BR112016011608B1 - Variantes de endoglucanases com atividades melhoradas, e, usos das mesmas - Google Patents

Abstract

VARIANTES DE ENDOGLUCANASES COM ATIVIDADES MELHORADAS, E, USOS DAS MESMAS. A presente invenção se refere à expressão e à otimização de enzimas envolvidas na degradação de biomassa de lignocelulose. A presente invenção se refere mais especificamente a variantes de endoglucanase I de Trichoderma reesei, e ao uso das referidas variantes com desempenho melhorado em métodos para degradação de celulose e produção de biocombustível.

Description

[0001] A possibilidade de produzir etanol a partir de celulose tem recebido uma grande atenção devido à disponibilidade de grandes quantidades de matéria-prima e também devido ao valor do etanol como combustível. As matérias-primas naturais à base de celulose, para tal processo, são denotadas "biomassa". Muitos tipos de biomassa, por exemplo, madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas e resíduos sólidos urbanos, têm sido considerados como potenciais matérias-primas para a produção de biocombustível. Estes materiais consistem principalmente de celulose, hemicelulose e lignina.

[0002] A celulose é um polímero constituído por moléculas de glicose ligadas por ligações beta-1,4 que são muito resistentes à degradação ou a despolimerização. Uma vez que a celulose tenha sido convertida em glicose, esta última é facilmente fermentada em biocombustíveis, por exemplo, etanol, utilizando-se uma levedura.

[0003] Os métodos mais antigos estudados para converter celulose em glicose são baseados em hidrólise ácida. Este processo pode ser realizado na presença de ácidos concentrados ou diluídos. No entanto, várias desvantagens, tais como a má recuperação do ácido, quando são utilizados ácidos concentrados, e a baixa produção de glicose no caso da utilização de ácidos diluídos, são prejudiciais para a economia do processo de hidrólise ácida.

[0004] Para superar os inconvenientes do processo de hidrólise ácida, os processos de conversão de celulose têm mais recentemente sido relacionados com a hidrólise enzimática, utilizando enzimas do tipo celulase. Esta hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica (por exemplo, celulose) tem, no entanto, o inconveniente de ser um processo industrial caro. Como resultado, é necessária a utilização de cepas de micro-organismos secretores de celulase cada vez mais eficazes. Neste contexto, muitos micro-organismos compreendem enzimas que hidrolisam celulose, tais como os fungos Trichoderma, Aspergillus, Humicola ou Fusarium e também as bactérias, tais como Thermomonospora, Bacillus, Cellulomonas e Streptomyces. As enzimas secretadas por esses micro-organismos possuem três tipos de atividades que são úteis na conversão de celulose em glicose e são divididas em três grupos: endoglucanases, que atacam aleatoriamente fibras de celulose internamente, exoglucanases que atacam as extremidades das fibras liberando celobiose, e β-glicosidases que hidrolisam celobiose em glicose. Outras classes de enzimas, tais como as hemicelulases ou a classe de enzimas polissacarídeo monooxigenase recentemente descoberta também pode desempenhar um papel na eficiência da hidrólise.

[0005] Existe um grande interesse industrial em diminuir o custo da hidrólise enzimática, e esta redução envolve a utilização de uma quantidade reduzida de enzimas e, portanto, coquetéis de enzimas que são mais eficazes. Consequentemente, vários Pedidos de Patentes descrevem enzimas naturais com capacidades maiores do que as de Trichoderma reesei, ou variantes que foram melhorados por meio de engenharia genética. Pode ser feita menção aos Pedidos de Patente US2010304464, WO 2010/066411 e WO 2013/029176 relativos à exoglucanases, aos Pedidos WO 2007/109441, WO 2012/149192 e WO 2010/076388, relativos à endoglucanases, aos Pedidos WO 2010/029259, WO 2010/135836 ou WO 2010/022518 relativos à β-glicosidases, ou então aos Pedidos WO12135659 e WO12149344 relativos à polissacarídeo monooxigenases.

[0006] As enzimas que hidrolisam biomassa lignocelulósica são classificadas no sistema CAZy (Cantarel, B. L., Coutinho, P. M., Rancurel, C., Bernard, T., Lombard, V., & Henrissat, B. (2009). The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic acids research, 37, D233-8) com base em critérios principalmente estruturais. As endoglucanases podem pertencer às famílias GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 16, 18, 19, 26, 44, 45, 48, 51, 74 e 124.

[0007] Com o intuito de que uma hidrólise da biomassa lignocelulósica seja eficaz e economicamente confortável, a mistura enzimática deve incorporar proporções equilibradas de enzimas que possuem diversas atividades enzimáticas, entre outras coisas, mas não exclusivamente, do tipo exoglucanase, endoglucanase, xilanase e β-glicosidase. A título de exemplo, nas misturas nativas de Trichoderma reesei, a presença de 60% a 70% de exoglucanases, de 15% a 20% de endoglucanases, alguns percentuais de hemicelulases e aproximadamente de 5% a 10% de β-glicosidases, são geralmente observadas. Esta mistura é adequada para hidrolisar a maioria dos substratos pré-tratados (por exemplo, tais como na explosão de vapor de palha de trigo em condições ácidas) com rendimentos aceitáveis. Em suma, o aumento da atividade de endoglucanase não deve ocorrer em detrimento das outras atividades enzimáticas. As especificidades funcionais destas enzimas são, no momento atual, mal compreendidas. O genoma de Trichoderma reesei compreende pelo menos 3 enzimas principais derivadas das famílias 7 (EG1, cel7b), 5 (EG2, cel5a) e 12 (EG3, cel12a). As enzimas EG1 e EG2 são as principais endoglucanases e podem representar até de 10% a 20% em peso do coquetel completo de enzimas produzidas por T. reesei.

[0008] As endoglucanases (EC 3.2.1.4), as primeiras enzimas que atuam sobre a celulose, são conhecidas por possuírem um papel principal na hidrólise, aumentando o número de locais que as exoglucanases podem atacar enquanto diminuem o grau de polimerização das microfibrilas atacadas. Estudos recentes (Szijártó, N., Siika-aho, M., Sontag- Strohm, T., & Viikari, L. (2011). “Liquefaction of hydrothermally pretreated wheat straw at high-solids content by purified Trichoderma enzymes”. Bioresource technology, 102 (2), 1968-1974) enfatizam o seu papel na diminuição da viscosidade da biomassa durante as primeiras horas de hidrólise. Esta diminuição da viscosidade pode possuir um impacto muito significativo nos custos operacionais do processo.

[0009] O problema de viscosidade é acentuado no caso de processos que exigem uma baixa temperatura do recurso, tais como a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF, na sigla em inglês) que envolve ambas as enzimas que hidrolisam a biomassa e o micro-organismo que converte os monômeros de açúcar em etanol.

[0010] A hidrólise e a fermentação podem ser realizadas de acordo com diferentes regimes. O mais comum é composto por hidrólise separada da fermentação (SHF, na sigla em inglês). Este método faz com que seja possível aperfeiçoar cada etapa através da manutenção das condições ótimas de reação. Esta fermentação é realizada extemporaneamente, a uma temperatura entre aproximadamente 28°C e aproximadamente 30°C, enquanto que a hidrólise ocorre geralmente a uma temperatura de pelo menos 45°C. No entanto, na SHF, os açúcares liberados no final da reação estão presentes em concentrações muito elevadas e conduzem a uma inibição das enzimas, diminuindo a eficiência do processo. Com o intuito de evitar estes inconvenientes, outro tipo de processo pode ser visionado. Na SSF, as duas etapas (hidrólise e fermentação das hexoses) são realizadas simultaneamente, evitando a acumulação de açúcares em concentrações que são inibidoras para as enzimas. Os custos de investimento também são reduzidos em virtude da utilização de um único reator. O grau de hidrólise é superior, seguido pela ausência de inibição, uma vez que os açúcares liberados são imediatamente utilizados para a fermentação em etanol. Neste método, a temperatura do reator encontra-se necessariamente entre as temperaturas ideais para a hidrólise e para a fermentação, tipicamente entre aproximadamente 30°C e aproximadamente 35°C. No entanto, nesta temperatura, a atividade das enzimas celulolíticas é diminuída em cerca de 30%.

