ES2876268T3 - Variantes de exoglucanasas con actividad mejorada y sus usos - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado o purificado caracterizado por que tiene una actividad exoglucanasa mejorada de al menos 10 % a una temperatura de aproximadamente 35 °C, y opcionalmente de al menos 10 % a una temperatura de aproximadamente 50 °C, con respecto a la actividad exoglucanasa de la proteína de referencia CBH1 de secuencia SEQ ID NO: 2 sobre un sustrato seleccionado entre celulosa Avicel, celulosa PASC, un sustrato celodextrinas reducidas o un sustrato cromogénico tal como pNP lactósido, siendo dicho polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: i. una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20, y ii. una secuencia de aminoácidos que presenta, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20, un porcentaje de identidad de al menos 99 %.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de exoglucanasas con actividad mejorada y sus usos

Sector de la técnica

La posibilidad de producir etanol a partir de celulosa ha recibido mucha atención debido a la disponibilidad de grandes cantidades de materia prima, así como por el interés del etanol como carburante. Las materias primas naturales celulósicas para dicho proceso están indicadas por el término "biomasa". Numerosos tipos de biomasa, por ejemplo, madera, residuos agrícolas, cultivos herbáceos y residuos sólidos municipales, se han considerado como materias primas potenciales para la producción de biocarburante. Estas materias están constituidas principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina.

Estado de la técnica

La celulosa es un polímero constituido por moléculas de glucosa unidas por enlaces beta 1-4, que son muy resistentes a la degradación o a la despolimerización. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa, ésta es fácilmente fermentada en biocarburante, por ejemplo, etanol, utilizando una levadura.

Los métodos más antiguos estudiados para convertir la celulosa en glucosa se basan en la hidrólisis ácida. Ese proceso puede realizarse en presencia de ácidos concentrados o diluidos. No obstante, varios inconvenientes tales como la deficiente recuperación del ácido cuando se utilizan ácidos concentrados y la baja producción de glucosa en el caso del uso de ácidos diluidos son perjudiciales para la economía del proceso de hidrólisis ácida.

Para superar los inconvenientes del proceso de hidrólisis ácida, los procesos de conversión de la celulosa se han dirigido más recientemente a la hidrólisis enzimática, con la ayuda de enzimas de tipo celulasa. Esta hidrólisis enzimática de la biomasa lignocelulósica (por ejemplo, la celulosa) presenta, no obstante, el inconveniente de ser un procedimiento industrial costoso. Por ello, es necesario utilizar cepas de microorganismos secretores de celulasas cada vez más eficientes. Como tal, muchos microorganismos constan de enzimas que hidrolizan la celulosa, tales como hongos Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Fusarium, así como bacterias tales como Thermomonospora, Bacillus, Cellulomonas y Streptomyces. Las enzimas secretadas por estos microorganismos poseen tres tipos de actividades útiles en la conversión de celulosa en glucosa y se dividen en tres grupos: las endoglucanasas, que atacan las fibras de celulosas al azar de forma interna, las exoglucanasas que atacarán los extremos de las fibras liberando celobiosa y las beta-glucosidasas que hidrolizarán esta celobiosa en glucosa. Otras clases de enzimas tales como hemicelulasas o la clase de enzimas recientemente descubierta de polisacáridos monooxigenasas también pueden desempeñar un papel en la eficacia de la hidrólisis.

Existe un gran interés industrial en reducir el costo de la hidrólisis enzimática, y esta reducción implica el uso de una dosis reducida de enzimas y, por tanto, cócteles enzimáticos más eficaces. En consecuencia, varias solicitudes de patente describen enzimas naturales con capacidades superiores a las de Trichoderma reesei, o variantes mejoradas por ingeniería genética. Se pueden citar las solicitudes de patente US2010304464, WO2010066411, PCT/US2013/074030, US 2014/017737, US2013/130353, US2008/167214 y WO2013029176 en lo concerniente a las exoglucanasas, las solicitudes WO2007109441, WO2012149192 y WO2010076388 en lo concerniente a las endoglucanasas, las solicitudes WO2010029259, WO2010135836 o WO2010022518 en lo concerniente a las betaglucosidasas, o incluso las solicitudes WO12135659, WO12149344 en lo concerniente a los polisacáridos monooxigenasas. También se pueden citar los siguientes números de acceso en lo concerniente a las exoglucanasas: BBI75603, BBI74548, BBB73564, BAO94743, AUP68912, ASQ81185 o ASQ81184.

La solicitud PCT/US2011/061482 describe polipéptidos quiméricos que poseen una actividad que refuerza la actividad celulolítica, del mismo modo que los números de acceso AZW45974 y AZW45973.

La solicitud de patente FR2782323 describe un procedimiento de producción in vitro de secuencias polinucleotídicas recombinadas.

Las enzimas que hidrolizan la biomasa lignocelulósica se clasifican en el sistema CAZy (Cantarel, B. L., Coutinho, P. M., Rancurel, C., Bernard, T., Lombard, V., y Henrissat, B. (2009). The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic acids research, 37, D233-8) en criterios principalmente estructurales. Las exoglucanasas pueden pertenecer a las familias GH 6, 7, 9,48 y 74.

Para que una hidrólisis de la biomasa lignocelulósica sea eficaz y económicamente rentable, la mezcla enzimática debe constar de proporciones equilibradas de enzimas que tienen actividades enzimáticas diversas, entre otras, pero no exclusivamente, del tipo exoglucanasas, endoglucanasas, xilanasas y beta-glucosidasas. Como ejemplo, en las mezclas nativas de Trichoderma reesei, se observa generalmente la presencia de 60-70 % de exoglucanasas, 15­ 20 % de endoglucanasas, algunos porcentajes de hemicelulasas y aproximadamente 5-10 % de beta-glucosidasas. Esta mezcla es adecuada para hidrolizar la mayoría de sustratos pretratados (p. ej., tipo paja de trigo explotada al vapor en condiciones ácidas) con rendimientos aceptables. La proporción ya considerable de exoglucanasas en la mezcla indica que será difícil aumentar la cantidad de estas enzimas sin perjudicar las otras actividades endoglucanasas, hemicelulasas y glucosidasas. El genoma de Trichoderma reesei consta de dos exoglucanasas, una procedente de la familia 6 (CBH2, cel6a) y la otra procedente de la familia 7 (CBH1, Cel7a). Estas dos exoglucanasas se hidrolizan en celobiosa, respectivamente, los extremos no reductores (EC3.2.1.176) y reductores (EC3.2.1.91) de la celulosa.

La hidrólisis y la fermentación se pueden llevar a cabo según diferentes esquemas. El más común consiste en una hidrólisis y una fermentación separadas (HFS) (SHF - Sepárate Hydrolysis and Fermentation). Este método permite optimizar cada etapa manteniendo condiciones óptimas de reacción. Esta fermentación se efectúa de manera extemporánea, a una temperatura comprendida entre aproximadamente 28 °C y aproximadamente 30 °C, mientras que la hidrólisis tiene lugar generalmente a una temperatura de al menos 45 °C. No obstante, en HFS, los azúcares liberados al final de la reacción están presentes a una concentración muy alta y producen una inhibición de las enzimas, ralentizando la eficacia del procedimiento. Para evitar estos inconvenientes, se puede considerar otro tipo de procedimiento. En SFS (Simultaneous Saccharification and Fermentation, sacarificación y fermentación simultáneas), las dos etapas (hidrólisis y fermentación de hexosas) tienen lugar de manera simultánea, evitando la acumulación de azúcares en concentraciones inhibidoras para las enzimas. Los costos de inversión también se reducen gracias al uso de un solo reactor. La tasa de hidrólisis es más elevada en respuesta a la ausencia de inhibición ya que los azúcares liberados se utilizan inmediatamente para la fermentación de etanol. En este método, la temperatura del reactor constituye necesariamente un término medio entre las temperaturas óptimas de hidrólisis y fermentación, normalmente entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 35 °C. No obstante, a tal temperatura, la actividad de las enzimas celulolíticas disminuye un 30 % aproximadamente.

