ES2579384B1

ES2579384B1 - Producción de alcoholes grasos

Info

Publication number: ES2579384B1
Application number: ES201530156A
Authority: ES
Inventors: Sandy Christiane FILLET; Mª Del Carmen RONCHEL BARRENO; Beatriz Suárez González; Armando Lara Cambil; José Luis Adrio Fondevila; Javier Velasco Álvarez
Original assignee: Neol Biosolutions SA
Current assignee: Neol Biosolutions SA
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2015-02-10
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2035-02-10
Also published as: ES2579384A1; WO2016128602A1

Abstract

Producción de alcoholes grasos.#La presente invención se refiere a la producción de alcoholes grasos mediante el cultivo de un microorganismo de la especie Rhodosporidium toruloides, mediante la inserción de un gen que codifica una enzima con actividad acil-Coa reductasa que permite producir alcoholes grasos en presencia de diferentes fuentes de carbono.

Description

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DESCRIPCION

Production de alcoholes grasos CAMPO DE LA INVENCION

La presente invention se refiere a la produccion de alcoholes grasos mediante el cultivo de un microorganismo en presencia de diferentes fuentes de carbono.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los acidos grasos son importantes precursores de valiosos compuestos quimicos y de carburantes que, en la actualidad, se obtienen a partir de fuentes petroquimicas o de aceites vegetales. Mientras que el uso de los acidos grasos libres esta generalmente limitado debido a la naturaleza ionica de su grupo carboxilo, sus derivados (ej. alcoholes grasos, ceras, aldehidos grasos, a-olefinas) son utilizados para producir surfactantes, lubricantes, carburantes, biomateriales u otros compuestos incluidos en muchos productos consumibles.

El mercado mundial de los alcoholes grasos alcanzo un valor de unos 5,2 billones de dolares en el ano 2011 y se preve una tasa de crecimiento del 4% anual durante los proximos diez anos. En la actualidad los alcoholes grasos se producen mayoritariamente a partir de aceites vegetales o grasas, fundamentalmente coco, palma, semilla de palma, sebo y manteca, mediante dos procedimientos quimicos: el primero parte de acidos grasos libres y el segundo de esteres metflicos de dichos acidos grasos. Ambos casos requieren una etapa de esterification (o transesterificacion) catalrtica y otra posterior de hidrogenacion. Estas fuentes naturales tienen diferentes composiciones de acidos grasos siendo especialmente importante la longitud de las cadenas acilo presentes en los mismos. La longitud de las cadenas de estos alcoholes tiene un gran impacto en las propiedades fisicas y quimicas de estas moleculas y, por ello, dicha longitud de cadena establece su posible uso para diferentes aplicaciones. Por ello, con el fin de obtener las fracciones conteniendo una longitud de cadena determinada, normalmente es necesario fraccionar por destilacion la mezcla de alcoholes grasos mediante un proceso que demanda mucha energia.

Los alcoholes grasos tambien se pueden obtener mediante hidratacion quimica de a-olemas producidas a partir de fuentes petroquimicas. Entre los procesos utilizados para realizar esta transformation se encuentran los procesos ALFOL®, desarrollado por Conoco, y EFAL® (BP/Amoco). Ambos son los denominados procesos Ziegler y se basan en el uso de

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catalizadores organicos de alumina. Otro proceso para sintetizar alcoholes grasos es el llamado proceso Oxo (hidroformilacion) que consiste en hacer reaccionar las olefinas con una mezcla de hidrogeno y CO en presencia de un catalizador.

Todos estos procesos requieren condiciones de reaccion severas, tiempos prolongados, equipamiento costoso, liberan compuestos peligrosos al medio ambiente y estan a expensas de la fluctuation del precio de las materias primas.

Por todo ello, la production de alcoholes grasos y otros derivados de acidos grasos, a partir de microorganismos se esta convirtiendo en una alternativa atractiva debido a la capacidad de los enzimas microbianos para utilizar materias primas renovables, controlar la longitud de la cadena del producto, anadir modificaciones a las moleculas y, ademas, no utilizar aceites de plantas como materia prima evitando de esta forma la competition entre el uso de dichos aceites como alimentos frente a su aplicacion en el sector oleoquimico.

Las enzimas capaces de reducir substratos acil-tioesteres grasos (ej. acil-CoA grasos, o acil- ACP grasos) a sus correspondientes alcoholes grasos se les denomina comunmente como reductasas de acil-CoA grasos (fatty acil-CoA reductases o "FARs”). Estas enzimas estan presentes en numerosos tipos de organismos, incluyendo, bacterias, hongos, algas, mamiferos, plantas, insectos, crustaceos y gusanos. En la naturaleza, los alcoholes grasos producidos por las acil-CoA reductasas son, a menudo, incorporados en ceras, cuticulas, u otras estructuras que sirven de barrera hidrofobica a la entrada de agua y, tambien, para reducir el riesgo de infection por patogenos. En ciertos organismos los alcoholes grasos pueden ser tambien incorporados a esteres de ceras como lipidos de almacenamiento, o como secreciones glandulares.

Las reductasas de acil-CoA grasos se puede dividir en dos clases: las que forman aldehidos y las que forman alcoholes (Metz et al. 2000. Plant Physiol, 122: 635-644). Las primeras catalizan la reduction de dos electrones de las formas activas de los acidos grasos a aldehidos grasos como, por ejemplo, la reductasa de Acinetobacter sp M-1 (Reiser y Somerville. 1997. J Bacteriol, 179: 2969-75; Ishige et al. 2002. Appl Environ Microbiol, 68: 1192-5), o la de la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 680 (Steen et al. 2010. Nature, 463: 559-562).

Las segundas catalizan la reduccion de cuatro electrones de las formas activas de los acidos grasos para producir directamente alcoholes grasos. Este es el caso de la reductasa

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de Simmonsia chinensis (jojoba) (Metz et al. 2000. Plant Physiol, 122: 635-644), o de aquellas presentes en animales como ratones, pajaros, humanos o nematodos (Cheng et al. 2004. J Biol Chem, 279: 37789-97; Moto et al. 2003. Proc Natl Acad Sci USA, 100: 9156-61; Hellenbrand et al. 2011. BMC Biochem,12: 64).

La biosmtesis de los alcoholes grasos utiliza fundamentalmente la ruta de smtesis de novo de acidos grasos presentes en los microorganismos. Por ello, esta ruta ha sido el objetivo de diferentes estrategias de ingenieria metabolica para producir alcoholes grasos.

Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae son los microorganismos modelo mas intensamente estudiados y ampliamente utilizados en el desarrollo de estrategias de ingenieria metabolica dirigidas a la production de metabolitos de valor anadido. Ambos tienen varias ventajas clave como bajos niveles de riesgo, altas tasas de crecimiento, buena trazabilidad, y han sido ampliamente utilizados en diversos procesos industriales.

Escherichia coli es, por el momento, el microorganismo de referencia en el desarrollo de procesos para la produccion de alcoholes grasos (Lennen y Pfleger. 2013. Curr Opin Biotechnol, 24: 1044-1053). Los diferentes estudios se han centrado en optimizar la produccion de acidos grasos, en limitar su metabolismo y en expresar diferentes enzimas endogenas o heterologas que conducen a la formation de estos compuestos. Asi, el documento US 2014336423 describe la construction de cepas productoras de alcoholes grasos saturados (C12:0-C18:0) que portan diferentes acil-ACP tioesterasas de plantas, genes de la ruta de biosmtesis de acidos grasos (FabZ, FabI, FabF y FabD) de diferentes bacterias, ademas de acil-CoA reductasas procedente de bacterias marinas (pertenecientes a los generos Marinobacter, Marinomonas, Oceanobacter, etc.), de plantas (ej. Arabidopsis thaliana, Simmonsia chinensis) u otros organismos. La produccion de alcoholes grasos alcanzada, dependiendo de la cepa productora, fue de 1,5-4,5 g/L conteniendo entre un 5080% de alcoholes saturados).

El documento US20130245339 describe el uso de cepas productoras de alcoholes lineales o ramificados. Para ello incluyen la donation y expresion de genes como tioesterasas de plantas, acil-CoA reductasas formadoras de aldehidos o alcoholes, o el operon Bkd (a-ceto acido deshidrogenasa de cadenas ramificadas). La produccion alcanzo 1-10 mg/L. El documento US20140093929 describe la produccion de alcoholes grasos mediante la expresion de variantes de las acil-CoA reductasas formadoras de alcoholes de Marinobacter aquaeolei y Marinobacter algicola. Bajo las mejores condiciones de cultivo, las variantes con mayor actividad lograron producir entre 0,2 y 1,2 g/L de alcoholes grasos.

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La sobreexpresion de la tioesterasa TesA', de FadD, y la expresion de acrl, una acil-CoA reductasa de Acinetobacter calcoaceticus en una cepa de Escherichia coli AfadE permitio producir 100 mg/L de alcoholes grasos C16 y C18 (Steen et al. 2010. Nature, 463: 559-562). La optimizacion de los niveles de expresion de la tioesterasa de Umbellularia californica, de fadD, y de la acil-CoA reductasa de Acinetobacter calcoaceticus permitieron lograr una cepa de E. coli capaz de producir 450 mg/L de alcoholes C12/C14, un 75% del total de los alcoholes grasos producidos (598 mg/L) (Zheng et al. 2012. Microbial Cell Factories, 11:6576).

Alcoholes grasos de diferentes longitudes de cadena se obtuvieron al utilizar dos acil-CoA reductasas de amplia especificidad de substrato procedentes de Marinobacter aquaeolei VT8 (Liu at el. 2013. Appl Microbiol Biotechnol, 97: 7061-7071). La mejor cepa productora, que tambien expresaba la tioesterasa modificada TesA y la acil-CoA ligasa (FadD) de E. coli, fue capaz de producir 1,75 g/L de alcoholes grasos.

Utilizando una cepa que sobre-expresaba la tioesterasa de Umbellularia californica, la acil- CoA ligase (FadD) nativa y la acil-CoA reductase de Marinobacter aquaeolei VT8, Youngquist et al (Youngquist et al. 2013. Metab Eng, 20:177-186) lograron producir 1,55 g/L de 1-dodecanol y de 1-tetradecanol con un rendimiento de 0,13 (g alcohol graso/g glucosa).

Saccharomyces cerevisiae es otro de los organismos modelo ampliamente utilizado en el desarrollo de procesos industriales. S. cerevisiae, en comparacion con E. coli, presenta una serie de ventajas como poder cultivarse hasta densidades celulares mas altas, tener un mejor comportamiento a baja temperatura y pH (Aronsson y Ronner, 2001; Ageitos et al., 2011), y estar mejor adaptada para la expresion funcional de enzimas eucariotas (muchas de las enzimas implicadas en la production de acidos grasos son del reino de las plantas) debido a sus sistemas de endomembranas y modificaciones post-translacionales (Ageitos et al., 2011). Sin embargo, en muchos casos, por causas desconocidas, los rendimientos de produccion de compuestos derivados de los acidos grasos producidos por cepas recombinantes de S. cerevisiae son mucho menores que los alcanzados en E. coli cuando se expresan identicos genes heterologos.

La produccion de alcoholes grasos en S. cerevisiae se realiza siguiendo estrategias similares a las empleadas en E. coli. La expresion de la reductasa de acil-CoA grasos de raton (mFAR1) bajo el promotor constitutivo TEF1 permitio lograr una produccion de 93 mg/L de alcoholes grasos (Runguphan y Keasling. 2014. Metab Eng, 21: 103-113). La posterior

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expresion de la enzima malica para incrementar el pool citosolico de NADPH logro incrementar ligeramente la production hasta 98 mg/L. Los alcoholes grasos producidos fueron mayoritariamente cetil (C16-OH) y estearil (C18-OH).

Debido a que la diacilglicerol acil transferasa (DAGAT) es la enzima que limita la tasa de smtesis de trigliceridos a partir de los acil-CoA grasos, la regulation de esta enzima puede alterar los niveles de produccion de estos acil-CoA grasos. La disruption genica del gen dgal, que codifica la diacilglicerol aciltransferasa, y la expresion heterologa de la acil-CoA reductasa (TaFAR) de la lechuza comun permitieron producir 49 mg/L de alcoholes grasos (Tang y Chen. 2014. Biotechnol Bioeng, 112: 386-392). El control de la relation carbono/nitrogeno en el medio de cultivo permitio incrementar la produccion hasta alcanzar 84 mg/L.

