. Coli, resulta na produção de um aumento da produtividade de compostos derivados de amina graxa incluindo aminas graxas e composições e combinações das mesmas em comparação com uma célula hospedeira recombinante que expressa o polipeptídeo de tipo selvagem correspondente. Em uma forma de realização, a maior produtividade varia de cerca de 0,3 g/L/h a cerca de 3 g/L/h.

[0063] Tal como aqui utilizado, o termo "espécies graxas totais" e "produto de amina graxa total" e " derivado de amina graxa" podem ser aqui utilizados indiferentemente com referência à quantidade de aminas graxas que podem ser produzidas pela célula hospedeira que expressa a proteína biossintética que pode converter aldeído graxo em uma amina graxa, tal como avaliada por GC- FID.

[0064] Tal como aqui utilizado, o termo "taxa de utilização da glicose" significa a quantidade de glicose usada pela cultura por unidade de tempo, expressa como gramas/litro/hora (g/L/h).

[0065] Tal como aqui utilizado, o termo "fonte de carbono" refere-se a um substrato ou composto adequado para ser usado como uma fonte de carbono para o crescimento celular procariótico ou eucariótico simples. As fontes de carbono podem ser de várias formas, incluindo, mas não se limitando a polímeros, carboidratos, ácidos, álcoois, aldeídos, cetonas, aminoácidos, peptídeos e gases (por exemplo, CO e CO2). Exemplos de fontes de carbono incluem, mas não estão limitados a monossacarídeos, tais como glicose, frutose, manose, galactose, xilose e arabinose; oligossacarídeos, tais como fruto-oligossacarídeo e galacto-oligossacarídeo; polissacarídeos, tais como amido, celulose, pectina e xilano; dissacarídeos, tais como sacarose, maltose, celobiose, e turanose; material celulósico e variantes, tais como hemiceluloses, metilcelulose e carboximetilcelulose de sódio; ácidos graxos saturados ou insaturados, succinato, lactato e acetato; álcoois, tais como etanol, metanol e glicerol, ou suas misturas. A fonte de carbono também pode ser um produto da fotossíntese, tal como glicose. Em certas formas de realização, a fonte de carbono é uma mistura de gases contendo CO proveniente de gás flu. Em uma outra forma de realização, a fonte de carbono é uma mistura de gases contendo CO proveniente da reformação de um material contendo carbono, tais como a biomassa, carvão ou gás natural. Em outras formas de realização a fonte de carbono é o gás de síntese, o metano ou gás natural. Em certas formas de realização preferidas, a fonte de carbono é biomassa. Em outras formas de realização preferidas, a fonte de carbono é glicose. Em outras formas de realização preferidas, a fonte de carbono é sacarose. Em outras formas de realização a fonte de carbono é glicerol. Em outras formas de realização preferidas, a fonte de carbono é um açúcar de um suco de lata, xarope de cana-de-açúcar ou xarope de milho. Em outras formas de realização preferidas, a fonte de carbono é obtida a partir de matérias-primas renováveis, tais como CO2, CO, glicose, sacarose, xilose, arabinose, glicerol, manose ou suas misturas. Em outras formas de realização, a fonte de carbono é obtida a partir de matérias-primas renováveis incluindo amidos, biomassa celulósica, melaço e outras fontes de carboidratos, incluindo misturas de carboidratos derivados da hidrólise de biomassa celulósica, ou os materiais residuais derivados do processamento de plantas ou óleo natural.

[0066] Tal como aqui utilizado, o termo "biomassa" refere-se a qualquer material biológico a partir do qual uma fonte de carbono é derivada. Em algumas formas de realização, uma biomassa é transformada em uma fonte de carbono, a qual é adequada para bioconversão. Em outras formas de realização, a biomassa não exige processamento adicional para uma fonte de carbono. A fonte de carbono pode ser convertida em uma composição que compreende as aminas graxas. Um exemplo de fonte de biomassa é a matéria da planta ou a vegetação, tais como milho, cana-de-açúcar ou “switchgrass”. Outro exemplo de fonte de biomassa é produtos residuais metabólicos, tais como a matéria animal (por exemplo, estrume de vaca). Outros exemplos de fontes de biomassa incluem as algas e outras plantas marinhas. Biomassa inclui ainda os produtos residuais da indústria, da agricultura, silvicultura e famílias, incluindo, mas não limitada a glicerol, resíduos de fermentação, ensilagem, palha, madeira serrada, esgoto, lixo, resíduo urbano celulósico e restos de alimentos (por exemplo, sabões, óleos e ácidos graxos). O termo "biomassa" pode também referir-se a fontes de carbono, tais como carboidratos (por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos).

[0067] Tal como aqui utilizado, o termo "isolado", no que diz respeito aos produtos (tais como aminas graxas e composições e suas combinações) refere-se aos produtos que são separados a partir de componentes celulares, meios de cultura de células, ou precursores químicos ou sintéticos. As aminas graxas produzidas pelos métodos aqui descritos podem ser relativamente imiscíveis no caldo de fermentação, assim como no citoplasma. Portanto, as aminas graxas podem recolher-se em uma fase orgânica, quer intracelularmente ou extracelularmente.

[0068] Tal como aqui utilizados, os termos "purificar", "purificado" ou "purificação" significa a remoção ou o isolamento de uma molécula do seu ambiente, por exemplo, o isolamento ou separação. Moléculas "substancialmente purificadas" são, pelo menos, cerca de 60 % livre (por exemplo, pelo menos cerca de 70 % livre, pelo menos cerca de 75 % livre, pelo menos cerca de 85 % livre, pelo menos cerca de 90 % livre, pelo menos cerca de 95 % livre, pelo menos cerca de 97 % livre, e pelo menos cerca de 99 % livre) a partir de outros componentes com os quais estão associadas. Como aqui utilizados, estes termos também se referem à remoção de contaminantes de uma amostra. Por exemplo, a remoção de contaminantes pode resultar num aumento da percentagem de compostos derivados de aminas graxas incluindo aminas graxas e composições e suas combinações em uma amostra. Por exemplo, quando um composto relacionado a uma amina graxa é produzido em uma célula hospedeira recombinante, o composto relacionado a amina graxa pode ser purificado, por remoção de proteínas da célula hospedeira e/ou outro material da célula hospedeira. Após a purificação, a percentagem de aminas graxas da amostra é aumentada. Os termos "purificar", "purificado" e "purificação" são termos relativos, que não requer uma pureza absoluta. Assim, por exemplo, quando um composto relacionado a uma amina graxa é produzido em células hospedeiras recombinantes, o composto de amina graxa está substancialmente separado de outros componentes celulares (por exemplo, ácidos nucleicos, polipeptídeos, lipídeos, carboidratos, ou outros hidrocarbonetos).

[0069] Tal como aqui utilizado, o termo "atenuar" significa enfraquecer, reduzir ou diminuir. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser atenuado através da modificação do polipeptídeo para reduzir a sua atividade (por exemplo, por modificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo).

[0070] Os termos "enzima biossintética produtora de aldeído graxo" ou "enzima geradora de aldeído graxo" são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a um polipeptídeo ou uma proteína ou uma enzima que possui a atividade enzimática para gerar aldeídos graxos ou precursores de aldeído graxo. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não estão limitados a uma ácido carboxílico redutase (CAR) (por exemplo, CarB) e/ou uma tioesterase (TE) (por exemplo, TesA, 'tesA); uma acil-ACP redutase (AAR) (por exemplo, a partir de Synechococcus elongatus PCC7942); uma acil-CoA redutase (por exemplo, Acrl); uma fosfopanteteinila transferase (PPTase); e similar.

De precursores de aldeído graxo para aminas graxas

[0071] A presente invenção refere-se à produção microbiana de aminas graxas. Tal como mostrado aqui, os microrganismos podem ser geneticamente modificados para expressar várias enzimas biossintéticas a fim de produzir aminas graxas in vivo. Mais especificamente, um microrganismo pode ser geneticamente manipulado para expressar uma via metabólica que converte um aldeído graxo em uma amina graxa. A via expressa pelo menos uma enzima biossintética que tem atividade aminotransferase (por exemplo, aminotransferase putrescina (YgjG) ou aminotransferase GABA (PuuE) a partir de Escherichia coli); ou aminodesidrogenase (por exemplo, metilamina desidrogenase de Paracoccus denitrificans ou aminodesidrogenase de proteína quinohemo de Pseudomonas spp.) ou aminooxidase para converter aldeídos graxos em aminas graxas. Transaminases realizam a mesma reação que as aminotransferases e estes nomes são por vezes utilizados indiferentemente. Por exemplo, a aminotransferase GABA é também referida como 4-aminobutirato transaminase. Em uma forma de realização, a aminotransferase ou transaminase ou aminodesidrogenase ou aminooxidase é uma enzima biossintética exógena ou expressa de forma exógena na célula. Alternativamente, as aminas graxas podem ser produzidas através da combinação das vias modificadas para a produção de uma amina graxa expressando uma enzima biossintética que tem atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase ou aminooxidase para converter aldeídos graxos em aminas graxas com uma via manipulada para a produção de aldeídos graxos expressando uma enzima biossintética exógena que produz aldeídos graxos. Tais precursores de aldeído graxo podem ser gerados in vivo por uma variedade de processos e de vias manipuladas, tais como uma via manipulada de ácido carboxílico redutase (CAR) utilizada para a produção de aldeídos graxos (ver Patente N° US 8097439, aqui incorporada por referência) ou uma via manipulada de tioesterase (TE) e CAR utilizada para a produção de álcool graxo (ver Patente N° US 8097439, supra) ou uma via manipulada de fosfopanteteinila transferase (PPTase) e CAR utilizada para a produção de aldeído graxo ou álcool graxo (ver Pedido de patente publicação N° US 20130035513, aqui incorporado por referência) ou uma via manipulada de acil-ACP redutase (AAR) utilizada para a produção de aldeídos graxos (ver Patente N° US 8268599, aqui incorporada por referência) ou para a produção de alcanos (ver Patente N° US 8323924, aqui incorporada por referência). Um exemplo de uma TE adequada é "TesA (isto é, uma tioesterase truncada de E. coli, que tem a sua sequência periplasma líder removida (daí a apóstrofe), de tal forma que ela permanece no citoplasma); um exemplo de uma CAR adequada é CarB; um exemplo de uma AAR adequada é a enzima a partir de Synechococcus elongatus PCC7942 (ver Tabela 6, infra).

