MX2011002142A

MX2011002142A - Beta-glucosidasas modificadas con estabilidad mejorada.

Info

Publication number: MX2011002142A
Application number: MX2011002142A
Authority: MX
Inventors: Christopher Hill; John Tomashek; James Lavigne; Martine Whissel
Original assignee: Iogen Energy Corp
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-04-26
Also published as: AU2009287325A1; EP2329016A4; EP2329016A1; CA2735271A1; BRPI0918823A2; US8143049B2; CN102482656A; WO2010022518A1; US20100093040A1

Abstract

Se proporcionan enzimas de beta-glucosidasa modificadas, derivadas de la beta-glucosidasa de Trichoderma reesei Ce13A, que exhiben estabilidad mejorada a bajo pH, bajo ph y alta aireación, bajo ph y alta agitación, o bajo pH y temperatura elevada. También se proporcionan estructuras genéticas que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican para las enzimas de beta-glucosidasa modificadas, los métodos para la producción de las enzimas de beta-glucosidasa modificadas a partir de cepas hospederas y el uso de las enzimas de beta-glucosidasa modificadas en la hidrólisis de celulosa.

Description

BETA-GLUCOSIDASAS MODIFICADAS CON ESTABILIDAD MEJORADA CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con una beta-glucosidasa de Trichoderma reesei modificada. Más específicamente, la invención se relaciona con una beta-glucosidasa de Trichoderma reesei modificada con estabilidad mejorada. La presente invención también se relaciona con un constructo genético que comprender secuencias de nuci.eótidos que codifican para una beta-glucosidasa modificada, los métodos para la producción de una beta-glucosidasa modificada a partir de cepas hospederas y el uso de una beta-glucosidasa modificada en la hidrólisis de celulosa y en la producción de compuestos tales como aquellos utilizados en las industrias médicas o de alimentos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las beta-glucosidasas comprenden miembros de las familias 1 y 3 de glucosil hidrolasa cuya función enzimática primaria es la hidrólisis de los enlaces beta-glucosídicos que enlazan los residuos de carbohidratos en celooiosa o celodextrinas solubles. Algunas beta-glucosidasas son específicas para celobiosa o arilglucósidos, la mayoría de los mismos caracterizados porque tienen amplia especificidad y pueden hidrolizar una amplia gama de sustratos (Bhatía et al., 2002). Bajo ciertas condiciones, estas enzimas también pueden catalizar la síntesis de los enlaces glucosi|dicos a través de la reacción inversa o a través de la transglucosilación (Sinnott, 1990) . Las capacidadels tanto hidroliticas como sintéticas de esta clase de enzima se pueden emplear en aplicaciones biotecnológicas .

Una aplicación principal de la actividad hidrolítica de la beta-glucosidasa es el alivio de la inhibición de productos de los sistemas de celulasa. La celobiosa, un producto principal de la hidrólisis de celulosa, inhibe en gran medida la actividad de las celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91). La inclusión de suficiente beta-glucosidasa para hidrolizar la celobiosa a glucosa, que es menos inhibidora, da por resultado en ganancias significativas en la actividad a grados superiores de la conversión de sustrato (US 6,015,703).

Se han revisado por Bhatia et al., (2002) muchas otras aplicaciones biotecnológicas de la beta-glucosidasa. Los ejemplos de aplicación que dependen de su actividad hidrolítica incluyen la liberación de compuestos médicamente importantes a partir de glucósidos de flavanpide e isoflavanoide y la liberación de compuestos aromáticos en jugos de frutas y vinos (US 6,087,131). Un uso representativo de la actividad sintética es la producción de alquil-glucósidos para utilizarse como un detergente | (Ducret et al. , 2002) .

La actividad de las glucosil hidrolasas, entre las que se incluyen las beta-glucosidasas, depende de los estados específicos de protonación de los aminoácidos catalíticos (glutamato o aspartato) en el sitio activo de la enzima, que se influyen por el pH. Por ejemplo, la beta-glucosidasa I proveniente de Trichoderma reesei es más activa en la variación de pH 5.0-5.5 y disminuye dramáticamente bajo condiciones más ácidas o básicas (Woodward and Arnold, 1981).

Las dependencias en el pH de la actividad y estabilidad de una proteína no necesariamente se relacionan. Los efectos de desestabilización de las condiciones ácidas o alcalinas resultan de la protonación o desprotonación de las cadenas laterales de aminoácidos que pueden no ser catalíticas o incluso estar en proximidad cercana al sitio activo. La desnaturalización dependiente del pH principalmente resulta de los valores pKa diferentes de las cadenas laterales de aminoácidos específicos en estados naturales y desnaturalizados, lo cual introduce la dependencia en el pH a la diferencia de energía libres entre estados. Adicionalmente , las proteínas se pueden | tornar bastante cargadas a los extremos de pH y experimentar una repulsión electrostática intramolecular aumentada (Fersht, 1998) .

Una enzima manipulada por ingeniería con un pH alterado óptimo no necesariamente será estable a un nuevo pH durante periodos prolongados. Diversas glucósido hidrolasas han experimentado mutagénesis para alterar su actividad o estabilidad a valores de pH importantes para aplicaciones industriales. Para una aplicación en procesamiento de almidones, se manipuló por ingeniería una alfa amilasa proveniente de Bacillus licheniformis para incluir dos reemplazos de aminoácidos, M15T y N188S, que aumentaron su actividad a bajo pH (5.2) a 140% del tipo silvestre (patente de los Estados Unidos No. 5,958,739). La adición de una tercera mutación, H133Y, aumentó adicionalmente la actividad a más del 150% del mutante doble. El reemplazo de un asa en una Bacillus endoglucanasa, identificada con un procedimiento de diseño racional, varió su pH óptimo para una aplicación en textiles. Con un reemplazo Ala-Gly-Ala, el pH óptimo se varió hasta más de la unidad 1 pH (publicación de los Estados Unidos No. 2005/0287656) . Un ejemplo adicional es la incorporación de los reemplazos de aminoácidos A162P y W62E en la endoglucanasa Cel45 a partir de Humicola insolens. Estas mutaciones aumentaron la actividad a condiciones alcalinas (pH 10) al 124-144% de la del tipo silvestre (patente de los Estados Unidos No. 5,792,641). Como un ejemplo final, la actividad de una xilanasa de Trichoderma recombinante a pH superior a 5.5 mejoró significativamente mediante la incorporación de diversas combinaciones de los reemplazos N10H, N11D, Y27M, y N29L (US 5,866,408).

Existen unos cuantos reportes de las beta-glucosidasas a pesar de la mutagénesís para modular las propiedades de estas enzimas. Por ejemplo, la termoestabilidad de un mutante cuádruple A16T/G142S/H226Q/D703G de una beta-glucosidasa de Aspérgillus se aumentó de tal forma que conservara -50% de su actividad después de una hora de incubación a 65°C contra 0-5% para las variantes tipo silvestre. Esta enzima se construyó utilizando una combinación de mutagénesís aleatoria, saturación y redistribución en el sitio (publicación de patente de los Estados Unidos No. 2004/013401) . Las sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones ¿3, 101, 260 y 543 de la beta-glucosidasa I de Trichoderma reesei dio por resultado en una beta-glucosidasa modificada con eficiencia catalítica aumentada (solicitud provisional de los Estados Unidos No. 61/182.275). Se encontró que las siguientes mutaciones serán particularmente ventajosas para aumentar la eficacia catalítica de la beta-glucosidasa I de Trichoderma reesei: V43I, V43C, V101A, V101G, F260I, F260V, F260Q, F260D, I543N, I543 , I543A, I543S, I543G, e I543L.

También se observa que las enzimas con perfiles de estabilidad con pH alterado no necesariamente requieren un pH alterado óptimo para ser de utilidad. Por ejemplo, el pH de un cultivo celular utilizado para expresar una enzima puede ser diferente del pH de funcionamiento pretendido de la enzima en su aplicación como un biocatalizador . Si la estabilidad de la enzima se compromete en la expresión de pH, se reducirá el rendimiento total de la actividad enzimática. Esto se ha observado con la beta-glucosidasa de Tri hoderma reesei expresada en Saccharomyces cerevísiae (Cummings and Fowler, 1996) . Se observó que un medio de expresión sin amortiguar se hace más ácido a través del tiempo, cayendo de pH 6.0 a 2.0-3.0; esta caída de pH se correlacionó con una declinación súbita en la actividad de beta-glucosidasa.

La inestabilidad se puede agravar adicionalmente por el esfuerzo cortante hidrodinámico que surge de la mezcla del cultivo celular, en particular en presencia de las interfaces de gas-líquido tales como aquellas producidas por la aireación ( eijers and Van't Riet, 1992; Elias and Joshi, i 1998). Algunas enzimas se pueden inactivar adicionalmente por las tensiones de esfuerzo cortante presentes durante los procesos de post-producción tales como ultra-filtración o en sus aplicaciones finales.

En la bibliografía se ha reportado la inactivación por esfuerzo cortante de las glucosil hidrolasas Jones and Lee (1988) describen la inactivación de una mezcla de la celulasa de T. reesei en un sistema reactor que incorpora un impulsor a alta velocidad, aunque sólo en presencia de aire; Sachse et al., (1990) reporta una mayor actividad específica de la celulasa de T. reesei producida en un bajo esfuerzo cortante contra un reactor agitado convencional; Reese (1980) también reporta la inactivación de la celulasa de T. reesei mediante agitación vigorosa durante la hidrólisis y observó que el efecto se podría disminuir mediante el uso de tensioactivos ; por último, Gunjikar et al., (2001) reportó la desactivaciones de exoglucanasas , endoglucanasas y beta glucosidasa en reactores mezclados, la magnitud de |lo cual fue proporcional a la energía de mezclado aplicada.

SUMARIO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con una beta-glucosidasa modificada de Trichoderma reesei. Más específicamente, la invención se relaciona con una beta-glucosidasa de Trichoderma reesei modificada con estabilidad me orada .

Es objetivo de la presente invención es presentar las variantes de la beta-glucosidasa con estabilidad me orada .

La presente invención proporciona una beta-glucosidasa modificada con estabilidad mejorada en solución acuosa a bajo pH, bajo pH con alta agitación, bajo pH con alta aireación, o bajo pH y temperatura elevada. Las beta-glucosidasas de la presente invención encuentran utilidad en procesos industriales que requieren el mantenimiento de la actividad bajo condiciones de bajo pH y alta aireación o alta agitación, tal como la fermentación microbiana, o bajo pH a temperatura elevada, tal como en la producción de azúcares fermentables mediante la hidrólisis enzimática de materias primas de alimentación celulósicas.

Esta invención se relaciona específicamente con una beta-glucosidasa modificada de Trichoderma reesei producida mediante la sustitución del aminoácido en una o más de las posiciones 66, 72, 101, 235, 248, 369 y 386 en la beta-glucosidasa I o la secuencia TrCel3A (SEQ ID NO: 10. Los inventores descubrieron que la sustitución del aminoácido natural en una o más de estas posiciones da por resultado en una mejora de al menos 2 veces, por ejemplo, una mejora entre aproximadamente 2 veces hasta aproximadamente 500 veces, en la estabilidad de la beta-glucosidasa en solución acuosa a bajo pH, bajo pH y temperatura elevada, bajo pH con alta agitación, o bajo pH con alta aireación. beta-glucosidasa TrCel3A modificada se puede derivar de una beta-glucosidasa TrCel3A parental que de otra manera es idéntica a la beta-glucosidasa TrCel3A modificada excepto por la sustitución de los aminoácidos | que se presentan en la naturaleza en una o más de las posiciones 66, 72, 101, 235, 248, 369, y 386. Además, la beta-glucosidasa TrCel3A modificada puede contener sustituciones de aminoácidos adicionales en las posiciones distintas a las posiciones 66, 72, 101, 235, 248, 369, y 386, con la condición de que estas sustituciones adicionales también estén presentes en la TrCel3A parenteral correspondiente. La beta-glucosidasa TrCel3A modificada puede contener sustituciones de aminoácidos adicionales en una o más de las posiciones 43, 96, 260 y 543.

La beta-glucosidasa TrCel3A modificada de la presente invención exhibe entre aproximadamente 80 ¾ hasta aproximadamente 99.9% de identidad de la secuencias de aminoácidos con una TrCel3A natural de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, la TrCel3A modificada exhibe entre aproximadamente 90% hasta 99.9% de identidad de aminoácidos con la TrCel3A natural de la SEQ ID NO: l o entre aproximadamente 95% hasta 99.9% de identidad de aminoácidos con la TrCel3A natural de la SEQ ID NO: 1.

Además, la beta-glucosidasa TrCel3A modificada, según se definió anteriormente, exhibe una mejora de al menos 2 veces, por ejemplo, una mejora entre aproximadamente 2 veces hasta aproximadamente 500 veces, en la estabilidad en una solución acuosa (a) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente 4.5, (b) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente 4.5 aireado a una velocidad superficial de gas entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100 cm/s, o entre aproximadamente 0.5 hasta 5 vvm (c) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente ¿..5 con agitación mediante agitación vigorosa entre aproximadamente 300 hasta aproximadamente 1000 rpm, (d) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente 4.5 con agitación mediante una agitación por impulsor con una velocidad de rotación entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 10 m/s; (e) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente 4.5 en un biorreactor agitado a entre aproximadamente 0.2 hasta 15 hp/378.54 litros (100 galones); o (f) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente de 4.5 a una temperatura entre 30°C y 60°C.

