CN106459942B - 具有增强活性的外切葡聚糖酶变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及参与分解木质纤维素生物质的酶的表达和优化。本发明具体涉及里氏木霉的外切葡聚糖酶1的变体以及所述具有增强功效的变体在用于分解纤维素和用于生产生物燃料的方法中的用途。

Description

具有增强活性的外切葡聚糖酶变体及其用途
由于大量原料的可利用性和乙醇作为燃料的优势，用纤维素生产乙醇的可能性已经得到很大的关注。用于这类工艺的基于纤维素的天然原料被称为“生物质”。已经将许多类型的生物质，例如木材、农业残余物、草本作物和城市固体垃圾，考虑作为生产生物燃料的潜在原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。
纤维素是由β-1,4键连接的葡萄糖分子组成的聚合物，其对分解或解聚合非常有耐性。一旦纤维素转化为葡萄糖，后者容易用酵母发酵成生物燃料，如乙醇。
研究的用于将纤维素转化为葡萄糖的最古老的方法是基于酸水解。该工艺可以在浓酸或稀酸的存在下进行。然而，几个缺点(例如当使用浓酸时酸回收率很差，以及使用稀酸的情况下葡萄糖的产量低)对于酸水解工艺的经济性是不利的。
为了克服酸水解工艺的缺点，最近的纤维素转化工艺已经更多地与使用纤维素酶类型的酶的酶促水解相关。然而，该木质纤维素生物质(如纤维素)的酶促水解的缺点是其工业生产工艺较为昂贵。因此，有必要使用日益有效的分泌纤维素酶的微生物菌株。在这方面，很多微生物包含水解纤维素的酶，例如真菌-木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergilus)、腐质霉属(Humicola)、或镰刀菌属(Fusarium)，以及细菌例如高温单孢菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌属(Bacilus)、纤维单胞菌属(Celulomonas)和链霉菌属(Streptomyces)。由这些微生物分泌的酶具有用于将纤维素转化为葡萄糖的三种不同类型的活性，可以分为三组：随机攻击纤维素纤维内部的内切葡聚糖酶，攻击纤维末端释放纤维二糖的外切葡聚糖酶，和将该纤维二糖水解为葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。其他类型的酶，例如半纤维素酶或最近发现的一类多糖单加氧酶也可以在水解功效中起作用。
工业上强烈需要降低酶促水解的成本，而这种降低涉及使用降低的酶剂量，从而使用更有效的酶鸡尾酒。因此，一些专利申请描述了活性高于里氏木霉(Trichodermareesei)的天然酶或通过基因工程改进的变体。可以提及的有涉及外切葡聚糖酶的专利申请US2010304464、WO 2010/066411和WO 2013/029176，涉及内切葡聚糖酶的申请WO 2007/109441、WO 2012/149192和WO 2010/076388，涉及β-葡萄糖苷酶的申请WO 2010/029259、WO2010/135836或WO 2010/022518，或涉及多糖单加氧酶的申请WO 12135659和WO 12149344。
主要基于结构标准，水解木质纤维素生物质的酶在CAZy系统中分类(Cantarel,B.L.,Coutinho,P.M.,Rancurel,C.,Bernard,T.,Lombard,V.,&Henrissat,B.(2009).TheCarbohydrate-Active EnZymes database(CAZy):an expert resource forGlycogenomics.Nucleic acids research,37,D233-8)。外切葡聚糖酶可属于GH 6、7、9、48和74家族。
为了使木质纤维素生物质水解有效且具有经济效益，酶混合物必须包含平衡比例的具有各种酶活性的酶，特别包括但不排除外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶类型。举例而言，在里氏木霉的天然混合物中，一般注意到存在60-70％的外切葡聚糖酶、15-20％的内切葡聚糖酶、几个百分点的半纤维素酶和约的5-10％的β-葡萄糖苷酶。该混合物适于以可接受的收率水解大部分经预处理的物质(例如在酸条件下汽爆的小麦秸秆类型)。在混合物中已经存在相当比例的外切葡聚糖酶表明，增加这些酶的量而不损害其他内切葡聚糖酶、半纤维素酶和葡萄糖苷酶的活性将非常困难。里氏木霉的基因组包含两种外切葡聚糖酶，一种来自家族6(CBH2,cel6a)，另一种来自家族7(CBH1,Cel7a)。这两种外切葡聚糖酶分别将纤维素的非还原(EC3.2.1.176)和还原(EC3.2.1.91)末端水解为纤维二糖。
水解和发酵可以根据各种方案进行。最常见的由独立的水解和发酵(SHF)组成。该方法能够通过维持最佳反应条件来优化各个步骤。该发酵在约28℃至约30℃的温度即时进行，而水解一般在至少45℃的温度进行。然而，在SHF中，在反应结束时释放的糖浓度非常高，导致对酶的抑制，降低了该方法的效率。为了避免这些缺点，可以设想另一种方法。在SSF(同时发生的糖化和发酵)中，两个步骤(己糖的水解和发酵)同时发生，防止糖积聚到抑制酶的浓度。由于使用单一反应器，投资成本也降低了。由于没有抑制，水解率更高，因为释放的糖立即被用于发酵成乙醇。在该方法中，反应器的温度必然在水解和发酵的最佳温度之间形成平衡，一般在约30℃至约35℃。然而，纤维素分解酶的活性在该温度降低约30％。
SSF也允许分解纤维素的酶在发酵糖的生物中表达，从而能够限制，或在极端情况下消除在单独步骤产生的酶的来源。
因此，获得在水解和发酵的最佳温度(即，30℃-50℃)下保留有效的外切葡聚糖酶活性的酶，同时保持混合物中所有酶的比例，对将木质纤维素生物质转化为生物燃料的工艺而言是显著的增益。
本发明人已经开发了具有增强的外切葡聚糖酶活性的多肽，尤其是与序列SEQ IDNO：2的CBH1参考蛋白的外切葡聚糖酶活性相比。CBH1对应于来自里氏木霉的外切葡聚糖酶1。
在这方面，值得赞扬的是，申请人在大量研究后已经分离或纯化与CBH1参考蛋白(SEQ ID NO：2)的外切葡聚糖酶活性相比，外切葡聚糖酶活性增强的多肽。
因此，本发明涉及选自以下的多肽：
i.选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和
ii.与序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20之一相比具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％百分比的相同残基(或同一性百分比)的氨基酸序列。
优选的，上述多肽的特征在于，其在发酵生物中的表达至少与CBH1参考蛋白(SEQID NO：2)的表达相等。
根据本发明，给定序列相对于SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18或20的同一性百分比对应于该给定序列与SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18或20之间相同的残基数除以SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18或20的残基数。
在一个优选的实施方案中，在约35℃和/或约50℃的温度下，与氨基酸序列SEQ IDNO：2的CBH1多肽的外切葡聚糖酶活性相比，本发明的多肽的外切葡聚糖酶活性增强至少10％，优选至少20％，优选至少30％，甚至更优选至少40％。
例如，本领域技术人员将能够使用底物例如纤维素
Figure BDA0001181993490000041
纤维素PASC或“Walseth”，或使用显色底物(对硝基苯基糖苷)例如pNP乳糖苷来测定酶活性的增加，或换言之增强。将分别通过释放的还原糖或硝基苯酚的比色法分析来显示酶活性。
本领域技术人员能够用来测定根据本发明的多肽与CBH1参考蛋白(SEQ ID NO：2)相比，酶活性是否增强的实验方案的一个实例如下：
–制备表达根据本发明的重组酶的解脂耶罗维亚酵母(Y.lipolytica)的原种培养物，于28℃过夜；
–用一定体积的原种培养物接种表达培养基使其在培养开始时在600nm的OD为0.2；
–于28℃培养所述细胞96小时；
–在8000rpm离心5分钟；
–于35℃和50℃用100μl含有1％还原纤维糊精(CD)的pH6的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液孵育100μl上清液24小时；
–取出100μl反应液；
–加入100μl DNS试剂；
–于100℃孵育5分钟；
–在冰上孵育3分钟；
–在3000rpm离心10分钟；
–用150μl在540nm读取OD。
下表1包含来自里氏木霉的CBH1(“野生型”)、来自柄篮状菌(Talaromycesstipitatus，TS)和来自费氏新萨托菌(Neosartorya ficheri，NF)的推定的外切葡聚糖酶的核酸和肽序列，以及本发明的多肽和核酸的鉴定。
表1：增强的克隆和亲本基因
克隆 核酸 多肽
cbh1(野生型) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2
32F9 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4
64C2 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6
130G9 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8
224C11 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10
225B11 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12
242D11 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14
453E8 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16
B SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18
91D9 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20