[0072] Em uma forma de realização, a co-expressão de uma via manipulada para a produção de aldeído graxo e uma via manipulada para a produção de uma amina graxa com a expressão de uma enzima biossintética tendo atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase ou aminooxidase, juntamente com a suplementação com uma fonte de nitrogênio adequada (por exemplo, glutamato de amônia ou peróxido de hidrogênio), permite a conversão de um precursor de aldeído na amina correspondente (ver Tabela 1 para aminotransferase putrescina; ver Tabelas 2, 3 e 4, para exemplos de reações enzimáticas). A disponibilidade de doadores de nitrogênio (por exemplo, glutamato) para a reação de aminotransferase pode ser opcionalmente aumentada pela super expressão de glutamato desidrogenase para aumentar a taxa da biossíntese de glutamato. A glutamato desidrogenase de E. coli nativa usa NADPH como cofator redox, assim, substituindo esta enzima com uma glutamato desidrogenase que é capaz de utilizar o NADH em vez disso (tal como, por exemplo, as glutamato desidrogenases de Bacteroides spp. incluindo, mas limitadas a B. thetaiotaomicron, B. fragilis, B. distasonis, B. ovatus, B. vulgatus, e B. uniformis) pode aumentar a disponibilidade de NADPH na célula. Isto pode proporcionar um aumento da oferta de NADPH para outros processos biossintéticos que dependem de NADPH (por exemplo, a biossíntese de ácidos graxos).

[0073] A Tabela 1 abaixo (infra) mostra os numerous EC e nomes de várias enzimas biossintéticas que são úteis na produção de aminas, incluindo aminotransferases/ transaminases. A comissão de enzima ou número de classificação (número EC) é um sistema de classificação numérica para as enzimas com base nas reações químicas que elas catalisam. Os números EC não especificam tecnicamente as enzimas, ao invés disso, eles especificam reações catalisadas por enzimas. Por exemplo, se enzimas diferentes (por exemplo, a partir de diferentes organismos) catalisam a mesma reação então elas recebem o mesmo número EC. Além disso, diferentes dobras de proteínas podem catalisar uma reação idêntica e podem, portanto, serem atribuídas um número EC idêntico por causa da evolução convergente (isto é, estas são chamadas enzimas isofuncionais não homólogas, ou NISE). Como mostrado na Tabela 1, a atividade enzimática da aminotransferase putrescina é classificada com o número EC 2.6.1.82. Todas as enzimas apresentadas na Tabela 1 participam em reações químicas que resultam em aminas e são classificadas como aminotransferases/transaminases porque o seu número EC cai sob o EC 2.6.1 (ver também a Tabela 7,infra). A Tabela 2 abaixo (infra) mostra uma série de enzimas biossintéticas diferentes que podem produzir aminas graxas a partir de precursores de aldeído graxo. Por exemplo, as aminotransferases ou transaminases, aminooxidases e aminodesidrogenases catalisam reações em que precursores de aldeído graxo são convertidos em aminas graxas. Em uma forma de realização, uma via metabólica manipulada inclui uma aminotransferase ou transaminase para a produção de aldeídos graxos in vivo. Em uma outra forma de realização, uma via metabólica manipulada inclui uma aminooxidase para a produção de aldeídos graxos in vivo. Em uma outra forma de realização, uma via metabólica manipulada inclui uma aminodesidrogenase para a produção de aldeídos graxos in vivo. A Tabela 3 abaixo (infra) mostra a reação catalisada pela aminotransferase putrescina, isto é, a conversão de aldeídos graxos em aminas graxas.Tabela 1: Enzimas envolvidas na produção de aminas sob EC 2.6.1

Tabela 2: Reações enzimáticas que produzem aminas graxas

Tabela 3: Reação enzimática da aminotransferase putrescina

[0074] A fim de ilustrar a presente invenção,células hospedeiras recombinantes foram manipuladas para expressar uma tioesterase (TE) que catalisa a conversão de acil-ACPs ou acil-CoAs em ácidos graxos livres; e uma ácido carboxílico redutase (CAR) que converte os ácidos graxos livres em aldeídos graxos. As células hospedeiras recombinantes foram adicionalmente manipuladas para expressar uma aminotransferase putrescina (YgjG) a fim de converter os aldeídos graxos em aminas graxas (ver Exemplo 1 para os resultados experimentais; ver Tabela 3 (supra) para a reação enzimática realizada pela YgjG; ver Tabela 5 (infra) para o mecanismo da aminotransferase/transaminase). Aqui, o gene ygjG foi clonado a partir E. coli e ligado em um vetor de expressão para gerar um plasmídeo de expressão. Um segundo plasmídeo de expressão foi gerado por clonagem e integrou um gene carB e tesA. As células foram em seguida transformadas com ambos os plasmídeos e cultivadas em um caldo de fermentação com uma fonte de carbono. A produção de aminas graxas foi confirmada enquanto as células de controle não produziram aminas graxas (ver Exemplo 1). Qualquer aminotransferase/transaminase adequada pode ser utilizada para a produção de aminas graxas desde que a atividade enzimática possa converter aldeídos graxos em aminas graxas. Se a célula produz naturalmente aldeídos graxos, em seguida, a célula é manipulada para expressar uma aminotransferase putrescina exógena (YgjG), como se mostra no Exemplo 1, a fim de converter os aldeídos graxos naturalmente presentes em aminas graxas.

[0075] Em uma outra forma de realização, uma aminodesidrogenase pode ser utilizada em vez de uma aminotransferase para converter aldeídos graxos em aminas graxas (ver a Tabela 4 (infra) para a reação enzimática efetuada por uma aminodesidrogenase; e Tabela 7 (infra) para exemplos de enzimas). Isto é aplicável se a fonte de nitrogênio for amônia em vez de aminoácidos. Exemplos de aminodesidrogenases que são úteis para converter aldeídos graxos em aminas graxas caem sob números EC: EC 1.4.9; EC 1.4.98; e EC 1.4.99 (ver Tabela 7, infra). Por exemplo, alanina desidrogenase, glutamato desidrogenase, L-lisina-6- desidrogenase; e metilamina desidrogenase são exemplos de aminodesidrogenases que podem ser utilizadas para converter os aldeídos graxos em aminas graxas (ver Tabela 7, infra).

[0076] Em ainda outra forma de realização, aminooxidase pode ser utilizada em vez de uma aminotransferase para converter aldeídos graxos em aminas graxas.Tabela 4: Reação de aminodesidrogenase

Tabela 5: Mecanismo para aminotransferase/transaminase

[0077] As Tabelas 6 e 7 abaixo (infra) retratam diversas atividades enzimáticas e seus números de classificação de enzima (EC) correspondentes. Tabela 6: Atividades enzimáticas

Tabela 7: Exemplos de transferases/ transaminases (EC 2.6.1) e aminodesidrogenases (EC 1.4.9, EC 1.4.98, EC 1.4.99)

Células hospedeiras microbianas e suas culturas

[0078] Os microrganismos da presente invenção funcionam como células hospedeiras microbianas e compreendem uma ou mais sequências de polinucleotídeos que incluem um enquadramento de leitura aberto que codifica pelo menos uma enzima biossintética exógena da presente invenção. Em uma forma de realização, uma composição de amina graxa é produzida por cultura de células hospedeiras que expressam uma enzima biossintética exógena (e.g., aminotransferases/transaminases ou aminodesidrogenases ou aminooxidases) na presença de uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar as aminas graxas. Em uma outra forma de realização, uma composição de amina graxa é produzida por cultura de células hospedeiras que expressam uma ou mais de uma enzima biossintética exógena (por exemplo, aminotransferases/transaminases ou aminodesidrogenases ou aminooxidases em combinação com uma ou mais enzimas que geram aldeído tal como uma CAR (por exemplo, CarB) e/ou uma TE (por exemplo, TesA, 'tesA) na presença de uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar as aminas graxas. Em uma outra forma de realização, uma composição de amina graxa é produzida por cultura de células hospedeiras que expressam uma ou mais de uma enzima biossintética exógena (por exemplo, aminotransferases/transaminases ou aminodesidrogenases ou aminooxidases em combinação com uma ou mais enzimas que geram aldeído tal como uma acil-ACP redutase (AAR) (por exemplo, a partir de Synechococcus elongatus PCC7942) na presença de uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar as aminas graxas. Em uma outra forma de realização, uma composição de amina graxa é produzida por cultura de células hospedeiras que expressam uma ou mais de uma enzima biossintética exógena (por exemplo, aminotransferases/transaminases ou aminodesidrogenases ou aminooxidases em combinação com uma ou mais enzimas que geram aldeído tal como uma acil-CoA redutase (por exemplo, AcrL) na presença de uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar as aminas graxas. Em uma outra forma de realização, uma composição de amina graxa é produzida por cultura de células hospedeiras que expressam uma ou mais de uma enzima biossintética exógena (por exemplo, aminotransferases/transaminases ou aminodesidrogenases ou aminooxidases em combinação com uma ou mais enzimas que geram aldeído tal como uma fosfopanteteinila transferase (PPTase) na presença de uma fonte de carbono sob condições eficazes para expressar as aminas graxas.

[0079] A expressão das enzimas biossintéticas resulta na produção de aminas graxas com rendimentos aumentados de aminas graxas e/ou composições de aminas graxas ou suas misturas. Em uma forma de realização, a expressão de um polipeptídeo aminotransferase ou aminodesidrogenase na célula hospedeira resulta em um elevado rendimento de aminas graxas ou suas composições. Em uma outra forma de realização, a expressão de um polipeptídeo aminotransferase ou aminodesidrogenase em combinação com uma ou mais enzimas que geram aldeído na célula hospedeira resulta em um elevado rendimento de aminas graxas e suas composições. Em uma outra forma de realização, a expressão de uma aminooxidase em combinação com uma ou mais enzimas que geram aldeído na célula hospedeira resulta em um elevado rendimento de aminas graxas e suas composições. Em algumas formas de realização, as enzimas biossintéticas são expressas na célula de forma exógena.

[0080] As células hospedeiras ou microrganismos da presente invenção podem incluir cepas hospedeiras ou células hospedeiras que são geneticamente manipuladas ainda mais para conter alterações a fim de testar a eficácia de mutações ou manipulações específicas sobre as atividades enzimáticas (i.e., células recombinantes ou microrganismos). Várias manipulações e alterações genéticas opcionais podem ser utilizadas indiferentemente a partir de uma célula hospedeira para outra dependendo de quais vias enzimáticas nativas estão presentes na célula hospedeira original. Em uma forma de realização, uma cepa hospedeira pode ser usada para testar a expressão de um polipeptídeo aminotransferase ou aminodesidrogenase em combinação com um polipeptídeo que gera aldeído. Uma cepa hospedeira pode abranger uma série de alterações genéticas a fim de testar variáveis específicas, incluindo, mas não se limitando a, condições de cultura, incluindo componentes de fermentação, fonte de carbono (por exemplo, matérias-primas), temperatura, pressão, condições de contaminação de cultura reduzida e os níveis de oxigénio.

