KR20150058274A

KR20150058274A - 저온에서 강화된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20150058274A
Application number: KR1020157008688A
Authority: KR
Inventors: 앙뚜안 마르조; 위그 마띠; 셀린 아이리나; 크리스토쁘 윌망; 세실 페르실롱; 세바스띠앙 포르; 실비 아르망; 모 프띠
Original assignee: 아이에프피 에너지스 누벨; 프로테우스; 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄(씨엔알에스)
Priority date: 2012-09-05
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2015-05-28
Also published as: ES2631678T3; EP2893010B1; JP6207609B2; AU2013311444B2; US9382555B2; CA2883715C; FR2994981B1; JP2015533486A; KR102092429B1; CN104769107B; WO2014037667A1; BR112015004445A2; MX359987B; CA2883715A1; CN104769107A; EP2893010A1; PL2893010T3; US20150218593A1; IN2015DN01766A; FR2994981A1

Abstract

본 발명은 약 30℃ 내지 약 35℃ 의 온도에서 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

저온에서 강화된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드 {POLYPEPTIDE WITH REINFORCED BETA-GLUCOSIDASE ACTIVITY AT LOW TEMPERATURE}

셀룰로오스로부터 에탄올을 제조하는 가능성은 다량의 원료의 이용능 및 또한 연료로서의 에탄올에 대한 관심 덕분에 큰 주목을 받아왔다. 이러한 방법을 위한 셀룰로오스-기반 천연 원료는 "바이오매스" 로 표시된다. 수많은 유형의 바이오매스, 예를 들어 목재, 농경 잔류물, 초본 작물 및 고체 도시 폐기물은 바이오연료를 제조하기 위한 잠재적인 원료로서 고려되어 왔다. 상기 물질은 주로 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 리그닌으로 이루어진다.

셀룰로오스는 베타-1,4 결합에 의해 연결된 글루코오스 분자로 이루어진 중합체이며, 이들은 분해 또는 해중합에 대해 매우 저항성이 있다. 일단 셀룰로오스가 글루코오스로 전환되면, 글루코오스는 효모를 사용하여 바이오연료, 예를 들어 에탄올로 쉽게 발효된다.

셀룰로오스를 글루코오스로 전환하기 위해 연구된 가장 오래된 방법은 산 가수분해에 기반하는 것이다. 상기 방법은 농축 또는 희석 산의 존재 하에 실시될 수 있다. 그러나, 여러가지 단점, 예컨대 농축 산이 사용되는 경우 산의 열악한 회수 및 희석 산을 사용하는 경우 글루코오스의 적은 제조가, 산 가수분해 방법의 경제학에는 악영향을 준다.

산 가수분해 방법의 단점을 극복하기 위해, 셀룰로오스 전환 방법은 더욱 최근에는 셀룰라아제 유형의 효소를 사용하는, 효소 가수분해와 관련된다. 리그노셀룰로오스 바이오매스 (예를 들어, 셀룰로오스) 의 상기 효소 가수분해는 그러나 값비싼 산업적 공정이라는 단점을 갖는다. 따라서, 점점 더 효과적인 셀룰라아제-분비 미생물 균주를 사용하는 것이 필수적이다. 이와 관련하여, 많은 미생물, 예컨대 진균 트리코데르마 (Trichoderma), 아스페르길루스 (Aspergillus), 휴미콜라 (Humicola) 또는 푸사리움 (Fusarium), 및 또한 박테리아, 예컨대 테르모모노스포라 (Thermomonospora), 바실러스 (Bacillus), 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 는 셀룰로오스를 가수분해하는 효소를 포함한다. 상기 미생물에 의해 분비되는 효소는 셀룰로오스의 글루코오스로의 전환에 사용되는 3 가지 유형의 활성을 갖고, 하기 3 가지 그룹으로 나눠진다: 셀룰로오스 섬유를 내부에서 랜덤으로 공격하는 엔도글루카나아제, 섬유의 말단을 공격하여 셀로비오스를 방출시킬 엑소글루카나아제, 및 상기 셀로비오스를 글루코오스로 가수분해할 베타-글루코시다아제. 베타-글루코시다아제는 셀룰로오스 전환 공정의 제한 단계를 구성한다. 게다가, 공정의 첫번째 어려움은, 공정의 종료시 가수분해되지 않는 임의의 셀로비오스가 바이오연료의 제조 동안 수율 상실을 나타내므로, 셀로비오스의 글루코오스로의 전환에 놓여 있다.

셀로비오스의 상기 축적은, 트리코데르마 (Trichoderma) 를 포함하는 여러 가지 셀룰라아제-제조 미생물이, 매우 적은 베타-글루코시다아제를 생성한다는 점을 고려하면, 효소 가수분해에서의 주요 문제점이다. 사실상, 상업적 트리코데르마 (Trichoderma) 균주에 의해 분비되는 총 단백질의 1% 미만은 베타-글루코시다아제 유형이다. 상기 적은 양의 베타-글루코시다아제는 따라서 셀로비오스를 글루코오스로 가수분해하는 낮은 능력을 산출하고, 따라서 시스템 내의 이의 축적을 야기한다. 이것이 일어나면서, 고 농도의 셀로비오스는 셀로비오스가 반응의 최종 생성물인 기타 셀룰라아제 및 특히 엑소글루카나아제의 활성을 억제한다. 상기 단점을 극복하기 위해, 본 출원인은 이들의 특허 출원 WO 2010/029259 에서, 증가된 특이적 활성을 가진 효소를 수득하는 것을 가능하게 만드는 베타-글루코시다아제 유전자를 개발하여, 이에 의해 리그노셀룰로오스 바이오매스를 바이오연료로 전환하기 위한 공정을 실질적으로 개선하였다.

가수분해 및 발효는 다양한 기작에 따라 실시될 수 있다. 가장 흔한 것은 분리된 가수분해 및 발효 (SHF: Separate Hydrolysis and Fermentation) 로 이루어진다. 상기 방법은 최적 반응 조건을 유지함으로써 각 단계를 최적화시키는 것을 가능하게 한다. 상기 발효는 약 28℃ 내지 약 30℃ 의 온도에서 즉흥적으로 실시되는 반면, 가수분해는 일반적으로 45℃ 이상의 온도에서 실시된다. 그러나, SHF 에서, 반응 마지막에 방출되는 당은 농도가 매우 높고 효소의 억제를 야기하여, 공정의 효율을 감속시킨다.

상기 결점을 피하기 위해, 또다른 유형의 공정 (SSF - Simultaneous Saccharification and Fermentation: 동시 당화 및 발효) 이 구상될 수 있다. SSF 에서, 2 개 단계 (헥소오스의 가수분해 및 발효) 가 동시에 일어나서, 효소에 대해 억제적인 농도에서의 당의 축적을 방지한다. 투자 비용은 또한 단일 반응기의 사용 후에 감소된다. 가수분해 정도는, 분비되는 당이 에탄올로의 발효에 즉시 사용되므로 억제의 부재에 후속하여 더 높다.

상기 방법에서, 반응기의 온도는 필수적으로 가수분해 및 발효에 대한 최적 온도 사이의 절충, 전형적으로는 약 30℃ 내지 약 35℃ 를 구성한다. 그러나, 이러한 온도에서, 베타-글루코시다아제를 비롯한 셀룰로오스분해성 효소의 활성은 약 30% 감소한다.

따라서 SSF 공정의 최적 가수분해 및 발효 온도에서, 특히 약 30℃ 내지 약 35℃ 의 온도에서 효율적인 베타-글루코시다아제 활성을 유지할 수 있는 효소에 대한 필요성이 있다.

본 출원인은 약 30℃ 내지 약 35℃ 의 온도에서, 특히 서열 SEQ ID No. 3 의 야생형 BGL1 단백질의 베타-글루코시다아제 활성과 비교하여, 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 개발하였다. BGL1 은 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 로부터의 베타-글루코시다아제에 상응한다.

본 출원인은 야생형 BGL1 단백질의 베타-글루코시다아제 활성과 비교하여 향상된 특이적 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 여러 개의 클론을 이전에 확인하였다. 이러한 결과는 이들의 특허 출원 WO 2010/029259 에 제시된다. 더욱 구체적으로는, 이들은 강한 프로모터의 조절 하에서 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 에서의 이의 발현이 상기 효소를 발현하지 않는 균주에 의해 생성되는 것과 비교하여, 생성된 효소 칵테일의 베타-글루코시다아제 활성에서 26.2 배 증가를 야기하는 (특허 출원 WO 2010/029259 의 표 6), SEQ ID No. 5 의 폴리펩티드 (100B11 이라고 불림) 를 엔코딩하는 특정 클론을 입증하였다.

이제 본 출원인은 놀랍고도 예상치 못하게, 이전에 확인된 클론 100B11 과 비교하여 향상된 활성을 갖는 (이것은 약 30℃ 내지 약 35℃ 의 온도에서임) 효소를 엔코딩하는 새로운 클론을 입증하였다.

본 발명은 따라서 아미노산 서열 SEQ ID No. 1 의, 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:

MRYRTAAALALATGPFARADSHSTSGASAEAVVPPAGTPWGTAYDKAKAALAKLNLQDKVGIVSGVGWNGGPCVGNTSPASKIGYPQLCLQDGPLGIRFGGSVTAFTPGIQAASTWDTELMRQRGEYLGAEAKGCGIHVLLGPVAGPLGKTPQGGRNWEGFGVDPYLTGIAMAETIEGLQSAGVQACAKHYIVNEQELNRETISSNPDDRTLHELYLWPFADAVHANVASVMCSYNKINGSWACEDQYTLQTVLKDQLGFPGYVMTDWNAQHTTVQSANSGLDMSMPGTDFNGNNRLWGPALTNAVNSNQVPTSRVDDMVTRILAAWYLTGQDQAGYPSFNISRNVQGNHKTNVRAIARDGIVLLKNDANILPLKKPASIAVVGSAAIIGNHARNSPSCNDKGCDDGALGMGWGSGAVNYPYFVAPYDAINTRASSQGTQVTLSNTDNTSSGASAARGKDVAIVFITADSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNALVQAVAGANSNVIVVVHSVGAIILEQILALPQVKAVVWAGLPSQESGNALVDVLWGDVSPSGKLVYTIAKSPNDYNTRIVSGGSDSFSEGLFIDYKHFDDANITPRYEFGYGLSYTKFNYSRLSVLSTAKSGPATGAVVPGGPSDLFQNVATVTVDIANSGQVTGAEVAQLYITYPSSAPRTPPKQLRGFAKLNLTPGQSGTATFNIRRRDLSYWDTASQKWVVPSGSFGISVGASSRDIRLTSTLSVA.

상기 폴리펩티드는 핵산 서열 SEQ ID No. 2 에 의해 엔코딩된다.