NF基因 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22
TS基因 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24
本发明的一个主题还是编码至少一种如上所述多肽的纯化或分离的核酸。
优选的，所述纯化或分离的核酸选自以下序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQID NO:19。
根据本发明，如上所述的核酸可以与启动子、终止子或其在宿主细胞中的表达所需的任何其他序列功能性连接。
本发明还涉及包含至少一个如上所述的核酸的载体。
根据本发明，术语“载体”意欲是指可能在其中插入外源核酸片段的任何DNA序列，载体能够将外源DNA引入宿主细胞。作为载体，可以提及(不排除其他)：质粒、黏粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、衍生自P1噬菌体的人工染色体(PAC)或来自病毒的载体。
根据本发明的载体还可以携带可选择标志物。术语“可选择标志物”意欲是指其表达赋予包含它的细胞使得能够选择它们这一特征的基因。例如抗生素抗性基因。
本发明的一个主题还是包含至少一种如上所述的多肽、或至少一种如上所述的核酸、或至少一种如上所述的载体的分离的宿主细胞。
本领域技术人员将能够通过熟知的常规方法将如上所述的多肽之一、核酸之一或载体之一引入宿主细胞。例如，可以提及氯化钙处理、电穿孔或使用基因枪。
根据一个实施方案，本领域技术人员将能够通过常规方法将编码根据本发明的具有增强的外切葡聚糖酶活性的多肽的核酸的几个拷贝引入宿主细胞。
根据一个实施方案，如上所述的分离的宿主细胞选自：木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergilus)、脉胞菌属(Neurospora)、腐质霉属(Humicola)、毁丝霉属(Myceliophthora)、金孢子菌属(Chrysosporium)、青霉属(Penicilium)、镰刀菌属(Fusarium)、高温单孢菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌属(Bacilus)、假单包菌属(Pesudomonas),埃希氏菌属(Escherichia)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、纤维单胞菌属(Celulomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces)。
根据一个优选的实施方案，如上所述的宿主细胞选自：里氏木霉、Trichodermaviridae、康氏木霉(Trichoderma koningi)、黑曲霉(Aspergilus niger)、构巢曲霉(Aspergilus nidulans)、文氏曲霉(Aspergilus wenti)、米曲霉(Aspergilus oryzae)、海枣曲霉(Aspergilus phoenicis)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermopila)、Chrysosporium lucknowense、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、灰腐质霉(Humicolagrisae)、嗜松青霉(Penicilium pinophilum)、草酸青霉(Penicilium oxalicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、糖解梭菌(Clostridium saccharolyticum)、拜氏梭菌(Clostridium benjerincki)、丁酸梭菌(Clostridium butylicum)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolityca)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
根据一个优选的实施方案，如上所述的分离的宿主细胞选自里氏木霉和酿酒酵母。
本发明的一个主题还是如上所述的至少任何一种多肽用于纤维素水解的用途。
本发明的一个主题还是如上所述的至少任何一种多肽用于生产生物燃料的用途。
根据本发明，术语“生物燃料”可以定义为来自生物质转化且可以用于能量目的的任何产物。首先，不希望被限制于此，可以提及的实例有生物气、可引入燃料(任选地在随后转化之后)或其本身可以作为燃料的产物，例如醇(乙醇、丁醇和/或异丙醇，取决于所用发酵生物的类型)、溶剂(丙酮)、酸(丁酸)、脂质及其衍生物(短链或长链脂肪酸、脂肪酸酯)和氢。
优选的，根据本发明的生物燃料是醇，例如乙醇、丁醇和/或异丙醇。更优选的，根据本发明的生物燃料是乙醇。
在另一个实施方案中，生物燃料是生物气。
在另一个实施方案中，产物是在化学工业中具有优势的分子，例如另一种醇，诸如1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丙二醇或2,3-丁二醇，有机酸例如乙酸、丙酸、丙烯酸、丁酸、琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸或衣康酸，或羟基酸例如乙醇酸，羟基丙酸或乳酸。
制备用于木质纤维素水解的酶鸡尾酒的一个实施方案描述如下。
在碳基底物例如乳糖或葡萄糖(选择用于微生物生长)存在下，在发酵器中培养能够表达至少一种根据本发明的多肽的丝状真菌(优选木霉属，更优选里氏木霉)的菌株。在一个实施方案中，取决于其性质，所述碳基底物在灭菌之前引入发酵器，或单独灭菌并在发酵器灭菌后引入发酵器，从而获得20-35g/l的初始浓度。
然后加入含有选择用于生产酶的底物的水性溶液。最后通过将培养基离心回收真菌产生的作用于木质纤维素生物质的酶组合物。该组合物特别包含根据本发明的β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。
在一个实施方案中，含有选择用于生产酶的底物的水性溶液以200-250g/l的浓度制备。该溶液优选还包含诱导底物，例如乳糖。在初始碳基底物耗尽后注入该水性溶液，以提供35-45mg/g细胞的最佳量(分批进料)。在该分批进料阶段期间，培养基中糖的残留浓度小于1g/l，通过真菌分泌作用于木质纤维素生物质的酶。所述酶可以通过离心培养基来回收。
本发明的一个主题是能够作用于木质纤维素生物质的酶组合物，所述酶组合物由丝状真菌产生，且包含至少任何一种如上所述的多肽。
术语“丝状真菌”特别意欲是指木霉属，更优选里氏木霉。
最后，本发明的一个主题是用于从生物质生产生物燃料的方法，包含以下连续步骤：
–将待水解的生物质悬浮于水相中；
–在如上所述的酶组合物存在下水解木质纤维素生物质，以产生含有葡萄糖的水解物；
–在发酵生物存在下发酵水解物的葡萄糖，以产生发酵液；
–将生物燃料与发酵液分离。
在一个实施方案中，待水解的生物质以6％-40％，优选20％-30％的固体量悬浮于水相。将pH调节至4-5.5，优选4.8-5.2，温度为40-60℃，优选45-50℃。通过加入作用于木质纤维素生物质的酶组合物启动水解反应，通常使用的量是10-30mg分泌蛋白/g预处理底物，或更少。反应通常持续15-48小时。反应之后分析释放的糖，尤其是葡萄糖。通过过滤或离心然后在发酵单元中处理将糖溶液与未水解的固体部分(主要由木质素组成)分离。
在发酵步骤后，例如通过蒸馏将生物燃料与发酵液分离。
本发明的另一个主题是用于从生物质生产生物燃料的方法，其特征在于，它包含以下连续步骤：
–将待水解的生物质悬浮于水相中；
–向悬浮液同时加入如上所述的作用于木质纤维素生物质的酶组合物和发酵生物，发酵混合物以产生发酵液；
–将生物燃料与发酵液分离。
优选的，同时加入酶组合物和发酵生物，然后在30-35℃的温度下孵育以产生发酵液。
根据该实施方案，根据本领域技术人员已知的SSF(同时发生的糖化和发酵)方法，将存在于生物质中的纤维素转化为葡萄糖，同时，在同一反应器中，发酵生物(例如酵母)将葡萄糖转化为最终产物。取决于发酵生物的代谢和水解能力，可能需要加入或多或少显著量的外源细胞裂解混合物以使操作正确进行。
在另一个实施方案中，发酵生物通过分泌或在其细胞表面产生本发明主题的多肽，任选和作用于木质纤维素生物质的其他酶一起，从而限制或消除对由丝状真菌产生的酶的需要。优选的，发酵生物是如上所述的宿主细胞。
优选的，加入产生酶组合物的宿主细胞和/或发酵生物，然后在30-35℃的温度下孵育以产生发酵液。
因此，使用根据本发明的具有更好外切葡聚糖酶活性的多肽具有以下优势：获得更好的葡萄糖生产收率，同时使用比之前更少的酶，从而还具有经济上的优势。
本发明的其他方面、主题、优势和特征将通过实施例和附图1-8的方式阅读以下描述本发明优选实施方案的非限制性描述展示。
附图说明
图1是显示用于筛选的DP3-DP11纤维糊精的MALDI-TOF质谱图。
图2是表明由纯克隆分泌的酶产生的水解圈的照片，所述纯克隆是在Walseth培养皿上在筛选里氏木霉期间分离的。
图3是比较里氏木霉克隆、CL847参考菌株、CL847ΔCBH1参考菌株、分离的130G9变体(SEQ ID NO：8)的纯克隆No.6和No.20的分泌蛋白质组的二维电泳凝胶。
图4是比较里氏木霉克隆：CL847参考菌株、CL847ΔCBH1参考菌株和分离的453E8变体(SEQ ID NO：16)的纯克隆No.24的分泌蛋白质组的二维电泳凝胶。
图5是显示453E8-24鸡尾酒(衍生自表达453E8变体(SEQ ID NO：16)的菌株No.24)和补充有β-葡萄糖苷酶的CL847参考鸡尾酒的SHF结果的图。
图6是显示130G9-6和130G9-20鸡尾酒(衍生自表达130G9变体(SEQ ID NO：8)的菌株No.6和No.20)和补充有β-葡萄糖苷酶的CL847参考鸡尾酒的SHF结果的图。
图7是显示453E8-24鸡尾酒(衍生自表达453E8变体(SEQ ID NO：16)的菌株No.24)和补充有β-葡萄糖苷酶的CL847参考鸡尾酒的SSF结果的图。
图8是显示两个鸡尾酒130G9-6和130G9-20(衍生自表达130G9变体(SEQ ID NO：8)的菌株No.6和No.20)和补充有β-葡萄糖苷酶的CL847参考鸡尾酒的SSF结果的图。
具体实施方式
实施例1：制备DP3-11还原纤维糊精
1-纤维素水解
(改编自Y-H.Percival Zhang,L.R.Lynd Analytical Biochemistry 322(2003),225-232.)