[0081] Em uma forma de realização, uma cepa hospedeira abrange uma deleção opcional fadE e fhuA. A Acil-CoA desidrogenase (FadE) é uma enzima que é importante para a metabolização de ácidos graxos. Ela catalisa o segundo passo na utilização de ácidos graxos (beta- oxidação), que é o processo de quebra de cadeias longas de ácidos graxos (acil-CoA) em moléculas de acetil-CoA. Mais especificamente, a segunda etapa do ciclo de degradação- oxidação de ácidos graxos nas bactérias, é a oxidação de acil-CoA para 2-enoil-CoA, a qual é catalisada pela FadE. Quando a E. coli carece de FadE ela não pode crescer em ácidos graxos como fonte de carbono, mas pode crescer em acetato. A incapacidade de utilizar ácidos graxos de qualquer comprimento de cadeia é consistente com o fenótipo relatado de cepas fadE, ou seja, cepas mutantes de fade onde a função FadE é interrompida. O gene fadE pode ser opcionalmente eliminado ou atenuado para assegurar que acil-CoAs, que podem ser intermediários em uma via de amina graxa, possam acumular-se na célula de tal modo que todo o acil-CoA possa ser eficientemente convertido em aminas graxas. No entanto, a atenuação de fadE é opcional quando o açúcar é usado como uma fonte de carbono, uma vez que sob tal condição de expressão, FadE é provavelmente reprimida e FadE, portanto, só pode estar presente em pequenas quantidades e não é capaz de competir de forma eficiente com a éster sintase para substratos Acil-CoA. FadE é reprimida devido à repressão catabólica. E. coli e outros micróbios preferem consumir açúcar sobre os ácidos graxos, por isso, quando ambas as fontes estão disponíveis o açúcar é consumido primeiro por reprimir o regulon de fad (ver D.Clark, J Bacteriol (1981) 148 (2):521-6)). Além disso, a ausência de açúcares induz a expressão de FadE. Intermediários Acil-CoA podem ser perdidos para a via de beta-oxidação uma vez que as proteínas expressas pelo regulon de fad (incluindo FadE) são up-reguladas e irão competir eficientemente por acil-CoA. Assim, pode ser beneficial sob certas circunstâncias ter o gene fadE eliminado ou atenuado. Uma vez que muitas fontes de carbono são baseadas em carboidratos, é opcional atenuar o FadE. Genes fhuA codificam para a proteína TonA, que é um transportador e receptor de energia acoplado na membrana externa de E. coli (V. Braun (2009) J Bacteriol I9I (LL):343I-3436). Sua deleção é opcional. A deleção de fhuA permite que a célula se torne mais resistente ao ataque de fagos o que pode ser beneficial em certas condições de fermentação. Assim, pode ser desejável a deleção de fhuA em uma célula hospedeira que esteja provavelmente sujeita à contaminação potencial durante a execução da fermentação.

[0082] Em uma outra forma de realização, a cepa hospedeira (supra) pode ainda abranger opcionalmente super expressão de um ou mais dos seguintes genes incluindo fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, FABv, e/ou fabF. Exemplos de tais genes são fadR a partir de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), FABv de Vibrio cholera (YP_001217283) e fabF de Clostridium acetobutylicum (NP_350156). A super expressão opcional de um ou mais destes genes, que codificam para enzimas e reguladores na biossíntese de ácidos graxos, pode servir para aumentar o título de compostos derivados de ácidos graxos sob várias condições de cultura.

[0083] Em uma outra forma de realização, as cepas de E. coli são usadas como células hospedeiras para a produção de aminas graxas. Similarmente, estas células hospedeiras podem fornecer super expressão opcional de um ou mais genes de biossíntese (ou seja, genes que codificam para enzimas e reguladores da biossíntese de ácidos graxos) que pode aumentar o título de compostos derivados de ácidos graxos, tais como aminas graxas sob várias condições de cultura incluindo, mas não se limitando a fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, FABv e/ou fabF. Exemplos de alterações genéticas incluem fadR a partir de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), FABv de Vibrio cholera (YP_001217283) e fabF de Clostridium acetobutylicum (NP_350156).

[0084] Em algumas formas de realização, as células hospedeiras ou microrganismos que são utilizados para expressar as enzimas biossintéticas (por exemplo, aminotransferases ou aminodesidrogenases em combinação com enzimas que geram aldeído tais como CAR e/ou TE e/ou AAR e/ou PPTase) podem ainda expressar genes que abrangem certas atividades enzimáticas que podem aumentar a produção de um ou mais derivado (s) particular de ácido graxo, tais como ésteres de ácidos graxo, álcoois graxos, aminas graxas, aldeídos graxos, derivados de ácidos graxos bifuncionais, diácidos e semelhantes. Em uma forma de realização, a célula hospedeira tem atividade tioesterase (E.C. 3.1.2. * Ou E.C. 3.1. 2.14 ou E.C. 3.1.1.5) para a produção de ácidos graxos que pode ser aumentada por super expressão do gene. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade de éster sintase (E.C. 2.3.1.75) para a produção de ésteres de ácidos graxos. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade acil-ACP redutase (AAR) (EC 1.2.1.80) e/ou atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1.) e/ou atividade de álcool graxo acil-CoA redutase (PAR) (EC 1.1.1. *) e/ou atividade ácido carboxílico redutase (CAR) (EC 1.2.99.6) para a produção de álcoois graxos. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade acil-ACP redutase (AAR) (E.C. 1.2.1.80) para a produção de aldeídos graxos. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade acil-ACP redutase (AAR) (E.C. 1.2.1.80) e atividade descarbonilase para a produção de alcanos e alcenos. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade acil-CoA redutase (EC 1.2.1.50), atividade acil-CoA sintetase (FADD) (EC 2.3.1.86) e atividade tioesterase (EC 3.1.2. * Ou EC 3.1. 2.14 ou EC 3.1.1.5) para a produção de álcoois graxos. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade éster sintase (EC. 2.3.1.75), atividade acil-CoA sintetase (FADD) (EC. 2.3.1.86, e atividade tioesterase (EC. 3.1.2. * Ou EC. 3.1. 2.14 ou EC. 3.1.1.5) para a produção de ésteres de ácidos graxos. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade OleA para a produção de cetonas. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade OleBCD para a produção de olefinas Internas. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade acil-ACP redutase (AAR) (EC. 1.2.1.80) e atividade álcool desidrogenase (EC. 1.1.1.1.) para a produção de álcoois graxos. Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira tem atividade tioesterase (EC. 3.1.2. * Ou EC. 3.1. 2.14 ou EC. 3.1.1.5) e atividade descarboxilase para produzir olefinas terminais. A expressão das atividades enzimáticas em microrganismos e células microbianas é ensinada pelas Patente US 8.097.439; 8.110.093; 8.110.670; 8.183.028; 8.268.599; 8.283.143; 8.232.924; 8.372.610 e 8.530.221, que são aqui incorporadas por referência.

[0085] Em outras formas de realização, as células hospedeiras ou microrganismos que são utilizados para expressar as enzimas biossintéticas (por exemplo, aminotransferases ou aminodesidrogenases em combinação com enzimas que geram aldeído tais como o CAR e/ou TE e/ou AAR e/ou PPTase) irão incluir certas atividades enzimáticas nativas que são reguladas positivamente ou super expressas a fim de produzir um ou mais derivado (s) de ácido graxo particular, tais como aminas graxas. Em uma forma de realização, a célula hospedeira tem uma atividade tioesterase nativa (EC. 3.1.2. * EC. 3.1 ou 2.14 ou EC. 3.1.1.5) para a produção de ácidos graxos que pode ser aumentada por super expressão do gene da tioesterase.

[0086] A presente invenção inclui cepas hospedeiras ou microrganismos que expressam genes que codificam para as enzimas biossintéticas (por exemplo, aminotransferases ou aminodesidrogenases em combinação com enzimas que geram aldeído tais como o CAR e/ou TE e/ou AAR e/ou PPTase). Em uma forma de realização, pelo menos uma enzima biossintética exógena é expressa na célula hospedeira. Por exemplo, a célula hospedeira pode expressar uma aminotransferase exógena a fim de produzir aminas graxas. Em uma outra forma de realização, uma ou mais enzimas biossintéticas exógenas são expressas na célula hospedeira. Por exemplo, a célula hospedeira pode expressar uma aminotransferase exógena e uma ácido carboxílico redutase exógena (CAR) a fim de produzir aminas graxas. Em ainda outra forma de realização, uma ou mais enzimas biossintéticas exógenas são expressas na célula hospedeira em combinação com uma ou mais enzimas biossintéticas que são super expressas na célula hospedeira. Por exemplo, a célula hospedeira pode expressar uma aminotransferase exógena e uma ácido carboxílico redutase exógena (CAR) em combinação com uma tioesterase exógena super expressa e/ou exógena a fim de produzir aminas graxas. A tioesterase pode ser uma tioesterase expressa de forma exógena. Alternativamente, a tioesterase pode ser uma tioesterase nativa que é super expressa ou transcricionalmente regulada positivamente na célula através de um promotor particularmente forte ou outras técnicas de biologia molecular que são bem conhecidas dos técnicos no assunto. As células hospedeiras recombinantes produzem aminas graxas e composições e suas misturas. As aminas graxas são tipicamente recuperadas a partir do meio de cultura e/ou são isoladas a partir das células hospedeiras. Em uma forma de realização, as aminas graxas são recuperadas a partir do meio de cultura (extracelular). Em uma outra forma de realização, as aminas graxas são isoladas a partir das células hospedeiras (intracelulares). Em uma outra forma de realização, as aminas graxas são recuperadas a partir do meio de cultura e isoladas a partir das células hospedeiras. A composição de amina graxa produzida por uma célula hospedeira pode ser analisada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, GC-FID, a fim de determinar a distribuição de determinadas aminas graxas, bem como comprimentos de cadeia e grau de saturação dos componentes da composição de amina graxa.

[0087] Exemplos de células hospedeiras que funcionam como microrganismos (por exemplo, células microbianas), incluem mas não estão limitadas a células do gênero Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Stenotrophamonas, Yarrowia, ou Streptomyces. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é uma célula bacteriana gram-positiva. Em outras formas de realização, a célula hospedeira é uma célula bacteriana gram-negativa. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de E. coli. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de E. coli B, uma célula de E. coli C, uma célula de E. coli K, ou uma célula de E. coli W. Em outras formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de Bacillus lentus, uma célula de Bacillus brevis, uma célula de Bacillus stearothermophilus, uma célula de Bacillus lichenoformis, uma célula de Bacillus alkalophilus, uma célula de Bacillus coagulans, uma célula de Bacillus circulans, uma célula de Bacillus pumilis, uma célula de Bacillus thuringiensis, uma célula de Bacillus clausii, uma célula de Bacillus megaterium, uma célula de Bacillus subtilis ou uma célula de Bacillus amyloliquefaciens.