La SFS también permite la expresión de enzimas que degradan la celulosa en el organismo que fermenta los azúcares, lo que permite limitar, o en un caso extremo, suprimir el uso de enzimas producidas en una etapa separada.

En consecuencia, la obtención de enzimas que mantienen una actividad exoglucanasa eficaz a temperaturas óptimas de hidrólisis y fermentación (es decir, entre 30 °C y 50 °C), mientras se mantiene la proporción del conjunto de enzimas de la mezcla, sería una ganancia significativa para el procedimiento de conversión de biomasa lignocelulósica en biocarburante.

Objetivo de la invención

Los inventores han desarrollado un polipéptido que tiene una actividad exoglucanasa mejorada, en concreto con respecto a la actividad exoglucanasa de la proteína de referencia CBH1 de secuencia SEQ ID NO: 2. CBH1 corresponde a la exoglucanasa 1 de Trichoderma reesei.

Para ello, los solicitantes han tenido el gran mérito de encontrar, después de numerosas investigaciones, un polipéptido aislado o purificado que tiene una actividad exoglucanasa mejorada con respecto a la actividad exoglucanasa de la proteína de referencia CBH1 (SEQ ID NO: 2).

La descripción se refiere por tanto a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i. una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:

10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20; y

ii. una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de residuos idénticos con respecto a una de las secuencias SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ

ID NO:18 o SEQ ID NO: 20 (o porcentaje de identidad), de al menos 70 %, preferentemente de al menos 75 %,

80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %.

La invención está definida por las reivindicaciones.

Preferentemente, el polipéptido descrito anteriormente se caracteriza por que su expresión en un organismo fermentativo es al menos igual a la expresión de la proteína de referencia CBH1 (SEQ ID NO: 2).

Según la invención, el porcentaje de identidad de una secuencia dada con respecto a SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14,

16, 18 o 20 corresponde al número de residuos idénticos entre esta secuencia dada y SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 16, 18 o 20 dividido por el número de residuos en SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20.

El polipéptido de la invención tiene una actividad exoglucanasa mejorada de al menos 10 %, preferentemente de al menos 20 %, preferentemente de al menos 30 %, incluso más preferentemente de al menos 40 %, a una temperatura de aproximadamente 35 °C y/o aproximadamente 50 °C, con respecto a la actividad exoglucanasa del polipéptido CBH1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

Los expertos en la materia podrán, por ejemplo, determinar el aumento, o en otras palabras, la mejora de la actividad enzimática ya sea usando un sustrato como la celulosa Avicel®, la celulosa PASC o "Walseth", o con un sustrato cromogénico (p-nitrofenil glicósido), por ejemplo, pNP lactósido. La actividad enzimática se revelará, respectivamente,

por un ensayo colorimétrico de los azúcares reductores o bien del nitrofenol liberado.

Un ejemplo de protocolo que un experto en la materia podrá utilizar para determinar si un polipéptido según la invención presenta una actividad enzimática mejorada con respecto a la de la proteína de referencia CBH1 (SEQ ID NO: 2), es el siguiente:

- preparación de un cultivo madre de Y. lipolytica que expresa una enzima recombinante según la invención durante toda la noche a 28 °C;

- siembra de un medio de expresión con un volumen de cultivo madre que permite tener una DO a 600 nm igual a 0,2 al inicio del cultivo;

- cultivo de dichas células a 28 °C durante 96 horas;

- centrifugación a 8000 rpm durante 5 minutos;

- incubación de 100 pl de sobrenadante con 100 pl de tampón citrato fosfato 0,1 M pH 6 que contiene 1 % de Celodextrinas (CD) reducidas durante 24 horas a 35 °C y 50 °C;

- extracción de 100 pl de reacción;

- adición de 100 pl de reactivo DNS;

- incubación durante 5 minutos a 100 °C;

- incubación durante 3 minutos en hielo;

- centrifugación durante 10 minutos a 3000 rpm;

- lectura de la DO a 540 nm en 150 pl.

La TABLA 1 a continuación comprende las identificaciones de secuencias nucleicas y peptídicas para CBH1 de T. reesei ("salvaje"), las exoglucanasas putativas de Talaromyces stipitatus (TS) y de Neosartorya fichen (NF), así como para los polipéptidos y nucleótidos de la invención.

TABLA 1 l n m r n r n l

La invención también tiene por objeto un ácido nucleico purificado o aislado que codifica al menos un polipéptido como se ha descrito anteriormente, según la invención.

Preferentemente, dicho ácido nucleico purificado o aislado se puede seleccionar entre las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19.

Según la invención, el ácido nucleico como se ha descrito anteriormente puede unirse operativamente a un promotor, un terminador o cualquier otra secuencia necesaria para su expresión en una célula hospedadora.

La invención también trata sobre un vector que comprende al menos un ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, según la invención.

Según la invención, se entiende por "vector" cualquier secuencia de ADN en la cual es posible insertar fragmentos de un ácido nucleico foráneo, permitiendo los vectores introducir ADN foráneo en una célula hospedadora. Se puede citar de manera no exhaustiva como vectores: plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales derivados del bacteriófago P1 (PAC) o vectores derivados de virus.

El vector según la invención podrá portar igualmente un marcador de selección. Se entiende por "marcador de selección" un gen cuya expresión confiere a las células que lo contienen una característica que permite seleccionarlas. Se trata, por ejemplo, de un gen de resistencia a los antibióticos.

La invención tiene también por objeto una célula hospedadora aislada que comprende al menos uno de los polipéptidos como se ha descrito previamente, según la invención, al menos uno de los ácidos nucleicos como se ha descrito anteriormente, según la invención, o al menos uno de los vectores como se ha descrito anteriormente, según la invención.

Los expertos en la materia podrán introducir uno de los polipéptidos, uno de los ácidos nucleicos o uno de los vectores como se ha descrito anteriormente en la célula huésped por métodos convencionales bien conocidos. Por ejemplo, se puede citar el tratamiento con cloruro de calcio, la electroporación, el uso de una pistola de partículas.

Según un modo de realización, el experto en la materia podrá introducir en la célula huésped y por métodos convencionales, varias copias de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad exoglucanasa mejorada según la invención.

Según un modo de realización, la célula hospedadora aislada como se ha descrito anteriormente según la invención se selecciona entre Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Myceliophthora, Chrysosporium, Pénicillium, Fusarium, Thermomonospora, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia y Saccharomyces.

Según un modo de realización preferido, la célula hospedadora aislada como se ha descrito anteriormente según la invención se selecciona entre TTrichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, Humicola grisae, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca y Saccharomyces cerevisiae.

Según un modo de realización preferido, la célula hospedadora aislada como se ha descrito anteriormente según la invención se selecciona entre Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae.

La invención también tiene por objeto el uso de al menos uno cualquiera de los polipéptidos de descritos anteriormente, según la invención, para la hidrólisis de celulosa.

