BR112014022919B1

BR112014022919B1 - Remoção enzimática de esteril glicosídeos

Info

Publication number: BR112014022919B1
Application number: BR112014022919-8A
Authority: BR
Inventors: Hugo Menzella; Salvador Peiru; Leandro Vetcher
Original assignee: Keclon S.A.
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2022-03-22
Also published as: AU2013231993A1; US10287521B2; US20150141680A1; EP2825662A4; EP2825662A1; US20170327756A1; BR112014022919A2; EP2825662B1; CA2867142A1; AR091994A1; CA2867142C; WO2013138671A1

Abstract

REMOÇÃO ENZIMÁTICA DE ESTERIL GLICOSÍDEOS. A presente invenção refere-se ás composições e métodos relacionados á produção e uso de enzimas adequadas para reduzir a quantidade de esteril glicosídeos ou glicoróis de monoacila saturados em uma mistura de lipídio.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA

[0001] Este pedido reivindica o benefício ao pedido número U.S. 61/611.949, depositado em 16 de março de 2012, e ao pedido número U.S. 61/696.588, depositado em 4 de setembro de 2012, que são incorporados a título de referência era sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Há uma demanda urgente por alternativas sustentáveis e acessíveis para combustíveis à base de óleo. Os biocombustíveis são uma substituição promissora para os combustíveis à base de óleo. Os biocombustíveis podem ser produzidos a partir de matérias animais ou vegetais, tais como, milho, cana-de-açúcar, capira-navalha, soja ou algas. Desse modo, as mesmas são uma fonte renovável e potencialmente ilimitada de combustível. Em particular, os biodieseis são úteis como combustível para veículos em substituição ou como um suplemento para combustíveis diesel à base de óleo. Os mesmos podem ser utilizados por motores de queima de combustível tradicionais, produzem menos particulados quando queimados, têm um ponto de fulgor mais alto e são menos tóxicos que os combustíveis à base de óleo. Em 2006, a produção de biodiesel nos Estados Unidos sozinho foi estimada em mais de 1 bilhão de galões.

[0003] Quimicamente, os biodieseis compreendem principalmente uma mistura de ésteres monoalquílicos de ácidos graxos de cadeia longa. Os biodieseis são tipicamente produzidos a partir da transesterificação de lipídios de óleos vegetais, incluindo aqueles a partir de soja, jatrofa, palma, semente de colza, girassol e outros; e/ou gorduras animais com um álcool monoídrico de cadeia curta. Quanto mais longa a cadeia de carbono do álcool usado, melhor as propriedades de fluxo frio. Por exemplo, o biodiesel que compreende ésteres etílicos de ácido graxo (FAEEs), derivados de etanol, tem propriedades de fluxo frio melhores que o biodiesel que compreende ésteres metílicos de ácido graxo (FAMEs), derivados de metanol.

[0004] Entretanto, a transesterificação produz diversos subprodutos indesejados, incluindo monoacilgliceróis saturados (SMGs) e esteril glicosideos, tais como, esteril glucosídeos. Os esteril glicosideos acilados são solúveis em óleo, porém, durante a esterificação, são convertidos em SGs não acilados, que são relativamente insolúveis. Se não forem removidos do biodiesel, os esteril glicosideos podem obstruir os filtros de óleo ou causar falhas de motor. As partículas de moléculas de esteril glicosideo amontoadas também podem promover cristalização, agregação ou precipitação de outros compostos no biodiesel. Isso reduz adicionalmente a fluidez de biodiesel e aumenta a probabilidade de obstrução. Os esteril glicosideos têm tipicamente um alto ponto de fusão de aproximadamente 240°C e, desse modo, não pode ser simplesmente aquecido para permitir que os mesmos passem através de um filtro de óleo. De maneira similar, os SMGs podem formar cristais no biodiesel, especialmente em baixas temperaturas, o que cria problemas de fluxo frio e pode causar bloqueios nas linhas de combustível sob condições frias. De maneira adicional, a formação desses precipitados pode causar diversos problemas durante o processo de produção de biodiesel resultando em um aumento nos custos de produção.

[0005] Os çontaminantes insolúveis contendo esteril glicosideos podem aparecer como névoa, precipitados ou sedimentos no biodiesel, o que impede que o produto cumpra com os requisitos sobre contaminação e filtrabilidade de acordo corn os padrões de qualidade de biodiesel.