[0088] Em ainda outras formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de Trichoderma koningii, uma célula de Trichoderma viride, uma célula de Trichoderma reesei, uma célula de Trichoderma longibrachiatum, uma célula de Aspergillus awamori, uma célula de Aspergillus fumigatus, uma célula Aspergillus foetidus, uma célula de Aspergillus nidulans, uma célula de Aspergillus niger, uma célula de Aspergillus oryzae, uma célula de Humicola insolens, uma célula de Humicola lanoso, uma célula de Rhodococcus opacus, uma célula de Rhizomucor miehei ou uma célula de Mucor michei. Em ainda outras formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces lividans ou uma célula de Streptomyces murinus. Em ainda outras formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de Actinomicetos. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

[0089] Em outras formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de uma planta eucariótica, algas, cianobactérias, bactérias verdes com teor de enxofre, bactérias verdes sem teor de enxofre, bactérias roxas com teor de enxofre, bactéria roxas sem teor de enxofre, extremófilo, levedura, fungo, um organismo manipulado da mesma ou um organismo sintético. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é luz dependente ou fixa carbono. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira tem atividade autotrófica.

[0090] Em algumas formas de realização, a célula hospedeira tem atividade foto autotrófica, tal como na presença de luz. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é heterotrófica ou mixotrófica na ausência de luz. Em certas formas de realização, a célula hospedeira é uma célula de Arabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis Sp. PCC 6803, Thermosynechococcus alonga BP-1, Chlorobium tepidum, Chlorojlexus auranticus, Chromatiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus,Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridium thermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas fluorescens ou Zymomonas Mobilis.

[0091] Em uma forma de realização particular, a célula microbiana é obtida a partir de uma cianobactéria, incluindo, mas não se limitando a Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cyanothece e Nostoc punctiforme. Em uma outra forma de realização, a célula microbiana é de uma espécie de cianobactéria específica incluindo, mas não se limitando a Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7001.

Métodos de produção de células hospedeiras recombinantes e Cultura

[0092] Vários métodos bem conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados para manipular células hospedeiras para a produção de aminas graxas e/ou composições de aminas graxas ou misturas. Os métodos podem incluir a utilização de vetores, de preferência vetores de expressão, incluindo um ácido nucleico que codifica a enzima biossintética (por exemplo, aminotransferases ou aminodesidrogenases isoladamente ou em combinação com enzimas que geram aldeído tais como o CAR e/ou TE e/ou AAR e/ou PPTase), tal como aqui descrito. Os técnicos no assunto irão apreciar que uma variedade de vetores virais e não virais podem ser usados nos métodos aqui descritos.

[0093] Em algumas formas de realização da presente invenção, um maior título de aminas graxas em uma composição particular é um maior título de um determinado tipo de amina graxa ou uma combinação de aminas graxas, produzidas por uma cultura de células hospedeiras recombinantes em relação à titulação da mesma amina graxa ou combinação de aminas graxas produzidas por uma cultura controle de células hospedeiras de tipo selvagem correspondente. Em algumas formas de realização, os polipeptídeos biossintéticos (por exemplo, aminotransferases ou aminodesidrogenases isoladamente ou em combinação com peptídeos que geram aldeído tais como o CAR e/ou TE e/ou AAR e/ou PPTase) são fornecidos para a célula hospedeira por meio de um vetor recombinante que pode incluir um promotor operativamente ligado a uma sequência polinucleotídica específica que codifica para um polipeptídeo biossintético específico. Em certas formas de realização, o promotor é um promotor desenvolvidamente regulado, organela-específico, tecido específico, induzível, constitutivo, ou específico de células. O vetor recombinante compreende tipicamente pelo menos uma sequência selecionada a partir de uma sequência de controle de expressão operativamente ligada à sequência polinucleotídica; um marcador de seleção operativamente ligado à sequência polinucleotídica; uma sequência de marcador operativamente ligado à sequência polinucleotídica; uma porção de purificação operacionalmente ligada à sequência polinucleotídica; uma sequência de secreção operativamente ligada à sequência polinucleotídica; e uma sequência de direcionamento operativamente ligada à sequência polinucleotídica. As sequências polinucleotídicas, que compreendem enquadramentos de leitura abertos que codificam proteínas e sequências reguladoras operativamente ligadas podem ser integradas em um cromossoma das células hospedeiras recombinantes, incorporadas em um ou mais sistemas de expressão do plasmídeo residente nas células hospedeiras recombinantes, ou ambos.

[0094] Os vetores de expressão incluem uma sequência polinucleotídica, tal como aqui descrita em uma forma adequada para a expressão da sequência polinucleotídica em uma célula hospedeira. Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado, etc. Os vetores de expressão aqui descritos podem ser introduzidos em células hospedeiras para a produção de polipeptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão, codificados pelas sequências polinucleotídicas como aqui descrito. Expressão de genes que codificam para polipeptídeos em procariotas, por exemplo, E. coli, é mais frequentemente realizada com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis dirigindo a expressão de polipeptídeos quer de fusão ou de não-fusão. Os sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas são bem conhecidos no estado da técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). Em certas formas de realização, uma sequência polinucleotídica da presente invenção está operativamente ligada a um promotor derivado do bacteriófago T5. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Nesta forma de realização, o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Os vetores podem ser introduzidos em células procarióticas ou eucarióticas através de uma variedade de técnicas reconhecidas para a introdução de ácido nucleico estranho (e.g., DNA) em uma célula hospedeira. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em, por exemplo, Sambrook et al. (Supra).

[0095] Para a transformação estável de células bacterianas, é sabido que, dependendo do vetor de expressão e técnica de transformação utilizada, apenas uma pequena fração das células tomará e replicará o vetor de expressão. De modo a identificar e selecionar estes transformantes, um gene que codifica um marcador selecionável (e.g., resistência a um antibiótico) pode ser introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a drogas, tais como, mas não limitados a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os ácidos nucleicos que codificam para um marcador de seleção podem ser introduzidos em uma célula hospedeira no mesmo vetor que codifica um polipeptídeo aqui descrito ou pode ser introduzido em um vetor separado. As células estavelmente transformadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas através do crescimento na presença de uma droga de seleção apropriada.

Cultura e Fermentação de células hospedeiras recombinantes

[0096] Tal como aqui utilizado, o termo "fermentação" refere-se genericamente a conversão de materiais orgânicos em substâncias alvo pelas células hospedeiras, por exemplo, a conversão de uma fonte de carbono pelas células hospedeiras recombinantes em aminas graxas ou os seus derivados por propagação de uma cultura de células hospedeiras recombinantes em um meio que compreende a fonte de carbono. Tal como aqui utilizado, o termo "condições permissivas para a produção" significa todas as condições que permitem que uma célula hospedeira produza um produto desejado, tal como uma amina graxa ou composição de amina graxa ou mistura. Da mesma forma, o termo "condições em que a sequência polinucleotídica de um vetor é expressa" significa todas as condições que permitem que uma célula hospedeira sintetize um polipeptídeo. As condições adequadas incluem, por exemplo, as condições de fermentação. As condições de fermentação podem compreender diversos parâmetros, incluindo, mas não se limitando a faixas de temperatura, níveis de aeração, taxas de alimentação e composição do meio. Cada uma destas condições, individualmente e em combinação, permite que a célula hospedeira cresça. A fermentação pode ser aeróbia, anaeróbia, ou suas variações (como micro-aeróbia). Exemplos de meios de cultura incluem caldos ou géis. Geralmente, a forma inclui uma fonte de carbono que pode ser metabolizada por uma célula hospedeira diretamente. Além disso, as enzimas podem ser usadas na forma de facilitar a mobilização (por exemplo, a despolimerização da celulose ou de amido em açúcares fermentáveis) e subsequente metabolização da fonte de carbono.

[0097] Para a produção em pequena escala, as células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em lotes de, por exemplo, cerca de 100 μL, 200 μL, 300 μL, 400 μL, 500 μL, 1 mL, 5 mL, 10 mL, 15 mL, 25 mL, 50 mL, 75 ml, 100 ml, 500 ml, 1 L, 2 L, 5 L ou 10 L; fermentadas; e induzidas para expressar a sequência polinucleotídica desejada, tal como uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo aminotransferase/transaminase ou aminodesidrogenase ou aminooxidase sozinho ou em combinação com uma sequência polinucleotídica de geração de aldeído que codifica para um polipeptídeo CAR e/ou um TE e/ou um AAR e/ou um PPtase. Para produção em larga escala, as células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em culturas com lotes de volume de cerca de 10 L, 100 L, 1000 L, 10000 L, 100000 L, 1.000.000 L ou maior; fermentadas; e induzidas para expressar uma sequência polinucleotídica desejada. Em uma forma de realização preferida, as aminas graxas e composições derivadas de aminas graxas aqui descritas são encontradas no ambiente extracelular da cultura de células hospedeiras recombinantes e podem ser facilmente isoladas a partir do meio de cultura. Em uma outra forma de realização, as aminas graxas e composições derivadas de aminas graxas aqui descritas são encontradas no ambiente intracelular de células hospedeiras recombinantes cultivadas em cultura. Uma amina graxa ou seus derivados podem ser secretados pela célula hospedeira recombinante, transportados para o ambiente extracelular ou passivamente transferidos para o ambiente extracelular da cultura de células hospedeiras recombinantes. A composição de amina graxa pode ser isolada a partir de uma cultura de células hospedeiras recombinantes utilizando métodos de rotina conhecidos no estado da técnica.

Triagem de células hospedeiras recombinantes

[0098] Em uma forma de realização da presente invenção, a atividade de um polipeptídeo aminotransferase/transaminase ou um aminodesidrogenase ou um amiooxidase é determinada por cultura de células hospedeiras recombinantes abrangendo uma ou mais sequências polipeptídicas de aminotransferase/transaminase ou aminodesidrogenase ou aminooxidase (opcionalmente em combinação com um ou mais polipeptídeos de geração de aldeído), seguido de rastreio para identificar as características de, por exemplo, composições de aminas graxas produzidas pelas células hospedeiras recombinantes; por exemplo, título, rendimento e produtividade de aminas graxas e composições e suas misturas. Em outra forma de realização, a atividade de um polipeptídeo aminotransferase/transaminase ou aminodesidrogenase ou aminooxidase é determinada por cultura de células hospedeiras recombinantes abrangendo uma ou mais sequências polinucleotídicas de aminotransferase/transaminase ou aminodesidrogenase ou aminooxidase, seguido de rastreio para identificar as características de, por exemplo, composições de aminas graxas produzidas pelas células hospedeiras recombinantes; por exemplo: título, rendimento e produtividade de aminas graxas e composições e suas misturas. Os polipeptídeos aminotransferase/transaminase ou aminodesidrogenase ou aminooxidase e os seus fragmentos podem ser ensaiados para a sua atividade em uma célula e/ou melhorar/aumentar a produção de compostos derivados de amina utilizando métodos de rotina conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, um polipeptídeo aminotransferase/transaminase ou um aminodesidrogenase ou um aminooxidase ou seu fragmento é posto em contato com um substrato in vivo (por exemplo, um aldeído graxo produzido por co-expressão CAR e/ou TE e/ou AAR e/ou PPTase na célula) sob condições que permitem que o polipeptídeo funcione e realize a sua atividade enzimática. Uma diminuição no nível de substrato ou um aumento no nível de uma amina graxa ou uma composição de amina graxa podem ser medidos para determinar a atividade da aminotransferase/transaminase ou aminodesidrogenase ou aminooxidase. Alternativamente, uma célula que expressa um polipeptídeo aminotransferase/transaminase ou um aminodesidrogenase ou um aminooxidase ou seus fragmentos pode ser alimentada com um substrato aldeído graxo sob condições que permitem que o polipeptídeo ainda funcione e realize a sua atividade enzimática. Um aumento no nível de uma amina graxa ou uma composição de amina graxa pode então ser medido para determinar a atividade da aminotransferase/transaminase ou aminodesidrogenase ou de aminooxidase.

