ES2682798T3 - Variantes de la endoglucanasa con actividad mejorada y sus usos - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado o purificado caracterizado por que tiene una actividad endoglucanasa mejorada con respecto a la actividad endoglucanasa de la proteína de referencia EG1, dicho polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en: i) una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26; ii) una secuencia de aminoácidos que presentan, con respecto a la secuencia, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26 un porcentaje de identidad de al menos 90 %, preferentemente 95%, 98 % o 99 %, o una secuencia de aminoácidos que presenta, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, un porcentaje de identidad de al menos 98%.

Description

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DESCRIPCION

Variantes de la endoglucanasa con actividad mejorada y sus usos Estado de la tecnica

La posibilidad de producir etanol a partir de celulosa ha recibido una gran atencion debido a la disponibilidad de grandes cantidades de materia prima asf como al interes del etanol como combustible. Las materias primas naturales celulosicas para tal procedimiento se denominan con el termino "biomasa". Numerosos tipos de biomasa, por ejemplo madera, residuos agrfcolas, cultivos herbaceos y desechos solidos municipales, se han considerado como posibles materias primas para la produccion de biocombustibles. Estas materias estan constituidas principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina.

La celulosa es un polfmero compuesto por moleculas de glucosa unidas por enlaces beta 1-4, que son muy resistentes a la degradacion o a la despolimerizacion. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa, esta se fermenta facilmente a biocombustible, por ejemplo etanol, utilizando levadura.

Los metodos mas antiguos estudiados para convertir celulosa en glucosa se basan en la hidrolisis acida. Este procedimiento puede realizarse en presencia de acidos concentrados o diluidos. Sin embargo, varios inconvenientes tales como la escasa recuperacion del acido cuando se utilizan acidos concentrados y la baja produccion de glucosa en el contexto del uso de acidos diluidos son perjudiciales para la economfa del procedimiento de hidrolisis acida.

Con el fin de superar las desventajas del procedimiento de hidrolisis acida, los procedimientos de conversion de celulosa han aumentado mas recientemente en la hidrolisis enzimatica, utilizando enzimas tipo celulasa. Sin embargo, esta hidrolisis enzimatica de la biomasa lignocelulosica (por ejemplo, celulosa) presenta el inconveniente de ser un procedimiento industrial costoso. Por lo tanto, es necesario utilizar cepas de microorganismos que secretan celulasa cada vez mas eficientes. Como tal, muchos microorganismos constan de enzimas que hidrolizan la celulosa, tales como hongos Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Fusarium, asf como bacterias tales como Thermomonospora, Bacillus, Cellulomouas y Streptomyces. Las enzimas secretadas por estos microorganismos poseen tres tipos de actividades utiles en la conversion de celulosa en glucosa y se dividen en tres grupos: las endoglucanasas, que atacan las fibras de celulosas al azar de forma interna, las exoglucanasas que atacaran los extremos de las fibras liberando celobiosa y las p-glucosidasas que hidrolizaran esta celobiosa en glucosa. Otras clases de enzimas tales como hemicelulasas o la clase de enzimas recientemente descubierta de polisacaridos monooxigenasas tambien pueden desempenar un papel en la eficacia de la hidrolisis.

Existe un fuerte interes industrial en reducir el costo de la hidrolisis enzimatica, y esta reduccion implica el uso de una dosis reducida de enzimas y, por lo tanto, cocteles enzimaticos mas eficaces. En consecuencia, varias solicitudes de patente describen enzimas naturales con capacidades superiores a las de Trichoderma reesei, o variantes mejoradas por ingenierfa genetica. Se pueden mencionar las solicitudes de patente US2010304464, WO2010066411 y WO2013029176 con respecto a las exoglucanasas, las solicitudes WO2007109441, WO2012149192, WO2012036810 y WO21010076388 con respecto a las endoglucanasas, las solicitudes WO2010029259, WO2010135836, WO2012044915, WO2011057140 o WO2010022518 con respecto a las p- glucosidasas, o las solicitudes WO12135659, WO12149344 con respecto a los polisacaridos monoxigenasas.

La solicitud WO2011/153516 describe asimismo cepas de levaduras que expresan enzimas sacarolfticas.

La solicitud WO2013028701 tambien describe variantes de glicosido hidrolasa GHG61.

La solicitud WO2008141131 describe protefnas que tienen una actividad celulolftica mejorada.

Gunseli Bayram Akcapinar et al. describen la produccion de endonucleasa I de Trichoderma reesei en Journal of Biotechnology, vol. 159, n.° 1-2, mayo de 2012, paginas 61-68.

Las enzimas que hidrolizan la biomasa lignocelulosica se clasifican en el sistema CAZy (Cantarel, B.L., Coutinho, P. M., Rancurel, C., Bernard, T., Lombard, V., y Henrissat, B. (2009). The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic acids research, 37, D233-8) en criterios principalmente estructurales. Las endoglucanasas pueden pertenecer a familias GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 16, 18, 19, 26, 44, 45, 48, 51, 74 y 124.

Para que una hidrolisis de la biomasa lignocelulosica sea eficiente y economicamente rentable, la mezcla enzimatica debe tener proporciones equilibradas de enzimas que tienen actividades enzimaticas diversas, entre otras, pero no exclusivamente, de tipo exoglucanasas, endoglucanasas, xilanasas y p-glucosidasas. A modo de ejemplo, en las mezclas nativas de Trichoderma reesei, se observa generalmente la presencia de 60-70 % de exoglucanasas, 1520 % de endoglucanasas, algunos porcentajes de hemicelulasas y aproximadamente 5-10 % de p-glucosidasas. Esta mezcla es adecuada para hidrolizar la mayorfa de los sustratos pretratados (p. ej., tipo paja de trigo explotada al vapor en condiciones acidas) con rendimientos aceptables. En resumen, el aumento en la actividad de la

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endoglucanasa no debe hacerse a expensas de otras actividades enzimaticas. Las especificidades funcionales de estas enzimas son hoy en dfa poco conocidas. El genoma de Trichoderma reesei consta de al menos 3 enzimas principales, procedentes de las familias 7 (EG1, cel7b), 5 (EG2, cel5a) y 12 (EG3, Ce112a). Las enzimas EG1 y EG2 son las principales endoglucanasas y pueden representar hasta 10-20 % en masa del coctel de enzimas completo producido por T. reesei.

Las endoglucanasas (EC 3.2.1.4), las primeras enzimas que actuan sobre la celulosa, son conocidas por tener un papel principal en la hidrolisis al aumentar el numero de sitios que pueden atacar las exoglucanasas al tiempo que disminuye el grado de polimerizacion de las microfibrillas atacadas. Trabajos recientes (Szijarto, N., Siika-aho, M., Sontag-Strohm, T., y Viikari, L. (2011). Liquefaction of hydrothermally pretreated wheat straw at high-solids content by purified Trichoderma enzymes. Bioresource technology, 102(2), 1968-74) destacan su papel en la reduccion de la viscosidad de la biomasa durante las primeras horas de hidrolisis. Esta disminucion en la viscosidad puede tener un impacto muy significativo en los costos operativos del procedimiento.

El problema de la viscosidad se ve agravado en el caso de procedimientos que obligan a utilizar una temperatura baja, tal como sacarificacion y fermentacion simultaneas (SFS), que involucra tanto a las enzimas que hidrolizan la biomasa como al microorganismo que convierte los monomeros de azucares en etanol.

La hidrolisis y la fermentacion se pueden llevar a cabo de acuerdo con diferentes esquemas. El mas comun consiste en una hidrolisis y una fermentacion separadas (HFS) (SHF-Separate Hydrolysis and Fermentation). Este metodo permite optimizar cada etapa manteniendo condiciones optimas de reaccion. Esta fermentacion se efectua de manera extemporanea, a una temperatura comprendida entre aproximadamente 28 °C y aproximadamente 30 °C, mientras que la hidrolisis tiene lugar generalmente a una temperatura de al menos 45 °C. Sin embargo, en HFS, los azucares liberados al final de reaccion estan presentes a una concentracion muy alta y causan una inhibicion de las enzimas, ralentizando la eficacia del procedimiento. Para evitar estos inconvenientes, se puede prever otro tipo de procedimiento. En SFS, las dos etapas (hidrolisis y fermentacion de hexosas) tienen lugar de manera simultanea, evitando la acumulacion de azucares en concentraciones inhibidoras para las enzimas. Los costos de inversion tambien se reducen mediante el uso de un solo reactor. La tasa de hidrolisis es mas elevada como resultado de la ausencia de inhibicion ya que los azucares liberados se utilizan inmediatamente para la fermentacion de etanol. En este metodo, la temperatura del reactor constituye necesariamente un compromiso entre las temperaturas optimas de hidrolisis y fermentacion, normalmente entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 35 °C. Sin embargo, a dicha temperatura, la actividad de las enzimas celulolfticas disminuye aproximadamente un 30 %.