En otro estudio, Feng et al (Feng et al. 2015. Metab Eng, 27: 10-19), lograron alcanzar una produccion de 1,1 g/L de alcoholes grasos en un cultivo en modo fed-batch. Para ello, construyeron una cepa en la que realizaron modificaciones tanto de genes estructurales como reguladores del metabolismo lipidico de la levadura. En concreto expresaron la acil- CoA reductasa (TaFAR) de lechuza comun, sobre-expresaron la ACC1 (acetil-CoA carboxilasa), deleccionaron un regulador negativo de la smtesis de fosfolipidos (RPD3) e incrementaron la concentration de acetil-CoA citoplasmatico mediante la expresion de la ACL (ATP citrato liasa) de Yarowia lipolytica.

Las cianobacterias tambien han sido recientemente utilizadas para la produccion de alcoholes grasos. Los documentos US20110195469 y US20148633002 describen el uso de cepas recombinantes de este microorganismo capaces de producir <100 mg/L. Las modificaciones incluyen la expresion de acil-CoA reductasas formadoras de alcoholes truncadas en el extremo amino (ej. FAR6 y MS2 de Arabidopsis), o acil-CoA reductasas procedentes de bacterias (ej. Marinobacter, Acinetobacter), asi como diferentes protemas transportadoras.

Los microorganismos oleaginosos que incluyen bacterias, levaduras, cianobacterias, microalgas y hongos filamentosos, se definen por su capacidad para acumular, al menos, un 20% de su peso seco en forma de lipidos (Ratledge y Wynn. 2002. Avd. Appl. Microbiol. 51: 1-51; Ratledge. 2004. Biochemie. 86: 807-815). Esta caracteristica hace que estos microorganismos se consideren como unos candidatos muy atractivos para ser utilizados

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como cepas hospedadoras para la produccion de diferentes compuestos derivados de acidos grasos, incluyendo los alcoholes grasos.

Las bacterias oleaginosas han sido las menos estudiadas hasta la fecha debido a que su contenido en lipidos es relativamente mas bajo que en levaduras, cianobacterias, microalgas y hongos filamentosos; y tambien estan limitadas por sus bajas tasas de crecimiento. Las cianobacterias y microalgas oleaginosas son hospedadores atractivos para la produccion de derivados de acidos grasos principalmente por su capacidad fotosintetica que les permite convertir la ene^a solar y reciclar el CO2 en biocarburantes. Asi, la cianobacteria Synechococcus elongatus sp. PCC 7942 ha sido modificada para producir diferentes compuestos relacionados con biocarburantes como 1-butanol (Lan y Liao. 2012. Proc Natl Acad Sci, 109: 6018-6023) o isobutanol (Atsumi et al. 2010. Appl Microbiol Biotechnol, 85: 651-657). Sin embargo, ambos tipos son tecnicamente dificiles de manipular y sus procesos de cultivo y de crecimiento son mas complicados que los de bacterias, levaduras y hongos. Estas dificultades son las que han impedido su uso en la produccion de compuestos derivados de acidos grasos a traves de ingenieria metabolica. De forma similar, la explotacion de hongos filamentosos oleaginosos como organismos de produccion tambien ha sido impedida por la falta de tecnicas de transformation eficientes.

Por ello, las levaduras oleaginosas tienen muchas ventajas sobre los otros organismos productores lo que hace que estos microorganismos se consideren las factorias celulares mas prometedoras para la produccion de derivados de acidos grasos.

Entre este tipo de microorganismos se encuentran varios generos como Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Criptococcus, Trichosporon, y Lipomyces. Varias especies pertenecientes a estos generos pueden crecer hasta altas densidades celulares y son capaces de acumular hasta un 70% de su peso seco en forma de lipidos (Ageitos et al. 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: 1219-1227; Beopoulos et al. 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: 1193-1206).

Los documentos WO2009118438 y WO2014198988 describen la produccion de trigliceridos (aceites) a partir de diferentes tipos de fuentes de carbono, incluyendo glicerina cruda industrial o hidrolizados de diferentes tipos de biomasa lignocelulosica, respectivamente. El alto contenido en aceite (mas de un 60% del peso celular) convierte a estas cepas en unas excelentes candidatas a la hora de ser utilizadas como hospedadoras para la produccion de compuestos derivados de los acidos grasos, incluyendo los alcoholes

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grasos. Ademas, el documento WO2014198988 describe la obtencion, mediante rondas de mutacion y selection, de la cepa CECT 13085 capaz de metabolizar de forma mas rapida la xilosa.

Sin embargo, a pesar de estos avances, permanece el reto de lograr un alto rendimiento, production y productividad para los alcoholes grasos y lograr que estos procesos puedan llegar a ser competitivos con los utilizados hoy en dia.

SUMARIO DE LA INVENCION

Los autores de la presente invention han modificado geneticamente un microorganismo de la especie Rhodosporidium toruloides, mediante la insertion de un gen que codifica una enzima con actividad acil-Coa reductasa que permite producir alcoholes grasos. La produccion de alcoholes grasos mediante el empleo de dicho microrganismo permite alcanzar rendimientos elevados por encima de 1 g/L en el caldo de cultivo.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invencion se relaciona con un microorganismo de la especie Rhodosporidium toruloides modificado geneticamente con un gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa, en donde dicha enzima tiene capacidad de producir alcoholes grasos.

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con un procedimiento para obtener una biomasa microbiana rica en alcoholes grasos que comprende:

i) cultivar el microorganismo de la invencion en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrogeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo; y

ii) separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con una biomasa microbiana rica en alcoholes grasos obtenible segun el procedimiento para obtener alcoholes grasos de la invencion.

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con un procedimiento para obtener una preparation enriquecida en alcoholes grasos que comprende:

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i) cultivar el microorganismo de la invention en un medio de cultivo que

comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de

nitrogeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho

microorganismo;

ii) separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo; y

iii) extraer los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del medio de cultivo obtenidos en la etapa (ii)

En otro aspecto, la invencion se relaciona con un procedimiento para obtener biosurfactantes que comprende:

i) cultivar un microorganismo de la invencion en un medio de cultivo que

comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de

nitrogeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho

microorganismo;

ii) separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo;

iii) extraer los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del caldo de cultivo obtenidos en la etapa (ii); y

iv) convertir la mezcla de alcoholes grasos obtenidos en la etapa (iii) en biosurfactantes.

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con el uso del microorganismo segun la invencion para obtener una biomasa microbiana enriquecida en alcoholes grasos segun el primer procedimiento de la invencion.

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con el uso del microorganismo segun la invencion para obtener una preparation rica en alcoholes grasos segun el segundo procedimiento de la invencion.

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con el uso del microorganismo segun la invencion para obtener biosurfactantes segun el tercer procedimiento de la invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: plasmido integrativo pNEOL102

Figura 2: Production de alcoholes grasos en diferentes medios de cultivo.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

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Microorganismo de la invention

En un primer aspecto, la presente invencion se relaciona con un microorganismo, en adelante “microorganismo de la invencion”, en donde el microorganismo pertenece a la especie Rhodosporidium toruloides modificado geneticamente con un gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa, en donde dicha enzima tiene capacidad de producir alcoholes grasos.

El termino “microorganismo” o “microbio”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un organismo microscopico con capacidad de producir alcoholes grasos, que puede ser unicelular o multicelular. En particular, el microorganismo de la invencion es una levadura de la especie Rhodosporidium toruloides.

El termino “gen”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena de desoxirribonuclotidos que codifica una protema. En el caso concreto de la invencion, dicho termino se refiere a una cadena de desoxirribonucleotidos que codifica una enzima acil-CoA reductasa con capacidad de producir alcoholes grasos.

El termino “enzima”, en el contexto de la presente invencion, se refiere a una protema que funciona como un catalizador altamente selectivo, acelerando tanto la velocidad como la especificidad de la reaction metabolica para la cual es espedfica.

En concreto, el microorganismo de la invencion es un microorganismo modificado geneticamente. El termino “microorganismo modificado geneticamente” como se usa en el presente documento, se refiere a un microorganismo cuyo material genetico se ha alterado usando tecnicas de ingenieria genetica. Segun esto, dicho microorganismo geneticamente modificado expresa una enzima que tiene una actividad acil-CoA reductasa, comparado con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa. En el contexto de la presente invencion, la enzima que tiene actividad acil-CoA reductasa puede estar codificada por un gen que codifica dicha enzima en otro organismo. Generalmente, el gen que codifica una enzima que tiene actividad acil-CoA reductasa se puede introducir en el microorganismo en cualquier forma adecuada, por ejemplo, comprendido en un vector, un plasmido o como acido nucleico desnudo. Despues de ser introducido en el microorganismo, el gen se puede expresar de modo exogeno si se expresa en un vector/plasmido en el microorganismo [es decir, fuera de del/de los cromosoma(s) microbiano(s)], o se puede incorporar en el/los cromosoma(s) microbiano(s) por recombination aleatoria (ectopica) u

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homologa o cualquier otro metodo adecuado conocido en el estado de la tecnica. Tecnicas apropiadas que permiten la transformation genetica en levaduras incluyen pero no estan limitadas a:

- Transformacion de esferoplastos que supone eliminar la pared celular de la levadura y poner en contacto los esferoplastos con el plasmido en presencia de PEG.

- Transformacion con Li+, que supone el tratamiento de las celulas de levadura con cationes alcalinos monovalentes (Na+, K+, Rb+, Cs+ y Li+) en combination con PEG para estimular la captation de ADN por las celulas intactas.

- Bombardeo genico que supone bombardear las celulas con microproyectiles recubiertos con el ADN exogeno.

- Electroporation, que supone administrar pulsos electricos a las levaduras que produce la apertura de poros en la membrana de los esferoplastos y celulas de levadura intactas.

- Transformacion mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT) se basa en el empleo de la capacidad de transferencia genica que A. tumefaciens posee de forma natural.

Los transformantes se hacen crecer en un medio nutriente adecuado y bajo condiciones de seleccion para asegurar la retencion del ADN endogeno. La insercion del gen que codifica una acil-CoA reductasa en dichos transformantes puede determinarse mediante cualquier tecnica de biologia molecular apropiada para ello, por ejemplo, mediante Southern blot o PCR. Metodos convencionales de detection y cuantificacion de la expresion de un gen pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y cols., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.

El termino “acil-CoA reductasa”, o "reductasa de acil-CoA grasos” tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a polipeptidos que tienen la capacidad de reducir las moleculas de acil-CoA grasos a los a los correspondientes alcoholes (E.C. 1.2.1.50). Las acil-CoA que reducen las moleculas de acil-CoA grasos a los correspondientes alcoholes grasos catalizan la reaction mediante la reduction de cuatro electrones de las formas activas de los acidos grasos para dar lugar a alcoholes grasos.

El termino “alcohol graso”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a alcoholes de cadena de entre 4 a 26 atomos de carbono, derivados de grasas y aceites naturales. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de alcoholes grasos de acuerdo a la presente invention incluyen, 1-hexanol (o alcohol hexilico), hepatanol (o alcohol heptflico). 1-octanol (o alcohol caprilico), 2-etilhexanol, 1-nonanol (o alcohol pelargonico), 1-decanol (o alcohol caprico o

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alcohol dedlico), dodecanol (alcohol laurico), 1-tridecanol (alcohol tridecflico), 1- tetratdecanol (alcohol miristflico), 1-pentadecanol (alcohol pentadecflico), 1-hexadecanol (alcohol cetflico o alcohol palmrtico), cis-9-hexadecen-1-ol (o alcohol palmitoleico, 1- heptadecanol (o alcohol pentadecflico), 1-octadecanol (o alcohol estearilico o alcohol octadecflico), cis-9-octadecen-1ol (o alcohol oleico), 1 nonadecanol (o alcohol nonadecflico), 1-eicosanol (o alcohjol araquidflico) , docosanol (o alcohol behenico), 1-tetracosanol (alcohol lignocerico) o 1 hecacosanol (o alcohol cerico).

En una realization particular y preferida de la invention, el gen que codifica la enzima que tiene actividad acil-CoA reductasa tiene codones optimizados, para la expresion en el microorganismo recombinante, es decir en R. tornloides. En la tecnica se conocen codones que pueden ser empleados para la expresion de genes en R. tornloides. Ejemplos ilustrativos no limitativos de codones optimizados que pueden ser empleados para la expresion de genes en incluyen: UUU, UUC, UUA,UUG,CUU, CUC, CUA, AUU,AUC, AUG, GUU,GUC, GUA o GUG (Codon usage database, data source: NCBI-GenBank). En este contexto de la invencion, el microorganismo geneticamente modificado se cultiva en las condiciones adecuadas que permitan la expresion del gen que tiene actividad acil-CoA reductasa y de esta manera, producir alcoholes grasos. Los medios de cultivo adecuados para el crecimiento apropiado de diferentes microorganismos se conocen bien en la tecnica. Normalmente dichos medios de cultivo comprenden fuentes de carbono, como, por ejemplo, glucosa, xilosa, sacarosa, glicerina, y fuentes de nitrogeno apropiadas como, por ejemplo, extracto de levadura, peptona, sales de amonio, flquido macerado de maiz, urea o glutamato sodico.