Produtos derivados de células hospedeiras recombinantes

[0099] Como aqui utilizado, "fração de carbon modelo" ou fM tem o mesmo significado conforme definido pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) Materiais de Referência Padrão (SRMs 4990B e 4990C, conhecido como padrões do ácido oxálico HOxl e HOxll, respectivamente. A definição fundamental refere-se a 0,95 vezes a razão isotópica 14C / 12C HOxl (com referência a AD 1950). Isto é aproximadamente equivalente à correção- decadência da revolução pré-industrial da madeira. Para a biosfera viva atual (material vegetal), fM é de aproximadamente 1,1.

[00100] Bioprodutos (por exemplo, as composições de amina graxas produzidas em conformidade com a presente invenção) que compreendem os compostos orgânicos produzidos biologicamente, e em particular, as composições de amina graxas produzidas usando a via biossintética aqui descrita, foram produzidos a partir de fontes renováveis e, como tal, são novas composições de matéria. Estes novos bioprodutos podem ser distinguidos de compostos orgânicos derivados de carbono petroquímico com base em impressões digitais carbono-isotópicas duplas ou datação 14C. Além disso, a fonte específica de carbono de origem biológica (por exemplo, glicose vs. glicerol, etc.) pode ser determinada por impressões digitais carbono-isotópicas duplas (ver, por exemplo, Patente US 7.169.588). A capacidade de distinguir bioprodutos de compostos orgânicos à base de petróleo é beneficial na localização desses materiais no comércio. Por exemplo, os compostos ou produtos químicos orgânicos que compreendem perfis de carbono isótopo tanto de base biológica quanto à base de petróleo podem ser distinguidos de compostos orgânicos e produtos químicos feitos apenas de materiais à base de petróleo. Assim, os bioprodutos aqui produzidos podem ser seguidos ou rastreados no comércio com base no seu perfil único de carbono isótopo. Bioprodutos podem ser distinguidos de compostos orgânicos à base de petróleo através da comparação da proporção de carbono isótopo estável (13Cl2C) em cada amostra. A proporção 13Cl2C em um dado bioproduto é uma consequência da relação 13Cl2C no dióxido de carbono atmosférico, no momento em que o dióxido de carbono é fixado. Esta também reflete a via metabólica precisa. As variações regionais também podem ocorrer. Petróleo, plantas C3 (folha larga), plantas C4 (gramíneas) e carbonatos marinhos todos mostram diferenças significativas na 13Cl2C e os valores de PC correspondentes. Ambas as plantas C4 e C3 apresentam uma faixa de proporções 13Cl2C isotópicas, mas os valores típicos são cerca de -7 a cerca de -13 por mil para plantas C4 e cerca de -19 a cerca de -27 por mil para plantas C3 (ver, por exemplo, Stuiver et al. (1977) Radiocarbon 19:355). Carvão e petróleo caem geralmente nesta última faixa.

[00101] Uma série de RMs alternativos foram desenvolvidos em cooperação com a IAEA, USGS, NIST e outros laboratórios de isótopos internacionais selecionados. Notações para os desvios PDB por mil é δ13C. As medições são realizadas em CO2 por espectrometria de massa de proporção estável de alta precisão (IRMS) em íons moleculares de massas 44, 45, e 46. As composições aqui descritas incluem composições de aminas graxas e produtos produzidos por qualquer dos métodos aqui descritos. Especificamente, a composição de amina graxa ou produto pode ter um δ13C de cerca de -28 ou maior, cerca de -27 ou maior, -20 ou maior, -18 ou maior, -15 ou maior, -13 ou maior, -10 ou maior ou -8 ou maior. Por exemplo, a composição de amina graxa ou produto pode ter um δ13C de cerca de -30 a cerca de -15, cerca de -27 a cerca de -19, cerca de -25 a cerca de -21, cerca de -15 a cerca de -5, cerca de -13 a cerca de -7 ou cerca de -13 a cerca de -10.Em outros casos, a composição de amina graxa ou produto pode ter um PC de cerca de -10, -11, -12, ou -12,3. Composições de aminas graxas e produtos produzidos em conformidade com a presente invenção pode também ser distinguidos de compostos orgânicos à base de petróleo através da comparação da quantidade de 14C em cada composto. Porque 14C tem uma meia-vida nuclear de 5.730 anos, combustíveis baseados em petróleo contendo carbono "mais velho" podem ser distinguidos de composições de amina graxas e bioprodutos que contêm carbonos "mais novos" (ver, por exemplo, Currie, " Source Apportionment of Atmospheric Particles", ", Characterization of Environmental Particles, J. Buffle HP e van Leeuwen, Eds., Vol 1 de I do IUPAC Analytical Chemistry Series Ambiental (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992)).

[00102] A suposição básica da datação por radiocarbono é que a constância da concentração de 14C na atmosfera leva à constância de 14C em organismos vivos. No entanto, por causa dos ensaios nucleares atmosféricos a partir de 1950 e a explosão de combustível fóssil desde 1850, 14C adquiriu uma segunda característica de tempo geoquímico. Sua concentração em CO2 atmosférico, e, portanto, na biosfera viva, aproximadamente dobrou no pico do teste nuclear, em meados da década de 1960. Este desde então tem sido gradualmente retornado ao estado estável cosmogênico (atmosférico) da linha de base da proporção de isótopos (14C/2C) de cerca de 1,2 x 10-12, com um relaxamento "meia-vida" aproximado de 7-10 anos. Esta última meia-vida não deve ser tomada literalmente; em vez disso, deve-se usar a função nuclear de entrada/decaimento atmosférico detalhada para traçar a variação de 14C atmosférico e biosférico desde o início da era nuclear. É esta última característica de tempo biosférico 14C que mantém a premissa de datação anual do carbono biosférico recente. 14C pode ser medido por espectrometria de massa acelerado (AMS), com os resultados apresentados em unidades de "fração de carbono modelo" (fM). As composições de aminas graxas e os produtos descritos na presente invenção incluem bioprodutos que podem ter um fM 14C de pelo menos cerca de 1. Por exemplo, o bioproduto da presente invenção pode ter um fM 14C de pelo menos cerca de 1.01, um fM 14C de cerca de 1 a cerca de 1.5, um fM 14C de cerca de 1.04 a cerca de 1.18, ou um fM 14C de cerca de 1.111 a cerca de 1.124.

[00103] Outra medida de 14C é conhecida como sendo a percentagem de carbono modelo (pMC). Para um arqueólogo ou um geólogo usando dados de 14C, 1950 AD é igual a "zero anos". Isto também representa pMC 100. "Bomba do carbono" na atmosfera atingiu quase o dobro do nível normal em 1963 no auge de armas termonucleares. Sua distribuição dentro da atmosfera tem sido aproximada desde o seu aparecimento, mostrando valores que são maiores que 100 pMC para plantas e animais vivendo desde 1950 AD. Ela diminuiu gradualmente ao longo do tempo com o valor de hoje estando perto 107,5 pMC. Isto significa que um material de biomassa fresca, como com, daria uma assinatura de 14C perto de 107,5 pMC. Compostos à base de petróleo terão um valor de 0 pMC. Combinando carbono fóssil com carbono dos dias de hoje, resultará em uma diluição do conteúdo pMC nos dias de hoje. Por presumir que 107,5 pMC representa o teor de 14C dos materiais de biomassa dos dias de hoje e 0 pMC representa o teor de 14C de produtos à base de petróleo, o valor pMC medido para esse material irá refletir as proporções dos dois tipos de componentes. Por exemplo, um material derivado 100 % de soja dos dias de hoje apresenta uma assinatura radiocarbono perto de 107,5 pMC. Se esse material for diluído a 50 % com produtos à base de petróleo, daria uma assinatura radiocarbono de aproximadamente 54 pMC. Um teor de carbono de base biológica é derivado atribuindo "100 %" igual a 107,5 pMC e "0 %" igual a 0 pMC. Por exemplo, uma amostra com 99 pMC dará um teor de carbono de base biológica equivalente de 93 %. Este valor é referido como o resultado de carbono médio, baseado biologicamente e assume todos os componentes dentro do material analisado originado quer a partir de material biológico nos dias de hoje ou material à base de petróleo. Um bioproduto compreendendo uma ou mais aminas graxas, tal como aqui descrito pode ter um pMC de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100. Em outros casos, uma composição de éster graxo aqui descrito pode ter uma pMC entre cerca de 50 e cerca de 100; cerca de 60 e cerca de 100; cerca de 70 e cerca de 100; cerca de 80 e cerca de 100; cerca de 85 e cerca de 100; cerca de 87 e cerca de 98; ou cerca de 90 e cerca de 95. Em ainda outros exemplos, uma composição de amina graxa aqui descrita pode ter uma pMC de cerca de 90, 91, 92, 93, 94 ou 94,2.

Composições de aminas graxas

[00104] A estrutura de aminas graxas é baseada em um ou mais grupos alquil alifáticos C8 a C24 (R = C8-C24) e uma ou mais amina (N) ou amônio quaternário. A cadeia alquil alifática é fortemente hidrofóbica, enquanto a amina é hidrofílica. Assim, a amina graxa tem uma natureza anfifílica como uma molécula (contendo entidades tanto hidrófobas e hidrófilas). Quando dissolvida em água ou outros solventes, aminas graxas formar micelas, porque uma parte da molécula é repelida pelo solvente. Como tal, as aminas graxas são compostos tensoativos catiônicos (isto é, agentes tensoativos que são caracterizados pela sua porção hidrofílica) que aderem fortemente às superfícies por qualquer ligação química ou física, modificando assim as propriedades de superfície. As propriedades tensoativas de aminas graxas são emulsificantes, umectantes, de formação de espuma, e espessantes. Além disso, as aminas graxas possuem propriedades adsorventes incluindo amolecimento, aderência, lubrificação, inibição de corrosão, propriedades ante estáticas e de hidrofobia; bem como propriedades reativas incluindo permuta iónica, descoloração e floculação.