우선적으로, 아미노산 서열 SEQ ID No. 1 의 상기 폴리펩티드는 약 30℃ 내지 약 35℃ 의 온도에서, 특히 서열 SEQ ID No. 3 의 야생형 BGL1 단백질의 베타-글루코시다아제 활성과 비교하여 상기 동일한 온도에서 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는다. BGL1 단백질은 핵산 서열 SEQ ID No. 4 에 의해 엔코딩된다.

더욱 우선적으로, 아미노산 서열 SEQ ID No. 1 의 상기 폴리펩티드는 약 30℃ 내지 약 35℃ 의 온도에서 아미노산 서열 SEQ ID No. 5 의 100B11 폴리펩티드의 베타-글루코시다아제 활성과 비교하여 상기 동일한 온도에서 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는다. 100B11 폴리펩티드는 핵산 서열 SEQ ID No. 6 에 의해 엔코딩된다.

게다가, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 글루코오스에 의한 억제에 대해 덜 민감하다는 장점을 갖고, 그 결과 높은 글루코오스 농도의 존재 하에 더욱 양호한 베타-글루코시다아제 활성을 보유한다.

하나의 구현예에서, 이전에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 글루코오스의 부재 하에서 측정된 야생형 단백질 BGL1 (SEQ ID No. 3) 의 베타-글루코시다아제 활성과 비교하여 향상된, 글루코오스의 존재하에서 측정된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는다.

하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID No. 5 의 100B11 폴리펩티드의 베타-글루코시다아제 활성과 비교하여, 약 30℃ 내지 약 35℃ 의 온도에서 10% 이상, 우선적으로 20% 이상, 우선적으로 30% 이상, 더 더욱 우선적으로 40% 이상 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는다.

당업자는, 예를 들어, 기질 파라-니트로페닐 베타-D-글루코피라노시드 (pNPG) 를 사용하는 효소 활성 시험에 의해 본 발명에 따른 폴리펩티드의 효소 활성의 증가 또는 다른 말로는 개선을 측정하는 것이 가능할 것이다. 베타-글루코시다아제의 작용 후 수득되는 파라-니트로페놀의 양은, 예를 들어, 414 nm 에서 광학 밀도를 판독함으로써 측정될 수 있다.

당업자가 본 발명에 따른 폴리펩티드가 야생형 BGL1 단백질의 것과 비교하여 향상된 효소 활성을 갖는지를 측정하기 위해 사용할 수 있는 프로토콜의 예는 하기와 같다:

- 37℃ 에서 밤새, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는 대장균 (E. coli) 의 저장 배양액의 제조;

- 24h 동안 20℃ 에서 LB 배양 배지의 1% 의 저장 배양액으로의 접종;

- 2 분 동안 13 000 rpm 에서 원심분리;

- pH 5 (최종 OD₆₀₀ = 100) 에서 100 mM 숙시네이트 완충액으로의 세포 펠렛의 재현탁;

- 50 ㎕ 의 세포의 15 mM 의 파라-니트로페닐 베타-D-글루코피라노시드 (pNPG) 를 함유하는 100 ㎕ 의 100 mM 숙시네이트 완충액 (pH 5) 으로의, 50℃ 에서 1 시간 30 분 이후, 빙상에서 5 분 동안의 인큐베이션;

- 150 ㎕ 의 0.2 M Na₂CO₃ 의 첨가;

- 2 분 동안 13 000 rpm 에서의 원심분리;

- 150 ㎕ 의 상청액에 대한 414 nm 에서의 광학 밀도의 판독.

게다가, 당업자는 본 발명에 따른 폴리펩티드가 야생형 BGL1 단백질보다 글루코오스 억제에 대해 덜 민감한지를 측정하기 위해, 50℃ 에서 1 시간 30 분 동안, 50 ㎕ 의 세포의 15 mM 의 pNPG 및 60 g/l 의 글루코오스를 함유하는 100 ㎕ 의 100 mM 숙시네이트 완충액 (pH 5) 으로의 인큐베이션에 의해 상기 기재된 프로토콜을 사용할 수 있을 것이다.

상기 프로토콜은 약 30℃ 내지 약 35℃ 의 온도 조건 하에, 특히 아미노산 서열 SEQ ID No. 5 의 100B11 폴리펩티드와 비교하여, 베타-글루코시다아제 활성의 향상을 측정하기 위해 쉽게 적용가능하다.

본 발명은 또한 아미노산 서열 SEQ ID No. 1 의 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산에 관한 것이다. 우선적으로, 상기 핵산은 핵산 서열 SEQ ID No. 2 를 포함한다.

본 발명은 또한 이전에 기재된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 용어 "벡터" 는 외래 핵산 단편을 삽입하는 것을 가능하게 하는 임의의 DNA 서열을 의미하는 것으로 의도되며, 벡터는 외래 DNA 를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 가능하게 한다. 벡터의 예는 플라스미드, 코스미드, 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC) 및 P1 박테리오파지-유래 인공 염색체 (PAC), 및 바이러스-유래 벡터이다.

본 발명에 따르면, 이전에 기재된 핵산은 숙주 세포의 발현에 필요한 프로모터, 터미네이터 또는 임의의 기타 서열에 기능적으로 연결될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 또한 선별가능 마커를 가질 수 있다. 용어 "선별가능 마커" 는 유전자의 발현이 상기 마커를 함유하는 세포에게 이들을 선별할 수 있게 하는 특징을 부여하게 하는 그러한 유전자를 의미하는 것으로 의도된다. 이것은, 예를 들어, 항생제에 대한 내성에 대한 유전자이다.

본 발명의 주제는 또한 이전에 기재된 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수 있는, 또는 본 발명의 상기 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포이다.

당업자는 적어도 이전에 기재된 폴리펩티드, 핵산 또는 벡터를 잘-공지된 통상의 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입할 수 있을 것이다. 예를 들어, 염화칼슘 처리, 전기천공, 또는 입자 총의 사용을 언급할 수 있다.

하나의 구현예에 따르면, 당업자는 숙주 세포 내로, 그리고 통상의 방법에 의해, 본 발명에 따른 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 여러 카피를 도입할 수 있을 것이다.

하나의 구현예에 따르면, 이전에 기재된 단리된 숙주 세포는 트리코데르마 (Trichoderma), 아스페르길루스 (Aspergillus), 뉴로스포라 (Neurospora), 휴미콜라 (Humicola), 마이셀리오프토라 (Myceliophthora), 크리소스포리움 (Chrysosporium), 페니실리움 (Penicillium), 푸사리움 (Fusarium), 테르모모노스포라 (Thermomonospora), 바실러스 (Bacillus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 에스케리챠 (Escherichia), 클로스트리듐 (Clostridium), 셀룰로모나스 (Cellulomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 야로위아 (Yarrowia), 피치아 (Pichia) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 로부터 선택된다.

하나의 바람직한 구현예에 따르면, 이전에 기재된 단리된 숙주 세포는 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei), 트리코데르마 비리다에 (Trichoderma viridae), 트리코데르마 코닌기이 (Trichoderma koningii), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 마이셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermopila), 크리소스포리움 룩노웬세 (Chrysosporium lucknowense), 아스페르길루스 웬티이 (Aspergillus wentii), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 포에니시스 (Aspergillus phoenicis), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 휴미콜라 그리사에 (Humicola grisae), 페니실리움 피노필룸 (Penicillium pinophilum), 페니실리움 옥살리쿰 (Penicillium oxalicum), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 사카롤라이티쿰 (Clostridium saccharolyticum), 클로스트리듐 벤제린키이 (Clostridium benjerinckii), 클로스트리듐 부틸리쿰 (Clostridium butylicum), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolityca), 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 및 이의 혼합물로부터 선택된다.

하나의 바람직한 구현예에 따르면, 이전에 기재된 단리된 숙주 세포는 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 및 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 로부터 선택된다.

본 발명은 또한 베타-올리고당의 가수분해를 위한, 이전에 기재된 폴리펩티드 또는 이전에 기재된 세포 중 임의의 하나의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 셀로비오스의 글루코오스로의 가수분해를 위한, 이전에 기재된 폴리펩티드 또는 이전에 기재된 세포 중 임의의 하나의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 주제는 또한 바이오연료의 생성을 위한, 이전에 기재된 폴리펩티드 또는 이전에 기재된 세포 중 임의의 하나의 용도이다.

본 발명에 따르면, 용어 "바이오연료" 는 바이오매스의 전환으로부터 산출되고 에너지 목적을 위해 사용될 수 있는 임의의 생성물로서 정의될 수 있다. 처음으로, 그리고 제한 없이, 바이오가스는 예를 들어, (임의로 후속 전환 후) 연료 내로 도입될 수 있거나 또는 그 자체로 연료일 수 있는 생성물, 예컨대 알코올 (사용되는 발효성 유기체의 유형에 따라 에탄올, 부탄올 및/또는 이소프로판올), 용매 (아세톤), 산 (부티르산), 지질 및 이의 유도체 (단쇄 또는 장쇄 지방산, 지방산 에스테르), 및 또한 수소가 언급될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 바이오연료는 알코올, 예를 들어 에탄올, 부탄올 및/또는 이소프로판올이다. 더욱 우선적으로, 본 발명에 따른 바이오연료는 에탄올이다.

또다른 구현예에서, 바이오연료는 바이오가스이다.

또다른 구현예에서, 생성물은 화학 산업에서 유리한 분자, 예를 들어, 기타 알코올, 예컨대 1,2-프로판디올, 1,3-프로판디올, 1,4-부탄디올, 2,3-부탄디올, 유기 산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 아크릴산, 부티르산, 숙신산, 말산, 푸마르산, 시트르산 또는 이타콘산, 또는 히드록시산, 예컨대 글리콜산, 히드록시프로피온산 또는 락트산이다.

바이오연료의 제조에 더해, 30℃ 내지 35℃ 의 온도에서 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 또한 다양한 기질의 가수분해를 촉매화하고, 따라서 다양한 아로마/풍미의 방출을 가능하게 함으로써 다른 유형의 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이것은 상기 과일 내에 존재하는 여러 글루코시드를 가수분해함으로써 과일 풍미를 방출하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 그 밖에 이것은 포도 모노테르페닐 베타-글루코시드를 가수분해하여, 와인에 대한 풍미의 중요한 공급원을 나타낼 수 있다. 따라서, 이전에 기재된 폴리펩티드는 여러 분야, 특히 향수산업, 식품 산업, 와인 양조학 등에서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 사상 진균의 균주, 바람직하게는 트리코데르마 (Trichoderma), 더욱 우선적으로 T. 레에세이 (T. reesei) 는 미생물의 성장을 위해 선택된, 탄소-기재 배지, 예컨대 락토오스 또는 글루코오스의 존재 하에, 발효조에서 배양된다. 하나의 구현예에서, 상기 탄소-기재 기질은, 그의 특성에 따라, 살균 전에 발효조 내에 도입되거나 또는 개별적으로 살균되고 20 내지 35 g/l 의 초기 농도를 수득하도록 이의 살균 후에 발효조 내에 도입된다.

