KR20210134820A - 지방족 아민의 미생물 생성 - Google Patents

지방족 아민의 미생물 생성 Download PDF

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KR20210134820A
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스티븐 비. 델 카다이레
루이스 지. 홈
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게노마티카 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 지방족 아민 및 이의 유도체의 생성을 위한 재조합 미생물에 관한 것이다. 또한, 배양되는 재조합 숙주 세포들 그리고 이러한 숙주 세포들을 이용하여 지방족 아민을 생성하는 방법들이 고려된다.

Description

지방족 아민의 미생물 생성{MICROBIAL PRODUCTION OF FATTY AMINES}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2013년 12월 5일에 출원된 미국 가출원 61/912,184의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용이 본 명세서에서 인용-참조된다.
분야
본 발명은 지방족 아민 및 이의 유도체의 생성을 위한 재조합 미생물에 관한 것이다. 또한, 생체 내에서(in vivo) 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 생합성 단백질들을 발현하는 재조합 숙주 세포들이 고려된다. 또한, 이러한 생합성 단백질들을 발현하는 숙주 세포들을 이용함으로써 지방족 아민을 생성하는 방법들이 고려된다.
지방족 아민은 지방산, 올레핀 또는 알코올의 질소 유도체이다. 이는 합성 또는 석유화학 원료(petrochemical raw material)로부터, 또는 천연 지방 또는 오일로부터 만들어진다. 오늘날, 이러한 화합물들은 주로 우지 또는 식물성 오일[예를 들어, 코코넛-, 카놀라-, 및 채종유(rapeseed oil)]과 같은 트리글리세리드의 화학적 변형(chemical modification)을 통해 생성된다.
상업적으로 이용가능한 지방족 아민은 C8 내지 C22의 범위를 갖는 특이적 사슬 길이 또는 탄소 사슬의 혼합으로 만들어진다. 일반적으로, 이는 지방족 알킬 또는 메틸기에 의해 대체되는 암모니아 분자의 수소 원자들의 수에 따라 1차-, 2차-, 및 3차 아민으로 분류된다. 지방족 아민은 물리적 또는 화학적 결합을 통해 표면에 강하게 부착되는 양이온성 계면-활성 화합물들인 것으로 알려져 있다. 다수의 상업적 제품들은 반응 중간체로서 지방족 아민을 이용하여 제조된다. 예를 들어, 이들은 계면활성제로서 또한 샴푸 및 컨디셔너와 같은 퍼스널 케어 제품(personal care product)들의 성분으로서 유용하다. 지방족 아민에 대한 최대 시장은 섬유유연제 및 세제 분야이다. 또한, 지방족 아민은 발포(foaming)- 및 습윤제(wetting agent), 직물 및 플라스틱 산업 분야에서의 대전방지제(antistatic agent), 윤활제(lubricant), 페인트 증점제(paint thickener), 유전 화학제(oil field chemical), 아스팔트 유화제(asphalt emulsifier), 석유 첨가제, 부식 억제제, 가솔린- 및 연료 오일 첨가제, 부유제(flotation agent), 안료 습윤제(pigment wetting agent), 에폭시 경화제, 제초제 등으로 사용된다(Visek K. (2003) Fatty Amines; Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology 참조).
미생물 발효를 통해 지방족 아민을 생성하는 것은, 더 일관적인 조성 제공, 더 낮은 비용으로 제조, 및 환경적 영향의 감소와 같은 다수의 장점들을 제공한다. 또한, 이는 오늘날 사용되는 천연 지방 및 오일 그리고 합성 또는 석유화학 원료를 넘어서는 다양하고 새로운 공급원료(feedstock)를 개시할 것이다. 현재, 지방족 아민의 미생물 생성을 위한 효율적인 방법이 존재하지 않는다. 본 발명은 이러한 필요성을 해결한다.
요약
본 발명의 일 측면은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위한 조작된 대사 경로(engineered metabolic pathway)를 포함하는 지방족 아민의 생성을 위한 재조합 미생물을 제공한다. 본 명세서에서, 재조합 미생물은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위한 조작된 대사 경로를 갖고, 이는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 포함한다. 일 구현예에서, 외인성 생합성 효소는 YgjG와 같은 푸트레신 아미노산트랜스퍼라아제이다. 또 다른 구현예에서, 외인성 생합성 효소는 PuuE와 같은 GABA 아미노산트랜스퍼라아제이다. YgjG는 재조합 미생물 또는 재조합 미생물 세포에서 발현되는 ygjG 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 유사하게, PuuE는 재조합 미생물 또는 재조합 미생물 세포에서 발현되는 puuE 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 구현예에서, 외인성 생합성 효소는 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans)로부터의 메틸아민 디하이드로게나아제와 같은 아민 디하이드로게나아제이다. 재조합 미생물 또는 재조합 미생물 세포는 생체 내에서 또는 세포 내부에서 지방족 아민을 생성한다. 지방족 아민은 재조합 미생물 또는 재조합 미생물 세포에 의해 배양 배지(culture medium) 내로 방출(release)된다. 일 구현예에서, 재조합 미생물 또는 미생물 세포는 재조합 박테리아 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위한 제 1 조작된 대사 경로를 포함하는 지방족 아민의 생성을 위한 재조합 미생물을 제공한다. 재조합 미생물은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위한 제 1 조작된 대사 경로를 갖고, 이는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 포함한다(위 참조). 일 구현예에서, 재조합 미생물은 아실-ACP 또는 아실-CoA를 지방산으로 전환시키기 위한 또 다른 또는 제 2 조작된 대사 경로를 갖는다. 제 2 조작된 대사 경로는 선택적이다. 본 명세서에서, 아실-ACP 또는 아실-CoA는 티오에스테라아제 활성을 갖는 생합성 효소에 의해 지방산으로 전환된다. 일 구현예에서, 티오에스테라아제 활성을 갖는 생합성 효소는 재조합 미생물 또는 미생물 세포에서 발현되는 tesA 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 재조합 미생물 또는 재조합 미생물 세포는 생체 내에서 또는 세포 내부에서 지방족 아민을 생성한다. 지방족 아민은 재조합 미생물 또는 재조합 미생물 세포에 의해 배양 배지 내로 방출된다. 일 구현예에서, 재조합 미생물 또는 미생물 세포는 재조합 박테리아 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위한 제 1 조작된 대사 경로를 포함하는 지방족 아민의 생성을 위한 재조합 미생물을 제공한다. 재조합 미생물은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위한 제 1 조작된 대사 경로를 갖고, 이는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 포함한다(위 참조). 일 구현예에서, 재조합 미생물은 아실-ACP 또는 아실-CoA를 지방산으로 전환시키기 위한 또 다른 또는 제 2 조작된 대사 경로를 갖는다(위 참조). 또 다른 구현예에서, 재조합 미생물은 지방산을 지방족 알데히드로 전환시키기 위한 또 다른 또는 제 3 조작된 대사 경로를 갖는다. 이 제 3 조작된 대사 경로는 선택적이고, 제 2 조작된 대상 경로와 독립적이다. 본 명세서에서, 지방산은 카르복시산 리덕타아제(CAR) 활성을 갖는 생합성 효소에 의해 지방족 알데히드로 전환된다. 일 구현예에서, CAR 활성을 갖는 생합성 효소는 재조합 미생물 또는 미생물 세포에서 발현되는 carB 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 재조합 미생물 또는 재조합 미생물 세포는 생체 내에서 또는 세포 내부에서 지방족 아민을 생성한다. 지방족 아민은 재조합 미생물 또는 재조합 미생물 세포에 의해 배양 배지 내로 방출된다. 일 구현예에서, 재조합 미생물 또는 미생물 세포는 재조합 박테리아 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 티오에스테라아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 코딩하는 하나 이상의 발현된 유전자; 카르복실산 리덕타아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 코딩하는 하나 이상의 발현된 유전자; 및 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 코딩하는 하나 이상의 발현된 유전자를 포함하는 지방족 아민의 생성을 위한 재조합 박테리아 세포를 제공하고, 재조합 박테리아 세포는 생체 내에서 또는 박테리아 세포 내부에서 지방족 아민을 생성한다. 지방족 아민은 재조합 박테리아 세포에 의해 배양 배지 내로 방출된다. 본 명세서에서, 티오에스테라아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 아실-ACP 또는 아실-CoA를 지방산으로 전환시킨다. 카르복실산 리덕타아제(CAR) 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 지방산을 지방족 알데히드로 전환시킨다. 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시킨다. 일 구현예에서, 티오에스테라아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 tesA 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 구현예에서, CAR 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 carB 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 YgjG와 같은 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제 또는 PuuE와 같은 GABA 아미노트랜스퍼라아제이다. YgjG는 ygjG 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. PuuE는 puuE 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 구현예에서, 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 파라코커스 데니트리피칸스로부터의 메틸아민 디하이드로게나아제와 같은 메틸아민 디하이드로게나아제이다.
본 발명의 또 다른 측면은 아실-ACP 또는 아실-CoA를 지방산으로 전환시키기 위해 티오에스테라아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 코딩하는 하나 이상의 발현된 유전자; 지방산을 지방족 알데히드로 전환시키기 위해 카르복실산 리덕타아제(CAR) 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 코딩하는 하나 이상의 발현된 유전자; 및 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위해 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 코딩하는 하나 이상의 발현된 유전자를 포함하는 지방족 아민의 생성을 위한 재조합 박테리아 세포를 제공하고, 재조합 박테리아 세포는 생체 내에서 또는 세포 내부에서 지방족 아민을 생성한다. 일 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 YgjG와 같은 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제이다. 또 다른 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 PuuE와 같은 GABA 아미노트랜스퍼라아제이다. YgjG는 재조합 박테리아 세포에서 발현되는 ygjG 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 유사하게, PuuE는 재조합 박테리아 세포에서 발현되는 puuE 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 파라코커스 데니트리피칸스의 메틸아민 디하이드로게나아제와 같은 아민 디하이드로게나아제이다. 일 구현예에서, 티오에스테라아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 tesA 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 구현예에서, CAR 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 carB 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 재조합 박테리아 세포는 생체 내에서 또는 세포 내부에서 지방족 아민을 생성한다. 지방족 아민은 재조합 박테리아 세포에 의해 배양 배지 내로 방출된다.
또한, 본 발명은 아실-ACP 또는 아실-CoA를 지방산으로 전환시키기 위한 제 1 조작된 대사 경로; 지방산을 지방족 알데히드로 전환시키기 위한 제 2 조작된 대사 경로; 및 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위한 제 3 조작된 대사 경로를 포함하는 지방족 아민의 생성을 위한 재조합 박테리아 세포를 고려하고, 재조합 박테리아 세포는 생체 내에서 또는 세포 내부에서 지방족 아민을 생성한다. 일 구현예에서, 아실-ACP 또는 아실-CoA는 티오에스테라아제 활성을 갖는 외인성으로 발현된 생합성 효소에 의해 지방산으로 전환되고; 지방산은 카르복실산 리덕타아제(CAR) 활성을 갖는 외인성으로 발현된 생합성 효소에 의해 지방족 알데히드로 전환되며; 지방족 알데히드는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성으로 발현된 생합성 효소에 의해 지방족 아민으로 전환된다. 일 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 YgjG와 같은 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제이다. 또 다른 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 PuuE와 같은 GABA 아미노트랜스퍼라아제이다. YgjG는 재조합 박테리아 세포에서 발현되는 ygjG 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 유사하게, PuuE는 재조합 박테리아 세포에서 발현되는 puuE 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 파라코커스 데니트리피칸스의 메틸아민 디하이드로게나아제와 같은 아민 디하이드로게나아제이다. 일 구현예에서, 티오에스테라아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 tesA 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 구현예에서, CAR 활성을 갖는 외인성 생합성 효소는 carB 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 재조합 박테리아 세포는 생체 내에서 또는 세포 내부에서 지방족 아민을 생성한다. 지방족 아민은 재조합 박테리아 세포에 의해 배양 배지 내로 방출된다.
본 발명의 또 다른 측면은 에스체리치아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 시아노피타(Cyanophyta), 락토바실러스(Lactobacillus), 자이모모나스(Zymomonas), 로도코커스(Rhodococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 푸사리움(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 리조무코르(Rhizomucor), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 무코르(Mucor), 미셀리오프토라(Myceliophtora), 페니실리움(Penicillium), 파네로카에테(Phanerochaete), 플레우로투스(Pleurotus), 트라메테스(Trametes), 크리소스포리움(Chrysosporium), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스테노트로파모나스(Stenotrophamonas), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로위아(Yarrowia), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 지방족 아민의 생성을 위한 재조합 미생물을 제공한다. 일 구현예에서, 에스체리치아는 대장균Escherichia coli)이다. 또 다른 구현예에서, 시아노피타는 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 시아노테세(Cyanothece) 및 노스톡 펑크티포르메(Nostoc Punctiforme)를 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 또 다른 구현예에서, 시아노피타는 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus) PCC7942, 시네코시스티스 종(Synechocystis sp.) PCC6803, 및 시네코코커스 종 PCC7001을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음).
본 발명의 또 다른 측면은 탄소원을 함유하는 발효 브로쓰(fermentation broth)에서 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 지방족 아민을 생성하는 방법을 제공한다. 미생물은 생체 내에서 지방족 아민을 생성하는 적어도 하나의 조작된 대사 경로(위 참조)를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 탄소원의 존재 하에서 발효 브로쓰에서 지방족 아민(위 참조)을 생성하는 조작된 대사 경로를 발현하는 세포를 배양하는 단계; 및 발효 브로쓰에 수집된 지방족 아민을 수득(harvest)하는 단계를 포함하는 재조합 박테리아 세포에서 지방족 아민을 생성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 아민(위 참조)의 생성을 위한 재조합 미생물 세포를 포함하는 세포 배양물(cell culture)을 포함한다. 일 구현예에서, 세포 배양물은 아민의 생성을 위한 재조합 박테리아 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 재조합 미생물 세포는 재조합 박테리아 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 생합성 효소 및 지방족 알데히드 생성을 위한 조작된 대사 경로를 갖는 재조합 미생물을 제공하고, 생합성 효소는 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 생합성 효소는 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제 또는 GABA 아미노트랜스퍼라아제이다. 또 다른 구현예에서, 생합성 효소는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제이다.
본 발명의 또 다른 측면은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 생합성 효소를 포함하는 지방족 아민 생성을 위한 조작된 대사 경로 및 지방족 알데히드 생성을 위한 조작된 대사 경로를 갖는 재조합 미생물을 제공하고, 재조합 미생물은 미생물 세포이다. 일 측면에서, 미생물 세포는 재조합 세포이다. 미생물 세포는 에스체리치아, 바실러스, 시아노피타, 락토바실러스, 자이모모나스, 로도코커스, 슈도모나스, 아스페르길루스, 트리코데르마, 뉴로스포라, 푸사리움, 후미콜라, 리조무코르, 클루이베로마이세스, 피치아, 무코르, 미셀리오프토라, 페니실리움, 파네로카에테, 플레우로투스, 트라메테스, 크리소스포리움, 사카로마이세스, 스테노트로파모나스, 스키조사카로마이세스, 야로위아, 및 스트렙토마이세스를 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 일 구현예에서, 에스체리치아는 대장균이다. 또 다른 구현예에서, 시아노피타는 프로클로로코커스, 시네코코커스, 시네코시스티스, 시아노테세 및 노스톡 펑크티포르메를 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 또 다른 특정 구현예에서, 시아노피타는 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942, 시네코시스티스 종 PCC6803, 및 시네코코커스 종 PCC7001이다.
본 발명의 또 다른 측면은 지방족 알데히드 생성을 위한 조작된 대사 경로 및 지방족 아민 생성을 위한 조작된 대사 경로를 갖는 재조합 미생물을 제공한다. 일 구현예에서, 지방족 알데히드 생성을 위한 조작된 대사 경로는 지방산을 지방족 알데히드로 전환시키는 티오에스테라아제 및/또는 카르복실산 리덕타아제(CAR)를 포함하는 한편, 지방족 아민 생성을 위한 조작된 대사 경로는 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 티오에스테라아제는 선도 서열을 갖거나 갖지 않고 tesA 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 한편, 카르복실산 리덕타아제(CAR)는 carB 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되고, 둘 모두는 미생물에서 발현된다. 일 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제는 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제 또는 GABA 아미노트랜스퍼라아제이다. 일 구현예에서, 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제는 미생물에서 발현되는 ygjG 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 YgjG이다. 또 다른 구현예에서, GABA 아미노트랜스퍼라아제는 미생물에서 발현되는 puuE 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 PuuE이다. 또 다른 구현예에서, 아민 디하이드로게나아제는 파라코커스 데니트리피칸스로부터의 메틸아민 디하이드로게나아제이다. 일 구현예에서, 지방족 아민은 미생물에 의해 상청액(supernatant) 또는 배양 배지 내로 방출된다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민은 미생물 내부로부터 수집되며, 이는 발효 과정 동안 또는 이후에 추출될 수 있다.
또한, 본 발명은 탄소원을 함유하는 발효 브로쓰에서 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 지방족 아민을 생성하는 방법을 고려하고, 재조합 미생물은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 생합성 효소 및 알데히드 생성을 위한 조작된 대사 경로를 함유하며, 생합성 효소는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖고, 미생물은 생체 내에서 지방족 아민을 생성한다.
또한, 본 발명은 티오에스테라아제 및 카르복실산 리덕타아제(CAR) 활성을 갖는 하나 이상의 효소의 발현; 및 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소의 발현을 포함하는 재조합 미생물 세포를 포함하고, 미생물 세포는 지방족 아민을 생성한다. 일 구현예에서, 생합성 효소는 YgjG와 같은 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제 또는 PuuE와 같은 GABA 아미노트랜스퍼라아제이다. 또 다른 구현예에서, 생합성 효소는 파라코커스 데니트리피칸스로부터의 메틸아민 디하이드로게나아제와 같은 아민 디하이드로게나아제이다. 또 다른 구현예에서, 생합성 효소는 아민 옥시다아제이다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 재조합 미생물에서 지방족 아민을 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 탄소원의 존재 하에서 발효 배지에서 미생물 세포(위 참조)를 배양하는 단계; 및 상청액 또는 발효 배지에 수집된 지방족 아민을 수득하는 단계를 포함한다. 재조합 미생물 세포는 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 생합성 효소 및 지방족 알데히드 생성을 위한 조작된 대사 경로를 발현하고, 생합성 효소는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는다. 또 다른 측면에서, 재조합 미생물 세포는 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 생합성 효소를 포함하는 아민 생성을 위한 조작된 대사 경로 및 지방족 알데히드 생성을 위한 조작된 대사 경로를 발현하고, 생합성 효소는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면은 석유화학 원료가 아닌 탄소원으로부터 유래되는 지방족 아민을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 재생가능한 공급원료(renewable feedstocks), 예컨대 CO2, CO, 글루코오스, 수크로오스, 자일로스, 아라비노오스, 글리세롤, 만노오스, 또는 이의 혼합물로부터 유래되는 지방족 아민을 제공한다. 지방족 아민이 유래될 수 있는 본 명세서에 제공된 다른 공급원료들은 녹말, 셀룰로오스 바이오매스(cellulosic biomass), 당밀, 및 셀룰로오스 바이오매스의 가수분해로부터 유래된 탄수화물 혼합물을 포함하는 다른 탄수화물원, 또는 식물- 또는 천연 오일 처리로부터 유래된 폐기물(waste material)을 포함한다.
본 발명은 바람직한 구현예들을 예시하는 역할을 하는 첨부한 도면들과 연계하여 읽을 때 가장 잘 이해된다. 하지만, 본 발명은 도면들에 개시된 특정 구현예들로 제한되지 않음을 이해한다.