La SFS tambien permite la expresion de enzimas que degradan la celulosa en el organismo que fermenta los azucares, lo que permite limitar, o en un caso extremo, suprimir el uso de enzimas producidas en una etapa separada. Sin embargo, producir grandes cantidades de enzimas con los organismos fermentativos y de este modo obtener una actividad importante puede resultar problematico y limita la viabilidad de estos enfoques.

En consecuencia, la obtencion de enzimas que mantienen una actividad endoglucanasa eficaz a temperaturas optimas de hidrolisis y fermentacion (es decir, entre 30 °C y 50 °C) mientras se mantiene la proporcion del conjunto de enzimas de la mezcla sena una ganancia significativa para el procedimiento de conversion de biomasa lignocelulosica en biocombustible.

Objeto de la invencion

Los inventores han desarrollado un polipeptido que tiene una actividad endoglucanasa mejorada, especialmente con respecto a la actividad endoglucanasa de la protema salvaje EG1 de la secuencia SEQ ID NO: 2. EG1 corresponde a la endoglucanasa 1 de Trichoderma reesei.

Con esta intencion, los solicitantes han tenido el gran merito de encontrar, despues de numerosas investigaciones, un polipeptido aislado o purificado que tiene una actividad endoglucanasa mejorada con respecto a la actividad endoglucanasa de la protema de referencia EG1 (SEQ ID NO: 2).

La descripcion se refiere por tanto a un polipeptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

i) una secuencia de aminoacidos seleccionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26;

ii) una secuencia de aminoacidos que presenta un porcentaje de identidad de al menos 70 %, preferentemente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26.

La invencion se define en las reivindicaciones.

Preferentemente, el polipeptido segun la invencion se caracteriza por que su expresion en un organismo

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fermentativo es al menos igual a la expresion de la protefna de referenda EG1 (SEQ ID NO: 2).

El porcentaje de identidad de una secuencia dada con respecto a SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12; 14,16, 18, 20, 22, 24 o 26 corresponde al numero de residuos identicos entre esta secuencia dada y SEQ ID NO: 4, 6, 8, SEQ ID NO:10, 12; 14 16, 18, 20, 22, 24 o 26 dividido por el numero de residuos en SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12; 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26. Cuando se utiliza la base de datos GenomeQuest, dicho porcentaje de identidad con respecto a SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12; 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 corresponde al porcentaje de identidad de interrogacion (% id Query), en el que interrogacion corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12; 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26.

Los expertos en la materia podran determinar por ejemplo el aumento, o en otras palabras, la mejora de la actividad enzimatica utilizando el sustrato de carboximetilcelulosa (CMC) o con un sustrato cromogenico (p-nitrofenil glicosido). La actividad enzimatica se revelara, respectivamente, mediante un ensayo colorimetrico de los azucares reductores o el nitrofenol liberado.

Preferentemente, el polipeptido de la invencion tiene una actividad enzimatica mejorada de al menos 10 %, preferentemente al menos 20 %, preferentemente al menos 30 %, con respecto a la actividad endoglucanasa de la protefna EG1 de la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 2.

Un ejemplo de un protocolo, que podra utilizar un experto en la materia para determinar si un polipeptido de acuerdo con la invencion presenta una actividad enzimatica mejorada en relacion con la de la protefna de referencia EG1 (SEQ ID NO: 2), es el siguiente:

- formacion de un cultivo madre de E. coli que expresa un polipeptido de acuerdo con la invencion durante toda la noche a 37 °C;

- siembra de un medio de cultivo LB con 1 % de cultivo madre a 37 °C hasta que se obtenga una densidad optica de 0,4;

- cultivo de dichas celulas a 20 °C durante 18 h;

- centrifugacion durante 5 minutos a 7.900 rpm;

- resuspension de residuos celulares con tampon citrato fosfato 100 mM a pH 5 que contiene 1 mg/ml de lisozima (DO600 final 100);

- incubacion de las celulas resuspendidas durante 30 minutos en hielo;

- lisis de celulas en 3 ciclos de congelacion/descongelacion;

- fraccionamiento de ADN por sometimiento a ultrasonidos;

- centrifugacion durante 30 minutos a 13.000 rpm;

- incubacion de 100 pl de sobrenadante de ruptura diluido 50 veces con 100 pl de tampon citrato fosfato 100 mM a pH 5 que contiene 1 % de CMC durante 1 h a 35 y 50 °C;

- eliminacion de 100 pl de reaccion;

- adicion de 100 pl de reactivo DNS (Miller, 1959);

- incubacion durante 5 minutos a 100 °C;

- incubacion durante 3 minutos en hielo;

- centrifugacion durante 10 minutos a 3.000 rpm;

- lectura de la densidad optica a 540 nm en 150 pl de sobrenadante.

La invencion tambien tiene por objeto un acido nucleico purificado o aislado que codifica al menos un polipeptido de acuerdo con la invencion como se ha descrito anteriormente. La TABLa 1 a continuacion comprende las identificaciones de secuencias nucleicas y peptfdicas para EG1 de T. reesei ("salvaje"), las endoglucanasas putativas de Chaetomium globosum (C) y Aspergilus fumigatus (A), asf como para los polipeptidos y nucleotidos de la invencion y la descripcion.

De acuerdo con la descripcion, dicho acido nucleico purificado o aislado se puede seleccionar entre las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25.

TABLA 1

Clones

Acido nucleico Polipeptido

EG1 (salvaje)

SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :2

76B4

SEQ ID NO :3 SEQ ID NO :4

105F11

SEQ ID NO :5 SEQ ID NO :6

107H12

SEQ ID NO :7 SEQ ID NO :8

154E4

SEQ ID NO :9 SEQ ID NO :10

202C12

SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO :12

272A9

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Clones

Acido nucleico Polipeptido

278F10

SEQ ID NO :15 SEQ ID NO :16

293B2

SEQ ID NO :17 SEQ ID NO :18

309A11

SEQ ID NO :19 SEQ ID NO :20

11G8

SEQ ID NO :21 SEQ ID NO :22

92A12

SEQ ID NO :23 SEQ ID NO :24

240H12

SEQ ID NO :25 SEQ ID NO :26

Gen C

SEQ ID NO :27 SEQ ID NO :28

Gen A

SEQ ID NO :29 SEQ ID NO :30

La invencion tambien se refiere a un vector que comprende un acido nucleico de acuerdo con la invencion como se ha descrito anteriormente.

De acuerdo con la invencion, se entiende por "vector" cualquier secuencia de ADN en la que es posible insertar fragmentos de acido nucleico extrano, los vectores permiten introducir ADN extrano en una celula huesped. Se puede citar de manera no exhaustiva como vectores: plasmidos, cosmidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales derivados del bacteriofago P1 (PAC) o vectores derivados de virus.

De acuerdo con la invencion, el acido nucleico como se ha descrito anteriormente puede unirse operativamente a un promotor, un terminador o cualquier otra secuencia necesaria para su expresion en la celula huesped.

El vector de acuerdo con la invencion tambien podra llevar un marcador de seleccion. Se entiende por "marcador de seleccion" un gen cuya expresion confiere a las celulas que lo contienen una caracterfstica que les permite ser seleccionadas. Se trata por ejemplo de un gen de resistencia a antibioticos.

La invencion tiene tambien por objeto una celula huesped aislada que comprende al menos uno de los polipeptidos de acuerdo con la invencion como se ha descrito previamente, al menos uno de los acidos nucleicos de acuerdo con la invencion como se ha descrito anteriormente o al menos uno de los vectores de acuerdo con la invencion como se ha descrito anteriormente.

Los expertos en la materia pueden introducir uno de los polipeptidos, uno de los acidos nucleicos o uno de los vectores de acuerdo con la invencion como se ha descrito previamente en la celula huesped de acuerdo con la invencion por metodos convencionales bien conocidos. Por ejemplo, se puede mencionar el tratamiento con cloruro de calcio, la electroporacion, el uso de una pistola de partfculas.

De acuerdo con un modo de realizacion, un experto en la materia puede introducir en la celula huesped de acuerdo con la invencion y mediante metodos convencionales, varias copias de un acido nucleico de acuerdo con la invencion que codifica un polipeptido de acuerdo con la invencion que tiene una actividad endoglucanasa mejorada de acuerdo con la invencion.

De acuerdo con un modo de realizacion, la celula huesped aislada de acuerdo con la invencion como se ha descrito anteriormente se selecciona entre Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Myceliophthora, Chrysosporium, Penicillium, Fusarium, Thermomonospora, Bacillus, Pseudomouas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia y Saccharomyces.

De acuerdo con un modo de realizacion preferente, la celula huesped aislada de acuerdo con la invencion como se ha descrito anteriormente se selecciona entre Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, Humicola grisae, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca y Saccharomyces cerevisiae.