[0006] Um método que tem capacidade para remover completamente os esteril glicosideos e SMGs do biodiesel é a destilação. A destilação consome muita energia, o que reduz a eficiência de custo e o ganho liquido de energia da produção de biodiesel. A filtragem, tal como, através de terra diatomácea, é dispendiosa e não facilmente escalável em grandes quantidades. A adição de adsorventes requer uma etapa de remoção adicional, e é similarmente dispendiosa e demorada. Outros métodos incluem os métodos de centrifugação descritos no documento n° WO 2010 004423.

[0007] As esteril glicosidases podem ser usadas para digerir esteril glicosideos, produzindo um glicosideo e um esterol. De maneira similar, as lipases podem ser usadas para eliminar os SMGs. Entretanto, as esteril glicosidases e lipases atualmente usadas no campo são ineficientes e não reduzem efetivamente a quantidade de esteril glicosideos e SMGs no biodiesel.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] A presente invenção proporciona enzimas termoestáveis isoladas que são capazes de hidrolisar a ligação glicosidica dos esteril glicosideos ou esteril glicosideos acilados e métodos de fabricação e uso de tais enzimas. Isso soluciona os desafios de produção de combustível biodiesel que seja de qualidade superior, mais economicamente eficazes e competitivos no mercado global.

[0009] A plataforma apresentada no presente documento usa engenharia genética, biologia sintética e evolução direcionada para gerar rapidamente enzimas novas e aprimoradas que possam reduzir significativamente os custos de produção atuais e proporcionar biodiesel de alta qualidade por eliminação das impurezas principais de um modo ecológico e comercialmente competitivo. A invenção também proporciona métodos e composições para gerar enzimas projetadas que eliminam as impurezas principais do biodiesel à base de plantas, tais como, esteril glicosldeos e monoacilgliceróis saturados (SMGs) que resultam na formação de materiais insolúveis que comprometem a qualidade e o desempenho dp produto final.

[0010] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para reduzir o esteril glicosldeo em uma amostra. O método compreende: misturar uma enzima termoestável a uma amostra que compreende estéril glicosldeo sob uma condição adequada para a enzima termoestável por um período de tempo adequado para degradar o esteril glicosldeo reduzindo, desse modo, o esteril glicosldeo na amostra para obter uma amostra processada.

[0011] Em algumas modalidades, a amostra compreende óleo, gordura ou biocombustivel (por exemplo, biodiesel).

[0012] Em algumas modalidades, o esteril glicosldeo compreende esteril glucosídeo. Em algumas modalidades, o esteril glicosldeo tem uma solubilidade que é superior a 50 ppm, superior a 8 0 ppm ou superior a 100 ppm.

[0013] Em algumas modalidades, a enzima termoestável tem capacidade para hidrolisar a ligação glicosídica de esteril glucosídeos ou esteril glucosídeos acilados.

[0014] Em algumas modalidades, a enzima termoestável compreende uma enzima glicosidase.

[0015] Em algumas modalidades, a enzima termoestável compreende uma enzima glicosidase.

[0016] Em algumas modalidades, a enzima termoestável compreende uma variante de uma enzima selecionada a partir da Tabela 1.

[0017] Em algumas modalidades, a enzima termoestável compreende uma variante que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade para uma sequência selecionada a partir das sequências da Tabela 1.

[0018] Em algumas modalidades, a enzima termoestável compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências da Tabela 1.

[0019] Em algumas modalidades, a amostra compreende 0,1% a 30% de água.

[0020] Em algumas modalidades, a etapa de mistura é realizada a uma temperatura que se encontra entre cerca de 50°C e cerca de 110°C, tal como, acima de cerca de 65°C, acima de cerca de 70°C ou acima de cerca de 75°C.

[0021] Em algumas modalidades, a etapa de mistura é realizada por cerca de 30 minutos a 24 horas.

[0022] Em algumas modalidades, o esteril gli.cos.ideo é reduzido em pelo menos 20% a 8 0%, inclusive.

[0023] Em algumas modalidades, a amostra processada compreende menos que 20 ppm do esteril glicosideo.

[0024] Em algumas modalidades, a etapa de mistura compreende misturar a amostra a uma enzima selecionada a partir de beta-glicosidases, esterolesterases, amiloglicosidases e pectinases.

[0025] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente coletar a amostra processada.