Preferiblemente, dicho gen se introduce en un vector de expresion o construction de ADN replicativa que permite la expresion del gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa segun la presente invencion y que incluye una unidad transcripcional que comprende el ensamblaje de (1) elemento(s) genetico(s) que desempena(n) un papel regulador en expresion genica, por ejemplo, promotores, operadores o potenciadores, operativamente unidos a (2) la secuencia del gen que codifica una enzima con actividad acil- CoA reductasa segun la invencion y que se transcribe a ARN mensajero y se traduce a protema y (3) secuencias adecuadas para iniciar y terminar la transcription y la traduction. Los vectores que se pueden usar en el contexto de la presente invencion normalmente incluyen un marcador genetico, un origen de replication en bacterias o levaduras, sitios multiples de donation y un marcador genetico. El marcador genetico es habitualmente un gen que confiere resistencia a un antibiotico, por ejemplo ampicilina o geneticina, o

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alternativamente, un marcador auxotrofico en el caso de levaduras. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripcion. La capacidad de replicarse en un huesped, habitualmente conferida por un origen de replication, y un gen de selection para facilitar el reconocimiento de transformantes se pueden incorporar adicionalmente. Las regiones de ADN estan operativamente unidas cuando estan funcionalmente relacionadas entre si. Por ejemplo, el ADN para un peptido senal esta operativamente unido al ADN para un polipeptido si se expresa como un precursor que participa en la secretion del polipeptido; un promotor esta operativamente unido a una secuencia codificante si controla la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union a ribosomas esta operativamente unido a una secuencia codificante si esta colocado de modo que permita la traduction. Las secuencias reguladoras utiles para la presente invention pueden ser secuencias promotoras nucleares o, de forma alternativa, secuencias potenciadoras y/o secuencias reguladoras que aumentan la expresion de la secuencia de nucleotidos, secuencias supresoras, sitios de inicio transcripcional, sitios de parada transcripcional, sitios de poliadenilacion y similares. En la tecnica se conocen un gran numero de secuencias de control de la expresion y se pueden utilizar segun la presente invencion.

En el caso de celulas eucariotas comprenden normalmente promotores que aseguran el inicio de la transcripcion y opcionalmente senales de poli-A que aseguran la termination de la transcripcion y estabilizacion del transcrito. Promotores comunmente usados son el promotor del virus del mosaico de la escrofularia, el promotor de poliubiquitina y el promotor de la actina para la expresion ubicua. El promotor puede ser constitutivo o inducible. Si se desea la expresion constante del gen, entonces se usa un promotor constitutivo. Se usa un promotor "inducible” cuando se desea una expresion regulada del gen dependiendo de las condiciones fisiologicas o de desarrollo. Los promotores tipicos para la expresion en celulas de levadura incluyen, pero no estan limitados a:

- Promotores constitutivos tales como, por ejemplo, el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH1), el promotor del factor de elongation 1-a (TEF) y el promotor del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa (TPI), el promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GPD) y el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa (GPK), el promotor de MRP7 y el promotor de la alcohol, oxidasa (AOX1).

- Promotores inducibles tales como, por ejemplo, el promotor de la metalotionema (CUP1), cuya expresion esta regulada por medio de la adicion de cobre al medio de cultivo, el promotor del gen que codifica el gen FUS1 o el gen FUS2, cuya expresion

se activa en presencia de feromonas (al factor a) como se describe en el documento

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US5063154, el promotor TET, cuya expresion se regula en presencia de tetraciclinas, los promotores GAL1-10, GALL, GALS que se activan en presencia de galactosa, el promotor VP16-ER, inducible por estrogenos, y el promotor de fosfatasa (PH05) cuya expresion se activa en presencia de fosfato y el promotor de la protema de choque termico HSP150, cuya expresion se activa a alta temperatura.

- Promotores represibles tales como, por ejemplo, el promotor del gen de la enolasa (ENO-1) de S. cerevisiae, cuya expresion se puede reprimir cuando el microorganismo se cultiva en una fuente de carbono no fermentable, asi como promotores cuya expresion esta sometida a represion de glucosa de modo que la expresion se reprimira cuando parte de la lactosa se haya hidrolizado y la concentracion de glucosa en el medio empiece a aumentar, el promotor de la gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de R.toruloides, y el promotor de galactoquinasa (GAL1).

Preferiblemente, en esos casos en los que se sospecha que la protema heterologa es toxica para la celula huesped, el promotor usado para regular su expresion es aconsejablemente un promotor inducible de modo que la expresion de la protema de interes se pueda retrasar hasta que se hayan alcanzado suficientes niveles de biomasa. En una forma de realization preferida, el gen que codifica para una enzima acil-CoA reductasa con capacidad para producir alcoholes grasos de acuerdo a la presente invention, se expresa bajo el control de un promotor constitutivo. Al construir plasmidos de expresion adecuados, las secuencias de termination asociadas con estos genes tambien se ligan en el vector de expresion 3’ de la secuencia deseada que se va a expresar para proporcionar poliadenilacion del ARNm y terminacion. Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de transcripcion controlada por condiciones de crecimiento son la region promotora para alcohol deshidrogenasa-2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrogeno, y la anteriormente mencionada gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilization de maltosa y galactosa. Cualquier vector plasmidico que contenga un promotor, origen de replication y terminacion compatibles con levadura, es adecuado.

Los vectores de levaduras adecuados para la presente invencion se pueden basar en los siguientes tipos de plasmidos:

- Plasmidos autonomos multicopia: estos plasmidos contienen secuencias que permiten generar multiples copias de dichos vectores. Estas secuencias pueden ser

la denominada 2^ tal como la que aparece en plasmidos episomales (YEp o

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plasmidos episomales de levadura) o secuencias de tipo ARS tales como las que aparecen en plasmidos de replication (YRps o plasmidos de replication de levadura), Los ejemplos de vectores basados en plasmidos de este tipo son p426GPD, p416GPD, p426TEF, p423GPD, p425GPD, p424GPD o p426GAL, YEp24 y YEplac.

- Plasmidos autonomos de copia unica: plasmidos que contienen la secuencia de replicacion autonoma ARS1 y una secuencia centromerica (CEN4). Los plasmidos de este tipo incluyen los plasmido centromericos (YCps o plasmidos centromericos de levadura).

- Plasmidos de integration: plasmidos que pueden ser integrados en el genoma de la celula huesped. Los plasmidos de este tipo incluyen plasmidos de integracion (YIPs o plasmidos de integracion de levadura). Los ejemplos de vectores basados en plasmidos de este tipo son pRS303, pRS304, pRS305 o pRS306 y similares.

Generalmente, todos los vectores mencionados por Sikorski (“Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae”, en Plasmid, A Practical Approach, Ed. K. G. Hardy, IRL Press, 1993) y por Ausubel et al. ("Yeast Cloning Vectors and Genes” Current Protocols in Molecular Biology, Section II, Unidad 13.4, 1994) son utiles en el contexto de la presente invencion.

En otra forma de realization particular, el gen que codifica una enzima con actividad acil- CoA reductasa de acuerdo a la presente invention, tiene codones optimizados para la expresion en R. toruloides. El termino “codones optimizados”, como se usa en el presente documento, se refiere a la alteration de codones en moleculas de acidos nucleicos para reflejar el uso de codones tipico del organismo huesped sin alterar el polipeptido codificado por el ADN, para mejorar la expresion. Hay varios metodos y herramientas de software conocidas en la tecnica para la optimization de codones. Vease, Narum D, et al., Infect. Immun. 2001; 69(12):7250-7253), Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 2002; 24(1):18- 24, Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39(50):15399-15409, y Humphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2):252-264.

En una realizacion aun mas particular y preferida de la invencion, dicho gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa se expresa bajo control del promotor glicerol-3- fosfato deshidrogenasa de R. toruloides y dicho gen contiene codones optimizados para la expresion en R. toruloides.

Realizaciones preferidas de la invencion contemplan el empleo de secuencias terminadoras. El termino “secuencia terminadora”, tal y como se utiliza en la presente invencion, ha ce

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referencia a una secuencia de ADN localizada en el extremo de una unidad transcripcional que senala la termination de la transcription. Los terminadores son secuencias de ADN sin traducir que contienen una senal de poliadenilacion, que facilita la adicion de secuencias de poliadenilato al extremo 3'de un transcrito primario. Las secuencias terminadoras son conocidas por el experto en la materia. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de secuencias terminadoras que pueden emplearse de acuerdo a la presente invention incluyen el terminador del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (t-nos) o el terminador del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). En una realization todavia mas preferida de la invencion el terminador es el terminador del gen nos de A. tumefaciens.

Como se ha mencionado anteriormente, la invencion contempla formas de realizacion en donde el vector empleado para la expresion del gen que codifica la acil-CoA reductasa en R. toruloides comprende un marcador genetico, como por ejemplo, un gen que confiere resistencia a un antibiotico. Si se desea la expresion he dicho gen puede optimizarse para la expresion en R. toruloides mediante el empleo de secuencias promotoras, terminadoras y codones optimizados para la expresion el levaduras. Ejemplos de dichas secuencias han sido mencionados anteriormente en el presente documento. En una realizacion preferida, dichas secuencias promotoras y terminadoras son distintas a los promotores y terminadores empelados para la correcta expresion del gen que codifica la enzima acil-CoA reductasa con capacidad de producir alcoholes grasos en R. toruloides.

En una realizacion particular, dicho gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa se selecciona del gen acil-CoA reductasa aislado de Marinobacter aquaqeolei que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. El termino "es de” o "aislado de” significa que el gen o la enzima codificada por dicho gen esta sustancialmente separado o purificado de un gen o la enzima codificada en la celula del organismo en el que el dicho gen o polipeptido codificado se produce de forma natural. Por tanto, el termino aislado abarca genes purificados por metodos de purification estandar para acidos nucleicos o protemas codificadas. El termino tambien comprende genes o enzimas codificadas por dichos genes preparados por expresion recombinante en una celula huesped asi como acidos nucleicos quimicamente sintetizados o el polipeptido codificado de los mismos.

El termino “variante funcionalmente equivalente” tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a todos aquellos polipeptidos derivados de la secuencia de la acil-CoA reductasa mostrada en la SEQ ID NO: 1 mediante modification, insertion y/o deletion de

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uno o mas aminoacidos siempre y cuando se mantenga sustancialmente la funcion de dicha enzima. En concreto, las variantes funcionalmente equivalentes mantendran la capacidad producir alcoholes grasos a partir de los acil-CoA grasos correspondientes. Metodos para determinar la production de alcoholes grasos a partir de acil-CoA grasos son conocidos en el estado de la tecnica. A modo ilustrativo, la determination de la produccion de acidos grasos puede llevarse a cabo mediante cualquier metodo que permita detectar componentes organicos en una muestra como por ejemplo, metodos cromatograficos que incluyen cromatografia de gases y cromatografia de masas. El ejemplo 5 de la presente solicitud detalla la determinacion de alcoholes grasos en una muestra mediante cromatografia de gases-masas. Si es necesario, puede llevarse a cabo una extraction previa de los alcoholes grasos del interior celular mediante cualquier metodo apropiado para ello. Tecnicas que permiten la extraccion de alcoholes grasos del interior celular son conocidas en el estado de la tecnica y comprenden metodos de extraccion mecanica como filtration o centrifugation y metodos de extraccion solido-liquido.

Variantes funcionalmente equivalentes de dicha acil-CoA reductasa incluyen aquellas que muestran al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%,al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia de aminoacidos con respecto a la secuencia de acil-CoA reductasa indicada anteriormente. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse por metodos convencionales mencionados en el contexto del primer metodo de la invention tales como, por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. Basic Local Alignment Search Tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10). El experto en la materia entendera que las secuencias de aminoacidos a las que se hace referencia en esta description pueden estar modificadas quimicamente, por ejemplo, mediante modificaciones quimicas que son fisiologicamente relevantes, tales como, fosforilaciones, acetilaciones, etc.

En una realization preferida de la invencion, dicho gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa consiste en la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1

En una realizacion particular, El microorganismo de la invencion se refiere a un mutante de la cepa Rhodosporidium tornloides CECT 13085. El termino “cepa”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una variante genetica o subtipo de un organismo determinado.