De acuerdo con un modo de realizacion preferente, la celula huesped aislada de acuerdo con la invencion como se ha descrito anteriormente se selecciona entre Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae.

La invencion tambien tiene por objeto el uso de uno cualquiera de los polipeptidos de acuerdo con la invencion descritos anteriormente para la hidrolisis de celulosa.

La invencion tambien tiene por objeto el uso de uno cualquiera de los polipeptidos de acuerdo con la invencion descritos anteriormente para la produccion de biocombustible.

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De acuerdo con la invencion, el termino biocombustible puede definirse como cualquier producto resultante de la transformacion de biomasa y puede utilizarse con fines energeticos. Por una parte y sin querer limitarse, se puede citar a modo de ejemplo biogas, productos que pueden incorporarse (posiblemente despues de una transformacion posterior) en un combustible o ser un combustible exclusivo, como los alcoholes (etanol, butanol y/o isopropanol de acuerdo con el tipo de organismo fermentativo utilizado), disolventes (acetona), acidos (butfrico), lfpidos y sus derivados (acidos grasos de cadenas cortas o largas, esteres de acidos grasos), asf como hidrogeno.

Prefe rente me nte, el biocombustible de acuerdo con la invencion es un alcohol, por ejemplo etanol, butanol y/o isopropanol. Mas preferentemente, el biocombustible de acuerdo con la invencion es etanol.

En otro modo de realizacion, el biocombustible es biogas.

En otro modo de realizacion, el producto es una molecula de interes para la industria qufmica, como por ejemplo, otro alcohol tal como 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol. 2,3-butanodiol, acidos organicos como acido acetico, propionico, acrflico, butfrico, succfnico, malico, fumarico, cftrico, itaconico o hidroxiacidos como acido glicolico, hidroxipropionico o lactico.

A continuacion se describe un modo de realizacion de produccion de un coctel enzimatico util para la hidrolisis de lignocelulosa.

Las cepas de hongos filamentosos, preferentemente Trichoderma, mas preferentemente T. reesei, capaces de expresar al menos un polipeptido de acuerdo con la invencion se cultivan en fermentadores, en presencia de un sustrato carbonado, tal como lactosa o glucosa, seleccionado para el crecimiento del microorganismo. En un modo de realizacion, este sustrato carbonado, de acuerdo con su naturaleza, se introduce en el fermentador antes de la esterilizacion o se esteriliza por separado y se introduce en el fermentador despues de la esterilizacion de este ultimo para obtener una concentracion inicial de 20 a 35 g/l.

Posteriormente se anade una solucion acuosa que contiene el sustrato seleccionado para la produccion de las enzimas. Una composicion enzimatica que actua sobre la biomasa lignocelulosica producida por los hongos se recupera finalmente por filtracion del medio de cultivo. En esta composicion, se encuentran, en particular, p- glucosidasa, exoglucanasa y endoglucanasa de acuerdo con la invencion.

En un modo de realizacion, la solucion acuosa que contiene el sustrato seleccionado para la produccion de las enzimas se prepara a una concentracion de 200-250 g/l. Esta solucion contiene ademas un sustrato inductor tal como lactosa. Esta solucion acuosa se inyecta despues del agotamiento del sustrato carbonado inicial a fin de proporcionar una cantidad optimizada, comprendida entre 35 y 45 mg/g de celulas ("fed batch" (proceso semicontinuo)). Durante esta fase de "proceso semicontinuo", la concentracion residual de azucar en el medio de cultivo es inferior a 1 g/l y las enzimas que actuan sobre la biomasa lignocelulosica son secretadas por el hongo. Estas ultimas pueden recuperarse por filtracion del medio de cultivo.

La invencion tiene por objeto una composicion enzimatica capaz de actuar sobre la biomasa lignocelulosica, siendo dicha composicion enzimatica es producida preferentemente por hongos filamentosos y comprende al menos un polipeptido que tiene una actividad endoglucanasa mejorada con respecto a la actividad endoglucanasa de la protefna de referencia EG1. Por "hongos filamentosos" se entiende especialmente Trichoderma, mas preferentemente T. reesei.

Finalmente, la invencion tiene por objeto un procedimiento de produccion de biocombustible a partir de biomasa que comprende las siguientes etapas sucesivas:

- poner suspension en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;

- hidrolisis en presencia de una composicion enzimatica de la biomasa lignocelulosica como se ha descrito anteriormente para producir un hidrolizado que contiene glucosa;

- fermentacion de la glucosa del hidrolizado para producir un mosto de fermentacion;

- separacion del biocombustible del mosto de fermentacion.

En un modo de realizacion, la biomasa que se va a hidrolizar se pone en suspension en fase acuosa a razon de 6 a 40 % de materia seca, preferentemente 20 a 30 %. El pH se ajusta entre 4 y 5,5; preferentemente entre 4,8 y 5,2 y la temperatura entre 40 y 60 °C, preferentemente entre 45 y 50 °C. La reaccion de hidrolisis se inicia mediante la adicion de la composicion enzimatica que actua sobre la biomasa lignocelulosica; la cantidad habitualmente utilizada es de 10 a 30 mg de protefnas excretadas por gramo de sustrato pretratado o menos. La reaccion dura generalmente de 15 a 48 horas. La reaccion se controla determinando los azucares liberados, especialmente la glucosa. La solucion de azucares se separa de la fraccion solida no hidrolizada, constituida esencialmente de lignina, por filtracion o centrifugacion y luego se trata en una unidad de fermentacion.

Despues de la etapa de fermentacion, el biocombustible puede separarse del mosto de fermentacion, por ejemplo por destilacion.

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Otro objeto de la invencion es un procedimiento de produccion de biocombustible a partir de la biomasa, caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:

- poner suspension en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;

- adicion simultanea de una composicion enzimatica como se ha definido anteriormente y de un organismo fermentativo, para producir un mosto de fermentacion;

- separacion del biocombustible del mosto de fermentacion.

Preferentemente, la composicion enzimatica y el organismo fermentativo se anaden simultaneamente y luego se incuban a una temperatura comprendida entre 30 °C y 35 °C para producir un mosto de fermentacion.

De acuerdo con este modo de realizacion, la celulosa presente en la biomasa se convierte en glucosa, y al mismo tiempo, en el mismo reactor, el organismo fermentativo (por ejemplo, una levadura) convierte la glucosa en el producto final de acuerdo con un procedimiento de SFS (sacarificacion y fermentacion simultaneas) (Simultaneous Saccharification and Fermentation) conocido por los expertos en la materia. Dependiendo de las capacidades metabolicas e hidrolfticas del organismo fermentativo, el buen progreso de la operacion puede requerir la adicion de una cantidad mayor o menor de mezcla celulolftica exogena.

En otro modo de realizacion, el organismo fermentativo tambien produce el polipeptido objeto de la invencion por secrecion o en la superficie de su celula, opcionalmente junto con otras enzimas que actuan sobre la biomasa lignocelulosica, limitando o suprimiendo asf la necesidad de enzimas producidas por el hongo filamentoso. Preferentemente, el organismo fermentativo es una celula huesped como se ha descrito anteriormente.

Por lo tanto, preferentemente, la invencion tiene por objeto un procedimiento de produccion de biocombustible a partir de biomasa, que comprende las siguientes etapas sucesivas:

- poner en suspension en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;

- adicion de una o mas celulas huesped como se ha descrito anteriormente, con un organismo fermentativo y/o una composicion enzimatica como se ha descrito anteriormente, para producir un mosto de fermentacion;

- separacion del biocombustible del mosto de fermentacion.

Preferentemente, las celulas huesped con la composicion enzimatica y/o el organismo fermentativo se anaden e incuban posteriormente a una temperatura comprendida entre 30 °C y 35 °C para producir un mosto de fermentacion.

El uso del polipeptido de acuerdo con la invencion que presenta una mejor actividad endoglucanasa de acuerdo con la presente invencion presenta asf la ventaja de obtener un mejor rendimiento de produccion de glucosa al emplear menos enzima que antes, lo que presenta una ventaja desde el punto de vista economico.

Descripcion de las figuras

Otros aspectos, objetos, ventajas y caracterfsticas de la invencion se expondran tras la lectura de la siguiente descripcion no restrictiva que describe modos de realizacion preferentes de la invencion proporcionados mediante ejemplos y FIGURAS.

La FIGURA 1 es un grafico que representa la hidrolisis de CMC al 1 % por la endoglucanasa de referencia EG1 y su mutante (154E4) secretados en el medio de cultivo por las cepas Sca-EG1 y Sca-154E4, respectivamente.

La FIGURA 2 es un grafico que representa los resultados de HFS para el coctel resultante de la cepa 145E4/8 (SEQ ID NO: 10), un coctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1) suplementado con p-glucosidasa y otro coctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG1 (AEG1cEG1) suplementado con p-glucosidasa.