Figure BDA0001181993490000101
向160ml冷却至0℃的盐酸溶液分批加入20g纤维素(Avicel,CAS Number 9004-34-6,Sigma-Aldrich Saint-Quentin Fallavier)，并剧烈搅拌。分几个步骤(4×10ml)向该溶液中加入预先冷却的硫酸。将该反应于24℃保持搅拌4小时，然后倒入冷却至-20℃的0.8l丙酮。搅拌2小时后，过滤出沉淀物，取400ml冷却的丙酮，然后再次过滤。然后将固体置于600ml水中，搅拌过夜以溶解纤维糊精(CD)。过滤出固体后，用300g Amberlite IRA400OH-树脂中和含有纤维糊精的可溶部分，然后冻干。然后在过滤前，在超声存在下，将冻干物重悬于500ml甲醇中30分钟以溶解低分子量的糖，然后再次冻干以获得6.8gDP3-11纤维糊精。对于筛选，选择具有最高可能分子量的底物进行，以尽可能模拟纤维素的结构。然而，高分子量的纤维糊精是不可溶的，这使该测试不容易重复。
因此，选择DP5-7的纤维糊精，这表示所需的高分子量和纤维糊精的溶解度之间的良好平衡。
图1表示根据如上所述的方法一般获得的MALDI-TOF质谱。
图1表明，分离的寡糖主要是DP5-7。
2-纤维糊精的还原
在稀释于120ml水的2g DP3-11纤维糊精中加入400mg硼氢化钠。在室温下搅拌3小时后，加入Amberlite H+IR 120树脂中和溶液，过滤，然后冻干，以获得2g定量还原的纤维糊精(C.Schou,G.Rasmussen,M-B.Kaltoft,B.Henrissat,M.SchuleinEur.J.Biochem.217,947-953(1993))。
用BCA(二喹啉甲酸)分析分离的纤维糊精能够确认末端的完全还原(Y.-H.Percival Zhang,L.R.Lynd Biomacromolecules 2005,6,1510-1515)。
实施例2：通过L-洗牌(shuffling)的进化
将里氏木霉的纤维二糖水解酶1基因(cbh1，SEQ ID NO：1)用与cbh1亲本基因分别具有62％和61％同源性的来自柄篮状菌ATCC10500(TS，SEQ ID NO：23)的纤维二糖水解酶基因和来自费氏新萨托菌NRRL 181(NF,SEQ ID NO:21)的纤维二糖水解酶基因根据专利EP1104457中所述的专利方法进行一轮L-洗牌。
1-高通量筛选
开发高通量筛选试验以选择由L-洗牌产生的最佳克隆，即，与cbh1参考酶(SEQ IDNO：2)相比，显示纤维二糖水解酶活性增强至少20％的那些。
高通量筛选试验实验根据以下步骤进行：
–在琼脂上分离表达根据本发明的酶的L-洗牌变体的解脂耶罗维亚酵母的克隆，并于28℃在YNB casa培养基(酵母氮基1.7g/l、NH4Cl 10g/l、葡萄糖10g/l、酪蛋白氨基酸2g/l,pH 7)中预培养所述克隆36小时；
–用所述预培养接种补充有12.5μg/ml的四环素的5％YTD培养基(酵母提取物10g/l、胰蛋白胨20g/l、葡萄糖2.5g/l,pH 6.8)，然后于28℃孵育20小时；
–用之前的培养物接种含有20g/l量的诱导剂(油酸)的10％表达培养基，然后于28℃孵育96小时；
–在1500rpm离心5分钟；
–取出100μl上清液；
–加入100μl在0.1M柠檬酸磷酸缓冲液(pH6)中的1g/l的还原CD，
–于50℃孵育17小时；
–在2500rpm离心5分钟；
–取出80μl上清液；
–加入80μl DNS试剂；
–于105℃孵育12分钟，然后在冰上孵育5分钟；
–用120μl在540nm读取光学密度(OD)。
在这些筛选条件下，发现一些克隆中的纤维二糖水解酶活性与cbh1参考酶(SEQID NO:2)相比增强(540nm的OD增加)，特别包括32F9、64C2、130G9、224C11、225B11和453E8克隆(分别SEQ ID NO:4、6、8、10、12和16)。
2-测定纤维二糖水解酶活性的增强
2-1、在还原纤维糊精底物上
为了评估在第一轮洗牌中选择的变体相对于cbh1参考酶(SEQ ID NO:2)的Kcat，进行以下过程：
–制备表达根据本发明的重组酶的解脂耶罗维亚酵母的原种培养物，于28℃过夜；
–用一定体积的原种培养物接种表达培养基使其在培养开始时在600nm的OD为0.2；
–于28℃培养所述细胞96小时；
–在8000rpm离心5分钟；
–于35℃和50℃用100μl含有1％还原纤维糊精(CD)的pH6的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液孵育100μl上清液24小时；
–取出100μl反应液；
–加入100μl DNS试剂；
–于100℃孵育5分钟；
–在冰上孵育3分钟；
–在3000rpm离心10分钟；
–用150μl在540nm读取OD。
根据本发明，根据以下方法计算Kcat：
–将在540nm的OD作为目标蛋白含量的函数作曲线图；
–减去阴性对照的值；
–除以葡萄糖标准率方向系数(用DNS显示的葡萄糖的各种量)；
–除以反应时间(1440分钟)。
表2给出了在这些实验条件下，与cbh1参考蛋白(SEQ ID NO：2)相比，32F9、64C2、130G9、224C11、225B11和453E8克隆(分别为SEQ ID NO:4、6、8、10、12和16)的Kcat值和增强倍数。
表2：在还原CD上纤维二糖水解酶活性的增强
Figure BDA0001181993490000141
在35℃下无法计算与cbh1参考蛋白(SEQ ID NO：2)相比的增强倍数，因为在这些实验条件下，cbh1的活性无法测量。在35℃和50℃下，与cbh1参考酶(SEQ ID NO：2)的酶活性相比，32F9、64C2、224C11、225B11和453E8克隆的酶活性增强。在35℃，与cbh1参考酶(SEQID NO：2)的酶活性相比，130G9酶(SEQ ID NO：8)的酶活性增强。
2-2、在Avicel底物上
然后在第二种底物：Avicel上测量32F9、64C2、130G9、224C11、225B11和453E8克隆(分别为SEQ ID NO:4、6、8、10、12和16)的活性的增强。
根据如上所述的实验方案通过测量540nm的终点OD来测定这些克隆的活性。还原纤维糊精底物用相同浓度的Avicel底物替换。活性测试用100μl含有目标蛋白的培养物上清液进行48小时。
表3示出了在这些实验条件下，与cbh1参考酶(SEQ ID NO：2)相比，32F9、64C2、130G9、224C11、225B11和453E8克隆(分别为SEQ ID NO:4、6、8、10、12和16)在540nm的OD值(减去用阴性对照获得OD值之后)和增强倍数。
表3：在Avicel上纤维二糖水解酶活性的增强
Figure BDA0001181993490000142
Figure BDA0001181993490000151
结果表明，与cbh1参考酶(SEQ ID NO：2)相比，32F9、130G9、和453E8克隆(分别为SEQ ID NO:4、8和16)的酶活性增强。
实施例3：通过重组的进化
选择32F9、130G9、和453E8基因(分别为SEQ ID NO:3、7和15)，因为它们编码的酶在还原CD和Avicel上增强。选择242D11基因(SEQ ID NO:13)，因为它的序列与32F9、130G9、和453E8克隆的序列不同，从而能够提高序列多样性。将32F9、130G9、453E8和242D11基因重组以产生新的突变体。首先，根据实施例2中第2-1小节所述的实验方案评估所得突变体在还原CD底物上的活性。
1-测定纤维二糖水解酶活性的增强
1-1、在还原纤维糊精底物上
与453E8变体(SEQ ID NO：16)相比，突变体B(SEQ ID NO：18)的纤维二糖水解酶活性增强。453E8变体是通过L-洗牌从进化产生的最好变体。
表4示出了在这些实验条件下，与453E8蛋白(SEQ ID NO：16)相比，克隆B的Kcat值和增强倍数。根据实施例2第2-1小节所述的实验方案计算Kcat。
表4：在还原纤维糊精上纤维二糖水解酶活性的增强
Figure BDA0001181993490000152
结果表明，在35℃下，与参考酶(SEQ ID NO：16)相比，克隆B(SEQ ID NO:18)的酶活性增强。
1-2、在Avicel底物上
然后就在第二种底物：Avicel上证实克隆B的活性增强。
根据实施例2的第2-2小节所述的实验方案通过测量540nm的终点OD来测定这些克隆的活性。
表5示出了在这些实验条件下，与453E8参考蛋白(SEQ ID NO：16)相比，克隆B的Kcat值和增强倍数。
表5：在Avicel上纤维二糖水解酶活性的增强
Figure BDA0001181993490000161
结果表明，在35℃下，与参考酶(SEQ ID NO：16)相比，克隆B(SEQ ID NO:18)的酶活性增强。
实施例4：通过Evosight的进化
为了提高纤维二糖水解酶活性，对L-洗牌产生的最好变体453E8突变体(SEQ IDNO:15)应用Evosight策略(专利申请WO 2006/003298)。
1-高通量筛选
用于选择最好克隆(即，与453E8酶(SEQ ID NO：16)相比，显示纤维二糖水解酶活性增强至少20％的那些)的高通量筛选与实施例2第1小节所述的相同。将通过Evosight产生的变体与453E8克隆(SEQ ID NO：16)相比，因为它是从L-洗牌产生的最好克隆。
在这些筛选条件下，发现一些克隆中的纤维二糖水解酶活性与453E8酶(SEQ IDNO：16)相比增强(540nm的OD增加)，特别是91D9克隆(SEQ ID NO:20)。
2-测定纤维二糖水解酶活性的增强
2-1、在还原纤维糊精底物上
用来测定91D9克隆(SEQ ID NO:20)与453E8酶(SEQ ID NO：16)相比的相对Kcat的实验方案与实施例1第2-1小节所述的相同。
表6示出了在这些实验条件下，与453E8酶(SEQ ID NO：16)相比，91D9克隆的Kcat值和增强倍数。
表6：在还原纤维糊精上纤维二糖水解酶活性的增强
Figure BDA0001181993490000171
这些结果表明，在35℃和50℃下，与453E8酶(SEQ ID NO：16)相比，91D9克隆(SEQID NO:20)的酶活性增强。
1-2、在Avicel底物上
然后就在第二种底物：Avicel上证实91D9克隆的活性增强。
根据实施例2的第2-2小节所述的实验方案通过测量540nm的终点OD来测定该克隆的活性。
表7示出了在这些实验条件下，与453E8蛋白(SEQ ID NO：16)相比，91D9克隆的Kcat值和增强倍数。
表7：在Avicel上纤维二糖水解酶活性的增强
Figure BDA0001181993490000172
这些结果表明，在35℃下，与453E8酶(SEQ ID NO：16)相比，91D9酶(SEQ ID NO:20)的酶活性增强。
实施例5：在里氏木霉CL847ΔCBH1菌株中克隆外切葡聚糖酶1变体130G9和453E8
130G9和453E8变体是从L-洗牌产生的克隆。将每个变体克隆入里氏木霉CL847ΔCBH1菌株。
用以下寡核苷酸通过PCR扩增130G9和453E8变体的编码序列：
-For:TCCATCctcgagatgtatcggaagttggccgtc(SEQ ID NO:25)
-Rev:TCCATCctcgagttacaggcactgagagtagtaag(SEQ ID NO:26)
根据本领域技术人员已知的方法(Wang等,2012,Microb Cell Fact.2012 June18；11:84.doi:10.1186/1475-2859-11-84)，将所得片段用XhoI消化，然后克隆入表达载体的cbh1启动子和终止子之间。载体的可选择标志物是福来霉素(Calmels等,2011,CurrGenet.1991Sep；20(4):309-14)。
用于构建的菌株是CL847菌株(Durand等,1988,Enz.Microb Technol,10,341-346)，其CBH1基因已经根据本领域技术人员已知的方法(Suominen等,MGG,1993,241；523-530)预先除去以产生CL847ΔCBH1菌株。根据本领域技术人员已知的常规方法，通过钙和PEG冲击，用5μg含有编码130G9或453E8变体的序列的DNA片段转化里氏木霉CL847ΔCBH1菌株的原生质体。在含有50g/ml福来霉素的PDA/蔗糖选择培养基上选择所得克隆。纯化和分离后所得的克隆数示于表8。
表8：选择已经整合目标变体的克隆
Figure BDA0001181993490000181
在纤维素板上筛选分离的纯克隆的活性，同时在2D凝胶上分析分泌蛋白质组。
按以下方式制备筛选培养基(称为“Walseth纤维素”培养基)：
-250ml/l"4N"培养基(KOH 3.32g/l、85％H3PO4 5ml/l、(NH4)2SO4 5.6g/l、MgSO4.7H2O 1.2g/l、CaCl2.2H2O 1.2g/l、Na2HPO4.12H2O:0.23g/l、用H2SO4将pH调节至1.5)；
-1ml/l微量元素溶液(FeSO4.7H2O 30g/l、Co(NO3)2.6H2O 9g/l、MnSO4.1H2O 6.4g/l、ZnSO4.7H2O 8.4g/l、硼酸0.4g/l、钼酸钠1.04g/l,用H3PO4将pH调节至1.5)；
-2g/l蛋白胨
-2g/l琼脂；
-根据Walseth方法(Walseth,1952,Tappi,225；228-232)制备的50g/l 8％纤维素。
用均质器(Ultra Turrax,Ika,Germany)将整个混合物均质化5分钟。用3M KOH溶液将pH调节至6.0。将所得培养基于110℃高压灭菌30分钟。当培养基的温度为50℃，以50μg/ml的量加入福来霉素。然后以20ml/皿的量将培养基转移至培养皿。监控固化直到琼脂完全凝固，然后在其上放置多孔Plexiglass板；从而每皿产生24孔。