La invención también tiene por objeto el uso de al menos uno cualquiera de los polipéptidos de descritos anteriormente, según la invención, para la producción de biocarburante.

Según la invención, el término biocarburante puede definirse como cualquier producto procedente de la transformación de biomasa y que puede ser utilizado con fines energéticos. Por un lado, y sin pretender limitar, se pueden citar, como ejemplo de biogás, productos que pueden ser incorporados (eventualmente después de una transformación posterior) a un carburante o ser un carburante por sí mismos, tales como alcoholes (etanol, butanol y/o isopropanol, según el tipo de organismo fermentativo utilizado), disolventes (acetona), ácidos (butírico), lípidos y sus derivados (ácidos grasos de cadena corta o larga, ésteres de ácidos grasos), así como hidrógeno.

De manera preferente, el biocarburante según la invención es un alcohol, por ejemplo, etanol, butanol y/o isopropanol. Más preferentemente, el biocarburante según la invención es etanol.

En otro modo de realización, el biocarburante es biogás.

En otro modo de realización, el producto es una molécula de interés para la industria química, como, por ejemplo, otro alcohol tal como 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, 2,3-butanodiol, ácidos orgánicos como ácido acético, propiónico, acrílico, butírico, succínico, málico, fumárico, cítrico, itacónico o hidroxiácidos como ácido glicólico, hidroxipropiónico o láctico.

A continuación se describe un modo de realización de producción de un cóctel enzimático útil para la hidrólisis de lignocelulosa.

Las cepas de hongos filamentosos, preferentemente Trichoderma, más preferentemente T. reesei, capaces de expresar al menos un polipéptido según la invención se cultivan en fermentadores, en presencia de un sustrato de carbono, tal como lactosa o glucosa, seleccionado para el crecimiento del microorganismo. En un modo de realización, este sustrato de carbono, según su naturaleza, se introduce en el fermentador antes de la esterilización o se esteriliza por separado y se introduce en el fermentador después de la esterilización de este último para obtener una concentración inicial de 20 a 35 g/l.

Luego se añade una solución acuosa que contiene el sustrato seleccionado para la producción de las enzimas. Una composición enzimática que actúa sobre la biomasa lignocelulósica producida por los hongos se recupera finalmente por filtración del medio de cultivo. En esta composición, se encuentran, en concreto, beta-glucosidasa, endoglucanasa y exoglucanasa según la invención.

En un modo de realización, la solución acuosa que contiene el sustrato seleccionado para la producción de las enzimas se prepara a una concentración de 200-250 g/l. Esta solución contiene además preferentemente un sustrato inductor tal como lactosa. Esta solución acuosa se inyecta después del agotamiento del sustrato de carbono inicial para proporcionar una cantidad optimizada, comprendida entre 35 y 45 mg/g de células ("fed batch" (proceso semicontinuo)). Durante esta fase de "proceso semicontinuo", la concentración residual de azúcar en el medio de cultivo es inferior a 1 g/l y las enzimas que actúan sobre la biomasa lignocelulósica son secretadas por el hongo. Estas últimas pueden recuperarse por filtración del medio de cultivo.

La invención tiene por objeto una composición enzimática apta para actuar sobre la biomasa lignocelulósica, siendo dicha composición enzimática producida por hongos filamentosos y que comprende al menos uno cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente, según la invención.

Por "hongos filamentosos", se entiende en concreto Trichoderma, más preferentemente T. reesei.

Finalmente, la invención tiene por objeto un procedimiento de producción de biocarburante a partir de biomasa que comprende las siguientes etapas sucesivas:

- se pone en suspensión en fase acuosa la biomasa a hidrolizar;

- se hidroliza la biomasa lignocelulósica en presencia de una composición enzimática como se ha descrito anteriormente, según la invención, para producir un hidrolizado que contiene glucosa;

- se fermenta en presencia de un organismo fermentativo la glucosa del hidrolizado para producir un mosto de fermentación;

- se separa el biocarburante del mosto de fermentación.

En un modo de realización, la biomasa a hidrolizar se pone en suspensión en fase acuosa a razón de 6 a 40 % de materia seca, preferentemente de 20 a 30 %. El pH se regula entre 4 y 5,5, preferentemente entre 4,8 y 5,2 y la temperatura entre 40 y 60 °C, preferentemente entre 45 y 50 °C. La reacción de hidrólisis se inicia por la adición de la composición enzimática que actúa sobre la biomasa lignocelulósica; la cantidad habitualmente utilizada es de 10 a 30 mg de proteínas excretadas por gramo de sustrato pretratado o menos. La reacción dura generalmente de 15 a 48 horas. La reacción es seguida por un análisis de los azúcares liberados, en concreto la glucosa. La solución de azúcares se separa de la fracción sólida no hidrolizada, constituida esencialmente de lignina, por filtración o centrifugación y luego se trata en una unidad de fermentación.

Después de la etapa de fermentación, el biocarburante se separa del mosto de fermentación, por ejemplo, por destilación.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de producción de biocarburante a partir de la biomasa, caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:

- se pone en suspensión en fase acuosa la biomasa a hidrolizar;

- se añade simultáneamente a la suspensión una composición enzimática que actúa sobre la biomasa lignocelulósica como se ha definido anteriormente, según la invención, y un organismo fermentativo y se fermenta la mezcla para producir un mosto de fermentación;

- se separa el biocarburante del mosto de fermentación.

Preferentemente, la composición enzimática y el organismo fermentativo se añaden simultáneamente y luego se incuban a una temperatura comprendida entre 30 °C y 35 °C para producir un mosto de fermentación.

Según este modo de realización, la celulosa presente en la biomasa se convierte en glucosa, y al mismo tiempo, en el mismo reactor, el organismo fermentativo (por ejemplo, una levadura) convierte la glucosa en el producto final según un procedimiento de SFS (Simultaneous Saccharification and Fermentation, sacarificación y fermentación simultáneas) conocido por los expertos en la materia. Según las capacidades metabólicas e hidrolíticas del organismo fermentativo, el buen desarrollo de la operación puede requerir la adición de una cantidad mayor o menor de mezcla celulolítica exógena.

En otro modo de realización, el organismo fermentativo produce el polipéptido objeto de la invención por secreción o en la superficie de su célula, opcionalmente junto con otras enzimas que actúan sobre la biomasa lignocelulósica, limitando o suprimiendo así la necesidad de enzimas producidas por el hongo filamentoso. Preferentemente, el organismo fermentativo es una célula hospedadora como se ha descrito anteriormente.

Preferentemente, las células hospedadoras que producen la composición enzimática y/o el organismo fermentativo, se añaden y luego se incuban a una temperatura comprendida entre 30 °C y 35 °C para producir un mosto de fermentación.

El uso del polipéptido que presenta una mejor actividad exoglucanasa según la presente invención presenta así la ventaja de obtener un mejor rendimiento de producción de glucosa mientras se emplea menos enzima que antes, lo que también presenta una ventaja económica.

Otros aspectos, objetos, ventajas y características de la invención, se presentarán tras la lectura de la siguiente descripción no restrictiva y que describe modos de realización preferidos de la invención dados mediante ejemplos y las Figuras 1 a 8.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es un espectro de masas MALDI-TOF que representa las celodextrinas DP3 a DP11 utilizadas para el cribado.

La Figura 2 es una fotografía que ilustra los halos de hidrólisis generados por las enzimas secretadas por los clones puros aislados durante el cribado de T. reesei en pocillos de placas de Petri Walseth.