효소의 생성으로부터 선택되는 기질을 함유하는 수용액을 이후 첨가한다. 진균에 의해 생성된, 리그노셀룰로오스 바이오매스 상에 작용하는 효소 조성물은 배양 배지의 여과에 의해 최종적으로 회수된다. 상기 조성물은 특히 엔도글루카나아제, 엑소글루카나아제 및 본 발명에 따른 베타-글루코시다아제를 함유한다. 하나의 구현예에서, 효소의 생성으로부터 선택되는 기질을 함유하는 수용액을 200-250 g/l 의 농도로 제조하고; 상기 용액은 락토오스와 같은 유도제 기질을 함유해야만 한다. 상기 수용액은 35 내지 45 mg/g 의 셀 (공급 배치) 의 최적 양을 제공하도록 초기 탄소-기재 기질의 소모 후에 주입된다. 상기 공급 배치 상 동안, 배양 배지 내의 당의 잔류 농도는 1 g/l 미만이고, 리그노셀룰로오스 바이오매스 상에 작용하는 효소는 진균에 의해 분비된다. 상기 효소는 배양 배지의 여과에 의해 회수될 수 있다.

본 발명의 주제는 리그노셀룰로오스 바이오매스 상에 작용하는 효소 조성물로서, 상기 효소 조성물은 사상 진균 또는 효모에 의해 생성되고 이전에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 효소 조성물이다.

마지막으로, 본 발명의 주제는 하기 단계:

- 수성상 내에, 가수분해하고자 하는 물질의 현탁;

- 글루코오스를 함유하는 가수분해물을 생성하도록, 효소 조성물의 존재 하에, 이전에 기재된 리그노셀룰로오스 바이오매스의 가수분해;

- 가수분해물의 글루코오스의 발효;

- 발효 포도액으로부터 바이오연료의 분리

를 포함하고,

가수분해 및 발효 단계가 동시에 실시되는 것을 특징으로 하는, 바이오매스로부터 바이오연료의 제조 방법이다.

본 발명의 또다른 주제는 하기 단계:

- 수성상 내에, 가수분해하고자 하는 바이오매스의 현탁;

- 이전에 정의된 리그노셀룰로오스 바이오매스 상에 작용하는 효소 조성물 및 발효성 유기체의 동시 첨가 및 인큐베이션;

- 발효 포도액으로부터 바이오연료의 분리

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오매스로부터 바이오연료를 제조하기 위한 방법이다.

본 발명의 또다른 주제는 하기 연속 단계:

- 수성상 내에, 가수분해하고자 하는 바이오매스의 현탁;

- 발효 포도액을 생성하도록, 30℃ 내지 35℃ 의 온도에서 이전에 정의된 하나 이상의 셀룰로오스분해성 및/또는 발효성 유기체의 첨가;

- 발효 포도액으로부터 바이오연료의 분리

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오매스로부터 바이오연료의 제조 방법이다.

상기 구현예에 따르면, 바이오매스 내에 존재하는 셀룰로오스는 글루코오스로 전환되고, 동시에, 동일한 반응기 내에서, 발효성 유기체 (예를 들어 효모) 는 당업자에게 공지된 SSF (동시 당화 및 발효) 공정에 따라 글루코오스를 최종 생성물로 전환시킨다. 발효성 유기체의 대사성 및 가수분해성 능력에 따라, 작업의 올바른 수행은 더 많은 또는 더 적은 양의 외생 셀룰로오스분해성 혼합물의 첨가를 필요로 할 수 있다.

또다른 구현예에서, 발효성 유기체는 사상 진균에 의해 생성된 효소에 대한 필요성을 제한하거나 제거하도록 리그노셀룰로오스 바이오매스 상에 작용하는 다른 효소와 임의로 함께, 이의 세포 표면 상에 또는 분비에 의해 본 발명의 주제인 폴리펩티드를 생성한다.

본 발명에 따라 약 30℃ 내지 약 35℃ 의 온도에서 더욱 양호한 베타-글루코시다아제 활성을 나타내는 폴리펩티드의 사용은 따라서 더욱 양호한 글루코오스 생성 수율을 수득하는 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명은 이전보다 효소를 적게 사용하는 것을 가능하게 하며, 이것은 바이오연료 생성 비용이 예를 들어, 줄어드는 경제적인 장점을 갖는다.

본 발명의 기타 양상, 주제, 장점 및 특성은 하기에 이어지고 예를 들어 제시된, 본 발명의 바람직한 구현예를 기술하는 비-제한적인 설명의 판독 시 제시될 것이다.

실시예

실시예 1 : 첫번째 라운드 셔플링

트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 베타-글루코시다아제 유전자 (모체 유전자 BGL1, SEQ ID No. 4) 의 서열을 EP 1 104 457 B1 에 기재된 특허 공정에 따라 BGL1 모체 유전자와 70% 일치성을 갖는 카에토뮴 글로보숨 (Chaetomium globosum) (유전자 A) (SEQ ID No. 7, 핵산 서열 SEQ ID No. 8 에 의해 엔코딩됨) 의 추정적 글루코시다아제 유전자와의 첫번째 라운드 셔플링에 적용하였다.

1- 고출력 스크리닝

고출력 스크리닝 시험은 상기 2 개의 서열의 셔플링으로부터 산출되는 최고의 클론, 즉, T. 레에세이 (T. reesei) 로부터의 BGL1 모체 유전자와 비교하였을 때 베타-글루코시다아제 활성 수준에서 2 보다 큰 향상 인자를 갖는 것들을 선별하는 것을 가능하게 하였다.

첫번째 라운드 셔플링의 라이브러리 스크리닝 시험을 하기 단계에 따라 실시하였다:

- 본 발명에 따른 재조합 효소의 셔플링 변이체를 발현하는 대장균의 다양한 콜로니의 아가 상의 단리 및 37℃ 에서 밤새 LB 배지에서 상기 콜로니의 예비배양;

- 3% 예비배양물로 LB 배지의 접종, 이후 4h 동안 37℃ 에서 인큐베이션;

- 100 μM 이소프로필-베타-티오-갈락토사이드 (IPTG) 의 첨가에 의한 변이체의 발현 유도, 이후 20℃ 에서 밤새 인큐베이션;

- 13 000 rpm 에서 2 분 동안 원심분리;

- 2.2 mM 의 파라-니트로페닐 베타-D-글루코피라노시드 (pNPG) 를 함유하는 100 ㎕ 의 0.1 M 숙시네이트 완충액 중에 세포 펠렛의 재현탁;

- 주위 온도에서 3h 동안 인큐베이션;

- 알칼리화 후 414 nm 에서의 광학 밀도의 판독.

상기 스크리닝 조건 하에서, BGL1 참조 효소와 비교하여 베타-글루코시다아제 활성의 향상을 나타내는 여러 개의 클론을 확인하였다.

2- 베타-글루코시다아제 활성의 향상 측정

2-1/ pNPG 기질 상에서

첫번째 라운드 셔플링에서 선택되는 변이체의 상대적 kcat 를 측정하기 위해, 하기 절차를 실시하였다:

- 37℃ 에서 밤새, 본 발명에 따른 재조합 효소를 발현하는 대장균의 저장 배양액의 형성;

- IPTG (250 μM) 유도와 함께 24h 동안 20℃ 에서 LB 배양 배지의 1% 의 저장 배양액으로의 접종;

- 2 분 동안 13 000 rpm 에서 원심분리;

- 150 ㎕ 의 0.2 M Na₂CO₃ 의 첨가;

- 2 분 동안 13 000 rpm 에서의 원심분리;

- 150 ㎕ 의 상청액에 대한 414 nm 에서의 광학 밀도의 판독.

표 2 는 상기 실험 조건 하에서 3 개의 이전에 확인된 클론 (10H7, 59B8 및 164A2 로 불림) 에 대해 수득된 kcat 값 및 또한 향상 인자를 제공한다.

표 2 : 베타-글루코시다아제 활성의 향상

(유도된 배양물의 결과)

결과는 3 개의 클론 10H7, 59B8 및 164A2 에 대해 야생형 효소 (BGL1) 와 비교한 효소 활성의 매우 상당한 향상을 보여준다.

2-2/ 셀로비오스 상에서

10H7, 59B8 및 164A2 클론의 활성의 향상을 이후 두번째 기질: 셀로비오스에 대해 확인하였다.

상기 시험은 본 발명에 따른 재조합 효소를 발현하는 대장균의 배양물 상에서 실시하였다. 시험 단계는 하기와 같다:

- IPTG 로 유도되는 1% 의 저장 배양액으로의 LB 배양 배지의 접종, 이후 37℃ 에서 밤새 인큐베이션;

- 상기 세포를 37℃ 에서 0.4 의 600 nm 에서의 광학 밀도가 수득될 때까지 배양;

- 상기 세포를 250 μM IPTG 로 20℃ 에서 20 시간 동안 유도;

- 배양 배지 글루코오스를 제거하기 위해, 100 mM 숙시네이트 완충액 (pH 5) 에서 세포 펠렛을 3 회 세정;

- 마이크로플레이트에서 12 시간 동안 50℃ 에서 10 ㎕ 의 상기 세포 및 190 ㎕ 의 셀로비오스 (263.2 mM) 로 이루어지는 반응 믹스 (RM1) (최종 농도 250 mM) 를 제조함;

- 마이크로플레이트에서 12 시간 동안 50℃ 에서 인큐베이션.

발현:

- 하기로 이루어지는 반응 믹스 (RM2) 를 제조한다:

- 10 ㎕ 의 RM1,

- 90 ㎕ 의 100 mM 숙시네이트 완충액 (pH 5),

- 5 ㎕ 의 글루코오스 옥시다아제 (44 U/ml).

- 주위 온도에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.

- 하기를 30 분 동안 주위 온도에서 혼합 및 인큐베이션한다:

- 10 ㎕ 의 RM2,

- 2 ㎕ 의 호스래디쉬 퍼록시다아제 (10 U/ml),

- 5 ㎕ 의 100 mM ABTS,

- 83 ㎕ 의 50 mM 포스페이트 완충액, pH 7.4.

- 420 nm 에서 광학 밀도를 판독한다.

표 3 : 베타-글루코시다아제 활성의 향상

(유도된 배양액의 결과)

마찬가지로, 결과는 셀로비오스가 기질로서 사용되었을 때 10H7, 59B8 및 164A2 클론에 대해 야생형 효소 (BGL1) 와 비교한 효소 활성의 매우 상당한 향상을 보여준다.