도 1은 티오에스테라아제, 카르복실산 리덕타아제, 및 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제(중간 열)의 발현을 통해 생성된 고유한 지방족 아민 피크(7.61 분에서 중간 패널, 화살표로 표시됨)를 나타내는 미생물 세포 추출물로부터의 MS/GC 크로마토그래프이다. 상부 열은 F16 음성 대조군(negative control)이고; 중간 열은 F16-YG 샘플이며; 하부 열은 YG 음성 대조군이다. 상부 및 중간 열에서의 추가 피크들은 지방족 알코올이다.
도 2는 1-도데실아민 표준 시료(reference standard)(하부 열)와 비교되는 F16-YG 샘플(상부 열)의 용출 프로파일(elution profile)을 나타내는 또 다른 MS/GC 크로마토그래프이다. 상부 및 중간 열에서의 추가 피크들은 지방족 알코올이다.
도 3은 1-도데실아민 표준 시료(하부 열) 및 F16-YG 샘플(상부 열)로부터의 7.6 분 피크의 이온 단편화 패턴(ion fragmentation pattern)을 나타낸다. 또한, C11H24N, C10H22N, C9H20N을 포함하는 1-도데실아민의 특징적인 이온 단편들의 분자 구조가 상부 열에 나타나 있다.
개관(General Overview)
본 발명은 새로운 부류의 재생가능한 화학 제품을 나타내는 지방족 아민의 미생물 생성에 관한 것이다. 지방족 아민은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위해 조작된 대상 경로를 발현하는 미생물을 통해 생성된다. 이와 같이, 미생물은 생체 내에서 지방족 아민을 생성하기 위해 적어도 하나의 외인성 생합성 효소를 발현한다. 외인성 생합성 효소는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성; 또는 카르복실산 리덕타아제(CAR) 활성; 또는 티오에스테라아제 활성 또는 이의 조합을 가질 수 있다. 대안적인 형태의 효소 활성 또한 본 명세서에 포함된다.
정의
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 본문에 명확히 달리 명시되지 않는다면 복수의 지시대상(referent)을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "숙주 세포"에 대한 언급은 이러한 2 이상의 숙주 세포를 포함하고, "지방족 아민"에 대한 언급은 하나 이상의 지방족 아민 또는 아민의 혼합물을 포함하며, "핵산 서열"에 대한 언급은 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고, "효소"에 대한 언급은 하나 이상의 효소를 포함하는 등이다.
"조작된 대사 경로"라는 용어는 세포 내부에서 특정 물질(즉, 전구체, 중간체 또는 최종 생성물)을 생성하기 위해(또는 이의 생성을 증가시키기 위해) 그 세포에서 발현되는 적어도 하나의 생합성 효소에 의해 촉매화되는 하나 이상의 유전적으로 조작된 또는 최적화된 화학 반응(들)을 지칭한다. 일 구현예에서, 생합성 효소는 외인성 생합성 효소이다. 또 다른 구현예에서, 조작된 대사 경로는 의도한 최종 생성물의 세포의 생성을 허용한다. 또 다른 구현예에서, 조작된 대사 경로는 의도한 전구체의 세포의 생성을 허용한다. 또 다른 구현예에서, 조작된 대사 경로는 의도한 중간체의 세포의 생성을 허용한다.
"생체 내에서"라는 용어는 특이적 생성물을 생성하는 것과 관련하여 사용될 때 "세포 내부에서"를 지칭한다. 예를 들어, 생체 내에서의 지방족 아민의 생성은 세포 내부에서의 지방족 아민의 생성을 의미한다.
본 명세서에서 언급되는 서열 수탁 번호는 (여기에서 "NCBI 수탁 번호" 또는 대안적으로 "GenBank 수탁 번호"로 식별되는) 미국 국립보건원에 의해 유지되는 NCBI(미국 국립 생물공학 정보센터)에 의해 제공되는 데이터베이스로부터 그리고 (여기에서 "UniProtKB 수탁 번호"로 식별되는) 스위스 생물정보학 연구소에 의해 제공되는 UniProt 지식베이스(UniProtKB) 및 Swiss-Prot 데이터베이스로부터 얻어졌다.
효소 분류(Enzyme Classification: EC) 번호는 생화학 및 분자생물학 국제 연합(International Union of Biochemistry and Molecular Biology: IUBMB)의 명명 위원회(Nomenclature Committee)에 의해 제정되며, 이의 설명은 월드 와이드 웹의 IUBMB 효소 명명 웹사이트에서 이용가능하다. EC 번호는 효소-촉매화 반응에 따라 효소들을 분류한다. 예를 들어, (예를 들어 상이한 유기체들로부터의) 상이한 효소들이 동일한 반응을 촉매화하는 경우, 이 효소들은 동일한 EC 번호로 분류된다. 또한, 수렴 진화(convergent evolution)를 통해, 상이한 단백질 접힘(protein fold)이 동일한 반응을 촉매화할 수 있으며, 그러므로 동일한 EC 번호가 할당된다(Omelchenko 외 (2010) Biol. Direct 5:31 참조). 진화적으로 관련이 없고(evolutionarily unrelated) 동일한 생화학 반응을 촉매화할 수 있는 단백질들은 때때로 상사 효소(analogous enzyme)[즉, 상동 효소(homologous enzyme)와 반대됨]로서 지칭된다. EC 번호는, 예를 들어 단백질의 아미노산 서열에 의해 단백질을 특정(specify)하는 UniProt 식별자와 상이하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오티드"라는 용어는 헤테로사이클릭 염기, 당 및 하나 이상의 인산기로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 단위체 단위를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 염기들[구아닌(G), 아데닌(A), 사이토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)]은 통상적으로 퓨린 또는 피리미딘의 유도체들이지만, 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 염기 유사체(base analog)들도 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 자연적으로 발생하는 당은 펜토오스(5-탄당)의 (DNA를 형성하는) 디옥시리보오스 또는 (RNA를 형성하는) 리보오스이지만, 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 당 유사체들도 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 핵산은 통상적으로 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 형성하는 인산 결합을 통해 연결되지만, 많은 다른 연결들(예를 들어, 포스포로티오에이트, 보라노포스페이트 등)이 해당 기술분야에 알려져 있다.
"폴리뉴클레오티드"라는 용어는 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 디옥시리보뉴클레오티드(DNA)의 중합체를 지칭하고, 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 비-자연적 또는 변경된 뉴클레오티드들을 함유할 수 있다. "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 본 명세서에서 교환가능하게 사용되고, 여하한의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 이러한 용어들은 분자의 일차 구조를 지칭하고, 따라서 이중 및 단일 가닥의 DNA, 및 이중 및 단일 가닥의 RNA를 포함한다. 이 용어들은 메틸화된 및/또는 캡핑된(capped) 폴리뉴클레오티드(단, 이로 제한되지 않음)와 같은 변형된 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어지는 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체를 등가물로서 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 바이러스성, 염색체의, EST, cDNA, mRNA 및 rRNA를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 여하한 형태로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 데 교환가능하게 사용된다. "재조합 폴리펩티드"라는 용어는 재조합 기술들에 의해 생성된 폴리펩티드를 지칭하며, 일반적으로 발현된 단백질을 코딩하는 cDNA 또는 RNA는 숙주 세포를 형질전환하여 폴리펩티드를 생성하는 데 사용되는 적합한 발현 벡터(expression vector) 내로 삽입된다. 유사하게, "재조합 폴리뉴클레오티드" 또는 "재조합 핵산" 또는 "재조합 DNA"라는 용어들은 해당 기술분야의 당업자에게 알려져 있는 재조합 기술들에 의해 생성된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "동족체(homolog)" 및 "상동(homologous)"이라는 용어는 대응하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 적어도 약 50 퍼센트(%) 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 바람직하게, 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 대응하는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 약 99 % 상동성(homology)을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 서열 "상동성" 및 "서열 동일성"이라는 용어는 교환가능하게 사용된다.
해당 기술분야의 당업자라면, 2 이상의 서열 간의 상동성을 결정하는 방법들을 잘 알고 있을 것이다. 간명하게, 두 서열 간의 "상동성"의 계산은 다음과 같이 수행될 수 있다. 서열은 최적의 비교를 위해 정렬된다[예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭(gap)이 도입될 수 있으며, 비교를 위해 비-상동 서열은 무시될 수 있다]. 바람직한 일 구현예에서, 비교를 위해 정렬되는 제 1 서열의 길이는 제 2 서열의 길이의 적어도 약 30 %, 바람직하게는 적어도 약 40 %, 더 바람직하게는 적어도 약 50 %, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 60 %, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 70 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 98 % 또는 약 100 %이다. 이후, 제 1 및 제 2 서열들의 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제 1 서열에서 위치가 제 2 서열에서 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 퍼센트 상동성은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는, 갭의 개수 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치들의 개수의 함수이다. 두 서열 간의 퍼센트 상동성의 결정 및 서열의 비교는 BLAST와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다(Altschul 외 (1990) J. Mol. Biol. 215(3):403-410). 또한, 두 아미노산 서열 간의 퍼센트 상동성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 어느 하나, 그리고 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량(length weight)을 이용하는, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(Needleman 및 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453). 또한, 두 뉴클레오티드 서열 간의 퍼센트 상동성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 그리고 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하는, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 해당 기술분야의 당업자는 초기 상동성 계산을 수행할 수 있으며, 이에 따라 알고리즘 파라미터들을 조정할 수 있다. 바람직한 파라미터들의 세트(및, 당업자가, 분자가 청구항들의 상동성 제한 내에 있는지 여부를 결정하기 위해 어떤 파라미터들이 적용되어야 하는지에 대한 확신이 없는 경우에 사용되어야 하는 파라미터들의 세트)는 12의 갭 페널티(gap penalty), 4의 갭 확장 페널티 및 5의 프레임시프트 갭 페널티(frameshift gap penalty)를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)이다. 서열 정렬의 추가 방법들이 생물공학 분야에 알려져 있다(예를 들어, Rosenberg (2005) BMC Bioinformatics 6:278; Altschul 외 (2005) FEBS J. 272(20):5101-5109 참조).
"낮은 엄격성(stringency), 중간 엄격성, 높은 엄격성 또는 매우 높은 엄격성 조건들 하에서 혼성화한다(hybridizes)"라는 용어는 혼성화 및 세척에 대한 조건들을 설명한다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 안내는 생물공학 문서에서 찾을 수 있다(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 참조, 여기에 수성 및 비-수성 방법들이 자세히 설명되며, 어느 하나의 방법이 사용될 수 있다). 예를 들어, 특이적 혼성화 조건들은 다음과 같다: (1) 낮은 엄격성 혼성화 조건 -- 약 45 ℃에서 6X 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC), 이후에 적어도 50 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS로 두 번 세척(세척의 온도는 낮은 엄격성 조건에 대해 55 ℃로 증가될 수 있음); (2) 중간 엄격성 혼성화 조건 -- 약 45 ℃에서 6X SSC, 이후에 60 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS로 한번 이상 세척; (3) 높은 엄격성 혼성화 조건 -- 약 45 ℃에서 6X SSC, 이후에 65 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS로 한번 이상 세척; 및 (4) 매우 높은 엄격성 혼성화 조건 -- 65 ℃에서 0.5 M 소듐 포스페이트, 7 % SDS, 이후에 65 ℃에서 0.2X SSC, 1 % SDS로 한번 이상 세척. 달리 명시하지 않는다면, 매우 높은 엄격성 조건 (4)가 바람직한 조건이다.
"내인성"이라는 용어는 "내부에서 발생함"을 의미한다. 이와 같이, "내인성" 폴리펩티드는 숙주 세포의 원래 게놈(native genome)에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 내인성 폴리펩티드는 재조합 세포가 조작되는(또는 유래되는) 모 미생물 세포(parental microbial cell)(예를 들어, 모 숙주 세포)의 게놈에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다.
"외인성"이라는 용어는 "외부로부터 발생함"을 의미한다. 이와 같이, "외인성" 폴리펩티드는 세포의 원래 게놈에 의해 코딩되지 않은 폴리펩티드를 지칭한다. 외인성 폴리펩티드 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포로 전달될 수 있고, 상이한 세포 유형 또는 종(species)으로부터 클로닝(clone)되거나 유래될 수 있으며; 또는 동일한 세포 유형 또는 종으로부터 클로닝되거나 유래될 수 있다. 예를 들어, "외인성 생합성 효소"는 외인성 폴리펩티드의 일 예시이고, 폴리펩티드는 특정 효소 활성을 갖는 효소를 코딩한다. 또 다른 예시에서, 변이(즉, 돌연변이 또는 변경된) 폴리펩티드는 외인성 폴리펩티드의 일 예시이다. 이와 유사하게, 비-자연적으로 발생하는 핵산 분자가 세포로 도입되면 세포에 대해 외인성인 것으로 고려된다. 또한, "외인성"이라는 용어는 비-원래 상태에서 재조합 숙주 세포에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 단백질에 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, "외인성" 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열이 대응하는 야생형 숙주 세포에 자연적으로 존재하는 야생형 서열에 대해 변형될 수 있으며, 이는 예를 들어 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 서열 또는 발현 수준에서의 변형이다. 이와 같은 선 상에서, 자연적으로 발생하는 핵산 분자는 특정 세포에 대해 외인성일 수 있다. 예를 들어, 세포 X로부터 분리된(isolated) 전체 코딩 서열은, 그 코딩 서열이 세포 Y 내로 도입되면, X 및 Y가 동일한 세포 유형이더라도, 세포 Y에 대해 외인성 핵산이다.
"과발현된"이라는 용어는, 유전자가 그 유전자에 대한 내인성 전사율(transcription rate)에 비해 상승된 비율로 전사되도록 야기됨을 의미한다. 몇몇 예시들에서, 과발현은 추가적으로 단백질에 대한 내인성 번역률(translation rate)에 비해 대응하는 단백질의 상승된 번역률을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, "과발현하다"라는 용어는 동일한 조건들 하에서 대응하는 야생형 세포에서 통상적으로 발현되는 것보다 더 큰 농도로 세포에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 것을 의미한다. 과발현에 대한 테스트 방법들은 해당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 전사된 RNA 수준이 rtPCR을 이용하여 평가되고, 단백질 수준이 SDS 페이지 겔 분석(page gel analysis)을 이용하여 평가될 수 있다.
"이종"이라는 용어는 "상이한 유기체, 상이한 세포 유형, 및/또는 상이한 종으로부터 유래됨"을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이종"이라는 용어는 통상적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 단백질과 연계되며, 주어진 유기체, 세포 유형, 또는 종 내에 자연적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 식물로부터의 폴리뉴클레오티드 서열이 재조합 방법들에 의해 미생물 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 이때 식물 폴리뉴클레오티드는 그 재조합 미생물 숙주 세포에 대해 이종이다. 유사하게, 시아노박테리아로부터의 폴리뉴클레오티드 서열이 재조합 방법들에 의해 에스체리치아 속의 미생물 숙주 세포로 도입될 수 있으며, 이때 시아노박테리아로부터의 폴리뉴클레오티드는 그 재조합 미생물 숙주 세포에 대해 이종이다. 이러한 선 상에서, "이종 생합성 효소"는 이종 폴리펩티드의 일 예시이며, 폴리펩티드는 특정 효소 활성을 갖는 효소를 코딩한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 "단편(fragment)"이라는 용어는 2 개의 아미노산 잔기에서부터 1 개의 아미노산 잔기를 뺀 전체 아미노산 서열에 이르는 크기 범위를 갖는 전체-길이 폴리펩티드 또는 단백질의 더 짧은 부분을 지칭한다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 단편은 폴리펩티드 또는 단백질의 도메인(예를 들어, 기질 결합 도메인 또는 촉매 도메인)의 전체 아미노산 서열을 지칭한다.
"돌연변이유발(mutagenesis)"이라는 용어는 유기체의 유전 정보가 안정한 방식으로 변화되는 과정을 지칭한다. 단백질 코딩 핵산 서열의 돌연변이유발은 돌연변이 단백질을 생성한다. 또한, 돌연변이유발은 변형된 단백질 활성을 야기하는 비-코딩 핵산 서열의 변화를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "돌연변이"는 유전자의 핵산 위치 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 위치의 영구적인 변화를 지칭한다. 돌연변이는 치환, 추가, 삽입 및 결실을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 위치의 돌연변이는 일 유형의 아미노산의 다른 유형의 아미노산으로의 치환일 수 있다[예를 들어, 세린(S)이 알라닌(A)으로 치환될 수 있고; 리신(L)이 T(트레오닌)로 치환될 수 있다]. 이와 같이, 폴리펩티드 또는 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있으며, 일 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, 생합성 폴리펩티드 또는 단백질은 그 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "생합성 효소"라는 용어는 지방산 유도체 생합성(예를 들어, 지방산, 지방족 알데히드, 지방족 알코올, 지방족 아민, 지방족 에스테르 등)과 관계된 효소 활성을 갖는 단백질을 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 바와 같은 생합성 효소의 일 예시는 지방족 알데히드 전구체를 지방족 아민으로 전환시킬 수 있는 효소[예를 들어, 지방족 아민 생성 생합성 효소(fatty amine producing biosynthetic enzyme)]이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 생합성 효소의 또 다른 예시는 지방산을 지방족 알데히드(예를 들어, 지방족 알데히드 생성 생합성 효소)로 전환시킬 수 있는 효소이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 생합성 효소의 또 다른 예시는 아실-ACP 또는 아실-CoA를 지방산으로 전환시킬 수 있는 효소(예를 들어, 지방산 생성 생합성 효소)이다. 세포가 생합성 효소로 형질전환되었을 때, 이는 생합성 효소(예를 들어, 재조합 세포)를 발현하는 세포이다. 일 구현예에서, 지방족 아민 생성 생합성 효소를 발현하는 세포에 의해 생성되는 지방족 아민 관련 화합물의 역가(titer) 및/또는 수율은 대응하는 야생형 세포(즉, 지방족 아민 생성 생합성 효소를 발현하지 않는 대응하는 세포)의 역가 및/또는 수율의 적어도 2 배이다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민 생성 생합성 효소를 발현하는 세포에 의해 생성되는 지방족 아민 관련 화합물의 역가 및/또는 수율은 대응하는 야생형 세포의 역가 및/또는 수율의 적어도 약 1 배, 적어도 약 2 배, 적어도 약 3 배, 적어도 약 4 배, 적어도 약 5 배, 적어도 약 6 배, 적어도 약 7 배, 적어도 약 8 배, 적어도 약 9 배, 또는 적어도 약 10 배 더 크다. 일 구현예에서, 지방족 아민 생성 생합성 효소를 발현하는 세포에 의해 생성되는 지방족 아민 관련 화합물의 역가 및/또는 수율은 대응하는 야생형 세포의 역가 및/또는 수율의 적어도 약 1 %, 적어도 약 2 %, 적어도 약 3 %, 적어도 약 4 %, 적어도 약 5 %, 적어도 약 6 %, 적어도 약 7 %, 적어도 약 8 %, 적어도 약 9 %, 또는 적어도 약 10 % 더 크다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민 생성 생합성 효소의 발현으로 인한 역가 및/또는 수율은 야생형 세포의 역가 및/또는 수율의 적어도 약 20 % 내지 적어도 약 100 % 더 크다. 또 다른 구현예들에서, 지방족 아민 생성 생합성 효소의 발현으로 인한 세포에 의해 생성되는 지방족 아민 관련 화합물의 역가 및/또는 수율은 대응하는 야생형 세포의 역가 및/또는 수율의 적어도 약 20 %, 적어도 약 25 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 35 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 45 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 55 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 65 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 75 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 97 %, 적어도 약 98 %, 또는 적어도 약 100 % 더 크다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자"라는 용어는 RNA 생성물 또는 단백질 생성물 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라, RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 주는 작동가능하게-연결된(operably-linked) 핵산 서열[예를 들어, 이러한 서열은 프로모터(promoter) 또는 인핸서(enhancer) 서열을 포함함(단, 이로 제한되지 않음)] 또는 RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 주는 서열을 코딩하는 작동가능하게-연결된 핵산 서열[예를 들어, 이러한 서열은 리보솜 결합 부위 또는 번역 조절 서열을 포함함(단, 이로 제한되지 않음)]을 지칭한다.