La Figura 3 es un gel de electroforesis bidimensional que compara los secretomas de los clones de T. reesei: cepa de referencia CL847; cepa de referencia CL847ACBH1; clones puros aislados n.° 6 y n.° 20 de la variante 130G9 (SEQ ID NO: 8).

La Figura 4 es un gel de electroforesis bidimensional que compara los secretomas de los clones de T. reesei: cepa de referencia CL847; cepa de referencia CL847ACBH1 y clon puro aislado n.° 24 de la variante 453E8 (SEQ ID NO: 16).

La Figura 5 es un gráfico que presenta los resultados de HFS para el cóctel 453E8-24, procedente de la cepa n.° 24 que expresa la variante 453E8 (SEQ ID NO: 16) y del cóctel de referencia CL847 suplementado con pglucosidasa.

La Figura 6 es un gráfico que presenta los resultados de HFS para los cócteles 130G9-6 y 130G9-20 procedentes de las cepas n.° 6 y n.° 20 que expresan la variante 130G9 (SEQ ID NO: 8) y del cóctel de referencia CL847 suplementado con p-glucosidasa.

La Figura 7 es un gráfico que presenta los resultados de SFS para el cóctel 453E8-24, procedente de la cepa n.° 24 que expresa la variante 453E8 (SEQ ID NO: 16) y del cóctel de referencia CL847 suplementado con pglucosidasa.

La Figura 8 es un gráfico que presenta los resultados de SFS para los 2 cócteles 130G9-6 y 130G9-20 procedentes de las cepas n.° 6 y n.° 2o que expresan la variante 130G9 (SEQ ID NO: 8) y del cóctel de referencia CL847 suplementado con p-glucosidasa.

Descripción detallada de la invención

EJEMPLO 1: Preparación de celodextrinas reducidas de DP 3-11.

1- H idrólisis de celulosa

Adaptado de Y-H. Percival Zhang, L. R. Lynd Analytical Biochemistry 322 (2003), 225-232.)

Avicel HCl H2

Celodextrinas

20 g de celulosa (Avicel. Número CAS 9004-34-6, Sigma-Aldrich Saint-Quentin Fallavier) se añaden por porciones y con agitación vigorosa a 160 ml de una solución enfriada a 0 °C de ácido clorhídrico. Ácido sulfúrico, previamente enfriado, se añade a la solución varias veces (4 x 10 ml). La reacción se mantiene en agitación durante 4 horas a 25 °C antes de verterse en 1,8 l de acetona enfriada a -20 °C. Después de 2 horas de agitación, el precipitado se filtra, se recoge en 400 ml de acetona enfriada y luego se filtra de nuevo. A continuación, se recoge el sólido en 600 ml de agua, y luego se agita durante una noche para solubilizar las celodextrinas (CD). Después de la filtración del sólido, la fracción soluble que contiene las celodextrinas se neutraliza con 300 g de resina Amberlite IRA 400 OH-, y luego se liofiliza. El liofilizado se resuspendió después en 500 ml de metanol en presencia de ultrasonidos durante 30 minutos para solubilizar los azúcares de bajo peso molecular antes de filtrarse y después de liofilizarse de nuevo para dar lugar a 6,8 g de celodextrinas de DP 3-11. Para el cribado, se eligió trabajar con sustratos del mayor peso molecular posible para imitar mejor la estructura de la celulosa. Pero las celodextrinas de alto peso molecular no son solubles, lo que impide una buena reproducibilidad de las pruebas.

Por tanto, se seleccionó una gama de celodextrinas de DP 5-7, lo que representa un buen término medio entre el alto peso molecular requerido y la solubilidad de las celodextrinas.

La Figura 1 presenta un espectro de masas MALDI-TOF normalmente obtenido según el procedimiento descrito anteriormente.

La Figura 1 muestra que los oligosacáridos aislados son en su mayor parte de DP 5-7.

2- Reducción de celodextrinas

Se añaden 400 mg de borohidruro de sodio a 2 g de celodextrinas DP 3-11 diluidas en 120 ml de agua. Después de 3 horas de agitación a temperatura ambiente, la solución se neutraliza por adición de resina Amberlite H+ IR 120, se filtra, y luego se liofiliza, para dar lugar a 2 g de celodextrinas reducidas de manera cuantitativa. (C. Schou, G. Rasmussen, M-B. Kaltoft, B. Henrissat, M. Schulein Eur. J. Biochem. 217, 947-953 (1993)).

Un análisis con BCA (ácido bicinconínico) de las celodextrinas aisladas permite verificar la reducción total de los extremos (Y.-H. Percival Zhang, L. R. Lynd Biomacromolecules 2005, 6, 1510-1515).

EJEMPLO 2: evolución por transposición en L

La secuencia del gen de la celobiohidrolasa 1 (cbhl, SEQ ID NO: 1) de Trichoderma reesei se sometió a un giro de transposición en L según el procedimiento patentado descrito en la patente EP1104457 con los genes de una celobiohidrolasa de Talaromyces stipitatus ATCC 10500 (TS, SEQ ID NO: 23) y de una celobiohidrolasa de Neosartorya fischeri NRRL 181 (NF, SEQ ID NO: 21) que presentan respectivamente 62 % y 61 % de homología con el gen parental cbhl.

1- Cribado de alto rendimiento

Se desarrolló una prueba de cribado de alto rendimiento a fin de seleccionar los mejores clones procedentes de la transposición en L, es decir, aquellos que presentan al menos un 20 % de mejora de la actividad celobiohidrolasa con respecto a la enzima de referencia cbhl (SEQ ID NO: 2).

La prueba de cribado de alto rendimiento se realizó según las siguientes etapas:

- aislamiento en agar de clones de Y. lipolytica que expresan las variantes de la transposición en L de la enzima según la invención y precultivados en medio YNB casa base de nitrógeno y levadura 1,7 g/l, NH4Cl 10 g/l, glucosa 10 g/l, casaminoácidos 2 g/l, pH7) de dichas colonias durante 36 horas a 28 °C;

- inoculación de un medio YTD (extracto de levadura 10 g/l, triptona 20 g/l, glucosa 2,5 g/l, pH 6,8) con tetraciclina añadida a 12,5 pg/ml al 5 % con el precultivo y luego incubación durante 20 horas a 28 °C;

- inoculación del medio de expresión que contiene el inductor (ácido oleico) a razón de 20 g/l al 10 % con el cultivo precedente y luego incubación durante 96 horas a 28 °C;

- centrifugación durante 5 minutos a 1500 rpm;

- extracción de 100 pl de sobrenadante;

- adición de 100 pl de CD reducidas a 1 g/l en tampón citrato fosfato 0,1 M a pH 6;

- incubación durante 17 horas a 50 °C;

- centrifugación durante 5 minutos a 2500 rpm;

- extracción de 80 pl de sobrenadante;

- adición de 80 pl de reactivo DNS;

- incubación durante 12 minutos a 105 °C y luego 5 minutos en hielo;

- lectura de la densidad óptica (DO) a 540 nm en 120 pl.

En estas condiciones de cribado, se ha descubierto una mejora de la actividad celobiohidrolasa (aumento de la DO a 540 nm) con respecto a la enzima de referencia cbhl (SEQ ID NO: 2) en varios clones, que incluyen concreto los clones 32F9, 64C2, 130G9, 224C11,225B11 y 453E8 (respectivamente SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 y 16).