如下进行筛选步骤：将转化产生的携带分离克隆的琼脂提取物沉积在Walseth培养皿的孔中(一个分离的纯克隆/孔)。该系统能够获得酶促水解圈，因为菌丝体仍然限于孔中，而分泌的纤维素裂解酶扩散至琼脂。将培养皿于30℃孵育7天，结束后通过不透明的琼脂和透明的水解区之间的颜色差异对圈进行肉眼评估。
图2通过显示用两个对照菌株的比较鉴定目标克隆说明了该技术及其区分能力：CL847ΔCBH1菌株(培养皿上称为ΔC1)和其中cbh1参考基因没有被删除的CL847菌株(SEQID NO:1)。
因此，弃掉其中圈小于CL847ΔCBH1的分离克隆，保留其中圈至少大于CL847ΔCBH1的那些。
对获得的所有克隆进行该程序，因此选择并保留了从转化CL847ΔCBH1菌株产生的具有编码130G9基因(SEQ ID NO:7)的序列的克隆No.6和No.20，以及从转化CL847ΔCBH1菌株产生的具有编码453E8基因(SEQ ID NO:15)的序列的克隆No.24。
为了确认该选择，在具有以下成分的液体培养基上，将选择的三个分离克隆于30℃以150rpm振荡培养7天：1L培养基中，3.4gK2HPO4、1.68g(NH4)2SO4、0.12g MgSO4、0.6g玉米粉、1ml微量元素溶液(30g/l FeSO4.7H2O、9g/l Co(NO3)2.6H2O、6.4g/l MnSO4.1H2O、8.4g/lZnSO4.7H2O、0.4g/l硼酸、1.04g/l钼酸钠,用H3PO4将pH调节至1.5)、4.64g马来酸、4g乳糖、4g Solka Floc纤维素(Nutrafiber,USA)。用Ultra Turrax将整个混合物均质化5分钟。用3M KOH溶液将pH调节至6.0。将所得培养基于110℃高温灭菌30分钟。当培养基处于室温时，以50μg/ml的量加入福来霉素。
基于牛血清白蛋白(BSA)标准范围，用DC蛋白质分析比色试剂盒(BioRad,California,United States)进行胞外培养基的蛋白质浓度的分析。然后如
Figure BDA0001181993490000201
-Gimbert等.(Biotechnol Biofuels.2008 Dec 23；1(1):18.doi:10.1186/1754-6834-1-18)所述，使用7cm胶条，pH4.0-7.0，将上清液进行2维电泳。
将130G9变体(SEQ ID NO:8)的克隆No.6和No.20以及453E8变体(SEQ ID NO:16)的克隆No.24所得的蛋白谱与CLN847和CL847ΔCBH1参考菌株的蛋白谱进行比较(图3和图4)。
示于图3和图4的结果表明，各菌株中的点密度(对应于分泌蛋白质组的蛋白)是相似的。这能够证实与菌株无关，这些蛋白的表达被保存。箭头所示的条带能够确认与用于CL847ΔCBH1转化的菌株相比，这些菌株中CBH1的存在。
在这些筛选步骤结束后选择的克隆在其余实施例中称为“菌株”。
实施例6：生产酶鸡尾酒
根据专利申请FR 2 989 385和Jourdier等(Microb Cell Fact.2012 May 30；11:70.doi:10.1186/1475-2859-11-70)所述的小型实验方案，实施例5中构建的已经整合130G9变体(SEQ ID NO:8)的菌株No.6和No.20以及已经整合453E8变体(SEQ ID NO:16)的菌株No.24是酶生产的主题。给定菌株分泌的所有蛋白构成它的鸡尾酒。
里氏木霉菌株的蛋白生产在两个阶段进行：第一分批阶段用于生物质生产，第二分批进料阶段用于蛋白质生产。
根据以下实验方案进行生产：
–在250ml玻璃瓶中,用各个菌株的孢子接种55ml的F45培养基(10g/l邻苯二甲酸二钾(dipotassium phthalate)缓冲液、pH 6、4.2g/l(NH4)2SO4、300mg/l MgSO4.7H2O、150mg/l CaCl2.2H2O、1.5g/l玉米粉、0.07％of正磷酸、5mg/l FeSO4、1.4mg/l MnSO4、1.4mg/lZnSO4、3.7mg/l CoCl2和12.5g/l葡萄糖)，并于30℃在150rpm振荡。
-每24小时取样以测定pH和葡萄糖浓度。
一旦葡萄糖浓度低于3g/l，通过以40mg糖/g生物质/小时的流量添加50g/l乳糖溶液和0.3％NH3开始分批进料阶段。每天取样以测定上清液的pH、干重和蛋白质浓度。分批进料培养5天后，在0.45μm过滤器上过滤培养物，并在测量蛋白质浓度后冷冻上清液。所述浓度用Lowry方法测量，用BSA制备标准范围。
453E8-24、130G9-6和130G9-20菌株以及CL847参考菌株的上清液的蛋白质浓度如表9所示。
表9：培养物上清液的蛋白质浓度
菌株 蛋白质浓度(g/l)
453E8-24 5.3
130G9-6 7.4
130G9-20 5.8
CL847 5.2
实施例7：根据SHF方法L-洗牌产生的酶在木质纤维素生物质水解中的效率
所用的参考底物是经过汽爆预处理(19巴-3分钟)的小麦秸秆。生物质在0.01％H2SO4的酸浸渍10小时后进行爆破。然后洗涤，调节至pH5，压制并干燥。秸秆的特征如表10所示。
表10：用于水解测试的秸秆的组成
组成 ％w/w
WIS 97.52
灰分 5
纤维素 51.7
修正后的木聚糖 3.57
半纤维素 4.14
Klason木质素(高估) 36.49
乙酰 0.6
水解在10％的固体w/w(即等于5.4％纤维素w/w)进行。在每次微水解前，系统性测定WIS(水溶性固体)含量。参考WIS值是93.7％。测试中的木质纤维素固体含量设为10％，即～5.4％纤维素。
蛋白质含量设为10mg/g固体，即约19mg/g纤维素。通过加入SP188β-葡萄糖苷酶(Novozymes,Denmark)，以120±2IU/g纤维素的量补充酶鸡尾酒的β-葡萄糖苷酶活性。这种β-葡萄糖苷酶添加能够限制纤维二糖对纤维二糖水解酶的抑制。
在具有2mml工作体积(1g反应)的含有以下的Eppendorf管中进行测试：
-0.11±0.001g洗涤的秸秆底物；
-0.9±0.02ml由以下组成的水解反应基质：50mM醋酸缓冲液-pH 4.8和氯霉素(0.05g/l)；
-0.1至0.2±0.02g酶鸡尾酒作为其蛋白质含量的函数。
在Eppendorf Thermomixer Comfort中，以900转/分钟的涡旋于45±2℃进行酶促水解。
所有测试进行两次重复，取样时间设为24、48和96小时，对一些在72小时取样。
在各取样时间，将水解物在Eppendorf管中加热五分钟。然后将这些管冷却并离心。用HPLC分析葡萄糖。平行地，将各Eppendorf管的固体残留物洗涤并离心三次，然后于105℃干燥24小时以评估WIS。将水解测试中所用秸秆的WIS量考虑在内计算水解收率。
评估了实施例6中由130G9-6、130G9-20和453E8-24重组菌株产生的三个鸡尾酒。用含有天然CBH1酶的CL847参考鸡尾酒进行对照测试，为比较其也补充有β-葡萄糖苷酶。
图5给出了含有453E8酶(SEQ ID NO:16)的453E8-24鸡尾酒的水解结果。
图5所示的结果表明，453E8-24鸡尾酒的初始水解率与CL847参考鸡尾酒的接近。453E8-24鸡尾酒的最终水解收率高于CL847参考鸡尾酒。
图6给出了从表达130G9酶(SEQ ID NO:8)的菌株产生的两个鸡尾酒130G9和130G9-20的水解结果。
图6所示的结果表明，在反应的最初20小时，两个鸡尾酒130G9和130G9-20的初始水解率高于CL847参考鸡尾酒的水解率。两个鸡尾酒130G9和130G9-20的最终水解收率也高于CL847参考鸡尾酒。
实施例8：根据SSF方法酶在木质纤维素生物质水解中的效率
所用底物与实施例7的表10所述的相同。
在实验室反应器中进行三次重复的SSF。这些反应器由以下元件构成：
–具有30ml工作体积的玻璃烧瓶；
–聚醚醚酮(PEEK)安全塞；
–穿过塞的DV-118单向阀(Vaplock,United States)。阀设置为当烧瓶中的相对压力大于70m巴时向出口方向打开；
–第一中空聚丙烯管，其低端配置有隔膜。该管穿过通过安全塞的第二管；
–置于烧瓶颈部和安全塞之间的平面封条。
使用生物反应器的原理如下：乙醇发酵期间产生的CO2在位于反应基质上方的顶部积聚，通过积聚导致生物反应器中的压力增加(PG)。当PG高于单向阀的打开压力(PS)，阀打开以允许一定量的气体放出，所述量例如通过称重测定。当PG<PS，阀再次关闭直到PG高于PS。因此，当操作时，生物反应器总是加压以确保发酵的稳定无氧环境。基于以下将葡萄糖发酵为乙醇的化学计量方程，产生的乙醇的量通过CO2的产量估计，所述CO2的产量通过重量损失来估计：
C6H12O6(葡萄糖)→2CO2+2CH3CH2OH(乙醇)+能量
用于SSF的培养基是含有以下的水性培养基：
-pH 5的50mM醋酸缓冲液；
-0.1g/l氯霉素；
-含有3g/l KH2PO4、2g/l of(NH4)2SO4、0.4g/l of MgSO4.7H2O和1g/l酵母提取物的营养基质。
对于总反应重量15±0.003g而言，SSF在10±0.01％的固体w/w(即等于5.4％纤维素w/w)进行。蛋白质含量设为10±0.01mg纤维素/g固体，即约19mg/g纤维素。通过加入SP188β-葡萄糖苷酶(Novozymes,Denmark)，以120±2IU/g纤维素的量补充酶鸡尾酒的β-葡萄糖苷酶活性。
向培养基添加用于发酵糖的酵母(酿酒酵母，乙醇红色菌株，Fermentis,France)以获得2±0.1g/kg的含量。
用培养基将预处理的小麦秸秆于35℃预处理1小时后，向生物反应器加入酶和酵母。
通过将实验室生物反应器置于Infors Multitron HT标准孵育箱(轴旋转速度为150转/分钟)，SSF反应在约35℃的温度进行。
通过称重生物反应器监测随时间的重量损失。在反应结束时，将发酵液于100℃加热5分钟，冷却并离心以将未水解固体与发酵液体分离。然后通过气相色谱分析发酵液体以测定其乙醇浓度。
评估了实施例6的由130G9-6、130G9-20和453E8-24重组菌株产生的三个鸡尾酒。用含有天然CBH1酶的参考鸡尾酒进行SSF，为比较其也补充有β-葡萄糖苷酶。
图7给出了由表达453E8外切葡聚糖酶的菌株产生的453E8-24鸡尾酒的SSF进展结果。
图7所示的结果表明，100小时的SSF后，453E8-24鸡尾酒的发酵液体中的乙醇浓度与CL847参考菌株相等。
图8给出了由表达130G9克隆的酶(SEQ ID NO：8)的菌株产生的130G9-6和130G9-20鸡尾酒的SSF进展结果。
图8所示的结果表明，在反应的最初20小时，两个鸡尾酒130G9-6和130G9-20的初始发酵率高于CL847参考鸡尾酒。两个鸡尾酒130G9-6和130G9-20的最终收率也高于CL847参考鸡尾酒。
序列表
<110> IFP Energies Nouvelles et al
<120> 具有增强活性的外切葡聚糖酶变体及其用途
<130> BFF140337
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1545
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 1
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60
tgcactctcc aatcggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc 120
acgtgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gactcacgct 180
acgaacagca gcacgaactg ctacgatggc aacacttgga gctcgaccct atgtcctgac 240
aacgagacct gcgcgaagaa ctgctgtctg gacggtgccg cctacgcgtc cacgtacgga 300
gttaccacga gcggtaacag cctctccatt ggctttgtca cccagtctgc gcagaagaac 360
gttggcgctc gcctttacct tatggcgagc gacacgacct accaggaatt caccctgctt 420
ggcaacgagt tctctttcga tgttgatgtt tcgcagctgc cgtgcggctt gaacggagct 480
ctctacttcg tgtccatgga cgcggatggt ggcgtgagca agtatcccac caacaccgct 540
ggcgccaagt acggcacggg gtactgtgac agccagtgtc cccgcgatct gaagttcatc 600
aatggccagg ccaacgttga gggctgggag ccgtcatcca acaacgcgaa cacgggcatt 660
ggaggacacg gaagctgctg ctctgagatg gatatctggg aggccaactc catctccgag 720
gctcttaccc cccacccttg cacgactgtc ggccaggaga tctgcgaggg tgatgggtgc 780
ggcggaactt actccgataa cagatatggc ggcacttgcg atcccgatgg ctgcgactgg 840
aacccatacc gcctgggcaa caccagcttc tacggccctg gctcaagctt taccctcgat 900
accaccaaga aattgaccgt tgtcacccag ttcgagacgt cgggtgccat caaccgatac 960