실시예 2 : 두번째 라운드 셔플링

첫번째 라운드 셔플링에서 수득된 향상된 유전자의 서열을 이어서 두번째 라운드 셔플링 (여전히 EP 1 104 457 B1 에 기재된 특허받은 방법에 따름) 에 적용하였다. 유전적 다양성을 증가시키기 위해, 야생형 BGL1 효소와 70% 일치성을 갖는 베타-글루코시다아제를 엔코딩하는 하나 이상의 유전자를 첨가하였다.

더욱 구체적으로는, 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) 의 추정적 글루코시다아제 유전자 (유전자 C) (핵산 서열 SEQ ID No. 10 에 의해 엔코딩되는 SEQ ID No. 9) 가 사용되었다.

1- 고출력 스크리닝

이전에 기재된 고출력 스크리닝 시험 (IPTG 유도 단계를 제외함, 첫번째 라운드 셔플링에서 제공된 향상이 오직 프로모터 누출에 근거한 베타-글루코시다아제 활성의 검출을 가능하게 하므로) 을 최고의 클론, 즉, 164A2 클론과 비교하였을 때 베타-글루코시다아제 활성 수준에서 2 보다 큰 향상 인자를 나타내는 것들을 선별하기 위해, 본 두번째 라운드 셔플링에 따라 수득되는 클론 상에서 실시하였다.

상기 스크리닝 조건 하에서, 참조 효소 (164A2) 와 비교한 베타-글루코시다아제 활성의 향상은, 특히 100B11 (핵산 서열 SEQ ID No. 6 에 의해 엔코딩된 SEQ ID No. 5) 및 115E1 (핵산 서열 SEQ ID No. 12 에 의해 엔코딩된 SEQ ID No. 11) 클론을 비롯한 여러 클론에서 발견되었다.

2-베타-글루코시다아제 활성의 향상의 측정

2-1/ pNPG 상에서

상대적 kcat 를 측정하기 위해, 100B11 및 115E1 클론의 활성을 이전에 기재된 활성 시험에 의해 측정하였다.

표 4 는 상기 실험 조건 하에서 100B11 및 115E1 클론에 대해 수득된 kcat 값 및 또한 향상 인자를 제시한다.

표 4 : 베타-글루코시다아제 활성의 향상

(유도된 배양액의 결과)

결과는 100B11 및 115E1 클론에 대해 참조 효소 (164A2) 및 BGL1 (X60) 과 비교한 효소 활성의 매우 상당한 향상을 보여준다.

2-2/ 셀로비오스 상에서

100B11 및 115E1 클론의 활성의 향상을 이후 두번째 기질: 셀로비오스 상에서 확인하였다.

상대적 kcat 를 측정하기 위해, 100B11 및 115E1 클론의 활성을, 실시예 1 의 2-2 지점에서 기재된 바와 같은 기질로서 셀로비오스를 사용하는 이전에 기재된 50℃ 에서의 활성 시험에 의해 측정하였다.

표 5 : 베타-글루코시다아제 활성의 향상

(유도된 배양액의 결과)

마찬가지로, 결과는 셀로비오스가 기질로서 사용되었을 때 100B11 및 115E1 클론에 대해 참조 효소 (164A2) 와 비교한 효소 활성의 매우 상당한 향상을 보여준다.

실시예 3 : 세번째 라운드 셔플링

두번째 라운드 셔플링에서 수득된 14 개의 향상된 유전자 (138E12, 134G2, 100B11, 115E1, 99G11, 127B12, 91F6, 135F9, 116D9, 212D11, 210A6, 124F5, 129D2 및 141F7) 의 서열을 이어서 세번째 라운드 셔플링 (여전히 EP 1 104 457 B1 에 기재된 특허받은 방법에 따름) 에 적용하였다. 유전적 다양성을 증가시키기 위해, 상기 유전자와 70% 일치성을 갖는 베타-글루코시다아제를 엔코딩하는 하나 이상의 유전자를 첨가하였다. 본 정확한 예에서, 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) 의 추정적 베타-글루코시다아제 유전자 (유전자 C) (핵산 서열 SEQ ID No. 10 에 의해 엔코딩되는 SEQ ID No. 9) 및 카에토뮴 글로보숨 (Chaetomium globosum) 의 추정적 베타-글루코시다아제 유전자 (유전자 A) (핵산 서열 SEQ ID No. 8 에 의해 엔코딩되는 SEQ ID No. 7) 가 사용되었다.

1- 고출력 스크리닝

이전에 기재된 고출력 스크리닝 시험 (IPTG 유도 단계를 제외함, 첫번째 라운드 셔플링에서 제공된 향상이 오직 프로모터 누출에 근거한 베타-글루코시다아제 활성의 검출을 가능하게 하므로) 을 본 세번째 라운드 셔플링에 따라 수득되는 클론 상에서 실시하였다. 상기 클론의 활성을 30℃ 및 50℃ 에서 측정하였다.

상기 스크리닝 조건 하에, 17E5 클론 (핵산 서열 SEQ ID No. 2 에 의해 엔코딩되는, 아미노산 서열 SEQ ID No. 1) 을 선택하였는데, 이것이 유리한 30℃/50℃ 활성 비를 가지고 있기 때문이다.

표 6 은 17E5 클론 및 100B11 클론 (두번째 라운드 셔플링으로부터 산출되는 참조 클론) 에 대해 50℃ 및 30℃ 에서 수득된 상대적 활성을 제공한다.

표 6 : 30℃ 에서의 상대적 활성

결과는 17E5 클론이, 100B11 클론의 경우 53% 에 대비하여, 50℃ 에서의 이의 활성과 비교하여 30℃ 에서 80% 활성을 보유한다는 것을 보여준다.

게다가, 이의 특이적 활성은 100B11 효소의 것보다 2 의 인자가 더 크다.

2-베타-글루코시다아제 활성의 측정

상대적 kcat 를 측정하기 위해, 17E5 클론의 활성을 이전에 기재된 활성 시험에 의해 30℃ 및 50℃ 에서 측정하였다.

표 7 은 상기 실험 조건 하에서 17E5 클론에 대해 수득된 kcat 값 및 또한 향상 인자를 제시한다.

표 7 : 30℃ 에서 베타-글루코시다아제 활성의 향상

(비유도된 배양물의 결과)

결과는 참조 클론과 비교하여 2 의 인자의 17E5 클론의 효소 활성의 향상을 보여준다 (이것은 두가지 온도 모두에서임).

실시예 4 : 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 중의 베타-글루코시다아제의 향상된 변이체의 발현

17E5 유전자를 하이그로마이신을 사용하는 선별 (스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus) Hph 유전자) 로 RUT C30 (ATCC 56765), CL847 (Durand et al., Enzyme Microb. Technol., 1988; 10:341-346) 로부터 유래된 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 균주에서의 발현을 허용하는 벡터 내로 클로닝하였다. 17E5 유전자는 다른 T. 레에세이 (T. reesei) 셀룰라아제와 동시에 유도가능한 cbh1 강한 프로모터의 통제 하에 위치하였다.

트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 의 형질전환을 당업자에게 공지된 통상의 방법에 따라 실시하였다 (칼슘 쇼크에 의한 원형질체의 형질전환 및 50μg/ml 하이그로마이신으로의 선별). 포자형성에 의해 형질전환체를 정제하고, 이후 불안정한 클론을 제거하기 위해 선별 배지에서 2 회 서브배양하였다.

이후 30 개의 클론을 24-웰 플레이트 중의 셀룰라아제 생성에 대해 평가하였다. 각각의 클론의 몇몇 포자를 하기 조성을 갖는 2 ml 의 배지를 접종하는데 사용하였다: 20 g/l 락토오스, 20 g/l Solka floc 셀룰로오스, 5 g/l 펩톤, 15 g/l KH₂PO₄, 5 g/l (NH₄)₂SO₄, 0.6 g/l CaCl₂, 0.6 g MgSO₄, 0.005 g/l FeSO₄, 0.0014 g/l MnSO₄, 0.0014 g/l ZnSO₄, 0.0037 g/l CoCl₂, 11.6 g/l 의 말레산, 12.1 g/l 의 트리스 및 2.08 g/l 의 NaOH. 플라스크를 150 rpm 로 교반하면서 30℃ 에서 인큐베이션하였다.

5 일 후, 배양물을 원심분리하고, 상청액의 단백질 농도를 폴린 (Folin) 방법을 사용하여 측정하였다. 상청액의 베타-글루코시다아제 활성을 하기 조건 하에서 파라-니트로페닐 베타-D-글루코피라노시드 (pNPG) 발색단 기질의 가수분해에 의해 측정하였다:

- 50 mM 의 시트레이트 완충액 (pH 4.8)

- 5 mM 의 pNPG

- 10 ㎕ 의 샘플

- 30℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션.

반응은 100 ㎕ 의 2% 탄산나트륨을 첨가함으로써 중지되었다. pNPG 의 가수분해에 의해 방출된 파라-니트로페놀의 양을 410 nm 에서의 흡광도를 측정함으로써 측정하고, 파라-니트로페놀 범위와 비교하였다. 반응은 25 에서 400 μM 의 파라-니트로페놀로 선형이었다. 샘플을 임의로 희석하여, 측정된 흡광도가 선형성의 범위에 남아있게 하였다. 베타-글루코시다아제 활성을 비교를 위해, 상기와 동일한 조건 하에서 또한 50℃ 에서 측정하였다. 가장 높은 베타-글루코시다아제 활성 (기원 균주와 비교하여 적어도 5 의 인자가 큼) 을 나타내는 클론을 선별하였다.

표 8 은 야생형 CL847 균주로부터, 변이체 100B11 을 발현하는 균주로부터 및 상기 기재된 방법에 따라 수득된, 변이체 17E5 를 발현하는 클론 중 하나로부터 각각 유래된, 상청액에 대해 μmol/min/mg 의 효소로 측정된 30℃/50℃ pNPase 베타-글루코시다아제 활성을 보여준다.

표 8: 야생형 CL847, 100B11 폴리펩티드 및 17E5 폴리펩티드의 베타-글루코시다아제 활성

30℃/50℃ 비의 증가는 30℃ 의 온도에서 100B11 변이체의 것보다 큰 특이적 활성을 갖고, 17E5 클론에서 명시된다.