2- Determinación de la mejora de la actividad celobiohidrolasa

2-1/ Sobre el sustrato celodextrinas reducidas

A fin de estimar la kcat relativa a las variantes seleccionadas en el primer giro de transposición en L con respecto a la enzima de referencia cbhl (SEQ ID NO: 2), se procede de la siguiente manera:

- preparación de un cultivo madre de Y. lipolytica que expresa una enzima recombinante según la invención durante toda la noche a 28 °C;

- siembra de un medio de expresión con un volumen de cultivo madre que permite tener una DO a 600 nm igual a 0,2 al inicio del cultivo;

- cultivo de dichas células a 28 °C durante 96 horas;

- centrifugación a 8000 rpm durante 5 minutos;

- incubación de 100 pl de sobrenadante con 100 pl de tampón citrato fosfato 0,1 M pH 6 que contiene 1 % de CD reducidas durante 24 horas a 35 °C y 50 °C;

- extracción de 100 pl de reacción;

- adición de 100 pl de reactivo DNS;

- incubación durante 5 minutos a 100 °C;

- incubación durante 3 minutos en hielo;

- centrifugación durante 10 minutos a 3000 rpm;

- lectura de la DO a 540 nm en 150 pl.

Según la invención, el cálculo de las kcat se realiza de la siguiente manera:

- trazado de la curva de las DO a 540 nm en función de la cantidad de proteína de interés (en nM);

- resta del valor del control negativo;

- división por el coeficiente director del intervalo patrón de glucosa (se revelan diferentes cantidades de glucosa con el DNS);

- división por el tiempo de reacción (1440 minutos).

La TABLA 2 presenta el valor de las kcat así como el factor de mejora obtenidos para los clones 32F9, 64C2, 130G9, 224C11, 225B11 y 453E8 (respectivamente SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 y 16) con respecto a la proteína de referencia cbhl (SEQ ID NO: 2) en estas condiciones experimentales.

TABLA 2 m r l i i l i hi r l r D r i

A 35 °C, el factor de mejora con respecto a la enzima de referencia cbhl (SEQ ID NO: 2) no puede ser calculado ya que, en estas condiciones experimentales, la actividad de cbhl no es medible. La actividad enzimática de los clones 32F9, 64C2, 224C11, 225B11 y 453E8 es mejorada a 35 °C y 50 °C con respecto a la actividad enzimática de la enzima de referencia cbhl (SEQ ID NO: 2). La actividad enzimática de la enzima 130G9 (SEQ ID NO:8) es mejorada a 35 °C con respecto a la actividad enzimática de la enzima de referencia cbhl (SEQ ID NO: 2).

2-2/ Sobre el sustrato Avicel

La mejora de actividad de los clones 32F9, 64C2, 130G9, 224C11, 225B11 y 453E8 (respectivamente SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 y 16) se midió a continuación con un segundo sustrato: Avicel.

La actividad de estos clones se determinó midiendo la DO a 540 nm en un criterio de valoración según el protocolo descrito anteriormente. El sustrato celodextrinas reducidas se reemplaza con el sustrato Avicel con la misma concentración. La prueba de actividad se realiza con 100 pl de sobrenadante de cultivo que contiene la proteína de interés durante 48 horas.

La tabla 3 presenta el valor de las DO a 540 nm después de restar el valor de DO obtenido con el control negativo, así como el factor de mejora de los clones 32F9, 64C2, 130G9, 224C11, 225B11 y 453E8 (respectivamente SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 y 16) con respecto a la enzima de referencia cbhl (SEQ ID NO: 2) en estas condiciones experimentales.

TABLA m r l i i l i hi r l r A i l

Estos resultados muestran una mejora de la actividad enzimática con respecto a la enzima de referencia cbhl (SEQ ID NO: 2) para los clones 32F9, 130G9 y 453E8 (respectivamente SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 16) a 35 °C y 50 °C.

EJEMPLO 3: evolución por recombinación

Los genes 32F9, 130G9 y 453E8 (respectivamente SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 15) se seleccionaron ya que las enzimas que los codifican son mejoradas sobre CD reducidas y Avicel. Se seleccionó el gen 242D11 (SEQ ID NO: 13) ya que su secuencia difiere de la de los clones 32F9, 130G9 y 453E8 y permite así mejorar la diversidad de secuencias. Los genes 32F9, 130G9 y 453E8 y 242D11 se recombinaron para generar nuevos mutantes. La actividad de los mutantes obtenidos se evaluó en primer lugar con el sustrato CD reducidas según el protocolo descrito en el párrafo 2-1 del ejemplo 2.

1- Determinación de la mejora de la actividad celobiohidrolasa

1-1/ Sobre el sustrato celodextrinas reducidas

El mutante B (SEQ ID NO: 18) tiene una actividad celobiohidrolasa mejorada (aumento de la DO a 540 nm) con respecto a la variante 453E8 (SEQ ID NO: 16). La variante 453E8 es la mejor variante resultante de la evolución por transposición en L.

La tabla 4 presenta el valor de las kcat así como el factor de mejora obtenidos para el clon B con respecto a la proteína 453E8 (s Eq ID NO: 16) en estas condiciones experimentales. Las kcat se calculan según el protocolo descrito en el párrafo 2-1 del ejemplo 2.

TABLA 4 m r l i i l i hi r l r l x rin r i

Los resultados muestran una mejora de la actividad enzimática con respecto a la enzima de referencia (SEQ ID NO: 16) para el clon B (SEQ ID NO:18) a 35 °C.

1-2/ Sobre el sustrato Avicel

A continuación, se confirmó la mejora de actividad del clon B con un segundo sustrato: Avicel.

La actividad de estos clones se determinó midiendo la DO a 540 nm en un criterio de valoración según el protocolo descrito en el párrafo 2-2 del ejemplo 2.

La tabla 5 presenta el valor de las kcat así como el factor de mejora obtenidos para el clon B con respecto a la proteína de referencia 453E8 (SEQ ID NO: 16) en estas condiciones experimentales.

TABLA m r l i i l i hi r l r A i l

Estos resultados muestran una mejora de la actividad enzimática con respecto a la enzima 453E8 (SEQ ID NO: 16) para el clon B (SEQ ID NO:18) a 35 °C.

EJEMPLO 4: evolución por Evosight

A fin de mejorar la actividad celobiohidrolasa, se aplicó la estrategia Evosight (solicitud de patente WO2006/003298) al mutante 453E8 (SEQ ID NO: 15), la mejor variante resultante de la transposición en L.

1- Cribado de alto rendimiento

La prueba de cribado de alto rendimiento utilizada para seleccionar los mejores clones, es decir, aquellos que presentan al menos un 20 % de mejora de la actividad celobiohidrolasa con respecto a la enzima 453E8 (SEQ ID NO: 16), es la misma que la descrita en el párrafo 1 del ejemplo 2. Las variantes generadas por Evosight se comparan con el clon 453E8 (SEQ ID NO: 16) ya que es el mejor clon resultante de la transposición en L.

En estas condiciones de cribado, se ha descubierto una mejora de la actividad celobiohidrolasa (aumento de la DO a 540 nm) con respecto a la enzima 453E8 (SEQ ID NO: 16) en varios clones, incluyendo en concreto el clon 91D9 (SEQ ID NO: 20).

2- Determinación de la mejora de la actividad celobiohidrolasa

2-1/ Sobre el sustrato celodextrinas reducidas

El protocolo utilizado para determinar la kcat relativa del clon 91D9 (SEQ ID NO: 20) con respecto a la enzima 453E8 (s Eq ID NO: 16) es idéntico al descrito en el párrafo 2-1 del ejemplo 1.