La FIGURA 3 es un grafico que presenta los resultados de HFS para el coctel resultante de la cepa 11G8 (SEQ ID NO: 22), un coctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1) suplementado con p-glucosidasa y otro coctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG1 (AEG1cEG1) suplementado con p-glucosidasa.

La FIGURA 4 es un grafico que presenta los resultados de SFS para los dos cocteles resultantes de las cepas 154E4/2 154 E4/8 (SEQ ID NO: 10), un coctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1) suplementado con p-glucosidasa y otro coctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG1 (AEG1cEG1) suplementado con p-glucosidasa.

La FIGURA 5 es un grafico que presenta los resultados de SFS para los tres cocteles resultantes de las cepas 11G8, 11G8/12 y 11G8/13 (SEQ ID NO: 22), un coctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

suplementado con p-glucosidasa y otro coctel de referencia producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG1 (AEG1cEG1) suplementado con p-glucosidasa.

Descripcion detallada de la invencion

Ejemplos

EJEMPLO 1: 1er giro por transposicion en L

La secuencia del gen de referencia EG1 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 1) se sometio a un primer giro de transposicion en L de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento EP1104457B1 con los genes de endoglucanasa putativa de Chaetomium globosum (SEQ ID NO: 29) y la endoglucanasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 29) que presenta cada uno un 64 % de identidad con el gen de referencia SEQ ID NO: 1.

1 - Identificacion sistematica de alto rendimiento

Se desarrollo un ensayo de identificacion sistematica de alto rendimiento para seleccionar los mejores clones resultantes de la transposicion en L, es decir, aquellos con al menos un 20 % de mejora en la actividad endoglucanasa en comparacion con la enzima de referencia SEQ ID NO: 2..

El ensayo de identificacion sistematica de alto rendimiento se realizo de acuerdo con las siguientes etapas:

- aislamiento en agar de clones de E. coli que expresan las variantes de la transposicion en L de la enzima recombinante de acuerdo con la invencion y precultivados en medio LB de dichas colonias durante la noche a 37 °C;

- inoculacion de un medio LB al 6 % con el precultivo y luego incubacion durante 5 h a 37 °C y 17 h a 20 °C;

- centrifugacion durante 10 minutos a 3.000 rpm;

- lisis de las celulas por adicion de 80 pl de una solucion de lisozima a 1 mg/ml en tampon citrato fosfato 0,1 M a pH 5;

- incubacion durante 4 h a temperatura ambiente;

- adicion de 80 pl de tampon citrato fosfato 0,1 M pH 5 que contiene 1 % de carboximetilcelulosa;

- incubacion durante 17 h a 35 °C;

- centrifugacion durante 10 minutos a 3.000 rpm;

- eliminacion de 100 pl de sobrenadante;

- adicion de 100 pl de reactivo DNS;

- incubacion durante 10 minutos a 100 °C y luego durante 5 minutos en hielo;

- lectura de la DO a 540 nm en 120 pl.

En estas condiciones de identificacion sistematica, se ha descubierto una mejora de la actividad endoglucanasa (aumento de la DO a 540 nm) con respecto a la enzima de referencia EG1 (SEQ ID NO: 2) que incluyen principalmente los clones 76B4,105F11, 107H12, 154E4, 202C12, 272A9, 278F10, 293B2 y 309A11..

2 - Determinacion de la mejora de la actividad endoglucanasa

2-1/Sobre el sustrato de carboximetilcelulosa (CMC)

Para estimar el kcat de los clones de las variantes seleccionadas en el primer giro de transposicion en L con respecto a la enzima de referencia (SEQ ID NO: 2), se procede de la siguiente manera:

- preparacion de un cultivo madre de E. coli que expresa una enzima recombinante de acuerdo con la invencion durante la noche a 37 °C;

- inoculacion de un medio de cultivo LB con 1 % de cultivo madre a 37 °C hasta que se obtiene una densidad optica a 600 nm de 0,4;

- cultivo de dichas celulas a 20 °C durante 18 horas;

- centrifugacion durante cinco minutos a 7.900 rpm;

- resuspension de los residuos celulares con tampon citrato fosfato 0,1 M a pH 5 que contiene 1 mg/ml de lisozima (D0600 final 100);

- incubacion de celulas resuspendidas durante 30 minutos en hielo;

- lisis de las celulas por tres ciclos de congelacion/descongelacion;

- fraccionamiento del ADN mediante sometimiento a ultrasonidos durante 3 segundos con una potencia de 5;

- centrifugacion durante 30 minutos a 13.000 rpm;

- incubacion de 100 pl de sobrenadante de rotura con 100 pl de tampon fosfato citrato 0,1 M a pH 5 que contiene 1 % de CMC durante 6 horas a 35 y 50 °C;

- eliminacion de 100 pl de reaccion;

- adicion de 100 p de reactivo DNS;

- incubacion durante 5 minutos a 100 °C;

- incubacion durante 3 minutos en hielo;

5

10

15

20

25

30

- centrifugacion durante 10 minutos a 3.000 rpm;

- lectura de la densidad optica a 540 nm en 150 pl.

De acuerdo con la invencion, el calculo de kcat se realiza de la siguiente manera:

- expresion de las DO a 540 nm en funcion de la cantidad de protefna de interes (en nM);

- resta del valor del control negativo;

- division por el coeficiente del intervalo patron de glucosa (se revelan diferentes cantidades de glucosa con el DNS);

- division por el tiempo de reaccion (360 minutos).

La TABLA 2 presenta el valor de los kcat asf como el factor de mejora obtenidos para los clones 76B4, 105F11, 107H12, 154E4, 202C12, 236C11, 272A9, 278F10, 293B2 y 309A11 con respecto a la protefna de referencia EG1 (SEQ ID NO: 2) en las condiciones experimentales del ensayo de actividad en CMC.

TABLA 2: Actividad endoglucanasa en CMC

35°C 50 "C

Cion Kcat (min’1) Factor de mejora Kcat (min’1) Factor de mejora

Clones del primer giro

76B4 0,25 i 0,35 1,1

105F11

1,13 4,7 1,24 4

107H12

1,06 4,4 1,14 3,7

154E4

1,27 5,3 3,39 10,9

202C12

0,73 3 0,61 2

236C11

0,12 5,3 0,05 0,2

272A9

0,99 4,1 2,33 7,5

278F10

0,95 4 1,06 3,4

293B2

1,04 4,3 1,78 5,7

309A11

1,07 4,5 0,6 1,9

Proteina de referencia

EG1 0,24 1 0,31 1

Los resultados muestran mejoras en la actividad enzimatica significativas en comparacion con la enzima de referencia SEQ ID NO: 2.

2-2/Sobre el sustrato de celulosa hinchada con acido fosforico (PASC)

La mejora de la actividad de los clones 76B4, 105F11, 107H12, 154E4, 202C12, 236C11, 272A9, 278F10, 293B2 y 309A11 se confirmo en un segundo sustrato: celulosa hinchada con acido fosforico (PASC).

La determinacion del kcat en este sustrato se efectua de acuerdo con el mismo protocolo que el que se ha descrito anteriormente. El sustrato CMC se reemplaza con el sustrato PASC con la misma concentracion.

La TABLA 3 presenta el valor de los kcat asf como el factor de mejora obtenidos para los clones 76B4, 105F11, 107H12, 154E4, 202C12, 236C11, 272A9, 278F10, 293B2 y 309A11 con respecto a la protefna de referencia EG1 (SEQ ID NO: 2) en las condiciones experimentales del ensayo de actividad en PASC.

5

10

15

20

25

30

35

TABLA 3: Actividad endoglucanasa en PASC

35°C 50°C

Clon Kcat (min Factor de mejora Kcat (min'1) Factor de mejora

Clones del primer giro

76B4 0,0116 1,66 0,0127 1,81

105F11

0,0099 1,41 0,0109 1,56

107H12

0,0069 0,99 0,0068 0,97

154E4

0,0101 1,44 0,0104 1,49

202C12

0,0098 1,4 0,0097 1,39

236C11

0,0102 1,46 0,0103 1,47

272A9

0,0103 1,47 0,0099 1,41

278F10

0,0094 1,34 0,0091 1,3

293B2

0,0089 1,27 0,0088 1,26

309A11

0,0102 1,46 0,0089 1,27

Protelna de referencia

EG1 0,007 1 0,007 1

Estos resultados muestran mejoras en la actividad enzimatica significativas con respecto a la enzima de referenda EG1 (SEQ ID NO: 2).