[0011] A SSF também permite a expressão de enzimas que quebram a celulose no organismo que fermenta os açúcares, tornando assim possível limitar, ou em um caso extremo eliminar, o recurso de enzimas produzidas durante uma etapa separada. No entanto, a produção de grandes quantidades de enzimas com organismos fermentativos e, consequentemente, a obtenção de uma elevada atividade pode provar-se problemática e limitar a viabilidade destas abordagens.

[0012] Consequentemente, a obtenção de enzimas que mantêm uma atividade de endoglucanase eficaz sob temperaturas ótimas para a hidrólise e para a fermentação (isto é, entre 30°C e 50°C), enquanto, ao mesmo tempo, mantém a proporção de todas as enzimas da mistura seria um ganho significativo para o processo de conversão de biomassa lignocelulósica em biocombustível.

Descrição da invenção

[0013] Os solicitantes desenvolveram um polipeptídeo que possui uma atividade de endoglucanase melhorada, em particular, em comparação com a atividade de endoglucanase da proteína EG1 de tipo selvagem de sequência de SEQ ID NO: 2. A EG1 corresponde a endoglucanase 1 de Trichoderma reesei .

[0014] Com esta perspectiva, os solicitantes possuem como grande crédito, após numerosas pesquisas, o fato de ter encontrado um polipeptídeo isolado ou purificado que possui uma atividade de endoglucanase melhorada em comparação com a atividade de endoglucanase da proteína de referência EG1 (SEQ ID NO: 2).

[0015] A invenção, portanto, refere-se a um polipeptídeo escolhido a partir do grupo que compreende: i) uma sequência de aminoácidos escolhida a partir do grupo que compreende as sequências SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 26; ii) uma sequência de aminoácidos que possui um percentual de identidade de pelo menos 70%, preferivelmente de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, em relação à sequência SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 26.

[0016] Preferivelmente, o polipeptídeo, tal como descrito acima, é caracterizado pelo fato de que a sua expressão em um organismo fermentativo é, pelo menos, igual à expressão da proteína de referência EG1 (SEQ ID NO: 2).

[0017] De acordo com a invenção, o percentual de identidade de uma dada sequência em relação à SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 corresponde ao número de resíduos que são idênticos entre essa dada sequência e a SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26, dividido pelo número de resíduos na SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26. Quando o banco de dados GenomeQuest é utilizado, o referido percentual de identidade em relação à SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 corresponde ao percentual de identidade de consulta (% do ID da consulta), onde consulta corresponde à sequência SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26.

[0018] Os técnicos na arte serão capazes, por exemplo, de determinar o aumento ou em outras palavras, a melhoria da atividade enzimática utilizando o substrato de carboximetilcelulose (CMC), ou um substrato cromogênico (p- nitrofenil glicosídeo). A atividade enzimática será respectivamente revelada pelo ensaio colorimétrico dos açúcares redutores ou então pelo nitrofenol liberado.

[0019] Preferivelmente, o polipeptídeo da invenção possui uma atividade enzimática melhorada em pelo menos 10%, preferivelmente em pelo menos 20%, preferivelmente em pelo menos 30%, em relação à atividade de endoglucanase da proteína EG1 de sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[0020] Um exemplo de um protocolo, que os técnicos na arte serão capazes de utilizar para determinar se um polipeptídeo, de acordo com a invenção, possui uma atividade enzimática melhorada em relação à da proteína de referência EG1 (SEQ ID NO: 2), é o seguinte: - formação de uma cultura de estoque de E. coli que expressa um polipeptídeo de acordo com a invenção durante a noite a 37°C; - inoculação de um meio de cultura LB com 1% de cultura de estoque a 37°C até uma densidade ótica de 0,4 ser obtida; - cultura das referidas células a 20°C durante 18 horas; - centrifugação durante 5 minutos a 7.900 rpm; - ressuspensão dos pellets de células com tampão de fosfato de citrato a 100 mM com pH 5 contendo 1 mg/ml de lisozima (OD600 100); - incubação das células ressuspensas durante 30 minutos em gelo; - lise das células por meio de 3 ciclos de congelamento - descongelamento; - fracionamento do DNA por sonicação; - centrifugação durante 30 minutos a 13.000 rpm; - incubação de 100 μl de sobrenadante de quebra com 100 - l de tampão fosfato citrato a 100 mM com pH 5 contendo 1% de CMC, durante 6 horas a 35°C e 50°C; - remoção de 100 μl de reação; - adição de 100 μl de reagente DNS (Miller, 1959); - incubação durante 5 minutos a 100°C; - incubação durante 3 minutos em gelo; - centrifugação durante 10 minutos a 3.000 rpm; - leitura da densidade ótica a 540 nm em 150 μl de sobrenadante.

[0021] Um objetivo adicional da invenção refere-se a um ácido nucleico purificado ou isolado que codifica pelo menos um polipeptídeo tal como descrito acima. A Tabela 1 abaixo compreende as identificações das sequências peptídicas e nucleicas de T. reesei EG1 ("de tipo selvagem"), as endoglucanases putativas de Chaetomium globosum (C) e de Aspergillus fumigatus (A), e também para os polipeptídeos e os nucleotídeos da invenção.

[0022] Preferivelmente, o referido ácido nucleico purificado ou isolado pode ser escolhido a partir do grupo constituído a partir das seguintes sequências: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 25. TABELA 1

[0023] A invenção adicionalmente se refere a um vetor que compreende um ácido nucleico, tal como descrito acima.

[0024] De acordo com a invenção, o termo "vetor" deverá ser entendido como significando qualquer sequência de DNA na qual é possível inserir fragmentos de ácido nucleico externos, em que os vetores permitem a introdução de DNA externo em uma célula hospedeira. Podem ser citados os vetores não exaustivos de: plasmídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais de levedura (YACs), cromossomos artificiais bacterianos (BACs), cromossomos artificiais derivados de bacteriófago P1 (PACs) ou vetores derivados de vírus.

[0025] De acordo com a invenção, o ácido nucleico, tal como descrito acima, pode ser funcionalmente ligado a um promotor, um terminador ou qualquer outra sequência necessária para a sua expressão na célula hospedeira.

[0026] O vetor de acordo com a invenção pode adicionalmente transportar um marcador selecionável. O termo "marcador selecionável" destina-se a significar um gene cuja expressão confere às células que o contêm uma característica que faz com que seja possível selecioná-las. Por exemplo, um gene de resistência a antibióticos.

[0027] Um objetivo adicional da invenção refere-se a uma célula hospedeira isolada que compreende pelo menos um dos polipeptídeos, tais como descritos acima, ou pelo menos um dos ácidos nucleicos, tais como descritos acima, ou pelo menos um dos vetores, tais como descritos acima.