La presente invención también se relaciona con una TrCel3A modificada seleccionada del grupo gue consiste; de: TrCel3A-V66l (SEQ ID NO: 2 ) ; TrCel3A-S72N (SEQ ID NO: 3); TrCel3A-V101M (SEQ ID NO: 5); TrCel3A-T235S (SEQ ID NO: 6) ; TrCeB A-N248K (SEQ ID NO: 7); TrCel3A-N369K (SEQ ID NO: 8); TrCel3A-A386T (SEQ ID NO: 9) ; TrCel3A-V66I-S72N (SEQ ID NO: 10); TrCel3A-S72N-F96L-V101M (SEQ ID NO: 11) ; TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K (SEQ ID NO: 12); TrCel3A-S72N-V101M-N369K-A386T (SEQ ID NO: 13); TrCel3A-V66I-S72N-V101 -N369K-A386T (SEQ ID NO: 14); TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T (SEQ ID NO: 15); TrCel3A-V66l-S72N-F96L-Vl01M-N369K-A386T (SEQ ID NO: 1|6) ; TrCel3A-S72E-F96L-V101M-N369K-A386T (SEQ ID NO: 4); y TrCel3A-S72N-F96L-Vl01M-N369P-A386T (SEQ ID NO: 55) .

La presente invención, también se relaciona con un constructo genético para dirigir la expresión y secreción de la TrCel3A modificada de un microbio hospedero que incluye, de manera enunciativa, cepas de Trichoderma reesei.

El constructo genético de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una TrCel3A modificada que es entre aproximadamente 80% hasta aproximadamente 99.9% idéntica a la SEQ ID NO: 1 y que comprende una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 66, 72, 101, 235, 248, 369 y 386, la secuencia de ácido nucleico se enlaza funcionalmente a las secuencias de ácido nucleico que regulan su expresión y secreción 1 partir de un microbio hospedero. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión y secreción de la beta-glucosidasa TrCel3A modificada se pueden derivar del microbio hospedero utilizado para la expresión de la beta-glucosidasa TrCel3A modificada. El microbio hospedero puede ser una levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae, o un hongo filamentoso, tal como Trichoderma reesei.

La invención también se relaciona con un constructo genético como se definió anteriormente, en donde la beta-glucosidasa TrCel3A modificada codificada por el constructo genético comprende además sustituciones de aminoácidos adicionales en las posiciones distintas a 66, 72, 101, 235, 248, 369 y 386. La beta-glucosidasa TrCel3A modificada codificada por el constructo genético puede contener sustituciones de aminoácidos adicionales en uno o más de las posiciones 43, 96, 260 y 543.

La invención también se relaciona con un Microbio modificado genéticamente que comprende un constructo [enético que codifica para la beta-glucosidasa TrCel3A modifi ada, el microbio modificado genéticamente será capaz de la expresión y secreción de una beta-glucosidasa TrCel3A modificadea que exhibe entre aproximadamente 80% hasta aproximadamentee 99.9% de identidad de la secuencias de aminoácidos con la, SEQ ID NO: 1 y que comprende una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 66, 72, 101, 235, 248, 369, y 386. El microbio modificado genéticamente puede ser capaz de la expresión y secreción de una beta-glucosidasa TrCel3A modificada que comprende además las sustituciones de aminoácidos adicionales en las posiciones distintas a 66, 72, 101, 235, 248, 369, y 386. La beta-glucosidasa TrCel3A modificada expresada y secretada por el microbio modificado genéticamente puede contener sustituciones de aminoácidos adicionales en uno o más de las posiciones 43, 96, 260 y 543. El microbio modificado genéticamente puede ser una levadura u hongo filamentoso. Por ejemplo, el microbio modificado genéticamente puede ser una especie de Saccharomyces, Pichia, HansenuLa, Trichoderma, Hypocrea, Aspergillus, Fusarium, Humicola o Neuroespora.

La presente invención, también se relaciona con el uso de una beta-glucosidasa TrCel3A modificada, como se definió anteriormente, en una reacción de hidrólisis que contiene un sustrato celulósico y una mezcla de celulasa que comprende la beta-glucosidasa TrCel3A modificada.

La invención, también se relaciona con un proceso para producir una beta-glucosidasa TrCel3A modificada, como se definió anteriormente, que incluye la transformación de una hospedero de levadura u hongo con un constructo genético que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la beta-glucosidasa TrCel3A modificada, la selección de las cepas de levadura u hongo recombinantes que expresan la beta-glucosidasa TrCel3A modificada, cultivar las cepas recombinantes seleccionadas en fermentaciones sumergidas en liquido bajo condiciones que induzcan la expresión de la beta-glucosidasa TrCel3A modificada y recuperar la beta-glucosidasa TrCel3A modificada mediante la separación del filtrado de cultivo a partir del microbio hospedero.

La beta-glucosidasa TrCel3A modificada de la presente invención, encuentra uso en una variedad de aplicaciones en la industria que requieren estabilidad a bajo pH, una combinación de bajo pH y alta aireación, una combinación de bajo pH y alta agitación o una combinación de bajo pH y temperatura elevada. Por ejemplo, la beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada, como se describe en la presente, se puede utilizar en procesos industriales en los cuales los sustratos lignocelulósicos se convierten a azúcares fermentables para la producción de etanol u otros productos, o los procesos de fermentación microbiana .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1, representa el vector de plásmido YEp352/PGK91-l/ocss6H-TrCel3A que dirige la expresión y secreción de la TrCel3A natural y modificada a parjtir del Saccharomyces cerevisiae recombinante, La figura 2, representa el vector de plásmido pc/xCel3A-AT003-pyr4 que dirige la expresión y secreción de la TrCel3A modificada a partir de Trichoderma reesei recombinante .

La figura 3, muestra la inactivación de la TrCel3A tipo silvestre como una función de pH y temperatura. (A) gráfica de la actividad de la beta-glucosidasa residual contra el tiempo de incubación en solución acuosa con agitación leve (200 rpm) a pH 3.0, 4.0 o 5.0 a 30°C o a 50°C. (B) gráfica de la actividad de la beta-glucosidasa residual contra el tiempo de incubación en solución acuosa a 30 °C y pH 3.0 o pH .0 en matraces sin divisiones con agitación suave (200 rpm) , en matraces con divisiones con agitación vigorosa a 200 rpm ("sacudir"), o en matraces sin divisiones con agitación mecánica ("agitado") .

La figura 4, es una gráfica de dispersióm de la actividad enzimática residual después de la pre-incubación a pH 3.5 contra pH 5.0. Los datos se relacionan Icón la selección de una placa para cultivo de 96 cavidades que contiene las beta-glucosidasas TrCel3A parenter les y modificadas. Los datos de la TrCel3A parenteral, se ajustaron mediante regresión lineal en la cual la interceptación y se fijó a cero.

La figura 5, muestra la inactivación de las beta-glucosidasas TrCel3A parenterales y modificadas a pH 3.0 y 30°C agitadas vigorosamente a 400 rpm en matraces con divisiones durante 0 hasta 30 horas. La concentración de TrCel3A en estos ensayos varió de 4.8-10.8 pg/m!l, y la actividad residual en cada vez intervalo de tiempo se midió como se describe en el ejemplo 1.

La figura 6, es una gráfica de las constantes de inactivación, tau (en h) , contra la actividad relativa de las beta-glucosidasas TrCel3A parenterales y modificadas. La actividad de la tipo silvestre se ajustó a 1.0 y todas las variantes se compararon con este valor. Los datos representan la media de los triplicados, excepto para N248K que se analizó en un singletón, y las barras de error representan +/- una desviación estándar.

La figura 7, representa la inactivación de las beta-glucosidasas TrCel3A parenterales y modificadas a pH 3.0 y 30°C agitadas vigorosamente a 400 rpm en matraces con divisiones durante 0 a 100 horas. La concentración de TrCel3A en estos ensayos varió de 4.8-10.8 g/ml y la actividad residual en cada intervalo de tiempo se midió como se describe en el ejemplo 1.

La figura 8, representa la inactivación las -glucosidasas TrCel3A modificadas a pH 3.0 30°C agitadas vigorosamente a 400 rpm en matraces con divisiones durante 0 a 300 horas La concentración de la TrCel3A modificada en estos ensayos varió de 4.8-10.8 µ9 p?1 y la actividad residual en cada intervalo de tiempo se midió como se describe en el ejemplo 1.

La figura 9, representa la estabilidad relativa de la beta-glucosidasa parenteral y modificada. La actividad de celobiasa especifica (medida a pH 5.0) de la TrCel3A parental y las beta-glucosidasas TrCel3A A-AT003 modificadas agregadas en las mezclas de celulasa producidas en fermentaciones piloto de Trichoderma reesei conducidas durante 165 horas a 28 °C y ya sea pH 3.0 y pH 5.0 se expresan como una proporción. Una proporción de 1.0 indica que una beta-glucosidasa es igualmente estable a pH 3.0 y pH 5.0; valores menores indican una estabilidad reducida a pH 3.0 contra pH 5.0. Las barras de error representan una desviación estándar .

La figura 10, representa la estabilidad de la beta-glucosidasa parenteral y modificada bajo condiciones que se podrían utilizar para la hidrólisis de celulosa. La beta-glucosidasa parenteral y modificada, dentro de una mezcla de celulasa, se incubó a 50 ó 60°C a pH 3.0, 3.5, 4.0 ó 5.0 Las muestras se extrajeron de la enzima en los | tiempos indicados y probados en un ensayado pNPGasa. Un mddelo de deterioro exponencial de primer orden se ajustó a los datos para determinar el tiempo de vida media de cada enzima bajo cada conjunto de condiciones. Todos los datos se normalizaron al mejor valor de ajuste de la actividad inicial según se determina por el modelo y las curvas de inactivación se exhiben con respecto a esta actividad inicial.

La figura 11, muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de 45 beta-glucosidasas de la familia 3 de hongos, incluyendo la TrCel3A, una secuencia consensual de la beta-glucosidasa de la familia 3, y el % de la identidad de secuencia de cada secuencia de aminoácidos para la de la TrCel3A. Una representación gráfica de la frecuencia de aparición del aminoácido en cada posición de la secuencia consensual de la beta-glucosidasa de la familia 3 de la figura 11 entre las 45 beta-glucosidasas de la familia 3 fungal se muestra debajo de las secuencias alineadas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con unj Ja beta-glucosidasa modificada. Más específicamente, la inveriición se relaciona con una beta-glucosidasa I modific da de Trichoderma reesei (en lo sucesivo TrCel3A) con estábilidad aumentada en soluciones acuosas a bajo pH, a bajo pH con alta aireación, bajo pH con alta agitación, o bajo pH temperatura elevada con relación a la TrCel3A parenteral de la cual se deriva. La presente invención, también se relaciona con constructos genéticos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para la TrCel3A modificada, los métodos para la producción de la TrCel3A modificada a partir de cepas hospederas y el uso de la TrCel3A modificada para aliviar la inhibición de productos de las celulasa en la hidrólisis de celulosa. La presente invención, también se relaciona con el uso de la TrCel3A modificada para catalizar la producción de otros compuestos químicos, entre los que se incluyen de manera enunciativa aquellas de las industrias médicas o de alimentos, ya sea a través de hidrólisis, hidrólisis inversa o transglucosilación .

La siguiente descripción es una modalidad preferida a manera de ejemplo únicamente y sin limitaciór. a la combinación de las características necesaria para llevar a cabo la invención.

Beta-glucosidasas modificadas El término "beta-glucosidasa" , se refiere a las enzimas clasificadas en EC3.2.1.21 y que transfieren un grupo glicosilo entre los nucleófilos de oxígeno, dando por resultado en general en la hidrólisis de un enlace beta-glucosídico que enlaza los residuos de carbohidratos en aril, amino, alquil-beta-D-glucósidos, glucósidos cianogénicos , oligosacáridos y disacáridos de cadena corta. En los oligosacáridos que contienen más de dos glucósidos, la actividad de la beta-glucosidasa disminuye a media que aumenta la longitud de cadena. Las beta-glucosidasas hidrolizan los enlaces betas-1 , 4-glucosidicos vía una reacción de doble desplazamiento, dando por resultado en una retención neta de la configuración anomérica. Dos aminoácidos de carga ácida, ácido aspártico (D) y/o glutámico (E) , están directamente implicados en la catálisis de sustratos. Uno de estos residuos actúa como un nucleófilo y forma un intermediario de enzima-glicosilo. El otro residuo ácido actúa como un catalizador de base ácida. En la beta-glucosidasa I de Trichoderma reesei, en la presente denominada como la TrCel3A cuya secuencia de aminoácidos se presentada en la SEQ ID NO: 1, el ácido aspártico en la posición 236 sirve como el nucleófilo y el ácido glutámico en la posición 447 es el catalizador de base ácida.

Las beta-glucosidasas son un subconjunto de beta-glicosidasas que pertenecen a las familias 1 y 3 de glucosil hidrolasa (GH) , que utilizan el sistema de clasificación desarrollado por Henrissat y colaboradores (Henrissat, B. (1991); Henrissat, B. and Bairoch, A. (1996)). Actualmente existen 115 familias de GH que se han identificado utilizando este sistema de clasificación, las cuales se listan en la base de datos de de las enzimas activas de carbohidratos (CAZy) (véase URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html para referencia) . La familia 1, comprende las beta-glucosidasas provenientes de arqueobacterias , plantas y animales. Las beta-glucosidasas provenientes de algunas bacterias, moho y levadura pertenecen a la familia 3. Para los fines de esta invención, una "beta-glucosidasa" por lo tanto se define como cualquier proteina que se clasifique en EC 3.2.1.21 y se categorice como una glucosil hidrolasa de la familia 3 de acuerdo con el sistema CAZy.

La estructura tridimensional de la beta-D-glucan exohidrolasa, una glucosil hidrolasa de la familia 3, se describió por Varghese et al. (1999) . La estructura fue de una proteina globular de dos dominios que comprende un dominio TIM-barrel N-terminal (alfa/beta) 8 y un C-terminal, un beta-emparedado de seis cadenas, que contiene una hoja beta de cinco cadenas beta paralelas y una cadena beta antiparalela, con tres hélices alfa en cada costado de la hoja. Probablemente esta estructura está compartida por otras enzimas de la familia 3.