발현 조절 서열은 해당 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위하여 제공되는 프로모터, 인핸서, 아데닐산중합반응 신호(polyadenylation signal), 전사 종결자(transcription terminator), 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry sites: IRES) 등을 포함한다. 발현 조절 서열은 전사에 관련된 세포성 단백질과 특이적으로 상호작용한다(Maniatis 외 Science 236:1237-1245(1987)). 예시적인 발현 조절 서열은 생명공학 문서에 개시되어 있다(예를 들어, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990) 참조). 본 발명의 방법들에서, 하나 이상의 발현 조절 서열은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. "작동가능하게 연결된"이라는 것은, 적절한 분자들(예를 들어, 전사 활성화인자 단백질들)이 발현 조절 서열에 결합될 때, 폴리뉴클레오티드 서열 및 발현 조절 서열이 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 작동가능하게 연결된 프로모터는, 전사 및 번역의 방향에 관하여, 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 상류에 위치된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 선택된 폴리뉴클레오티드의 상류, 내부 또는 하류에 위치될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 벡터가 연결된 다른 핵산, 즉 폴리뉴클레오티드 서열을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 유형의 유용한 벡터는 에피솜(episome)[즉, 염색체외 복제(extra-chromosomal replication)가 가능한 핵산]이다. 유용한 벡터는 벡터가 연결된 핵산의 자율 복제 및/또는 발현이 가능한 벡터이다. 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지향할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 칭해진다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술들에 유용한 발현 벡터는 흔히 "플라스미드"의 형태로 되어 있으며, 이는 일반적으로 벡터 형태로 염색체에 결합되지 않는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유용한 발현 벡터가 선형 형태로 제공된다. 등가의 기능들을 제공하고, 이후에 해당 기술분야에 알려지는 이러한 다른 형태들의 발현 벡터도 또한 포함된다. 몇몇 구현예들에서, 재조합 벡터는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 프로모터는 발달-조절된 프로모터(developmentally-regulated promoter), 세포소기관-특이적 프로모터(organelle-specific promoter), 조직-특이적 프로모터(tissue-specific promoter), 유도성 프로모터(inducible promoter), 구성적 프로모터(constitutive promoter), 또는 세포-특이적 프로모터이다. 재조합 벡터는 통상적으로, 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티(purification moiety); 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열(secretion sequence); 및 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적 서열(targeting sequence)로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함한다. 특정 구현예들에서, 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 안정하게 통합되며, 뉴클레오티드 서열의 발현은 조절된 프로모터 구역의 조절을 받는다. 본 명세서에 사용되는 발현 벡터는 숙주 세포에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 형태로 된 본 명세서에 설명되는 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 해당 기술분야의 당업자라면, 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 의도한 폴리펩티드의 발현 수준 등과 같은 이러한 인자들에 의존할 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 설명되는 발현 벡터는 본 명세서에 설명되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 생성하기 위하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
"재조합 세포" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본 명세서에서 교환가능하게 사용되고, 적어도 하나의 생합성 효소를 외인성으로 발현하도록 변형된 세포를 지칭한다. 특정한 일 구현예에서, 생합성 효소는 지방족 알데히드 전구체를 지방족 아민으로 전환시킬 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 재조합 세포는 지방족 아민 또는 지방족 아민 유래 화합물을 생성하기 위해 재조합 세포의 특이적 활성을 증가시킬 수 있는 생합성 효소를 포함한다. 재조합 세포는 박테리아, 바이러스 또는 균류와 같은 미생물 또는 미생물 세포로부터 유래될 수 있다. 재조합 세포는 지방족 아민을 생성하는 데 사용될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 재조합 세포는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)를 외인성으로 발현하고, 각각의 폴리뉴클레오티드는 생합성 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며, 재조합 세포는 폴리뉴클레오티드(들)를 발현하기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원의 존재 하에 배양될 때 지방족 아민 관련 조성물을 생성한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "미생물"이라는 용어는 미세한 생물(microscopic organism)을 지칭한다. 미생물의 예시는 박테리아, 바이러스 또는 균류이다. 일 구현예에서, 미생물은 박테리아성 세포이다. 또 다른 구현예에서, 미생물은 원핵생물 또는 원핵 세포이다. 또 다른 구현예에서, 미생물은 효모 세포와 같은 균류 세포이다. 또 다른 구현예에서, 미생물은 바이러스성 세포이다. 관련 구현예에서, "재조합 미생물"은 유전적으로 변경된, 또한 외인성 및/또는 이종 핵산 서열을 발현하거나 포함하는 미생물이다. 또 다른 관련 구현예에서, "재조합 미생물"은 유전적으로 변경된, 또한 외인성으로 발현된 적어도 하나의 단백질(예를 들어, 외인성 생합성 효소)을 포함하는 조작된 대사 경로를 발현하는 미생물이다.
"아실-ACP"라는 용어는 아실기 운반 단백질(ACP)의 포스포판테테이닐 모이어티의 술피드릴기와 알킬 사슬의 카르보닐 탄소 사이에서 형성되는 아실 티오에스테르를 지칭한다. 포스포판테테이닐 모이어티는 홀로(holo)-아실기 운반 단백질 신타아제(ACPS)인 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제의 작용에 의해 ACP 상의 보존된 세린 잔기에 번역후(post-translationally) 부착된다. 몇몇 구현예들에서, 아실-ACP는 완전히 포화된 아실-ACP의 합성에 있어서 중간체이다. 다른 구현예들에서, 아실-ACP는 불포화된 아실-ACP의 합성에 있어서 중간체이다. 몇몇 구현예들에서, 탄소 사슬은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 탄소들을 가질 것이다. 이러한 아실-ACP의 각각은 이를 지방산 유도체로 전환시키는 효소에 대한 기질이다.
"아실-CoA"라는 용어는 조효소 A(CoA)가 살아있는 세포 내부에서 지방산의 단부에 부착될 때 형성되는 임시 화합물(temporary compound)이다. 이는 지방산의 대사에 관여되는 조효소의 그룹을 지칭한다. 몇몇 구현예들에서, 탄소 사슬은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 탄소들을 가질 것이다. 이러한 아실-CoA의 각각은 이를 지방산 유도체로 전환시키는 효소에 대한 기질이다.
"지방족 알데히드 생성을 위한 대사 경로"라는 용어는 지방족 알데히드를 생성하는 여하한의 생합성 경로를 의미한다. 지방족 알데히드 생성을 위한 대사 경로는 지방족 알데히드를 생성하기 위해 여하한의 수의 효소들을 포함할 수 있다.
"지방족 아민 생성을 위한 대사 경로"라는 용어는 지방족 아민을 생성하는 여하한의 생합성 경로를 의미한다. 지방족 아민 생성을 위한 대사 경로는 지방족 아민을 생성하기 위해 적어도 하나의 효소를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방족 아민"은 화학식 RNH2를 갖는 아민을 의미한다. 본 명세서에서 언급되는 지방족 아민은, 예를 들어 지방산 또는 지방족 알데히드 또는 지방족 아실-ACP로부터 유래된 지방족 알데히드로부터 만들어지는 여하한의 지방족 아민일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, R기는 길이가 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19 개의 탄소들이다. 대안적으로 또는 추가적으로, R기는 길이가 24 이하, 23 이하, 22 이하, 20 이하, 19 이하, 18 이하, 17 이하, 16 이하, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하 또는 6 이하의 탄소들이다. 따라서, R기는 상기의 종단점들 중 어느 2 개에 의해 한정되는 R기를 가질 수 있다. 예를 들어, R기는 길이가 6 내지 16 개의 탄소들, 길이가 10 내지 14 개의 탄소들, 또는 길이가 12 내지 18 개의 탄소들일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 지방족 아민 조성물은 C6, C7, C8, C9, C1O, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, 및 C24 지방족 아민 중 하나 이상을 포함한다. 다른 구현예들에서, 지방족 아민 조성물은 C6, C7, C8, C9, C1O, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17 및 C18 지방족 아민 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예들에서, 지방족 아민 조성물은 C12, C14, C16 및 C18 지방족 아민; C12, C14 및 C16 지방족 아민; C14, C16 및 C18 지방족 아민; 또는 C12 및 C14 지방족 아민을 포함한다. 지방족 아민의 R기는 직쇄형 또는 분지쇄형일 수 있다. 분지쇄형은 하나 이상의 분지점을 가질 수 있으며, 사이클릭형 분지들을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 분지형 지방족 아민은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23 또는 C24 분지형 지방족 아민이다. 분지형 또는 비분지형 지방족 아민의 R기는 포화되거나 불포화될 수 있다. 불포화된 경우, R기는 하나 또는 하나 이상의 불포화점을 가질 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 단일불포화 지방족 아민이다. 특정 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 C6:1, C7:1, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1 또는 C24:1 불포화 지방족 아민이다. 특정 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 또는 C18:1 불포화 지방족 아민이다. 다른 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 오메가-7 위치에서 불포화된다. 특정 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 시스(cis) 이중 결합을 갖는다. 지방족 아민은 지방족 알킬 또는 메틸기에 의해 대체되는 암모니아 분자의 수소 원자들의 수에 따라 1차-, 2차-, 및 3차 아민으로 분류된다. 물 처리에서 세제로서, 석유에서 부유제(flotation agent)로서, 직물, 고무 등에서 부식 방지제 등으로서 사용될 수 있는 지방족 아민의 예시들은 디-메틸 알킬 아민(C10, C12, C14, C16, 또는 C18) 및 디-알킬 메틸 아민(C10)과 같은 3차 아민; 및 디-메틸 알킬 아민(C8 내지 C18, C12 내지 C18, C12 내지 C14, 또는 C16 내지 C18)과 같은 3차 아민 혼합물(blend)이다.
"클론"이라는 용어는 통상적으로 단일 공통 선조와 본질적으로 유전적으로 동일하고 이의 자손인 세포 또는 세포들의 그룹, 예를 들어 단일 박테리아성 세포에서 발생하는 클로닝된 박테리아성 콜로니(cloned bacterial colony)의 박테리아를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "배양물"이라는 용어는 통상적으로 생세포(viable cell)를 포함하는 액체 배지를 지칭한다. 일 구현예에서, 배양물은 조절된 조건들 하에서 사전설정된 배양 배지에서 번식하는 세포, 예를 들어 선택된 탄소원 및 질소를 포함하는 액체 배지에서 성장되는 재조합 숙주 세포의 배양물을 포함한다. "배양하는" 또는 "배양"은 액체 또는 고체 배지의 적절한 조건들 하에서 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)의 개체군을 성장시키는 것을 지칭한다. 몇몇 구현예들에서, 배양은 최종 생성물로의 기질의 발효성 생물전환(bioconversion)을 지칭한다. 배양 배지는 잘 알려져 있으며, 이러한 배양 배지의 개별 성분들은 상용 공급원(commercial source)(예를 들어, DIFCO 배지 및 BBL 배지)으로부터 이용가능하다. 일 예시에서, 수성 영양 배지는 YP 배지와 같이 질소, 염 및 탄소의 복합원을 포함하는 "풍부한 배지(rich medium)"이며, 이는 10 g/L의 펩톤 및 10 g/L 효모 추출물을 포함한다. 또 다른 예시에서, 영양 배지는 미량의 원소, 영양소, 및 염으로 이루어진 "최소 배지"이다.
예를 들어, 재조합 숙주 세포 내에서의 효소 활성에 대해 "변형된 활성" 또는 "변경된 수준의 활성"이라는 용어는 모(parent) 또는 원래 숙주 세포에 대해 결정된 바와 같은 효소 활성의 하나 이상의 특징의 차이를 지칭한다. 통상적으로, 이러한 활성의 차이는, 특히 재조합 숙주 세포의 배양물을 대응하는 야생형 숙주 세포의 배양물과 비교함으로써, 재조합 숙주 세포(즉, 변형된 활성을 가짐)와 대응하는 야생형 숙주 세포 사이에서 결정된다. 예를 들어, 변형된 활성은 (예를 들어, 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 증가 또는 감소된 수의 복제, 단백질을 코딩하는 증가 또는 감소된 수의 mRNA 전사체, 및/또는 mRNA로부터의 단백질의 증가 또는 감소된 양의 단백질 번역의 결과로서) 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 변형된 양의 단백질; 단백질의 구조 변화[예를 들어, 기질 특이성의 변화, 관찰되는 운동 파라미터(kinetic parameter)들의 변화를 야기하는 단백질 코딩 서열에 대한 변화와 같은 일차 구조에 대한 변화]; 및 단백질 안정성의 변화(예를 들어, 단백질의 증가 또는 감소된 분해)의 결과일 수 있다. 특정 경우에서, 본 명세서에 설명된 폴리펩티드들에 대한 코딩 서열은 특정 숙주 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 예를 들어, 대장균의 발현에 대하여, 하나 이상의 코돈이 이에 따라 최적화될 수 있다(Grosjean 외 (1982) Gene 18:199-209 참조).
통상적으로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "조절 서열(regulatory sequence)"이라는 용어는 궁극적으로 단백질의 발현을 조절하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열들에 작동가능하게-연결된, DNA의 염기 서열을 지칭한다. 조절 서열의 예시들은 RNA 프로모터 서열, 전사 인자 결합 서열, 전사 종결 서열, (인핸서 요소와 같은) 전사의 조절인자(modulator), RNA 안정성에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열, 및 번역 조절 서열[예컨대, 리보솜 결합 부위(예를 들어, 원핵생물의 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequence) 또는 진핵생물의 코작 서열(Kozak sequence)), 개시 코돈, 종결 코돈]을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "상기 뉴클레오티드 서열의 발현은 야생형 뉴클레오티드 서열에 대해 변형된다"라는 어구는, 내인성 뉴클레오티드 서열의 발현 및/또는 활성 또는 이종 혹은 비-원래 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 발현 및/또는 활성의 수준의 증가 또는 감소를 의미한다. "변경된 수준의 발현" 및 "변형된 수준의 발현"이라는 용어는 교환가능하게 사용되며, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 탄화수소가 동일한 조건들 하에서 대응하는 야생형 세포의 농도와 비교 시 조작된 숙주 세포에서 상이한 농도로 존재함을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드에 대한 "발현"이라는 용어는 이것이 기능하게 한다는 것이다. 폴리펩티드(또는 단백질)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 발현될 때, 그 폴리펩티드(또는 단백질)를 생성하기 위해 전사 및 번역될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "역가"라는 용어는 숙주 세포 배양물의 단위 부피당 생성된 지방족 아민 또는 지방족 아민 관련 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 본 명세서에 설명된 조성물들 및 방법들의 어느 한 측면에서, 지방족 아민은 약 25 mg/L, 약 50 mg/L, 약 75 mg/L, 약 100 mg/L, 약 125 mg/L, 약 150 mg/L, 약 175 mg/L, 약 200 mg/L, 약 225 mg/L, 약 250 mg/L, 약 275 mg/L, 약 300 mg/L, 약 325 mg/L, 약 350 mg/L, 약 375 mg/L, 약 400 mg/L, 약 425 mg/L, 약 450 mg/L, 약 475 mg/L, 약 500 mg/L, 약 525 mg/L, 약 550 mg/L, 약 575 mg/L, 약 600 mg/L, 약 625 mg/L, 약 650 mg/L, 약 675 mg/L, 약 700 mg/L, 약 725 mg/L, 약 750 mg/L, 약 775 mg/L, 약 800 mg/L, 약 825 mg/L, 약 850 mg/L, 약 875 mg/L, 약 900 mg/L, 약 925 mg/L, 약 950 mg/L, 약 975 mg/L, 약 1000 mg/L, 약 1050 mg/L, 약 1075 mg/L, 약 1100 mg/L, 약 1125 mg/L, 약 1150 mg/L, 약 1175 mg/L, 약 1200 mg/L, 약 1225 mg/L, 약 1250 mg/L, 약 1275 mg/L, 약 1300 mg/L, 약 1325 mg/L, 약 1350 mg/L, 약 1375 mg/L, 약 1400 mg/L, 약 1425 mg/L, 약 1450 mg/L, 약 1475 mg/L, 약 1500 mg/L, 약 1525 mg/L, 약 1550 mg/L, 약 1575 mg/L, 약 1600 mg/L, 약 1625 mg/L, 약 1650 mg/L, 약 1675 mg/L, 약 1700 mg/L, 약 1725 mg/L, 약 1750 mg/L, 약 1775 mg/L, 약 1800 mg/L, 약 1825 mg/L, 약 1850 mg/L, 약 1875 mg/L, 약 1900 mg/L, 약 1925 mg/L, 약 1950 mg/L, 약 1975 mg/L, 약 2000 mg/L(2 g/L), 3 g/L, 5 g/L, 1O g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 1OO g/L 또는 상기 값들 중 어느 2 개에 의해 한정되는 범위의 역가로 생성된다. 다른 구현예들에서, 지방족 아민은 1OO g/L 초과, 200 g/L 초과 또는 300 g/L 초과의 역가로 생성된다. 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생성되는 지방족 아민의 바람직한 역가는 5 g/L 내지 200g/L, 1O g/L 내지 150 g/L, 20 g/L 내지 120 g/L, 및 30 g/L 내지 1OO g/L이다. 역가는 주어진 재조합 숙주 세포 배양물에 의해 생성되는 특정 지방족 아민 또는 지방족 아민의 조합물 또는 조성물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 대장균과 같은 재조합 숙주 세포에서 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시킬 수 있는 생합성 단백질의 발현은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시킬 수 있는 생합성 단백질의 발현을 결여시킨 대응하는 야생형 폴리펩티드를 발현하는 재조합 숙주 세포와 비교 시 더 높은 역가의 생성을 야기한다. 일 구현예에서, 더 높은 역가는 적어도 약 5 g/L에서 약 200 g/L의 범위를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포에 의해 생성되는 지방족 아민을 포함하는 지방족 아민 관련 화합물의 수율"은 투입된 탄소원이 숙주 세포에서 생성물로 전환되는 효율을 지칭한다. 본 발명의 방법들에 따라 지방족 아민 또는 지방족 아민 관련 화합물을 생성하도록 조작된 숙주 세포는 적어도 약 3 %, 적어도 약 4 %, 적어도 약 5 %, 적어도 약 6 %, 적어도 약 7 %, 적어도 약 8 %, 적어도 약 9 %, 적어도 약 10 %, 적어도 약 11 %, 적어도 약 12 %, 적어도 약 13 %, 적어도 약 14 %, 적어도 약 15 %, 적어도 약 16 %, 적어도 약 17 %, 적어도 약 18 %, 적어도 약 19 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 21 %, 적어도 약 22 %, 적어도 약 23 %, 적어도 약 24 %, 적어도 약 25 %, 적어도 약 26 %, 적어도 약 27 %, 적어도 약 28 %, 적어도 약 29 % 또는 적어도 약 30 %, 또는 상기 값들 중 어느 2 개에 의해 한정되는 범위의 수율을 갖는다. 