tatgtccaga atggcgtcac tttccagcag cccaacgccg agcttggtag ttactctggc 1020
aacgagctca acgatgatta ctgcacagct gaggaggcag aattcggcgg atcctctttc 1080
tcagacaagg gcggcctgac tcagttcaag aaggctacct ctggcggcat ggttctggtc 1140
atgagtctgt gggatgatta ctacgccaac atgctgtggc tggactccac ctacccgaca 1200
aacgagacct cctccacacc cggtgccgtg cgcggaagct gctccaccag ctccggtgtc 1260
cctgctcagg tcgaatctca gtctcccaac gccaaggtca ccttctccaa catcaagttc 1320
ggacccattg gcagcaccgg caaccctagc ggcggcaacc ctcccggcgg aaacccgcct 1380
ggcaccacca ccacccgccg cccagccact accactggaa gctctcccgg acctacccag 1440
tctcactacg gccagtgcgg cggtattggc tacagcggcc ccacggtctg cgccagcggc 1500
acaacttgcc aggtcctgaa cccttactac tctcagtgcc tgtaa 1545
<210> 2
<211> 514
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 2
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr
20 25 30
Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser
35 40 45
Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser
50 55 60
Thr Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp
65 70 75 80
Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala
85 90 95
Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe
100 105 110
Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
115 120 125
Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
130 135 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
180 185 190
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly
195 200 205
Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly
210 215 220
Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu
225 230 235 240
Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu
245 250 255
Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr
260 265 270
Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
275 280 285
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys
290 295 300
Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
340 345 350
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
370 375 380
Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
385 390 395 400
Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr
405 410 415
Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys
420 425 430
Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn
435 440 445
Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr
450 455 460
Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln
465 470 475 480
Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val
485 490 495
Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln
500 505 510
Cys Leu
<210> 3
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 32F9
<400> 3
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60
tgcactctcc aatcggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc 120
acgtgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gactcacgct 180
acgaacagca gcacgaactg ctacgatggc aacacttgga gctcgaccct atgtcctgac 240
aacgagacct gcgcgaagaa ctgctgtctg gacggtgccg cctacgcgtc cacgtacgga 300
gttaccacga gcggtaacag cctctccatt ggctttgtca cccagtctgc gcagaagaac 360
gttggcgctc gcctttacct tatggcgagc gacacgacct accaggaatt caccctgctt 420
ggcaacgagt tctctttcga tgttgatgtt tcgcagctgc cgtgcggctt gaacggagct 480
ctttacttcg tgtccatgga cgcggatggt ggcgtgagca agtatcccac caacaccgct 540
ggcgccaagt acggcacggg gtactgtgac agccagtgtc cccgcgatct gaagttcatc 600
aatggccagg ccaacgttga gggctgggag ccgtcatcca acaacgcgaa cacgggcatt 660
ggaggacacg gaagctgctg ctctgagatg gatatctggg aggccaactc catctccgag 720
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aacgagctca acgatgatta ctgcacagct gaggaggcag aattcggcgg atcctctttc 1080
tcagacaagg gcggcctgac tcagttcaag aaggctacct ctggcggcat ggttctggtc 1140
atgagtctgt gggatgatta ctccgtcaac atgctgtggc tggactccac ctacccgaca 1200
aacgccaccg gtacacccgg tgccgctcgc ggaacctgct ccaccagctc cggttcacct 1260
aagaccgtcg aagccaactc tcccaacgcc aaggtcacct tctccaacat caagttcgga 1320
cccattggca gcaccggcaa ccctagcggc ggcaaccctc ccggcggaaa cccgcctggc 1380
accaccacca cccgccgccc agccactacc actggaagct ctcccggacc tacccagtct 1440
cactacggcc agtgcggcgg tattggctac agcggcccca cggtctgcgc cagcggcaca 1500
acttgccagg tcctgaaccc ttactactct cagtgcctgt aa 1542
<210> 4
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 32F9
<400> 4
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr
20 25 30
Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser
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Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser
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65 70 75 80
Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala
85 90 95
Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe
100 105 110
Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
115 120 125
Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
130 135 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
180 185 190
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly
195 200 205
Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly
210 215 220
Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu
225 230 235 240
Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu
245 250 255
Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr
260 265 270
Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
275 280 285
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys
290 295 300
Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
340 345 350
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
370 375 380
Asp Asp Tyr Ser Val Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
385 390 395 400
Asn Ala Thr Gly Thr Pro Gly Ala Ala Arg Gly Thr Cys Ser Thr Ser
405 410 415
Ser Gly Ser Pro Lys Thr Val Glu Ala Asn Ser Pro Asn Ala Lys Val
420 425 430
Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn Pro
435 440 445
Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr Thr
450 455 460
Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser
465 470 475 480
His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys
485 490 495
Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys
500 505 510
Leu
<210> 5
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 64C2