Como se muestra en la figura 11, la secuencia de aminoácidos primaria de las beta-glucosidasas de la familia 3 muestran un alto grado de similitud. Múltiples alineaciones a través de las 45 secuencias de aminoácidos de lia beta-glucosidasa de la familia 3 muestran que la mayoría de las beta-glucosidasas de la familia 3 que se presentan en la naturaleza de origen fungal muestran entre aproximadamente 40% a 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de TrCel3A (figura En particular, existen varias regiones de muy alta conservación de la secuencia de aminoácidos dentro de beta-glucosidasas de la familia 3 entre las que se incluyen, por ejemplo, de los 225-256 y 439-459 aminoácidos, que contienen los aminoácidos catalíticos D236 y E447, respectivamente.

Por "TrCel3A", se debe entender la glucpsil hidrolasa de la familia 3 producida por Trichoderma reesei definida por la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 1. TrCel3A también se conoce como ß-glucosidasa de Trichoderma reesei o BGL1. Por TrCel3A "natural" o "tipo silvestre", se debe entender la TrCel3A de la SEQ ID NO: 1 sin ninguna de las sustituciones de aminoácidos. Por "TrCel3A modificada", se debe entender una TrCel3A que comprende una o más sustituciones de aminoácidos, introducidas por técnicas de ingeniería genéticas, seleccionadas del grupo que consiste de V66X (es decir, Val en la posición 66 se reemplaza por cualquier aminoácido X), S72X, V101X, T235X, N248X, N369X, A386X. Las técnicas de ingeniería genética para alterar las secuencias de aminoácidos incluyen, de manera enunciativa, mutagénesis sitio-dirigida, mutagénesis de cásete, mutagénesis aleatoria, construcción de oligonuci.eótidos sintéticos, clonación y otras técnicas de ingeniería genética como se podría conocer por aquellos con experiencia en la técnica (Eijsink VG, et al., 2005.). Se debe entender que una TrCel3A modificada se puede derivar de la TrCel3A tipo silvestre o de una TrCel3A que ya contenga otras sustituciones de aminoácidos. Las beta-glucosidasas TrCel3A modificadas de la presente invención incluyen aquellas que comprenden las sustituciones de aminoácidos en cualquiera de V66X, S72X, VIO IX, T235X, N248X, N369X y A386X, en cualquiera de dos de V66X, S72X, V101X, T235X, N248X, N369X y A386X, en cualesquiera de tres de V66X, S72X, V101X, T235X, N248X, N369X y A386X, en cualquiera de cuatro de V66X, S72X, V101X, T235X, N248X, N369X y A386X, en cualquiera de cinco de V66X, S72X, V101X, T235X, N248X, N369X y A386X, en cualquiera de seis de V66X, S72X, V101X, T235X, N248X, N369X y A386X, o en la totalidad de siete de V66X, S72X, V101X, T235X, N248X, N369X y A386X.

Se debe entender que la beta-glucosidasa TrCel3A modificada se puede derivar de la beta-glucosidasa TrCel3A tipo silvestre o de una beta-glucosidasa TrCel3A que contenga otras sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, la beta-glucosidasa TrCel3A modificada puede contener una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 43, 96|, 260 y 543. Alternativamente, después de la producción de una beta-glucosidasa TrCel3A modificada que comprende mutaciones en una o más de las posiciones 66, 72, 101, 235, 248, 369 y 386, posteriormente se puede modificar adicionalmente para que contenga sustituciones de aminoácidos adicionales, incluyendo de manera enunciativa aquellas establecidas anteriormente.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, con respecto a las secuencias de aminoácidos de la beta-glucosidasa TrCel3A modificada, "derivada de" se refiere al aislamiento de un elemento de la secuencia de ácido nucleico blanco que codifica para la beta-glucosidasa TrCel3A modificada, deseada, que utiliza material genético o ácido nucleico o una información de secuencia de aminoácidos especifica para la beta-glucosidasa TrCel3A parenteral correspondiente. Como se sabe por alguien con experiencia en la técnica, este material o información de secuencia se puede utilizar para generar una secuencia de ácido nucleico que codifica para la beta-glucosidasa TrCel3A modificada, Ideseada que utiliza una o más técnicas de biología molecular incluyendo, de manera enunciativa, clonación, sub-clónación, amplificación mediante PCR, síntesis in vitro, | y lo semejante .

En una primera modalidad de la invención, la TrCel3A modificada, según se definió anteriormente, exhibe entre aproximadamente 80% hasta aproximadamente 99.9% de identidad de secuencias de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1, o cualquier cantidad entre las mismas. Por ejemplo, la TrCel3A modificada puede exhibir entre aproximadamente 90 hasta aproximadamente 99.9% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1 o entre aproximadamente 95% hasta aproximadamente 99.9% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1. Los métodos para alinear las secuencias de aminoácidos son bien conocidos y están disponibles para aquellos expertos en la técnica e incluyen BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, véase URL blast.ncbi.nlm.nihh.gov/Blast.cgi; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) que es útil para alinear dos secuencias CLUSTALW (véase URL: ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) para la alineación de dos o más secuencias. La identidad de secuencia también se puede determinar mediante alineación manual e inspección visual .

En otras modalidades de la invención, la |TrCel3A modificada exhibe entre aproximadamente 80% | hasta aproximadamente 99.9% de la identidad de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1 y al menos una mejora de 2 veces en la estabilidad en una solución acuosa (a) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente 4.5, (b) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente 4.5 aireado a una velocidad superficial de gas entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100 cm/s, o (c) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente 4.5 con agitación mediante agitación vigorosa entre aproximadamente 300 hasta aproximadamente 1000 rpm, (d) entre aproximadamente un pH 2 hasta aproximadamente 4.5 con agitación mediante agitación por impulsor con una velocidad de rotación entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 10 m/s, (e) entre aproximadamente pH 2 hasta aproximadamente 4.5 en un biorreactor agitado en entre aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 15 hp/378.54 litros (100 galones), o (f) entre aproximadamente pH 2 hasta aproximadamente 4.5 a una temperatura entre 30°C y 60°C.

Por "TrCel3A parenteral", se debe entender una TrCel3A que no contenga una sustitución de sus aminoácidos originales en las posiciones 66, 72, 101, 235, 248, 369 ó 386 y que de otra manera sea idéntica a la TrCel3A modificada. Como tal, la TrCel3A parenteral puede contener sustit.uciones de aminoácidos en nada menos que 116 (es decir, el 20? de 582 aminoácidos) posiciones distintas que se hayan introducido mediante ingeniería genética u otras técnicas. Por ejemplo, la TrCel3A parenteral puede comprender las sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 43, 96, 26C y 543 Para ayudar a un experto en la técnica con respecto a aquellas posiciones de aminoácidos de la beta-glucosidasa TrCel3A en la cual se pueden preparar y producir sustituciones de aminoácidos (distintas de V66X, S72X, V101X, T235X, N248X, N369X y A386X) una beta-glucosidasa activa, una alineación de las 45 beta-glucosidasas de la familia 3 derivadas de fuentes fúngales junto con una secuencia consensual de beta-glucosidasa que consiste de los aminoácidos que se presentan en la naturaleza con la mayor frecuencia en cada posición se proporciona en la figura 11 junto con una gráfica que muestra la frecuencia de aparición de cada aminoácido de la secuencia consensual en cada posición. Utilizando la información proporcionada en la figura 11, un experto en la técnica podría reconocer las regiones de baja conservación de secuencia para otras beta-glucosidasas de la familia 3. Los ejemplos no limitantes de estas regiones incluyen, por ejemplo, las regiones entre las posiciones 1-20, 303-323 y 403-414 y seleccionar las posiciones de aminoácidos dentro de estas regiones.

Como se describirá con más detalle en la presente, se han preparado diversas beta-glucosidasas | TrCel3A modificadas que exhiben estabilidad aumentada bajo condiciones de bajo pH y agitación. Una lista de diversos mutantes, que no se consideran limitantes de ninguna forma, se presenta en la tabla 1.

Tabla 1: Beta-glucosidasas TrCel3A con estabilidad mejorada Beta-glucosidasas TrCel3A modificadas con estabilidad mejorada La inactivación funcional de las enzimas se mide mediante la determinación de la constante de velocidad de inactivación, ki, un parámetro con unidades de tiempo | inverso que determina la velocidad de disminución instantáne'a de la actividad enzimática en la ecuación At/A0 = e~kl t donde At es la actividad en el tiempo t y A0 es la actividad inicial del sistema. Este parámetro se puede expresar equivalentemente como tau, el tiempo de vida activa media de una enzima determinada, al tomar el inverso de ki, o como una vida media al multiplicar tau por el logaritmo natural de 2 enzimas que son más estables tienen un valor menor de k± los valores mayores correspondientes de tau y la vida media. Como se define en la presente, por lo tanto, la "estabilidad mejorada" significa un valor mayor, superior o aumentado de tau, expresado en unidades de tiempo, tal como horas.

Para los fines de la presente invención, una TrCel3A modificada exhibe estabilidad mejorada (es decir, un valor mayor de tau) con respecto a la glucosil hidrqlasa de la familia 3 parenteral correspondiente o la TrCel3A parenteral en solución acuosa (a) con bajo pH, (b con bajo pH y alta aireación, (c) con bajo pH y alta agitación o (d) con bajo pH y temperatura elevada.

Por "bajo pH", se debe entender cualquier entre aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4.5, o cualquier pH entre los mismos, por ejemplo, cualquier pH entre aproximadamente 2.5 hasta aproximadamente 4.0, o cualquier pH entre los mismos; por ejemplo pH 2.0, 2.2, 2.4, 2.|d, 2 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4.0, 4.2, 4.4, 4.5 o cualquier pH entre los mismos.

Por "alta aireación", se debe entender la provisión de un gas a la solución acuosa a una velocidad superficial de gas entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100 cm/s, o cualquier velocidad entre las mismas, por ejemplo, cualquier velocidad entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 1 cm/s, o cualquier velocidad en:re las mismas. Un parámetro alternativo para medir la velocidad de aireación que se conoce por alguien experto en la técnica es los volúmenes de recipiente por minuto (vvm) . En el contexto de la presente invención, por lo tanto, "alta aireación" también se puede definir como la provisión de un gas a la solución acuosa a una velocidad entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 5 vvm, o cualquier velocidad entre las mismas. El gas puede ser un gas individual, tal como oxigeno, nitrógeno, y dióxido de carbono, o una mezcla de gases tales como aire.

Por la alta agitación, se debe entender el mezclado de la solución acuosa mediante agitación vigorosa entre aproximadamente 300 hasta aproximadamente 1000 | rpm, cualquier velocidad entre las mismas, o mediante agitación por impulsor con una velocidad de rotación entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 10 m/s, o cualquier velocidad entre las mismas, por ejemplo entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 3 m/s. Un parámetro alternativo para medir la agitación que se conoce por un experto en la técnica, en particular según se relaciona con la agitación en biorreactores , es los caballos de fuerza (hp) por 378.54 litros (100 galones) . En el contexto de la presente invención, por lo tanto, "alta agitación" también Je puede definir como el mezclado de la solución acuosa entre aproximadamente 0.2 hp/378.54 litros (100 galones hasta aproximadamente 15 hp/378.54 litros (100 galones).

Por temperatura elevada, se debe entender cualquier temperatura entre aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 60 °C, o cualquier temperatura entre las mismas, por ejemplo cualquier temperatura entre aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 60 °C, o cualquier temperatura entre las mismas, por ejemplo 30, 35, 40, 45, 50, 52, 54, 56, 58, 60°C, o cualquier temperatura entre las mismas La TrCel3A modificada exhibe una estabilidad mejorada con relación a una TrCel3A parenteral de la cual se deriva cuando tau de la TrCel3A modificada es al menos 2 veces, por ejemplo entre aproximadamente 2 veces hasta aproximadamente 500 veces, superior a la de tau de la|TrCel3A parenteral bajo condiciones idénticas de bajo pH, baljo pH y alta aireación, bajo pH y alta agitación, o baj b PH y temperatura elevada. Por ejemplo, el tau de la TrCel3A modificada puede ser entre aproximadamente 2 veces hasta 250 veces superior que el tau de la TrCel3A parenteral correspondiente, o cualquiera valor entre las mismas, entre aproximadamente 3 veces hasta aproximadamente 200 veces superior que el tau de la TrCel3A parenteral correspondiente, o cualquier valor entre las mismas, o por ejemplo el tau puede ser de aproximadamente 2-, 3-, 5- 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 100-, 120-, 140-, 160-, 180-, 200-, 220-, 240-, 250-, 300-, 350-, 400-, 450-, o 500-veces superior, o cualquier valor entre los mismos, distinto del tau del TrCel3A parenteral correspondiente bajo condiciones idénticas. El ejemplo 8 detalla un análisis para medir el tau de las beta-glucosidasas TrCel3A naturales y modificadas.

La estabilidad de diversas beta-glucosidasas TrCel6A modificadas se comparó mediante la incubación de las enzimas a bajo pH (3.0) bajo condiciones de agitación severa producida al agitar rotacionalmente las soluciones de enzimas en matraces con divisiones a 400 rpm y medir la actividad residual en diversos puntos de tiempo tomados durante un periodo de 30 minutos. La actividad de la beta-glucosidasa residual se determinó vía un análisis cromogénico utilizando para-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido como un sustrato según se describe en el ejemplo 1 El efecto de las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 66, 72, 101, 235, 248, 369 y 386, se determinó vía un estudio comparativo de la TrCel3A modificada y la TrCel3A tipo silvestre parenteral. El aumento relativo en tau sobre el de la TrCel3A parenteral (donde el valor de tau para la TrCel3A parenteral se ajusta a 1.0) se muestra en la siguiente tabla 2. Las curvas de inactivación para estas variantes se muestran en las 5, 7 y 8.