La tabla 6 presenta el valor de las kcat así como el factor de mejora obtenidos para el clon 91D9 con respecto a la enzima 453E8 (SEQ ID NO: 16) en estas condiciones experimentales.

TABLA m r ^ l i i l i hi r l r l x rin r i

Estos resultados muestran una mejora de la actividad enzimática con respecto a la enzima 453E8 (SEQ ID NO: 16) para el clon 91D9 (SEQ ID NO: 20) a 35 °C y 50 °C.

2-2/ Sobre el sustrato Avicel

A continuación, se confirmó la mejora de actividad del clon 91D9 con un segundo sustrato: Avicel.

La actividad de este clon se determinó midiendo la DO a 540 nm en un criterio de valoración según el protocolo descrito en el párrafo 2-2 del ejemplo 2.

La tabla 7 presenta el valor de las kcat así como el factor de mejora obtenidos para el clon 91D9 con respecto a la proteína 453E8 (SEQ ID NO: 16) en estas condiciones experimentales.

TABLA m r l i i l i hi r l r A i l

Estos resultados muestran una mejora de la actividad enzimática con respecto a la enzima 453E8 (SEQ ID NO: 16) para la enzima 91D9 (SEQ ID NO: 20) a 35 °C.

EJEMPLO 5: Clonación de variantes 130G9 y 453E8 de la exoglucanasa 1 en la cepa T. reesei CL847 ACBH1

Las variantes 130G9 y 453E8 son clones procedentes de la transposición en L. Cada variante se clonó en una cepa T. reesei CL847 ACBH1.

Las secuencias codificantes de las variantes 130G9 y 453E8 se amplificaron por PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos:

- Dir: TCCATCctcgagatgtatcggaagttggccgtc (SEQ ID NO: 25)

- Inv: TCCATCctcgagttacaggcactgagagtagtaag (SEQ ID NO: 26)

Los fragmentos obtenidos se digirieron con Xhol y luego se clonaron en un vector de expresión entre el promotor y el terminador cbhl, según los métodos conocidos por los expertos en la materia (Wang et., 2012, Microb Cell Fact. 18 de junio de 2012;11:84. doi: 10.1186/1475-2859-11-84). El marcador de selección del vector es la fleomicina (Calmels et al., 2011, Curr Genet. septiembre de 1991;20(4):309-14).

La cepa utilizada para la construcción es una cepa CL847 (Durand et al., 1988, Enz. Microb Technol, 10, 341-346) cuyo gen CBH1 ha sido previamente eliminado según un método conocido por los expertos en la materia (Suominen et al., MGG, 1993, 241; 523-530) para dar la cepa CL847ACBH1. Los protoplastos de la cepa de T. reesei CL847ACBH1 se transformaron según un método convencional conocido por los expertos en la materia, por choque cálcico y PEG, con 5 |jg del fragmento de ADN que contiene las secuencias que codifican las variantes 130G9 o 453E8. Los clones así obtenidos se seleccionaron en medio selectivo de PDA/sacarosa que contenía 50 jg/m l de fleomicina. El número de clones obtenidos después de la purificación y aislamiento se presenta en la Tabla 8.

TABLA 8: Selección de los clones ue han inte rado la variante de interés

La actividad de los clones puros aislados se criba en placas de celulosa acoplada a un análisis del secretoma en gel 2D.

El medio de cribado, denominado "Celulosa Walseth" se prepara de la siguiente manera:

- 250 ml/l de medio "4N" (KOH 3,32 g/l, H^a PO4 85 % 5 ml/l, (NH⁴)²SO⁴ 5,6 g/l, MgSO⁴ ,7H²O 1,2 g/l, CaC^b ,2H²O 1,2 g/l, Na²HPO⁴ ,12H²O: 0,23 g/l, pH ajustado a 1,5 con H²SO⁴);

- 1 ml/l de una solución de oligoelementos (FeSO⁴ ,7H²O 30 g/l, Co(NO³)² ,6H²O 9 g/l, MnSO⁴ ,1H²O 6,4 g/l, ZnSO⁴ ,7H²O 8,4 g/l, ácido bórico 0,4 g/l, Molibdato de sodio 1,04 g/l, pH ajustado a 1,5 con H³PO⁴);

- 2 g/l de peptona;

- 20 g/l de agar;

- 50 g/l de celulosa al 8 % preparada según el método de Walseth (Walseth, 1952, Tappi, 225; 228-232).

El conjunto se homogeneiza utilizando un homogeneizador (Ultra Turrax, Ika, Alemania) durante 5 minutos. El pH se ajusta a 6,0 con una solución de KOH 3 M. El medio obtenido se esteriliza en autoclave a 110 °C durante 30 minutos. Cuando la temperatura del medio es de 50 °C, la fleomicina se añade a razón de 50 jg/ml. A continuación, el medio se transfiere a las placas de Petri a razón de 20 ml/placa. La solidificación se supervisa hasta la cura completa del agar sobre el que se coloca un disco de plexiglás perforado: se crean así 24 pocillos por placa.

La etapa de cribado se realiza depositando extractos de agar que portan clones aislados al final de la transformación en los pocillos de las placas de Petri Walseth (1 clon puro aislado/pocillo). Este sistema permite obtener halos de hidrólisis enzimática puesto que el micelio permanece confinado en el pocillo mientras que las enzimas celulolíticas secretadas se distribuyen en el agar. Las placas se incuban a 30 °C durante 7 días después de los cuales se realiza una evaluación visual de los halos por diferencia de color entre el agar opaco y las zonas hidrolizadas transparentes.

La Figura 2 ilustra esta técnica y su poder discriminante mostrando clones de interés identificados por comparación con las dos cepas de control: la cepa CL847ACBH1 (expresada AC1 en la placa) y la cepa CL847 no delecionada del gen de referencia cbhl (SEQ ID n O: 1).

Así, se descarta cualquier clon aislado cuyo halo es inferior al de CL847ACBH1 mientras que se conservan aquellos cuyo halo sea al menos superior al de CL847ACBH1.

Siguiendo este procedimiento para el conjunto de los clones obtenidos, los clones n.° 6 y n.° 20 resultantes de la transformación de la cepa CL847ACBH1 por la secuencia que codifica el gen 130G9 (SEQ ID NO: 7) y el clon aislado n.° 24 resultante de la transformación de la cepa CL847ACBH1 por la secuencia que codifica el gen 453E8 (SEQ ID NO: 15) se seleccionaron y conservaron así.

A fin de confirmar esta elección, los tres clones aislados seleccionados se cultivaron durante 7 días a 30 °C y con agitación a 150 rpm en medio líquido de la siguiente composición:

3,48 g de K²HPO⁴, 1,68 g de (NH⁴)²SO⁴ , 0,12 g de MgSO⁴ , 0,6 g de maíz fermentado, 1 ml de solución de oligoelementos (30 g/l de FeSO⁴ ,7H2O, 9 g/l de Co(NO^a )²,6H²O, 6,4 g/l de MnSO⁴ ,1H²O, 8,4 g/l de ZnSO⁴ ,7H²O, 0,4 g/l de ácido bórico, 1,04 g/l de molibdato de sodio, pH ajustado a 1,5 con H³PO⁴), 4,64 g de ácido maleico, 4 g de lactosa, 4 g de celulosa Solka Floc (Nutrafiber, EE. UU.) para 1 l de medio. El conjunto se homogeneiza utilizando un Ultrathurax durante 5 minutos. El pH se ajusta a 6,0 con una solución de KOH 3 M. El medio obtenido se esteriliza en autoclave a 110 °C durante 30 minutos. La fleomicina se añade a razón de 50 pg/ml cuando el medio está a temperatura ambiente.