다른 구현예들에서, 지방족 아민은 약 30 % 이상, 약 35 % 이상, 약 40 % 이상, 약 45 % 이상, 약 50 % 이상, 약 55 % 이상, 약 60 % 이상, 약 65 % 이상, 약 70 % 이상, 약 75 % 이상, 약 80 % 이상, 약 85 % 이상, 약 90 % 이상, 또는 그 이상의 수율로 생성된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 수율은 약 30 % 이하, 약 27 % 이하, 약 25 % 이하 또는 약 22 % 이하이다. 또 다른 구현예에서, 수율은 약 50 % 이하, 약 45 % 이하, 또는 약 35 % 이하이다. 또 다른 구현예에서, 수율은 약 95 % 이하, 약 90 % 이하, 약 85 % 이하, 약 80 % 이하, 약 75 % 이하, 약 70 % 이하, 약 65 % 이하, 약 60 % 이하, 약 55 % 이하, 또는 약 50 % 이하이다. 따라서, 수율은 상기 종단점들 중 어느 2 개에 의해 한정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생성되는 지방족 아민 또는 지방족 관련 화합물의 수율은 약 5 % 내지 약 15 %, 약 10 % 내지 약 25 %, 약 10 % 내지 약 22 %, 약 15 % 내지 약 27 %, 약 18 % 내지 약 22 %, 약 20 % 내지 약 28 %, 또는 약 20 % 내지 약 30 %, 약 30 % 내지 약 40 %, 약 40 % 내지 약 50 %, 약 50 % 내지 약 60 %, 약 60 % 내지 약 70 %, 약 70 % 내지 약 80 %, 약 80 % 내지 약 90 %, 또는 약 90 % 내지 약 100 %일 수 있다. 수율은 주어진 재조합 숙주 세포 배양물에 의해 생성되는 특정 지방족 아민 또는 지방족 아민 관련 화합물 또는 지방족 아민의 조합물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 대장균과 같은 재조합 숙주 세포에서 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시킬 수 있는 생합성 단백질의 발현은, 대응하는 야생형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포와 비교 시, 지방족 아민 또는 지방족 아민의 조성물들 또는 혼합물들을 포함하는 지방족 아민 유래 화합물의 더 높은 수율의 생성을 야기한다. 일 구현예에서, 더 높은 수율은 이론적인 수율의 약 10 %에서 약 100 %의 범위를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생산성"이라는 용어는 단위 시간당 숙주 세포 배양물의 단위 부피당 생성된 지방족 아민 또는 하나 이상의 지방족 아민의 조성물 또는 혼합물을 포함하는 지방족 아민 관련 화합물의 양을 지칭한다. 본 명세서에 설명된 조성물들 및 방법들의 어느 한 측면에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 아민의 조성물 또는 혼합물을 포함하는 지방족 아민 관련 화합물의 생산성은 적어도 100 mg/L/시간, 적어도 200 mg/L/시간, 적어도 300 mg/L/시간, 적어도 400 mg/L/시간, 적어도 500 mg/L/시간, 적어도 600 mg/L/시간, 적어도 700 mg/L/시간, 적어도 800 mg/L/시간, 적어도 900 mg/L/시간, 적어도 1000 mg/L/시간, 적어도 1100 mg/L/시간, 적어도 1200 mg/L/시간, 적어도 1300 mg/L/시간, 적어도 1400 mg/L/시간, 적어도 1500 mg/L/시간, 적어도 1600 mg/L/시간, 적어도 1700 mg/L/시간, 적어도 1800 mg/L/시간, 적어도 1900 mg/L/시간, 적어도 2000 mg/L/시간, 적어도 2100 mg/L/시간, 적어도 2200 mg/L/시간, 적어도 2300 mg/L/시간, 적어도 2400 mg/L/시간, 적어도 2500 mg/L/시간이거나, (세포 질량에 따라) 10 g/L/시간만큼 높다. 예를 들어, 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 지방족 아민의 조성물 또는 혼합물을 포함하는 지방족 아민 관련 화합물의 생산성은 500 mg/L/시간 내지 2500 mg/L/시간, 또는 700 mg/L/시간 내지 2000 mg/L/시간일 수 있다. 생산성은 주어진 숙주 세포 배양물에 의해 생성된 지방족 아민의 조성물 또는 지방족 아민의 혼합물 또는 지방족 아민의 조합물을 포함하는 특정 지방족 아민 관련 화합물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 대장균과 같은 재조합 숙주 세포에서 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시킬 수 있는 생합성 단백질의 발현은 대응하는 야생형 폴리펩티드를 발현하는 재조합 숙주 세포와 비교 시 지방족 아민 및 이의 조성물 및 혼합물을 포함하는 지방족 아민 유래 화합물들의 증가된 생산성의 생성을 야기한다. 일 구현예에서, 더 높은 생산성은 약 0.3 g/L/시간 내지 약 3 g/L/시간의 범위를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "총 지방 종(fatty species)" 및 "총 지방족 아민 생성물" 및 "지방족 아민 유도체"라는 용어는 GC-FID에 의해 평가되는 바와 같이 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시킬 수 있는 생합성 단백질을 발현하는 숙주 세포에 의해 생성될 수 있는 지방족 아민의 양과 관련하여 본 명세서에서 교환가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "글루코오스 이용률"이라는 용어는 그램/리터/시간(g/L/hr)으로 기록되는 단위 시간당 배양물에 의해 사용되는 글루코오스의 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "탄소원"이라는 용어는 원핵 또는 단순 진핵 세포 성장을 위한 탄소원으로서 사용되기에 적합한 기질 또는 화합물을 지칭한다. 탄소원은 중합체, 탄수화물, 산, 알코올, 알데히드, 케톤, 아미노산, 펩티드 및 기체(예를 들어, CO 및 CO2)를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 다양한 형태로 존재할 수 있다. 예시적인 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 갈락토오스, 자일로오스 및 아라비노오스와 같은 단당류; 프럭토-올리고당 및 갈락토-올리고당과 같은 올리고당류; 녹말, 셀룰로오스, 펙틴 및 자일란과 같은 다당류; 수크로오스, 말토오스, 셀로비오스 및 투라노오스(turanose)와 같은 이당류; 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 메틸 셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 물질 및 변이체; 숙시네이트, 락테이트 및 아세테이트와 같은 포화 또는 불포화 지방산류; 에탄올, 메탄올 및 글리세롤과 같은 알코올류, 또는 이의 혼합물들을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 또한, 탄소원은 글루코오스와 같은 광합성의 산물일 수 있다. 특정 구현예들에서, 탄소원은 플루 가스(flu gas)로부터 나오는 CO를 함유한 가스 혼합물이다. 또 다른 구현예에서, 탄소원은 바이오매스, 석탄 또는 천연 가스와 같은 탄소 함유 물질의 개량물(reformation)로부터 나오는 CO를 함유한 가스 혼합물이다. 다른 구현예들에서, 탄소원은 합성가스, 메탄 또는 천연 가스이다. 바람직한 특정 구현예들에서, 탄소원은 바이오매스이다. 바람직한 다른 구현예들에서, 탄소원은 글루코오스이다. 바람직한 다른 구현예들에서, 탄소원은 수크로오스이다. 다른 구현예들에서, 탄소원은 글리세롤이다. 바람직한 다른 구현예들에서, 탄소원은 사탕수수 쥬스, 사탕수수 시럽, 또는 옥수수 시럽이다. 바람직한 다른 구현예들에서, 탄소원은 CO2, CO, 글루코오스, 수크로오스, 자일로오스, 아라비노오스, 글리세롤, 만노오스, 또는 이의 혼합물들과 같은 재생가능한 공급원료로부터 유래된다. 다른 구현예들에서, 탄소원은 녹말, 셀룰로오스 바이오매스, 당밀, 및 식물- 또는 천연 오일 처리로부터 유래된 폐기물 또는 셀룰로오스 바이오매스의 가수분해로부터 유래된 탄수화물 혼합물들을 포함하는 다른 탄수화물 공급원들을 포함하는 재생가능한 공급원료로부터 유래된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "바이오매스"라는 용어는 탄소원이 유래되는 여하한의 생물학적 물질을 지칭한다. 몇몇 구현예들에서, 바이오매스는 탄소원으로 처리되며, 이는 생물전환에 적합하다. 다른 구현예들에서, 바이오매스는 탄소원으로의 추가적인 처리를 요구하지 않는다. 탄소원은 지방족 아민을 포함하는 조성물로 전환될 수 있다. 예시적인 바이오매스의 공급원은 옥수수, 사탕수수 또는 스위치그래스(switchgrass)와 같은 식물성 물질 또는 식생(vegetation)이다. 또 다른 예시적인 바이오매스의 공급원은 동물성 물질[예를 들어, 우분(cow manure)]과 같은 대사 노폐물(metabolic waste product)이다. 또 다른 예시적인 바이오매스의 공급원은 조류 및 여타의 해양 식물을 포함한다. 또한, 바이오매스는 글리세롤, 발효 찌꺼기, 목초, 짚, 목재, 오수, 쓰레기, 셀룰로오스성 도시 폐기물 및 음식 쓰레기(예를 들어, 비누, 오일 및 지방산)를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 산업, 농업, 임업 및 가정으로부터의 폐기물을 포함한다. 또한, "바이오매스"라는 용어는 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류 또는 다당류)과 같은 탄소원을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 생성물들(예를 들어, 지방족 아민 및 이의 조성물 및 혼합물)에 대하여 "분리된"이라는 용어는 세포 성분, 세포 배양 배지, 또는 화학적 또는 합성 전구체로부터 분별된(separated) 생성물들을 지칭한다. 본 명세서에 설명된 방법들에 의해 생성된 지방족 아민은 발효 브로쓰에서 그리고 세포질에서 상대적으로 혼합되지 않을 수 있다. 그러므로, 지방족 아민은 세포내 또는 세포외에서 유기 상(organic phase)으로 수집될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "정제한다", "정제된" 또는 "정제"라는 용어는, 예를 들어 분리 또는 분별에 의해 그 환경으로부터 분자의 제거 또는 분리를 의미한다. "실질적으로 정제된" 분자는 이것이 연계된 다른 성분들로부터 적어도 약 60 % 유리(free)(예를 들어, 적어도 약 70 % 유리, 적어도 약 75 % 유리, 적어도 약 85 % 유리, 적어도 약 90 % 유리, 적어도 약 95 % 유리, 적어도 약 97 % 유리, 적어도 약 99 % 유리)된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 또한 이러한 용어들은 샘플로부터 오염물의 제거를 지칭한다. 예를 들어, 오염물의 제거는 샘플에서의 지방족 아민 및 이의 조성물 및 혼합물을 포함하는 지방족 아민 유래 화합물의 백분율의 증가를 야기할 수 있다. 예를 들어, 지방족 아민 관련 화합물이 재조합 숙주 세포에서 생성될 때, 지방족 아민 관련 화합물은 숙주 세포 단백질 및/또는 다른 숙주 세포 물질의 제거에 의해 정제될 수 있다. 정제 후, 샘플에서의 지방족 아민의 백분율이 증가된다. "정제한다", "정제된" 및 "정제"라는 용어는 절대 순도를 요구하지 않는 상대적인 용어이다. 따라서, 예를 들어, 지방족 아민 관련 화합물이 재조합 숙주 세포들에서 생성될 때, 지방족 아민 화합물은 다른 세포 성분(예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물 또는 다른 탄화수소)과 실질적으로 분별된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "감쇠"라는 용어는 약화, 감소 또는 줄어듦을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 그 활성을 감소시키기 위해 폴리펩티드를 변형시킴으로써(예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 변형시킴으로써) 감쇠될 수 있다.
"지방족 알데히드 생성 생합성 효소" 또는 "지방족 알데히드 생성 효소"라는 용어는 본 명세서에서 교환가능하게 사용되며, 지방족 알데히드 또는 지방족 알데히드 전구체들을 생성하기 위해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 효소를 지칭한다. 이러한 효소들의 예시는 카르복실산 리덕타아제(CAR)(예를 들어, CarB) 및/또는 티오에스테라아제(TE)(예를 들어, TesA, 'tesA); (예를 들어, 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942로부터의) 아실-ACP 리덕타아제(AAR); 아실-CoA 리덕타아제(예를 들어, Acrl); 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제(PPTase) 등을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음).
지방족 알데히드 전구체로부터 지방족 아민으로
본 발명은 지방족 아민의 미생물 생성에 관한 것이다. 본 명세서에 나타내어진 바와 같이, 미생물은 지방족 아민을 생체 내에서 생성하기 위해 다양한 생합성 효소를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 더 구체적으로, 미생물은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 대사 경로를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 경로는 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위해 아미노트랜스퍼라아제[예를 들어, 대장균으로부터의 GABA 아미노트랜스퍼라아제(PuuE) 또는 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제(YgjG)] 또는 아민 디하이드로게나아제[예를 들어, 파라코커스 데니트리피칸스로부터의 메틸아민 디하이드로게나아제 또는 슈도모나스 종의 퀴노헤모(quinohemo) 단백질 아민 디하이드로게나아제] 또는 아민 옥시다아제 활성을 갖는 적어도 하나의 생합성 효소를 발현한다. 트랜스아미나아제는 아미노트랜스퍼라아제와 동일한 반응을 수행하며, 이 명칭들은 때때로 교환가능하게 사용된다. 또한, 예를 들어, GABA 아미노트랜스퍼라아제는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나아제라고도 칭해진다. 일 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제 또는 트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제는 외인성 생합성 효소이거나, 세포에서 외인성으로 발현된다. 대안적으로, 지방족 아민은 지방족 알데히드를 생성하는 외인성 생합성 효소를 발현하는 지방족 알데히드 생성을 위한 조작된 경로와, 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위해 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 활성을 갖는 생합성 효소를 발현하는 지방족 아민 생성을 위한 조작된 경로를 조합함으로써 생성될 수 있다. 이러한 지방족 알데히드 전구체들은 다양한 공정들 및 조작된 경로들, 예컨대 지방족 알데히드 생성을 위해 이용되는 조작된 카르복실산 리덕타아제(CAR) 경로(본 명세서에서 인용 참조되는 미국 특허 8,097,439 참조), 또는 지방족 알코올 생성을 위해 이용되는 조작된 CAR 및 티오에스테라아제(TE) 경로(위의 미국 특허 8,097,439 참조), 또는 지방족 알데히드 또는 지방족 알코올 생성을 위해 이용되는 조작된 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제(PPTase) 및 CAR 경로(본 명세서에서 인용 참조되는 미국 출원 공개 20130035513 참조), 또는 지방족 알데히드 생성을 위해(본 명세서에서 인용 참조되는 미국 특허 8,268,599 참조) 또는 알칸 생성을 위해(본 명세서에서 인용 참조되는 미국 특허 8,323,924 참조) 이용되는 조작된 아실-ACP 리덕타아제(AAR) 경로를 통해 생체 내에서 생성될 수 있다. 적합한 TE의 예시는 'TesA(즉, 그 주변세포질 선도 서열이 제거된 대장균으로부터의 절단된 티오에스테라아제(이에 따라 어퍼스트로피)이고(이는 세포질 내에 유지됨); 적합한 CAR의 예시는 CarB이며; 적합한 AAR의 예시는 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942로부터의 효소이다(아래의 표 6 참조).
일 구현예에서, 적절한 질소원(예를 들어, 글루타메이트 또는 암모니아 또는 과산화수소)으로 보충과 함께, 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 활성을 갖는 생합성 효소의 발현과 지방족 알데히드 생성을 위한 조작된 경로 및 지방족 아민 생성을 위한 조작된 경로의 동시발현(co-expression)은 알데히드 전구체의 대응하는 아민으로의 전환을 허용한다(푸트레신 아미노트랜스퍼라아제에 대해서는 표 1 참조; 효소 반응의 예시들에 대해서는 표 2, 표 3 및 표 4 참조). 아미노트랜스퍼라아제 반응에 대한 질소 공여체(예를 들어, 글루타메이트)의 이용률(availability)은 선택적으로 글루타메이트 생합성의 비율을 증가시키기 위해 글루타메이트 디하이드로게나아제를 과발현함으로써 향상될 수 있다. 원래 대장균 글루타메이트 디하이드로게나아제는 산화환원 보조인자(redox cofactor)로서 NADPH를 이용함에 따라, [예를 들어, B. 테타이오타오미크론(thetaiotaomicron), B. 프라길리스(fragilis), B. 디스타소니스(distasonis), B. 오바투스(ovatus), B. 불가투스(vulgatus), 및 B. 유니포르미스(Uniformis)를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 박테로이데스 종(Bacteroides spp.)으로부터의 글루타메이트 디하이드로게나아제와 같은] NADH를 대신 이용할 수 있는 글루타메이트 디하이드로게나아제로 이 효소를 대체하는 것은, 세포에서 NADPH의 이용률을 증가시킬 수 있다. 이는 NADPH에 의존하는 다른 생합성 공정들(예를 들어, 지방산 생합성)에 대해 NADPH의 증가된 공급을 제공할 수 있다.
하기의 표 1(아래 참조)은 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제를 포함하는 아민의 생성에 유용한 다양한 생합성 효소에 대한 EC 번호 및 명칭을 나타낸다. 효소 위원회 또는 분류 번호(EC 번호)는 효소가 촉매화하는 화학 반응에 기초한 효소에 대한 수치 분류 방식이다. EC 번호는 기술적으로 효소들을 특정하지 않으며, 그보다는 효소-촉매화 반응들을 특정한다. 예를 들어, (예를 들어, 상이한 유기체들로부터의) 상이한 효소들이 동일한 반응을 촉매화하는 경우, 효소들은 동일한 EC 번호를 받는다. 또한, 상이한 단백질 접힘이 동일한 반응을 촉매화할 수 있으며, 따라서 수렴 진화로 인해 동일한 EC 번호가 할당될 수 있다[즉, 이들은 비상동성 동기능 효소(non-homologous isofunctional enzyme, 또는 NISE)들이라고 칭해진다]. 표 1에 나타내어진 바와 같이, 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제의 효소 활성은 EC 번호 2.6.1.82로 분류된다. 표 1에 나타내어진 모든 효소들은 아민을 야기하는 화학 반응에 참여하며, 그들의 EC 번호가 EC 2.6.1에 속해 있기 때문에 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제로서 분류된다(또한, 아래의 표 7 참조). 하기의 표 2(아래 참조)는 지방족 알데히드 전구체로부터 지방족 아민을 생성할 수 있는 다수의 상이한 생합성 효소들을 나타낸다. 예를 들어, 아미노트랜스퍼라아제 또는 트랜스퍼라아제, 아민 옥시다아제 및 아민 디하이드로게나아제는 지방족 알데히드 전구체들이 지방족 아민으로 전환되는 반응들을 촉매화한다. 일 구현예에서, 조작된 대사 경로는 생체 내에서 지방족 알데히드의 생성을 위해 아미노트랜스퍼라아제 또는 트랜스아미나아제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조작된 대사 경로는 생체 내에서 지방족 알데히드의 생성을 위해 아민 옥시다아제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조작된 대사 경로는 생체 내에서 지방족 알데히드의 생성을 위해 아민 디하이드로게나아제를 포함한다. 하기의 표 3(아래 참조)은 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제에 의해 촉매화된, 즉 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 반응들을 나타낸다.
표 1: EC 2.6.1 하에서 아민의 생성에 관여된 효소들
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표 2: 지방족 아민을 생성하는 효소 반응
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표 3: 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제의 효소 반응
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본 발명을 예시하기 위해, 재조합 숙주 세포들은 아실-ACP 또는 아실-CoA의 유리 지방산으로의 전환을 촉매화하는 티오에스테라아제(TE); 및 유리 지방산을 지방족 알데히드로 전환시키는 카르복실산 리덕타아제(CAR)를 발현하도록 조작되었다. 또한, 재조합 숙주 세포들은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위해 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제(YgjG)를 발현하도록 조작되었다[실험 결과들에 대한 실시예 1 참조; YgjG에 의해 수행된 효소 반응에 대한 표 3(위) 참조; 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 메카니즘에 대한 표 5(아래) 참조]. 본 명세서에서, ygjG 유전자는 대장균으로 클로닝되었고, 발현 플라즈마를 생성하기 위해 발현 벡터로 결찰(ligate)되었다. 제 2 발현 플라스미드는 carB 및 tesA 유전자를 클로닝하고 통합함으로써 생성되었다. 이후, 세포들은 두 개의 플라스미드로 형질전환되었고, 탄소원을 갖는 발효 브로쓰에서 배양되었다. 지방족 아민의 생성이 확인된 한편, 대조군 세포(control cell)는 지방족 아민을 생성하지 않았다(실시예 1 참조). 효소 활성이 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시킬 수 있는 한, 여하한의 적합한 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제가 지방족 아민을 생성하는 데 사용될 수 있다. 세포가 자연적으로 지방족 알데히드를 생성하는 경우, 세포는 자연적으로 존재하는 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위해 실시예 1에 나타내어진 바와 같은 외인성 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제(YgjG)를 발현하도록 조작된다.