Tabla 2: Estabilidad aumentada de la TrCel3A modificada Sustitución de aminoácidos Tau relativo Ninguna (TrCel3A) 1.0 S72N 4.3 V66I-S72N 13.9 V101M 2.9 T235S 2.9 N248K 3.8 N369K 8.2 A386T 5.1 S72N-F96L-V101M 19.4 S72N-F96L-V101M-N369K 145 S72N-F96L-V101M-N369K-A386T 134 S72N-V101 -N369K-A386T 205 V661-S72N-V101M-N369K-A386T 97 V661-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T 59 S72E-F96L-V101M-N369K-A386T 194 S72N-F96L-V101M-N369P-A386T 330 Constructos genéticos que codifican para la TrCel3A modificada La presente invención también se relaciona con un constructo genético que comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica para la TrCel3A modificada enlazada funcionalmente a las secuencias de ácido nucleico reguladoras que dirigen la expresión y secreción de la TrCel3A modificada a partir de un microbio hospedero. Por "secuencias de ácido nucleico reguladoras" se debe entender las secuencias de ácido nucleico que dirigen la transcripción y traduación de la TrCel3A modificada que codifica para la secuencia de ácido nucleico y una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido con señal de secreción capaz de dir:.gir la secreción de la TrCel3A modificada a partir del microbio hospedero. Las secuencias de ácido nucleico reguladoras de preferencia son funcionales en un hospedero fangal. Las secuencias de ácido nucleico reguladoras se pueden derivar de los genes que se expresen y secreten altamente en el microbio hospedero bajo condiciones industriales de fermentación. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico reguladoras se pueden derivar de cualquiera de uno o más de los genes de celulasa o hemicelulasa de Trichoderma reesei.

El constructo genético puede comprender además un gen marcador seleccionable para permitir el aislamiento de un microbio modificado genéticamente transformado con la estructura que se conoce comúnmente por aquellos expertos en la técnica. El gen marcador seleccionable puede conferir resistencia a un antibiótico o la capacidad de desarrollarse en un medio que carezca de un nutriente especifico para el organismo hospedero que de otra manera no se | podría desarrollar bajo estas condiciones. La presente invención no se limita por la elección del gen marcador seleccionable, y alguien con experiencia en la técnica puede determinar fácilmente un gen adecuado. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable puede conferir resistencia a higromicina, fleomicma, kanamicina, geneticina, o G418, o puede complementar una deficiencia del microbio hospedero er. uno de los genes trp, arg, leu, pyr4, pyr, ura3, ura5, his, o ade o puede conferir la capacidad de desarrollarse en aoetamida como una fuente única de nitrógeno.

El constructo genético puede comprender además otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, los terminadores transcripcionales, las secuencias de ácido nucleico que codifican para las marcas de péptidos, las secuencias sintéticas para enlazar las diversas secuencias de ácido nucleico distintas conjuntamente, los orígenes de replicación, y lo semejante. La práctica de la presente invención, no se limita por la presencia de cualquiera de una o más de estas secuencias de ácido nucleico.

Microbios modificados genéticamente que producen la TrCel3A modificada La TrCel3A modificada se puede expresar y secretar a partir de un microbio modificado genéticamente producido mediante la transformación de un microbio hospedero con un constructo genético que codifica para la TrCel3A mod:.ficada . El microbio hospedero puede ser una levadura o u:i hongo filamentoso, en particular aquellos microbios que sean miembros del filo Ascomycota . Los géneros de levaduras útiles como microbios hospederos para la expresión de la beta-glucosidasa TrCel3A modificada de la presente invención incluyen Saccharomyces, Pichia, Hansenula , Kluyveromyces, Yarrowia, y Arxula. Los géneros de hongos útiles como microbios para la expresión de las beta-glucosidasas TrCel3A modificadas de la presente invención incluyen Trichoderma , Hypocrea , Aspergillus, Fusarium, Humicola , Neuroespora, y Penicillium. Por ejemplo, el microbio hospedero puede ser una cepa industrial de Trichoderma reesei. Tipicame te , el microbio hospedero es uno que no exprese una |TrCel3A parenteral .

El constructo genético se puede introducii en el microbio hospedero mediante cualquier número de Imétodos conocidos por un experto en la técnica de la transformación microbiana, incluyendo de manera enunciativa, el tratamiento de las células con CaCl2, electroporación, bpmbardeo biolistico, fusión de protoplastos suministrada por EG (por ejemplo, hite et al., WO 2005/093072). Después de seleccionar las cepas fúngales recombinantes que expresan la TrCel3A modificada, las cepas recombinantes seleccionadas se pueden cultivar en fermentaciones sumergidas en liquido bajo condiciones que induzcan la expresión de la TrCel3A modificada .

Producción de la TrCel3A modificada La TrCel3A modificada de la presente invención se puede producir en un proceso de fermentación que utiliza un microbio modificado genéticamente que comprende un coristructo genético que codifica para la TrCel3A modificada l en una fermentación de cultivo sumergido en liquido.

Las fermentaciones de microorganismos sumergidas en liquido, incluyendo Trichoderma y los hongos filamentosos relacionados, como un experto en la técnica podría conocer, típicamente se conducen como un proceso en lotes, alimentado en lotes o continuo. En un proceso en lotes, todos los materiales necesarios, con excepción del oxígeno para los procesos aeróbicos, se colocan en un reactor al inicio de la operación y se deja proceder la fermentación hasta término, en cuyo punto se recolecta el producto. En un | proceso alimentado por lotes, el cultivo se alimenta continua o secuencialmente con uno o más componentes de los medios sin la eliminación del fluido de cultivo. En un proceso continuo, se suministra medio recién preparado y el fluido de cultivo se elimina continuamente a velocidades volumétricamente iguales para mantener el cultivo a lina tasa de crecimiento estable.

El proceso para producir la TrCel3A modifi cada de la presente invención se puede realizar como un proqeso por lotes, alimentado por lotes, alimentado por lotes rej >etidos, o continuo o cualquier combinación de los mismos Por ejemplo, el proceso puede ser un proceso aliment. ido por lotes .

Un experto en la técnica estará consciente de que el medio de fermentación comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y otros nutrientes, las vitaminas y minerales se pueden agregar al medio de fermentación para mejorar el crecimiento y la producción enzimática de la célula hospedera. Estos otros componentes del medio se pueden agregar antes, simultáneamente con o después de la inoculación del cultivo con la célula hospedera.

Para el proceso para producir la TrCel3A modificada de la presente invención, la fuente de carbón© puede comprender un carbohidrato que inducirá la expresica de la TrCel3A modificada a partir de un constructo genético en un microbio genéticamente modificado. Por ejemplo, si el microbio genéticamente modificado es una cepa de Trichoderma y el constructo genético comprende un promotor de celulasa o hemicelulasa enlazado funcionalmente o la secuencia de ácido nucleico de la TrCel3A modificada, la fuente de carbono puede comprender uno o más de celulosa, celobiosa, soforosa, xilano, xilosa, xilobiosa y oligo o polisacáridos relacionados conocidos para inducir la expresión de celulasas, hemicelulasas y beta-glucosidasa en Trichoderma .

En el caso de la fermentación por lotes, la fuente de carbono se puede agregar al medio de fermentación antes de o simultáneamente con la inoculación. En los casos de las operaciones alimentadas por lotes o continuas, la fuente de carbono también se puede suministrar continua o intermitentemente durante el proceso de fermentación.

El proceso para producir la TrCel3A modifi|cada de la presente invención se puede llevar a cabo una temperatura entre aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 40°C, o cualquier temperatura entre las mismas, o de 20, 22, 25, 26, 27.28, 29, 30, 32, 35, 37, 40°C o cualquier temperatura entre las mismas.

El proceso para producir la TrCel3A modificada de la presente invención se puede llevar a cabo a un pH de aproximadamente 3.0 hasta 6.5, o cualquier pH entre los mismos,, por ejemplo de aproximadamente un pH 3.0, 3 2, 3.4, 3.5, 3.7, 3.8, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4 7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.2, 5.4, 5.5, 5.7, 5.8, 6.0, 6.2, 6.5 o cualquier pH entre los mismos.

El proceso para producir la TrCel3A modificada de la presente invención se puede llevar a cabo aeróbicamente, con una velocidad superficial de gas entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100 cm/s. Por ejemplo, la velocidad superficial de gas puede ser entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 1.0 cm/s. Alternativamente, la velocidad superficial de gas utilizada en el proceso para producir la TrCel3A modificada de la presente invención, puede ser entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 5 vvm, o cualquier velocidad entre las mismas.

El proceso para producir la TrCel3A modificada de la presente invención se puede llevar a cabo en un¡ matraz para agitación que se agita vigorosamente entre aproximadamente 300 hasta aproximadamente 1000 rpm o un biorreactor que se agita mediante un impulsor con una velocidad de rotación del impulsor entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 10.0 m/s, o cualquier velocidad entre las mismas por ejemplo a una velocidad de rotación del impulsor hasta aproximadamente 0.5 hasta 3 m/s, o cualquier velocidad entre las mismas. Alternativamente, el biorreactor se puede agitar a una potencia entre aproximadamente 0.2 hp/378.54 litros (100 galones) hasta aproximadamente 15 hp/378.54 litros (100 galones), o cualquier potencia entre las mismas.

Después de la fermentación, el caldo de fermentación que contiene la enzima de celulasa se puede utilizar directamente, o la enzima de celulasa se puede separar de las células fúngales, por ejemplo, mediante filtración o centrifugación. Mediante ultra-filtración se pueden eliminar los solutos de bajo peso molecular ta] es como los componentes sin consumir del medio de fermentación. La enzima de celulasa se puede concentrar, por ejemplo, mediante evaporación, precipitación, sedimentación o filtración. Para estabilizar la enzima de celulasa, se pueden agregar químicos tales como glicerol, sacarosa, sorbitol y lo semejante. Para evitar el desarrollo de contaminación microbiana, a la, enzima de celulasa se le pueden agregar otro!s químicos, taljes como benzoato de sodio o sorbato de potasio.

El uso de la TrCel3A modificada para la hidrólisis de los sustratos celulósicos La TrCel3A modificada de la invención, se puede combinar con una o más celulasas para producir una mezcla de celulasas para utilizarse en la hidrólisis enzimática de la celulosa. Para los fines de la presente invención, las celulasas incluyen todas las enzimas y proteínas conocidas que participan en la conversión de celulosa a azúcares solubles, incluyendo de manera enunciativa celobiohiirolasas (EC 3.2.1.91), endoclucanasas (E.C 3.2.1.4), y otras enzimas complementarias que intensifiquen la conversión enzim tica de celulosa a azúcares solubles tales como, "swol enins , "expansins", y lo semejante. Además de la TrCel3A modificada y las celulasas, la mezcla de celulasas puede comprender otras enzimas tales como otras beta-glucosidasas, hemicelulasas, glucuronidasas, galacturonasas, esterasas, galactosidasas , amilasas, y glucoamilasas . Se debe entender que la hidrólisis enzimática de celulosa mediante mezclas de celulasas que comprende las beta-glucosidasas TrCel3A modificadas de la presente invención no se limita por la composición de la mezcla de celulasas.

La mezcla de celulasas que comprende la TrCel3A modificada de la presente invención se pueden utilizar para la hidrólisis enzimática de la celulosa presente en la "materia prima de alimentación lignocelulósica pret::atada" . Una materia prima de alimentación lignocelulósica prétratada es un material de origen vegetal que, antes del pre-tratamiento, contiene al menos 20% de celulosa (peso en seco), de mayor preferencia más de aproximadamente | 30 celulosa, incluso de mayor preferencia más del 40% de celulosa, por ejemplo 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 90% o cualquier % entre los mismos, y al menos 10% de lignii (peso seco) , más típicamente al menos 12% (peso seco) y que se haya sometido a procesos físicos y/o químicos para hacer que la fibra sea más accesible y/o receptiva a las acciones! de las enzimas celulolíticas .

Después del pre-tratamiento, la materia p|rima de alimentación lignocelulósica puede contener niveles mayores de celulosa. Por ejemplo, si se emplea pre-tratamiento con ácido, se hidroliza el componente de hemicelulo a, que aumenta el nivel relativo de celulosa. En este caso, la materia prima de alimentación pre-tratada puede contener más de aproximadamente 20% de celulosa y más de aproximadamente 12% de lignina. Las materias primas de alimentación lignocelulósica que se pueden utilizar en la invención incluyen, de manera enunciativa, residuos agrícolas tales como forraje de maíz, paja de trigo, paja de cebada, paja de arroz, paja de avena, paja de cañóla, y forraje de soya; residuos del proceso para formación de fibras tales como fibra de maíz, pulpa de betabel blanco, finos y desechos del molido de pulpa o bagazo de caña de azúcar; ::esiduos forestales tales como, madera de álamo, otras maderas duras, madera suave, y aserrín; o pastos tales como, pasto de vara, miscanthus, pasto cord, y caña de alpiste. La materia prima de alimentación lignocelulósica se puede someter primero a reducción de tamaño mediante métodos que incluyen, de manera enunciativa, molienda, trituración, agitación, desmenuzado, compresión/expansión, u otros tipos de acción mecánica. La reducción de tamaño mediante la acción mecánica sa puede realizar mediante cualquier tipo de equipo adaptado para este fin, por ejemplo, de manera enunciativa, un | molino triturador.

Los ejemplos no limitantes de procesos de pre tratamiento incluyen el tratamiento químico de una materia prima de alimentación lignocelulósica con ácido sulfúrico o sulfuroso, u otros ácidos; amoniaco, cal, hidróxido de amonio, u otros álcalis; etanol, butanol, u otros solventes orgánicos; o agua presurizada (véanse, las patente de los Estados Unidos Nos. 4,461,648, 5,916,780, 6,(590,595, 6, 043, 392 y 4, 600, 590) .