EJEMPLO 2: 2° giro de transposicion en L

Los genes mejorados 105F11, 154E4, 202C12, 272A9 y 309A10 278F10 (SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13, 15, 19, respectivamente) obtenidos en el primer giro de evolucion han sido posteriormente sometidos a un segundo giro de transposicion en L (siempre de acuerdo con el procedimiento patentado descrito en el documento EP1104457B1). Con el fin de promover la reconstruccion en un esqueleto de la secuencia de Trichoderma, el gen de referencia EG1 (SEQ ID NO: 1) se reintrodujo como un gen parental para el segundo giro de transposicion en L.

1-Identificacion sistematica de alto rendimiento

Se realizo un ensayo de identificacion sistematica de alto rendimiento como se ha descrito anteriormente en los clones obtenidos despues de este segundo giro de transposicion en L para seleccionar los mejores. El ensayo de actividad se redujo a 2 horas (en comparacion con 17 horas para la identificacion sistematica de los clones resultantes del primer giro de evolucion) para tener en cuenta las mejoras obtenidas con el primer giro de transposicion en L.

La actividad de los clones generados se compara con la actividad obtenida con el clon 154E4. Este clon, resultante del primer giro de transposicion en L, es el que permitio obtener la mejor mejora de la actividad.

En estas condiciones de identificacion sistematica, se descubrio una mejora de la actividad de endoglucanasa con respecto al clon de referencia 154E4 (SEQ ID NO: 10) en varios clones, en particular, los clones 11G8 y 240H12.

2-Determinacion de la mejora de la actividad endoglucanasa

2-1/ Sobre el sustrato de carboximetilcelulosa (CMC)

Para determinar el kcat, las actividades de los clones 11G8, 92A12 y 240H12 se midieron mediante el ensayo de actividad como se ha descrito anteriormente. La duracion del ensayo de actividad se redujo a una hora de incubacion con el sustrato para tener en cuenta las mejoras en estos clones.

La TABLA 4 presenta los valores de kcat asf como el factor de mejora obtenidos para los clones 11G8, 92A12 y 240H12 con respecto al clon (SEQ ID NO: 10) en las condiciones experimentales.

5

10

15

20

25

30

TABLA 4: Actividad endoglucanasa en CMC

[.................................... “1.............

35°C 5C )°C

Clon Kcat (min *) Factor de mejora Kcat (min’1) Factor de mejora

Clones del segundo giro

11G8 804,7 1,8 944,2 1,9

92A12

420 0,94 478,5 0,95

240H12

488,6 1,1 590,8 1,2

Proteina de referencia

154E4 446,4 1 501,3 1

Los resultados muestran una mejora de actividad con respecto al clon de referencia 154E4 para los clones 11G8 y 240H12.

2-2/ En el sustrato de celulosa hinchada con acido fosforico (PASC)

La mejora de la actividad de los clones 11G8, 92A12 y 240H12 se confirmo posteriormente en un segundo sustrato: celulosa hinchada con acido fosforico (PASC).

Para determinar el kcat, la actividad de estos clones se midio a 35 y 50 °C mediante el ensayo de actividad como ha se descrito previamente con PASC como sustrato.

La TABLA 5 muestra los valores de kcat asf como tambien el factor de mejora obtenido para los clones 11G8, 92A12 y 240H12 con respecto al clon 154E4 (SEQ ID NO: 10) en estas condiciones experimentales.

TABLA 5: Actividad endoglucanasa en PASC

35°C 50° C

Clon Kcat (min’1) Factor de mejora Kcat (min’1) Factor de mejora

Clones del segundo giro

11G8 1,37 0,8 1,72 1,1

92A12

1,36 0,81 1,7 1,04

240H12

1,87 1,1 1,9 1,2

Proteina de referencia

154E4 1,68 1 1,63 1

La actividad del clon 11G8 no se mejora a 35 °C en este sustrato con respecto al clon 154E4 de referencia.

Por el contrario, la actividad del clon 11G8 se mejora a 50 °C. La actividad del clon 240H12 se mejora a 35 °C y 50 °C.

EJEMPLO 3: Clonacion de una variante de la endoglucanasa 1 resultante del primer giro de transposicion en L en una cepa de T. reesei CL847 AEG1

La construccion del fragmento de ADN que se va a insertar en T. reesei, que contiene el clon 154E4 resultante del primer giro de transposicion en L, se llevo a cabo mediante fusion por PCR. El fragmento de una longitud de aproximadamente 5,4 kb estaba constituido del gen de resistencia a la fleomicina de la secuencia codificante del clon 154E4 bajo el control del promotor y seguido por el terminador cbhl. Asimismo, el gen de referencia EG1 (SEQ ID NO: 1) de T. reesei se amplifico y fusiono entre el promotor y el terminador cbhl, dando como resultado una segunda construccion.

Los protoplastos de una cepa de T. reesei CL87 AEG1 se transformaron de acuerdo con un metodo convencional

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

conocido por los expertos en la materia, mediante choque calcico y PEG, con 5 |jg de cada construccion, a saber el fragmento de ADN que contiene o bien el gen 154E4 o bien EG1. Los transformantes se seleccionaron en medio selectivo PDA/sacarosa que contema 30 jg/l de fleomicina. Se subcultivaron catorce clones de cada transformacion. Despues de tres subcultivos para aislar clones puros, se obtuvieron finalmente siete clones que tienen integrado el gen nativo y cinco clones que tienen integrado la variante 154E4 y que secretan un nivel de protefnas comparable a la cepa CL847.

1-Identificacion sistematica de un ensayo de actividad en carboximetlcelulosa (CMC)

Los 11 clones se cultivaron en placas de 24 pocillos que contienen el siguiente medio:

800 jl de H3PO4 85 %, 4,2 g (NHU^SCL, 0,3 g de MgSO4.7H2O, 1,5 g de mafz macerado, 1 ml de Oligo Ferment, 11,6 g de acido maleico, 10 g de SolkaFloc y 20 g de lactosa por litro de medio. El pH se ajusto a 5,8-6,0. Despues de 5 dfas de cultivo a 30 °C, se elimina el sobrenadante y se utiliza el equivalente de 10 mg/l de protefnas (medidas por el metodo Lowry) para un ensayo de actividad en CMC. Se mezclaron 150 jl de una solucion de CMC al 2 % en tampon citrato 50 mM, pH 4,8, con 150 jl de tampon citrato que contema 10 mg/l de protefnas. La reaccion se incuba a 50 °C y 35 °C durante 10 min y luego se inactiva al bano maria hirviendo. Despues de la centrifugacion durante 5 minutos, se eliminan 20 pl para realizar una determinacion de azucares reductores utilizando acido 3,5-dinitrosalicflico (DNS). La reduccion de DNS y la formacion de acido 3-amino-5- nitrosalicflico se controlan mediante la lectura de absorcion a 540 nm, y los azucares reductores se cuantifican utilizando un intervalo de glucosa.

La TABLA 6 resume las actividades obtenidas con los clones que contienen la variante 154E4, en comparacion con la cepa de referencia CL847, la cepa CL87 AEG1, y la cepa CL87 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG1 (AEG1cEG1, media obtenida con los cuatro mejores transformantes).

TABLA 6: Actividad endoglucanasa en CMC

Clon

Actividad especffica a 50 °C (pmol/mg/min) Relacion 154E4/AEG2cEG1 (50 °C) Actividad especffica a 35 °C (pmol/mg/min) Relacion 154E4/AEG2cEG1 (35 °C)

CL847

12,9 ± 3,1 9,7 ± 0,4

AEG1

6,4 ± 0,4 -

AEG1CEG 1

16,8 ± 2,5 12,1 ± 1,0

154E4/2

22,5 ± 2,9 1,3 12,7 ± 2,0 1,1

154E4/8

24,1 ± 1,9 1,4 12,5 ± 2,0 1,0

154E4/9

20,2 ± 3,9 1,2 7,4 ± 2,2 0,6

Los resultados muestran que las actividades de las variantes 154E4 son entre 1,2 y 1,4 veces superiores a la de los clones retransformados con el gen de referencia EG1 (SEQ ID NO: 1). La mejora es visible a 35 °C y 50 °C.

2-Clonacion de la variante 11G8 obtenida despues del segundo giro de transposicion en L en una cepa de T. reesei CL847 AEG1 e identificacion selectiva de los transformantes:

La variante 11G8 se clono entre el promotor y el terminador cbhl en el plasmido pUT1040 que contiene un gen de resistencia a la fleomicina como marcador, utilizando una doble digestion BamH1/XhoI. Se utilizaron 5 pg de este vector para la transformacion de la cepa de T. reesei CL847 AEG1. La transformacion de los protoplastos se llevo a cabo en las mismas condiciones que para la variante 154E4. Al final del proceso de transformacion y de tres subcultivos sucesivos realizados con el fin de obtener clones puros, se obtuvieron trece clones con una produccion de protefnas similares a la cepa CL847 y se sometieron a identificacion sistematica por medicion de la actividad CMCasa. El ensayo de actividad es identico a la identificacion sistematica de clones que contienen la variante 154E4 del primer giro de transposicion en L. Seis clones que expresan la variante 11G8 muestran una actividad CMCasa mayor que la de la cepa AEGIcEG. Los dos mejores transformantes tienen una actividad aumentada en un 70 % con respecto a la cepa que expresa el gen de referencia EG1 (SEQ ID NO: 1).