실시예 5 : 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 내의 야생형 베타-글루코시다아제 (BGL1) 및 향상된 변이체 100B11 및 17E5 의 재조합 발현

1- 효모 세포질 내의 BGL1, 100B11 및 17E5 단백질의 제조:

트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) (BGL1) 의 야생형 베타-글루코시다아제 유전자 및 또한 100B11 및 17E5 변이체의 것을 신호 펩티드 없이 pESC-Leu 벡터 (Agilent Technologies) 내로 클로닝하였다. 상기 구축물은 류신 및 트립토판에 대해 영양요구성인, 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) EBY100 균주의 세포질에서 단백질의 발현을 허용한다 (Boder ET and Wittrup KD, Biotechnol Prog, 1998, 14:55-62). 상기 플라스미드는 유전자 발현을 갈락토오스-유도가능 GAL1 프로모터의 조절 하에 두는 것을 가능하게 하고, 형질전환체의 선별을 허용하는 선별가능 영양요구성 마커 유전자 (Leu2) 를 갖는다. 생성된 단백질은 마지막으로 N-말단 c-myc 태그에 융합되어, 친화성 크로마토그래피에 의해 생성된 효소의 검출 및 정제를 허용한다.

S. 세레비지아에 (S. cerevisiae) EBY100 의 형질전환을 당업자에게 공지된 통상의 방법에 따라 실시하였다 (열 쇼크 및 리튬 아세테이트에 의한 효모의 형질전환). 형질전환체를 0.67% 의 Yeast Nitrogen Base (YNB), 2% 의 글루코오스 및 0.01% 의 트립토판을 함유하는 YNB-Glc-Trp 배지 상에서 선별하였다.

각각의 유전자에 대해 (Sc-BGL1, Sc-100B11 및 Sc-17E5) 하나의 형질전환체를 0.67% 의 YNB, 0.5% 의 카사미노산 (CAA), 0.01% 의 트립토판 및 2% 의 글루코오스를 함유하는 15 ml 의 YNB-Glc-CAA-Trp 최소 배지를 접종하는데 사용하였다. 220 rpm 에서 교반하면서 30℃ 에서 24 시간의 예비배양 후, 3 개의 Sc-BGL1, Sc-100B11 및 Sc-17E5 균주를 0.67% 의 YNB, 0.5% 의 CAA, 0.01% 의 트립토판 및 2% 의 갈락토오스를 함유하는 150 ml 의 YNB-Gal-CAA-Trp 배지 (0.5 의 OD₆₀₀ 에서) 를 접종하는데 사용하였다. 배양물을 220 rpm 에서 교반하면서 25℃ 에서 인큐베이션하였다.

4 일 인큐베이션 후, 20 ml 의 배양물을 3000 g 로, 4℃ 에서 5 분 동안 원심분리하였다. 효모 펠렛을 3 ml 의 50 mM 시트레이트 완충액, pH 5 에 취하고, 2.5 kbar 의 압력으로 기계적으로 용리하였다. 세포질 추출물을 4℃ 에서 30 분 동안 50 000 g 에서의 원심분리 후 수득하였다.

2- 베타-글루코시다아제 활성의 측정

세포질 추출물 중의 총 단백질 농도를 Bradford 어세이 (Bradford MM., Anal Biochem, 1976, 72:248-54) 에 의해, 평균적으로 1.7 mg/ml 에서 추정하였다.

세포질 추출물의 베타-글루코시다아제 활성을 하기 조건 하에서 600 ㎕ 의 부피로 파라-니트로페닐 베타-D-글루코피라노시드 (pNPG) 기질의 가수분해에 의해 측정하였다:

- 50 mM 의 시트레이트 완충액 (pH 5)

- 5 mM 의 pNPG

- 6.1 ㎍ 의 총 단백질을 함유하는 3.6 ㎕ 의 세포질 추출물

- 30℃ 또는 50℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션.

100 ㎕ 의 1M 탄산나트륨을 100 ㎕ 의 가수분해 반응에 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. pNPG 의 가수분해에 의해 방출된 파라-니트로페놀 (pNP) 의 농도를 415 nm 에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하고, 파라-니트로페놀의 표준 범위 (0.36 μM 에서 360 μM 로 선형) 와 비교하였다. 세포질 추출물을 초기 반응 속도 조건 하에 두도록 하기 위해 임의로 희석하였다.

표 9 는 야생형 효소 (Sc-BGL1) 를 발현하는 균주, 100B11 (Sc 100B11) 을 발현하는 균주 및 17E5 (Sc-17E5) 를 발현하는 균주로부터 각각 유래된 세포질 추출물에 대해 μmol.min^-1.mg^-1 의 총 단백질로 측정된 30℃/50℃ 베타-글루코시다아제 활성 비를 보여준다.

표 9: Sc-BGL1, Sc-100B11 및 Sc-17E5 의 베타-글루코시다아제 활성

상기 결과는 Sc-17E5 균주의 30℃ 에서의 특이적 활성은 Sc-BGL1 균주와 비교하여 3 의 인자 및 Sc-100B11 과 비교하여 2.5 의 인자가 더 크다는 것을 보여준다.

실시예 6 : 야생형 베타-글루코시다아제 (BGL1) 및 S. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 에서 생성된 향상된 변이체 100B11 및 17E5 의 정제 및 특징분석

1- 베타-글루코시다아제 정제:

실시예 5 의 Sc-BGL1 및 Sc-100B11 및 Sc-17E5 변이체의 세포질 추출물을 하기 프로토콜에 따라 상응하는 효소, BGL1, 100B11 및 17E5 를 정제하기 위해 사용하였다:

500 ㎕ 의 세포질 추출물을 축 교반으로 4℃ 에서 1h 동안 20 ㎕ 의 "Anti-c-Myc tag Gel" 수지 (MBL) 와 함께 인큐베이션하였다. 13 000 rpm 에서 10 초의 원심분리 후에, 수지를 1X PBS 로 3 회 세정하였다. c-myc 펩티드 (EQKLISEEDL) (1 mg.ml^-1) 로 구성된 용리 용액 중의 5 분 동안 4℃ 에서의 수지의 인큐베이션 후, 단백질의 용리를 13 000 rpm 에서 10 초 동안의 원심분리에 의해 실시하였다.

2- 베타-글루코시다아제 활성의 측정

정제된 효소의 농도를 고유의 BGL1 에 대해 120 125 M^-1.cm^-1 및 100B11 및 17E5 에 대해 120 250 M^-1.cm^-1 과 동일한 몰 흡광 계수를 사용하여, 나노드롭으로 280 nm 에서의 흡광도를 측정함으로써 수득하였다. 상기 농도는 평균 0.19 mg/ml 과 동일하다.

각각의 효소의 순도를 코마시 블루 (Coomassie blue) 를 사용하는 단백질 염색으로 SDS 의 존재 하에 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해 입증하였다.

BGL1 및 정제된 100B11 및 17E5 변이체의 활성을 30℃ 및 50℃ 에서 이전에 기재된 바와 같이 측정하였다.

표 10 은 30℃ 및 50℃ 에서 pNPG 의 가수분해 동안 측정된 각각의 효소 (μmol.min^-1.mg^-1 의 효소) 의 특이적 활성을 보여준다.

표 10: 정제된 BGL1, 100B11 및 17E5 의 베타-글루코시다아제 활성

결과는 야생형 BGL1 과 비교하여 2 및 100B11 변이체와 비교하여 1.4 의 인자에 의해 17E5 변이체의 특이적 활성의 30℃ 에서의 향상을 보여준다.