Se lleva a cabo un análisis de concentración proteica del medio extracelular utilizando un kit colorimétrico DC Protein Assay (BioRad, California, Estados Unidos) a partir de un intervalo patrón de albúmina de suero bovino (ASB). A continuación, los sobrenadantes son objeto de una electroforesis bidimensional tal como se describe por Herpoél-Gimbert et al. (Biotechnol Biofuels. 23 de diciembre de 2008; 1(1):18. doi: 10.1186/1754-6834-1-18), utilizando tiras de 7 cm pH 4,0-7,0.

Se comparan los perfiles proteicos obtenidos para los clones n.° 6 y n.° 20 de la variante 130G9 (SEQ ID NO: 8) y para el clon n.° 24 de la variante 453E8 (SEQ ID NO: 16) con los de las cepas de referencia CL847 y CL847ACBH1 (Figura 3 y Figura 4).

Los resultados presentados en la Figura 3 y en la Figura 4 muestran que la intensidad de las manchas, que corresponden a las proteínas del secretoma, es similar en cada cepa. Esto permite verificar que la expresión de estas proteínas se conserva independientemente de la cepa. La banda indicada por las flechas permite confirmar la presencia de CBH1 en estas cepas, por comparación con la cepa que había servido para las transformaciones CL847ACBH1.

Los clones seleccionados al final de estas etapas de cribado se denominan "cepas" en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 6: Producción de cócteles de enzimas

Las cepas n.° 6 y n.° 20 que han integrado la variante 130G9 (SEQ ID NO: 8) y la cepa n.° 24 que ha integrado la variante 453E8 (SEQ ID NO: 16) construidas en el ejemplo 5 fueron objeto de producciones de enzimas según el protocolo miniaturizado descrito en la solicitud de patente FR2989385 y Jourdier et al. (Microb Cell Fact. 30 de mayo de 2012;11:70. doi: 10.1186/1475-2859-11-70). El conjunto de proteínas secretadas por una cepa dada constituye su cóctel.

La producción de proteínas por las cepas de T. reesei se lleva a cabo en dos fases: una primera fase de proceso discontinuo para la producción de la biomasa y una segunda fase de proceso semicontinuo para la producción de proteínas.

La producción se realiza según el siguiente protocolo:

- En los frascos de 250 ml, 55 ml de medio F45 (10 g/l de tampón ftalato dipotásico pH 6, 4,2 g/l de (NH4)2SO⁴ , 300 mg/l de MgSO⁴.7H²O, 150 mg/l de CaCb.2H²O, 1,5 g/l de maíz fermentado, 0,07 % de ácido ortofosfórico, 5 mg/l de FeSO⁴ , 1,4 mg/l de MnSO⁴ , 1,4 mg/l de ZnSO⁴ , 3,7 mg/l de CoC^b y 12,5 g/l de glucosa) se siembran con esporas de las cepas respectivas y se agitan a 150 rpm y 30 °C.

- Las muestras se realizan cada 24 horas para determinar el pH y la concentración de glucosa.

Tan pronto como la concentración de glucosa sea inferior a 3 g/l, la fase de proceso semicontinuo se inicia mediante la adición de una solución de lactosa 50 g/l y de NH³ 0,3 % a un caudal de 40 mg de azúcar/g de biomasa por hora. Se realizan muestras diarias para determinar el pH, el peso seco y la concentración de proteínas en el sobrenadante. Después de 5 días de cultivo semicontinuo, el cultivo se filtra a través de un filtro de 0,45 pm y el sobrenadante se congela después de medir la concentración de proteínas. Esto se midió por el método de Lowry utilizando ASB para realizar el intervalo patrón.

Las concentraciones de proteínas de los sobrenadantes obtenidos para las cepas 453E8-24, 130G9-6, 130G9-20 así como la cepa CL847 de referencia se presentan en la Tabla 9.

Tabla ^ cu ltivo

Ejemplo 7: Eficacia de las enzimas resultantes de la transposición en L en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica según un procedimiento HFS

El sustrato de referencia utilizado es una paja de trigo que ha sido sometida a un pretratamiento por explosión de vapor (19 bars - 3 minutos). La biomasa sufre la explosión después de la impregnación ácida al 0,01 % de H2SO4 durante 10 horas. Luego se lava, se ajusta a pH 5, se prensa y se seca. Las características de la paja se presentan en la Tabla 10.

Tabla 1 m i i n l iliz r l n hidrólisis

Las hidrólisis se llevaron a cabo al 10 % de materia seca m/m o en un equivalente al 5,4 % de celulosa m/m. La tasa de WIS (SIA) (Water Insoluble Solids, sólidos insolubles en agua) se determina sistemáticamente antes de cada serie de microhidrólisis. El valor SIA de referencia es del 93,7 %. El contenido de materia seca lignocelulósica de los ensayos se fijó al 10 %, es decir -5,4 % de celulosa.

La tasa de proteínas se fija a 10 mg/g de MS, es decir, aproximadamente 19 mg/g de celulosa. Los cócteles enzimáticos se suplementaron con actividad p-glucosidasa con un máximo de 120 ± 2 Ul/g de celulosa, mediante la adición de p-glucosidasa SP188 (Novozymes, Dinamarca). Esta adición de p-glucosidasa permite limitar la inhibición de las celobiohidrolasas por la celobiosa.

Los ensayos se llevan a cabo en tubos Eppendorf de 2 ml útiles (1 g de reacción) que contienen:

- 0,11 ± 0,001 g de sustrato de paja lavada;

- 0,9 ± 0,02 ml de medio de reacción de hidrólisis compuesto de tampón acetato 50 mM - pH 4,8 y cloranfenicol (0,05 g/l);

- entre 0,1 y 0,2 ± 0,02 g de cóctel enzimático en función de su tasa de proteínas;

Las hidrólisis enzimáticas realizan a 45 ± 2 °C bajo agitación tipo vórtex a 900 rotaciones por minuto en un Thermomixer Comfort Eppendorf.

Todos los ensayos se llevan a cabo por duplicado con tiempos de muestreo fijados a las 24, 48 y 96 horas, con algunos muestreos a las 72 horas.

En cada tiempo de muestreo, los hidrolizados se escaldan durante 5 minutos en los tubos Eppendorf sacrificados. Estos tubos se enfrían y centrifugan a continuación. El análisis de glucosa se lleva a cabo por HPLC. Paralelamente, los residuos sólidos de cada tubo Eppendorf se lavan y se centrifugan 3 veces antes de secarse a 105 °C durante 24 horas para evaluar los SIA. El cálculo del rendimiento de hidrólisis se lleva a cabo teniendo en cuenta la cantidad de SIA en la paja utilizada en los ensayos de hidrólisis.

Se evaluaron los tres cócteles procedentes de las cepas recombinantes 130G9-6, 130G9-20 y 453E8-24 del ejemplo 6. Se lleva a cabo una prueba de control con el cóctel de referencia CL847 que consta de la enzima CBH1 nativa también suplementada con p-glucosidasa para comparación.

La Figura 5 presenta los resultados de hidrólisis para el cóctel 453E8-24 que comprende la enzima 453E8 (SED ID NO: 16).

Los resultados presentados en la Figura 5 muestran que la velocidad inicial de hidrólisis del cóctel 453E8-24 es cercana a la del cóctel de referencia CL847. El rendimiento final de la hidrólisis del cóctel 453E8-24 es superior al del cóctel de referencia CL847.