[0028] Os técnicos na arte serão capazes de introduzir um dos polipeptídeos, um dos ácidos nucleicos ou um dos vetores, tais como descritos acima, na célula hospedeira por meio de métodos convencionais bem conhecidos. Por exemplo, pode ser feita menção ao tratamento com cloreto de cálcio, eletroporação, ou a utilização de uma pistola de partículas.

[0029] De acordo com uma modalidade, os técnicos na arte serão capazes de introduzir na célula hospedeira, e por meio de métodos convencionais, várias cópias de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que possui uma atividade de endoglucanase melhorada de acordo com a invenção.

[0030] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira isolada, tal como descrita acima, é escolhida a partir do grupo que compreende Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Myceliophthora, Chrysosporium, Penicillium, Fusarium, Thermomonospora, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia e Saccharomyces.

[0031] De acordo com uma modalidade preferencial, a célula hospedeira isolada, tal como descrita acima, é escolhida a partir do grupo que compreende Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, Humicola grisae, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca e Saccharomyces cerevisiae.

[0032] De acordo com uma modalidade preferencial, a célula hospedeira isolada, tal como descrita acima, é escolhida a partir de Trichoderma reesei e Saccharomyces cerevisiae.

[0033] Um objetivo adicional da invenção é a utilização de qualquer um dos polipeptídeos descritos acima para a hidrólise da celulose.

[0034] Um objetivo adicional da invenção é a utilização de qualquer um dos polipeptídeos descritos acima para a produção de biocombustível.

[0035] De acordo com a invenção, o termo "biocombustível" pode ser definido como sendo qualquer produto que resulta da conversão de biomassa e que pode ser utilizado para fins energéticos. Além disso, e sem pretender ficar limitado, podem ser citados, a título de exemplo, os biogases, produtos que podem ser incorporados (opcionalmente após a conversão subsequente) em um combustível ou podem ser um combustível no seu próprio direito, tais como álcoois (etanol, butanol e/ou isopropanol, dependendo do tipo de organismo fermentativo utilizado), solventes (acetona), ácidos (ácido butírico), lipídeos e derivados dos mesmos (ácidos graxos de cadeia curta ou cadeia longa, ésteres de ácidos graxos), e também hidrogênio.

[0036] Preferivelmente, o biocombustível de acordo com a invenção é um álcool, por exemplo, etanol, butanol e/ou isopropanol. Mais preferivelmente, o biocombustível de acordo com a invenção é o etanol.

[0037] Em outra modalidade, o biocombustível é biogás.

[0038] Em outra modalidade, o produto é uma molécula de interesse para a indústria química, por exemplo, outro álcool, tal como 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,4- butanodiol, 2,3-butanodiol, ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido propiônico, ácido acrílico, ácido butírico, ácido succínico, ácido málico, ácido fumárico, ácido cítrico ou ácido itacônico, ou hidroxiácidos tais como ácido glicólico, ácido láctico ou ácido hidroxipropiônico.

[0039] Uma modalidade de produção de um coquetel enzimático que é útil para a hidrólise do material lignocelulósico é descrita abaixo.

[0040] As cepas de fungos filamentosos, preferivelmente Trichoderma, mais preferivelmente T. reesei, capazes de expressar pelo menos um polipeptídeo de acordo com a invenção, são cultivadas em fermentadores na presença de um substrato à base de carbono, tal como lactose ou glicose, escolhido para o crescimento do micro-organismo. Em uma modalidade, este substrato à base de carbono, dependendo da sua natureza, é introduzido no fermentador antes da esterilização, ou é esterilizado separadamente e introduzido no fermentador após esterilização deste último de modo a obter uma concentração inicial de 20 g/l a 35 g/l.

[0041] Uma solução aquosa contendo o substrato escolhido para a produção das enzimas é então adicionada. Uma composição enzimática que atua sobre a biomassa lignocelulósica produzida pelos fungos é finalmente recuperada por filtração do meio de cultura. Nesta composição estão, em particular, a β-glicosidase, a exoglucanase e a endoglucanase, de acordo com a invenção.

[0042] Em uma modalidade, a solução aquosa contendo o substrato escolhido para a produção das enzimas é preparada a uma concentração de 200 g/l a 250 g/l. Esta solução adicionalmente contém, preferivelmente, um substrato indutor, tal como lactose. Esta solução aquosa é injetada após a exaustão do substrato inicial à base de carbono de modo a fornecer uma quantidade otimizada, entre 35 mg/l e 45 mg/g, de células ("batelada alimentada"). Durante esta fase de " batelada alimentada", a concentração residual de açúcar no meio de cultura é inferior a 1 g/l e as enzimas que atuam sobre a biomassa lignocelulósica são secretadas pelo fungo. O último pode ser recuperado por filtragem do meio de cultura.

[0043] Um objetivo da invenção é uma composição enzimática capaz de atuar sobre a biomassa lignocelulósica, sendo a referida composição enzimática produzida por fungos filamentosos e que compreende pelo menos um polipeptídeo que possui atividade de endoglucanase melhorada em relação à atividade de endoglucanase da proteína de referência EG1. O termo "fungos filamentosos" pretende significar, em particular, Trichoderma, mais preferivelmente T. reesei.

[0044] Finalmente, um objetivo da invenção é um processo para a produção de biocombustível a partir de biomassa, que compreende as seguintes etapas sucessivas: - suspensão, em uma fase aquosa, da biomassa a ser hidrolisada; - hidrólise, na presença de uma composição enzimática da biomassa lignocelulósica, tal como descrito acima, de modo a produzir um hidrolisado contendo glicose; - fermentação da glicose do hidrolisado de modo a produzir um mosto fermenteiro; - separação do biocombustível a partir do mosto fermentativo.

[0045] Em uma modalidade, a biomassa a ser hidrolisada é suspensa em uma fase aquosa em uma proporção de 6% a 40% de sólidos, preferivelmente de 20% a 30%. O pH é ajustado entre 4 e 5,5; preferivelmente entre 4,8 e 5,2, e a temperatura é ajustada entre 40°C e 60°C, preferivelmente entre 45°C e 50°C. A reação de hidrólise é iniciada pela adição da composição enzimática que atua sobre a biomassa lignocelulósica; a quantidade utilizada é normalmente de 10 mg a 30 mg de proteína excretada por grama de substrato pré- tratado ou menos. A reação dura, em geral, de 15 a 48 horas. A reação é monitorada por ensaio de liberação de açúcares, em particular, de glicose. A solução de açúcares é separada a partir da fração sólida não hidrolisada, constituída essencialmente de lignina, por filtragem ou centrifugação e, subsequentemente, tratada em uma unidade de fermentação.

[0046] Após a etapa de fermentação, o biocombustível é separado a partir do mosto fermentativo, por exemplo, através de destilação.

[0047] Outro objetivo da invenção é um processo para a produção de biocombustível a partir de biomassa, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas sucessivas: - suspensão, em uma fase aquosa, da biomassa a ser hidrolisada; - adição simultânea de uma composição enzimática, tal como definida acima e de um organismo fermentativo, de modo a produzir um mosto fermentativo; - separação do biocombustível a partir do mosto fermentativo.

[0048] Preferivelmente, a composição enzimática e o organismo fermentativo são adicionados ao mesmo tempo e, em seguida, incubados a uma temperatura entre 30°C e 35°C de modo a produzir um mosto fermentativo.

[0049] De acordo com esta modalidade, a celulose presente na biomassa é convertida em glicose, e ao mesmo tempo, no mesmo reator, o organismo fermentativo (por exemplo, uma levedura) converte a glicose e o produto final de acordo com uma SSF, processo conhecido pelos técnicos na arte. Dependendo da capacidade metabólica e hidrolítica do organismo fermentativo, pode ser necessária a adição de uma quantidade maior ou menor de mistura celulolítica com o intuito de que a operação proceda corretamente.