<110> IFP Energies nouvelles <120> POLYPEPTIDE WITH REINFORCED BETA-GLUCOSIDASE ACTIVITY AT LOW TEMPERATURE <130> BFF120334 <160> 12 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 744 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 1 Met Arg Tyr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Pro Phe 1 5 10 15 Ala Arg Ala Asp Ser His Ser Thr Ser Gly Ala Ser Ala Glu Ala Val 20 25 30 Val Pro Pro Ala Gly Thr Pro Trp Gly Thr Ala Tyr Asp Lys Ala Lys 35 40 45 Ala Ala Leu Ala Lys Leu Asn Leu Gln Asp Lys Val Gly Ile Val Ser 50 55 60 Gly Val Gly Trp Asn Gly Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Ser Pro Ala 65 70 75 80 Ser Lys Ile Gly Tyr Pro Gln Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly 85 90 95 Ile Arg Phe Gly Gly Ser Val Thr Ala Phe Thr Pro Gly Ile Gln Ala 100 105 110 Ala Ser Thr Trp Asp Thr Glu Leu Met Arg Gln Arg Gly Glu Tyr Leu 115 120 125 Gly Ala Glu Ala Lys Gly Cys Gly Ile His Val Leu Leu Gly Pro Val 130 135 140 Ala Gly Pro Leu Gly Lys Thr Pro Gln Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly 145 150 155 160 Phe Gly Val Asp Pro Tyr Leu Thr Gly Ile Ala Met Ala Glu Thr Ile 165 170 175 Glu Gly Leu Gln Ser Ala Gly Val Gln Ala Cys Ala Lys His Tyr Ile 180 185 190 Val Asn Glu Gln Glu Leu Asn Arg Glu Thr Ile Ser Ser Asn Pro Asp 195 200 205 Asp Arg Thr Leu His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val 210 215 220 His Ala Asn Val Ala Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Lys Ile Asn Gly 225 230 235 240 Ser Trp Ala Cys Glu Asp Gln Tyr Thr Leu Gln Thr Val Leu Lys Asp 245 250 255 Gln Leu Gly Phe Pro Gly Tyr Val Met Thr Asp Trp Asn Ala Gln His 260 265 270 Thr Thr Val Gln Ser Ala Asn Ser Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly 275 280 285 Thr Asp Phe Asn Gly Asn Asn Arg Leu Trp Gly Pro Ala Leu Thr Asn 290 295 300 Ala Val Asn Ser Asn Gln Val Pro Thr Ser Arg Val Asp Asp Met Val 305 310 315 320 Thr Arg Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Thr Gly Gln Asp Gln Ala Gly 325 330 335 Tyr Pro Ser Phe Asn Ile Ser Arg Asn Val Gln Gly Asn His Lys Thr 340 345 350 Asn Val Arg Ala Ile Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp 355 360 365 Ala Asn Ile Leu Pro Leu Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Val Val Gly 370 375 380 Ser Ala Ala Ile Ile Gly Asn His Ala Arg Asn Ser Pro Ser Cys Asn 385 390 395 400 Asp Lys Gly Cys Asp Asp Gly Ala Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser Gly 405 410 415 Ala Val Asn Tyr Pro Tyr Phe Val Ala Pro Tyr Asp Ala Ile Asn Thr 420 425 430 Arg Ala Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp Asn 435 440 445 Thr Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ala Arg Gly Lys Asp Val Ala Ile Val 450 455 460 Phe Ile Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly Asn 465 470 475 480 Ala Gly Asp Arg Asn Asn Leu Asp Pro Trp His Asn Gly Asn Ala Leu 485 490 495 Val Gln Ala Val Ala Gly Ala Asn Ser Asn Val Ile Val Val Val His 500 505 510 Ser Val Gly Ala Ile Ile Leu Glu Gln Ile Leu Ala Leu Pro Gln Val 515 520 525 Lys Ala Val Val Trp Ala Gly Leu Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn Ala 530 535 540 Leu Val Asp Val Leu Trp Gly Asp Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val 545 550 555 560 Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Pro Asn Asp Tyr Asn Thr Arg Ile Val Ser 565 570 575 Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Glu Gly Leu Phe Ile Asp Tyr Lys His 580 585 590 Phe Asp Asp Ala Asn Ile Thr Pro Arg Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu 595 600 605 Ser Tyr Thr Lys Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Val Leu Ser Thr Ala 610 615 620 Lys Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Val Pro Gly Gly Pro Ser Asp 625 630 635 640 Leu Phe Gln Asn Val Ala Thr Val Thr Val Asp Ile Ala Asn Ser Gly 645 650 655 Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Thr Tyr Pro Ser 660 665 670 Ser Ala Pro Arg Thr Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ala Lys Leu 675 680 685 Asn Leu Thr Pro Gly Gln Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn Ile Arg Arg 690 695 700 Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Ala Ser Gln Lys Trp Val Val Pro 705 710 715 720 Ser Gly Ser Phe Gly Ile Ser Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg 725 730 735 Leu Thr Ser Thr Leu Ser Val Ala 740 <210> 2 <211> 2235 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 2 atgcgttacc gaacagcagc tgcgctggca cttgccactg ggccctttgc tagggcagac 60 agtcactcaa catcgggggc ctcggctgag gcagttgtac ctcctgcagg gactccatgg 120 ggaaccgcgt acgacaaggc gaaggccgca ttggcaaagc tcaatctcca agataaggtc 180 ggcatcgtga gcggtgtcgg ctggaacggc ggtccttgcg ttggaaacac atctccggcc 240 tccaagatcg gctatccaca gctatgcctt caagacggac ccctcggtat ccgattcggc 300 ggcagcgtca cagcctttac gccgggcatc caagcggcct cgacgtggga taccgagttg 360 atgcgccagc gtggagagta cctgggtgcc gaggccaagg gctgcgggat tcatgtcctg 420 cttggtcctg tggctgggcc gctgggaaag actccgcagg gcggtcgcaa ctgggagggc 480 ttcggtgtcg atccatatct cacgggcatt gccatggccg agacaatcga gggcctgcag 540 tcggccggcg tgcaggcgtg cgcgaagcac tatatcgtca acgagcagga gctcaatcga 600 gaaaccattt cgagcaaccc agatgaccga actctccatg agctgtatct gtggccattt 660 gccgacgcgg ttcacgccaa tgtcgcttct gtcatgtgct cgtacaacaa gatcaatggc 720 agctgggcct gcgaggatca gtacacgctg cagactgtgc tgaaagacca gctggggttc 780 ccaggctatg tcatgacgga ctggaacgca cagcacacga ctgtccaaag cgcgaattct 840 gggcttgaca tgtcaatgcc tggcacagac ttcaacggta acaatcggct ctggggtcca 900 gctctcacca atgcggtaaa tagcaatcag gtccccacga gcagagtcga cgatatggtg 960 actcgtatcc tcgccgcatg gtacttgaca ggccaggacc aggcaggcta tccgtcgttc 1020 aacatcagca gaaatgttca aggaaaccac aagaccaatg tcagggcaat tgccagggac 1080 ggcatcgttc tgctcaagaa tgacgccaac atcctgccgc tcaagaagcc cgctagcatt 1140 gccgtcgttg gatctgccgc aatcattggt aaccacgcca gaaactcgcc ctcgtgcaac 1200 gacaaaggct gcgacgacgg ggccttgggc atgggttggg gttccggcgc cgtcaactat 1260 ccgtacttcg tcgcgcccta cgatgccatc aataccagag cgtcttcgca gggcacccag 1320 gttaccttga gcaacaccga caacacgtcc tcaggcgcat ctgcagcaag aggaaaggac 1380 gtcgccatcg tcttcatcac cgccgactcg ggtgaaggct acatcaccgt ggagggcaac 1440 gcgggcgatc gcaacaacct ggatccgtgg cacaacggca atgccctggt ccaggcggtg 1500 gccggtgcca acagcaacgt cattgttgtt gtccactccg ttggcgccat cattctggag 1560 cagattcttg ctcttccgca ggtcaaggcc gttgtctggg cgggtcttcc ttctcaggag 1620 agcggcaatg cgctcgtcga cgtgctgtgg ggagatgtca gcccttctgg caagctggtg 1680 tacaccattg cgaagagccc caatgactat aacactcgca tcgtttccgg cggcagtgac 1740 agcttcagcg agggactgtt catcgactat aagcacttcg acgacgccaa tatcacgccg 1800 cggtacgagt tcggctatgg actgtcttac accaagttca actactcacg cctctccgtc 1860 ttgtcgaccg ccaagtctgg tcctgcgact ggggccgttg tgccgggagg cccgagtgat 1920 ctgttccaga atgtcgcgac agtcaccgtt gacatcgcaa actctggcca agtgactggt 1980 gccgaggtag cccagctgta catcacctac ccatcttcag cacccaggac ccctccgaag 2040 cagctgcgag gctttgccaa gctgaacctc acgcctggtc agagcggaac agcaacgttc 2100 aacatccgac gacgagatct cagctactgg gacacggctt cgcagaaatg ggtggtgccg 2160 tcggggtcgt ttggcatcag cgtgggagcg agcagccggg atatcaggct gacgagcact 2220 ctgtcggtag cgtag 2235 <210> 3 <211> 744 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 3 Met Arg Tyr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Pro Phe 1 5 10 15 Ala Arg Ala Asp Ser His Ser Thr Ser Gly Ala Ser Ala Glu Ala Val 20 25 30 Val Pro Pro Ala Gly Thr Pro Trp Gly Thr Ala Tyr Asp Lys Ala Lys 35 40 45 Ala Ala Leu Ala Lys Leu Asn Leu Gln Asp Lys Val Gly Ile Val Ser 50 55 60 Gly Val Gly Trp Asn Gly Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Ser Pro Ala 65 70 75 80 Ser Lys Ile Ser Tyr Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly 85 90 95 Val Arg Tyr Ser Thr Gly Ser Thr Ala Phe Thr Pro Gly Val Gln Ala 100 105 110 Ala Ser Thr Trp Asp Val Asn Leu Ile Arg Glu Arg Gly Gln Phe Ile 115 120 125 Gly Glu Glu Val Lys Ala Ser Gly Ile His Val Ile Leu Gly Pro Val 130 135 140 Ala Gly Pro Leu Gly Lys Thr Pro Gln Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly 145 150 155 160 Phe Gly Val Asp Pro Tyr Leu Thr Gly Ile Ala Met Gly Gln Thr Ile 165 170 175 Asn Gly Ile Gln Ser Val Gly Val Gln Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile 180 185 190 Leu Asn Glu Gln Glu Leu Asn Arg Glu Thr Ile Ser Ser Asn Pro Asp 195 200 205 Asp Arg Thr Leu His Glu Leu Tyr Thr Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val 210 215 220 Gln Ala Asn Val Ala Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Lys Val Asn Thr 225 230 235 240 Thr Trp Ala Cys Glu Asp Gln Tyr Thr Leu Gln Thr Val Leu Lys Asp 245 250 255 Gln Leu Gly Phe Pro Gly Tyr Val Met Thr Asp Trp Asn Ala Gln His 260 265 270 Thr Thr Val Gln Ser Ala Asn Ser Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly 275 280 285 Thr Asp Phe Asn Gly Asn Asn Arg Leu Trp Gly Pro Ala Leu Thr Asn 290 295 300 Ala Val Asn Ser Asn Gln Val Pro Thr Ser Arg Val Asp Asp Met Val 305 310 315 320 Thr Arg Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Thr Gly Gln Asp Gln Ala Gly 325 330 335 Tyr Pro Ser Phe Asn Ile Ser Arg Asn Val Gln Gly Asn His Lys Thr 340 345 350 Asn Val Arg Ala Ile Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp 355 360 365 Ala Asn Ile Leu Pro Leu Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Val Val Gly 370 375 380 Ser Ala Ala Ile Ile Gly Asn His Ala Arg Asn Ser Pro Ser Cys Asn 385 390 395 400 Asp Lys Gly Cys Asp Asp Gly Ala Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser Gly 405 410 415 Ala Val Asn Tyr Pro Tyr Phe Val Ala Pro Tyr Asp Ala Ile Asn Thr 420 425 430 Arg Ala Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp Asn 435 440 445 Thr Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ala Arg Gly Lys Asp Val Ala Ile Val 450 455 460 Phe Ile Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly Asn 465 470 475 480 Ala Gly Asp Arg Asn Asn Leu Asp Pro Trp His Asn Gly Asn Ala Leu 485 490 495 Val Gln Ala Val Ala Gly Ala Asn Ser Asn Val Ile Val Val Val His 500 505 510 Ser Val Gly Ala Ile Ile Leu Glu Gln Ile Leu Ala Leu Pro Gln Val 515 520 525 Lys Ala Val Val Trp Ala Gly Leu Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn Ala 530 535 540 Leu Val Asp Val Leu Trp Gly Asp Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val 545 550 555 560 Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Pro Asn Asp Tyr Asn Thr Arg Ile Val Ser 565 570 575 Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Glu Gly Leu Phe Ile Asp Tyr Lys His 580 585 590 Phe Asp Asp Ala Asn Ile Thr Pro Arg Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu 595 600 605 Ser Tyr Thr Lys Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Val Leu Ser Thr Ala 610 615 620 Lys Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Val Pro Gly Gly Pro Ser Asp 625 630 635 640 Leu Phe Gln Asn Val Ala Thr Val Thr Val Asp Ile Ala Asn Ser Gly 645 650 655 Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Thr Tyr Pro Ser 660 665 670 Ser Ala Pro Arg Thr Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ala Lys Leu 675 680 685 Asn Leu Thr Pro Gly Gln Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn Ile Arg Arg 690 695 700 Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Ala Ser Gln Lys Trp Val Val Pro 705 710 715 720 Ser Gly Ser Phe Gly Ile Ser Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg 725 730 735 Leu Thr Ser Thr Leu Ser Val Ala 740 <210> 4 <211> 2235 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 4 atgcgttacc gaacagcagc tgcgctggca cttgccactg ggccctttgc tagggcagac 60 agtcactcaa catcgggggc ctcggctgag gcagttgtac ctcctgcagg gactccatgg 120 ggaaccgcgt acgacaaggc gaaggccgca ttggcaaagc tcaatctcca agataaggtc 180 ggcatcgtga gcggtgtcgg ctggaacggc ggtccttgcg ttggaaacac atctccggcc 240 tccaagatca gctatccatc gctatgcctt caagacggac ccctcggtgt tcgatactcg 300 acaggcagca cagcctttac gccgggcgtt caagcggcct cgacgtggga tgtcaatttg 360 atccgcgaac gtggacagtt catcggtgag gaggtgaagg cctcggggat tcatgtcata 420 cttggtcctg tggctgggcc gctgggaaag actccgcagg gcggtcgcaa ctgggagggc 480 ttcggtgtcg atccatatct cacgggcatt gccatgggtc aaaccatcaa cggcatccag 540 tcggtaggcg tgcaggcgac agcgaagcac tatatcctca acgagcagga gctcaatcga 600 gaaaccattt cgagcaaccc agatgaccga actctccatg agctgtatac ttggccattt 660 gccgacgcgg ttcaggccaa tgtcgcttct gtcatgtgct cgtacaacaa ggtcaatacc 720 acctgggcct gcgaggatca gtacacgctg cagactgtgc tgaaagacca gctggggttc 780 ccaggctatg tcatgacgga ctggaacgca cagcacacga ctgtccaaag cgcgaattct 840 gggcttgaca tgtcaatgcc tggcacagac ttcaacggta acaatcggct ctggggtcca 900 gctctcacca atgcggtaaa tagcaatcag gtccccacga gcagagtcga cgatatggtg 960 actcgtatcc