La TABLA 7 resume las actividades obtenidas con los clones que contienen la variante 11G8, en comparacion con la cepa de referencia CL847, la cepa CL847 AEG1, y la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG1 (AEG1cEG1, media obtenida con los cuatro mejores transformantes).

TABLA 7: Actividad endoglucanasa en CMC

Clon

Actividad especffica a 50 °C (pmol/mg/min) Relacion 11G8/AEG1 cEG1 (50 °C) Actividad especffica a 35 °C (pmol/mg/min) Relacion 11G8/AEG1cEG1 (35 °C)

CL847

20,8 ± 0,8 11,8 ± 0,5

AEG1

- 3,3 ± 1,1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Clon

Actividad especifica a 50 °C (pmol/mg/min) Relacion 11G8/AEG1 cEG1 (50 °C) Actividad especifica a 35 °C (pmol/mg/min) Relacion 11G8/AEG1cEG1 (35 °C)

AEG1CEG 1

13,2 ± 2,2 9,1 ± 0,7

11G8/6

15,6 ± 1,8 1,2 10,0 ± 0,4 1,1

11G8/7

17,3 ± 0,7 1,3 10,8 ± 0,9 1,2

11G8/9

17,9 ± 0,4 1,4 11,9 ± 0,2 1,3

11G8/10

15,0 ± 0,3 1,1 13,9 ± 1,6 1,5

11G8/12

17,0 ± 0,1 1,3 15,7 ± 0,8 1,7

11G8/13

17,3 ± 1,2 1,3 15,6 ± 0,4 1,7

Los resultados muestran que las actividades de las variantes 11G8 son entre 1,1 y 1,7 veces superiores a la de los clones retransformados con el gen de referencia SEQ ID NO: 1. La mejora es visible a 35 °C y 50 °C.

Ejemplo 4: Expresion recombinante de endoalucanasa de referenda EG1 y de la variante mejorada 154E4 en Saccharomyces cerevisiae

1- Produccion de proteinas EG1 de referencia y 154E4 en el medio extracelular

Los genes de endoglucanasa de Trichoderma reesei (EG1) y de la variante 154E4 se clonaron sin su peptido senal en el vector pESC-LeuaAmyc (CNRS-CERMAV). Esta construccion permite la expresion de las proteinas en el medio de cultivo de la cepa Saccharomyces cerevisiae EBY100, auxotrofa para leucina y triptofano (Boder ET y Wittrup KD, Biotechnol Prog, 1998, 14: 55-62). Este plasmido permite colocar la expresion de genes bajo el control del promotor GAL1 inducible a galactosa, y posee el gen marcador de seleccion de la auxotrofia (Leu2) que permite la seleccion de transformantes.

La transformacion de Saccharomyces cerevisiae EBY100 se llevo a cabo de acuerdo con los metodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (transformacion de levaduras por choque termico y acetato de litio). Los transformantes se seleccionaron en medio YNB 0,67 %-Glc 2 %-Trp 0,01 %.

Se utilizo un transformante para cada gen (Sca-EG1,y Sca-154E4) para sembrar 15 ml de un medio minimo YNB 0,67 %-Glc 2 %-SD-Trp 0,01 %. SD es una mezcla de aminoacidos (40 mg/l de adenina sulfato, 20 mg/l de L- arginina, 100 mg/l de acido L-aspartico, 100 mg/l de acido L-glutamico, 20 mg/l de L-histidina, 30 mg/l de L-lisina, 20 mg/l de L-metionina, 50 mg/l de L-fenilalanina, 375 mg/l de L-serina, 200 mg/l de L-treonina, 30 mg/l de L-tirosina, 150 mg/l de L-valina y 20 mg/l de uracilo). Despues de 24 h de precultivo a 30 °C con agitacion a 220 rpm, las cepas Sca-EG1 y Sca-154E4 se utilizaron para sembrar (DO600 de 0,5) 150 ml de medio YNB 0,67 %-Gal 2 %-SD-Trp 0,01 %. Los cultivos se incubaron a 25 °C con agitacion a 220 rpm. Despues de 8 h de incubacion, se anadieron 6 ml de citrato de sodio a pH 5,6 a cada cultivo para estabilizar el pH a 5.

Despues de 4 dias de incubacion, se eliminaron 20 ml de cultivo. El sobrenadante del cultivo se obtuvo despues de la centrifugacion a 3.000 g a 4 °C durante 5 minutos.

2- Determinacion de la actividad endoglucanasa en p-nitrofenil-B-lactosida

La actividad endoglucanasa de los sobrenadantes de cultivo se midio por hidrolisis del sustrato p-nitrofenil-p- lactosida (pNPL) en un volumen de 700 pl en las siguientes condiciones:

- 50 mM de tampon de citrato a pH 5

- 2 mM de pNPL

- 605 pl y 90 pl del sobrenadante de cultivo de las cepas Sca-154E4

- incubacion a 35 °C o 50 °C durante 30 min para la cepa .Sca-EG1.

La reaccion se detuvo mediante la adicion de 100 pl de carbonato de sodio 1 M a 100 pl de reaccion de reaccion. La concentracion de para-nitrofenol (pNP) liberada por hidrolisis de pNPL se determino midiendo la absorbancia a 415 nm en comparacion con un intervalo patron de para-nitrofenol (lineal de 0,36 pM a 360 pM).

La TABLA 8 presenta los resultados de la actividad endoglucanasa (AE en nmol.min'1.ml'1 de cultivo) en pNPL a 35 °C y 50 °C de los medios de cultivo de las cepas ScaEGI y SCa154E4.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

TABLA 8: Actividad endoglucanasa en pNPL a 35 °C y 50 °C de los medios de cultivo de las cepas ScaEGI y

SCa154E4.

AE a 35 °C AE a 50 °C Ratio de actividad 35 °C/50 °C Mejora de AE a 35 °C

Sca-EG1

1,17 1,18 1 -

Sca-154E4

45,0 61,1 1,4 38,5

Los resultados obtenidos muestran una mejora a 35 °C de la actividad enzimatica de la cepa Sca-154E4 por un factor cercano a 40 con respecto a la cepa que expresa la protefna de referencia EG1 de T. reesei (SEQ ID NO: 2). La amplitud de la mejora de la actividad constatada sobre E. coli y T. reesei sugiere que la enzima no solo tiene una actividad especffica mejorada sino que tambien se sobreexpresa y/o se secreta mejor.

3- Determinacion de la actividad endoglucanasa en carboximetilcelulosa

La actividad endoglucanasa de los sobrenadantes de cultivo se midio por hidrolisis de carboximetilcelulosa (CMC) en un volumen de 700 pl en las siguientes condiciones:

- 50 mM de tampon citrato a pH 5

- 1 % de CMC

- 210 pl de sobrenadante de cultivo de cepas Sca-EG1 y Sca-154E4 dializadas respectivamente contra el tampon citrato 50 mM pH 5 en membrana de 10 kDa y concentrados dos veces

- incubacion a 35 °C durante 48 horas.

La reaccion se detuvo mediante la adicion de 150 pl de reactivo DNS a 100 pl de medio de reaccion. Despues de un calentamiento durante 5 minutos a 100 °C y enfriamiento en hielo, la cantidad de azucares reductores liberados se determino midiendo la absorbancia a 550 nm en comparacion con un intervalo patron preparado con glucosa.

La FIGURA 1 muestra los resultados de la hidrolisis del CMC al 1 % por la endoglucanasa de referencia EG1 (SEQ ID NO: 2) y su mutante 154E4 (SEQ ID NO: 10) secretadas respectivamente en el medio de cultivo de las cepas Sca-EG1 y Sca-154E4.

Los resultados de la FIGURA 1 muestran que durante las primeras horas de reaccion, la cantidad de azucares reductores liberados por 1 ml de cultivo de la cepa Sca-154E4 es aproximadamente 10 veces mayor que con 1 ml de Sca-EG1. La magnitud de la mejora de la actividad constatada sobre E. coli y T. reesei sugiere que la enzima no solo tiene una actividad especffica mejorada sino que tambien se sobreexpresa y/o secreta mejor.