[0050] Em outra modalidade, o organismo fermentativo produz o polipeptídeo que constitui o objetivo da invenção através de secreção ou na superfície da sua célula, opcionalmente em conjunto com outras enzimas que atuam sobre a biomassa lignocelulósica, assim limitando ou eliminando a necessidade de enzimas produzidas pelo fungo filamentoso. Preferivelmente, o organismo fermentativo é uma célula hospedeira tal como descrita acima.

[0051] Assim, de um modo preferencial, um objetivo da invenção é um processo para a produção de biocombustível a partir de biomassa, que compreende as seguintes etapas sucessivas: - suspensão, em uma fase aquosa, da biomassa a ser hidrolisada; - adição de uma ou mais células hospedeiras, tal como descritas acima, com um organismo fermentativo e/ou uma composição enzimática, tal como descrito acima, de modo a produzir um mosto fermentativo; - separação do biocombustível a partir do mosto fermentativo.

[0052] Preferivelmente, as células hospedeiras com a composição enzimática e/ou o organismo fermentativo são adicionados e, em seguida, incubados a uma temperatura de entre 30°C e 35°C de modo a produzir um mosto fermentativo.

[0053] A utilização do polipeptídeo que possui uma atividade de endoglucanase melhorada, de acordo com a presente invenção, tem assim a vantagem de se obter um rendimento melhorado da produção de glicose, enquanto emprega menos enzima do que anteriormente, o que também fornece uma vantagem econômica.

[0054] Outros aspectos, vantagens, temas e características da invenção serão apresentados na leitura da descrição não restritiva que se segue e que descreve modalidades preferencias da invenção, dadas por meio de exemplos e figuras.

[0055] A Figura 1 é um gráfico que representa a hidrólise de 1% de CMC pela endoglucanase (EG1) de referência e o seu mutante (154E4) secretado para o meio de cultura pelas cepas Scα-EG1 e Scα-154E4, respectivamente.

[0056] A Figura 2 é um gráfico que apresenta os resultados de SHF para o coquetel derivado da cepa 154E4/8 (SEQ ID NO: 10), um coquetel de referência produzida pela cepa CL847 ΔEG1 (ΔEG1) suplementada com β-glicosidase e outro coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformada com o gene de referência EG1 (ΔEG1cEG1) suplementado com β-glicosidase.

[0057] A Figura 3 é um gráfico que apresenta os resultados de SHF para o coquetel derivado da cepa 11G8/10 (SEQ ID NO: 22), um coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 (ΔEG1) suplementada com β-glicosidase e outro coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformada com o gene de referência EG1 (ΔEG1cEG1) suplementado com β-glicosidase.

[0058] A Figura 4 é um gráfico que apresenta os resultados de SHF para os dois coquetéis derivados a partir das cepas 154E4/2 e 154E4/8 (SEQ ID NO: 10), um coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 (ΔEG1) suplementada com β-glicosidase e outro coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformada com o gene de referência EG1 (ΔEG1cEG1) suplementado com β- glicosidase.

[0059] A Figura 5 é um gráfico que apresenta os resultados de SSF para os três coquetéis derivados a partir das cepas 11G8/10, 11G8/12 e 11G8/13 (SEQ ID NO: 22), um coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 (ΔEG1) suplementada com β-glicosidase e outro coquetel de referência produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformada com o gene de referência EG1 (ΔEG1cEG1) suplementado com β- glicosidase.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Primeiro ciclo de L-shuffling

[0060] A sequência do gene de referência de Trichoderma reesei EG1 (SEQ ID NO: 1) foi submetida a um primeiro ciclo de L-shuffling, de acordo com o processo descrito no Documento EP1104457B1, com os genes de endoglucanase putativa de Chaetomium globosum (SEQ ID NO: 29) e da endoglucanase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 27) cada um possuindo aproximadamente 60% de identidade com o gene de referência da SEQ ID NO: 1.

1 - Rastreio de alto rendimento

[0061] Um teste de rastreio de alto rendimento foi desenvolvido com o intuito de selecionar os melhores clones resultantes do L-shuffling, isto é, aqueles que exibem melhoria de pelo menos 20% na atividade de endoglucanase em relação ao enzima de referência da SEQ ID NO: 2.

[0062] O teste de rastreio de alto rendimento foi realizado de acordo com as seguintes etapas: - isolamento em ágar dos clones de E. coli que expressam as variantes de L-shuffling da enzima recombinante de acordo com a invenção e pré-cultivo das referidas colônias em meio LB durante a noite a 37°C; - inoculação de um meio LB a 6% com a pré-cultura, seguida de incubação durante 5 horas a 37°C, depois 17 horas a 20°C; - centrifugação durante 10 minutos a 3.000 rpm; - lise das células por adição de 80 μl de uma solução - e lisozima a 1 mg/ml em um tampão de fosfato de citrato 0,1 M, com pH 5; - incubação durante 4 horas à temperatura ambiente; - adição de 80 μl de tampão de fosfato de citrato 0,1 M, pH 5, contendo 1% de carboximetilcelulose; - incubação durante 17 horas a 35°C; - centrifugação durante 10 minutos a 3.000 rpm; - remoção de 100 μl de sobrenadante; - adição de 100 μl de reagente DNS; - incubação durante 10 minutos a 100°C e depois 5 minutos em gelo; - leitura da DO a 540 nm em 120 μl.

[0063] Sob estas condições de rastreio de alto rendimento, uma melhoria da atividade de endoglucanase (aumento na DO a 540 nm) em relação à enzima referência EG1 (SEQ ID NO: 2) foi encontrada em vários clones, incluindo, em particular, os clones 76B4, 105F11, 107H12, 154E4, 202C12, 272A9, 278F10, 293B2 e 309A11.

2 - Determinação da melhoria na atividade de endoglucanase 2.1 - No substrato de carboximetilcelulose (CMC)

[0064] Com o intuito de estimar a kcat das variantes selecionadas no primeiro ciclo de L-shuffling em comparação com a enzima de referência (SEQ ID NO: 2), o seguinte procedimento é realizado: - preparação de uma cultura de reserva de E. coli que expressa uma enzima recombinante de acordo com a invenção durante a noite a 37°C; - inoculação de um meio de cultura LB com 1% de cultura de estoque a 37°C até uma densidade óptica a 600 nm de 0,4 ser obtida; - cultura das referidas células a 20°C durante 18 horas; - centrifugação durante cinco minutos a 7.900 rpm; - ressuspensão dos sedimentos de células com tampão de citrato fosfato 0,1 M com pH 5 contendo 1 mg/ml de lisozima (DO600 final de 100); - incubação das células ressuspensas durante 30 minutos em gelo; - lise das células por meio de 3 ciclos de congelamento / descongelamento; - fracionamento do DNA com ultrassons durante 3 segundos na potência 5; - centrifugação durante 30 minutos a 13.000 rpm; - incubação de 100 μl de sobrenadante de quebra com 100 μl de tampão de fosfato de citrato 0,1 M com pH 5 contendo 1% de CMC, durante 6 horas a 35°C e 50°C; - remoção de 100 μl de reação; - adição de 100 μl de reagente DNS; - incubação durante 5 minutos a 100°C; - incubação durante 3 minutos em gelo; - centrifugação durante 10 minutos a 3.000 rpm; - leitura da densidade ótica a 540 nm em 150 μl.