tcgccgcatg gtacttgaca ggccaggacc aggcaggcta tccgtcgttc 1020 aacatcagca gaaatgttca aggaaaccac aagaccaatg tcagggcaat tgccagggac 1080 ggcatcgttc tgctcaagaa tgacgccaac atcctgccgc tcaagaagcc cgctagcatt 1140 gccgtcgttg gatctgccgc aatcattggt aaccacgcca gaaactcgcc ctcgtgcaac 1200 gacaaaggct gcgacgacgg ggccttgggc atgggttggg gttccggcgc cgtcaactat 1260 ccgtacttcg tcgcgcccta cgatgccatc aataccagag cgtcttcgca gggcacccag 1320 gttaccttga gcaacaccga caacacgtcc tcaggcgcat ctgcagcaag aggaaaggac 1380 gtcgccatcg tcttcatcac cgccgactcg ggtgaaggct acatcaccgt ggagggcaac 1440 gcgggcgatc gcaacaacct ggatccgtgg cacaacggca atgccctggt ccaggcggtg 1500 gccggtgcca acagcaacgt cattgttgtt gtccactccg ttggcgccat cattctggag 1560 cagattcttg ctcttccgca ggtcaaggcc gttgtctggg cgggtcttcc ttctcaggag 1620 agcggcaatg cgctcgtcga cgtgctgtgg ggagatgtca gcccttctgg caagctggtg 1680 tacaccattg cgaagagccc caatgactat aacactcgca tcgtttccgg cggcagtgac 1740 agcttcagcg agggactgtt catcgactat aagcacttcg acgacgccaa tatcacgccg 1800 cggtacgagt tcggctatgg actgtcttac accaagttca actactcacg cctctccgtc 1860 ttgtcgaccg ccaagtctgg tcctgcgact ggggccgttg tgccgggagg cccgagtgat 1920 ctgttccaga atgtcgcgac agtcaccgtt gacatcgcaa actctggcca agtgactggt 1980 gccgaggtag cccagctgta catcacctac ccatcttcag cacccaggac ccctccgaag 2040 cagctgcgag gctttgccaa gctgaacctc acgcctggtc agagcggaac agcaacgttc 2100 aacatccgac gacgagatct cagctactgg gacacggctt cgcagaaatg ggtggtgccg 2160 tcggggtcgt ttggcatcag cgtgggagcg agcagccggg atatcaggct gacgagcact 2220 ctgtcggtag cgtag 2235 <210> 5 <211> 744 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 5 Met Arg Tyr Arg Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Pro Phe 1 5 10 15 Ala Arg Ala Asp Ser His Ser Thr Ser Gly Ala Ser Ala Glu Ala Val 20 25 30 Val Pro Pro Ala Gly Thr Pro Trp Gly Thr Ala Tyr Asp Lys Ala Lys 35 40 45 Ala Ala Leu Ala Lys Leu Asn Leu Gln Asp Lys Val Gly Ile Val Ser 50 55 60 Gly Val Gly Trp Asn Gly Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Ser Pro Ala 65 70 75 80 Ser Lys Ile Ser Tyr Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly 85 90 95 Ile Arg Phe Gly Thr Gly Ser Thr Ala Phe Thr Pro Gly Val Gln Ala 100 105 110 Ala Ser Thr Trp Asp Thr Glu Leu Met Arg Gln Arg Gly Glu Tyr Leu 115 120 125 Gly Ala Glu Ala Lys Gly Cys Gly Ile His Val Leu Leu Gly Pro Val 130 135 140 Ala Gly Pro Leu Gly Lys Thr Pro Gln Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly 145 150 155 160 Phe Gly Val Asp Pro Tyr Leu Thr Gly Ile Ala Met Ala Glu Thr Ile 165 170 175 Glu Gly Leu Gln Ser Ala Gly Val Gln Ala Cys Ala Lys His Tyr Ile 180 185 190 Val Asn Glu Gln Glu Leu Asn Arg Glu Thr Ile Ser Ser Asp Val Asp 195 200 205 Asp Arg Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val 210 215 220 Gln Ala Asn Val Ala Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Lys Ile Asn Gly 225 230 235 240 Ser Trp Ala Cys Glu Asp Gln Tyr Thr Leu Gln Thr Val Leu Lys Asp 245 250 255 Gln Leu Gly Phe Pro Gly Tyr Val Met Thr Asp Trp Asn Ala Gln His 260 265 270 Thr Thr Val Gln Ser Ala Asn Ser Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly 275 280 285 Thr Asp Phe Asn Gly Asn Asn Arg Leu Trp Gly Pro Ala Leu Thr Asn 290 295 300 Ala Val Asn Ser Asn Gln Val Pro Thr Ser Arg Val Asp Asp Met Val 305 310 315 320 Thr Arg Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Thr Gly Gln Asp Gln Ala Gly 325 330 335 Tyr Pro Ser Phe Asn Ile Ser Arg Asn Val Gln Gly Asn His Lys Thr 340 345 350 Asn Val Arg Ala Ile Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp 355 360 365 Ala Asn Ile Leu Pro Leu Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Val Val Gly 370 375 380 Ser Ala Ala Ile Ile Gly Asn His Ala Arg Asn Ser Pro Ser Cys Asn 385 390 395 400 Asp Lys Gly Cys Asp Asp Gly Ala Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser Gly 405 410 415 Ala Val Asn Tyr Pro Tyr Phe Val Ala Pro Tyr Asp Ala Ile Asn Thr 420 425 430 Arg Ala Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp Asn 435 440 445 Thr Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ala Arg Gly Lys Asp Val Ala Ile Val 450 455 460 Phe Ile Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly Asn 465 470 475 480 Ala Gly Asp Arg Asn Asn Leu Asp Pro Trp His Asn Gly Asn Ala Leu 485 490 495 Val Gln Ala Val Ala Gly Ala Asn Ser Asn Val Ile Val Val Val His 500 505 510 Ser Val Gly Ala Ile Ile Leu Glu Gln Ile Leu Ala Leu Pro Gln Val 515 520 525 Lys Ala Val Val Trp Ala Gly Leu Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn Ala 530 535 540 Leu Val Asp Val Leu Trp Gly Asp Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val 545 550 555 560 Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Pro Asn Asp Tyr Asn Thr Arg Ile Val Ser 565 570 575 Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Glu Gly Leu Phe Ile Asp Tyr Lys His 580 585 590 Phe Asp Asp Ala Asn Ile Thr Pro Arg Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu 595 600 605 Ser Tyr Thr Lys Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Val Phe Ser Thr Ala 610 615 620 Lys Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Val Pro Gly Gly Pro Ser Asp 625 630 635 640 Leu Phe Gln Asn Val Ala Thr Val Thr Val Asp Ile Ala Asn Ser Gly 645 650 655 Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Thr Tyr Pro Ser 660 665 670 Ser Ala Pro Arg Thr Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ala Lys Leu 675 680 685 Asn Leu Thr Pro Gly Gln Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn Ile Arg Arg 690 695 700 Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Ala Ser Gln Lys Trp Val Val Pro 705 710 715 720 Ser Gly Ser Phe Gly Ile Ser Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg 725 730 735 Leu Thr Ser Thr Leu Ser Val Ala 740 <210> 6 <211> 2235 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 6 atgcgttacc gaacagcagc tgcgctggca cttgccactg ggccctttgc tagggcagac 60 agtcactcaa catcgggggc ctcggctgag gcagttgtac ctcctgcagg gactccatgg 120 ggaaccgcgt acgacaaggc gaaggccgca ttggcaaagc tcaatctcca agataaggtc 180 ggcatcgtga gcggtgtcgg ctggaacggc ggtccttgcg ttggaaacac atctccggcc 240 tccaagatca gctatccatc gctatgcctt caagacggac ccctcggtat ccgattcggc 300 acaggcagca cagcctttac gccgggcgtt caagcggcct cgacgtggga taccgagttg 360 atgcgccagc gtggagagta cctgggtgcc gaggccaagg gctgcgggat tcatgtcctg 420 cttggtcctg tggctgggcc gctgggaaag actccgcagg gcggtcgcaa ctgggagggc 480 ttcggtgtcg atccatatct cacgggcatt gccatggccg agacaatcga gggcctgcag 540 tcggccggcg tgcaggcgtg cgcgaagcac tatatcgtca acgagcagga gctcaatcga 600 gaaaccattt cgagcgacgt cgatgaccga actatgcatg agctgtatct gtggccattt 660 gccgacgcgg ttcaggccaa tgtcgcttct gtcatgtgct cgtacaacaa gatcaatggc 720 agctgggcct gcgaggatca gtacacgctg cagactgtgc tgaaagacca gctggggttc 780 ccaggctatg tcatgacgga ctggaacgca cagcacacga ctgtccaaag cgcgaattct 840 gggcttgaca tgtcaatgcc tggcacagac ttcaacggta acaatcggct ctggggtcca 900 gctctcacca atgcggtaaa tagcaatcag gtccccacga gcagagtcga cgatatggtg 960 actcgtatcc tcgccgcatg gtacttgaca ggccaggacc aggcaggcta tccgtcgttc 1020 aacatcagca gaaatgttca aggaaaccac aagaccaatg tcagggcaat tgccagggac 1080 ggcatcgttc tgctcaagaa tgacgccaac atcctgccgc tcaagaagcc cgctagcatt 1140 gccgtcgttg gatctgccgc aatcattggt aaccacgcca gaaactcgcc ctcgtgcaac 1200 gacaaaggct gcgacgacgg ggccttgggc atgggttggg gttccggcgc cgtcaactat 1260 ccgtacttcg tcgcgcccta cgatgccatc aataccagag cgtcttcgca gggcacccag 1320 gttaccttga gcaacaccga caacacgtcc tcaggcgcat ctgcagcaag aggaaaggac 1380 gtcgccatcg tcttcatcac cgccgactcg ggtgaaggct acatcaccgt ggagggcaac 1440 gcgggcgatc gcaacaacct ggatccgtgg cacaacggca atgccctggt ccaggcggtg 1500 gccggtgcca acagcaacgt cattgttgtt gtccactccg ttggcgccat cattctggag 1560 cagattcttg ctcttccgca ggtcaaggcc gttgtctggg cgggtcttcc ttctcaggag 1620 agcggcaatg cgctcgtcga cgtgctgtgg ggagatgtca gcccttctgg caagctggtg 1680 tacaccattg cgaagagccc caatgactat aacactcgca tcgtttccgg cggcagtgac 1740 agcttcagcg agggactgtt catcgactat aagcacttcg acgacgccaa tatcacgccg 1800 cggtacgagt tcggctatgg actgtcttac accaagttca actactcacg cctctccgtc 1860 ttttcgaccg ccaagtctgg tcctgcgact ggggccgttg tgccgggagg cccgagtgat 1920 ctgttccaga atgtcgcgac agtcaccgtt gacatcgcaa actctggcca agtgactggt 1980 gccgaggtag cccagctgta catcacctac ccatcttcag cacccaggac ccctccgaag 2040 cagctgcgag gctttgccaa gctgaacctc acgcctggtc agagcggaac agcaacgttc 2100 aacatccgac gacgagatct cagctactgg gacacggctt cgcagaaatg ggtggtgccg 2160 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Val Val His 500 505 510 Ser Val Gly Ala Ile Ile Leu Glu Gln Ile Leu Ala Leu Pro Gln Val 515 520 525 Lys Ala Val Val Trp Ala Gly Leu Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn Ala 530 535 540 Leu Val Asp Val Leu Trp Gly Asp Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Val 545 550 555 560 Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Pro Asn Asp Tyr Asn Thr Arg Ile Val Ser 565 570 575 Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Glu Gly Leu Phe Ile Asp Tyr Lys His 580 585 590 Phe Asp Asp Ala Asn Ile Thr Pro Arg Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu 595 600 605 Ser Tyr Thr Lys Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Val Leu Ser Thr Ala 610 615 620 Lys Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Val Pro Gly Gly Pro Ser Asp 625 630 635 640 Leu Phe Gln Asn Val Ala Thr Val Thr Val Asp Ile Ala Asn Ser Gly 645 650 655 Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Thr Tyr Pro Ser 660 665 670 Ser Ala Pro Arg Thr Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ala Lys Leu 675 680 685 Asn Leu Thr Pro Gly Gln Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn Ile Arg Arg 690 695 700 Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Ala Ser Gln Lys Trp Val Val Pro 705 710 715 720 Ser Gly Ser Phe Gly Ile Ser Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile Arg 725 730 735 Leu Thr Ser Thr Leu Ser Val Ala 740 <210> 12 <211> 2235 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 12 atgcgttacc gaacagcagc tgcgctggca cttgccactg ggccctttgc tagggcagac 60 agtcactcaa catcgggggc ctcggctgag gcagttgtac ctcctgcagg gactccatgg 120 ggaaccgcgt acgacaaggc gaaggccgca ttggcaaagc tcaatctcca agataaggtc 180 ggcatcgtga gcggtgtcgg ctggaacggc ggtccttgcg ttggaaacac atctccggcc 240 tccaagatca gctatccatc gctatgcctt caagacggac ccctcggtat ccgattcggc 300 acaggcagca cagcctttac gccgggcgtt caagcggcct cgacgtggga tgtcaatttg 360 atccgcgaac gtggacagtt catcggtgag gaggtgaagg cctcggggat tcatgtcata 420 cttggtcctg tggctgggcc gctgggaaag atcccgcacg gcggtcgcaa ctgggagggc 480 ttcggtgtcg atccatatct cacgggcatt gccatggccg agacaatcga gggcctgcag 540 tcggccggcg tgcaggcgtg cgcgaagcac tatatcctca acgagcagga gctcaatcga 600 gaaaccattt cgagcaaccc agatgaccga actctccatg agctgtatac ttggccattt 660 gccgacgcgg ttcacgccaa tgtcgcttct gtcatgtgct cgtacaacaa gatcaatggc 720 agctgggcct gcgaggatca gtacacgctg cagactgtgc tgaaagacca gctggggttc 780 ccaggctatg tcatgacgga ctggaacgca cagcacacga ctgtccaaag cgcgaattct 840 gggcttgaca tgtcaatgcc tggcacagac ttcaacggta acaatcggct ctggggtcca 900 gctctcacca atgcggtaaa tagcaatcag gtccccacga gcagagtcga cgatatggtg 960 actcgtatcc tcgccgcatg gtacttgaca ggccaggacc aggcaggcta tccgtcgttc 1020 aacatcagca gaaatgttca aggaaaccac aagaccaatg tcagggcaat tgccagggac 1080 ggcatcgttc tgctcaagaa tgacgccaac atcctgccgc tcaagaagcc cgctagcatt 1140 gccgtcgttg gatctgccgc aatcattggt aaccacgcca gaaactcgcc ctcgtgcaac 1200 gacaaaggct gcgacgacgg ggccttgggc atgggttggg gttccggcgc cgtcaactat 1260 ccgtacttcg tcgcgcccta cgatgccatc aataccagag cgtcttcgca gggcacccag 1320 gttaccttga gcaacaccga caacacgtcc tcaggcgcat ctgcagcaag aggaaaggac 1380 gtcgccatcg tcttcatcac cgccgactcg ggtgaaggct acatcaccgt ggagggcaac 1440 gcgggcgatc gcaacaacct ggatccgtgg cacaacggca atgccctggt ccaggcggtg 1500 gccggtgcca acagcaacgt cattgttgtt gtccactccg ttggcgccat cattctggag 1560 cagattcttg ctcttccgca ggtcaaggcc gttgtctggg cgggtcttcc ttctcaggag 1620 agcggcaatg cgctcgtcga cgtgctgtgg ggagatgtca gcccttctgg caagctggtg 1680 tacaccattg cgaagagccc caatgactat aacactcgca tcgtttccgg cggcagtgac 1740 agcttcagcg agggactgtt catcgactat aagcacttcg acgacgccaa tatcacgccg 1800 cggtacgagt tcggctatgg actgtcttac accaagttca actactcacg cctctccgtc 1860 ttgtcgaccg ccaagtctgg tcctgcgact ggggccgttg tgccgggagg cccgagtgat 1920 ctgttccaga atgtcgcgac agtcaccgtt gacatcgcaa actctggcca agtgactggt 1980 gccgaggtag cccagctgta catcacctac ccatcttcag cacccaggac ccctccgaag 2040 cagctgcgag gctttgccaa gctgaacctc acgcctggtc agagcggaac agcaacgttc 2100 aacatccgac gacgagatct cagctactgg gacacggctt cgcagaaatg ggtggtgccg 2160 tcggggtcgt ttggcatcag cgtgggagcg agcagccggg atatcaggct gacgagcact 2220 ctgtcggtag cgtag 2235