El pre-tratamiento se puede llevar a cabo para hidrolizar la hemicelulosa, o una porción de la misma, que esté presente en la materia prima de alimentación lignocelulósica para azúcares monoméricos, por ejemplo xilosa, arabinosa, mañosa, galactosa, o combinaciones de los mismos. De preferencia, el pre-tratamiento se lleva a cabo de tal forma que se presente una hidrólisis casi completa de la hemicelulosa y una pequeña cantidad de conversión de la celulosa a glucosa. Durante el pre-tratamiento, típicamente se utiliza una concentración de ácido en la suspensión acuosa entre aproximadamente 0.02% (p/p) hasta aproximadamente 2% (p/p) , o cualquier cantidad entre las mismas, para el tratamiento de la materia prima de alimentación lignocelulósica. El ácido puede ser, de manera enunciativa, ácido clorhídrico, ácido nítrico, o ácido sulfúrico. Por ejemplo, el ácido utilizado durante el pre-tratamiento es ácido sulfúrico.

Un método para realizar el pre-tratamiento con ácido de la materia prima de alimentación es la explosión de vapor utilizando las condiciones de proceso establecidas en la patente de los Estados Unidos No. 4,461,648. Otro método para pre-tratar la suspensión de la materia prima de alimentación implica pre-tratamiento continuo, lo que significa que la materia prima de alimentación lignocelulósica se bombea a través reactor continuamente. El pre-tratamiento continuo con ácido es familiar para aquellos expertos en la técnica; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,536,325; WO 2006/128304; y la patente de los Estados Unicos No. 4,237,226. Técnicas adicionales conocidas en este campo se pueden utilizar según se requiera, tales como el proceso expuesto en la patente de los Estados Unidos No. 4,556,430.

Como se observó anteriormente, el pre-tratamiento se puede conducir con álcali. En contraste con el pre-tratamiento con ácido, el pre-tratamiento con álcali no hidroliza el componente de hemicelulosa de la materia prima de alimentación, aunque en su lugar el álcali reacciona con los grupos ácidos presentes en la hemicelulosa para abrir la superficie del sustrato. La adición de álcali también puede alterar la estructura cristalina de la celulosa de tal forma que sea más apta para la hidrólisis. Los ejemplos de álcali que se pueden utilizar en el pre-tratamiento incluyen amoniaco, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, e hidróxido de sodio. El pre-tratamiento de preferencia no se conduce con álcali que sea insoluble en agua, tal como cal e hidróxido de magnesio.

La materia prima de alimentación lignoceiLulósica pre-tratada se puede procesar después del pre-tratamiento aunque antes de la hidrólisis enzimática mediante cualesquiera de varios pasos, tales como dilución cojn agua, lavando con agua, amortiguamiento, filtración, o centrifugación, o una combinación de estos procesos, a.ntes de la hidrólisis enzimática, como es familiar para aquellos expertos en la técnica.

La materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada luego se somete a hidrólisis enzimática. Por el término "hidrólisis enzimática", se debe entender un proceso mediante el cual las enzimas de celulasa actúan sobre la celulosa para convertir la totalidad o una porción de la misma a azúcares solubles. Se debe entender que los azúcares solubles incluyen monómeros y oligómeros de hexosa solubles en agua de hasta seis unidades monoméricas que se suministran a partir de la porción de celulosa de la materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada. Los ejem los de azúcares solubles incluyen, de manera enunciativa, glucosa, celobiosa, celodextrinas , o mezclas de las mismas. Los azúcares solubles pueden ser predominante celobiosa y glucosa. Las azúcares solubles pueden ser predominante glucosa.

El proceso de hidrólisis enzimática de preferencia convierte entre aproximadamente el 80% hasta aproximadamente 100% de la celulosa a azúcares solubles, o cualquier variación entre las mismas. De mayor preferencia, el |proceso de hidrólisis enzimática convierte entre aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100% de la celulosa a azúcares solubles, o cualquier variación entre las mismas. En la modalidad más preferida, el proceso de hidrólisis en2imática convierte entre aproximadamente 98% hasta aproximadamente 100% de la celulosa a azúcares solubles, o cualquier variación entre las mismas. El proceso de hicrólisis enzimática puede ser hidrólisis por lotes, hidrólisis continua, o una combinación de las mismas. El proceso de hidrólisis puede estar agitado, sin mezclar o una combinación de los mismos.

La hidrólisis enzimática de celulasa utilizando una mezcla de celulasa que comprende la TrCel3A modificada puede ser hidrólisis por lotes, hidrólisis continua, o una combinación de las mismas. La hidrólisis puede estar agitado, sin mezclar, o una combinación de los mismos.

La hidrólisis enzimática se puede llevar a cabo a una temperatura entre aproximadamente 45°C hasta aproximadamente 75°C, o cualquier temperatura entre las mismas, por ejemplo una temperatura de 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75°C, o cualquier temperatura entre las mismas, y un pH entre aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente |7.5, cualquier pH entre los mismos, por ejemplo un pffi entre aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 5.5, o cualquier pH entre los mismos, por ejemplo un pH 3.0, 3.5, 4.0, 4.|5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, o un pH entre los mismo's La concentración inicial de celulosa en el reactor de hidrólisis, antes de iniciar la hidrólisis, de preferencia es entre aproximadamente 4% (p/p) hasta aproximadamente 15% (p/p) , o cualquier cantidad entre los mismos, por ejemplo 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15% o cualquier cantidades entre los mismos. La dosificación de la mezcla con enzimas de celulasa que comprenden la TrCel3A modificada puede ser! entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg de proteina por gramo de celulosa, o cualquier cantidad entre las mismas, por ejemplo 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mg de proteina por gramo de celulosa, o cualquier cantidad entre las mismas. La hidrólisis se puede llevar a cabo durante un periodo de tiempo entre aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 200 horas, o cualquier tiempo entre los mismos, por ejemplo, la hidrólisis se puede llevar a cabo durante un periodo de 15 horas hasta 100 horas, o cualquier tempo entre los mismos, o se puede llevar a cabo durante 12, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200 horas, o cualquier cantidad entre las mismas. Se debe apreciar que las condiciones de reacción no significa que limiten la invención de ninguna forma y se pueden ajustar según se desee por un experto en la técnica.

La hidrólisis enzimática típicamente se lleva a cabo en un reactor para hidrólisis. La mezcla de enzimas se agrega a la materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada (también denominada como el "sustrato") antes de, durante, o después de la adición del sustrato al react.or para hidrólisis .

Todas las enzimas en la mezcla de celulasa se pueden secretar de una cepa de un organismo, denominado en la presente como una "combinación completa" de enzimas secretadas. Por el término "combinación completa", se debe entender todas las proteínas secretadas extra-celularmente en el medio de crecimiento por un microorganismo específico. La mezcla de enzimas puede incluir la combinación completa de enzimas secretadas por Trichoderma reesei.

Las enzimas individuales de la mezcla de celulasa que comprende la beta-glucosidasa TrCel3A modificada se pueden expresar individualmente o en subgrupos a partir de diferentes cepas de diferentes organismos y las enzimas combinadas para preparar la mezcla de enzimas de celulasa. También se contempla que las enzimas individuales de la mezcla de celulasa se pueden expresar individualmente o en subgrupos a partir de diferentes cepas de un solo organismo, tal como a partir de diferentes cepas de Trichoderma reesei, y las enzimas combinadas para preparar la mezcla de celulasa. De preferencia, todas las enzimas se expresan a partir de una sola cepa de Trichoderma reesei.

EJEMPLOS La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, se debe entender que estos ejemplos son para fines ilustrativos únicamente y no se deben utilizar para limitar el alcance de la presente invención de ninguna forma.

El ejemplo 1, describe la evaluación de la estabilidad de la TrCel3A parenteral a condiciones con pH diferente con baja y alta agitación/aireación. El ejemplo 2, describe las cepas y vectores utilizados en los siguientes ejemplos. El ejemplo 3, describe la clonación del gen TrCel3A y la transformación de la levadura. El ejemplo 4, describe la elaboración de bibliotecas PCR propensas a errores. Los ejemplos 5 y 6, describen la expresión de las beta-glucosidasas TrCel3A parenterales y modificadas a partir de microcultivo de levadura y la selección de alto rendimiento para identificar la TrCel3A modificada con estabilidad mejorada. Los ejemplos 7 y 8, describen la expresión y caracterización a gran escala de las beta-glucosidasas TrCel3A modificadas y naturales. El ejemplo 9, describe la evaluación de la actividad de las beta glucosidasas TrCel3A parenterales y modificadas, Los ejemplos 10 y 11, describen la generación de una TrCel3A modificada agregada con múltiples sustituciones de aminoácidos y la preparación y selección de las bibliotecas de mutagénesis de saturación en el sitio de la |TrCel3A modificada agregada. Los ejemplos 12 y 13, describen la producción de una beta-glucosidasa TrCel3A modificada a partir de Trichoderma reesei. El ejemplo 14, describe el análisis de la actividad especifica relativa de las beta-glucosidasas TrCel3A parenterales y modificadas. Los ejemplos 15 y 16, describen los ensayos de estabilic.ad para las beta-glucosidasas TrCel3A parenterales y modificadas.

Ejemplo 1 : inactivación de TrCel3A en vina mezcla de celulasa de Trichoderma reesei.

Este ejemplo demuestra que la TrCel3A parenteral se inactiva bajo condiciones de bajo pH, bajo pH y alta agitación, bajo pH y alta aireación, o bajo pH y temperatura elevada .

Las muestras de una mezcla de celulasa con | niveles mejorados de la TrCel3A parenteral producida mediante | la cepa P59G de T. reesei se ajustaron a pH 3.0, 3.5, 4. (|) y 5.0 (figura 3A) y se mezclaron a 30°C o 50°C en matraces sin divisiones mediante agitación vigorosa orbital a 200 rpm durante hasta 80 horas. Las muestras de una mezcla de celulasa con niveles mejorados de la TrCel3A pa::enteral producida mediante la cepa P59G de G. reesei se ajustaron a pH 3.0 o pH 5.0 (figura 3B) y se incubaron a 30°C en un matraz sin divisiones, sin agitación vigorosa o agitación normal, en matraces sin divisiones con agitación vigorosa orbital a 200 rpm ("sacudir") o en matraces con divisiones con un agitador magnético ("agitado") durante hasta 400 horas (figura 3B) . Las muestras de la mezcla de celulasa que contienen la TrCel3A parenteral se retiraron a diversos puntos de tiempo y se analizaron para la actividad de beta-glucosidasa residual utilizando un para-nitrofenil--beta-D-glucósido (pNPG) como sustrato.

La liberación de para-nitrofenol a partir de pNPG se detectó fácilmente mediante su absorbancia a 340 nm. El "análisis pNPGasa se llevó a cabo a 50°C en un espectrofotómetro Cary300, la concentración de sustrato es 0.4 mM en 3 mL, al cual se agregaron 2 \iq de una mezcla de celulasa que comprende la TrCel3A parenteral (celulasa P59G) . La concentración proteinica total también se midió en cada punto de tiempo utilizando el método de Bradford et al. {Analytical Bioche istry, 72:248-254, (1976)). Para la celulasa P59G, esto representa la adición de aproximadamente Ejemplo 2: Cepas y vectores.

La cepa BJ3505 de Sa echaromyees ce ¦evisiae (pep4::¿HIS3 prb-M .6R HIS3 Jys2-208 trp-???? ura3-¡52 gal2 canl) se obtuvo de Sigma y formó parte del Kit para Expresión de la Levadura Amino-Terminal FLAG. La cepa DH5a ( F~ <t>801acZAM15 ? ( 2acZYA-argF) U169 recAl endAl hsdRll (rk~, k+)phoA supE44 thi-1 gyrA96 relAl ?-) se obtuvo de Invitrogen. El vector YEp352/PGK91-l se obtuvo del Instituto Nacional de Salud. El vector pGEM T-easy se ob:uvo de Promega .

La cepa P59G de Trichoderma reesei es u a cepa modificada genéticamente que produce y secreta altos niveles de la beta-glucosidasa TrCel3A, codificada por T. reesei bgll, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6,015,703. BTR213 es un derivado de RutC30 (ATCC #56765; Montenecourt and Eveleigh, 1979) producido nediante mutagénesis aleatoria y se seleccionó primero por su capacidad para producir grandes zonas de aclaramiento en agar medio mínimo que contuvo 1% de celulosa hinchada con ácido y 4 g/L de 2-desoxiglucosa, y luego se seleccionó por su capacidad para crecer en medios en lactosa que contuvo 0.2 µ?/t?? de carbendazim. La cepa P107B es un derivado de la cepa BTR213 generada mediante el reemplazo del gen cel6a con el gen Neuroespora crassa pyr . Las cepas BTR213aux y P107Baux, deficientes en la producción de uridina, se aislaron por la capacidad para crecer en 5-FOA (ácido 5-fluororótico) y la incapacidad para crecer prototroficamente en ausencia de uridina.