[00105] A presente invenção contempla a produção de aminas graxas e os seus derivados que são úteis em muitas aplicações industriais, incluindo como intermediários químicos, como auxiliares de processamento, e como componentes funcionais em várias formulações. Exemplos de aminas graxas incluem aquelas produzidas nas células hospedeiras presentes e derivadas de precursores de aldeído graxo tal como aqui descrito. As aminas graxas e/ou composições de aminas graxas ou misturas que são aqui produzidas podem ser utilizadas, individualmente ou em combinações ou misturas adequadas. As aminas graxas da presente invenção encontram uso em aplicações industriais, incluindo, mas não se limitando a detergentes (de limpeza, espessantes, amaciadores de tecidos); líquidos de lavar louça; agentes umectantes e de formação de espuma; demulsionantes (produtos farmacêuticos, papel, petróleo); emulsionantes (solventes, produtos de limpeza solventes, silicones, óleo, cera de polimento, tratamento de couro, triglicerídeos); tensoativos; shampoos e condicionadores; agentes ante estáticos na indústria têxtil e de plásticos (têxteis, polímeros, eletrônicos, sprays eletrostáticos, papel); aditivos de combustível; lubrificantes e aditivos de lubrificantes (espessantes de graxa, óleo do motor); espessantes de tinta; processamento de minerais; fabricação de papel; produção e refino de petróleo (aditivos de petróleo, produtos químicos da área de petróleo); emulsionantes de asfalto; inibidores de corrosão (ácido, tratamento de água, funcionamento de metais, petróleo); gasolina e aditivos de óleo combustível; agentes de flotação; agentes de cura epóxi; e produtos químicos da agricultura e herbicidas. Em alguns aspectos, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma composição de amina graxa incluindo aminas graxas que são feitas de uma mistura de cadeias de carbono ou um comprimento de cadeia específico que varia desde cerca de C8 até cerca de C24. Em um aspecto particular, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma composição de amina graxa abrangendo aminas graxas primárias (RNH2). Em um outro aspecto, aminas graxas secundárias (R2NH) e/ou aminas graxas terciárias (trialquil (R3N), dialquilmetil (R2NCH3), e/ou alquildimetil (RN(CH3h)) também estão contempladas. Em outro aspecto, a presente invenção abrange a produção de aminas primárias que podem tornar-se os blocos de construção principais para muitos produtos industriais, bem como fornecer a fonte de material para numerosos derivados químicos, tais como poliaminas, aminas etoxiladas, diaminas etoxiladas, aminas propoxiladas, sais de amina, óxidos de aminas, amidas, amidas etoxiladas e nitrilas. Em aspectos relacionados, o método abrange um hospedeiro de produção geneticamente modificado adequado para fazer as aminas graxas e composições de amina graxas, incluindo, mas não se limitando a aminas primárias que são adequadas para a produção de derivados químicos e composições dos mesmos, incluindo, mas não se limitando a poliaminas, aminas etoxiladas, diaminas etoxiladas, aminas propoxiladas, sais de amina, óxidos de aminas, amidas, amidas etoxiladas e nitrilas.

[00106] Em geral, a amina graxa ou a composição de amina graxa da presente invenção é isolada a partir do ambiente extracelular da célula hospedeira. Em algumas formas de realização, a amina graxa ou composição de amina graxa é secretada espontaneamente, parcialmente ou completamente, a partir da célula hospedeira. Em formas de realização alternativas, a amina graxa ou a composição de amina graxa é transportada para o ambiente extracelular, opcionalmente com o auxílio de uma ou mais proteínas de transporte. Em ainda outras formas de realização, a amina graxa ou a composição de amina graxa é passivamente transportada para o ambiente extracelular.

[00107] Os métodos podem produzir aminas graxas incluindo uma amina graxa C8-C24. Em algumas formas de realização, a amina graxa inclui uma amina graxa C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23 e/ou C24. Em outras formas de realização, a composição inclui uma amina graxa ou mais de uma amina graxa C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18. Em ainda outras formas de realização, a composição de amina graxa inclui aminas graxas C12, C14, C16 e C18; aminas graxas C12, C14 e C16; aminas graxas C14, C16 e C18; ou aminas graxas C12 e C14. O grupo R de uma amina graxa, pode ser uma cadeia linear ou uma cadeia ramificada. Cadeias ramificadas podem ter mais do que um ponto de ramificação e podem incluir ramos cíclicos. Em algumas formas de realização, a amina graxa de cadeia ramificada é uma amina graxa ramificada C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23 ou C24. O grupo R de uma amina graxa ramificada ou não ramificada pode ser saturado ou insaturado. Se insaturado, o grupo R pode ter um ou mais do que um ponto de insaturação. Em algumas formas de realização, a amina graxa insaturada é uma amina graxa monoinsaturada. Em certas formas de realização, a amina graxa insaturada é uma amina graxa insaturada C6: 1, C7: 1, C8: 1, C9: 1, C10: 1, C11: 1, C12: 1, C13: 1, C14: 1, C15: 1, C16: 1, C17: 1, C18: 1, C19: 1, C20: 1, C21: 1, C22: 1, C23: 1 ou C24: 1. Em certas formas de realização, a amina graxa insaturada é uma amina graxa insaturada C10: 1, C12: 1, C14: 1, C16: 1 ou C18: 1. Em outras formas de realização, a amina graxa insaturada é insaturada na posição omega-7. Em certas formas de realização, a amina graxa insaturada tem uma ligação dupla EIS.

[00108] Em uma forma de realização preferida, a amina graxa é uma amina primária, incluindo, mas não se limitando a octil amina, decil amina, dodecil amina, tetradecil amina, hexadecil amina, octadecil amina, estearil amina e amina oleílica. Em uma outra forma de realização, a amina graxa é uma amina secundária, por exemplo, 1-dodecilamina (laurilamina), 1-hexadecilamina (palmitilamina), 1-octadecilamina (estearilamina), esemelhantes. Em uma outra forma de realização, a amina graxa é uma amina terciária, por exemplo, 1-octadecen-9- ilamina (oleilamina), e semelhantes. Outros exemplos de aminas graxas são dimetil alquil aminas incluindo, mas não limitados a dimetil octil amina, decil dimetil amina, dodecil dimetil amina, dimetil tetradecil amina, hexadecil dimetil amina, dimetil octadecil amina e oleil dimetil amina. Ainda outros exemplos de aminas graxas são dialquil metil aminas, incluindo, mas não limitados a dioctil metil amina, didecil metil amina, didodecil metil amina, ditetradecil metil amina, dihexadecil metil amina e dioctadecil metil amina. A presente invenção contempla ainda as aminas graxas produzidas pelas células hospedeiras recombinantes como aqui descritas que podem ser usadas para os derivados químicos, tais como as amidas graxas (por exemplo, estearamida, oleamida, erucamida); quartenárias (por exemplo, cloreto de tetrametil amônio, brometo de tetrametil amônio, brometo de tetraetil amônio, brometo de tetrapropil amônio); e etoxilatos (por exemplo,laurilamina, estearilamina, oleilamina, octadecilamina).

[00109] Em outras formas de realização, a amina graxa inclui uma amina graxa de cadeia linear. Em outras formas de realização, a amina graxa inclui uma amina graxa de cadeia ramificada. Em ainda outras formas de realização, a amina graxa compreende uma porção cíclica. Em algumas formas de realização, a amina graxa é uma amina graxa insaturada. Em outras formas de realização, a amina graxa é uma amina graxa monoinsaturada. Em ainda outras formas de realização, a amina graxa é uma amina graxa saturada. Em outro aspecto, a presente invenção apresenta aminas graxas produzidas por qualquer um dos métodos ou qualquer um dos microrganismos aqui descritos, ou um agente tensoativo compreendendo uma amina graxa produzido por qualquer um dos métodos ou qualquer um dos microrganismos aqui descritos. Em algumas formas de realização, a amina graxa tem um δ13C de cerca de -15,4 ou maior. Em certas formas de realização, a amina graxa tem um δ13C de cerca de -15,4 a cerca de - 10,9, ou de cerca de -13,92 a cerca de -13,84. Em algumas formas de realização, a amina graxa tem um 14C fM de pelo menos cerca de 1,003. Em certas formas de realização, a amina graxa tem um 14C fM de pelo menos cerca de 1,01 ou pelo menos cerca de 1,5. Em algumas formas de realização, a amina graxa tem um 14C fM de cerca de 1,111 a cerca de 1,124.

EXEMPLOS

[00110] Os seguintes exemplos específicos são destinados a ilustrar a presente invenção e não devem ser interpretados como limitando o escopo das reivindicações.

Exemplo 1:

[00111] Precursores de aldeído graxo e aminas graxas correspondentes foram gerados in vivo por co-expressão de uma tioesterase ('tesA) e uma ácido carboxílico redutase (CarB) com uma aminotransferase putrescina (ygjG) juntamente com suplementação de uma fonte de nitrogênio (glutamato). Os precursores de aldeído graxo foram convertidos nas aminas correspondentes.

[00112] O gene ygjG foi clonado a partir da cepa de E. coli MG1655 através de PCR com os seguintes iniciadores:

[00113] Iniciador direto:‘5-AGGAGG AA TAACAIA1G AACAGGT TACCI TCGAGCGCA1 CGGC-3’

[00114] Iniciador reverso: ‘5-CCCAAGCTTCGAATTCTTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCATGGCC-3’

[00115] O gene ygjG foi então ligado ao vetor de expressão pACYC (isto é, vetor de expressão de elevado número de cópias), para gerar o plasmídeo pACYC-ygjG. Um segundo plasmídeo foi gerado e chamado pLC1920-Carb-18- cTesA2-13C05 (isto é, plasmídeo de baixo número de cópias), que continha o gene carB de Mycobacterium smegmatis e uma variante do gene da tioesterase ('tesA) a partir de E. coli. Os dois plasmídeos foram co-transformados em uma cepa de E. coli que não produz aminas graxas (DVD2.1, contendo 11fadE 11tonA fabB-A329V PT5-entD da cepa de E. coli MG1655) resultando na cepa F16-YG. As células hospedeiras também foram transformadas com cada um dos plasmídeos separadamente para utilização como controles resultando em cepa de controle F16 (pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05) e cepa de controle YG (pACYC-ygjG).