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La cepa Rhodosporidium toruloides CECT 13085 se refiere a un microorganismo de la especie Rhodosporidium toruloides que tiene la capacidad de crecer presencia de hidrolizados de biomasa sin detoxificar y/o tiene la capacidad de metabolizar xilosa. Dicha cepa esta depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con fecha 7 de Mayo de 2013. Las caracteristicas de dicha cepa se describen en la solicitud de patente ES2526617A1.

En una realization particular, el gen DAG1 del microorganismo de la invention no es funcional. El termino “DAG1” o “DGAT1”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica la enzima diacilglicerol acil transferasa y la isoforma que cataliza la etapa final de la smtesis de trigliceridos a partir de diacilglicerol y acil-CoA grasos y que presenta dos isoformas DAG1 y DAG2. La isoforma 1 cataliza dicha reaccion a concentraciones altas de cloruro de magnesio mientras que la isoforma 2 lo hace a concentraciones bajas. DAG1 tambien esta implicada en la transferencia de residuos de acil- CoA a moleculas de retinol. La secuencia de la protema DAG1 de R. toruloides esta depositada en la base de datos Uniprot bajo el numero de acceso BAH85840.1 (version del 22 de septiembre de 2009).

En una realizacion preferida, la expresion “el gen DAG1 no es funcional” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a que dicho gen codifica una protema DAG1 cuya capacidad de realizar la smtesis de trigliceridos a partir de diacilglicerol y acil-CoA grasos, esta disminuida con respecto a la capacidad de llevar a cabo dicha smtesis por una protema codificada por dicho gen DAG1 funcional. De acuerdo a la presente invencion, el microorganismo de la invencion presenta un gen DAG1 no funcional si la capacidad de sintetizar trigliceridos por la protema DAG1 codificada por dicho gen DAG1 no funcional esta reducida al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% al menos un 90%, al menos un 95% o mas con respecto a dicha smtesis realizada por un gen DAG1 funcional. El gen DAG1 de R. toruloides, preferiblemente de R. toruloides CECT 13085 puede ser no funcional consecuencia de una mutation en la secuencia de dicho gen.

En otra realizacion preferida de acuerdo a la presente invencion, la expresion “gen DAG1 no

es funcional” tambien se refiere a que dicho gen esta ausente en el genoma del

microorganismo de la invencion, consecuencia de una deletion total de la secuencia de

dicho gen. En una realizacion preferida de la invencion, el microrganismo de la invencion

presenta el gen DAG1 delecionado en su totalidad. La determination de la funcionalidad del

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gen DAG1 en R. toruloides, preferiblemente en R. toruloides CECT 13085, pude llevarse a cabo mediante cualquier metodo conocido en el estado de la tecnica que permita detectar la actividad enzimatica de DAG1.

El termino “mutation” se refiere a sustituciones, inserciones o deleciones que se producen a nivel de la secuencia nucleotidica. Por “insertion”, se entiende la ganancia de uno o mas nucleotidos. Dentro de la insercion se encuentra las duplicaciones que consisten en la repetition de un segmento de ADN del interior de una secuencia, pudiendo producirse tres (triplication) o mas veces. Por “deletion” tal y como se usa el presente documento, se entiende la perdida de uno o mas nucleotidos. Las deleciones pueden ser totales o parciales. Por “delecion total” de la secuencia de un gen, segun se emplea en la presente invention, se refiere a la perdida del 100% de los nucleotidos que constituyen la secuencia nucleotidica de dicho gen. Por “delecion parcial” de la secuencia de un gen, segun se emplea en la presente invencion se refiere a la perdida de al menos 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 99% de los nucleotidos que componen la secuencia nucleotidica de dicho gen. Como el experto en la materia sabe, en la tecnica existen metodos apropiados para realizar mutaciones en la secuencia de un gen como la mutagenesis de sitio dirigido por PCR o mutagenesis de sitio dirigido por PCR en un plasmido.

En otra realization particular, el gen LRO1P del microrganismo de la invencion no es funcional. El termino “LRO1P”, tal y como se utiliza en el presente documento se refiere a la fosofolipido acilglicerol aciltransferasa. La reaction catalizada por dicha enzima comprende transferir un residuo de acil-CoA de un fosfolipido a una molecula de diacilglicerol dando como resultado una molecula de triacilglicerol y un lisofosfolipido. La secuencia de la protema LRO1P de R. toruloides esta depositada en la base de datos Uniprot bajo el numero de acceso RHTO_01945 (version del 29 de mayo de 2013).

En una realizacion preferida, la expresion “el gen LROP1 no es funcional” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a que dicho gen codifica una protema LROP1 cuya capacidad de realizar la smtesis de trigliceridos a partir de un fosfolipido y acil-CoA grasos, esta disminuida con respecto a la capacidad de llevar a cabo dicha smtesis por una protema codificada por dicho gen LROP1 funcional. De acuerdo a la presente invencion, el microorganismo de la invencion presenta un gen LROP1 no funcional si la capacidad de sintetizar trigliceridos por la protema LROP1 codificada por dicho gen LROP1 no funcional esta reducida al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% al

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En otra realization preferida, la expresion "gen LROP1 no es funcional” tambien se refiere a que dicho gen esta ausente en el genoma del microorganismo de la invention, consecuencia de una deletion total de la secuencia de dicho gen. En una realizacion preferida de la invencion, el microrganismo de la invencion presenta el gen LROP1 delecionado en su totalidad. La determination de la funcionalidad del gen LROP1 en R. tornloides, preferiblemente en R. tornloides CECT 13085, puede llevarse a cabo mediante cualquier metodo conocido en el estado de la tecnica que permita detectar la actividad enzimatica de LROP1.

En otra realizacion particular, el gen DAG3 del microrganismo de la invencion no es funcional. El termino “DAG3””. “DGAT3”, o “delta-1-pirrolm carboxilato deshidrogenasa” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a la isoforma soluble de la enzima diacilglicerol acil transferasa que cataliza la etapa final de la smtesis de trigliceridos a partir de diacilglicerol y acil-CoA grasos y cuya localization es citosolica. La secuencia de la protema DAG3 de R. tornloides esta depositada en la base de datos Uniprot bajo el numero de acceso RTHO_07378 (version del 29 de mayo de 2013).

En una realizacion preferida la expresion “el gen DAG3 no es funcional” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a que dicho gen codifica una protema DAG3 cuya capacidad de realizar la smtesis de trigliceridos a partir de un fosfolipido y acil-CoA grasos, esta disminuida con respecto a la capacidad de llevar a cabo dicha smtesis por una protema codificada por dicho gen DAG3 funcional. De acuerdo a la presente invencion, el microorganismo de la invencion presenta un gen DAG3 no funcional si la capacidad de sintetizar trigliceridos por la protema DAG3 codificada por dicho gen DAG3 no funcional esta reducida al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% al menos un 90%, al menos un 95% o mas con respecto a dicha smtesis realizada por un gen DAG3 funcional. El gen DAG3 de R. tornloides, preferiblemente de R. tornloides CECT 13085 puede ser no funcional consecuencia de una mutacion en la secuencia de dicho gen.

En otra realizacion preferida, la expresion “gen DAG3 no es funcional” tambien se refiere a que dicho gen esta ausente en el genoma del microorganismo de la invencion, consecuencia de una delecion total de la secuencia de dicho gen. En una realizacion

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preferida de la invention, el microrganismo de la invention presenta el gen DAG3 delecionado en su totalidad. La determination de la funcionalidad del gen DAG3 en R. tornloides, preferiblemente en R. tornloides CECT 13085, puede llevarse a cabo mediante cualquier metodo conocido en el estado de la tecnica que permita detectar la actividad enzimatica de DAG3.

En una realization particular, el gen DAG1, y/o el gen LROP1 y/o el gen DAG3 del microorganismo de la invencion no es funcional.

Procedimiento para obtener una biomasa microbiana rica en alcoholes grasos

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con un procedimiento para obtener una biomasa microbiana rica en alcoholes graos, en adelante “primer procedimiento de la invencion”, que comprende

i) cultivar el microorganismo de la invencion en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrogeno, en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo, y

ii) separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo,

El termino “biomasa microbiana”, tal y como se utiliza en la presente invencion, se refiere al material biologico de organismos vivos o recientemente vivos, en particular del microorganismo de la invencion, y a la materia organica originada en un proceso biologico, espontaneo o provocado, utilizable como fuente de energia. Como una fuente de energia renovable, la biomasa puede ser utilizada directa o indirectamente, previa conversion en otro tipo de producto tal como biocombustible. En el caso particular de la presente invencion, la biomasa microbiana es rica en alcoholes grasos.

El termino “biomasa microbiana rica en alcoholes grasos”, tal y como se utiliza en la presente invencion, se refiere a una biomasa microbiana con un contenido en alcoholes grasos de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, o al menos el 90% de su peso seco total.

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El termino “microorganismo de la invention”, as^ como las realizaciones particulares y preferidas del mismo han sido detallados en el contexto del primer aspecto de la invencion y aplican de igual manera al primer procedimiento de la invencion.

En una primera etapa, el primer procedimiento de la invencion comprende cultivar el microorganismo de la invencion en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrogeno, en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo.

El termino “cultivar”. tal y como se utiliza en la presente invencion, se refiere al procedimiento de sembrar, mantener y hacer que se desarrollen microorganismos sobre medios de cultivo adecuados.

El termino “medio de cultivo”, tal y como se utiliza en la presente invencion, se refiere a un medio liquido, semisolido o solido que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH, temperatura y oxigenacion, el crecimiento de microorganismos. En una forma de realization particular, el medio de cultivo es un medio liquido. Medios de cultivo adecuados para cultivar microorganismos son ampliamente conocidos en la materia. Entre otros nutrientes, el medio de cultivo comprende una fuente de carbono y una fuente de nitrogeno. Ejemplos no limitativos de medios de cultivo adecuados para llevar a cabo el primer procedimiento de la invencion incluyen medio MEM, medio YPD, medio MBO3-1 (composition: NH4NO3 0.7 g/L, CaCl2.2H2O 0.4 g/L, MgSO4.7H2O 0.4 g/L, KH2PO4 0.75 g/L, liquido macerado de maiz 9,6 g/L a pH6, glucosa 110 g/L), medio MBO3-2 (composicion NH4NO3 0.7 g/L, CaCb.2H2O 0.4 g/L, MgSO4.7H2O 0.4 g/L, KH2PO4 0.75 g/L, liquido macerado de maiz 9,6 g/L a pH6, glicerina 110 g/L), medio MBO3-3 (composicion: extracto de levadura 10 g/L, glucosa 40 g/L, peptona 20 g/L), medio MBO3-4 (composicion: extracto de levadura 10 g/L, sacarosa 40 g/L, peptona 20 g/L), medio MBO3-5 (composicion NH4NO3 0.28 g/L, CaCl2.2H2O 0.4 g/L, MgSO4.7H2O 0.4 g/L, KH2PO4 0.75 g/L, extracto de levadura 1.5 g/L, sacarosa 40 g/L), medio MBO3-6 (composicion glucosa 70 g/L, xilosa 40 g/L, liquido macerado de maiz 19,2 g/L a pH6, acido acetico 4,5 g/L, acido formico 0,4 g/L, furfural 0,15 g/L), medio MBO3-7 (composicion: NH4NO3 0.28 g/L, CaCl2.2H2O 0.4 g/L, MgSO4.7H2O 0.4 g/L, KH2PO4 0.75 g/L, extracto de levadura 1.5 g/L, glucosa 40 g/L), o medio MBO3-8 ( composicion: glucosa 70 g/L, xilosa 40 g/L, liquido macerado de maiz 9,6 g/L a pH6).

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En una realization particular, la fuente de carbono es un hidrolizado de biomasa lignocelulosica.

El termino “hidrolizado de biomasa”, segun se usa en el presente documento, se refiere a cualquier producto de sacarificacion, que contiene los azucares producidos en el proceso de sacarificacion, los restos de biomasa no hidrolizada y las enzimas empleadas para la hidrolisis de dicha biomasa.

El termino “sacarificacion” o “hidrolisis de la biomasa”, segun se usa en el presente documento, se refiere a la production de azucares fermentables a partir de polisacaridos.

El termino “azucar fermentable”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a los oligosacaridos y monosacaridos que pueden ser empleados como fuente de carbono por un microorganismo en el proceso de fermentation para la obtencion de productos como etanol.