Ejemplo 3: Clonación del gen TrCel3A parenteral en YEp352/PGK91-l y la transformación en levadura El gen TrCel3A contiene dos intrones. Un intrón se ubica en la señal de secreción en la posición 323 pares de bases a 391 pares de bases, mientras que el otro se ubica dentro del gen en la posición de 2152 pares de bases| a 2215 pares de bases. El gen TrCel3A contiene un sitio Nhel único ubicado en la posición de 1203 pares de bases. Para facilitar la expresión a partir de la levadura y la clonación utilizando las enzimas de restricción Nhel y Kpnl , el Nhel único ubicado dentro de TrCel3A en la posición de 1203 pares de bases y el segundo intrón se retiraron mediante una PCR de tres pasos. El gen TrCel3A se amplificó en tres segmentos a partir de un plásmido que contuvo TrCel3A, pc/xBG (Xbal)-TV (patente de los Estados Unidos No. 6,015,703) utilizando iPROOF ADN polimerasa (BioRad) . El primer fragmento (A) se amplificó utilizando cebadores que introdujeron un sitio Nhel en el extremo 5' de la dirección 3' del gen de la señal de secreción (AT048) y el cual retiró el sitio Nhel interno (AT051) . El segundo fragmento (B) se amplificó utilizando cebadores que retiraron el sitio Nhel interno (AT050) y el intrón en la posición de 2152 a 2215 pares de bases (AT053) . El tercer fragmento (C) se amplificó utilizando cebadores que retiraron el intrón en la posición de 2152 a 2215 pares de bases (AT052) y se introdujeron un sitio de Kpnl en el extremo 3' del gen, en la dirección 3' del codón de paro (AT049) . Los productos génicos B y C se juntaroi (para preparar el producto génico D) utilizando PCR con los cebadores AT050 y AT049. El producto génico D se unió con eí producto génico A utilizando PCR con los cebadores AT048 y AT049 para obtener TrCel3A sin intrones y con sitios únicos Nhel y Kpnl en los extremos 5' y 3' , respectivamen El producto génico final se clonó en el vector pGEM T-easy (Promega) según las instrucciones del fabricante para producir el plásmido pGE -TrCel3A. Las secuencias de cebadores se muestran enseguida: AT048 5 ' CGC CAG GCT AGC GTT GTA CCT CCT GC (SEQ ID NO: 17) AT049 5' CTG AGG GTA CCG CTA CGC TAC CGA C (SEQ ? NO: 18) AT050 5" CCC GCT AGT ATT GCC GTC GTT GGA TC (SEQ ID NO: 19) AT051 5' CCA ACG ACG GCA ATA CTA GCG GGC TTC (SEQ ID NO: 20) AT052 5' GTT CGG CTA TGG ACT GTC TTA CAC CAA GTT CAA CTA C (SEQ ID NO. 21) AT053 5' GTT GAA CTT GGT GTA AGA CAG TCC ATA GCC GAA CTC (SEQ ID NO: 22) Se preparó un adaptador de ADN que contuvo los sitios de restricción Alhel, Kpnl , y EcoRI al fijar los cebadores AT046 y AT047 conjuntamente. El adaptador se insertó en un plásmido a base de YEp que contuvo el promotor pgkl , la señal de secreción del factor de apariamiento alfa, y las secuencias del terminador pgkl para elaborar el plásmido YEp352/PGK91-l/assNKE . Especi ficamente, el adaptador se insertó como un fragmento Nhel/EcoRI en los sitios Nhel y EcoRI ubicados en la dirección 3' de ].a señal de secreción del factor de apariamiento alfa y en la dirección 5' del terminador pgkl. Las secuencias ce;badoras se muestran enseguida: AT046: 5' CTA GCT GAT CAC TGA GGT ACC G (SEQ ID NO: 23) AT047: 5' AAT TCG GTA CCT CAG TGA TCA G (SEQ ID NO: 24) El plásmido pGEM-TrCel3A se digirió con Nhel y EcoRI para liberar el gen TrCel3A de 2235 pares de bases. El fragmento se purificó y se ligó en los sitios Nhel y EcoRI de YEp352/PGK91-l/assNKE para obtener YEp352/PGK91-l/assCel3A.

Se preparó un adaptador de ADN que contuvo los sitios de restricción Spel, Nhel, Kpnl, y EcoRI al fijar los cebadores AT044 y AT045 conjuntamente. El adaptador contuvo las secuencias que codifican para seis residuos de histidina en la dirección 3' del sitio Spel y la dirección 5' del sitio Nhel. El adaptador se insertó en un plásmido a base de YEp que contuvo el promotor pgkl , la señal de secreción del factor de apariamiento alfa, y las secuencias del terminador pgkl para producir el plásmido YEp352/PGK91-l/ass6HN E . Específicamente, el enlazante se insertó como un fragmento Nhel/EcoRI en los sitios Nhel y EcoRI ubicados! en la dirección 3' de la señal de secreción del factor de apariamiento alfa y en la dirección 5' del terminadqr pgkl. Las secuencias cebadoras se muestran enseguida: AT044: 5' CTA GTC ATC ACC ATC ACC ATC ACG CTA GCT GAT CAC TGA GGT ACC G (SEQ ID NO: 25) AT045. 5' AAT TCG GTA CCT CAG TGA TCA GCT AGC GTG ATG GTG ATG GTG ÁTG A (SEQ ID NO: 26) El plásmido pGEM-TrCel3A se digirió con Miel y EcoRl para liberar el gen TrCel3A de 2235 pares de bases. El fragmento se purificó y se ligó en los sitios Nhel y EcoRI de YEp352/PGK91-l/ass6HNKE para obtener YEp352/PGK91-|l/ass6H-Cel3A (figura 1) .

Ejeaplo 4: Construcción de las bibliotecas PCR propensas a error Se generó una biblioteca de mutagénesis a .eatoria utilizando un método de polimerasa con ADN Mutazyme® II. Se ralizó una serie de cuatro PCR independientes utilizando 5, 10, 15, 20 ng del vector YEp352/PGK91-l/ocss6H-Cel3A y la polimerasa con ADN Mutazyme® II con los cebadores YalphaN21 y 3'PGK-term. La temperatura de fijación se ajustó a 50°C. La amplificación se realizó durante 20 ciclos. cuatro productos PCR se agruparon y diluyeron a 16 ng/pL. El vector YEp352/PGK91-l/ass6H-Cel3A se digirió con Miel y Kpñl y se aisló el fragmento con vector vacio. Este fragmento lineal y el amplicón final se transformaron simultáneamente y se clonaron mediante recombinación in vivo en la cepa de levadura BJ3505 (Butler, T. and Alcalde, M. 2003) .

YalphaN21 : 5'AGC ACA AAT AAC GGG TTA TTG (SEQ ID NO: 27 ) S'PGK-term: 5'GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC (SEQ ID NO: 28) Ejemplo 5: Expresión de las beta-glucosidasas \TrCel3A parenterales y modificadas a partir de cultivos en microplaca Este ejemplo describe la selección y expresión de TrCel3A a partir de Saccharomyces cerevisiae para utilizarse en un análisis de selección de alto rendimiento Los transformantes de S. cerevisiae se desarrollaron en placas que contuvieron medio completo sintético (SC: 2% de agar p/v, 0.17% de base de nitrógeno parea levadura p/v, 0.078% de suplemento con desprendimiento de Ura p/v, 2% de glucosa p/v, 2% de casaminoácidos p/v, 0.5% de sulfato de amonio p/v, pH 5.5) durante 4-5 días |a 30°C. Cada placa de crecimiento se replicó al transferir una porción de cada colonia, utilizando terciopelo esterilizado, a una placa de eliminación que contuvo medio SC más 0.1% de hidrato de esculina y 0.03% de FeCl3. Las colonias que se tornaron negras después de la incubación durante 3-4 días a 30 °C se identificaron como la expresión de la enzima activa. Las colonias se correlacionaron nuevamente a su placa de crecimiento original y se seleccionaron para los cultivos de expresión en medio liquido mediante la inoculación con palillos de 1 mL de medio SC en placas de 96 cavidades que contienen una perla de vidrio (1.5-2.0 mm) . Los cultivos de expresión se dejaron desarrollar durante 3 días a 30°C y 250 rpm con control de humedad. Los concentrados de glicerol se prepararon al transferir 0.050 mL de cultivo liquido a las cavidades correspondientes de una microplaca que contuvo 0.050 mL de 40% de glicerol y se almacenaron a -80°C. Las placas para cultivo de expresión se sometieron a centrifugación a 1600 x g guante 5 minutos para que las células se sedimentaran y el sobre-nadante se aspijró para análisis de selección.

Ejemplo 6: Selección de las bibliotecas génicas para las beta-gl cosidasas TrCel3A modificadas con estabilidad mejorada a bajo pH Este ejemplo describe la selección de la Trichoderma reesei TrCel3As modificada para estabilidad mejorada a bajo pH mediante la comparación con la TrCel3A original y que se había clonado en Saccharomyces cere isiae .

La TrCel3As modificada a partir de microcult.ivos de levadura, como se describe en el ejemplo 5, se pre-incubó utilizando dos condiciones distintas amortiguadas con 0.1 mL de citrato en un formato en placa PCR de 96 cavidades. Una alícuota del sobre-nadante proveniente de cada micro-cultivo se pre-incubó tanto a pH 5.0 como a pH 3.5 (amortiguador de citrato 200 mm) durante 30 minutos a 46°C. La actividad de la beta-glucosidasa residual de cada TrCel3A modificada se valoró al agregar una alícuota de la mezcla pre-incubada a 4-nitrofenil-p-D-piranósido 0.5 mM (pNPG) en amortiguador de citrato a pH 5.0 200 mm e incubación a 50°C durante 20 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de amortiguador de Na2C03 400 mm. La absorbancia se midió a 340 nm. En cada placa PCR de 96 cavidades se contuvieron seis controles TrCel3A parenterales utilizados para comparación.

Se calculó una proporción de estabilidad a pH 3.5/5 .0 para todos los TrCel3A modificados y TrCel3As parenterales dividir la actividad después de la pre-incubación a pH 3.5 entre la actividad después de la pre-incubación a pH ! .0. La proporción de estabilidad de pH 3.5/pH 5.0 para cada TrCel3A modificada se comparó con la proporción promedio de . os seis controles TrCel3A parenterales en cada placa y los p< isitivos se seleccionaron a un nivel de confianza del 95% ut: .lizando una prueba t. En la figura 4, se puede encontrar una | muestra de los datos provenientes de una placa de selección.| Todas las beta-glucosidasas TrCel3A modificadas positilvas se produjeron nuevamente en microcultivos y se volvieron a seleccionar para reducir el número de positivos falsos Ejemplo 7: Expresión de la TrCel3As parenteral y modificada a partir de cultivos a gran escala 500 mi de medio YPD estéril (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona, 20 g/L de glucosa) se inocularon con 10 mL de cultivos durante la noche de Saccharomyces cerevisiae transformado en el mismo medio que se había inoculado con las células recién recolectadas a partir de una placa de agar. El cultivo luego se incubó durante 96 | horas a 30°C con agitación vigorosa a 250 rpm.

Después de la incubación, los 500 mi de cultivo con levadura se sometieron a centrifugación durante 10 minutos a 16,000 x g y se desechó el sedimento de células de levadura.

Se siguió una captura de anticuerpos estándar ELISA | (Harlow and Lañe, 1988, p.564-565). Los filtratos de levadura se diluyeron con amortiguador de carbonato (pH 9.6) y se sometieron a ebullición durante 5 minutos antes del recubrimiento de la microplaca (Costar #9018). El anticuerpo His-tag primario (Sigma #H1029) y el anticuerpo secundario marcado de peroxidasa (Sigma #A4416) se utilizaron a una dilución de 1:2000.

Ejemplo 8: Caracterización de las beta-glucosidasas TrCel3A modificadas a bajo pH y alta agitación Los sobrenadantes del cultivo de levadura que contuvieron las TrCel3As parenterales y modificadas se recolectaron como se describió en el ejemplo 7 y se ajustaron a pH 3.0 o pH 5.0 con 10 mL de citrato 250 mm y amortiguadores de fosfato 500 mm en las proporciones 4:1 o 1:1, respectivamente. Las muestras luego se incuharon en matraces con divisiones a 30°C con agitación a 400 rpm. La concentración de TrCel3A para las diferentes muestras en cada análisis se normalizó a la muestra con la menor concentración. Medio usado libre de células proveniente de la fermentación de Saccharomyces que contuvo el vector vacio a un volumen total de 50 mi. La variación | de la concentración de TrCel3A en los análisis diferentes fue 4 10.8 pg/mL.

Las alícuotas se muestrearon durante un periodo de 96 horas y se midieron para la actividad en para-ni rofenil ß-D-glucopiranósido 0.4 mM (pNPG) en citrato 167 mM pH 5.0 a 50°C. La concentración de la enzima fue 1.9-4.3 µ?/ml. Se utilizó la pendiente del cambio de absorbancia a 340 nm (A340) como una medida de la actividad enzimática. Los datos se graficaron como una función de tiempo y se ajustaron con un primer modelo de deterioro de primer orden utili2;ando la función Solver en Microsoft Excel. Los intervalos de confianza del 95% del ajuste para los valores ki obtenidos se calcularon utilizando métodos estándar (Motuls y and Christopolous , 2003). Para cada TrCel3A modificada, el tau (en horas), gue es la inversa de la constante de inactivación ki, se comparó con la de la TrCel3A parenteral utilizando una prueba t bilateral, tipo 2.

Los resultados en la figura 5 y la tabla 2 muestran que las siguientes sustituciones de aminoácidos aumentaron el valor tau, y con esto mejoraron la estabilidad, de TrCel3A a bajo pH: V66I, S72N, V101M, T235S, N248K, N369K, ?386? .

Ejemplo 9: Determinación de la actividad enzimática de la beta-glucosidasas TrCel3A modificadas La concentración de la TrCel3A parenteral o modificado en filtrados de levadura se determinó mediante ELISA como se describió en el ejemplo 7.