Claims

아미노산 서열 SEQ ID No. 1 의 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서, 서열 SEQ ID No. 3 의 야생형 BGL1 단백질의 베타-글루코시다아제 활성과 비교해, 약 30℃ 내지 약 35℃ 를 포함하는 온도에서 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서, 아미노산 서열 SEQ ID No. 5 의 100B11 폴리펩티드의 베타-글루코시다아제 활성과 비교해, 30℃ 내지 35℃ 를 포함하는 온도에서 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 3 항에 있어서, 아미노산 서열 SEQ ID No. 5 의 100B11 폴리펩티드의 베타-글루코시다아제 활성과 비교해, 약 30℃ 내지 약 35℃ 를 포함하는 온도에서 10% 이상, 우선적으로 20% 이상, 우선적으로 30% 이상, 더 더욱 우선적으로 40% 이상 향상된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 엔코딩하는 것을 특징으로 하는, 정제된 또는 단리된 핵산.
제 5 항에 있어서, 핵산 서열 SEQ ID No. 2 를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 5 항 또는 제 6 항에 따른 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제 5 항에 따른 핵산 또는 제 7 항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
제 8 항에 있어서, 트리코데르마 (Trichoderma), 아스페르길루스 (Aspergillus), 뉴로스포라 (Neurospora), 휴미콜라 (Humicola), 페니실리움 (Penicillium), 푸사리움 (Fusarium), 테르모모노스포라 (Thermomonospora), 마이셀리오프토라 (Myceliophthora), 크리소스포리움 (Chrysosporium), 바실러스 (Bacillus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 에스케리챠 (Escherichia), 클로스트리듐 (Clostridium), 셀룰로모나스 (Cellulomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 야로위아 (Yarrowia), 피치아 (Pichia) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei), 트리코데르마 비리다에 (Trichoderma viridae), 트리코데르마 코닌기이 (Trichoderma koningii), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 웬티이 (Aspergillus wentii), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 포에니시스 (Aspergillus phoenicis), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 휴미콜라 그리사에 (Humicola grisae), 마이셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermopila), 크리소스포리움 룩노웬세 (Chrysosporium lucknowense), 페니실리움 피노필룸 (Penicillium pinophilum), 페니실리움 옥살리쿰 (Penicillium oxalicum), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 사카롤라이티쿰 (Clostridium saccharolyticum), 클로스트리듐 벤제린키이 (Clostridium benjerinckii), 클로스트리듐 부틸리쿰 (Clostridium butylicum), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolityca), 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 및 이의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
제 9 항에 있어서, 종 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 의 것인 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
제 9 항에 있어서, 종 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 의 것인 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
베타-올리고당의 가수분해를 위한, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 상기 폴리펩티드 또는 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 용도.
셀로비오스의 글루코오스로의 가수분해를 위한, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 상기 폴리펩티드 또는 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 용도.
바이오연료의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 상기 폴리펩티드 또는 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 용도.
리그노셀룰로오스 바이오매스 상에 작용하는 효소 조성물로서, 사상 진균에 의해 제조되고 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 효소 조성물.
하기 단계:
- 수성상 내에, 가수분해하고자 하는 물질의 현탁;
- 글루코오스를 함유하는 가수분해물을 생성하도록, 제 16 항에 따른 효소 조성물 또는 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포의 존재 하에, 리그노셀룰로오스 바이오매스의 가수분해;
- 발효 포도액을 생성하도록, 가수분해물의 글루코오스의 발효;
- 발효 포도액으로부터 바이오연료의 분리
를 포함하고,
가수분해 및 발효 단계가 동시에 실시되는 것을 특징으로 하는, 바이오매스로부터 바이오연료의 제조 방법.