Los terminos “biomasa” y “sustrato de biomasa”, tal y como se utilizan en el presente documento, hacen referencia a cualquier material apropiado para su uso en reacciones de sacarificacion. Dichos terminos incluyen pero no estan limitados a materiales que comprenden celulosa (por ejemplo, biomasa celulosica, materia prima celulosica y sustrato celulosico), lignina o la combination de celulosa y lignina. La biomasa puede derivar de plantas, animales o microorganismos y pude incluir, sin estar limitada, a residuos agricolas, industriales y forestales, desechos agricolas y municipales y cultivos terrestres y acuaticos con fines energeticos. Ejemplos de sustratos de biomasa incluyen pero no estan limitados a madera, pasta de madera, pasta de papel, fibra de maiz, grano de maiz, mazorcas de maiz, residuos de cosechas como hojas de maiz, rastrojo de maiz, pastos, trigo, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, arroz, paja de arroz, mijo, residuos de papel, papel, residuos de procesamiento de pulpa, lenosas o herbaceas, pulpa de fruta o verdura, productos de destilado del grano, hierbas, cascaras de arroz, algodon, canamo, lino, sisal, bagazo de cana, sorgo, soja, mijo, componentes obtenidos de la molienda de granos, arboles, ramas, raices, hojas, virutas de madera, aserrin, arbustos y matas, verduras, frutas y flores y cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la biomasa comprende pero no esta limitada a plantas cultivadas (por ejemplo, hierbas, incluyendo grammeas C4, tales como pasto varilla, hierba espinal, hierba de centeno, Miscanthus, hierba cinta o combinaciones de las mismas), residuos de procesamiento del azucar, por ejemplo pero sin limitarse a, bagazo [por ejemplo, bagazo de cana de azucar, pulpa de remolacha (por

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ejemplo remolacha azucarera), o una combination de las mismas], residuos agricolas (por ejemplo rastrojo de soja, rastrojo de maiz, fibra de maiz, paja de arroz, azucar de cana de paja, arroz, cascaras de arroz, paja de cebada, mazorcas de ma^z, paja de trigo, paja de canola, paja de avena, cascaras de avena, fibra de maiz, canamo, lino, sisal, algodon o cualquier combinacion de los mismos), pulpa de fruta, pulpa de vegetales, productos de destilado del grano, biomasa forestal (por ejemplo madera, pasta de madera, fibra, fibras de pasta de madera reciclada, serrin, madera dura, tal y como madera de alamo, madera blanda o una combinacion de las mismas).

En algunas formas de realization, la biomasa comprende material de desecho celulosico y/o residuos forestales incluyendo pero sin estar limitada a, papel y residuos de procesamiento de pasta de papel, residuos municipales de papel, papel de periodico, carton y similares. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una especie de fibra mientras que en otras realizaciones alternativas, la biomasa comprende una mezcla de fibras que se originan a partir de diferentes biomasas. En algunas realizaciones, la biomasa puede comprender tambien plantas transgenicas que expresan ligninasa y/o celulasas.

El termino “biomasa” incluye cualquier material biologico vivo o muerto que contiene polisacaridos como sustratos incluyendo pero sin estar limitado a celulosa, almidon, otras formas de polimeros de carbohidratos de cadena larga y combinaciones de los mismos. Puede o no estar formado completamente a partir de glucosa o xilosa, y opcionalmente, puede contener otros monomeros de pentosas o hexosas. La xilosa es una aldopentosa que contiene cinco atomos de carbono y un grupo aldehido. Es el azucar precursor de la hemicelulosa y es a menudo, el componente principal de la biomasa. En algunas realizaciones, el sustrato se pone en suspension antes del pretratamiento. En algunas realizaciones, la consistencia de la suspension es de entre aproximadamente 2% y aproximadamente 30% y mas tipicamente entre aproximadamente 4% y aproximadamente 15%. En algunas realizaciones la suspension se lava o se trata con acido antes del pretratamiento. En algunas formas de realizacion, la suspension se deshidrata mediante cualquier metodo adecuado para reducir el consumo de agua y de productos quimicos antes del pretratamiento. Ejemplos de dispositivos de deshidratacion incluyen, pero no se limitan a prensas de tornillo a presion, filtros presurizados y extrusoras.

Un sustrato de biomasa esta “pretratado” cuando ha sido sometido a procedimientos fisicos y/o quimicos para facilitar la sacarificacion. En algunas realizaciones, el sustrato de biomasa es “pretratado” o “tratado” para aumentar la susceptibilidad de dicha biomasa a la hidrolisis

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de la celulosa mediante el empleo de metodos conocidos en el estado de la tecnica, tales como metodos de pretratamiento fisico-qwmicos (por ejemplo, tratamiento con amonio, pretratamiento con acido diluido, pretratamiento con alcalis diluida, exposition a disolventes, explosion de vapor, molienda, extrusion), metodos de pretratamiento biologico (por ejemplo, la aplicacion de microorganismos lignina-solubilizantes) y combinaciones de los mismos.

La molienda consiste en un proceso de trituration de la materia vegetal hasta su reduction a particulas de diferentes tamanos que pueden ser separadas por procedimientos mecanicos.

La extrusion es un procedimiento mediante el cual el material vegetal es forzado a fluir bajo una o mas de una variedad de condiciones de mezclado, calentamiento y cizallamiento, a traves de una boquilla disenada para dar forma o expandir los ingredientes. Puede realizarse en frio donde el material se extruye sin expansion o en caliente o en caliente, donde las macromoleculas de los componentes pierden su estructura nativa discontinua y se forma una masa continua y viscosa que dextriniza y gelatiniza el almidon, se desnaturalizan las protemas, se inactivan las enzimas responsables de posibles deterioros, se destruyen algunos compuestos no nutricionales y se destruye al carga microbiana.

La hidrolisis acida consiste en tratar el material vegetal con acidos como acido sulfurico o acido clorhidrico empleando altas temperaturas. Mediante este proceso se favorece la hidrolisis de la celulosa pero requiere una neutralization del pH al finalizar la hidrolisis para permitir el crecimiento posterior de microrganismos.

El tratamiento con alcalis consiste en la adicion de bases diluidas a la biomasa vegetal. La eficiencia de este procedimiento depende del contenido de lignina de los materiales. El hidroxido de sodio diluido produce un hinchamiento, permitiendo un incremento en el area de superficie interna reduciendo el grado de polimerizacion y cristalinidad de la celulosa, causando la separation de las uniones estructurales entre la lignina y los carbohidratos.

El tratamiento con disolventes organicos consiste en utilizar solventes como el metanol, etanol o acetona para la ruptura de los enlaces de la lignina y la celulosa. La remocion de los solventes del sistema es necesaria, ya que inhiben el crecimiento de los organismos.

El tratamiento con liquidos ionicos (por ejemplo, con una disolucion de cloruro sodico) favorece la degradation de la celulosa debido a que los atomos de hidrogeno y oxigeno que

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forman parte de la misma interactuan por separado con el solvente de manera que se produce la ruptura de los enlaces puentes de hidrogeno entre las cadenas de celulosa.

El tratamiento con explosion de vapor consiste en tratar la biomasa con vapor saturado a una temperatura de 160-260°C (0,69-4,83 MPa) durante un cierto tiempo que dependera del tipo de material vegetal de origen.

El tratamiento con microorganismos lignina-solubilizantes consiste en tratar a la biomasa con microorganismos que producen enzimas con capacidad de degradar el material lignocelulosico como por ejemplo, Trichoderma reesei, Fusarium oxysporium, Piptopus betulinus, Penicillum echinalatum, Penicillum purpurogenum, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Anaeromyces sp., Caecomices sp., Cyllamcyces sp., Neocallimastix sp., Orpinomyces sp., Piromyces sp., Sporotrichum thermophile, Scytalidium thermophillu, Thermonospora cubata, Rhodosporillum rubrum, Cellulomonas fimi, Clostridium stercocarium, Bacillus polymyxa, Pyrococcus furiosus, Acidothermus cellulotycus, Saccharophagus degradans, etc.

Como el experto en la materia entendera, el hidrolizado de biomasa lignocelulosica puede obtenerse de diferentes origenes vegetales o subproductos de los mismos. El termino “subproducto”, tal y como se utiliza en la presente invencion, hace referencia al producto resultante de someter a dicho vegetal a procedimientos fisico y/o qdmicos. En una realizacion particular, el medio de cultivo comprende como fuente de carbono un hidrolizado de biomasa lignocelulosica que se obtiene a partir de paja de trigo, bagazo de cana de azucar, racimos vados de palma aceitera, poda de palma aceitera, fibra de palma aceitera, poda de vid, poda de olivo y combinaciones de las mismas. En una realizacion preferida, dicho hidrolizado procede de paja de trigo. En otra realizacion preferida, dicho hidrolizado procede de bagazo de cana. En otra realizacion preferida, dicho hidrolizado procede de racimos vados de palma aceitera.

Preferiblemente, dichas combinaciones de hidrolizados mencionadas anteriormente tienen al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40% de biomasa lignocelulosica hidrolizada.

En otra realizacion particular, la fuente de carbono empleada para el cultivo del microorganismo de la invencion procede de una mezcla de un hidrolizado de biomasa lignocelulosica y glicerol. Como entendera el experto en la materia, la proporcion de

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hidrolizado y glicerol podra variar para que las condiciones de crecimiento y de production lip^dica del microrganismo de la invention sean optimas. As^ preferiblemente la relation de hidrolizado de biomasa:glicerina es 60:40; mas preferiblemente, la relacion de hidrolizado de biomasa:glicerina es 70:30; y aun mas preferiblemente la relacion de hidrolizado de biomasa:glicerina es 75:25. El experto en la materia entendera que el glicerol pude obtenerse de diferentes origenes. En realizaciones preferidas de la invencion el glicerol como fuente de carbono proviene de una fuente de glicerina cruda. En otra realization preferida de la invencion, el glicerol se obtiene de aguas glicerinosas procedentes de procesos de esterificacion o transesterificacion de aceites o grasas.

En otra realizacion particular, la fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste en glucosa, glicerol, glicerina, melazas, xilosa, arabinosa, manosa, fructosa, acetato, almidones y combinaciones de las mismas. En una realizacion preferida, la fuente de carbono es glucosa. En otra realizacion preferida, la fuente de carbono es xilosa. En una realizacion mas preferida, la concentration de xilosa en el medio de cultivo es de 20 g/l. En otra realizacion mas preferida, la concentracion de xilosa en el medio es de 40 g/l.

En otra realizacion particular, la fuente de la fuente de nitrogeno se selecciona del grupo que consiste en extracto de levadura, peptona, liquido macerado de maiz, urea, glutamato sodico, diferentes fuentes de nitrogeno inorganico, como sales de amonio y combinaciones de las mismas. En una realizacion preferida, la fuente de nitrogeno es una sal de amonio, preferiblemente cloruro de amonio.

En otra realizacion particular, el medio de cultivo comprende inhibidores solidos. El termino “inhibidores solidos”, tal y como se utiliza en la presente invencion, hace referencia a compuestos que inhiben el metabolismo microbiano y afectan negativamente al crecimiento del organismo. En una forma de realizacion mas particular, dichos inhibidores solidos proceden de la degradation de la biomasa sin detoxificar (por ejemplo, proceden de la degradation de la lignocelulosa) y se seleccionan del grupo formado por acido acetico, acido formico, acido levulmico, acido cumarico, acido ferulico, acido suctinico, 4- hidroxibenzaldehido, vainillina, acido vanfllico, siringaldehido, acido 4-hidroxibenzoico, catecol, guaiacol, acido siringico, furfural, 5-hidroximetilfurfural y combinaciones de los mismos. Metodos adecuados para determinar la capacidad de una cepa de R. tornloides de crecer en presencia de inhibidores solidos procedentes de hidrolizados de biomasa sin detoxificar incluyen, por ejemplo, metodos que permiten determinar la adaptation del microorganismo a un medio de cultivo en el que se incrementa progresivamente la concentracion de inhibidores.

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Adicionalmente, si se desea, el medio de cultivo comprende otros medios espedficos para conseguir la production del metabolito deseado. Dichos medios de cultivo son ampliamente conocidos en el estado de la tecnica y prepararlos constituye practica rutinaria para el experto en la materia. Tipicamente, el cultivo es sometido un estres metabolico, de forma que produzcan y acumulen intracelularmente grandes cantidades de alcoholes grasos (intermediarios del metabolismo de los lipidos). El estres metabolico se puede inducir por un exceso de fuente de carbono en relation con la fuente de nitrogeno en el medio de cultivo. La acumulacion de trigliceridos se produce cuando una fuente de carbono se encuentra en exceso y la fuente de nitrogeno limita el crecimiento. Bajo estas condiciones de crecimiento, las celulas utilizan la fuente de carbono para la smtesis de lipidos neutros y sus intermediarios (acil-CoA). En realizaciones preferidas, el microorganismo de la invention esta manipulado geneticamente para favorecer la acumulacion de alcoholes grasos y obtener una biomasa rica en alcoholes grasos de acuerdo al primer procedimiento de la invencion, mediante la deletion del gen DAG1 y/o del gen LROP y/o del gen DAG3.