또 다른 구현예에서, 아민 디하이드로게나아제는 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위해 아미노트랜스퍼라아제 대신 사용될 수 있다[아민 디하이드로게나아제에 의해 수행된 효소 반응에 대한 표 4(아래) 참조; 효소의 예시들에 대한 표 7(아래) 참조]. 이는 질소원이 아미노산이라기보다는 암모니아인 경우에 적용가능하다. 아민 디하이드로게나아제의 예시들은 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환하는 데 유용하며, 이는 EC 번호 EC 1.4.9; EC 1.4.98; 및 EC 1.4.99에 속한다(아래의 표 7 참조). 예를 들어, 알라닌 디하이드로게나아제, 글루타메이트 디하이드로게나아제, L-리신-6-디하이드로게나아제; 및 메틸알라닌 디하이드로게나아제는 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키는 데 사용될 수 있는 아민 디하이드로게나아제의 예시이다(아래의 표 7 참조).
또 다른 구현예에서, 아민 옥시다아제는 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위해 아미노트랜스퍼라아제 대신 사용될 수 있다.
표 4: 아민 디하이드로게나아제 반응
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표 5: 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제에 대한 메카니즘
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하기의 표 6 및 표 7(아래 참조)은 다양한 효소 활성 및 대응하는 효소 분류(EC) 번호를 나타낸다.
표 6: 효소 활성
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표 7: 아미노 트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제(EC 2.6.1) 및 아민 디하이드로게나아제(EC 1.4.9, EC 1.4.98, EC 1.4.99)의 예시들
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미생물 숙주 세포들 및 이들의 배양
본 발명의 미생물들은 미생물 숙주 세포들로서 기능하고, 본 발명의 적어도 하나의 외인성 생합성 효소를 코딩하는 개방형 해독틀(open reading frame)을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 지방족 아민 조성물은 지방족 아민을 발현하기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원의 존재 시 외인성 생합성 효소(예를 들어, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제)를 발현하는 숙주 세포들을 배양함으로써 생성된다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민 조성물은 지방족 아민을 발현하기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원의 존재 시 CAR(예를 들어, CarB) 및/또는 TE(예를 들어, TesA, 'tesA)와 같은 하나 이상의 알데히드 생성 효소와 조합하여 외인성 생합성 효소(예를 들어, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제) 중 하나 이상을 발현하는 숙주 세포들을 배양함으로써 생성된다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민 조성물은 지방족 아민을 발현하기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원의 존재 시 (예를 들어, 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942로부터의) 아실-ACP 리덕타아제(AAR)와 같은 하나 이상의 알데히드 생성 효소와 조합하여 외인성 생합성 효소(예를 들어, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제) 중 하나 이상을 발현하는 숙주 세포들을 배양함으로써 생성된다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민 조성물은 지방족 아민을 발현하기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원의 존재 시 아실-CoA 리덕타아제(예를 들어, Acrl)와 같은 하나 이상의 알데히드 생성 효소와 조합하여 외인성 생합성 효소(예를 들어, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제) 중 하나 이상을 발현하는 숙주 세포들을 배양함으로써 생성된다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민 조성물은 지방족 아민을 발현하기에 효과적인 조건들 하에서 탄소원의 존재 시 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제(PPTase)와 같은 하나 이상의 알데히드 생성 효소와 조합하여 외인성 생합성 효소(예를 들어, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제) 중 하나 이상을 발현하는 숙주 세포들을 배양함으로써 생성된다.
생합성 효소들의 발현은 지방족 아민 및/또는 지방족 아민 조성물 또는 이의 혼합물의 증가된 수율로 지방족 아민의 생성을 야기한다. 일 구현예에서, 숙주 세포에서의 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 폴리펩티드의 발현은 지방족 아민 또는 이의 조성물의 높은 수율을 야기한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포에서 하나 이상의 알데히드 생성 효소와 조합하는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 폴리펩티드의 발현은 지방족 아민 및 이의 조성물의 높은 수율을 야기한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포에서 하나 이상의 알데히드 생성 효소와 조합하는 아민 옥시다아제의 발현은 지방족 아민 및 이의 조성물의 높은 수율을 야기한다. 몇몇 구현예들에서, 생합성 효소들은 세포에서 외인성으로 발현된다.
본 발명의 숙주 세포 또는 미생물은, 효소 활성에 대한 특이적 돌연변이 또는 조작(manipulation)의 효율성을 테스트하기 위해 변경을 포함하도록 유전적으로 더 조작된 숙주 균주 또는 숙주 세포(즉, 재조합 세포 또는 미생물)을 포함할 수 있다. 다양한 선택적인 유전적 조작 및 변경이, 어떤 원래의 효소 경로들이 원래 숙주 세포에 존재하는지에 따라 한 숙주 세포로부터 다른 숙주 세포로 교환가능하게 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 숙주 균주는 알데히드 생성 폴리펩티드와 조합하는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 폴리펩티드의 발현을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 숙주 균주는, 발효 성분, 탄소원(예를 들어, 공급원료), 온도, 압력, 감소된 배양 오염 조건, 및 산소 수준을 포함한 배양 조건들을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 특이적 변수들을 테스트하기 위해 다수의 유전적 변경을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 숙주 균주는 선택적인 fadE 및 fhuA 결실을 포함한다. 아실-CoA 디하이드로게나아제(FadE)는 지방산을 대사시키는 데 중요한 효소이다. 이는 지방산 이용(베타-산화)의 두 번째 단계를 촉매화하며, 이는 지방산(아실-CoA)의 긴 사슬들을 아세틸-CoA 분자들로 쪼개는 공정이다. 더 구체적으로, 박테리아에서의 지방산 분해의 β-산화 사이클의 두 번째 단계는 아실-CoA의 2-엔오일-CoA로의 산화이며, 이는 FadE에 의해 촉매화된다. 대장균에 FadE가 없는 경우, 이는 탄소원으로서 지방산에서 성장할 수 없지만, 아세테이트에서 성장할 수 있다. 여하한의 사슬 길이의 지방산을 이용하는 불가능성(inability)은 fadE 균주들, 즉 FadE 기능이 파괴되는 fadE 돌연변이 균주들의 보고된 표현형과 일치한다. fadE 유전자는 선택적으로 녹아웃(knock out)되거나 감쇠되어, 지방족 아민 경로에서 중간체일 수 있는 아실-CoA가 세포에 누적될 수 있도록 보장하여, 모든 아실-CoA가 지방족 아민으로 효율적으로 전환될 수 있도록 한다. 하지만, fadE 감쇠는 탄소원으로서 당이 사용될 때 선택적인데, 이는 이러한 조건 하에서 FadE의 발현이 억제될 가능성이 있고, 이에 따라 FadE가 소량만 존재할 수 있으며, 아실-CoA 기질에 대해 에스테르 신타아제와 효율적으로 경쟁할 수 없기 때문이다. FadE는 분해대사물 억제(catabolite repression)로 인해 억제된다. 대장균 및 많은 다른 미생물들이 지방산보다 당의 소모를 선호하므로, 두 공급원들이 이용가능한 경우 fad 레귤론(regulon)을 억제함으로써 당이 우선적으로 소모된다(D. Clark, J Bacteriol. (1981) 148(2):521-6 참조). 또한, 당의 부재는 FadE 발현을 유도한다. (FadE를 포함한) fad 레귤론에 의해 발현되는 단백질이 상향-조절(up-regulate)되고 아실-CoA에 대해 효율적으로 경쟁할 것이기 때문에, 아실-CoA 중간체들이 베타 산화 경로에 대해 손실될 수 있다. 따라서, 특정 상황들에서는 fadE 유전자가 녹아웃되거나 감쇠되는 것이 유리할 수 있다. 대부분의 탄소원들이 탄수화물 기반이기 때문에, FadE를 감쇠시키는 것은 선택적이다. 유전자 fhuA는 TonA 단백질을 코딩하며, 이는 대장균의 외막에서의 에너지-관련 운반체(energy-coupled transporter) 및 수용체이다(V. Braun (2009) J Bacteriol. 191(11):3431-3436). 이것의 결실은 선택적이다. fhuA 결실은 세포로 하여금 특정 발효 조건들에 유리할 수 있는 파지 공격(phage attack)에 대해 더 저항성 있게 한다. 따라서, 발효 진행 시 잠재적 오염을 겪기 쉬운 숙주 세포에서 fhuA를 결실시키는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 또 다른 구현예에서, 숙주 균주(위 참조)는 다음의 유전자들: fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV, 및/또는 fabF을 포함하는 유전자들 중 하나 이상의 선택적 과발현을 포함할 수 있다. 이러한 유전자들의 예시는 대장균으로부터의 fadR, 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)으로부터의 fabA(NP_460041), 쥐티푸스균으로부터의 fabD(NP_460164), 쥐티푸스균으로부터의 fabG(NP_460165), 쥐티푸스균으로부터의 fabH(NP_460163), 콜레라균(Vibrio cholera)으로부터의 fabV(YP_001217283), 및 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 fabF(NP_350156)이다. 지방산 생합성에서의 조절제 및 효소를 코딩하는 이러한 유전자들 중 하나 이상의 선택적 과발현은 다양한 배양 조건들 하에서 지방산 유도체 조성물의 역가를 증가시키는 역할을 할 수 있다.
또 다른 구현예에서는, 대장균 균주들이 지방족 아민의 생성을 위한 숙주 세포로서 사용된다. 유사하게, 이러한 숙주 세포는 fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV, 및/또는 fabF을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 다양한 배양 조건들 하에서 지방족 아민과 같은 지방산 유도체 화합물의 역가를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 생합성 유전자(즉, 지방산 생합성의 조절제 및 효소를 코딩하는 유전자)의 선택적인 과발현을 제공할 수 있다. 유전적 변경들의 예시는 대장균으로부터의 fadR, 쥐티푸스균으로부터의 fabA(NP_460041), 쥐티푸스균으로부터의 fabD(NP_460164), 쥐티푸스균으로부터의 fabG(NP_460165), 쥐티푸스균으로부터의 fabH(NP_460163), 콜레라균으로부터의 fabV(YP_001217283), 및 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 fabF(NP_350156)를 포함한다.
몇몇 구현예들에서, 생합성 효소들(예를 들어, CAR 및/또는 TE 및/또는 AAR 및/또는 PPTase와 같은 알데히드 생성 효소들과 조합하는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제)을 발현하는 데 사용되는 숙주 세포 또는 미생물은 하나 이상의 특정 지방산 유도체(들), 예컨대 지방족 에스테르, 지방족 알코올, 지방족 아민, 지방족 알데히드, 이작용성 지방산 유도체, 이산 등에 대한 생성을 증가시킬 수 있는 특정 효소 활성을 포함하는 유전자들을 더 발현할 수 있다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 유전자를 과발현함으로써 증가될 수 있는 지방산의 생성을 위해 티오에스테라아제 활성(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5)을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 지방족 에스테르의 생성을 위해 에스테르 신타아제 활성(E.C. 2.3.1.75)을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 지방족 알코올의 생성을 위해 아실-ACP 리덕타아제(AAR)(E.C, 1.2.1.80) 활성 및/또는 알코올 디하이드로게나아제 활성(E.C. 1.1.1.1) 및/또는 지방족 알코올 아실-CoA 리덕타아제(FAR)(E.C. 1.1.1.*) 활성 및/또는 카르복실산 리덕타아제(CAR)(E.C. 1.2.99.6) 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 지방족 알데히드의 생성을 위해 아실-ACP 리덕타아제(AAR)(E.C. 1.2.1.80) 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 알칸 및 알켄의 생성을 위해 아실-ACP 리덕타아제(AAR)(E.C. 1.2.1.80) 활성 및 디카르보닐라아제 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 지방족 알코올의 생성을 위해 아실-CoA 리덕타아제(E.C. 1.2.1.50) 활성, 아실-CoA 신타아제(FadD)(E.C. 2.3.1.86) 활성, 및 티오에스테라아제(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5) 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 지방족 에스테르의 생성을 위해 에스테르 신타아제 활성(E.C. 2.3.1.75), 아실-CoA 신타아제(FadD)(E.C. 2.3.1.86) 활성, 및 티오에스테라아제(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5) 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 케톤의 생성을 위해 OleA 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 내부 올레핀의 생성을 위해 OleBCD 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 지방족 알코올의 생성을 위해 아실-ACP 리덕타아제(AAR)(E.C. 1.2.1.80) 활성 및 알코올 디하이드로게나아제 활성(E.C. 1.1.1.1)을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 말단 올레핀을 만들기 위해 티오에스테라제(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5) 활성 및 디카르복실라아제 활성을 갖는다. 미생물 및 미생물 세포에서의 효소 활성의 발현은 미국 특허 8,097,439; 8,110,093; 8,110,670; 8,183,028; 8,268,599; 8,283,143; 8,232,924; 8,372,610; 및 8,530,221에 개시되어 있으며, 이들은 본 명세서에서 인용 참조된다.
다른 구현예들에서, 생합성 효소들(예를 들어, CAR 및/또는 TE 및/또는 AAR 및/또는 PPTase와 같은 알데히드 생성 효소들과 조합하는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제)을 발현하는 데 사용되는 숙주 세포 또는 미생물은 지방족 아민과 같은 하나 이상의 특정 지방산 유도체(들)를 생성하기 위해 상향조절되거나 과발현되는 특정한 원래의 효소 활성을 포함할 것이다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 티오에스테라아제 유전자를 과발현함으로써 증가될 수 있는 지방산의 생성을 위해 원래의 티오에스테라아제(E.C. 3.1.2.* 또는 E.C. 3.1.2.14 또는 E.C. 3.1.1.5) 활성을 갖는다.
본 발명은 생합성 효소들(예를 들어, CAR 및/또는 TES 및/또는 AAR 및/또는 PPTase와 같은 알데히드 생성 효소들과 조합하는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제)을 코딩하는 유전자를 발현하는 숙주 균주 또는 미생물을 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 생합성 효소는 숙주 세포에서 외인성으로 발현된다. 예를 들어, 숙주 세포는 지방족 아민을 생성하기 위해 외인성 아미노트랜스퍼라아제를 발현할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 생합성 효소는 숙주 세포에서 외인성으로 발현된다. 예를 들어, 숙주 세포는 지방족 아민을 생성하기 위해 외인성 아미노트랜스퍼라아제 및 외인성 카르복실산 리덕타아제(CAR)를 발현할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 생합성 효소는 숙주 세포에서 과발현되는 하나 이상의 생합성 효소와 조합하여 숙주 세포에서 외인성으로 발현된다. 예를 들어, 숙주 세포는 지방족 아민을 생성하기 위해 외인성 및/또는 과발현된 티오에스테라아제와 조합하여 외인성 아미노트랜스퍼라아제 및 외인성 카르복실산 리덕타아제(CAR)를 발현할 수 있다. 티오에스테라아제는 외인성으로 발현되는 티오에스테라아제일 수 있다. 대안적으로, 티오에스테라아제는 특히 강한 프로모터, 또는 해당기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 다른 분자 생물학 기술들을 통해 세포 내에서 과발현되거나 전사적으로 상향조절되는 원래의 티오에스테라아제일 수 있다. 재조합 숙주 세포는 지방족 아민 및 조성물 및 이의 혼합물을 생성한다. 지방족 아민은 통상적으로 배양 배지로부터 회수되고, 및/또는 숙주 세포로부터 분리된다. 일 구현예에서, 지방족 아민은 배양 배지(세포외)로부터 회수된다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민은 숙주 세포(세포내)로부터 분리된다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민은 배양 배지로부터 회수되고, 숙주 세포로부터 분리된다. 숙주 세포에 의해 생성되는 지방족 아민 조성물은, 지방족 아민 조성물의 성분들의 포화도 및 사슬 길이뿐만 아니라 특정 지방족 아민의 분포를 결정하기 위해, 해당 기술분야에 알려진 방법들, 예를 들어 GC-FID를 이용하여 분석될 수 있다.
미생물(예를 들어, 미생물 세포)로서 기능하는 숙주 세포들의 예시들은 에스체리치아 속, 바실러스 속, 락토바실러스 속, 자이모모나스 속, 로도코커스 속, 슈도모나스 속, 아스페르길루스 속, 트리코데르마 속, 뉴로스포라 속, 푸사리움 속, 후미콜라 속, 리조무코르 속, 클루이베로마이세스 속, 피치아 속, 무코르 속, 미셀리오프토라 속, 페니실리움 속, 파네로카에테 속, 플레우로투스 속, 트라메테스 속, 크리소스포리움 속, 사카로마이세스 속, 스테노트로파모나스 속, 스키조사카로마이세스 속, 야로위아 속, 또는 스트렙토마이세스 속으로부터의 세포들을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 그람-양성(Gram-positive) 박테리아 세포이다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 그람-음성(Gram-negative) 박테리아 세포이다. 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 대장균 세포이다. 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 대장균 B 세포, 대장균 C 세포, 대장균 K 세포 또는 대장균 W 세포이다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 바실러스 렌투스(Bacillus lentus) 세포, 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 세포, 바실러스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus) 세포, 바실러스 리케니포르미스(Bacillus lichenoformis) 세포, 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus) 세포, 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 세포, 바실러스 키르쿨란스(Bacillus circulans) 세포, 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 세포, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 세포, 바실러스 클라우시(Bacillus clausii) 세포, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 세포, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 세포이다.
또 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 트리코데르마 코닌지(Trichoderma koningii) 세포, 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 세포, 트리코데르마 르에세이(Trichoderma reesei) 세포, 트리코데르마 롱기브라키아텀(Trichoderma longibrachiatum) 세포, 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 세포, 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigates) 세포, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus) 세포, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 세포, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 세포, 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 세포, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 세포, 후미콜라 라누기노세(Humicola lanuginose) 세포, 로도코커스 오파쿠스(Rhodococcus opacus) 세포, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 세포, 또는 무코르 미에헤이(Mucor michei) 세포이다. 또 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포 또는 스트렙토마이세스 무리누스(Streptomyces murinus) 세포이다. 또 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 방선균(Actinomycetes) 세포이다. 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지에 세포이다.
다른 구현예들에서, 숙주 세포는 진핵 식물, 조류, 남세균(cyanobacterium), 녹색-황 세균, 녹색 비-황 세균(green non-sulfur bacterium), 자색 황 세균, 자색 비-황 세균, 극한 생물(extremophile), 효모, 균류, 이의 조작된 유기체, 또는 합성 유기체로부터의 세포이다. 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 광 의존적이거나 탄소를 고정시킨다. 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 독립영양적 활성을 갖는다.
몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 빛의 존재 하에서와 같이, 광독립영양적 활성(photoautotrophic activity)을 갖는다. 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 빛의 부재 하에서 종속영양적 또는 혼합영양적이다. 특정 구현예들에서, 숙주 세포는 애기장대(Arabidopsis thaliana), 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 미스칸투스 기간테우스(Miscanthus giganteus), 제아 메이스(Zea mays), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcuse braunii), 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii), 두나리엘라 살리나(Dunaliela salina), 시네코코커스 종 PCC 7002, 시네코코커스 종 PCC 7942, 시네코시스티스 종 PCC 6803, 서모시네코코커스 엘롱게이트(Thermosynechococcus elongates) BP-1, 클로로비움 테피둠(Chlorobium tepidum), 클로로프렉수스 아우란티쿠스(Chlorojlexus auranticus), 크로마티움 비노숨(Chromatiumm vinosum), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 로도박터 캡술라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 파루스리스(Rhodopseudomonas palusris), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 서모셀룸(Clostridium thermocellum), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지에, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 또는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)로부터의 세포이다.
일 구현예에서, 미생물 세포는 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 시네코코커스, 시네코시스티스, 시아노테세, 및 노스톡 펑크티포르메를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 시아노박테리아로부터의 세포이다. 또 다른 구현예에서, 미생물 세포는 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942, 시네코시스티스 종 PCC6803, 및 시네코코커스 종 PCC7001을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 특이적 시아노박테리아 종으로부터의 세포이다.