Ejemplo 5: Produccion de enzimas por T. reesei en matraces alimentados

Las cepas de referencia y las que presentan la mejor actividad en CMC (CL847, AEG1, AEG1cEG1, 154E4/2, 154E4/8, 11G8/10, 11G8/12, 11G8/13) se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml. 55 ml de medio F45 (10 g/l de tampon dipotasio ftalato pH 6, 4,2 g/l (NH4)2SO4, 300 mg/l de MgSO4.7H2O, 150 mg/l de CaCl2.2H2O, 1,5 g/l de maceracion del mafz, 0,07 % de acido ortofosforico, 5 mg/l de FeSO4, 1,4 mg/l de MnSO4, 1,4 mg/l de ZnSO4, 3,7 mg/l de CoCh y 12,5 g/l de glucosa) se siembran y agitan a 150 rpm y 30 °C. La produccion se realiza en dos fases: una fase continua en glucosa y una fase discontinua en lactosa. Los muestreos regulares permiten determinar el momento en el que la concentracion de glucosa cae por debajo de 3 g/l. En este estadio, se inicia un suministro semicontinuo con una bomba de jeringa (6 vfas). Los cultivos se suministran con una solucion de 50 g/l de lactosa y 0,3 % de NH3 a un caudal de 40 mg de azucar/g de biomasa por hora. Se toman muestras diarias para determinar el pH, el peso en seco y la concentracion de protefnas en el sobrenadante. Despues de 5 dfas de cultivo semicontinuo, el cultivo se filtra a traves de un filtro de 0,45 pm y el sobrenadante se congela.

La concentracion final de protefnas se encontraba en el orden de 3 a 4 g/l. Si la concentracion era inferior a 3 g/l, los sobrenadantes se concentraron en una columna (Vivaspin MWC05, Sartorius).

Ejemplo 6: Eficacia de las enzimas resultantes de la transposicion en L en la hidrolisis de la biomasa lignocelulosica de acuerdo con un procedimiento HFS

El sustrato de referencia utilizado es una paja de trigo que se ha sometido a un pretratamiento por explosion de vapor (19 bar - 3 minutos) despues de la impregnacion acida al 0,01 % de H2SO4 durante 10 horas, que se ha lavado, neutralizado a pH 5, prensado, secado. La tabla 9 presenta la composicion del sustrato de referencia.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tabla 9: Composicion de la paja utilizada para los ensayos de hidrolisis

Composicion

% m/m

SIA

97,52

Contenido en cenizas

5

Celulosa

51,7

Xilanos corregidos

3,57

Hemicelulosa

4,14

Lignina de Klason (sobreestimada)

36,49

Acetil

0,6

Las hidrolisis se llevaron a cabo al 10 % de materia seca m/m, o en un equivalente al 5,4 % de celulosa m/m. La tasa de protefnas se fija a 10 mg/g de materia seca o aproximadamente 19 mg/g de celulosa. La concentracion de cocteles enzimaticos se midio por el metodo Lowry utilizando ASB como referencia. Cada coctel se suplemento con actividad p-glucosidasa con un maximo de 120 ± 2 lU/g de celulosa, anadiendo p-glucosidasa SP188 (Novozymes).

Los ensayos se llevan a cabo en tubos Eppendorf de 2 ml utiles (1g de reaccion) que contienen:

- 0,11 ± 0,001 g de sustrato de paja lavada

- 0,9 ± 0,02 ml de medio de reaccion de hidrolisis compuesto de tampon acetato 50 mM - pH 4,8 y cloranfenicol (0,05 g/l)

- entre 0,1 y 0,2 ± 0,02 g de coctel enzimatico en funcion de su tasa de protefnas.

Las hidrolisis enzimaticas se llevan a cabo a 45 ± 2 °C bajo agitacion tipo vortex a 900 rotaciones por minuto en un Thermomixer Comfort Eppendorf.

Todas los ensayos se llevan a cabo por duplicado con tiempos de muestreo fijados a t 24, 48 y 96 horas, algunos de los cuales se muestrean a t 72 horas.

En cada tiempo de muestreo, los hidrolizados se escaldan durante 5 minutos en los tubos Eppendorf sacrificados. Estos tubos se enfrfan y centrifugan. La determinacion de glucosa se realiza por HPLC. Paralelamente, los residuos solidos de cada tubo Eppendorf se lavan y se centrifugan 3 veces antes de secarse a 105 °C durante 24 horas para evaluar los SIA (solidos insolubles en agua). El calculo del rendimiento de la hidrolisis se realiza teniendo en cuenta los SIA.

Los cocteles resultantes del ejemplo 5 fueron evaluados. Se llevan a cabo dos ensayos de control con cocteles de referencia tambien suplementados con p-glucosidasa para comparacion: un coctel producido por la cepa CL847 AEG1 (AEG1) y un coctel producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG1 (AEG1cEG1).

La FIGURA 1 presenta los resultados de HFS para el coctel resultante de la cepa 154/8 que expresa la variante 154E4 (SEQ ID NO: 10).

Los resultados presentados en la FIGURA 2 muestran que la velocidad inicial de hidrolisis del coctel producido por la variante 146C4 es superior a la de los cocteles de referencia AEG1 y AEG1cEG1. El rendimiento final de la hidrolisis tambien es superior al de los cocteles de referencia AEG1 y AEG1 cEG1.

La FIGURA 3 presenta los resultados de HFS para el coctel resultante de la cepa 11G8 que expresa la variante 11G8 (SEQ ID NO: 22).

Los resultados presentados en la FIGURA 3 muestran que las velocidades iniciales de hidrolisis de los cocteles producidos por la variante 11G8 es superior a la de los cocteles de referencia AEG1 y AEG1cEG1. El rendimiento final de hidrolisis tambien es superior al de los cocteles de referencia AEG1 y AEG1 cEG1.

Ejemplo 7: Eficacia de las enzimas en la hidrolisis de biomasa lianocelulosica de acuerdo con un procedimiento SFS

El sustrato utilizado es el mismo que el descrito en la tabla 9 (Ejemplo 6).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las SFS se realizan por triplicado en reactores de laboratorio. Se constituyen de los siguientes elementos:

- un frasco de vidrio de 30 ml de volumen util;

- un tapon de seguridad de polieter eter cetona (Peek);

- una valvula unidireccional DV-118 comercializada por la sociedad Vaplock fijada a traves del tapon. La valvula esta configurada para abrirse cuando la presion relativa en la botella es superior a 70 mbar;

- un tubo hueco de polipropileno, unido a traves de un segundo que atraviesa el tapon y equipado en el extremo inferior de dicho tubo con un septo;

- una junta plana dispuesta entre el cuello del frasco y el tapon.

El principio de implementacion de los biorreactores es el siguiente: el CO2 producido durante la fermentacion etanolica se acumula en el cielo sobre el medio de reaccion que causa por acumulacion un aumento en la presion en el biorreactor (Pg). Cuando Pg es superior a la presion de apertura de la valvula unidireccional (Ps), esta se abre para liberar una cantidad de gas que por ejemplo se determina mediante pesaje. Cuando Pg < Ps, la valvula se cierra hasta que Pg sea superior a Ps. Por lo tanto, el biorreactor en funcionamiento todavfa esta bajo presion para proporcionar un medio anaerobico estable para la fermentacion. La cantidad de etanol producida se evalua por la produccion de CO2 estimada por la perdida de peso a partir de la siguiente ecuacion estequiometrica de fermentacion de glucosa en etanol:

C6H12O6 (glucosa)^- 2 CO2 + 2 CH3CH2OH (etanol) + energfa

El medio de cultivo utilizado para SFS es un medio acuoso que comprende:

- un tampon acetato 50 mM para pH 5;

- cloranfenicol a 0,1 g/l;

- medio nutritivo con 3 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4, 0,4 g/l de MgSO4, 7H2O y 1 g/l de extracto de levadura.

Las SFS se prepararon con 10 ± 0,01 % m/m de materia seca o un equivalente de 5,4 % de celulosa m/m para una masa de reaccion total de 15 ± 0,003 g. La tasa de protefnas se fija en 10 ± 0,01 mg de celulasas por gramo de materia seca, o aproximadamente 19 mg/g de celulosa. La concentracion de cocteles enzimaticos se midio por el metodo de Lowry utilizando ASB (albumina serica bovina) como referencia. Cada coctel se suplemento con actividad de p-glucosidasa a un maximo de 120 ± 2 lU/g de celulosa, anadiendo p-glucosidasa SP188 (Novozymes).

La levadura de fermentacion de azucares (Saccharomyces cerevisiae, cepa de etanol rojo, Fermentis, Francia) se anade al medio para obtener un contenido de 2 ± 0,1 g/kg.

Se anaden enzimas y levaduras a los biorreactores despues de una hora de acondicionamiento de la paja de trigo pretratada a 35 °C con el tampon, cloranfenicol y medio de cultivo.

La reaccion de SFS se realiza a una temperatura de aproximadamente 35 °C, colocando el biorreactor de laboratorio en una incubadora tipo INFORS Multitron HT Standard con una velocidad de rotacion orbital de 150 rpm.