[0065] De acordo com a invenção, os valores da kcat são calculadas da seguinte forma: - expressão das DOs a 540 nm como uma função da quantidade de proteína de interesse (em nM); - subtração do valor do controle negativo; - divisão pelo coeficiente da faixa padrão de glicose (várias quantidades de glicose são reveladas com o DNS); - divisão pelo tempo de reação (360 minutos).

[0066] A Tabela 2 apresenta os valores kcat e também o fator de melhoria obtidos para os clones 76B4, 105F11, 107H12, 154E4, 202C12, 236C11, 272A9, 278F10, 293B2 e 309A11 em relação à proteína de referência EG1 (SEQ ID NO: 2) sob as condições experimentais do teste de atividade sobre CMC. TABELA 2: Atividade de endoglucanase em CMC

[0067] Os resultados mostram, para estes clones, uma melhoria da atividade enzimática em relação à enzima de referência da SEQ ID NO: 2.

2.2 - No substrato de celulose inchada com ácido fosfórico (PASC)

[0068] A melhoria da atividade dos clones 76B4, 105F11, 107H12, 154E4, 202C12, 236C11, 272A9, 278F10, 293B2 e 309A11 foi então confirmada em um segundo substrato: celulose inchada com ácido fosfórico (PASC).

[0069] A determinação da kcat sobre este substrato é realizada de acordo com o mesmo protocolo descrito acima. O substrato de CMC é substituído pelo substrato de PASC com a mesma concentração.

[0070] A Tabela 3 apresenta os valores kcat e também o fator de melhoria obtidos para os clones 76B4, 105F11, 107H12, 154E4, 202C12, 236C11, 272A9, 278F10, 293B2 e 309A11 em relação à proteína de referência EG1 (SEQ ID NO: 2) sob as condições experimentais do teste de atividade sobre PASC. TABELA 3: Atividade de endoglucanase em PASC

[0071] Estes resultados mostram uma melhoria na atividade enzimática em relação à enzima de referência EG1 (SEQ ID NO: 2).

Exemplo 2: Segundo ciclo de L-shuffling

[0072] Os genes melhorados 105F11, 154E4, 202C12, 272A9, 278F10 e 309A10 (respectivamente SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13, 15, 19) obtidos no primeiro ciclo da evolução foram posteriormente submetidos a um segundo ciclo de L-shuffling (ainda de acordo com o processo patenteado descrito no Documento EP1104457B1). Com o intuito de promover a reconstrução de uma espinha dorsal da sequência de Trichoderma, o gene de referência EG1 (SEQ ID NO: 1) foi reintroduzido como gene pai no segundo ciclo de L-shuffling.

1 - Rastreio de alto rendimento

[0073] Um teste de rastreio de alto rendimento, tal como descrito acima, foi realizado nos seguintes clones obtidos após o segundo ciclo de L-shuffling, de modo a selecionar os melhores. O teste de atividade foi reduzido para 2 horas (em comparação com as 17 horas para o rastreio dos clones resultantes do primeiro ciclo de evolução), com o intuito de ter em conta as melhorias obtidas com o primeiro ciclo de L-shuffling.

[0074] A atividade gerada pelos clones é comparada com a atividade obtida com o clone 154E4. Este clone, resultante do primeiro ciclo de L-shuffling, é aquele que tornou possível obter a melhoria mais elevada na atividade.

[0075] Sob estas condições de rastreio, uma melhoria da atividade de endoglucanase em relação ao clone de referência 154E4 (SEQ ID NO: 10) foi encontrada em vários clones, incluindo, em particular, os clones 11G8 e 240H12.

2 - Determinação da melhoria na atividade de endoglucanase 2.1 - No substrato de carboximetilcelulose (CMC)

[0076] Com o intuito de determinar a kcat, as atividades dos clones 11G8, 92A12 e 240H12 foram medidas utilizando-se o teste de atividade, tal como descrito acima. A duração do teste de atividade foi reduzida para uma hora de incubação com o substrato, com o intuito de ter em conta as melhorias destes clones.

[0077] A Tabela 4 apresenta os valores de kcat e também o fator de melhoria obtidos para os clones 11G8, 92A12 e 240H12 em relação ao clone 154E4 (SEQ ID NO: 10), sob estas condições experimentais. TABELA 4: Atividade de endoglucanase em CMC

[0078] Os resultados mostram uma melhoria da atividade em relação ao clone de referência 154E4 para os clones 11G8 e 240H12.

2.2 - No substrato de celulose inchada com ácido fosfórico (PASC)

[0079] A melhoria da atividade dos clones 11G8, 92A12 e 240H12 foi então confirmada em um segundo substrato: celulose inchada com ácido fosfórico (PASC).

[0080] Com o intuito de determinar a kcat, a atividade destes clones foi medida a 35°C e 50°C, utilizando- se o teste de atividade, tal como descrito acima com PASC como substrato.

[0081] A Tabela 5 apresenta os valores de kcat e também o fator de melhoria obtidos para os clones 11G8, 92A12 e 240H12 em relação ao clone 154E4 (SEQ ID NO: 10), sob estas condições experimentais. TABELA 5: Atividade de endoglucanase em PASC

[0082] A atividade do clone 11G8 não é melhorada a 35°C neste substrato em relação ao clone de referência 154E4. Por outro lado, a atividade do clone 11G8 é melhorada a 50°C. A atividade do clone 240H12 é melhorada a 35°C e a 50°C.

EXEMPLO 3: Clonagem de uma variante de endoglucanase 1 resultante a partir do primeiro ciclo de L-shuffling em uma cepa de T. reesei CL847 ΔEG1

[0083] A construção do fragmento de DNA a ser inserido em T. reesei, contendo o clone 154E4 resultante do primeiro ciclo de L-shuffling, foi realizada por PCR de fusão. O fragmento de aproximadamente 5,4 kb de comprimento constituído pelo gene de resistência à fleomicina, e a sequência de codificação do clone 154E4 sob o controle do promotor cbh1 e seguido pelo terminador cbh1. Da mesma forma, o gene de referência T. reesei EG1 (SEQ ID NO: 1) foi amplificado e fundido entre o promotor e o terminador cbh1, resultando em uma segunda construção.

[0084] Os protoplastos de uma cepa de T. reesei CL847 ΔEG1 foram transformados de acordo com um método convencional conhecido pelos técnicos na arte, através de choque de PEG e cálcio, com 5 μg de cada construto, a saber, o fragmento de DNA contendo o gene 154E4 ou o gene EG1. Os transformantes foram selecionados em meio seletivo de PDA/sacarose contendo 30 μg/l de fleomicina. Quatorze clones de cada transformação foram subcultivados. Após três subculturas, com o intuito de isolar clones puros, sete clones tendo integrado o gene nativo e cinco clones tendo integrado a variante 154E4 e secretando um nível de proteína comparável ao nível da cepa CL847, foram finalmente obtidos.

1 - Rastreio utilizando um teste de atividade em carboximetilcelulose (CMC)

[0085] Os 11 clones foram cultivados em placas de 24 poços contendo o seguinte meio: 800 μl de H3PO4 85%, 4,2 g de (NH4)2SO4, 0,3 g de MgSO4. 7H2O, 1,5 g de CornSteep, 1 ml de Oligo Ferment, 11,6 g de ácido maleico, 10 g de Solka- Floc e 20 g de lactose por litro de meio. O pH é ajustado entre 5,8 e 6,0. Após 5 dias de cultura a 30°C, o sobrenadante é removido e o equivalente a 10 mg/l de proteínas (medida pelo método de Lowry) é utilizado para um teste de atividade de CMC. 150 μl de uma solução de CMC a 2% em tampão de 50 mM de citrato, pH 4,8, são misturados com 150 μl de tampão de citrato contendo 10 mg/l de proteínas. A reação é incubada a 50°C ou 35°C durante 10 minutos e em seguida inativada em um banho de água fervente. Depois da centrifugação durante 5 minutos, 20 μl do sobrenadante são removidos com o intuito ensaiar açúcares redutores utilizando ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS). A redução do DNS e a formação de ácido 3-amino-5-nitrossalicílico são monitoradas através da leitura da absorção a 540 nm e os açúcares redutores são quantificados utilizando uma gama de glicose.