La actividad enzimática de los filtros de cultivo de levadura que contuvieron las beta-glucosidasas TrCel3A parenterales y modificadas se midió en un análisis pNPG (pNPG 0.4 mM, citrato 50 mM pH 5.0, 50°C) como se describió D en el ejemplo 1. Para cada análisis de actividad, se agregó suficiente filtrado de cultivo de levadura a la solución de sustrato pNPG para llevar la concentración de |TrCel3A parenteral o modificada a una concentración final de 5 pg/ml [con base en las concentraciones determinadas mediante ELISA) y al cambio de absorbancia se supervisó a 340 nm. La pendiente inicial de la curva de producción pNP se determinó utilizando Microsoft Excel y se tomó como una medida de la actividad de la variante. Las actividades se midieron por triplicado y la actividad media de cada variante se comparó con la actividad media de la TrCel3A parenteral utilizando una prueba t (tipo 2, bilateral) .

Las actividades de las beta-glucosidasas TrCel3A modificadas y parenterales se graficaron contra el valor tau para cada uno en la figura 6. La actividad de las beta-glucosidasas TrCel3A modificadas que está dentro del 20% de la actividad de la TrCel3A parenteral que demuestra que las sustituciones de aminoácidos que conducen a una estabilidad mejorada no fueron perjudiciales para la actividad de la enzima .

Ejemplo 10: Construcción de las beta-glv.cosxda.sas \TrCel3A modificadas agregadas con múltiples sustituciones de aminoácidos Utilizando YEp352/PGK91-l/ccss6H-Cel3A-S72N como un molde, se introdujeron mutaciones adicionales utiliz.ando un método PCR de dos pasos que implican la síntesis de megacebadores seguida por PCR de megacebador utilizando la polimerasa iProof Taq de Alta Fidelidad (BioRad Los cebadores internos se modificaron para introduc]ir las sustituciones de aminoácidos deseadas en la estructura de TrCel3A. Los cebadores de plásmidos externos (YalphaN21 y 3'PGK-term) se utilizaron para amplificar el producto final. Los megacebadores y los productos finales se purificaron utilizando el Gel Wizard® SV y el Sistema PCR Clean-Up.

Tabla 3 : Generación de las enzimas TrCel3A modificadas agregadas mediante PCR 5 10 10 ±5r cuatro o cinco de las sustituciones de aminoácidos seleccionadas de V66I, S72N, V101M, N369K, A386T, exhibieron valores tau que son de 19 veces o hasta más de 200 veces mayores que el valor tau para la TrCel3A parenteral.

El vector que codifica para la TrCel3A modificada agregada que comprende las sustituciones de aminoácidos S72N, F96L, V101M, N369K, y A386T (YEp352/PGK91-l/ass6H-Cel3A-AT003) se utilizó como un molde para la mutagénesis de saturación en el sitio en el ejemplo 11. La |TrCel3A modificada agregada codificada por este vector (†rCel3A-AT003) se expresó en Trichoderma reesei como describe en el ejemplo 12 y el vector de levadura que codificaba para esta TrCel3A modifica agregada.

Ejemplo 11: Construcción de las bibliotecas de mutagénesis de saturación en el sitio Se seleccionaron cuatro posiciones de aminoácidos en TrCel3A (S72, V101, N369 y A386) para la mutagénesis de saturación en el sitio para encontrar un aminoácido que mejore adicionalmente la estabilidad a bajo pHj. La mutagénesis de saturación en el sitio se realizó mediante PCR (una reacción PCR de un solo paso y la ligación de ambos fragmentos) utilizando los cebadores NNS (listados más adelante) . El vector YEp352/PGK91-l/aSE6H-Cel3A-AT003 (S72N, F96L, V101M, N369K y A386T) se utilizó como molde, la PCR se realizó con la polimerasa de ADN iProof High-Fidelity (Biorad) y los fragmentos PCR se ligaron con la ligasa de ADN T4 (Fermentas) . Para cada posición se generó una biblioteca SSM, manteniendo las otras posiciones sin cambio en e.'. molde. La PCR para el fragmento 1 se realizó utilizando el cebador PGK y el cebador 3'-term externo complementario. La PCR para el segundo fragmento se realizó con el segundo cebador gue no contuvo NNS ni el cebador YalphaN21 externo complementario. No se realizó ningún paso de purificación y ambos fragmentos PCR amplificados se ligaron debido a que los cebadores se fosforilaron . Los amplicones ligados se clona]ron en YEp352/PGK91-l/ ss6HNKE utilizando el método de repar. ción de separación en la levadura. 5'P-GA TAC TCG ACA GGC NNS ACA GCC TTT ACG (SEQ ID NO, 29) 5 'P-GAA CAC CGA GGG GTC CGT CTT G (SEQ ID NO: 30) 5 'P C GGT GAG GAG NNS AAG GCC TCG G (SEQ ID NO: 31) 5'P-ATG AAC TGT CCA CGT TCG CGG (SEQ ID NO: 32) 5'P-G CCC TCG TGC NNS GAC AAA GGC TG (SEQ ID NO: 33) 5'P-GAG TTT CTG GCG TGG TI A C (SEQ ID NO: 34) 5'P-G GGT TCC GGC NNS GTC AAC TAT CC (SEQ ID NO: 35) 5' P-CAA CCC ATG CCC AAG GCC (SEQ ID NO: 36) Para realizar una reparación de separaciones, el vector YEp352/PGK91-l/ass6HNKE se digirió con Nhel y Kpnl y purificó sobre gel. La cepa BJ3505 de Saccháromyces sustituciones de aminoácidos S72N, F96L, V101M, N369 , y A386T (TrCel3A a AT003) se construyó como se describe más adelante. El ADN separador requerido para introducir sitios de restricciones únicos adicionales, MluI y No ti, se amplificó a partir de pCAMBIA1301 (véase URL: cambia . org/daisy/cambia/materials/vectors/585. html#dsy585_Description y Acceso GenBank No. AF234297) utilizando los cebadores AC168 y AC169 y se clonó en los sitios SacI/BamHI de pUC19 para forma pUC19-SP. El cásete de expresión, c/x-Cel6A-cbh2 , que contiene el promotor, ce!7a el gen de codificación ce!6a y el terminador cel6a se aisló del vector pC/X-S413P-TV (publicación de los Estados Unidos No. US2008-0076152A1) . El vector se digirió con la enzima de restricción Nüel , de extremo romo y se digirió con Xbal . Este fragmento luego se clonó en los sitios £coRV/Xbal para pUC19-SP para formar el vector pUC19-SP-c/xCel6A. Para construir el cásete de expresión TrCel3A-AT003 , el promotor cel7-xyn2 y la señal de secreción xyn2 se amplificaron utilizando los cebadores AC230 y AC231 y el vector pC/X-S413P-TV (publicación de los) Estados Unidos No. 2008-0076152A1) como un molde. La secuencia de codificación TrCel3A-AT003 se amplificó utilizando AC232 y AC233 y el vector YEp352/PGK91-l/ass6H-Cel3A-AT003 (ejemplo 10) como un molde. Los fragmentos generados tuvieron cortas secuencias idénticas superpuestas en el extremo 3' y 5' AC168 5 '-GCAGAGCTCGCGGCCGCGAACCGACGACTCGTCCGTC-3' (SEQ ID NO: 47) AC169 S'-CTGGGATCCGATATCACGCGTGTGACATCGGCTTCAAATGGC-S ' (SEQ ID NO: 48) AC230 5 ' -TTT ACGCGTG ATTATGGCGT ACTAGAGAGCGG-3 ' (SEQ ID NO: 49) AC231 5 -CTGC AGG AGGTAC AACCTGGCGCTTCTCCACAGCC ACGG-3 ' (SEQ DO NO. 50) AC232 5 -GTGG AG AAGCGCCAGGTTGTACCTCCTGCAGGGACTCCATG-3 ' (SEQ ID NO: 51 ) AC233 5 -TT GGTACCCTACGCTACCGACAGAGTGCTCG-3' (SEQ ID NO: 52) AC323 5 ' -TTTGCGGCCGCC ATC ATTCGTCGCTTTCGG-3 ' (SEQ ID NO: 53) AC343 5 '-TTCG ATCG ACT ATACCACCACCC ACCG-3 ' (SEQ ID NO: 54) 12.2. Transformación de Trichoderma reesei Las cepas BTR213aux y P107Baux de Trichoderma (ejemplo 2) se transformaron con el vector pc/xCel3A-AT003-pyr4 mediante bombardeo biolístico con partículas de oro utilizando el sistema PDS-1000/He (BioRad; E.I. DuPont de Nemours and Company) . Las partículas de oro (diámetro medio de 0.6 um, BioRad Cat . No. 1652262) se utilizaron como microportadores . Se utilizaron los siguientes parámetros en la optimización de la transformación: una presión de ruptura de 77.34 kg/cm2 (1100 psi) , una presión de helio de 29 mm de Hg, una distancia de separación de 0.95 cm, una distancia de viaje del microportador de 16 mm, y una distancia blanco de 9 cm. La suspensión de esporas se preparó mediante el lavado de esporas de T. reesei a partir de las placas PDA incubadas durante 4-5 días a 30°C con agua estéril. Se colocaron en placas aproximadamente 1 x 106 esporas en placas | con un diámetro de 60 mm que contuvieron medio mínimo de agir (MM Después del suministro de partículas, todas las placas de transformación se incubaron a 30°C durante 5-10 días. Los transformantes que surgieron en las placas de transformación se transfirieron a medio MM y se incubaron a 30°C. Los transformantes estables aislados se utilizaron para Análisis posterior .

Medio mínimo (MM) de Componente Cantidad para 1L de medio KH2P04 10 g (NH4 ) 2S04 6 g Na3Citrato--2H20 3 g FeS0-7H20 5 mg MnS04-H20 1.6 mg ZnS0 -7H20 1.4 mg CaCl2-2H20 2 mg Agar 20 g Glucosa f. s. al 20% 50 mi MgS04-7H20 f.s. 1 M 4 mL pH 5.5 12.3. Producción de TrCel36A-AT003 modificada en microcultivos Para identificar los transformantes que expresan la proteína TrCel3A modificada agregada, todos los transformantes estables aislados se desarrollaron en microcultivo. Aproximadamente 5000 esporas de G. reesei se inocularon en cada cavidad de un plato para cultivo de 24 cavidades (COSTAR) que contuvo 1 mi de medio de microcultivo de Trichoderma . Las placas se inocularon durante 5-7| días a 30°C con agitación vigorosa a 250 rpm.

Medio de microcultivo de Trichoderma Componente Concentración g/L Cóctel para inducción de celulasa 35 Sulfato de amonio 12.7 KH2P04 8.0 MgS04-7H2o 4.0 CaCl2-2H20 1.0 FeSO4-7H20 0.1 MnS04-7H20 0.032 ZnS04-7H20 0.028 CaC03 20 Licor de maíz macerado (polvo) 5 pM 4.24 ** cóctel para inducir celulasa que comprende, como una función de carbohidrato total, 56% de gentiobiosa, 14% de soforosa, 6% de celobiosa, 10% de trehalosa, 6% maltotriosa, 4% de glucosa y 14% de otros carbohidratos.

Los cultivos se transfirieron a tubos para microcentrifuga, las células se sedimentaron mediante microcentrifugación a 12,000 rpm, y los sobrenadantes del cultivo se transfirieron a tubos para microcentrifuga limpios. La concentración proteinica total de cada sobrenadante se midió mediante un análisis proteinico Bradford como se describió en el ejemplo 1. La concentración relativa de la TrCel3A modificada agregada producida mediante los transformantes se determinó mediante ELISA como sigue. Los sobrenadantes del cultivo y los estándares de componentes purificados se diluyeron 0.01-10 µ?/?a? (con base en la proteina total) en solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.2 (PBS) y se incubaron durante la noche a 4°C en placas microtituladoras (Costar EIA #9018) . Estas placas se lavaron con PBS que contuvo 0.1% de Tween-20 (PBS/Tween) y luego se incubaron en PBS que contuvo 1% de albúmina de suero bovino (PBS/BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas microtituladoras bloqueadas se lavaron con PBS/Tween. Los antisueros policlonales de conejo específicos para TrCel3A se diluyeron (1:16,000) en PBS/BSA, se agregaron a placas microtituladoras por separado y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado con peroxidasa de rábano picante (Sigma #A6154), se diluyeron 1/2000 en PBS/BSA, durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavado, se agregó tetrametilbencidina a cada placa y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia a 360 nm se midió en cada cavidad y se convirtió en la concentración proteínica utilizando la curva estándar TrCel3A. La concentración relativa de la proteína TrCel3A se calculó al dividir la concentración de TrCel3A entre la cantidad total de la proteína producida y los transfórmantes que poseen una abundancia de TrCel3A relativa aproximadamente 20-30% de la proteína total se seleccionaron para análisis en 14L de fermentación (tabla 3) .

Tabla 3. Niveles de expresión relativa Cel3A producidos mediante los transformantes de T reesei desarrollados en microcultivos con carbohidratos inducibles celulasa seleccionados para análisis adicional en 1 4L < fermentación Nombre de la cepa Cantidad relativa de Cel3A de proteina total P59G (control) 42.7 BTR213aux (hospedero) 6.0 BTRc)x-penta 54 29.1 BTRc)x-penta 46 54.3 BTRc)x-penta 69S 51.8 Pl07Baux (hospedero) 6.4 P107BcJx-penta 15S 36.1 P107BcJx-penta 22 42.9 Ejemplo 13: Producción de una mezcla de celulasa que comprende la TrCel3A modificada Las esporas de los transformantes de G. reesei seleccionados se inocularon en placas de Petri de 85 mm estándar que contienen dextrosa agar de papa (PDA) . Estas placas se incubaron a 30°C durante 5 días hasta alcanzar un crecimiento confluente de esporas verdes frescas. Para preparar el inoculo para la prueba de fermentación, las esporas provenientes de una placa PDA individual se transfirieron a 2L, un matraz Erlenmeyer con divisiones que contuvo 750 mi de medio Berkley liquido (pH 5.5) . Los matraces se inocularon a 28°C durante 3 días utilizando un agitador orbital (Modelo G-52 New Brunswick ic Co , que corrió a 100 rpm.