[0026] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um óleo produzido pelos métodos proporcionados no presente documento.

[0027] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma enzima termoestável isolada que é capaz de hidrolisar a ligação glicosidica de esteril glicosideos ou esteril glicosideos acilados. Em algumas modalidades, a enzima tem uma atividade de pelo menos 5: g de esteril glicosídeo por grama de enzima por hora a uma temperatura que se encontra entre cerca de 50°C e cerca de 99°C, tal como, acima de cerca de 65°C, 70®C, 75°C, 80°C, 85°C ou 90°Ç. Em algumas modalidades, a enzima termoestável compreende uma variante de uma das enzimas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, a enzima termoestável compreende uma variante que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de uma das enzimas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, a enzima termoestável compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências da Tabela 1.

[0028] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para gerar um gene que codifica uma esteril glicosidase variante, que compreende: (a) cultivar ém um meio de cultura de uma pluralidade de células hospedeiras transformadas com uma biblioteca de genes de esteril glicosidase variantes, em que a expressão de cada gene de esteril glicosidase variante se encontra sob o controle de um promotor que responde linearmente às concentrações de um indutor adicionado ao meio de cultura, em que as células hospedeiras requerem ergosterol para cultivar e são incapazes de sintetizar ergosterol, e em que o meio de cultura compreende esteril glucosideos e uma primeira concentração do indutor, a fim de permitir apenas uma célula hospedeira que expressa uma esteril glicosidase variante com atividade suficiente para formar uma colônia; e (b) recuperar o gene de esteril glicosidase variante a partir da colônia. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente repetir as etapas (a) e (b) em que a biblioteca de genes de esteril glicosidase variantes é gerada a partir do gene de esteril glicosidase variante recuperado a partir da iteração anterior, e em que no novo ciclo de iteração uma concentração mais baixa do indutor é adicionada ao meio de cultura.

[0029] Em algumas modalidades, a biblioteca é gerada usando PCR propensa a erros ou mutagênese dirigida por oligonucleótideos.

[0030] Em algumas modalidades, um vetor de expressão usado para transformar células hospedeiras em genes de esteril glicosidase variantes compreende um vetor de expressão de levedura.

[0031] Em algumas modalidades, um vetor de expressão usado para transformar células hospedeiras em genes de esteril glicosidase variantes é induzivel por um indutor selecionado a partir de: Çü24 e beta-estradiol.

[0032] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende uma célula mutante de levedura.

[0033] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente projetar e sintetizar sequências otimizadas por códon que codifica a esteril glicosidase variante.

[0034] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir uma esteril glicosidase recombinante, que compreende: (a) expressar as sequências otimizadas por códon proporcionadas no presente documento ou obtidas usando um método proporcionado no presente documento em uma célula hospedeira heteróloga adequada para gerar esteril glicosidase recombinante; e (b) isolar a esteril glicosidase recombinante. Em algumas modalidades, a etapa de cultivo ocorrer a ou acima de 50°C, 55°C, βO^C, 65°C, 70DC, 75°c, 80üÇ ou 85°Ç.

[0035] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira que expressa um gene produzido pelos métodos proporcionados no presente documento.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[0036] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados no presente documento a titulo de referência com a mesma abrangência como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especifica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0037] Os novos recursos da invenção são particularmente estabelecidos nas reivindicações em anexo. Um melhor entendimento dos recursos e vantagens da presente invenção será obtido com referência à seguinte descrição detalhada que estabelece as modalidades ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos em anexo dos quais:

[0038] A Figura 1 mostra a hidrólise enzimática de um esteril glicosideo exemplificative (SG) , B-sitosteril glucosideo.

[0039] A Figura 2 é Uma vista esquemática que mostra um processo exemplificative de remoção enzimática de esteril glicosideos do biodiesel.

[0040] A Figura 3 é um gráfico que mostra a solubilidade dependente de temperatura do esteril glucosideo no biodiesel.

[0041] A Figura 4A é uma coleção de fotografias que mostra a expressão de diversos genes de esteril glicosidase exemplificativos (SGase) em um hospedeiro de E. coli e a purificação de proteínas expressadas através de cromatografia de afinidade por Ni- NTA (níquel-ácido nitrilotriacético). A Figura 4B é uma coleção fotografias que mostra a atividade de um SGase exemplificative avaliado em meio aquoso (5 h de incubação a 8Õ°C, pH5, 5 com 100 ppm de SG) .