Los metodos para el cultivo de microorganismos son estandares en la tecnica y son ampliamente conocidos por el experto en la materia. El cultivo puede llevarse a cabo en matraces o biorreactores hasta alcanzar una produccion maxima de alcoholes grasos. La duration del cultivo es variable, aunque tipicamente el cultivo se realiza durante de 2 o 3 dias.

El termino “condiciones adecuadas para el crecimiento del microorganismo de la invencion”, tal y como se utiliza en la presente invencion, se refiere a condiciones que soportan el crecimiento del microorganismo de la invencion. Tales condiciones pueden incluir pH, nutrientes, temperatura, humedad, oxigenacion, ambiente y otros factores.

En una realization particular, las condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo de la etapa i) comprenden

- una temperatura en un rango entre 18 °C y 37 °C, preferentemente entre 23 °C y 32 °C, mas preferentemente entre 28 °C y 30°C,

- una concentration de oxigeno disuelto de al menos el 20%, y/o

- agitation constante.

Las condiciones en las que se lleva a cabo el cultivo del microorganismo de la invencion pueden ajustarse para aumentar el porcentaje de alcoholes grasos por unidad de peso seco en la biomasa microbiana resultante. Por ejemplo, es posible cultivar el microorganismo en

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presencia de concentraciones limitantes de algun nutriente, como por ejemplo, nitrogeno, fosforo o azufre a la vez que se mantiene un exceso de la fuente carbono. La limitation de la fuente de nitrogeno permite aumentar el rendimiento en alcoholes grasos de la biomasa por unidad de peso seco. El microorganismo se puede cultivar en condiciones limitantes de alguno de los nutrientes durante todo el tiempo de cultivo o se puede cultivar alternando ciclos de cultivo en concentraciones limitantes y ciclos de cultivo sin concentraciones limitantes.

El cultivo de acuerdo al primer procedimiento de la invention se lleva a cabo hasta que se ha alcanzado la cantidad de biomasa deseada y/o hasta que la biomasa contiene la cantidad intracelular de alcoholes grasos deseada. El experto entendera que es posible llevar a cabo una monitorizacion del cultivo para determinar la cantidad de biomasa alcanzada a lo largo del tiempo (por ejemplo, mediante la determination de la densidad optica a 600 nm o mediante la determinacion del peso solido por unidad de volumen de cultivo). El experto entendera que es posible llevar a cabo una monitorizacion del cultivo para determinar el porcentaje de alcoholes grasos que se acumulan en la biomasa a lo largo del tiempo (por ejemplo, mediante la determinacion de la cantidad de alcoholes por unidad de masa en el cultivo usando cualquier metodo apropiado para ello conocido en el estado de la tecnica).

Realizaciones preferidas de la invencion contemplan la utilization de medios de cultivo que favorecen la excrecion de un porcentaje de los metabolitos producidos por el microorganismo de la invencion. Aun mas preferiblemente, dichos medios de cultivo favorecen la excretion de al menos el 50% del total de alcoholes grasos producidos por el microorganismo de la invencion al medio de cultivo. Todavia mas preferiblemente, dichos medios de cultivo favorecen la excrecion de al menos el 60% del total de alcoholes grasos producidos por el microorganismo de la invencion al medio de cultivo. Todavia mas preferiblemente, dichos medios de cultivo favorecen la excrecion de al menos el 70% del total de alcoholes grasos producidos por el microorganismo de la invencion al medio de cultivo. Todavia mas preferiblemente, dichos medios de cultivo favorecen la excrecion de al menos el 80% del total de alcoholes grasos producidos por el microorganismo de la invencion al medio de cultivo. Todavia mas preferiblemente, dichos medios de cultivo favorecen la excrecion de al menos el 85% del total de alcoholes grasos producidos por el microorganismo de la invencion al medio de cultivo. Todavia mas preferiblemente, dichos medios de cultivo favorecen la excrecion de al menos el 90% del total de alcoholes grasos producidos por el microorganismo de la invencion al medio de cultivo. Todavia mas preferiblemente, dichos medios de cultivo favorecen la excrecion de al menos el 95% del

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total de alcoholes grasos producidos por el microorganismo de la invention al medio de cultivo. Medios apropiados para la excretion de al menos un 90% de los alcoholes grasos producidos por el microorganismo de la invencion al medio de cultivo se ilustran en el ejemplo 3.

Una vez alcanzada la cantidad de biomasa deseada y/o la cantidad intracelular de alcoholes grasos deseada, en una segunda etapa, el primer procedimiento de la invencion comprende separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo. Las celulas se recogen mediante alguno de los procedimientos habitualmente utilizados para este fin, tales como, centrifugation, filtration, decantation, flotation o sedimentation, adicionalmente ayudados por floculacion o evaporation para eliminar parte o la totalidad del agua o del medio de la fraction acuosa del medio de cultivo.

En una realization particular, la segunda etapa del primer procedimiento de la invencion se realiza mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en filtracion, microfiltracion, centrifugacion, presion, decantamiento y combinaciones de los mismos.

En una realizacion particular, el procedimiento de la invencion comprende ademas secar la biomasa microbiana obtenida en la segunda etapa.

Biomasa microbiana

En otro aspecto, la presente invencion tambien se refiere a la biomasa microbiana rica en alcoholes grasos obtenible segun el primer procedimiento de la invencion, en adelante “biomasa microbiana de la invencion”. El termino “biomasa microbiana” se ha descrito con anterioridad y es de aplicacion en el presente aspecto.

La biomasa microbiana generada de acuerdo al primer metodo de la invencion comprende no solo los microorganismos sino tambien todos aquellos componentes del cultivo generados por los microorganismos o que se han incorporado a los microorganismos a partir del cultivo durante su crecimiento y proliferation, tales como acidos nucleicos, protemas, polisacaridos, lipidos o productos intermediarios de los mismos. La biomasa microbiana de acuerdo a la invencion comprende microorganismos de acuerdo a la presente invencion.

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El termino “microorganismo de la invention”, as^ como las realizaciones particulares y preferidas del mismo han sido detallados en el contexto del primer aspecto de la invencion y aplican de igual manera a la biomasa microbiana de la invencion.

En una realization particular, la biomasa rica en alcoholes grasos tiene un contenido en alcoholes grasos de al menos el 10% del peso seco, al menos el 20% del peso seco, al menos el 30% del peso seco, al menos el 40% del peso seco, al menos 50% del peso seco al menos 60% del peso seco, al menos 70% del peso seco, al menos 80% del peso seco o al menos el 90% del peso seco.

Procedimiento para obtener una preparation enriquecida en alcoholes grasos

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con un procedimiento para obtener una preparacion rica en alcoholes grasos, en adelante “segundo procedimiento de la invencion”, que comprende

ii) separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo,

iii) extraer los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del caldo de cultivo obtenidos en la etapa (ii).

La primera etapa del segundo procedimiento de la invencion comprende cultivar el microorganismo de la invencion en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrogeno, en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo. Los terminos “microorganismo de la invencion”, “cultivar”. medio de cultivo”, “condiciones adecuadas para el crecimiento del microorganismo de la invencion” asi como las realizaciones particulares y preferidas de dichos terminos han sido detallados anteriormente y se interpretan de igual manera en el contexto del segundo procedimiento de la invencion.

La segunda etapa comprende separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo. La biomasa microbiana puede separarse del caldo de cultivo mediante cualquier metodo apropiado conocido del estado de la tecnica. Metodos que permiten separar la biomasa microbiana del caldo han sido detallados en el contexto del primer procedimiento de la

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invention. Dichos metodos incluyen pero no estan limitados a filtration, microfiltracion, centrifugation, presion, decantamiento y combinaciones de los mismos.

El termino “caldo de cultivo”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere al medio de cultivo obtenido tras el cultivo del microorganismo de la invencion y que comprende nutrientes procedentes del medio de cultivo y compuestos producidos por el microorganismo de la invencion como consecuencia de su metabolismo, como, alcoholes grasos.

En una realization preferida, la concentration de alcoholes grasos en el caldo de cultivo como consecuencia de la excretion por parte del microrganismo de la invencion de, al menos 0,1 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 0,2 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de al menos 0,3 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 0,4 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de al menos 0,5 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 0,6 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de al menos 0,7 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 0,8 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 0,9 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1 g/Ls en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1,1 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1,2 g/Ls en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1,3 g/Ls en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1,4 g/Ls en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1,5 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1,6 g/Ls en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1,7 g/Ls en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1,8 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 1,9 g/L; en otra realizacion preferida, la concentracion de alcoholes grasos en el caldo de cultivo es de, al menos, 2 g/L o mas.

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Una vez retirada la biomasa microbiana, el caldo de cultivo puede filtrarse a traves de un filtro esteril con un diametro de poro de de 0,22 ^m o centrifugarse para eliminar los restos celulares. Asimismo, si el caldo de cultivo no va a utilizarse de manera inmediata, puede conservarse en frio, por ejemplo, a 4°C, a -20°C o a -80°C hasta su uso.

La tercera etapa del segundo procedimiento de la invention comprende extraer los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del caldo de cultivo obtenido en la segunda etapa de dicho procedimiento.

Los microorganismos que acumulan alcoholes grasos y que forman parte de la biomasa microbiana de acuerdo la presente invencion se puede lisar para producir un lisado, que se usa como material de partida para la extraction de alcoholes grasos. La etapa de lisis se puede llevar a cabo usando cualquier metodo conocido para un experto, como por ejemplo, lisis por calor, lisis en medio basico, lisis en medio acido, lisis enzimatica usando enzimas tales como proteasas o enzimas que degradan polisacaridos (amilasas), lisis mediante ultrasonidos, lisis mecanica, lisis mediante choque osmotico, Estos metodos se pueden llevar a cabo de forma individual o combinada y, en caso de uso combinado, se pueden llevar a cabo de forma simultanea o secuencial. El grado de rotura celular se puede determinar mediante analisis microscopico.

Preferiblemente, la etapa de lisis requiere de la rotura de al menos en torno a un 70% de las celulas, al menos en torno a un 80% de las celulas, al menos en torno a un 90% de las celulas o, preferiblemente, al menos en torno a un 100% de las celulas.

Una vez obtenidos los lisados celulares, el presente procedimiento comprende la extraccion de los alcoholes grasos presentes en dichos lisados celulares y/o de los alcoholes grasos presente en el caldo de cultivo. En una realization preferida dicho procedimiento comprende la extraccion de alcoholes grasos de los lisados celulares y del caldo de cultivo. En otra realizacion preferida de la invencion, el procedimiento para obtener una preparation rica en alcoholes grasos comprende extraer los alcoholes grasos del caldo de cultivo.

Metodos adecuados para separar alcoholes grasos de los lisados celulares incluyen cualquier metodo de extraccion mecanica y dentro de estos, cualquier metodo de extraccion solido-liquido o mecanico quimico conocidos en el estado de la tecnica. La extraccion de los

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alcoholes grasos del caldo de cultivo puede llevarse a cabo mediante cualquier tecnica de extraction flquido-flquido.

En una realization particular, el metodo de extraccion mecanica se realiza utilizando prensa de tornillo, prensa francesa o molino de bolas.

Por otra parte, la extraccion de los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del caldo de cultivo tambien se puede llevar a cabo aprovechando diferencias de solubilidad de los mismos en un determinado disolvente. En el caso favorable de una mezcla de solidos en la cual uno de los compuestos es soluble en un determinado disolvente (normalmente un disolvente organico), mientras que los otros son insolubles, se puede realizar una extraccion consistente en anadir este disolvente a la mezcla contenida en un vaso de precipitados, un matraz o una capsula de porcelana, en frio o en caliente, agitar o triturar con ayuda de una varilla de vidrio y separar por filtration la disolucion que contiene el producto extraido y la fraction insoluble. La extraccion solido-flquido suele ser mucho mas eficiente cuando se hace de manera continua con el disolvente de extraccion caliente en un sistema cerrado, utilizando una metodologia similar a la explicada anteriormente, basada en la maceration con disolvente organico de la mezcla solida a extraer, previa al vaporizado en un matraz y condensado en un refrigerante. El paso del disolvente organico con parte del producto extraido al matraz inicial, permite que el mismo disolvente organico vuelva a ser vaporizado, repitiendo un nuevo ciclo de extraccion, mientras que el producto extraido, no volatil, se concentra en el matraz.