[0086] A Tabela 6 resume as atividades obtidas com os clones contendo a variante 154E4, em comparação com a cepa de referência CL847, a cepa CL847 ΔEG1, e a cepa CL847 ΔEG1 retransformadas com o gene de referência EG1 (ΔEG1cEG1, média obtida com os quatro melhores transformantes). TABELA 6: Atividade de endoglucanase em CMC

[0087] Os resultados mostram que as atividades dos variantes 154E4 tão entre 1,2 e 1,4 vezes maiores do que as atividades dos clones retransformados com o gene de referência EG1 (SEQ ID NO: 1). A melhoria pode ser vista a 35°C e a 50°C.

2 - Clonagem de variante 11G8 obtido após o segundo ciclo de L-shuffling em uma cepa de T. reesei CL847 ΔEG1 e rastreio dos transformantes:

[0088] A variante 11G8 foi clonada entre o promotor e o terminador cbh1 no plasmídeo pUT1040 contendo um gene de resistência à fleomicina como marcador, por meio de uma dupla digestão BamH1/XhoI. 5 μg deste vetor foram utilizados para transformar a cepa de T. reesei CL847 ΔEG1. A transformação dos protoplastos foi realizada sob as mesmas condições utilizadas para a variante 154E4. No final do processo de transformação, e para as três subculturas sucessivas efetuadas com o objetivo da obtenção de clones puros, treze clones com produção de proteína semelhante à cepa CL847 foram obtidos e submetidos ao rastreio por medição da atividade de CMCase. O teste de atividade é idêntico para o rastreio de clones que contêm a variante 154E4 a partir do primeiro ciclo de L-shuffling. Seis clones que expressam a variante 11G8 mostram uma atividade de CMCase que é maior do que a da cepa ΔEG1cEG. Os dois melhores transformantes possuem uma atividade aumentada em 70% em comparação com a cepa que expressa o gene de referência EG1 (SEQ ID NO: 1).

[0089] A Tabela 7 resume as atividades obtidas com os clones contendo a variante 11G8, em comparação com a cepa de referência CL847, a cepa CL847 ΔEG1 e a cepa CL847 ΔEG1 retransformadas com o gene de referência (ΔEG1cEG1, média obtida com os melhores quatro transformantes). TABELA 7: Atividade de endoglucanase em CMC

[0090] Os resultados mostram que as atividades das variantes 11G8 são entre 1,1 e 1,7 vezes maiores do que as atividades dos clones retransformados com o gene de referência da SEQ ID NO: 1. A melhoria pode ser vista a 35°C e a 50°C.

Exemplo 4: Expressão recombinante da endoglucanase EG1 de referência e da variante 154E4 melhorada em Saccharomyces cerevisiae 1 - Produção de EG1 de referência e proteínas de 154E4 no meio extracelular

[0091] Os genes de endoglucanase de Trichoderma reesei (EG1) e da variante 154E4 foram clonados, sem o seu peptídeo sinal, no vetor pESC-LeuαΔmyc (CNRS-CERMAV). Esta construção permite a expressão de proteínas no meio de cultura da cepa de Saccharomyces cerevisiae EBY100, que é auxotrófica para leucina e triptofano (Boder E.T. e Wittrup K.D., Biotechnol Prog, 1998, 14: 55-62). Este plasmídeo faz com que seja possível colocar a expressão dos genes sob o controle do promotor GAL1 induzível por galactose e possui o gene marcador selecionável de auxotrofia (Leu2) que permite a seleção dos transformantes.

[0092] A transformação de Saccharomyces cerevisiae EBY100 foi realizada de acordo com os métodos convencionais conhecidos pelos técnicos na arte (transformação de leveduras por choque térmico e acetato de lítio). Os transformantes foram selecionados em meio 0,67%YNB-2%Glc-0,01%Trp.

[0093] Um transformante para cada gene (Scα-EG1 e Scα-154E4) foi utilizado para inocular 15 ml de um médio mínimo 0,67%YNB-2%Glc-SD-0,01%Trp. SD é uma mistura de aminoácidos (40 mg/l de sulfato de adenina, 20 mg/l de L- arginina; 100 mg/l de ácido aspártico; 100 mg/l de ácido L- glutâmico; 20 mg/l de L-histidina; 30 mg/l de L-lisina, 20 mg/l de L-metionina; 50 mg/l de L-fenilalanina; 375 mg/l de L-serina; 200 mg/l de L-treonina; 30 mg/l de L-tirosina; 150 mg/l de L-valina e 20 mg/l de uracil). Após 24 horas de pré- cultura a 30°C com agitação a 220 rpm, as duas cepas de Scα- EG1 e de Scα-154E4 foram utilizadas para inocular (DO600 de 0,5) a 150 ml de meio 0,67%YNB-2%Gal-SD-0,01%Trp. As culturas foram incubadas a 25°C com agitação a 220 rpm. Após 8 horas de incubação, 6 ml de citrato de sódio com pH 5,6 foram adicionados a cada cultura, com o intuito de estabilizar o pH em 5.

[0094] Após 4 dias de incubação, 20 ml de cultura foram removidos. O sobrenadante da cultura foi obtido depois de centrifugação a 3.000 g, a 4°C, durante 5 minutos.

2 - Determinação da atividade de endoglucanase em p- nitrofenil-β-lactosídeo

[0095] A atividade de endoglucanase dos sobrenadantes de cultura foi medida por meio de hidrólise do substrato de p-nitrofenil-β-lactosideo (pNPL) em um volume de 700 μl nas seguintes condições: - 50 mM de tampão de citrato com pH 5; - 2 mM de pNPL; - 605 μl e 90 μl de sobrenadante de cultura a partir das cepas Scα-154E4; - incubação a 35°C ou 50°C durante 30 minutos para a cepa Scα-EG1.

[0096] A reação foi interrompida pela adição de 100 μl de 1M de carbonato de sódio para 100 μl do meio de reação. A concentração de para-nitrofenol (PNP) liberado por hidrólise de pNPL foi determinada medindo-se a absorvância a 415 nm por comparação com uma escala padrão de para- nitrofenol (linear de 0,36 uM a 360 uM).

[0097] A Tabela 8 apresenta os resultados da atividade de endoglucanase (“EA”, na sigla em inglês, em nmol.min-1.ml-1 de cultura) em pNPL a 35°C e 50°C do meio de cultura das cepas ScαEG1 e Scα-154E4. TABELA 8: Atividade de endoglucanase em pNPL a 35°C e 50°C do meio de cultura das cepas ScαEG1 e Scα-154E4.

[0098] Os resultados obtidos mostram uma melhoria a 35°C na atividade enzimática da cepa Scα-154E4 por um fator de cerca de 40 em relação à cepa que expressa a proteína de referência T. reesei EG1 (SEQ ID NO: 2). A magnitude da melhoria da atividade comparada com E. coli e T. reesei, sugere que a enzima não só possui uma atividade específica melhorada, mas que também é sobre- expressa e/ou melhor secretada.