<400> 5
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagcaggtc 60
ggtacttccc aagcggaggt gcacccgtcc atgacatggc agagctgcac tgctggtggc 120
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gttggcgctc gcctttacct tatggcgagc gacacgacct accaggaatt caccctgctt 420
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ggaggacacg gaagctgctg ctctgagatg gatatctggg aggccaactc catctccgag 720
gctcttaccc cccacccttg cacgactgtc ggccaggaga tctgcgaggg tgatgggtgc 780
ggcggaactt actccgataa cagatatggc ggcacttgcg atcccgatgg ctgcgactgg 840
aacccatacc gcctgggcaa caccagcttc tacggccctg gctcaagctt taccctcgat 900
accaccaaga aattgaccgt tgtcacccag ttcgagacgt cgggtgccat caaccgatac 960
tatgtccaga atggcgtcac tttccagcag cccaacgccg agcttggtag ttactctggc 1020
aacgagctca acgatgatta ctgcacagct gaggaggcag aattcggcgg atcctctttc 1080
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<210> 6
<211> 514
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 64C2
<400> 6
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Gln Val Gly Thr Ser Gln Ala Glu Val His Pro Ser Met Thr
20 25 30
Trp Gln Ser Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Thr Thr Asn Asn Gly Lys
35 40 45
Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Lys Val Gly Asp Tyr
50 55 60
Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Lys Thr Leu Cys Pro Asp
65 70 75 80
Asp Ala Thr Cys Ala Ser Asn Cys Ala Leu Glu Gly Ala Asn Tyr Gln
85 90 95
Ser Thr Tyr Gly Ala Thr Thr Ser Gly Asp Ser Leu Arg Leu Asn Phe
100 105 110
Val Thr Thr Ser Gln Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
115 120 125
Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
130 135 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
180 185 190
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly
195 200 205
Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly
210 215 220
Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu
225 230 235 240
Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu
245 250 255
Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr
260 265 270
Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
275 280 285
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys
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Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr
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Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
340 345 350
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
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Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
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Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr
405 410 415
Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys
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Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr
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Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln
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Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val
485 490 495
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500 505 510
Cys Leu
<210> 7
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 130G9
<400> 7
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60
tgcactctcc aatcggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc 120
acgtgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gactcacgct 180
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ctttacttcg tgtccatgga cgcggatggt ggcgtgagca agtatcccac caacaccgct 540
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accaccaaga aattgaccgt tgtcacccag ttcgagacgt cgggtgccat caaccgatac 960
tatgtccaga atggcgtcac tttccagcag cccaacgccg agcttggtag ttactctggc 1020
aacgagctca acgatgatta ctgcacagct gaggaggcag aattcggcgg atcctctttc 1080
tcagacaagg gcggcctgac tcagttcaag aaggctacct ctggcggcat ggttctggtc 1140
atgagtctgt gggatgatta ctacgccaac atgctgtggc tggactccac ctacccgaca 1200
aacgagacct cctccacacc cggtgccgtg cgcggaagct gctccaccag ctccggtgtc 1260
cctgctcagg tcgaatctca gtctcccaac gccaaggtca ccttctccaa catcaagttc 1320
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acaacttgcc aggtcctgaa cccttactac tctcagtgcc tgtaa 1545
<210> 8
<211> 514
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 130G9
<400> 8
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr
20 25 30
Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser
35 40 45
Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe
100 105 110
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130 135 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu
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290 295 300
Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
340 345 350
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
370 375 380
Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
385 390 395 400
Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr
405 410 415
Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys
420 425 430
Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn
435 440 445
Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr
450 455 460
Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln
465 470 475 480
Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val
485 490 495
Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln
500 505 510
Cys Leu
<210> 17
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 B
<400> 17
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60
tgcactctcc aatcggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc 120
acgtgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gactcacgct 180
acgaacagca gcacgaactg ctacgatggc aacacttgga gctcgaccct atgtcctgac 240
aacgagacct gcgcgaagaa ctgctgtctg gacggtgccg actactcggg aacgtacgga 300
attaccacga gcggtaacag cctctccatt ggctttgtca cccagtctgc gcagaagaac 360
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ggcaacgagt tctctttcga tgttgatgtt tcgcagctgc cgtgcggctt gaacggagct 480
ctttacttcg tgtccatgga cgcggatggt ggcgtgagca agtatcccac caacaccgct 540