Asi, en otra realizacion particular, el metodo de extraccion solido-flquido se realiza usando un disolvente organico inmiscible en agua. El termino “disolvente organico”, tal y como se utiliza en la presente invention, se refiere a una sustancia que disuelve un soluto cuyas moleculas contienen atomos de carbono. El termino “disolvente organico inmiscible en agua”, tal y como se utiliza en la presente invencion, se refiere a un disolvente organico con poca o ninguna capacidad para mezclarse con el agua. Ejemplos no limitativos de disolventes organicos inmiscibles en agua incluyen n-hexano, acetato de etilo, eter de petroleo y eter-etflico. Asi, en una realizacion preferida, dicho disolvente organico inmiscible en agua se selecciona del grupo que consiste en n-hexano, acetato de etilo, eter de petroleo, eter-etflico y combinaciones de los mismos. En una realizacion aun mas preferida, dicho disolvente organico inmiscible en agua es acetato de etilo. La extraccion de alcoholes grasos de la biomasa microbiana y del caldo de cultivo puede llevarse a cabo tal y como se ilustra en el ejemplo 4 del presente documento. Asi, la etapa de extraccion de alcoholes

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grasos del caldo de cultivo comprende un metodo de extraction Kquido-Kquido con un disolvente organico apropiado, como, por ejemplo acetato de etilo. La extraccion puede repetirse tantas veces como se desee, preferiblemente hasta que hasta que no se obtenga una fase organica (donde estaran los alcoholes grasos). A continuation, los alcoholes grasos presentes en dichos sobrenadantes se precipitan mediante el empleo de un agente apropiado para ello, por ejemplo, sulfato sodico anhidro. La adicion del agente precipitante se realiza en condiciones que favorezcan la precipitation de los alcoholes grasos, por ejemplo, durante un tiempo apropiado (entre 15 minutos y una hora), tipicamente, 30 minutos y con agitation suave. Posteriormente, el sobrenadante se filtra y el disolvente es evaporado en un rotavapor hasta obtener un solido. Posteriormente, dicho solido es tratado convenientemente para analizar el contenido en alcoholes grasos mediante cualquier metodo apropiado para ello, como cromatografia gases-masas.

Procedimiento para obtener biosurfactantes

Los alcoholes grasos obtenidos a partir de la biomasa microbiana y del caldo de cultivo de acuerdo a la presente invention pueden ser procesados quimicamente para dar lugar a productos de interes en la industria. Ejemplos de modificaciones quimicas que pueden ser aplicadas a los alcoholes grasos de acuerdo a la invencion incluyen sin limitation, epoxidacion, oxidation, hidrolisis, sulfatacion, sulfonacion, etoxilacion, propoxilacion, amidacion y saponificacion.

Como consecuencia de dichas modificaciones, a partir de los alcoholes grasos se obtienen productos de interes industrial como, por ejemplo sulfatos de alcoholes grasos, resinas, emulsionantes, cosmeticos, jabones, jabones metalicos, etoxilatos de alcoholes grasos, sulfatos de esteres de alcoholes grasos, productos quimicos industriales (por ejemplo, productos de limpieza, auxiliares de tratamiento de textiles, plastificantes, estabilizantes o aditivos), revestimientos, pinturas y lacas, productos aislantes del cableado electrico y alcanos superiores.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invencion se relaciona con un procedimiento para obtener biosurfactantes a partir de los alcoholes grasos obtenidos en el segundo procedimiento de la invencion, en adelante “tercer procedimiento de la invencion”, que comprende:

i) cultivar el microorganismo de la invencion en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de

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nitrogeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo;

ii) separar la biomasa microbiana del medio de cultivo

El termino “biosurfactante”, tal y como se utiliza en la presente invention, se refiere a un compuesto anfipatico con capacidad para interaccionar con compuestos hidrofobicos e hidrofflicos al mismo tiempo, que se deriva de la biomasa, tal como residuos animales, de plantas o microbianos. Dicho termino incluye sin limitation ramnolipidos, trehalolipidos, soforolipidos, celobiolipidos, lipidos polioles, diglicosil digliceridos, lipopolisacaridos, arthrofactin, surfactina, viscosina, fosfoKpidos y sulfonilipidos.

En una primera etapa, el tercer procedimiento de la invencion comprende cultivar el microorganismo de la invencion en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrogeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo. Los terminos “microorganismo de la invencion”, “cultivar”. medio de cultivo”, “condiciones adecuadas para el crecimiento del microorganismo de la invencion” asi como las realizaciones particulares y preferidas de dichos terminos han sido detallados anteriormente y se interpretan de igual manera en el contexto del tercer procedimiento de la invencion.

La segunda etapa comprende separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo. La biomasa microbiana puede separarse del caldo de cultivo mediante cualquier metodo apropiado conocido del estado de la tecnica. Metodos que permiten separar la biomasa microbiana del caldo han sido detallados en el contexto del primer procedimiento de la invencion. Dichos metodos incluyen pero no estan limitados a filtration, microfiltracion, centrifugacion, presion, decantamiento y combinaciones de los mismos.

La tercera etapa del tercer procedimiento de la invencion comprende extraer los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del caldo de cultivo. Metodos para extraer los alcoholes grasos acumulados en el microorganismo de la invencion y en el caldo de cultivo han sido detallados en el contexto del segundo procedimiento de la invencion y aplican de igual manera al contexto del tercer procedimiento de la invencion.

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En una cuarta etapa, el sexto procedimiento de la invention comprende convertir la mezcla de alcoholes grasos obtenidos en la tercera etapa en biosurfactantes El experto en la materia entendera que existen en la tecnica numerosos procedimientos para convertir alcoholes grasos en biosurfactantes que incluyen, sin limitation, procedimientos de esterification, acilacion, transesterificacion, saponification, acetalizacion o neutralization (ver por ejemplo O'Lenick. 1999. Surfactants: Chemistry & Properties; Levinson. 2008. Surfactant production, pp: 1-37. CRC Press.)

En una forma preferida de realization, el surfactante es un alquil poliglucosido (APG) que se obtiene a partir de un alcohol graso, que puede obtenerse a partir de la biomasa microbiana y/o el caldo de cultivo de acuerdo a la invencion mediante un proceso deacetalizacion (o transcetalzacion) de dicho alcohol graso. La acetalizacion es una reaction organica que implica la formation de un acetal.

En otra forma preferida de realizacion, el surfactante es un ester de acido graso, que puede obtenerse mediante la condensation con etanolamina para dar lugar a los etoxilatos.

Usos de la invencion

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con el uso del microorganismo de la invencion, en adelante “primer uso de la invencion”, para obtener una biomasa microbiana rica en alcoholes grasos segun el primer procedimiento de la invencion.

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con el uso del microorganismo de la invencion, en adelante “segundo uso de la invencion”, para obtener una preparation rica en alcoholes grasos segun el segundo procedimiento de la invencion.

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con el uso del microorganismo de la invencion, en adelante “tercer uso de la invencion”, para obtener surfactantes segun el tercer procedimiento de la invencion.

Los terminos “microorganismo”, “biomasa microbiana” y “surfactante” y sus particularidades han sido descritos en el contexto del microorganismo y del primer procedimiento de la invencion, y son aplicables al segundo uso de la invencion. Asimismo, tambien son

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aplicables de igual manera los modos de realization particulares y preferidos del

microorganismo y del segundo procedimiento de la invention.

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La invencion se describe en detalle a continuation por medio de los siguientes ejemplos, que han de interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invencion.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Construction de un casete integrativo conteniendo la acil-CoA reductasa (FAR) de Marinobacter aquaeolei VT8

Utilizando como molde la secuencia proteica de la acil-CoA reductasa de Marinobacter aquaeoli VT8 depositada en Genbank (YP_959486.1), se sintetizo el gen empleando en uso de codones de R. toruloides y la secuencia proteica obtenida es la que se muestra en la SEQ ID NO:1. El vector de donation contiendo el gen sintetizado fue digerido con las enzimas de restriction PacI y Xbal. El fragmento de 1564 pb extraido se trato con la polimerasa “Klenow” (Takara) para su clonacion en un vector bajo control del promotor de la glicerol-3-fostato deshidrogenasa de R. toruloides y del terminador Tnos de Agrobacterium tumefaciens dando lugar a pNEOL71. A continuacion, el vector pNEOL71 obtenido se digirio con la endonucleasa mitocondrial I-Scel y el casete de expresion, conteniendo el promotor, el gen maqRt y Tnos, se clono en el vector pNEOL85. El vector pNEOL85 contiene otro casete conteniendo el gen de resistencia a la geneticina con uso de codon de R. toruloides (G418Rt) bajo el control del promotor de la fosfoglicerato quinasa de R. toruloides (pPGK) y del terminador T35S del virus mosaico de la coliflor. Por otro lado, se modifico el plasmido de tipo Ti de A. tumefaciens pUR5750, insertando un sitio multiple de clonacion (Kpnl- Smal/Xmal-I Scel-Spel-Pacl-Xbal) entre los sitios de restricciones Kpnl y Xbal, dando lugar al plasmido pNEOL57. Por ultimo, el vector pNEOL85 se corto con Pacl y un fragmento de 5 kb, portando los dos casetes de expresion, se clono en el plasmido pNEOL57 dando lugar al plasmido integrativo pNEOL102 (Figura 1).

Ejemplo 2: Transformation de R. toruloides

La transformacion de R. toruloides CECT 13085 se realizo mediante el sistema de transformacion mediado por Agrobacterium tumefaciens (ATMT). Para ello, se cultivaron el pre-inoculo de A. tumefaciens llevando el plasmido pNEOL102 en el medio de crecimiento MM (preparado segun Hooykaas y col., 1979) y el pre-inoculo de R. toruloides CECT 13085

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en medio YPD (extracto de levadura 10g/L, glucosa 20g/L, peptona 20g/L) durante 24h. A partir del pre-inoculo de Agrobacterium, se inocula 10 mL de medio MI (preparado segun Bundock y col., 1995) suplementado en acetosiringona a 200 ^M con una DO660 inicial de 0.5, y se incuba 6h a 30°C, con agitacion de 250 rpm. En paralelo, se inocula la cepa R. toruloides CECT 13085 en 10 mL de YPD con una DO600 inicial de 1.5. Tras 6h de incubacion se recogen 100^l de cada cultivo y se realiza un co-cultivo sobre una membrana de nitrocelulosa de 0.45 ^m en medio MI suplementado en acetosiringona a 200 ^M, se incuba a 25°C durante 72h. A continuacion, el co-cultivo o mezcla de transformacion se recoge con 2 mL de medio YPD y se siembra en placas de Petri con medio YPD suplementado con cefotaxima (200 ^g/mL) y geneticina (35 ^g/mL).

Los transformantes se picaron en medio YPD suplementado con geneticina (35 ^g/mL) y se comprobo la integracion del casete conteniendo la acil-CoA reductasa (maqRt) en el genoma de la levadura mediante PCR con oligonucleotidos espedficos (O21+, ggactagtCGCCGGGATGCCAACGTCGTT (SEQ ID NO: 2); O22-,

ccactagtaaatgtataattgcgggactc (SEQ ID NO: 3); O66+, GAGATCGCCACCTCGTCGGT (SEQ ID NO: 4); O66-, AGCGAGAGGATGATCGAGTT (SEQ ID NO: 5)) y mediante Southern blot. Para ello, se extrajo el ADN genomico de los transformantes seleccionados con el metodo clasico de extraccion utilizando el fenol-CIA. A continuacion, los ADNs genomicos fueron digeridos con dos enzimas de restriccion: KpnI o BglII. Se sintetizo una sonda de 785 pb, espedfica del gen maqRt, con los oligonucleotidos O66+ y O66-, dicha sonda se marco segun el protocolo descrito en el kit de Roche (DIG High Prime DNA labeling and detection Starter kit I) y se hibrido en el ADN genomico de los transformantes seleccionados. Tanto las membranas de Southern como los geles de agarosa de PCR confirmaron que el casete de expresion maqRt se habia integrado en el genoma de R. toruloides CECT 13085.