3- Determinação da atividade de endoglucanase em carboximetilcelulose

[0099] A atividade de endoglucanase dos sobrenadantes de cultura foi medida por meio de hidrólise de carboximetilcelulose (CMC) em um volume de 700 μl nas seguintes condições: - 50 mM de tampão de citrato com pH 5; - 1% de CMC; - 210 μl de sobrenadante de cultura de cepas Scα-EG1 e Scα -154E4 respectivamente dialisadas contra 50 nM de tampão de citrato, pH 5, em uma membrana de 10 kDa, e concentradas duas vezes; - incubação a 35°C durante 48 horas.

[0100] A reação foi interrompida pela adição de 150 μl de reagente de DNS para 100 μl do meio de reação. Depois aquecimento durante 5 minutos a 100°C e arrefecimento em gelo, a quantidade de açúcares redutores liberados foi determinada medindo-se a absorvância a 550 nm por comparação com uma escala padrão produzida com glicose.

[0101] A Figura 1 apresenta os resultados da hidrólise de CMC a 1% pela endoglucanase EG1 de referência (SEQ ID NO: 2) e o seu mutante 154E4 (SEQ ID NO: 10), respectivamente, secretados para o meio de cultura das cepas Scα-EG1 e Scα-154E4.

[0102] Os resultados da Figura 1 mostram que, durante as primeiras horas de reação, a quantidade de açúcares redutores liberados por 1 ml de cultura da cepa Scα-154E4 é aproximadamente 10 vezes maior do que 1 ml de Scα-EG1. A magnitude da melhoria da atividade comparada com E. coli e T. reesei sugere que a enzima não só possui uma atividade específica melhorada, mas que também é sobre- expressa e/ou melhor secretada.

Exemplo 5: Produção de enzimas por T. reesei em frascos alimentados

[0103] As cepas de referência e aquelas que possuem a melhor atividade sobre CMC (CL847, ΔEG1, ΔEG1cEG1, 154E4/2, 154E4/8, 11G8/10, 11G8/12, 11G8/13) foram cultivadas em fracos Erlenmeyer de250 ml, 55 ml de meio F45 (10 g/l de tampão de biftalato de potássio, pH 6, 4,2 g/l de (NH4)2SO4, 300 mg/l de MgSO4.7H2O, 150 mg/l de CaCl2.2H2O, 1,5 g/l de cornsteep, ácido ortofosfórico a 0,07%, 5 mg/l de FeSO4, 1,4 mg/l de MnSO4, 1,4 mg/l de ZnSO4, 3,7 mg/l de CoCl2 e 12,5 g/l de glicose) são inoculadas e agitadas a 150 rpm e 30°C. A produção de enzima é realizada em duas fases: uma fase de batelada em glicose e uma fase de batelada alimentada em lactose. Amostras regulares tornam possível determinar o momento em que a concentração de glicose vai abaixo de 3 g/l. Nesta fase, a alimentação da batelada alimentada utilizando uma bomba de seringa (6-vias) é iniciada. As culturas são alimentadas com uma solução de 50 g/l de lactose e 0,3% de NH3 a uma taxa de fluxo de 40 mg de açúcar / grama de biomassa por hora. Amostras diárias são tomadas com o intuito de determinar o pH, o peso seco e a concentração de proteínas no sobrenadante. Após 5 dias de cultura em batelada alimentada, a cultura é filtrada através de um filtro de 0,45 μm e o sobrenadante é congelado.

[0104] A concentração final de proteínas foi de cerca de 3 g/l a 4 g/l. Se a concentração for inferior a 3 g/l, os sobrenadantes foram concentrados em uma coluna (Vivaspin MWCO5, Sartorius).

Exemplo 6: Eficácia das enzimas resultantes da L-shuffling na hidrólise da biomassa lignocelulósica de acordo com um processo de SHF

[0105] O substrato de referência utilizado é uma palha de trigo que foi submetida a um pré-tratamento de explosão de vapor (19 bar - 3 minutos) após impregnação ácida com 0,01% de H2SO4 durante 10 horas, e sendo lavada, neutralizada em pH 5, prensada e seca. A Tabela 9 apresenta a composição do substrato de referência. Tabela 9: Composição da palha utilizada para os ensaios de hidrólise

[0106] As hidrólises foram realizadas a 10% de sólidos em peso, isto é, um equivalente de 5,4% de celulose em peso. O teor de proteínas foi fixado em 10 mg/g de sólidos, isto é, aproximadamente 19 mg/g de celulose. A concentração dos coquetéis enzimáticos foi medida pelo método de Lowry utilizando BSA como referência. Cada coquetel foi suplementado com atividade de β-glicosidase em uma quantidade de 120 ± 2 UI/g de celulose, através da adição de SP188 β-glicosidase (Novozymes).

[0107] Os testes são realizados em tubos Eppendorf com uma capacidade de trabalho de 2 ml (capacidade de reação de 1 g) contendo: - 0,11 ± 0,001 g de substrato de palha lavada, - 0,9 ± 0,02 ml de meio de reação de hidrólise composto por 50 mM de tampão de acetato, pH 4,8, e cloranfenicol (0,05 g/l), - entre 0,1 e 0,2 ± 0,02 g de coquetel enzimático em função do seu teor de proteína.

[0108] As hidrólises enzimáticas são realizadas a 45°C ± 2°C com agitação do tipo vortex a 900 rotações por minuto em um Eppendorf Thermomixer Comfort.

[0109] Todos os testes são realizados em duplicado com tempos de amostragem fixos em t 24, 48 e 96 horas, com algumas amostras colhidas em t 72 horas.

[0110] Em cada instante de tempo de amostragem, os hidrolisados são fervidos durante 5 minutos, em tubos Eppendorf sacrificados. Esses tubos são, em seguida, arrefecidos e centrifugados. O ensaio de glicose é realizado por HPLC. Em paralelo, os resíduos sólidos de cada tubo Eppendorf são lavados e centrifugados 3 vezes antes de serem secos a 105°C durante 24 horas de forma a avaliar os Sólidos Insolúveis em Água (WIS, na sigla em inglês). O rendimento de hidrólise é calculado tendo em conta o valor de WIS.

[0111] Os coquetéis resultantes do Exemplo 5 foram avaliados. Dois ensaios de controle são realizados com os coquetéis de referência também suplementados com β- glicosidase para comparação: um coquetel produzido pela cepa ΔEG1 CL847 (ΔEG1) e um coquetel produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformado com o gene de referência EG1 (ΔEG1cEG1).

[0112] A Figura 2 apresenta os resultados de SHF para o coquetel resultante da cepa 154/8 que expressa a variante 154E4 (SEQ ID NO: 10).

[0113] Os resultados apresentados na Figura 2 mostram que a taxa inicial de hidrólise do coquetel produzido pela variante 154E4 é maior do que aquelas dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG1. O rendimento da hidrólise final é também maior do que a dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG1.

[0114] A Figura 3 apresenta os resultados de SHF para o coquetel resultante da cepa 11G8/10 que expressa a variante 11G8 (SEQ ID NO: 22).

[0115] Os resultados apresentados na Figura 3 mostram que a taxa inicial de hidrólise do coquetel produzido pela variante de 11G8 é maior do que aquelas dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG1. O rendimento da hidrólise final é também maior do que a dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG1.

Exemplo 7: Eficácia das enzimas na hidrólise de biomassa lignocelulósica de acordo com um processo de SSF

[0116] O substrato utilizado é o mesmo que o descrito na Tabela 9 (Exemplo 6).