Con el tiempo, la perdida de masa se controlo mediante el pesaje de los biorreactores. Al final de la reaccion, el mosto de fermentacion se calienta a 100 °C durante 5 minutos, se enfrfa y se centrifuga para separar las materias solidas no hidrolizadas del zumo de fermentacion. Este ultimo se analiza luego por cromatograffa en fase gaseosa para determinar su concentracion de etanol.

Se evaluaron los cocteles del ejemplo 5. Dos ensayos de control se llevan a cabo con cocteles de referencia tambien suplementados con p-glucosidasa para la comparacion: un producto con la cepa CL847 AEG1 (AEG1) y un coctel producido por la cepa CL847 AEG1 retransformada con el gen de referencia EG1 (AEG1cEG1).

La FIGURA 4 presenta los resultados de SFS para los 2 cocteles resultantes que expresan la endoglucanasa 154E4 (media de los resultados obtenidos con las 2 variantes).

Los resultados presentados en la FIGURA 4 muestran que el progreso (produccion de etanol para la misma dosis de enzimas) de sFs en 100 horas para los 2 cocteles que expresan endoglucanasa 154E4 es superior a los de los cocteles de referencia AEG1 y AEG1cEG1.

La FIGURA 5 presenta los resultados de SFS para los 3 cocteles que expresan la endoglucanasa 11G8 (media de los resultados obtenidos con las 2 variantes).

Los resultados presentados en la FIGURA 5 muestran que el progreso de SFS en 100 horas para los 3 cocteles que expresan la endoglucanasa 11G8 (media) es superior a los de los cocteles de referencia AEG1 y AEG1cEG1.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> IFPEN

<120> VARIANTES DE LA ENDOGLUCANASA CON ACTIVIDAD MEJORADA Y SUS USOS 5 <130> BFF

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

10

<210> 1 <211>1380 <212> ADN

<213> Trichoderma reesei 15

<400> 1

atggcgccct

cagttacact gccgttgacc acggcoatcc tggccattgc ccggctcgtc 60

gccgcccagc

aaccgggtac cagcaccccc gaggtccatc ccaagttgac aacctacaag 120

tgtacaaagt

ccggggggtg cgtggcccag gacacctcgg tggtccttga ctggaactac 180

cgctggatgc

acgacgcaaa ctacaactcg tgcaocgtaa acggcggcgt caacaccacg 240

ctctgccctg

acgaggcgac ctgtggcaag aactgcttca tcgagggogt cgactacgcc 300

gcctcgggcg

tcacgacctc gggcagcagc ctcaccatga accagtacat gcccagcagc 360

tctggcggct

acagcagcgt ctctoctcgg ctgtatctcc tggactctga cggtgagtac 420

gtgatgctga

agctcaacgg ccaggagctg agcttcgacg tcgacctctc tgctctgccg 480

tgtggagaga

acggctcgct ctacctgtct cagatggacg agaacggggg cgccaaccag 540

tataacacgg

ccggtgccaa ctacgggagc ggctactgcg atgctcagtg ccccgtccag 600

acatggagga

acggcaccct caacactagc caccagggct tctgctgoaa cgagatggat 660

atcctggagg

gcaactcgag ggcgaatgcc ttgaoccctc actcttgcac ggccacggcc 720

tgcgactctg

ccggttgcgg cttcaacccc tatggcagcg gctacaaaag ctactacggc 780

cccggagata

ccgttgacac ctccaagacc ttcaccatca tcacccagtt caacacggac 840

aacggctcgc

cotcgggcaa ccttgtgagc atcacccgca agtaccagca aaacggcgtc 900

gacatcccca

gcgcccagcc cggcggcgac accatctcgt cctgcccgtc cgcctcagcc 960

tacggcggcc

tcgccaccat gggcaaggcc ctgagcagcg gcatggtgct cgtgttcagc 1020

atttggaacg

acaacagcca gtacatgaac tggctcgaca gcggcaacgc cggcccctgc 1080

agcagcaccg

agggcaaccc atccaacatc ctggccaaca accccaacac gcacgtcgtc 1140

ttctccaaca

tccgctgggg agacattggg tctactacga actcgactgc gcccccgccc 1200

ccgcctgcgt

coagcacgac gttttcgact acacggagga gctcgacgac ttcgagcagc 1260

ccgagctgca

cgcagactca ctgggggcag tgcggtggca ttgggtacag cgggtgcaag 1320

acgtgcacgt

cgggcactac gtgccagtat agcaacgact actactcgca atgcctttaa 1380

20 <210>2

<211> 459

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400>2 5

Met Ala Pro Ser Val Thr 1 5

Ala Arg Leu Val Ala Ala

20

His Pro Lys Leu Thr Thr 35

Ala Gin Asp Thr Ser Val 50

Asp Ala Asn Tyr Asn Ser 65 70

Leu Cys Pro Asp Glu Ala 85

Val Asp Tyr Ala Ala Ser 100

Met Asn Gin Tyr Met Pro 115

Pro Arg Leu Tyr Leu Leu 130

Leu Asn Gly Gin Glu Leu 145 150

Cys Gly Glu Asn Gly Ser 165

Gly Ala Asn Gin Tyr Asn 180

Cys Asp Ala Gin Cys Pro 195

Thr Ser His Gin Gly Phe

Leu Pro Leu Thr Thr Ala lie Leu Ala lie 10 15

Gin Gin Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val

25 30

Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val 40 45

Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His 55 60

Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr 75 80

Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe lie Glu Gly 90 95

Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr 105 110

Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser 120 125

Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys 135 140

Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro 155 160

Leu Tyr Leu Ser Gin Met Asp Glu Asn Gly 170 175

Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr 185 190

Val Gin Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn 200 205

Cys Cys Asn Glu Met Asp lie Leu Glu Gly

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Polipeptido aislado o purificado caracterizado por que tiene una actividad endoglucanasa mejorada con respecto a la actividad endoglucanasa de la protema de referencia EG1, dicho polipeptido se selecciona entre el grupo que consiste en:

   i) una secuencia de aminoacidos seleccionada entre SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26;

   ii) una secuencia de aminoacidos que presentan, con respecto a la secuencia, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26 un porcentaje de identidad de al menos 90 %, preferentemente 95%, 98 % o 99 %, o una secuencia de aminoacidos que presenta, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, un porcentaje de identidad de al menos 98%.
2. 2. Acido nucleico purificado o aislado, caracterizado por que codifica al menos un polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 1.
3. 3. Acido nucleico purificado o aislado de acuerdo con la reivindicacion 2 seleccionado entre las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25.
4. 4. Vector caracterizado por que comprende un acido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 o 3.
5. 5. Celula huesped aislada caracterizada por que comprende el acido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 o 3 o el vector de acuerdo con la reivindicacion 4.
6. 6. Celula huesped aislada de acuerdo con la reivindicacion 5, caracterizada por que se selecciona entre Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Penicillium, Fusarium, Thermomonospora, Myceliophthora, Chrysosporium, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia y Saccharomyces.
7. 7. Celula huesped aislada de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, caracterizada por que se selecciona entre Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisae, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca y Saccharomyces cerevisiae.
8. 8. Uso de dicho polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 1 para la hidrolisis de celulosa.
9. 9. Uso de dicho polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 1 para la produccion de biocombustible.
10. 10. Composicion enzimatica capaz de actuar sobre la biomasa lignocelulosica, dicha composicion enzimatica se produce por hongos filamentosos y comprende al menos un polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 1.
11. 11. Procedimiento de produccion de biocombustible a partir de biomasa, caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:

    - poner en suspension en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;

    - hidrolisis en presencia de una composicion enzimatica de acuerdo con la reivindicacion 10 de la biomasa lignocelulosica a fin de producir un hidrolizado que contiene glucosa;

    - fermentacion de la glucosa del hidrolizado a fin de producir un mosto de fermentacion;

    - separacion del biocombustible del mosto de fermentacion.
12. 12. Procedimiento de produccion de biocombustible a partir de biomasa, caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:

    - poner en suspension en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;

    - adicion simultanea de una composicion enzimatica de acuerdo con la reivindicacion 10 y de un organismo fermentativo a fin de producir un mosto de fermentacion;

    - separacion del biocombustible del mosto de fermentacion.
13. 13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que el organismo fermentativo se selecciona entre una celula huesped de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 o 6.
14. 14. Procedimiento de produccion de biocombustible a partir de biomasa, caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:

    - poner en suspension en fase acuosa la biomasa que se va a hidrolizar;

    5 - adicion de una o mas celulas huesped de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7 con un organismo

    fermentativo y/o una composicion enzimatica de acuerdo con la reivindicacion 10, a fin de producir un mosto de fermentacion;

    - separacion del biocombustible del mosto de fermentacion.

    Equivalentes re duct ores (pg/ml de cultivo)

    imagen1

    FIGURA1

    imagen2

    FIGURA2

    CD

    CD

    C

    2

    4*

    imagen3

    FIGURA3

    imagen4

    imagen5