[00116] As células foram cultivadas a 32 °C em meio mínimo M9 suplementado com 3 % (p/v) de glicose, 0,5 % (v/v) de TRITON X-100, 0,1 M de bis-Tris, pH 7,0, e induzidas pelo OD600~1,0 com 1 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). (IPTG provoca a transcrição do operon lac e é utilizado para induzir a expressão da proteína em que o gene está sob o controle do operador lac.) No momento da indução, 5 g/L de L-glutamato também foi adicionado como uma fonte de nitrogênio. As cepas contendo pACYC-ygjG foram cultivadas na presença do antibiótico carbenicilina, e as cepas contendo pCL1920- CarB-18-cTesA2-13C05 foram cultivadas na presença de espectinomicina, de modo a selecionar para os respectivos plasmídeos. Após crescimento durante a noite, as culturas das três cepas foram suplementadas adicionalmente com 10 g/L de glicose e 5 g/L de L-glutamato. Alíquotas de 1 ml da cultura foram congeladas por 24 horas pós-indução.

[00117] De modo a preparar as amostras para análise, 0,5 ml de acetato de etila foram adicionados a cada alíquota da cultura. As amostras foram então agitadas a uma velocidade máxima durante 15 minutos e centrifugou-se durante 5 minutos. A fase orgânica foi analisada com um cromatógrafo de gás de Espectrometria de Massa (GCMS da Agilent 6890) no modo EI (isto é, o método: alcano 1 splitless CTC). A cepa F16-YG, em que ygjG, carB, e 'tesA foram expressos de forma exógena, rendeu um único pico em 7,6 minutos (Figura 1 painel do meio) que não foi observado em nenhum dos controles negativos YG ou F16 (Figura 1 painel superior e inferior). O único pico na amostra a partir da cultura F16-YG em 7,6 minutos, foi identificado como 1-dodecilamina pela biblioteca de compostos químicos NIST 05. Um padrão de referência analítica adquiridos da Sigma/Aldrich (Produto # 325163) foi executado de volta para trás com a amostra F16-YG, que confirmou a identidade do composto como 1-dodecilamina pelo seu tempo de retenção (Figuras 2) e pelo seu padrão de fragmentação de íon (Figura 3), mostrando fragmentos característicos a m/z= 142, 156 e 170 e um íon molecular a 185.

Exemplo 2:

[00118] Precursores de aldeído graxo e as aminas graxas correspondentes podem ser gerados in vivo por co- expressão de uma acil-ACP redutase (AAR) com uma aminotransferase putrescina (ygjG) juntamente com suplementação de uma fonte de nitrogênio (glutamato). Os precursores de aldeído graxo podem ser convertidos nas aminas correspondentes.

[00119] O gene ygjG pode ser clonado a partir da cepa de E. coli MG1655 através de PCR com os seguintes iniciadores:

[00120] Iniciador direto:\5-AGGAGGAATAACATATGAACAGGTTACCTTCGAGCGCATCGGC-3’

[00121] Iniciador reverso: ‘ 5-CCC A AGGTTCG A ATTCTT ACGC’TTCTTCG AC ACTTACTCGCATG<;CC-3 ’

[00122] O gene ygjG pode então em seguida ser ligado no vetor de expressão pACYC, para gerar o plasmídeo pACYC- ygjG. Um segundo plasmídeo pode ser gerado e chamado pCL1920-aar, que é um plasmídeo baseado em PCL contendo um gene para AAR de Synechococcus elongatus PCC7942 (aar). Os dois plasmídeos podem ser co-transformados na cepa de E. coli que não produz as aminas graxas (supra) resultando na cepa F17-YG. As células hospedeiras também podem ser transformadas com cada um dos plasmídeos separadamente para utilização como controles resultando na cepa de controle F17 (pLC1920-aar) e cepa de controle YG (pACYC-ygjG).

[00123] As células podem ser cultivadas a 32 °C em meio mínimo M9 suplementado com 3 % (p/v) de glicose, 0,5 % (v/v) de TRITON X-100, 0,1 M de bis-Tris, pH 7,0, e induzidas pelo OD600~1.0 com 1 mM de isopropil β-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). No momento da indução, 5 g/L de L-glutamato também pode ser adicionado como uma fonte de nitrogênio. As cepas contendo pACYC-ygjG podem ser cultivadas na presença do antibiótico carbenicilina (0,05 mg/ml), e as cepas contendo pLC1920-aar podem ser cultivadas na presença de 0,1 mg/ml de espectinomicina, a fim de selecionar para os respectivos plasmídeos. Após crescimento durante a noite, as culturas das três cepas podem ser suplementadas adicionalmente com um 10 g/L de glicose e 5 g/L de L-glutamato. Alíquotas de 1 ml de cultura podem ser congeladas por 24 horas pós-indução.

[00124] De modo a preparar as amostras para análise, 0,5 ml de acetato de etila pode ser adicionado a cada alíquota da cultura. As amostras podem ser, em seguida, agitadas à velocidade máxima durante aproximadamente 15 minutos e centrifugadas durante cerca de 5 minutos, conforme necessário. A fase orgânica pode ser analisada com um cromatógrafo de gás de Espectrometria de Massa (GCMS da Agilent 6890) no modo EI (isto é, o método: alcano 1 splitless CTC). A cepa F17-YG, em que ygjG e/ou aar são expressos de forma exógena, espera-se que se obtenha um ou mais únicos picos que representam as aminas graxas semelhantes ao que foi observado no Exemplo 1 (supra) e que não foram observados em qualquer um dos controles negativos YG ou F17. Quaisquer picos únicos na amostra a partir da cultura F17-YG podem ser identificados como aminas graxas, através da biblioteca de compostos químicos NIST 05. Para efeitos de comparação, um padrão de referência analítica a partir de Sigma/Aldrich (produto # 325163) pode ser executado de volta com a amostra F17-YG, a fim de confirmar a identidade do composto a ser produzido pelo seu tempo de retenção e pelo seu padrão de fragmentação de íon.

Exemplo 3:

[00125] Precursores de aldeído graxo e as aminas graxas correspondentes podem ser gerados in vivo por co- expressão de uma tioesterase (tesA) e uma ácido carboxílico redutase (CarB) com uma aminotransferase de GABA (PuuE) juntamente com suplementação de uma fonte de nitrogênio (glutamato). Os precursores de aldeído graxo podem ser convertidos nas aminas correspondentes. O gene puuE pode ser clonado a partir de uma cepa de E. coli através de PCR com um iniciador direto e inverso adequado (de modo semelhante ao ensinado nos Exemplos 1 e 2, supra). O gene puuE pode então ser ligado em um vetor de expressão (por exemplo, pACYC, supra) para gerar o plasmídeo pACYC-puuE. Um segundo plasmídeo pode ser gerado e chamado pCL1920- CarB-18-cTesA2-13C05, que é um segundo vetor de expressão contendo o gene carB de Mycobacterium smegmatis e uma variante do gene da tioesterase ('tesA) a partir de E. coli (ver Exemplo 1, supra). Os dois plasmídeos podem ser co- transformados na cepa de E. coli que não produz aminas graxas (supra) resultando na cepa F18-PU. As células hospedeiras também podem ser transformadas com cada um dos plasmídeos separadamente para uso como controles resultando na cepa de controle F18 (pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05) e na cepa de controle PU (pACYC-puuE).

[00126] As células podem ser cultivadas a 32 °C em meio mínimo M9 suplementado com 3 % (p/v) de glicose, 0,5 % (v/v) de TRITON X-100, 0,1 M de bis-Tris, pH 7,0, e induzidas pelo OD600~1,0 com 1 mM de isopropil β-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). No momento da indução, 5 g/L de L-glutamato também pode ser adicionado como uma fonte de nitrogênio. As cepas contendo pACYC-puuE podem ser cultivadas na presença do antibiótico carbenicilina (0,05 mg/ml), e as cepas contendo pLC1920-CarB podem ser cultivadas na presença de 0,1 mg/ml de espectinomicina, a fim de selecionar para os respectivos plasmídeos. Após crescimento durante a noite, as culturas das três cepas podem ser suplementadas adicionalmente com um 10 g/L de glicose e 5 g/L de L-glutamato. Alíquotas de 1 ml de cultura podem ser congeladas por 24 horas pós-indução.

[00127] De modo a preparar as amostras para análise, 0,5 ml de acetato de etila pode ser adicionado a cada alíquota da cultura. As amostras podem ser, em seguida, agitadas à velocidade máxima durante aproximadamente 15 minutos e centrifugadas durante cerca de 5 minutos, conforme necessário. A fase orgânica pode ser analisada com um cromatógrafo de gás de Espectrometria de Massa (GCMS da Agilent 6890) no modo EI (isto é, o método: alcano 1 splitless CTC). A cepa F18-PU, em que puuE, carB e/ou 'tesA são expressos de forma exógena, espera-se que se obtenha um ou mais únicos picos que não foram observados em qualquer um dos controles negativos PU ou F18. O pico único esperado na amostra a partir da cultura F18-PU pode ser identificado através da biblioteca de compostos químicos NIST 05. Um padrão de referência analítica a partir de Sigma/Aldrich (produto # 325163) pode ser executado de volta para trás com a amostra F18-PU, a fim de confirmar a identidade de um novo composto de amina graxa.

Exemplo 4:

[00128] Precursores de aldeído graxo e as aminas graxas correspondentes podem ser gerados in vivo por co- expressão de uma AAR com uma aminotransferase GABA (PuuE) juntamente com suplementação de uma fonte de nitrogênio (glutamato). Os precursores de aldeído graxo podem ser convertidos nas aminas correspondentes.

[00129] O gene puuE pode ser clonado a partir de uma cepa de E. coli através de PCR com um iniciador direto e inverso adequado (de modo semelhante ao ensinado no Exemplo 1, supra). O gene puuE pode ser ligado em um vetor de expressão (por exemplo, pACYC, supra) para gerar o plasmídeo pACYC-puuE. Um segundo plasmídeo pode ser gerado e chamado pCL1920-aar, que é um segundo vetor de expressão contendo o gene AAR de Synechococcus elongatus PCC7942 (aar). Os dois plasmídeos podem ser co-transformados na cepa de E. coli que não produz aminas graxas (supra) resultando na cepa F19-PU. As células hospedeiras também podem ser transformadas com cada um dos plasmídeos separadamente para uso como controles resultando na cepa de controle F19 (pCL1920-aar) e na cepa de controle PU (pACYC-puuE).

[00130] As células podem ser cultivadas a 32 °C em meio mínimo M9 suplementado com 3 % (p/v) de glicose, 0,5 % (v/v) de TRITON X-100, 0,1 M de bis-Tris, pH 7,0, e induzidas pelo OD600~1,0 com 1 mM de isopropil β-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). No momento da indução, 5 g/L de L-glutamato também pode ser adicionado como uma fonte de nitrogênio. As cepas contendo pACYC-puuE podem ser cultivadas na presença do antibiótico carbenicilina (0,05 mg/ml), e as cepas contendo pLC1920-aar podem ser cultivadas na presença de 0,1 mg/ml de espectinomicina, a fim de selecionar para os respectivos plasmídeos. Após crescimento durante a noite, as culturas das três cepas podem ser suplementadas adicionalmente com um 10 g/L de glicose e 5 g/L de L-glutamato. Alíquotas de 1 ml de cultura podem ser congeladas por 24 horas pós-indução.