재조합 숙주 세포 및 배양물을 제조하는 방법
숙주 세포를 조작하여 지방족 아민 및/또는 지방족 아민 조성물 또는 혼합물을 생성하기 위해 해당 기술분야에 잘 알려진 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 본 명세서에 설명된 바와 같이 생합성 효소(예를 들어, CAR 및/또는 TE 및/또는 AAR 및/또는 PPTase와 같은 알데히드 생성 효소들과 조합하거나 단독인 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제)를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터의 사용을 포함할 수 있다. 당업자라면, 다양한 바이러스 및 비-바이러스 벡터가 본 명세서에 설명된 방법들에 사용될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 몇몇 구현예들에서, 특정 조성물에서의 지방족 아민의 더 높은 역가는, 재조합 숙주 세포 배양물에 의해 생성된 특정 유형의 지방족 아민 또는 지방족 아민의 조합이 대응하는 야생형 숙주 세포의 대조 배양물에 의해 생성된 동일한 지방산 아민 또는 지방족 아민의 조합에 대해 더 높은 역가이다. 몇몇 구현예들에서, 생합성 폴리펩티드(예를 들어, CAR 및/또는 TE 및/또는 AAR 및/또는 PPTase와 같은 알데히드 생성 효소들의 폴리펩티드와 조합하거나 단독인 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제)는 특이적 생합성 폴리펩티드를 코딩하는 특이적 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있는 재조합 벡터에 의하여 숙주 세포에 제공된다. 특정 구현예들에서, 프로모터는 발달-조절된, 세포소기관-특이적, 조직-특이적, 유도성, 구성적, 또는 세포-특이적 프로모터이다. 재조합 벡터는 통상적으로 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티; 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열; 및 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적화 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 단백질 및 작동가능하게 연결된 조절 서열을 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 숙주 세포의 염색체 내로 통합될 수 있거나, 재조합 숙주 세포에 내재하는 하나 이상의 플라스미드 발현계에 포함될 수 있거나, 둘 모두가 구현될 수 있다.
발현 벡터들은 숙주 세포 내에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 적절한 형태로 된 본 명세서에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 당업자라면, 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 의도한 폴리펩티드의 발현 수준 등과 같은 요인들에 의존할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 설명된 발현 벡터들은 본 명세서에 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 생성하도록 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 흔히, 원핵생물, 예를 들어 대장균에서 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현은 대부분 융합 또는 비-융합 폴리펩티드 중 어느 하나의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터들로 수행된다. 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 모두에 적절한 발현 시스템들이 해당 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook 외, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) 참조). 특정 구현예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리오파지 T5로부터 유래된 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 이 구현예에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 벡터들은 외래(foreign) 핵산(예를 들어, DNA)을 숙주 세포 내로 도입하기 위하여 본 기술분야에서 인정되는 다양한 기술들을 통해 원핵 세포 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염(transfecting)시키는 적절한 방법들은, 예를 들어 Sambrook 외에서 찾아볼 수 있다(위 참조).
박테리아 세포들의 안정한 형질전환을 위하여, 사용되는 발현 벡터 및 형질전환 기술에 따라, 세포들의 일부만이 발현 벡터를 흡수하고 복제하는 것으로 알려져 있다. 이 형질전환체들을 식별하고 선택하기 위하여, 선별가능한 마커(예를 들어, 항생제에 대한 내성)를 코딩한 유전자가 관심 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 선별가능한 마커들은 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린과 같은(단, 이로 제한되지 않음) 약물들에 대한 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산들은 본 명세서에서 설명되는 폴리펩티드를 코딩하는 벡터와 동일한 벡터에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는 별개의 벡터에 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질전환된 세포는 적절한 선택 약물의 존재 하에서 성장에 의해 식별될 수 있다.
재조합 숙주 세포의 배양물 및 발효
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발효"라는 용어는 광범위하게 숙주 세포에 의한 유기 물질의 표적 물질로의 전환, 예를 들어 탄소원을 포함하는 배지에서 재조합 숙주 세포의 배양물을 증식시킴으로써 재조합 숙주 세포에 의한 탄소원의 지방족 아민 또는 이의 유도체로의 전환을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생성을 위하여 허용되는 조건들"이라는 용어는 숙주 세포로 하여금 의도한 생성물, 예컨대 지방족 아민 또는 지방족 아민 조성물 또는 혼합물을 생성하게 하는 여하한의 조건들을 의미한다. 이와 유사하게, "벡터의 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 조건들"이라는 용어는 숙주 세포로 하여금 폴리펩티드를 합성하게 하는 여하한의 조건들을 의미한다. 적절한 조건들은, 예를 들어 발효 조건들을 포함한다. 발효 조건들은 온도 범위, 통기 수준, 공급량(feed rate), 및 배지 조성물을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 다수의 파라미터를 포함할 수 있다. 이러한 조건들의 각각은 개별적으로 그리고 조합하여 숙주 세포가 성장하게 한다. 발효는 호기성, 혐기성, 또는 [미-호기성(micro-aerobic)과 같은] 이의 변이성(variation)일 수 있다. 예시적인 배양 배지는 브로쓰 또는 겔을 포함한다. 일반적으로, 배지는 숙주 세포에 의해 직접적으로 대사될 수 있는 탄소원을 포함한다. 또한, 효소들이 탄소원의 가동화(mobilization)[예를 들어, 녹말 또는 셀룰로오스의 발효성 당들로의 해중합(depolymerization)] 및 후속 대사를 가능하게 하도록 배지에서 사용될 수 있다.
소규모 생성을 위해, 조작된 숙주 세포들은 예를 들어 약 100 μL, 200 μL, 300 μL, 400 μL, 500 μL, 1 mL, 5 mL, 10 mL, 15 mL, 25 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L, 5 L 또는 10 L의 뱃치(batch)에서 성장될 수 있고; 발효될 수 있으며; 의도한 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 CAR 및/또는 TE 및/또는 AAR 및/또는 PPtase 폴리펩티드를 코딩하는 알데히드-생성 폴리뉴클레오티드와 조합하여 또는 단독으로 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현하도록 유도될 수 있다. 대규모 생성을 위해, 조작된 숙주 세포들은 약 10 L, 100 L, 1000 L, 10,000 L, 100,000 L 및 1,000,000 L 또는 그 이상의 부피의 뱃치를 갖는 배양물에서 성장될 수 있고; 발효될 수 있으며; 의도한 폴리뉴클레오티드 서열을 발현하도록 유도될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 본 명세서에서 설명되는 지방족 아민 및 지방족 아민 유도체 조성물은 재조합 숙주 세포 배양물의 세포외 환경에서 발견되고, 배양 배지로부터 쉽게 분리될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 설명되는 지방족 아민 및 지방족 아민 유도체 조성물은 배양물에서 성장된 재조합 숙주 세포의 세포내 환경에서 발견된다. 지방족 아민 또는 이의 유도체는 재조합 숙주 세포에 의해 분비될 수 있고, 세포외 환경으로 수송될 수 있거나, 또는 수동적으로 재조합 숙주 세포 배양물의 세포외 환경으로 전달될 수 있다. 지방족 아민 조성물은 해당 기술분야에 알려진 통상의 방법들을 이용하여 재조합 숙주 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
재조합 숙주 세포의 스크리닝
본 발명의 일 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 폴리펩티드의 활성은 (선택적으로, 하나 이상의 알데히드-생성 폴리펩티드들과 조합하여) 하나 이상의 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 폴리펩티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 결정되며, 이후 재조합 숙주 세포에 의해 생성된, 예를 들어 지방족 아민 조성물의 특징들; 예를 들어 지방족 아민 및 조성물 및 이의 혼합물의 역가, 수율 및 생산성을 식별하기 위해 스크리닝이 후속된다. 또 다른 구현예에서, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 폴리펩티드의 활성은 하나 이상의 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 결정되며, 이후 재조합 숙주 세포에 의해 생성된, 예를 들어 지방족 아민 조성물의 특징들; 예를 들어 지방족 아민 및 조성물 및 이의 혼합물의 역가, 수율 및 생산성을 식별하기 위해 스크리닝이 후속된다. 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 폴리펩티드 또는 이의 단편은 해당 기술분야에 알려진 통상의 방법들을 이용하여 아민-유래 화합물의 개선된/증가된 생성 및/또는 세포에서의 활성에 대해 어세이(assay)될 수 있다. 예를 들어, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 폴리펩티드 또는 이의 단편은 폴리펩티드가 기능하게 하고 그 효소 활성을 수행하게 하는 조건들 하에서 생체 내에서 기질(예를 들어, 세포에서 CAR 및/또는 TE 및/또는 AAR 및/또는 PPTase를 동시발현함으로써 생성되는 지방족 알데히드)과 접촉된다. 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제의 활성을 결정하기 위해 기질의 수준의 감소 또는 지방족 아민 또는 지방족 아민 조성물의 수준의 증가가 측정될 수 있다. 대안적으로, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제 폴리펩티드 또는 이의 단편을 발현하는 세포는 폴리펩티드가 기능하게 하고 그 효소 활성을 여전히 수행하게 하는 조건들 하에서 지방족 알데히드 기질로 공급될 수 있다. 이후, 아미노트랜스퍼라아제/트랜스아미나아제 또는 아민 디하이드로게나아제 또는 아민 옥시다아제의 활성을 결정하기 위해 지방족 아민 또는 지방족 아민 조성물의 수준의 증가가 측정될 수 있다.
재조합 숙주 세포들로부터 유도된 생성물
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "현대 탄소의 분율" 또는 fM은 각각 옥살산 표준 HOxI 및 HOxII로 알려져 있는 미국 국립표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology: NIST) 표준 물질(Standard Reference Material: SRM) 4990B 및 4990C에 의해 정의된 것과 동일한 의미를 갖는다. 기본적인 정의는 (AD 1950을 기준으로) 0.95 배의 14C/12C 동위원소 비율 HOxI에 관한 것이다. 이는 붕괴-보정된 산업혁명-전 목재(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)와 거의 등가이다. 현재 생존 생물권(living biosphere)(식물 재료)에 대하여, fM은 약 1.1이다.
생물학적으로 생성되는 유기 화합물을 포함하는 바이오생성물(예를 들어, 본 발명에 따라 생성되는 지방족 아민 조성물), 및 특히 본 명세서에서 지방산 생합성 경로를 이용하여 생성되는 지방족 아민 조성물은 재생가능한 공급원로부터 생성되었으며, 이를테면 새로운 물질의 조성물이다. 이러한 새로운 바이오생성물은 이중 탄소-동위원소 핑거프린팅(dual carbon-isotopic fingerprinting) 또는 14C 연대측정(dating)에 기초하여 석유화학의 탄소로부터 유래되는 유기 화합물과 구별될 수 있다. 추가적으로, 생물자원 탄소(biosourced carbon)의 특이적 공급원(예를 들어, 글루코오스 대 글리세롤)은 이중 탄소-동위원소 핑거프린팅에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 7,169,588 참조). 석유 기반 유기 화합물과 바이오생성물을 구별하는 능력은 상업적으로(in commerce) 이러한 물질들을 추적하는 데 유익하다. 예를 들어, 생물학적 기반 및 석유 기반 탄소 동위원소 프로파일 둘 모두를 포함하는 유기 화합물 또는 화학물질들은 석유 기반 물질들로만 만들어진 유기 화합물 및 화학물질들과 구별될 수 있다. 따라서, 여기서 생성되는 바이오생성물은 이들의 고유한 탄소 동위원소 프로파일에 기초하여 상업적으로 후속되거나 추적될 수 있다. 바이오생성물은 각 샘플의 안정한 탄소 동위원소 비율(13C/12C)을 비교함으로써 석유 기반 유기 화합물과 구별될 수 있다. 주어진 바이오생성물의 13C/12C 비율은, 이산화탄소가 고정된 시간에 대기 중의 이산화탄소에서의 13C/12C 비율의 결과이다. 또한, 이는 정확한 대사 경로를 반영한다. 또한, 국부적인 변이들도 일어난다. 석유, C3 식물(활엽), C4 식물(목초), 및 해양 탄산염(marine carbonate)이 모두 13C/12C 및 대응하는 δ13C 값들에서 상당한 차이를 나타낸다. C4 및 C3 식물들이 모두 13C/12C 동위원소 비율의 범위를 나타내지만, 통상적인 값들은 C4 식물에 대해 약 -7 내지 약 -13 퍼밀(per mil)이고, C3 식물에 대해 약 -19 내지 약 -27 퍼밀이다(예를 들어, Stuiver 외 (1977) Radiocarbon 19:355 참조). 석탄 및 석유는 일반적으로 이 후자의 범위에 속한다.
Figure pat00013
일련의 대안적인 RM가 IAEA, USGS, NIST 및 다른 선택된 국제 동위원소 실험실과 협력하여 개발되었다. PDB로부터의 퍼밀 편차에 대한 표기는 δ13C이다. 질량 44, 45 및 46의 분자 이온들에 대한 고정밀 안정 비율 질량 분석(high precision stable ratio mass spectrometry)(IRMS)에 의해 CO2에 대해 측정이 행해진다. 본 명세서에서 설명되는 조성물들은 본 명세서에서 설명되는 방법들 중 어느 하나에 의해 생성되는 지방족 아민 조성물 및 생성물을 포함한다. 구체적으로, 지방족 아민 조성물 또는 생성물은 약 -28 이상, 약 -27 이상, -20 이상, -18 이상, -15 이상, -13 이상, -10 이상, 또는 -8 이상의 δ13C를 가질 수 있다. 예를 들어, 지방족 아민 조성물 또는 생성물은 약 -30 내지 약 -15, 약 -27 내지 약 -19, 약 -25 내지 약 -21, 약 -15 내지 약 -5, 약 -13 내지 약 -7, 또는 약 -13 내지 약 -10의 δ13C를 가질 수 있다. 다른 경우들에서, 지방족 아민 조성물 또는 생성물은 약 -10, -11, -12 또는 -12.3의 δ13C를 가질 수 있다. 또한, 본 명세서의 기재내용에 따라 생성되는 지방족 아민 조성물 및 생성물은 각 화합물의 14C의 양을 비교함으로써 석유 기반 유기 화합물과 구별될 수 있다. 14C는 핵 반감기가 5730년이기 때문에, "더 오래된" 탄소를 함유한 석유 기반 연료가 "더 새로운" 탄소를 함유한 지방족 아민 조성물 및 바이오생성물과 구별될 수 있다(예를 들어, Currie, "Source Apportionment of Atmospheric Particles", Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992) 참조).
방사성탄소 연대측정법(radiocarbon dating)의 기본적인 가정은 대기 중의 14C 농도의 항상성(constancy)이 생물(living organism)의 14C의 항상성을 유도한다는 것이다. 하지만, 1950년 이후부터의 대기권 핵실험 및 1850년 이후부터의 화석 연료의 연소로 인하여, 14C는 제 2의, 지구화학적인 시간 특성을 얻었다. 대기 CO2 및 이에 따른 생물권(living biosphere)에서의 그 농도는 1960년대 중반의 핵실험 피크의 거의 두 배였다. 이후, 7년 내지 10년의 근사적 이완 "반-감기"(approximate relaxation "half-life")를 갖는, 약 1.2×10-12의 정상-상태 우주기원(steady-state cosmogenic) (대기) 기준 동위원소 비율(14C/12C)로 점진적으로 복귀되었다. 이 후자의 반감기가 문자 그대로 받아들여져야 하는 것이 아니라; 그보다는 핵무기 시대의 시작 이후로 대기권 및 생물권의 14C의 변이성을 추적하기 위해 상세한 대기 핵 투입/붕괴의 함수(detailed atmospheric nuclear input/decay function)를 사용하여야 한다. 이는 최근 생물권 탄소의 매년 연대측정의 가능성(promise of annual dating)을 지속하는 후자의 생물권 14C 시간 특성이다. 14C는 "현대 탄소의 분율"(fM)의 단위로 주어지는 결과들을 갖는 가속기 질량 분광 분석(accelerator mass spectrometry: AMS)에 의해 측정될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 지방족 아민 조성물 및 생성물은 적어도 약 1의 fM 14C를 가질 수 있는 바이오생성물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 바이오생성물은 적어도 약 1.01의 fM 14C, 약 1 내지 약 1.5의 fM 14C, 약 1.04 내지 약 1.18의 fM 14C, 또는 약 1.111 내지 약 1.124의 fM 14C를 가질 수 있다.
14C의 또 다른 측정은 pMC(percent of modern carbon)로 알려져 있다. 14C 연대를 이용하는 고고학자 또는 지질학자에 대하여, AD 1950년은 "0의 해(zero years old)"와 같다. 또한, 이는 100 pMC를 나타낸다. 대기 중의 "핵무기 탄소(bomb carbon)"는 열-핵무기의 피크에서 1963년의 통상 수준의 거의 두 배에 달하였다. 대기권 내의 이의 분포는 이의 출연 이후로 근사화되었으며, AD 1950년 이후로 살아 있는 식물들 및 동물들에 대하여 100 pMC보다 더 큰 값을 나타낸다. 이는 시간이 지나면서 107.5 pMC 부근인 현재의 값으로 점차 감소하였다. 이는 옥수수와 같은 신선한(fresh) 바이오매스 물질이 107.5 pMC 부근의 14C 시그너처(signature)를 제공할 것임을 의미한다. 석유 기반 화합물들은 0의 pMC 값을 가질 것이다. 오늘날의 탄소와 화석 탄소의 조합은 오늘날의 pMC 함량의 희석을 야기할 것이다. 107.5 pMC가 오늘날의 바이오매스 물질의 14C 함량을 나타내고 0 pMC가 석유 기반 생성물의 14C 함량을 나타낸다고 가정함으로써, 그 물질에 대해 측정된 pMC 값은 두 성분 유형의 비율을 반영할 것이다. 예를 들어, 오늘날의 콩으로부터 100 % 유래된 물질은 107.5 pMC 부근의 방사성탄소 시그너처를 제공할 것이다. 그 물질이 석유 기반 생성물로 50 % 희석되었다면, 이는 약 54 pMC의 방사성탄소 시그너처를 제공할 것이다. 생물학적 기반 탄소 함량은 107.5 pMC와 같은 "100 %", 및 0 pMC와 같은 "0 %"를 할당함으로써 유래된다. 예를 들어, 99 pMC를 측정한 샘플은 93 %의 등가의 생물학적 기반 탄소 함량을 제공할 것이다. 이 값은 평균 생물학적 기반 탄소 결과로 지칭되며, 오늘날의 생물학적 물질 또는 석유 기반 물질 중 어느 하나로부터 비롯된 분석된 물질 내의 모든 성분을 가정한다. 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 하나 이상의 지방족 아민을 포함하는 바이오생성물은 적어도 약 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100의 pMC를 가질 수 있다. 다른 경우에, 본 명세서에서 설명되는 지방족 에스테르 조성물은 약 50 내지 약 100; 약 60 내지 약 100; 약 70 내지 약 100; 약 80 내지 약 100; 약 85 내지 약 100; 약 87 내지 약 98; 또는 약 90 내지 약 95의 pMC를 가질 수 있다. 또 다른 경우에, 본 명세서에서 설명되는 지방족 아민 조성물은 약 90, 91, 92, 93, 94, 또는 94.2의 pMC를 가질 수 있다.
지방족 아민 조성물
지방족 아민의 구조는 하나 이상의 C8 내지 C24 지방족 알킬기(aliphatic alkyl group)(R=C8 내지 C24) 및 하나 이상의 아민(N) 또는 4차 암모늄에 기초한다. 지방족 알킬 사슬은 매우 소수성인 한편, 아민은 친수성이다. 따라서, 지방족 아민은 (소수성 및 친수성 개체들을 함유하는) 분자로서 지방족 성질을 갖는다. 물 또는 다른 용매에 용해될 때, 분자의 일부분이 용매에 의해 배척되기 때문에 지방족 아민은 미셀(micelle)을 형성한다. 이와 같이, 지방족 아민은 물리적 또는 화학적 결합에 의해 표면에 강하게 부착되는 양이온성 계면-활성 화합물(즉, 친수성 모이어티에 의해 특성화되는 계면활성제)임에 따라, 표면 특성들을 변화시킨다. 지방족 아민의 표면 활성 특성들은 유화, 습윤, 발포 및 증점이다. 또한, 지방족 아민은 연화(softening), 접착(adhesion), 윤활(lubrication), 부식 억제, 대전-방지 특성 및 소수화(hydrophobation)를 포함하는 흡착 특성들; 그리고 이온 교환, 탈색 및 응집(flocculation)을 포함하는 반응 특성들을 갖는다.