ggcgccaagt acggcacggg gtactgtgac agccagtgtc cccgcgatct gaagttcatc 600
aatggccagg ccaacgttga gggctgggag ccgtcatcca acaacgcgaa cacgggcatt 660
ggaggacacg gaagctgctg ctctgagatg gatatctggg aggccaactc catctccgag 720
gctcttaccc cccacccttg cgacactccc ggccaggtga tctgcgaggg tgatgggtgc 780
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aacccatacc gcctgggcaa caccagcttc tacggccctg gctcaagctt taccctcgat 900
accaccaaga aattgaccgt tgtcacccag ttcgagacgt cgggtgccat caaccgatac 960
tatgtccaga atggcgtcac tttccagcag cccaacgccg agcttggtag ttactctggc 1020
aacgagctca acgatgatta ctgcacagct gaggaggcag aattcggcgg atcctctttc 1080
tcagacaagg gcggcctgac tcagttcaag aaggctacct ctggcggcat ggttctggtc 1140
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<210> 18
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 B
<400> 18
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr
20 25 30
Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser
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Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser
85 90 95
Gly Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe
100 105 110
Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
115 120 125
Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
130 135 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
180 185 190
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly
195 200 205
Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly
210 215 220
Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu
225 230 235 240
Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Val Ile Cys Glu
245 250 255
Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr
260 265 270
Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
275 280 285
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys
290 295 300
Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr
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Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
340 345 350
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
370 375 380
Asp Asp Tyr Ser Val Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
385 390 395 400
Asn Ala Thr Gly Thr Pro Gly Ala Ala Arg Gly Thr Cys Ser Thr Ser
405 410 415
Ser Gly Ser Pro Lys Thr Val Glu Ala Asn Ser Pro Asn Ala Lys Val
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Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn Pro
435 440 445
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Leu
<210> 19
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 91D9
<400> 19
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60
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<210> 20
<211> 514
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆 91D9
<400> 20
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Gly Thr His Pro Pro Leu Thr
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Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser
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Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser
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Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
115 120 125
Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Leu Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
130 135 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
180 185 190
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Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Met Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu
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Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr
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Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
275 280 285
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys
290 295 300
Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asp Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
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Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
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Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
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Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr
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Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys
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500 505 510
Cys Leu
<210> 21
<211> 1566
<212> DNA
<213> 柄篮状菌
<400> 21
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagcaggtc 60
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<210> 22
<211> 521
<212> PRT
<213> 柄篮状菌
<400> 22
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Lys Asp Asp Thr Thr Tyr Glu Met Phe Lys Leu Leu Asn Gln Glu Phe
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Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
180 185 190
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly
195 200 205
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Ala Phe Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Val Met Cys Thr
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Gly Asp Ala Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Asp Arg Tyr Gly Gly Thr
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Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Phe Arg Gln Gly Asn Lys
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Val Val Thr Gln Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Ala Ser Gly Thr Leu
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Lys Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn
325 330 335
Ser Glu Ser Thr Trp Ser Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Thr Asn Asp
340 345 350
Tyr Cys Thr Ala Gln Lys Ser Leu Phe Lys Asp Gln Asn Val Phe Ala
355 360 365
Lys His Gly Gly Met Glu Gly Met Gly Ala Ala Leu Ala Gln Gly Met
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Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asn Tyr Pro Thr Thr Ala Ser Ser Ser Thr Pro Gly Val