La Figura 6 presenta los resultados de hidrólisis para los 2 cócteles 130G9-6 y 130G9-20 procedentes de las cepas que expresan la enzima 130G9 (SEQ ID NO: 8).

Los resultados presentados en la Figura 6 muestran para los dos cócteles 130G9-6 y 130G9-20 que la velocidad inicial de hidrólisis es superior a la velocidad de hidrólisis del cóctel de referencia CL847 durante las 20 primeras horas de reacción. El rendimiento final de la hidrólisis de los dos cócteles 130G9-6 y 130G9-20 también es superior al del cóctel de referencia CL847.

Ejemplo 8: Eficacia de las enzimas en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica según un procedimiento SFS

El sustrato utilizado es el mismo que el descrito en la tabla 10 del ejemplo 7.

Las SFS se realizan por triplicado en reactores de laboratorio. Estos reactores están constituidos por los siguientes elementos:

- un frasco de vidrio de 30 ml de volumen útil;

- un tapón de seguridad de poliéter éter cetona (Peek);

- una válvula unidireccional DV-118 (Vaplock, Estados Unidos) fijada a través del tapón. La válvula está configurada para abrirse cuando la presión relativa en el frasco es superior a 70 mbar;

- un primer tubo hueco de polipropileno, cuyo extremo inferior está equipado de un tabique. Este tubo se une a través de un segundo tubo que pasa por el tapón de seguridad;

- una junta plana dispuesta entre el cuello del frasco y el tapón de seguridad.

El principio de implementación de los biorreactores es el siguiente: el CO² producido durante la fermentación etanólica se acumula en el cielo situado por encima del medio de reacción que causa por acumulación un aumento de la presión en el biorreactor (P^g ). Cuando P^g es superior a la presión de abertura de la válvula unidireccional (P^s), la válvula se abre para liberar una cantidad de gas que por ejemplo se determina por pesaje. Cuando P^g < P^s , la válvula se cierra hasta que P^g sea superior a P^s. De este modo, el biorreactor en funcionamiento está siempre bajo presión para garantizar un medio anaeróbico estable para la fermentación. La cantidad de etanol producida se evalúa mediante la producción de CO² estimada por pérdida de peso a partir de la siguiente ecuación estequiométrica de fermentación de glucosa en etanol:

C6H12O6 (glucosa) ^ 2 CO2 2 CH3CH2OH (etanol) energía

El medio de cultivo utilizado para la SFS es un medio acuoso que comprende:

- un tampón acetato 50 mM para pH 5;

- cloranfenicol con 0,1 g/l;

- medio nutritivo con 3 g/l de KH²PO⁴ , 2 g/l de (NH⁴)²SO⁴ , 0,4 g/l de MgSO⁴ ,7H²O y 1 g/l de extracto de levadura.

Las SFS se realizaron con 10 ± 0,01 % m/m de materia seca o bien un equivalente de 5,4 % de celulosa m/m para una masa de reacción total de 15 ± 0,003 g. La tasa de proteínas se fija en 10 ± 0,01 mg de celulasas por gramo de materia seca, o bien aproximadamente 19 mg/g de celulosa. Los cócteles enzimáticos se suplementaron con actividad p-glucosidasa con un máximo de 120 ± 2 Ul/g de celulosa, mediante la adición de p-glucosidasa SP188 (Novozymes, Dinamarca).

La levadura de fermentación de azúcares (Saccharomyces cerevisiae, cepa de etanol rojo, Fermentis, Francia) se añade al medio para obtener un contenido de 2 ± 0,1 g/kg.

Las enzimas y la levadura se añaden a los biorreactores después de una hora de acondicionamiento de la paja de trigo pretratada a 35 °C con el medio de cultivo.

La reacción de SFS se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 35 °C, colocando el biorreactor de laboratorio en una incubadora de tipo INFORS Multitron HT Standard con una velocidad de rotación orbital de 150 revoluciones por minuto.

A lo largo del tiempo, se siguió la pérdida de masa por pesaje de los biorreactores. Al finalizar la reacción, el mosto de fermentación se calienta a 100 °C durante 5 minutos, se enfría y se centrifuga para separar las materias sólidas no hidrolizadas del zumo de fermentación. A continuación, el zumo de fermentación se analiza mediante cromatografía en fase gaseosa a fin de determinar su concentración de etanol.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido aislado o purificado caracterizado por que tiene una actividad exoglucanasa mejorada de al menos 10 % a una temperatura de aproximadamente 35 °C, y opcionalmente de al menos 10 % a una temperatura de aproximadamente 50 °C, con respecto a la actividad exoglucanasa de la proteína de referencia CBH1 de secuencia SEQ ID NO: 2 sobre un sustrato seleccionado entre celulosa Avicel, celulosa PASC, un sustrato celodextrinas reducidas o un sustrato cromogénico tal como pNP lactósido, siendo dicho polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i. una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20, y

ii. una secuencia de aminoácidos que presenta, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20, un porcentaje de identidad de al menos 99 %.

2. Ácido nucleico purificado o aislado, caracterizado por que codifica al menos un polipéptido según la reivindicación 1.

3. Ácido nucleico purificado o aislado según la reivindicación 2 seleccionado entre las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 19.

4. Vector caracterizado por que comprende al menos un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 2 o 3.

5. Célula hospedadora aislada caracterizada por que comprende al menos un polipéptido según la reivindicación 1, o al menos un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 2 o 3, o al menos un vector según la reivindicación 4.

6. Célula hospedadora según la reivindicación 5, caracterizada por que se selecciona entre Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Pénicillium, Fusarium, Thermomonospora, Myceliophthora, Chrysosporium, Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Clostridium, Cellulomonas, Streptomyces, Yarrowia, Pichia y Saccharomyces.

7. Célula hospedadora aislada según una de las reivindicaciones 5 o 6, caracterizada por que se selecciona entre Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisae, Myceliophthora thermopila, Chrysosporium lucknowense, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Escherichia coli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium benjerinckii, Clostridium butylicum, Pichia pastoris, Yarrowia lipolityca y Saccharomyces cerevisiae.

8. Uso de dicho polipéptido según la reivindicación 1 para la hidrólisis de la celulosa.

9. Uso de dicho polipéptido según la reivindicación 1 para la producción de biocarburante.

10. Composición enzimática apta para actuar sobre la biomasa lignocelulósica, siendo dicha composición enzimática producida por hongos filamentosos y que comprende al menos un polipéptido según la reivindicación 1.

11. Procedimiento de producción de biocarburante a partir de biomasa lignocelulósica, caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:

- se pone en suspensión en fase acuosa la biomasa a hidrolizar;

- se hidroliza en presencia de una composición enzimática según la reivindicación 10 la biomasa lignocelulósica para producir un hidrolizado que contiene glucosa;

- se fermenta la glucosa del hidrolizado para producir un mosto de fermentación;

- se separa el biocarburante del mosto de fermentación.

12. Procedimiento de producción de biocarburante a partir de la biomasa, caracterizado por que comprende las siguientes etapas sucesivas:

- se pone en suspensión en fase acuosa la biomasa a hidrolizar;

- se añade simultáneamente una composición enzimática según la reivindicación 10 y un organismo fermentativo en la suspensión y la mezcla se fermenta para producir un mosto de fermentación;

- se separa el biocarburante del mosto de fermentación.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 o 12, en donde el organismo fermentativo es una célula hospedadora según una de las reivindicaciones 5 a 7.