본 발명은 화학 중간체, 처리 보조제, 및 다양한 화학식의 기능적 구성요소를 포함하는 다수의 산업적 용도에 유용한 지방족 아민 및 이의 유도체의 생성을 고려한다. 지방족 아민의 예시들은 본 숙주 세포에서 생성되고 본 명세서에 설명되는 바와 같은 지방족 알데히드 전구체로부터 유래되는 것들을 포함한다. 여기서 생성되는 지방족 아민 및/또는 지방족 아민 조성물 또는 혼합물은 개별적으로 또는 적절한 조합물 또는 혼합물로 사용될 수 있다. 본 발명의 지방족 아민은 세제(세정제, 증점제, 섬유 유연제); 주방용 액체; 발포- 및 습윤제; 항유화제(의약품, 종이, 석유); 유화제(용매, 용매 세정제, 실리콘, 오일, 왁스 광택제, 가죽 처리, 트리글리세라이드); 계면활성제; 샴푸 및 컨디셔너; 직물 및 플라스틱 산업 분야에서의 대전 방지제(직물, 중합체, 전자기기, 정전기 스프레이, 종이); 연료 첨가제; 윤활제 및 윤활 첨가제[그리스 증점제(grease thickener), 엔진 오일]; 페인트 증점제; 광물 처리; 종이 제조; 석유 생산 및 정제(석유 첨가제, 유전 화학제); 아스팔트 유화제; 부식 억제제(산, 물 처리, 금속 가공, 석유); 가솔린- 및 연료 오일 첨가제; 부유제; 에폭시 경화제; 및 농약 및 제조체를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 산업적 용도에서 사용을 찾을 수 있다. 몇몇 측면들에서, 본 발명은 약 C8 내지 약 C24의 범위를 갖는 특이적 사슬 길이 또는 탄소 사슬의 혼합물로 만들어지는 지방족 아민을 포함하는 지방족 아민 조성물을 생성하는 방법에 관한 것이다. 특정한 일 측면에서, 본 발명은 1차 지방족 아민(RNH2)을 포함하는 지방족 아민 조성물을 생성하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 2차 지방족 아민(R2NH) 및/또는 3차 지방족 아민[트리알킬(R3NH), 디알킬메틸(R2NCH3), 및/또는 알킬디메틸(RN(CH3)2)]이 또한 고려된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 다수의 산업 생성물에 대한 1차 빌딩 블록(building block)이 될 수 있고, 또한 폴리아민, 에톡시레이티드 아민, 에톡시레이티드 디아민, 프로폭시레이티드 아민, 아민 염, 아민 옥사이드, 아미드, 에톡시레이티드 아미드 및 니트릴과 같은 다수의 화학 유도체에 대한 원료를 제공할 수 있는 1차 아민의 생성을 포함한다. 관련 측면에서, 본 방법은 폴리아민, 에톡시레이티드 아민, 에톡시레이티드 디아민, 프로폭시레이티드 아민, 아민 염, 아민 옥사이드, 아미드, 에톡시레이티드 아미드 및 니트릴을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 화학 유도체 및 이의 조성물을 생성하기에 적합한 1차 아민을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 지방족 아민 및 지방족 아민 조성물을 제조하기에 적합한 유전적으로 조작된 생산 숙주를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 지방족 아민 또는 지방족 아민 조성물은 숙주 세포의 세포외 환경으로부터 분리된다. 몇몇 구현예들에서, 지방족 아민 또는 지방족 아민 조성물은 숙주 세포로부터 부분적으로 또는 완전히 동시 분비된다. 대안적인 구현예들에서, 지방족 아민 또는 지방족 아민 조성물은, 선택적으로 하나 이상의 수송 단백질의 도움으로, 세포외 환경 내로 수송된다. 또 다른 구현예들에서, 지방족 아민 또는 지방족 아민 조성물은 세포외 환경 내로 수동적으로 수송된다.
본 방법은 C8 내지 C24 지방족 아민을 포함하는 지방족 아민을 생성할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 지방족 아민은 C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23 및/또는 C24 지방족 아민을 포함한다. 다른 구현예들에서, 지방족 아민 조성물은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, 및 C18 지방족 아민 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예들에서, 지방족 아민 조성물은 C12, C14, C16 및 C18 지방족 아민; C12, C14 및 C16 지방족 아민; C14, C16 및 C18; 또는 C12 및 C14 지방족 아민을 포함한다. 지방족 아민의 R기는 직쇄형 또는 분지쇄형일 수 있다. 분지쇄형은 하나 이상의 분지점을 가질 수 있으며, 사이클릭형 분지들을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 분지형 지방족 아민은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23 또는 C24 분지형 지방족 아민이다. 분지형 또는 비분지형 지방족 아민의 R기는 포화되거나 불포화될 수 있다. 불포화된 경우, R기는 하나 또는 하나 이상의 불포화점을 가질 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 단일불포화 지방족 아민이다. 특정 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 C6:1, C7:1, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1 또는 C24:1 불포화 지방족 아민이다. 특정 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 또는 C18:1 불포화 지방족 아민이다. 다른 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 오메가-7 위치에서 불포화된다. 특정 구현예들에서, 불포화 지방족 아민은 시스 이중 결합을 갖는다.
바람직한 일 구현예에서, 지방족 아민은 옥틸 아민, 데실 아민, 도데실 아민, 테트라데실 아민, 헥사데실 아민, 옥타데실 아민, 스테아릴 아민 및 올레일 아민을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 1차 아민이다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민은 2차 아민, 예를 들어 1-도데실아민(라우릴아민), 1-헥사데실아민(팔미 틸 아민), 1-옥타데실아민 (스테아릴아민) 등이다. 또 다른 구현예에서, 지방족 아민은 3차 아민, 예를 들어 1-옥타데센-9-일아민(올레일 아민) 등이다. 지방족 아민의 다른 예시들은 옥틸 디메틸 아민, 데실 디메틸 아민, 도데실 디메틸 아민, 테트라데실 디메틸 아민, 헥사데실 디메틸 아민, 옥타데실 디메틸 아민 및 올레일 디메틸 아민을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 알킬 디메틸 아민이다. 지방족 아민의 또는 다른 예시들은 디옥틸 메틸 아민, 디데실 메틸 아민, 디도데실 메틸 아민, 디테트라데실 메틸 아민, 디헥사데실 메틸 아민 및 디옥타데실 메틸 아민을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 디알킬 메틸 아민이다. 또한, 본 발명은 지방족 아미드[예를 들어, 스테아라미드(stearamide), 올레아미드, 에루카미드(erucamide)]; 4차(예를 들어, 테트라메틸 암모늄 클로라이드, 테트라메틸 암모늄 브로마이드, 테트라에틸 암모늄 브로마이드, 테트라프로필 암모늄 브로마이드); 및 에톡시레이트(예를 들어, 라우릴 아민, 스테아릴 아민, 올레일 아민, 옥타데실 아민)와 같은 화학 유도체들에 사용될 수 있는 본 명세서에 설명된 바와 같은 재조합 숙주 세포에 의해 생성되는 지방족 아민을 고려한다.
다른 구현예들에서, 지방족 아민은 직쇄형 지방족 아민을 포함한다. 다른 구현예들에서, 지방족 아민은 분지쇄형 지방족 아민을 포함한다. 또 다른 구현예들에서, 지방족 아민은 사이클릭형 모이어티를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 지방족 아민은 불포화 지방족 아민이다. 다른 구현예들에서, 지방족 아민은 단일불포화 지방족 아민이다. 또 다른 구현예들에서, 지방족 아민은 포화 지방족 아민이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 설명되는 미생물들 중 어느 하나 또는 방법들 중 어느 하나에 의해 생성되는 지방족 아민, 또는 본 명세서에 설명되는 미생물들 중 어느 하나 또는 방법들 중 어느 하나에 의해 생성되는 지방족 아민을 포함하는 계면 활성제를 특성화한다. 몇몇 구현예들에서, 지방족 아민은 약 -15.4 이상의 δ13C를 갖는다. 특정 구현예들에서, 지방족 아민은 약 -15.4 내지 약 -10.9 또는 약 -13.92 내지 약 -13.84의 δ13C를 갖는다. 몇몇 구현예들에서, 지방족 아민은 적어도 약 1.003의 fM 14C를 갖는다. 특정 구현예들에서, 지방족 아민은 적어도 약 1.01 또는 적어도 약 1.5의 fM 14C를 갖는다. 몇몇 구현예들에서, 지방족 아민은 약 1.111 내지 약 1.124의 fM 14C를 갖는다.
실시예들
다음의 특정 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 의도된 것이며, 청구항의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1:
지방족 알데히드 전구체 및 대응하는 지방족 아민은 질소원(글루타메이트)의 보충과 함께 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제(ygjG)와 티오에스테라아제('tesA) 및 카르복실산 리덕타아제(CarB)를 동시발현함으로써 생체 내에서 생성되었다. 지방족 알데히드 전구체는 대응하는 아민으로 전환되었다.
ygjG 유전자는 다음과 같은 프라이머로 PCR을 통해 대장균 MG1655 균주로부터 클로닝되었다:
포워드 프라이머:
'5-AGGAGGAATAACATATGAACAGGTTACCTTCGAGCGCATCGGC-3'
리버스 프라이머:
'5-CCCAAGCTTCGAATTCTTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCATGGCC-3'
이후, ygjG 유전자는 발현 벡터 pACYC[즉, 고 카피(high copy) 발현 벡터] 내로 결찰되어, 플라스미드 pACYC-ygjG를 생성하였다. 제 2 플라스미드가 생성되었고, pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05[즉, 저 카피(low copy) 플라스미드]라고 명칭하였으며, 이는 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) carB 유전자 및 대장균으로부터의 티오에스테라아제 유전자('tesA)의 변이체를 함유하였다. 2 개의 플라스미드는 균주 F16-YG를 제공하는 지방족 아민을 생성하지 않는 대장균 균주로 동시형질전환(co-transform)되었다(DVD2.1, 대장균 MG1655 균주로부터 ΔfadE ΔtonA fabB-A329V PT5-entD를 함유함). 또한, 숙주 세포들은 대조 균주 F16 (pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05) 및 대조 균주 YG (pACYC-ygjG)를 생성하는 대조군으로서 별개로 사용하기 위해 플라스미드들의 각각으로 형질전환되었다.
세포들은 32 ℃에서 3 % (w/v) 글루코오스, 0.5 % (v/v) TRITON X-100, 0.1 M 비스-트리스, pH 7.0으로 보충된 M9 최소 배지에서 생성되었고, OD600~1.0에서 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도되었다. [IPTG는 락 오페론(lac operon)의 전사를 촉발시키고, 유전자가 락 오퍼레이터의 조절 하에 있는 경우 단백질 발현을 유도하는 데 사용된다.] 또한, 유도 시, 5 g/L의 L-글루타메이트가 질소원으로서 추가되었다. 각각의 플라스미드에 대해 선택하기 위해, pACYC-ygjG를 함유하는 균주들은 항생제 카르베니실린의 존재 하에서 성장되었고, pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05를 함유하는 균주들은 스펙티노마이신의 존재 하에서 성장되었다. 하룻밤 성장 후, 3 개의 균주들의 배양물들은 추가 10 g/L의 글루코오스 및 5 g/L의 L-글루타메이트로 보충되었다. 1 mL의 배양물의 분취량(aliquot)이 24 시간 유도후 동결되었다.
분석을 위한 샘플들을 제조하기 위해, 0.5 mL의 에틸 아세테이트가 배양물의 각각의 분취량에 추가되었다. 이후, 샘플들은 15 분 동안 최대 속도로 볼텍싱(vortex)되었고, 5 분 동안 원심분리되었다. 유기 상은 EI 모드[즉, 방법: 알칸 1 비분할(splitless) CTC]에서 가스 크로마토그래프 질량분석법(Agilent 6890으로부터의 GCMS)으로 분석되었다. ygjG, carB, 및 'tesA가 외인성으로 발현되는 F16-YG 균주는 YG 또는 F16 음성 대조군 중 어느 하나에서 관찰되지 않았던 7.6 분에서 고유한 피크를 산출하였다(도 1의 상부 및 하부 패널). 7.6 분에서 F16-YG 배양물로부터의 샘플의 고유한 피크는 NIST 05 화합물 라이브러리에 의해 1-도데실아민으로서 식별되었다. Sigma/Aldrich(Product #325163)로부터 구매한 분석 표준 시료가 F16-YG 샘플로 연이어(back to back) 진행되었고, 이는 그 보유 시간(도 2)에 의해 또한 m/z = 142, 156 및 170에서 특징적인 단편 및 185에서 분자 이온을 나타내는 그 이온 단편화 패턴(도 3)에 의해 1-도데실아민으로서 화합물의 식별을 확인하였다.
실시예 2:
지방족 알데히드 전구체 및 대응하는 지방족 아민은 질소원(글루타메이트)의 보충과 함께 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제(ygjG)와 아실-ACP 리덕타아제(AAR)를 동시발현함으로써 생체 내에서 생성될 수 있다. 지방족 알데히드 전구체는 대응하는 아민으로 전환될 수 있다.
ygjG 유전자는 다음과 같은 프라이머로 PCR을 통해 대장균 MG1655 균주로부터 클로닝될 수 있다:
포워드 프라이머:
'5-AGGAGGAATAACATATGAACAGGTTACCTTCGAGCGCATCGGC-3'
리버스 프라이머:
'5-CCCAAGCTTCGAATTCTTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCATGGCC-3'
이후, ygjG 유전자는 발현 벡터 pACYC 내로 결찰될 수 있어, 플라스미드 pACYC-ygjG를 생성한다. 제 2 플라스미드가 생성될 수 있고, pCL1920-aar이라고 명칭하였으며, 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942(aar)로부터 AAR에 대한 유전자를 함유하는 pCL-기반 플라스미드이다. 2 개의 플라스미드가 균주 F17-YG를 제공하는 지방족 아민(위 참조)을 생성하지 않는 대장균 균주 내로 동시형질전환될 수 있다. 또한, 숙주 세포들은 대조 균주 F17 (pCL1920-aar) 및 대조 균주 YG (pACYC-ygjG)를 제공하는 대조군으로서 별개로 사용하기 위해 플라스미드들의 각각으로 형질전환될 수 있다.
세포들은 32 ℃에서 3 % (w/v) 글루코오스, 0.5 % (v/v) TRITON X-100, 0.1 M 비스-트리스, pH 7.0으로 보충된 M9 최소 배지에서 생성될 수 있고, OD600~1.0에서 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도될 수 있다. 또한, 유도 시, 5 g/L의 L-글루타메이트가 질소원으로서 추가될 수 있다. 각각의 플라스미드에 대해 선택하기 위해, pACYC-ygjG를 함유하는 균주들은 항생제 카르베니실린(0.05 mg/mL)의 존재 하에서 성장될 수 있고, pCL1920-aar를 함유하는 균주들은 0.1 mg/mL의 스펙티노마이신의 존재 하에서 성장될 수 있다. 하룻밤 성장 후, 3 개의 균주들의 배양물들은 추가 10 g/L의 글루코오스 및 5 g/L의 L-글루타메이트로 보충될 수 있다. 1 mL의 배양물의 분취량이 24 시간 유도후 동결될 수 있다.
분석을 위한 샘플들을 제조하기 위하여, 0.5 mL의 에틸 아세테이트가 배양물의 각각의 분취량에 추가될 수 있다. 이후, 샘플들은 요구된다면 약 15 분 동안 최대 속도로 볼텍싱될 수 있고, 약 5 분 동안 원심분리될 수 있다. 유기 상은 EI 모드(즉, 방법: 알칸 1 비분할 CTC)에서 가스 크로마토그래프 질량분석법(Agilent 6890으로부터의 GCMS)으로 분석될 수 있다. ygjG 및/또는 aar이 외인성으로 발현되는 F17-YG 균주는 YG 또는 F17 음성 대조군 중 어느 하나에서 관찰되지 않았고 실시예 1(위 참조)에서 관찰된 것과 유사한 지방족 아민을 나타내는 하나 이상의 고유한 피크를 산출할 것으로 예상된다. F17-YG 배양물로부터의 샘플의 여하한의 고유한 피크는 NIST 05 화합물 라이브러리를 통해 지방족 아민으로서 식별될 수 있다. 비교를 위해, Sigma/Aldrich(Product #325163)로부터의 분석 표준 시료가 F17-YG 샘플로 연이어 진행될 수 있어, 그 보유 시간에 의해 또한 그 이온 단편화 패턴에 의해 생성되는 화합물의 식별을 확인할 수 있다.
실시예 3:
지방족 알데히드 전구체 및 대응하는 지방족 아민은 질소원(글루타메이트)의 보충과 함께 GABA 아미노트랜스퍼라아제(PuuE)와 티오에스테라아제(TesA) 및 카르복실산 리덕타아제(CarB)를 동시발현함으로써 생체 내에서 생성될 수 있다. 지방족 알데히드 전구체는 대응하는 아민으로 전환될 수 있다. puuE 유전자는 적합한 포워드 및 리버스 프라이머(실시예 1 및 2에 교시된 것과 유사, 위 참조)로 PCR을 통해 대장균 균주로부터 클로닝될 수 있다. 이후, puuE 유전자는 발현 벡터(예를 들어, pACYC, 위 참조) 내로 결찰될 수 있어, 플라스미드 pACYC-puuE를 생성한다. 제 2 플라스미드가 생성될 수 있고, pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05라고 명칭하였으며, 이는 미코박테리움 스메그마티스 carB 유전자 및 대장균으로부터의 티오에스테라아제 유전자('tesA)의 변이체(위의 실시예 1 참조)를 함유하는 제 2 발현 벡터이다. 2 개의 플라스미드가 균주 F18-PU를 제공하는 지방족 아민(위 참조)을 생성하지 않는 대장균 균주 내로 동시형질전환될 수 있다. 또한, 숙주 세포들은 대조 균주 F18 (pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05) 및 대조 균주 PU (pACYC-puuE)를 제공하는 대조군으로서 별개로 사용하기 위해 플라스미드들의 각각으로 형질전환될 수 있다.
세포들은 32 ℃에서 3 % (w/v) 글루코오스, 0.5 % (v/v) TRITON X-100, 0.1 M 비스-트리스, pH 7.0으로 보충된 M9 최소 배지에서 생성될 수 있고, OD600~1.0에서 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도될 수 있다. 유도 시, 5 g/L의 L-글루타메이트가 질소원으로서 추가될 수 있다. 각각의 플라스미드에 대해 선택하기 위해, pACYC-puuE를 함유하는 균주들은 항생제 카르베니실린(0.05 mg/mL)의 존재 하에서 성장될 수 있고, pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05를 함유하는 균주들은 0.1 mg/mL의 스펙티노마이신의 존재 하에서 성장될 수 있다. 하룻밤 성장 후, 3 개의 균주들의 배양물들은 추가 10 g/L의 글루코오스 및 5 g/L의 L-글루타메이트로 보충될 수 있다. 1 mL의 배양물의 분취량이 24 시간 유도후 동결될 수 있다.