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Ala Arg Gly Thr Cys Asp Ile Ser Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu
420 425 430
Ala Asn His Pro Asp Ala Ser Val Val Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly
435 440 445
Pro Ile Gly Ser Thr Phe Asn Ser Gly Gly Ser Asn Pro Gly Gly Gly
450 455 460
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465 470 475 480
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<210> 23
<211> 1557
<212> DNA
<213> 费氏新萨托菌
<400> 23
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagcagatt 60
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gatacttcct gcgcgcagga ctgcgctgtc gacggtgccg actactcggg aacgtacgga 300
attaccacga gcggtaacag cctccgtctg aactttgtca ccggctctaa cgttggctcc 360
cgcacttacc ttatggcgga taagacgcat taccagctct tcaacctgct taaccaggag 420
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tactccaatg acagatatgg cggcacttgc gatcccgatg gctgcgactt caacccatac 840
cgcgttggcg tcaccgactt ctacggccct ggcatgacca ttgataccac caagcccgtg 900
accgttgtca cccagttcgt cacgaatgac ggtacctcaa gcggtaccct ttctgagatc 960
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atttctggca acgccatcaa ctccgattac tgctccgctg agatttccac tttcggcgga 1080
aacccttctt tcactaagca tggcggcctg gcaggtgtga gcacagctct taagaatggc 1140
atggttctgg tcatgagtct gtgggatgat tactccgtca acatgctgtg gctggactcc 1200
acctacccga caaacgccac cggtacaccc ggtgccgctc gcggaacctg ctccaccagc 1260
tccggttcac ctaagaccgt cgaagccaac tctcccaacg cccatgtcat cttctccgat 1320
atccgagttg gacccttgaa cagcaccttc agtggcagcg gcacttctac ccccggcgga 1380
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tgcgccagcg gctttacttg cactgtcata aacccttact actctcagtg cctgtaa 1557
<210> 24
<211> 518
<212> PRT
<213> 费氏新萨托菌
<400> 24
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Gln Ile Gly Asn Leu Thr Ala Glu Thr Gln Pro Ser Leu Ser
20 25 30
Trp Ser Thr Cys Thr Ser Gly Gly Ser Cys Thr Ser Lys Ser Ala Ser
35 40 45
Ile Thr Leu Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Ser Val Asn Gly Ser
50 55 60
Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser Ile Cys Asp Thr
65 70 75 80
Asp Thr Ser Cys Ala Gln Asp Cys Ala Val Asp Gly Ala Asp Tyr Ser
85 90 95
Gly Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Arg Leu Asn Phe
100 105 110
Val Thr Gly Ser Asn Val Gly Ser Arg Thr Tyr Leu Met Ala Asp Lys
115 120 125
Thr His Tyr Gln Leu Phe Asn Leu Leu Asn Gln Glu Phe Thr Phe Thr
130 135 140
Val Asp Ala Ser Thr Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe
145 150 155 160
Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Gln Pro Asn Asn Lys
165 170 175
Ala Gly Ala Gln Tyr Gly Val Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg
180 185 190
Asp Leu Lys Phe Ile Gly Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp Gln Pro
195 200 205
Ser Ser Asn Asn Ser Asn Thr Gly Leu Gly Asn His Gly Ser Cys Cys
210 215 220
Ala Glu Leu Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu Ala Leu Thr
225 230 235 240
Pro His Pro Cys Asp Thr Ser Ser Gln Thr Val Cys Thr Gly Asp Ala
245 250 255
Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asn Asp Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp Pro
260 265 270
Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Val Gly Val Thr Asp Phe Tyr
275 280 285
Gly Pro Gly Met Thr Ile Asp Thr Thr Lys Pro Val Thr Val Val Thr
290 295 300
Gln Phe Val Thr Asn Asp Gly Thr Ser Ser Gly Thr Leu Ser Glu Ile
305 310 315 320
Arg Arg Tyr Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Phe Ala Gln Pro Ser Ser
325 330 335
Lys Ile Asp Gly Ile Ser Gly Asn Ala Ile Asn Ser Asp Tyr Cys Ser
340 345 350
Ala Glu Ile Ser Thr Phe Gly Gly Asn Pro Ser Phe Thr Lys His Gly
355 360 365
Gly Leu Ala Gly Val Ser Thr Ala Leu Lys Asn Gly Met Val Leu Val
370 375 380
Met Ser Leu Trp Asp Asp Tyr Ser Val Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser
385 390 395 400
Thr Tyr Pro Thr Asn Ala Thr Gly Thr Pro Gly Ala Ala Arg Gly Thr
405 410 415
Cys Ser Thr Ser Ser Gly Ser Pro Lys Thr Val Glu Ala Asn Ser Pro
420 425 430
Asn Ala His Val Ile Phe Ser Asp Ile Arg Val Gly Pro Leu Asn Ser
435 440 445
Thr Phe Ser Gly Ser Gly Thr Ser Thr Pro Gly Gly Gly Ser Ser Thr
450 455 460
Thr Thr Ser Pro Gly Ser Thr Thr Thr Thr Pro Gly Ser Gly Ser Gly
465 470 475 480
Ser Gly Val Ala Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr
485 490 495
Gly Pro Thr Thr Cys Ala Ser Gly Phe Thr Cys Thr Val Ile Asn Pro
500 505 510
Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
515
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例5的正向引物
<400> 25
tccatcctcg agatgtatcg gaagttggcc gtc 33
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例5的反向引物
<400> 26
tccatcctcg agttacaggc actgagagta gtaag 35

Claims (14)

1.一种分离或纯化的多肽，其特征在于，在约35℃和/或约50℃的温度下，与SEQ IDNO：2的CBH1参考蛋白的外切葡聚糖酶活性相比，它具有增强至少10％的外切葡聚糖酶活性，所述多肽选自：
选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的分离或纯化的多肽,其特征在于，所述多肽对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
3.一种纯化或分离的核酸，其特征在于，它编码至少一种如权利要求1-2任一项所述的多肽。
4.如权利要求3所述的纯化或分离的核酸，选自以下序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19。
5.一种载体，其特征在于，它包含至少一种如权利要求3或4所述的核酸。
6.一种分离的宿主细胞，其特征在于，它包含至少一种如权利要求1-2任一项所述的多肽，或至少一种如权利要求3或4所述的核酸，或至少一种如权利要求5所述的载体。
7.如权利要求6所述的分离的宿主细胞，其特征在于，它选自：木霉属、曲霉属、脉胞菌属、腐质霉属、毁丝霉属、金孢子菌属、青霉属、镰刀菌属、高温单孢菌属、芽孢杆菌属、假单包菌属,埃希氏菌属、梭状芽孢杆菌、纤维单胞菌属、链霉菌属、耶罗维亚酵母属、毕赤酵母属和酵母属。
8.如权利要求6或7所述的分离的宿主细胞，其特征在于，它选自：里氏木霉、Trichoderma viridae、康氏木霉、黑曲霉、构巢曲霉、文氏曲霉、米曲霉、海枣曲霉、嗜热毁丝霉、Chrysosporiumlucknowense、粗糙脉孢菌、灰腐质霉、嗜松青霉、草酸青霉、大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌、糖解梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、毕赤酵母、解脂耶罗维亚酵母和酿酒酵母。
9.如权利要求1-2任一项所述的多肽用于纤维素水解的用途。
10.如权利要求1-2任一项所述的多肽用于生物燃料生产的用途。
11.一种能够作用于木质纤维素生物质的酶组合物，所述酶组合物由丝状真菌产生且包含至少一种如权利要求1-2任一项所述的多肽。
12.一种用于从木质纤维素生物质生产生物燃料的方法，其特征在于，它包含以下连续步骤：
–将待水解的生物质悬浮于水相中；
–在如权利要求11所述的酶组合物存在下水解所述木质纤维素生物质，以产生含有葡萄糖的水解物；
–发酵水解物的葡萄糖，以产生发酵液；
–将生物燃料与发酵液分离。
13.一种用于从生物质生产生物燃料的方法，其特征在于，它包含以下连续步骤：
–将待水解的生物质悬浮于水相中；
–向所述悬浮液同时加入如权利要求11所述的酶组合物和发酵生物，发酵混合物以产生发酵液；
–将生物燃料与发酵液分离。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述发酵生物是如权利要求6-8任一项所述的宿主细胞。
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