Ejemplo 3: Produccion de alcoholes grasos en diferentes medios de cultivo

Los clones confirmados en el ejemplo anterior se cultivaron en matraces de 500 mL conteniendo 100 mL de los siguientes medios de cultivo: MBO3-1 (NH4NO3 0.7 g/L, CaCl2.2H2O 0.4 g/L, MgSO4.7H2O 0.4 g/L, KH2PO4 0.75 g/L, liquido macerado de maiz 9,6 g/L a pH6, glucosa 110 g/L), MBO3-2 (NH4NO3 0.7 g/L, CaCl2.2H2O 0.4 g/L, MgSO4.7H2O 0.4 g/L, KH2PO4 0.75 g/L, liquido macerado de maiz 9,6 g/L a pH6, glicerina 110 g/L), MBO3-3 (extracto de levadura 10 g/L, glucosa 40 g/L, peptona 20 g/L), MBO3-4 (extracto de levadura 10 g/L, sacarosa 40 g/L, peptona 20 g/L), MBO3-5 (NH4NO3 0.28 g/L, CaCl2.2H2O 0.4 g/L, MgSO4.7H2O 0.4 g/L, KH2PO4 0.75 g/L, extracto de levadura 1.5 g/L, sacarosa 40

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g/L), MBO3-6 (glucosa 70 g/L, xilosa 40 g/L, liquido macerado de maiz 19,2 g/L a pH6, acido acetico 4,5 g/L, acido formico 0,4 g/L, furfural 0,15 g/L), MBO3-7 (NH4NO3 0.28 g/L, CaCl2.2H2O 0.4 g/L, MgSO4.7H2O 0.4 g/L, KH2PO4 0.75 g/L, extracto de levadura 1.5 g/L, glucosa 40 g/L), MBO3-8 (glucosa 70 g/L, xilosa 40 g/L, liquido macerado de maiz 9,6 g/L a pH6). Los cultivos crecieron a 250 rpm, 30°C durante 72 h.

En la mayoria de las muestras observamos un solido blanco, ausente en la cepa parental, tras centrifugar el cultivo 10 min a 10.000xg. La Figura 2 muestra los resultados obtenidos en algunos de los medios de cultivo ensayados tras 24 h o 36 h de cultivo. La extraction de los alcoholes grasos se realizo como se indica en el ejemplo 4 y su detection y cuantificacion se describe en el ejemplo 5. El microorganismo de la invention es capaz de producir entre 0,5 y 2 g/L de alcoholes grasos en 24-36 h dependiendo del medio de cultivo utilizado (ver figura 2). En la mayoria de los casos, excepto en el medio MBO3-6, y dependiendo del tiempo de incubation, entre el 60% y el 95% del total de los alcoholes producidos se secretaron al medio de cultivo. Por el contrario, en el medio MBO3-6 el 80% de los alcoholes quedaron retenidos en el interior de las celulas. Los tres alcoholes grasos producidos en todos los medios fueron oleil (C18:1-OH), cetil (C16:0-OH) y estearil (C18:0- OH). En todos los casos el oleil fue el alcohol mayoritario ().

Ejemplo 4: Extraccion de alcoholes grasos

La presencia de alcoholes grasos se determino tras centrifugar 100 mL de caldo de cultivo a 10000g/10min. El sobrenadante se extrajo tres veces con 30 mL de acetato de etilo y las fases organicas obtenidas en cada extraccion se juntaron. A esta fase organica, contenida en un recipiente cerrado, se le anadio Na2SO4 anhidro y se mezclo agitando ligeramente la mezcla cada 5-10min durante 30min. A continuacion se filtro y se evaporo el disolvente hasta sequedad en un rotavapor. La extraccion de los alcoholes contenidos en el interior de las celulas se realizo segun el procedimiento descrito por Schneiter y Daum (Schneiter y Daum. 2006. Methods in Molecular Biology, Vol. 313: Yeast Protocols. Xiao, Wei (Ed.) 2nd. Humana Press). Para ello, 2 g de biomasa se lavan con una solution salina (0.9% NaCl, centrifugar a 10000xg/10min), la biomasa lavada se mezcla con metanol, 13 mL, y se introduce en un frasco de 100 mL. Se anaden 20 g de perlas de vidrio (0.25-0.3mm) y se completa la lisis celular con algunos de estos metodos o combination de los mismos: agitation 1000-1500rpm/1-10min y/o sonicacion durante 1-20 min. Anadimos 26 mL de cloroformo y se agita al menos durante 20-60 min en un agitador orbital (100-400 rpm). La mezcla de lisis resultante se filtra y el filtrado se lava sucesivamente con una solucion de Cl2Mg (0.034%), otra disolucion KCl 2N:metanol (1:1 v/v), y otra, mezcla

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cloroformo/metanol/agua (3:48:7 v/v). despues de cada lavado se centrifuga (3000xg/5min) y se desprecia la fase ligera. Se repiten estos lavados hasta que la interfase aparezca clara. La fase organica se evapora en rotavapor hasta sequedad.

Ejemplo 5: Analisis y caracterizacion de los alcoholes grasos

La presencia de alcoholes grasos se realizo empleando CG-MS. Para ello el solido obtenido mediante la extraction con acetato de etilo se trato de dos formas diferentes bien disolviendolo directamente en cloroformo bien realizando una silanizacion (patrones puros). Para llevar a cabo dicha silanizacion se peso aproximadamente 1 mg de cada uno de los patrones puros y se les adiciono 2 mL de N,N-dimetilformamida y 0,5 mL de N,O-Bis (Trimetillsilil) trifluoroacetamida (BSTFA) con 1% trimetilsilyl chloride. La disolucion resultante se agita vigorosamente en vortex y se mantienen en un bano de agua a 60°C durante 30 min. Transcurrido este tiempo, las muestras se dejan enfriar hasta temperatura ambiente, se centrifugan a 6500 r.p.m. durante 5 minutos (en caso necesario) y se recoge el sobrenadante.

Las muestras tratadas de una u otra forma se analizaron usando un equipo Agilent modelo 6890 GC acoplado a un espectrometro de masas Agilent 5973 MS equipado con una columna ZB-5ms (30 m de longitud por 250 ^m de diametro interno y 0.25 ^m de espesor de fase). Para el analisis un volumen de inyeccion de 1 microlitro de cada muestra es inyectado en el GC-MS mediante un automuestreador y separado en la columna en modo splitless. El Helio se uso como gas portador con una velocidad de flujo constante de 0.8 mL/min. La temperatura de inyector es 280°C y la temperatura de la fuente del MS se mantuvo a 290°C. El programa de temperatura del horno fue: temperatura inicial de 80°C mantenida durante 0.5 min a continuation una rampa de 5°C/min hasta una temperatura final de 250°C y posteriormente una rampa de 40°C/min hasta una temperatura de 290°C mantenida durante 5 minutos. Las condiciones del espectrofotometro de masas son: solvent delay de 4 min, ionization por impacto electronico (70 eV) y dwell time de 100 ms.

Los cromatogramas se registraron en modo SCAN y en modo SIR estableciendose un rango de masas de 50-400 m/z para el modo SCAN y fijando los iones 299.1 / 313.2 / 325.2 / 340.2 / 327.2 / 341.3 para el modo SIM.

Los analisis de GC-MS identificaron 3 alcoholes grasos producidos por el microorganismo de la invention. Las muestras se compararon con los patrones inyectados a traves de los tiempos de retention asi como los m/z caracteristicos obtenidos para cada uno de ellos en

su correspondiente espectro de masas. En los cromatogramas obtenidos (tanto en modo SCAN como en modo SIM) a partir de las muestras silanizadas con BSTFA se puede apreciar la aparicion de 3 picos mayoritarios con tiempos de retencion 24.09 min, 27.27 min y 27.78 min correspondientes al alcohol cetflico, al alcohol oleico y al alcohol estearico, 5 respectivamente. El analisis de los espectros de masas de estos compuestos verificaron su identidad ya que en cada uno de ellos se aprecia el fragmento correspondiente a [M+73-1] o [M+73-2] tipico de las muestras silanizadas con BSTFA y otro fragmento correspondiente a la perdida de un grupo metilo [M+73-1]-15 o [M+73-2]-15. En la siguiente tabla se puede observar un resumen de los resultados obtenidos.

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Compuesto: TR(min) m/z caracteristico

Alcohol cetNico: 24.09 313/299

Alcohol oleico: 27.27 340/325

Alcohol estearico: 27.78 341/327

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REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo de la especie Rhodosporidium toruloides modificado geneticamente con un gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa, en donde dicha enzima tiene capacidad de producir alcoholes grasos.
2. Un microorganismo segun la reivindicacion 1, en donde dicho gen se expresa bajo control de un promotor constitutivo y/o en donde dicho gen contiene codones optimizados para su expresion en R. toruloides.
3. Un microorganismo segun las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa se selecciona del gen acil-CoA reductasa que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.
4. Un microorganismo segun las reivindicaciones 1 a 3 en donde el microorganismo de la especie Rhodosporidium toruloides en el que se ha introducido el gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa pertenece a la cepa R. toruloides CECT 13085.
5. Un procedimiento para obtener una biomasa microbiana rica en alcoholes grasos que comprende:

i) cultivar un microorganismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrogeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo; y

ii) separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo.
6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en donde la fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste en glucosa, sacarosa, glicerol, melazas, xilosa, arabinosa, manosa, fructosa, acetato y combinaciones de las mismas.

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7. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en donde la fuente de carbono es un hidrolizado de biomasa lignocelulosica.
8. Procedimiento, segun la reivindicacion 7, en donde el hidrolizado se obtiene de paja de trigo, bagazo de cana de azucar, bagazo de maiz, racimos vados de palma aceitera, poda de palma aceitera, fibra de palma aceitera, poda de vid, poda de olivo y combinaciones de las mismas.
9. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en donde la fuente de carbono es glucosa.
10. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en donde la fuente de carbono es xilosa.
11. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde la fuente de nitrogeno se selecciona del grupo que consiste en extracto de levadura, peptona, liquido macerado de maiz, urea, glutamato sodico, fuentes de nitrogeno inorganico y combinaciones de las mismas.
12. Procedimiento segun la reivindicacion 11, en donde la fuente de nitrogeno es una sal de amonio, preferiblemente cloruro de amonio.
13. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en donde el medio de cultivo contiene inhibidores solidos seleccionados de: acido acetico, acido formico, acido levulmico, acido cumarico, acido ferulico, acido sucdnico, 4-hidroxibenzaldeddo, vanillina, acido vanfllico, siringaldehido, acido 4- hidroxibenzoico, catecol, guaiacol, acido siringico, furfural, 5-hidroximetilfurfural y combinaciones de los mismos.
14. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en donde las condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo de la etapa (i) comprenden

- temperatura en un rango entre 18 °C y 37 °C,

- concentration de oxigeno disuelto de al menos el 20%, y/o

- agitation constante.

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15. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14 en donde la etapa (ii) se realiza mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en filtracion, microfiltracion, centrifugacion y combinaciones de los mismos.
16. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15, que comprende ademas secar la biomasa microbiana de la etapa (ii).
17. Biomasa microbiana rica en alcoholes grasos obtenible segun el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16.
18. Procedimiento para obtener una preparation enriquecida en alcoholes grasos que comprende

i) cultivar un microorganismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrogeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo;

ii) separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo; y

iii) extraer los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del caldo de cultivo obtenidos en la etapa (ii)
19. Procedimiento segun la reivindicacion 18, en donde la extraction de la etapa (iii) se lleva cabo mediante metodos mecanicos, o mediante un metodo de extraccion solido-liquido, o un metodo de extraccion liquido-liquido.
20. Procedimiento segun la reivindicacion 19, en donde el metodo de extraccion mecanica se realiza usando prensa de tornillo, prensa francesa o molino de bolas.
21. Procedimiento segun la reivindicacion 19, en donde el metodo de extraccion solido-liquido o liquido-liquido se realiza usando un disolvente organico inmiscible en agua.
22. Procedimiento segun la reivindicacion 21, en donde dicho disolvente organico inmiscible en agua se selecciona del grupo que consiste en n-hexano, acetato de etilo, eter de petroleo, eter-etflico y combinaciones de los mismos.
23. Procedimiento para obtener biosurfactantes que comprende:

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i) cultivar un microorganismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrogeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo;

ii) separar la biomasa microbiana del medio de cultivo

iii) extraer los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del caldo de cultivo obtenidos en la etapa (ii); y

iv) convertir la mezcla de alcoholes grasos obtenidos en la etapa (iii) en biosurfactantes.
24. Uso del microorganismo segun las reivindicaciones 1 a 4 para obtener una biomasa microbiana rica en alcoholes grasos, para obtener una preparation enriquecida en alcoholes grasos o para obtener biosurfactantes.

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