분석을 위한 샘플들을 제조하기 위하여, 0.5 mL의 에틸 아세테이트가 배양물의 각각의 분취량에 추가될 수 있다. 이후, 샘플들은 요구된다면 약 15 분 동안 최대 속도로 볼텍싱될 수 있고, 약 5 분 동안 원심분리될 수 있다. 유기 상은 EI 모드(즉, 방법: 알칸 1 비분할 CTC)에서 가스 크로마토그래프 질량분석법(Agilent 6890으로부터의 GCMS)으로 분석될 수 있다. puuE, carB, 및/또는 'tesA가 외인성으로 발현되는 F18-PU 균주는 PU 또는 F18 음성 대조군 중 어느 하나에서 관찰되지 않은 하나 이상의 고유한 피크를 생성할 것으로 예상된다. F18-PU 배양물로부터의 샘플의 예상되는 고유한 피크는 이후 NIST 05 화합물 라이브러리를 통해 식별될 수 있다. Sigma/Aldrich(Product #325163)로부터의 분석 표준 시료가 F18-PU 샘플로 연이어 진행될 수 있어, 신규한 지방족 아민 화합물의 식별을 확인할 수 있다.
실시예 4:
지방족 알데히드 전구체 및 대응하는 지방족 아민은 질소원(글루타메이트)의 보충과 함께 GABA 아미노트랜스퍼라아제(PuuE)와 AAR을 동시발현함으로써 생체 내에서 생성될 수 있다. 지방족 알데히드 전구체는 대응하는 아민으로 전환될 수 있다.
puuE 유전자는 적합한 포워드 및 리버스 프라이머(실시예 1에 교시된 것과 유사, 위 참조)로 PCR을 통해 대장균 균주로부터 클로닝될 수 있다. puuE 유전자는 발현 벡터(예를 들어, pACYC, 위 참조) 내로 결찰될 수 있어, 플라스미드 pACYC-puuE를 생성한다. 제 2 플라스미드가 생성될 수 있고, pCL1920-aar이라고 명칭하였으며, 이는 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942(aar)로부터 AAR에 대한 유전자를 함유하는 또 다른 발현 벡터이다. 2 개의 플라스미드가 균주 F19-PU를 제공하는 지방족 아민(위 참조)을 생성하지 않는 대장균 균주 내로 동시형질전환될 수 있다. 또한, 숙주 세포들은 대조 균주 F19 (pCL1920-aar) 및 대조 균주 PU (pACYC-puuE)를 제공하는 대조군으로서 별개로 사용하기 위해 플라스미드들의 각각으로 형질전환될 수 있다.
세포들은 32 ℃에서 3 % (w/v) 글루코오스, 0.5 % (v/v) TRITON X-100, 0.1 M 비스-트리스, pH 7.0으로 보충된 M9 최소 배지에서 생성될 수 있고, OD600~1.0에서 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도될 수 있다. 유도 시, 5 g/L의 L-글루타메이트가 질소원으로서 추가될 수 있다. 각각의 플라스미드에 대해 선택하기 위해, pACYC-puuE를 함유하는 균주들은 항생제 카르베니실린(0.05 mg/mL)의 존재 하에서 성장될 수 있고, pCL1920-aar을 함유하는 균주들은 0.1 mg/mL의 스펙티노마이신의 존재 하에서 성장될 수 있다. 하룻밤 성장 후, 3 개의 균주들의 배양물들은 추가 10 g/L의 글루코오스 및 5 g/L의 L-글루타메이트로 보충될 수 있다. 1 mL의 배양물의 분취량이 24 시간 유도후 동결될 수 있다.
분석을 위한 샘플들을 제조하기 위하여, 0.5 mL의 에틸 아세테이트가 배양물의 각각의 분취량에 추가될 수 있다. 이후, 샘플들은 요구된다면 약 15 분 동안 최대 속도로 볼텍싱될 수 있고, 약 5 분 동안 원심분리될 수 있다. 유기 상은 EI 모드(즉, 방법: 알칸 1 비분할 CTC)에서 가스 크로마토그래프 질량분석법(Agilent 6890으로부터의 GCMS)으로 분석될 수 있다. puuE, 및/또는 aar이 외인성으로 발현되는 F19-PU 균주는 PU 또는 F19 음성 대조군 중 어느 하나에서 관찰되지 않은 하나 이상의 고유한 피크를 생성할 것으로 예상된다. F19-PU 배양물로부터의 샘플의 예상되는 고유한 피크는 이후 NIST 05 화합물 라이브러리를 통해 식별될 수 있다. Sigma/Aldrich(Product #325163)로부터의 분석 표준 시료가 F19-PU 샘플로 연이어 진행될 수 있어, 신규한 지방족 아민 화합물의 식별을 확인할 수 있다.
실시예 5:
지방족 알데히드 전구체 및 대응하는 지방족 아민은 질소원(암모니아)의 보충과 함께 아민 디하이드로게나아제(예를 들어, 파라코커스 데니트리피칸스로부터의 메틸아민 디하이드로게나아제 또는 슈도모나스 종의 퀴노헤모 단백질 아민)와 티오에스테라아제(TesA) 및 카르복실산 리덕타아제(CarB)를 동시발현함으로써 생체 내에서 생성될 수 있다. 지방족 알데히드 전구체는 대응하는 아민으로 전환될 수 있다.
파라코커스 데니트리피칸스 또는 슈도모나스 종으로부터의 아민 디하이드로게나아제(AD) 유전자는 적합한 포워드 및 리버스 프라이머(실시예 1에 교시된 것과 유사, 위 참조)로 PCR을 통해 클로닝될 수 있다. 이후, AD 유전자는 발현 벡터(예를 들어, pACYC, 위 참조) 내로 결찰될 수 있어, 플라스미드 pACYC-AD를 생성한다. 제 2 플라스미드가 생성될 수 있고, pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05라고 명칭하였으며, 이는 미코박테리움 스메그마티스 carB 유전자 및 대장균으로부터의 티오에스테라아제 유전자('tesA)의 변이체(위의 실시예 1 참조)를 함유하는 또 다른 발현 벡터이다. 2 개의 플라스미드가 균주 F20-AD를 제공하는 지방족 아민(위 참조)을 생성하지 않는 대장균 균주 내로 동시형질전환될 수 있다. 또한, 숙주 세포들은 대조 균주 F20 (pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05) 및 대조 균주 AD (pACYC-AD)를 제공하는 대조군으로서 별개로 사용하기 위해 플라스미드들의 각각으로 형질전환될 수 있다.
세포들은 32 ℃에서 3 % (w/v) 글루코오스, 0.5 % (v/v) TRITON X-100, 0.1 M 비스-트리스, pH 7.0으로 보충된 M9 최소 배지에서 생성될 수 있고, OD600~1.0에서 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도될 수 있다. 유도 시, 약 0.5 내지 1 g/L의 암모니아가 질소원으로서 추가될 수 있다. 각각의 플라스미드에 대해 선택하기 위해, pACYC-AD를 함유하는 균주들은 항생제 카르베니실린(0.05 mg/mL)의 존재 하에서 성장될 수 있고, pCL1920-CarB-18-cTesA2-13C05를 함유하는 균주들은 0.1 mg/mL의 스펙티노마이신의 존재 하에서 성장될 수 있다. 하룻밤 성장 후, 3 개의 균주들의 배양물들은 추가 10 g/L의 글루코오스 및 약 0.5 내지 1 g/L의 암모니아로 보충될 수 있다. 1 mL의 배양물의 분취량이 24 시간 유도후 동결될 수 있다.
분석을 위한 샘플들을 제조하기 위하여, 0.5 mL의 에틸 아세테이트가 배양물의 각각의 분취량에 추가될 수 있다. 이후, 샘플들은 요구된다면 약 15 분 동안 최대 속도로 볼텍싱될 수 있고, 약 5 분 동안 원심분리될 수 있다. 유기 상은 EI 모드(즉, 방법: 알칸 1 비분할 CTC)에서 가스 크로마토그래프 질량분석법(Agilent 6890으로부터의 GCMS)으로 분석될 수 있다. AD, carB, 및/또는 'tesA 가 외인성으로 발현되는 F20-AD 균주는 PU 또는 F20 음성 대조군 중 어느 하나에서 관찰되지 않은 하나 이상의 고유한 피크를 생성할 것으로 예상된다. F20-AD 배양물로부터의 샘플의 예상되는 고유한 피크는 이후 NIST 05 화합물 라이브러리를 통해 식별될 수 있다. Sigma/Aldrich(Product #325163)로부터의 분석 표준 시료가 F20-AD 샘플로 연이어 진행될 수 있어, 신규한 지방족 아민 화합물의 식별을 확인할 수 있다.
실시예 6:
지방족 알데히드 전구체 및 대응하는 지방족 아민은 질소원(암모니아)의 보충과 함께 아민 디하이드로게나아제(예를 들어, 파라코커스 데니트리피칸스로부터의 메틸아민 디하이드로게나아제 또는 슈도모나스 종의 퀴노헤모 단백질 아민)와 AAR을 동시발현함으로써 생체 내에서 생성될 수 있다. 지방족 알데히드 전구체는 대응하는 아민으로 전환될 수 있다.
아민 디하이드로게나아제(AD) 유전자는 적합한 포워드 및 리버스 프라이머(실시예 1에 교시된 것과 유사, 위 참조)로 PCR을 통해 대장균으로부터 클로닝될 수 있다. AD 유전자는 발현 벡터(예를 들어, pACYC, 위 참조) 내로 결찰될 수 있어, 플라스미드 pACYC-AD를 생성한다. 제 2 플라스미드가 생성될 수 있고, pCL1920-aar이라고 명칭하였으며, 이는 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942(aar)로부터 AAR에 대한 유전자를 함유하는 또 다른 발현 벡터이다. 2 개의 플라스미드가 균주 F21-AD를 제공하는 지방족 아민(위 참조)을 생성하지 않는 대장균 균주 내로 동시형질전환될 수 있다. 또한, 숙주 세포들은 대조 균주 F21 (pCL1920-aar) 및 대조 균주 AD (pACYC-AD)를 제공하는 대조군으로서 별개로 사용하기 위해 플라스미드들의 각각으로 형질전환될 수 있다.
세포들은 32 ℃에서 3 % (w/v) 글루코오스, 0.5 % (v/v) TRITON X-100, 0.1 M 비스-트리스, pH 7.0으로 보충된 M9 최소 배지에서 생성될 수 있고, OD600~1.0에서 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도될 수 있다. 유도 시, 약 0.5 내지 1 g/L의 암모니아가 질소원으로서 추가될 수 있다. 각각의 플라스미드에 대해 선택하기 위해, pACYC-AD를 함유하는 균주들은 항생제 카르베니실린(0.05 mg/mL)의 존재 하에서 성장될 수 있고, pCL1920-aar을 함유하는 균주들은 0.1 mg/mL의 스펙티노마이신의 존재 하에서 성장될 수 있다. 하룻밤 성장 후, 3 개의 균주들의 배양물들은 추가 10 g/L의 글루코오스 및 약 0.5 내지 1 g/L의 암모니아로 보충될 수 있다. 1 mL의 배양물의 분취량이 24 시간 유도후 동결될 수 있다.
분석을 위한 샘플들을 제조하기 위하여, 0.5 mL의 에틸 아세테이트가 배양물의 각각의 분취량에 추가될 수 있다. 이후, 샘플들은 요구된다면 약 15 분 동안 최대 속도로 볼텍싱될 수 있고, 약 5 분 동안 원심분리될 수 있다. 유기 상은 EI 모드(즉, 방법: 알칸 1 비분할 CTC)에서 가스 크로마토그래프 질량분석법(Agilent 6890으로부터의 GCMS)으로 분석될 수 있다. AD 및/또는 aar이 외인성으로 발현되는 F21-AD 균주는 AD 또는 F21 음성 대조군 중 어느 하나에서 관찰되지 않은 하나 이상의 고유한 피크를 생성할 것으로 예상된다. F21-AD 배양물로부터의 샘플의 예상되는 고유한 피크는 이후 NIST 05 화합물 라이브러리를 통해 식별될 수 있다. Sigma/Aldrich(Product #325163)로부터의 분석 표준 시료가 F21-AD 샘플로 연이어 진행될 수 있어, 신규한 지방족 아민 화합물의 식별을 확인할 수 있다.
해당 기술분야의 당업자에게 명백한 바와 같이, 상기의 측면들 및 구현예들의 다양한 변형들 및 변경들이 본 발명의 기술사상 및 범위를 벗어나지 않고 행해질 수 있다. 이러한 변형들 및 변경들은 본 발명의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> REG LIFE SCIENCES, LLC <120> MICROBIAL PRODUCTION OF FATTY AMINES <130> LS00051 PCT <140> PCT/US2014/068950 <141> 2014-12-05 <150> 61/912,184 <151> 2013-12-05 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 aggaggaata acatatgaac aggttacctt cgagcgcatc ggc 43 <210> 2 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 cccaagcttc gaattcttac gcttcttcga cacttactcg catggcc 47

Claims (43)

  1. 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위한 조작된 대사 경로를 포함하는 지방족 아민의 생성을 위한 재조합 미생물에 있어서,
    상기 대사 경로는 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 포함하고, 상기 미생물은 생체 내에서 지방족 아민을 생성하는 재조합 미생물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 지방족 아민은 상기 미생물에 의해 배양 배지 내로 방출되는 재조합 미생물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 외인성 생합성 효소는 푸트레신 또는 GABA 아미노트랜스퍼라아제인 재조합 미생물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제는 YgjG인 재조합 미생물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 YgjG는 상기 미생물에서 발현되는 ygjG 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 미생물.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 GABA 아미노트랜스퍼라아제는 PuuE인 재조합 미생물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 PuuE는 상기 미생물에서 발현되는 puuE 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 미생물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 외인성 생합성 효소는 아민 디하이드로게나아제인 재조합 미생물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 아민 디하이드로게나아제는 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans)의 메틸아민 디하이드로게나아제인 재조합 미생물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 아실-ACP 또는 아실-CoA를 지방산으로 전환시키기 위한 조작된 또 다른 대사 경로를 더 포함하는 재조합 미생물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 아실-ACP 또는 상기 아실-CoA는 티오에스테라아제 활성을 갖는 생합성 효소에 의해 지방산으로 전환되는 재조합 미생물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    티오에스테라아제 활성을 갖는 상기 생합성 효소는 상기 미생물에서 발현되는 tesA 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 미생물.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 지방산을 지방족 알데히드로 전환시키기 위한 조작된 또 다른 대사 경로를 더 포함하는 재조합 미생물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 지방산은 카르복실산 리덕타아제(CAR) 활성을 갖는 생합성 효소에 의해 지방족 알데히드로 전환되는 재조합 미생물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    CAR 활성을 갖는 상기 생합성 효소는 상기 미생물에서 발현되는 carB 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 미생물.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 재조합 미생물 세포인 재조합 미생물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물 세포는 재조합 박테리아 세포인 재조합 미생물 세포.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물 세포는 에스체리치아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 시아노피타(Cyanophyta), 락토바실러스(Lactobacillus), 자이모모나스(Zymomonas), 로도코커스(Rhodococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 푸사리움(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 리조무코르(Rhizomucor), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 무코르(Mucor), 미셀리오프토라(Myceliophtora), 페니실리움(Penicillium), 파네로카에테(Phanerochaete), 플레우로투스(Pleurotus), 트라메테스(Trametes), 크리소스포리움(Chrysosporium), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스테노트로파모나스(Stenotrophamonas), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로위아(Yarrowia), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 재조합 미생물 세포.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 에스체리치아는 대장균인 재조합 미생물 세포.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 시아노피타는 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 시아노테세(Cyanothece) 및 노스톡 펑크티포르메(Nostoc Punctiforme)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 미생물 세포.
  21. 제 18 항에 있어서,
    상기 시아노피타는 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus) PCC7942, 시네코시스티스 종(Synechocystis sp.) PCC6803, 및 시네코코커스 종 PCC7001로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 미생물 세포.
  22. 탄소원을 함유하는 발효 브로쓰(fermentation broth)에서 제 1 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 지방족 아민을 생성하는 방법.
  23. 지방족 아민의 생성을 위한 재조합 박테리아 세포에 있어서,
    (i) 티오에스테라아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 코딩하는 하나 이상의 발현된 유전자;
    (ⅱ) 카르복실산 리덕타아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 코딩하는 하나 이상의 발현된 유전자; 및
    (ⅲ) 아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 외인성 생합성 효소를 코딩하는 하나 이상의 발현된 유전자를 포함하고,
    상기 재조합 박테리아 세포는 생체 내에서 지방족 아민을 생성하는 재조합 박테리아 세포.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 지방족 아민은 상기 박테리아 세포에 의해 배양 배지 내로 방출되는 재조합 박테리아 세포.
  25. 제 23 항에 있어서,
    티오에스테라아제 활성을 갖는 상기 외인성 생합성 효소는 아실-ACP 또는 아실-CoA를 지방산으로 전환시키기 위한 재조합 박테리아 세포.
  26. 제 25 항에 있어서,
    카르복실산 리덕타아제 활성을 갖는 상기 외인성 생합성 효소는 상기 지방산을 지방족 알데히드로 전환시키기 위한 재조합 박테리아 세포.
  27. 제 26 항에 있어서,
    아미노트랜스퍼라아제 또는 아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 상기 외인성 생합성 효소는 상기 지방족 알데히드를 지방족 아민으로 전환시키기 위한 재조합 박테리아 세포.
  28. 제 23 항에 있어서,
    티오에스테라아제 활성을 갖는 상기 외인성 생합성 효소는 tesA 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 박테리아 세포.
  29. 제 23 항에 있어서,
    카르복실산 리덕타아제 활성을 갖는 상기 외인성 생합성 효소는 carB 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 박테리아 세포.
  30. 제 23 항에 있어서,
    아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖는 상기 외인성 생합성 효소는 푸트레신 또는 GABA 아미노트랜스퍼라아제인 재조합 박테리아 세포.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 푸트레신 아미노트랜스퍼라아제는 YgjG인 재조합 박테리아 세포.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 YgjG는 ygjG 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 박테리아 세포.
  33. 제 30 항에 있어서,
    상기 GABA 아미노트랜스퍼라아제는 PuuE인 재조합 박테리아 세포.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 PuuE는 puuE 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 재조합 박테리아 세포.
  35. 제 23 항에 있어서,
    아민 디하이드로게나아제 활성을 갖는 상기 외인성 생합성 효소는 메틸아민 디하이드로게나아제인 재조합 박테리아 세포.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 메틸아민 디하이드로게나아제는 파라코커스 데니트리피칸스로부터 만들어지는 재조합 박테리아 세포.
  37. 제 23 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아 세포는 에스체리치아, 바실러스, 시아노피타, 락토바실러스, 자이모모나스, 로도코커스, 슈도모나스, 아스페르길루스, 트리코데르마, 뉴로스포라, 푸사리움, 후미콜라, 리조무코르, 클루이베로마이세스, 피치아, 무코르, 미셀리오프토라, 페니실리움, 파네로카에테, 플레우로투스, 트라메테스, 크리소스포리움, 사카로마이세스, 스테노트로파모나스, 스키조사카로마이세스, 야로위아, 및 스트렙토마이세스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 박테리아 세포.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 에스체리치아는 대장균인 재조합 박테리아 세포.
  39. 제 37 항에 있어서,
    상기 시아노피타는 프로클로로코커스, 시네코코커스, 시네코시스티스, 시아노테세 및 노스톡 펑크티포르메로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 박테리아 세포.
  40. 제 37 항에 있어서,
    상기 시아노피타는 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942, 시네코시스티스 종 PCC6803, 및 시네코코커스 종 PCC7001로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 재조합 박테리아 세포.
  41. 제 23 항의 박테리아 세포를 포함하는 세포 배양물.
  42. 탄소원을 함유하는 발효 브로쓰에서 제 23 항의 상기 박테리아 세포를 배양하는 단계를 포함하는 지방족 아민을 생성하는 방법.
  43. 박테리아 세포에서 지방족 아민을 생성하는 방법에 있어서,
    (i) 탄소원의 존재 하에서 발효 브로쓰에서 제 23 항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 발효 브로쓰에 수집된 지방족 아민을 수득하는 단계를 포함하는 지방족 아민 생성 방법.
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