[00131] De modo a preparar as amostras para análise, 0,5 ml de acetato de etila pode ser adicionado a cada alíquota da cultura. As amostras podem ser, em seguida, agitadas à velocidade máxima durante aproximadamente 15 minutos e centrifugadas durante cerca de 5 minutos, conforme necessário. A fase orgânica pode ser analisada com um cromatógrafo de gás de Espectrometria de Massa (GCMS da Agilent 6890) no modo EI (isto é, o método: alcano 1 splitless CTC). A cepa F19-PU, em que puuE e/ou aar são expressos de forma exógena, espera-se que se obtenha um ou mais únicos picos que não foram observados em qualquer um dos controles negativos PU ou F19. O pico único esperado na amostra a partir da cultura F19-PU pode ser identificado através da biblioteca de compostos químicos NIST 05. Um padrão de referência analítica a partir de Sigma/Aldrich (produto # 325163) pode ser executado de volta para trás com a amostra F19-PU, a fim de confirmar a identidade de um novo composto de amina graxa.

Exemplo 5:

[00132] Precursores de aldeído graxo e as aminas graxas correspondentes podem ser gerados in vivo por co- expressão de uma tioesterase (TesA) e uma ácido carboxílico redutase (CarB) com uma aminodesidrogenase (Por exemplo, metilamina desidrogenase de Paracoccus denitrificans ou proteína quinohemo aminadesidrogenase de Pseudomonas spp.) juntamente com suplementação de uma fonte de nitrogênio (amônia). Os precursores de aldeído graxo podem ser convertidos nas aminas correspondentes.

[00133] O gene aminodesidrogenase (AD) de Paracoccus denitrificans ou Pseudomonas spp. pode ser clonado através de PCR com um iniciador direto e inverso adequado (de modo semelhante ao ensinado no Exemplo 1, supra). O gene AD pode então ser ligado em um vetor de expressão (por exemplo, pACYC, supra) para gerar o plasmídeo pACYC-AD. Um segundo plasmídeo pode ser gerado e chamado pCL1920-CarB-18-cTesA2- 13C05, que é um segundo vetor de expressão contendo o gene carB de Mycobacterium smegmatis e uma variante do gene da tioesterase ('tesA) a partir de E. coli (ver Exemplo 1, supra). Os dois plasmídeos podem ser co-transformados na cepa de E. coli que não produz aminas graxas (supra) resultando na cepa F20-AD. As células hospedeiras também podem ser transformadas com cada um dos plasmídeos separadamente para uso como controles resultando na cepa de controle F20 (pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05) e na cepa de controle AD (pACYC-AD).

[00134] As células podem ser cultivadas a 32 °C em meio mínimo M9 suplementado com 3 % (p/v) de glicose, 0,5 % (v/v) de TRITON X-100, 0,1 M de bis-Tris, pH 7,0, e induzidas pelo OD600~1,0 com 1 mM de isopropil β-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). No momento da indução, 0,5-1 g/L de amônia também pode ser adicionado como uma fonte de nitrogênio. As cepas contendo pACYC-AD podem ser cultivadas na presença do antibiótico carbenicilina (0,05 mg/ml), e as cepas contendo pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05 podem ser cultivadas na presença de 0,1 mg/ml de espectinomicina, a fim de selecionar para os respectivos plasmídeos. Após crescimento durante a noite, as culturas das três cepas podem ser suplementadas adicionalmente com um 10 g/L de glicose e 0,5-1 g/L de amônia. Alíquotas de 1 ml de cultura podem ser congeladas por 24 horas pós-indução.

[00135] De modo a preparar as amostras para análise, 0,5 ml de acetato de etila pode ser adicionado a cada alíquota da cultura. As amostras podem ser, em seguida, agitadas à velocidade máxima durante aproximadamente 15 minutos e centrifugadas durante cerca de 5 minutos, conforme necessário. A fase orgânica pode ser analisada com um cromatógrafo de gás de Espectrometria de Massa (GCMS da Agilent 6890) no modo EI (isto é, o método: alcano 1 splitless CTC). A cepa F20-AD, em que AD, carB e/ou 'tesA são expressos de forma exógena, espera-se que se obtenha um ou mais únicos picos que não foram observados em qualquer um dos controles negativos PU ou F20. O pico único esperado na amostra a partir da cultura F20-AD pode então ser identificado através da biblioteca de compostos químicos NIST 05. Um padrão de referência analítica a partir de Sigma/Aldrich (produto # 325163) pode ser executado de volta para trás com a amostra F18-PU, a fim de confirmar a identidade de um novo composto de amina graxa.

Exemplo 6:

[00136] Precursores de aldeído graxo e as aminas graxas correspondentes podem ser gerados in vivo por co- expressão de uma AAR com uma aminodesidrogenase (Por exemplo, metilamina desidrogenase de Paracoccus denitrificans ou proteína quinohemo aminadesidrogenase de Pseudomonas spp.) juntamente com suplementação de uma fonte de nitrogênio (amônia). Os precursores de aldeído graxo podem ser convertidos nas aminas correspondentes.

[00137] O gene aminodesidrogenase (AD) pode ser clonado a partir de uma cepa de E. coli através de PCR com um iniciador direto e inverso adequado (de modo semelhante ao ensinado no Exemplo 1, supra). O gene AD pode ser ligado em um vetor de expressão (por exemplo, pACYC, supra) para gerar o plasmídeo pACYC-AD. Um segundo plasmídeo pode ser gerado e chamado pCL1920-aar, que é um segundo vetor de expressão contendo o gene AAR de Synechococcus elongatus PCC7942 (aar). Os dois plasmídeos podem ser co- transformados na cepa de E. coli que não produz aminas graxas (supra) resultando na cepa F21-AD. As células hospedeiras também podem ser transformadas com cada um dos plasmídeos separadamente para uso como controles resultando na cepa de controle F21 (pCL1920-aar) e na cepa de controle AD (pACYC-AD).

[00138] As células podem ser cultivadas a 32 °C em meio mínimo M9 suplementado com 3 % (p/v) de glicose, 0,5 % (v/v) de TRITON X-100, 0,1 M de bis-Tris, pH 7,0, e induzidas pelo OD600~1.0 com 1 mM de isopropil β-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). No momento da indução, 0,5-1 g/L de amônia também pode ser adicionado como uma fonte de nitrogênio. As cepas contendo pACYC-AD podem ser cultivadas na presença do antibiótico carbenicilina (0,05 mg/ml), e as cepas contendo pLC1920-aar podem ser cultivadas na presença de 0,1 mg/ml de espectinomicina, a fim de selecionar para os respectivos plasmídeos. Após crescimento durante a noite, as culturas das três cepas podem ser suplementadas adicionalmente com um 10 g/L de glicose e 0,5-1 g/L de amônia. Alíquotas de 1 ml de cultura podem ser congeladas por 24 horas pós-indução.

[00139] De modo a preparar as amostras para análise, 0,5 ml de acetato de etila pode ser adicionado a cada alíquota da cultura. As amostras podem ser, em seguida, agitadas à velocidade máxima durante aproximadamente 15 minutos e centrifugadas durante cerca de 5 minutos, conforme necessário. A fase orgânica pode ser analisada com um cromatógrafo de gás de Espectrometria de Massa (GCMS da Agilent 6890) no modo EI (isto é, o método: alcano 1 splitless CTC). A cepa F21-AD, em que AD e/ou aar são expressos de forma exógena, espera-se que se obtenha um ou mais únicos picos que não foram observados em qualquer um dos controles negativos AD ou F21. O pico único esperado na amostra a partir da cultura F21-AD pode ser identificado através da biblioteca de compostos químicos NIST 05. Um padrão de referência analítica a partir de Sigma/Aldrich (produto # 325163) pode ser executado de volta para trás com a amostra F21-AD, a fim de confirmar a identidade de um novo composto de amina graxa.

[00140] Como é evidente para um técnico no assunto, várias modificações e variações dos aspectos e formas de realização acima podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção. Tais modificações e variações estão dentro do escopo da presente invenção.

Claims

1. Célula bacteriana recombinante para a produção de uma amina graxa, caracterizada pelo fato de compreender: (i) um ou mais genes tes, tesA, ‘tesA (tesA sem sequência líder), tesB, fatA, fatA1, fatB, fatB1, fatB2, fatB3, fadM, yciA e ybgC expressos que codificam uma enzima biossintética exógena tendo atividade tioesterase; (ii) um ou mais genes carB expressos que codificam uma enzima biossintética exógena tendo atividade ácido carboxílico redutase; e (iii) um ou mais genes ygjG, pPuuE, gabT, ou GABA-T expressos que codificam uma enzima biossintética exógena tendo atividade aminotransferase, em que a referida enzima biossintética exógena, tendo atividade aminotransferase, é uma aminotrasferase putrescina ou GABA; ou um ou mais genes mauRFBEDACJGMN, ald, gdhA ou gdh expressos que codificam uma enzima biossintética exógena com atividade de amina desidrogenase, em que a referida enzima biossintética exógena com atividade de amina desidrogenase é uma metilamina desidrogenase, preferencialmente em que a referida metilamina desidrogenase é de Paracoccus denitrificans, ou é uma alanina desidrogenase ou uma glutamato desidrogenase; ou um ou mais genes expressos que codificam uma metilamina desidrogenase que é uma quinohemoproteína amino desidrogenase; ou um ou mais genes expressos que codificam uma enzima biossintética com atividade de amina desidrogenase, em que a referida enzima biossintética com atividade de amina desidrogenase é uma L-lisina 6- desidrogenase; em que a referida célula bacteriana recombinante produz a amina graxa in vivo, em que a referida célula bacteriana recombinante é selecionada de Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus e Pseudomonas, preferencialmente em que a referida Escherichia é Escherichia coli; em que a referida Cyanophyta é selecionada de (a) Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cyanothece e Nostoc punctiforme; ou (b) Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7001; e em que a referida amina graxa tem um comprimento de cadeia de carbono entre 5 e 24 carbonos.

2. Célula bacteriana recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a referida enzima biossintética exógena, tendo atividade tioesterase, converter um acil-ACP ou acil-CoA em um ácido graxo.

3. Célula bacteriana recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de a referida enzima biossintética exógena, tendo atividade ácido carboxílico redutase, converter o referido ácido graxo em um aldeído graxo.

4. Célula bacteriana recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de a referida enzima biossintética exógena, tendo atividade aminotransferase ou aminodesidrogenase, converter o referido aldeído graxo em uma amina graxa.

5. Cultura de células caracterizada pelo fato de compreender a célula bacteriana recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Método de produção de uma amina graxa, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a referida célula bacteriana, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em um caldo de fermentação contendo uma fonte de carbono.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender ainda colher aminas graxas que se reúnem no caldo de fermentação.