Medio Berkley para matraces Componente Concentración g/L ;NH4) 2so4 1.4 KH2P04 2.0 MgS04 ' 7H20 0.31 CaCl2 · 7H20 0.53 Licor de maíz macerado en seco Glucosa Elementos traza* 1 mL/L * La solución de elementos traza contiene 5 g/L de FeS04-7H20; 1.6 g/L de MnS04-H20; 1.4 g/L ZnS04 · 7H20 Los contenidos de cada matraz para inóculos se transfirieron a un recipiente de fermentación de escala piloto de 14L (Modelo MF114 New Brunswick Scientiflc Co . ) ajustado con 10L de medio inicial para fermentación Feb-Batch (pH 5.5). El recipiente se corrió en un modo por lotes hasta que la glucosa en el medio se redujo. En este punto, un cóctel para inducción de celulasa que comprende, como una función del carbohidrato total, 56% de gentiobiosa, 4% de soforosa, 6% de celobiosa, 10% de trehalosa, 6% de maltotriosa, 4% de glucosa y 14% de otros carbohidratos, se alimentó sobre una base continua desde un concentrado que fue 35% p/v de sólidos disueltos en agua. Se utilizaron bombas peristálticas para suministrar la fuente de carbono a una alimentación a una velocidad de 0.4 gramos de carbono por litro de cultivo por hora. Los parámetros funcionales durante ambas porciones de lote y alimentación por lote en la corrida fueron: mezclando mediante agitación por impulsora 500 rpm, aire que rocía a 8 litros estándar por minuto, y una temperatura de 28°C. El pH del cultivo se mantuvo a 4.0-4.5 durante el crecimiento por lotes y pH 3.0 o 5.0 durante la producción de celulasa utilizando un controlador automático conectado a una sonda de pH en línea y una bomba que permite la adición de una solución de hidróxido de amonio 'al 10% .

Periódicamente, se extrajeron muestras de caldo de 100 mL para análisis de biomasa y proteina. Después de 165 horas de un tiempo de fermentación, se recolectó 1L de médio de fermentación y se filtró para un análisis prqteinico adicional .

Medio inicial para fermentaciones alimentadas por loltes Componente Concentración g/L (NH4) 2S04 2.20 KH2P04 1.39 MgSO„ · 7H20 0.70 CaCl2 · 7H20 0.185 Licor de maíz macerado 6.00 Glucosa 13.00 Elementos traza* 0.38 mL/L * La solución de elementos traza contiene 5 g/L de FeS04-7H20; 1.6 g/L de MnS04-H20; 1.4 g/L ZnS04 · H20 La concentración proteinica total de los filtrados de fermentación final se midieron mediante análisis Bradford como se describe en el ejemplo 1. La concentración de las enzimas tipo TrCel3A en los filtrados de fermentación final se midió mediante ELISA como se describió en el ejempjJo 12.3.

Ejemplo 14: Análisis de la actividad de celobiasa específica de las beta-glucosidasas TrCel3A parenterales y modificadas producidas en fermentaciones a pH 3.0 y pH 5.0 Este ejemplo demuestra que la actividad especifica relativa, en este caso, la actividad especifica de .'.a beta-glucosidasa producida en fermentaciones de Trichoderm reesei conducidas a pH 3.0 dividido entre la actividad especifica de la beta-glucosidasa producida en las fermentaciones de Trichoderma reesei conducidas a pH 5.0, es mayor para la TrCel3A-AT003 modificada agregada (TrCel3A con las sustituciones de aminoácidos S72N, F96L, V101M, N369K, y A386T) distintas para la TrCel3A parenteral.

Se utilizaron análisis de velocidad inicial para medir la actividad especifica de la TrCel3A parenteral y la beta-glucosidasa TrCel3A-AT003 modificada agregada en las mezclas de celulasa producidas a partir de las fermentaciones de Trichoderma reesei conducidas a pH 5.0 ó 3.0, sobre celobiosa. Las mezclas de la enzima de celulasa que comprenden las beta-glucosidasas se incubaron con celobiosa 30 mm en amortiguador de citrato 50 mm a pH 5.0. Se utilizaron seis diluciones de la mezcla de celulasa, que varia de 1000 hasta 6000 veces. Las muestras se incubaron a 50°C durante 30 minutos en placas de cavidades profundas y luego se colocaron en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos para detener la reacción. La concentración de glucosa producida en cada dilución de la mezcla de celulasa se midió utilizando un sistema acoplado con glucosa xidasa/ peroxidaza de rábano picante (Trinder P., 1969) . La actividad especifica, en IU/mg, se determinó al dividir el número de pmoles de glucosa producidos por la duración del ensayo, 30 minutos, y luego entre el número de miligramos de la enzima tipo TrCel3A presente en la reacción. La concentración de la enzima tipo TrCel3A (parenteral o agregado modificado) en cada experimento se determinó utilizando la concentración proteinica de la enzima cruda, como se determinó por el método Bradford como se describió en el ejemplo 1, y el contenido de la enzima tipo TrCel3A fraccional de cada filtrado de cultivo, como se determinó mediante el ELISA como se describió en el ejemplo 13. Las determinaciones de actividad especifica se realizaron por triplicado.

Como se muestra en la figura 9, la actividad de colobiasa especifica de la enzima de beta-glucosida sa tipo TrCel3A producida a pH 3.0 dividida entre la actividad de celobiasa especifica de la enzima de beta-glucosidasa tipo TrCel3A producida a pH 5.0 es significativamente superior para la TrCel3A-AT003 agregada producida mediante los transformantes de las cepas hospederas BTR213aux o P107Baux que para la TrCel3A parenteral producida mediante la cepa control P59G. Por lo tanto, la beta-glucosidasa TrCel3A-AT003 es más estable bajo las condiciones de pH bajo, bastante aereadas y bastante agitadas de las fermentaciones de Trichoderma reesei que es la TrCel3A parenteral.

Ejemplo 15: Estabilxdad de la TrCel3A modificada y parenteral bajo condiciones que imitan aquellas | de la reacción de hidrólisis de celulosa Este ejemplo demuestra que la estabilidad de la TrCel3A modificada agregada se mejora a pH reducido a una temperatura de hidrólisis estándar, se mejora a una mayor temperatura a pH estándar, y se mejora bajo condiciones tanto de temperatura aumentada como pH reducido.

Las cepas de Trichoderma que utilizan mezclas de celulasa que comprenden las variantes TrCel3A modificadas parenterales y agregadas se fermentaron a pH 5.0 ¡como se describió en el ejemplo 13. Se prepararon muestras de 10 mL de mezclas de celulasa ajustada por pH en tubos, para centrifugación de vidrio con tapa roscada de 35 mL a través de la adición de 9 mL de una mezclas de celulaza a |1 mL de amortiguador de citrato 1.0 M, pH 5.0, 4.0, 3.5 y 3.0! Estas muéstras se incubaron a 50°C o 60°C en incubadoras calentadas por aire con agitación vigorosa orbital de 250 rpm. Las muestras se extrajeron a 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 11.5, 24 5, 74 y 98 horas y se analizaron para la actividad de beta- glucosidasa utilizando el método pNPG descrito en el ejemplo 1.

Como se muestra en la figura 10 y en la tabla 4, la beta-glucosidasa TrCel3A-AT003 modificada agregada fue significativamente más estable que la TrCel3A parenteral a 50°C y pH 3.5 ó 3.0 y a 60°C a todos los pH probados. Estos resultados sugieren que las sustituciones de aminoácidos en TrCel3A-AT003 (S72N, F96L, V101M, N369K, y A386T) confieren estabilidad mejorada a bajo pH y a temperatura elevada.

Tabla 4 : Estabilidad de la TrCel3A parenteral y la TrCel3A-AT003 modificada agregado a bajo pH y temperatura elevada Tau (h) 50°C PH TrCel3A TrCel3A-AT0( )3 5.0 1000 1000 4.0 761 800 3.5 22.4 322 3.0 1.13 17.0 60°C pH TrCel3A TrCel3A-AT0( )3 5.0 130 639 4.0 12.6 176 3.5 2.20 11.9 3.0 0.224 1.38 La presente invención se ha descrito con respecto a una o más modalidades. Sin embargo, será evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden realizar diversas variaciones y modificaciones , sin apartarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones .

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Una beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de V66X, S72X, V101X, T235X, N248X, N369K, N369P y A386X, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de la beta-glucosidasa TrCel3A modificada comprende una secuencia que es entre aproximadamente 80% hasta aproximadamente| 99.9% idéntica a la SEQ ID NO: 1.

2. Una beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de V66I, S72E, S72N, F96L, V101M, T235S, N248K, N369K, N369P y A386T, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de la beta-glucosidasa TrCel3A modificada comprende una secuencia que es entre aproximadamente 80% hasta aproximadamente! 99.9% idéntica a la SEQ ID NO: 1.

3. La beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada de conformidad con cualquiera |de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de la beta-glucosidasa TrCel3A modificada comprende una secuencia que es entre aproximadamente 90' hasta aproximadamente 99.9% idéntica a la SEQ ID NO: '.

4. La beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada de conformidad con la reivindica!ción 3, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente 95% hasta aproximadamen' e 99.9% idéntica a la SEQ ID NO: 1.

5. La beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada de conformidad con cualquiera | de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada exhibe al menos una mejora de 2 veces en la estabilidad, con relación a una beta-glucosidasa TrCel3A parenteral de Trichoderma reesei a partir de la cual se deriva, cuando se incuba en una solución acuosa a un pH entre aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 4.5.

6. La beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada exhibe un aumento en la estabilidad entre aproximadamente 2 | veces y aproximadamente 500 veces, con relación a la beta-glucosidasa TrCel3A parenteral de Trichoderma reesei a partir de la cual se deriva, cuando se incuba en una solución acuosa a un pH entre aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 4.5.

7. La beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada de conformidad con cualquiera | de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de V43X, F96X, F260X, e I543X.

8. La beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque una o más de las sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste ce V43I, V43C, F96L, V101A, V101G, F260I, F260V, F260Q, F260D, I543N, I543W, I543A, I543S, I543G, e I543L.

9. La beta-glucosidasa TrCel3A de Trithoderma reesei modificada de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizada porque la solución acuosa se somete a aireación a una velocidad superficial de gas entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100 cm/s, agitación mediante agitación vigorosa entre aproximadamente 300 hasta aproximadamente 1000 rpm, o agitación mediante agitación normal con un impulsor a una velocidad de rotación entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 10 m/s .

10. La beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizada porque la solución acuosa se somete a aireación a una velocidad superficial de gas entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 5 vvn, o agitación en un biorreactor entre aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 15 hp/378.54 litros (100 galones).

La beta-glucosidasa TrCel3A de [choderma reesei modificada de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la beta-glucosidasa TrCe (L3A de Trichoderma reesei modificada exhibe una mejora en la estabilidad de al menos 2 veces, con relación a una beta-glucosidasa TrCel3A parenteral de Trichoderma reesei á partir de la cual se deriva, cuando se incuba en una solució:i acuosa a un pH entre aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 4.5 y una temperatura entre aproximadamente 30°C y 60°C.

12. Un constructo genético aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma | reesei modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. El constructo genético aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende secuencias de ácido nucleico reguladoras que dirigen la expresión y secreción de la beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada.

14. Un microbio modificado genéticamente aislado caracterizado porque comprende el constructo genéltico de conformidad con la reivindicación 12 ó 13.

15. El microbio modificado genéticamente aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el microbio es una especie de levadura u hongo filamentoso.

16. El microbio modificado genéticamente aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el microbio es Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma reesei

17. Un proceso para producir una beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada, caracterizado porque comprende los pasos de cultivar el microbio modificado genéticamente de conformidad con la reivindicación 14, bajo condiciones que induzcan la expresión y secreción de a beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada y recuperar la beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada del medio de cultivo.

18. Un proceso para hidrolizar un sustrato de celulosa caracterizado porque comprende poner en contacto del sustrato con una mezcla de celulasa que comprende la beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modifióada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

19. El proceso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el sustijato de celulosa es una materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada .

20. Un proceso para producir una beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei, caracterizado porque comprende los pasos de (i) transformar células hospederas fúngales con un constructo genético de conformidad como se define en la reivindicación 12, para producir cepas ::ungales recombinantes; (ii) seleccionar las cepas fúngales recombinantes que expresan la beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada; y (iii) cultivar las cepas recombinantes seleccionadas en fermentaciones sumergidas en líquido bajo condiciones que induzcan la expresión de la beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada.

21. Una beta-glucosidasa TrCel3A de Trichoderma reesei modificada caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos según se define en las seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 2 (TrCel3A-V66I ) ; SEQ ID NO: 3 (TrCel3A-S72N) ; SEQ ID NO: 5 (TrCel3A-V101M) SEQ ID NO: 6 (TrCel3A-T235S) SEQ ID NO: 7 (TrCel3A-N248K) SEQ ID NO: 8 (TrCel3A-N369K) SEQ ID NO: 9 (TrCel3A-A386T) SEQ ID NO: 10 (TrCel3A-V66l-S72N) ; SEQ ID NO: 11 (TrCel3A-S72N-F96L-V101M) ; SEQ ID NO: 12 (TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K) ; SEQ ID NO: 13 (TrCel3A-S72N-V101 -N369K-A386T) ; SEQ ID NO: 14 (TrCel3A-V66I-S72N-V101 -N369K-A386T) ; SEQ ID NO: 15 (TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369K-A386T) ; SEQ ID NO: 16 (TrCel3A-V66l-S72N-F96L-V101M-N369K-A386;T) SEQ ID NO: 4 (TrCel3A-S72E-F96L-V101M-N369K-A386T) ; o SEQ ID NO: 55 (TrCel3A-S72N-F96L-V101M-N369P-A386T) .