[0117] As SSF são realizadas em triplicado em reatores laboratoriais. Os referidos reatores constituídos pelos seguintes elementos: - um frasco de vidro com um 30 ml de capacidade de trabalho; - uma rolha de segurança de poliéter éter cetona (PEEK); - uma válvula de via única DV-118 vendida pela empresa Vaplock ligada através da rolha. A válvula é configurada para abrir a saída quando a pressão relativa no frasco é maior do que 70 mbar; - um tubo oco de polipropileno, provido através de um segundo, que passa através da rolha, e equipado na extremidade inferior do referido tubo com um septo; - uma vedação plana disposta entre o gargalo da garrafa e rolha.

[0118] O princípio para o funcionamento dos biorreatores é a seguinte: O CO2 produzido durante a fermentação alcoólica acumula-se no espaço superior situado acima do meio de reação, causando, através de acumulação, um aumento na pressão no biorreator (PG). Quando PG torna-se maior do que a pressão para abrir a válvula via única (PS), a referida válvula é aberta para permitir que uma quantidade de gás escape, sendo a referida quantidade, por exemplo, determinada por pesagem. Quando PG < PS, a válvula se fecha novamente até que PG seja maior do que PS. Deste modo, o biorreator durante a operação está sempre sob pressão, de modo a assegurar um meio anaeróbico estável durante a fermentação. A quantidade de etanol produzida é avaliada pela produção de CO2 estimada pela perda de peso com base na seguinte equação estequiométrica para a fermentação de glicose em etanol: C6H12O6 (glicose) ^ 2 CO2 + 2 CH3CH2OH (etanol) + energia

[0119] O meio de cultura utilizado para a SSF é um meio aquoso que compreende: - 50 mM de tampão de acetato com pH 5; - cloranfenicol a 0,1 g/l; - meio nutritivo contendo 3 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4, 0,4 g/l de MgSO4. 7H2O e 1 g/l de extrato de levedura.

[0120] As SSF foram realizadas a 10 ± 0,01% em peso de sólidos, isto é, um equivalente de 5,4% de celulose em peso de uma massa total de reação de 15 ± 0,003 g. O teor de proteínas foi fixado em 10 ± 0,01 mg de celulases por grama de sólidos, isto é, aproximadamente 19 mg/g de celulose. A concentração dos coquetéis enzimáticos foi medida pelo método de Lowry utilizando Albumina de Soro Bovino (BSA, na sigla em inglês) como referência. Cada coquetel foi suplementado com atividade de β-glicosidase em uma quantidade de 120 ± 2 UI/g de celulose, adicionando SP188 β- glicosidase (Novozymes).

[0121] A levedura de fermentação de açúcar (Saccharomyces cerevisiae, cepa Ethanol Red, Fermentis, França) é adicionada ao meio de modo a obter um teor de 2 ± 0,1 g/kg.

[0122] As enzimas e as leveduras são adicionadas aos biorreatores após uma hora de condicionamento da palha de trigo que tenha sido pré-tratada a 35°C com o tampão, cloranfenicol e meio de cultura.

[0123] A reação de SSF é realizada a uma temperatura de aproximadamente 35°C, colocando-se o biorreator laboratorial em uma incubadora padrão HT Multitron com uma velocidade de rotação orbital de 150 revoluções por minuto.

[0124] Ao longo do tempo, a perda de peso foi monitorada através da pesagem dos biorreatores. No final da reação, o mosto fermentativo é aquecido a 100°C durante 5 minutos, arrefecido e centrifugado para separar os sólidos não hidrolisados a partir do licor de fermentação. Este último é, em seguida, analisado por cromatografia gasosa, com o intuito de determinar a concentração de etanol.

[0125] Foram avaliados os coquetéis resultantes do Exemplo 5. Dois ensaios de controle são realizados com os coquetéis de referência também suplementados com β- glicosidase para comparação: um coquetel produzido pela cepa ΔEG1 CL847 (ΔEG1) e um coquetel produzido pela cepa CL847 ΔEG1 retransformados com o gene de referência EG1 (ΔEG1cEG1).

[0126] A Figura 4 apresenta os resultados de SSF para os 2 coquetéis que expressam a 154E4 endoglucanase (média dos resultados obtidos com as 2 variantes).

[0127] Os resultados apresentados na Figura 4 mostram que a progressão (produção de etanol para a mesma dose de enzimas) da SSF ao longo de 100 horas para os 2 coquetéis que expressam 154E4 endoglucanase é maior do que a dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG1.

[0128] A Figura 5 apresenta os resultados de SSF para os 3 coquetéis que expressam a 11G8 endoglucanase (média dos resultados obtidos com as 2 variantes).

[0129] Os resultados apresentados na Figura 5 mostram que a progressão da SSF ao longo de 100 horas para os 3 coquetéis que expressam 11G8 endoglucanase (média) é maior do que a dos coquetéis de referência ΔEG1 e ΔEG1cEG1.

Claims (13)

1. Polipeptídeo isolado ou purificado, caracterizado pelo fato de ter uma atividade melhorada de endoglucanase em comparação com a atividade de endoglucanase da proteína de referência EG1 conforme definida na SEQ ID NO: 2, sendo o referido polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo de uma sequência de aminoácidos escolhida a partir de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 26.

2. Polipeptídeo isolado ou purificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter uma atividade melhorada de endoglucanase a 35oC em comparação com a atividade de endoglucanase da proteína de referência EG1.

3. Ácido nucleico purificado ou isolado caracterizado pelo fato de ser escolhido dentre as seguintes sequências: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 25 em que ele codifica pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1.

4. Vetor caracterizado pelo fato de compreender um ácido nucleico como definido na reivindicação 3.

5. Célula hospedeira isolada caracterizada pelo fato de compreender o ácido nucleico como definido na reivindicação 3 ou o vetor como definido na reivindicação 4, em que a referida célula é escolhida dentre Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Penicillium, Fusarium, Thermomonospora, Myceliophthora, Chrysosporium, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia e Saccharomyces.

6. Célula hospedeira isolada de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de ser escolhida dentre Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisae, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca e Saccharomyces cerevisiae.

7. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a hidrólise de celulose.

8. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a produção de biocombustíveis.

9. Composição enzimática capaz de atuar sobre a biomassa lignocelulósica, a referida composição enzimática caracterizada pelo fato de ser produzida por fungos filamentosos e compreender pelo menos um polipeptídeo como definido na reivindicação 1.

10. Processo para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas sucessivas: - suspender, em uma fase aquosa, a biomassa a ser hidrolisada; - hidrolisar, na presença de uma composição enzimática como definida na reivindicação 9, a biomassa lignocelulósica de modo a produzir um hidrolisado contendo glicose; - fermentar a glicose do hidrolisado de modo a produzir um bolor de fermentação; - separar o biocombustível do bolor de fermentação.

11. Processo para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas sucessivas: - suspender, em uma fase aquosa, a biomassa a ser hidrolisada; - adicionar simultaneamente uma composição enzimática como definida na reivindicação 9 e um organismo fermentativo, de modo a produzir um bolor de fermentação; - Separar o biocombustível do bolor de fermentação.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o organismo fermentativo é escolhido a partir de uma célula hospedeira como definida na reivindicação 5.

13. Processo para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas sucessivas: - suspender, em uma fase aquosa, a biomassa a ser hidrolisada; - adicionar uma ou mais células hospedeiras como definidas em qualquer uma das reivindicações 5 a 6, com um organismo fermentativo e/ou uma composição enzimática como definida na reivindicação 11, de modo a produzir um bolor de fermentação; - separar o biocombustível a partir do bolor de fermentação.

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