[0042] A Figura 5 é um gráfico que mostra a hidrólise de SG em emulsões de Siodiesel/água (5% de ADMUL) usando um SGase exemplificative, LacS.

[0043] A Figura 6 é um gráfico e um conjunto de fotografias que mostra a hidrólise de um SG usando SGases Sulfolobus solfataricus LacS e Thermococcüs litoralis TL exempt ificativos em 40 ml de frascos sem emulsificador (3 ug Ez/ml de biodiesel, 120 ppm de SG).

[0044] A Figura 7 é uma representação gráfica que mostra a análise por cromatografia gasosa com detecção de ionização de chama (GC-FID) de amostras de biodiesel antes e após o tratamento enzimático com um SGase exemplificative (TL) .

[0045] A Figura 8 é uma representação gráfica e coleção de fotografias que mostra a hidrólise de SG usando um SGase exemplificative (TL) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0046] A presente invenção é voltada para as composições e métodos para reduzir a quantidade de esteril glicosideos em uma amostra de biodiesel. A invenção proporciona adicionalmente, métodos para aumentar a eficiência da degradação enzimática de esteril glicosideos. Em algumas modalidades, temperaturas elevadas podem ser usadas para aumentar a eficiência de degradação enzimática. Em algumas modalidades, uma enzima termoestável pode ser usada, tal como, uma esteril glicosidase termoestável ou uma lipase termoestável. Em algumas modalidades, pressão, aditivos ou outras técnicas podem ser usadas para aumentar a eficiência da atividade enzimática.

[0047] Os biodieseis, tais como, aqueles gerados por transesterificação de lipídios, podem conter diversos compostos contaminantes, que incluem, porém, sem limitação, esteril glicosideos e monoacilgliceróis saturados (SMGs). Os esteril glicosideos acilados são solúveis em óleo, porém, durante a esterificação, os mesmos são convertidos era esteril glicosideos não acilados, que são relativamente insolúveis. Os esteril glicosideos não acilados também. estar naturalmente presentes. A precipitação de esteril glicosideos e SMGs pode ocorrer e qualquer temperatura. Mesmos os níveis baixos, tal como, 10 a 90 ppm de esteril glicosídeo em biodiesel, podem formar agregados. Esses agregados, se presentes nos biodieseis, podem obstruir os filtros de óleo e, também, promover a cristalização, agregação ou precipitação de outros compostos.

[0048] 0 documento n0 W02007/076163 descreve métodos filtração para remover esteril glucosídeos, incluindo o uso de aditivos para aumentar a precipitação ou agregação. Entretanto, esse procedimento introduz uma etapa de filtração extra que pode ser dispendiosa e/ou demorada. De maneira adicional, remoção de esteril glucosídeos por filtração ou centrifugação requer que os esteril glucosídeos esperem para se agregar e precipitar antes que os mesmos possam ser removidos do biodiesel ou óleo de partida. Esses métodos também reduzem o rendimento total do biodiesel.

[0049] Os documentos n° WO 2010/102952 e n° WO 2010/004423, incorporados no presente documento a título de referência, descrevem os métodos que usam a catálise enzimática para remover esteril glucosídeos do biodiesel e do óleo. Entretanto, os documentos n° WO 2010/102952 e n° WO 2010/004423 descrevem processos onde a reação ótima ocorre a 5Ü°C. A 5Õ°C, a solubilidade de esteril glucosídeos no biodiesel é de aproximadamente 50 ppm. Entretanto, o biodiesel, bruto contém tipicamente 10 a 300 ppm de esteril glucosídeos. Desse modo, uma fração significativa de esteril glucosideo é insolúvel a 50°C e, portanto, não acessível às enzimas.

[0050] Os esteril glicosideos e agregados de SMG em biodieseis são resistentes à degradação enzimática porque sua agregação impede que as enzimas acessem ou digiram eficientemente os compostos. A digestão enzimática funciona de maneira mais eficiente quando os substratos são livres na solução. A solubilidade de esteril glicosideos no biodiesel aumenta com a temperatura, o que reduz a agregação e aumenta a acessibilidade. Entretanto, altas temperaturas podem reduzir a atividade enzimática, tal como, através da desnaturação térmica das enzimas.

[0051] A presente invenção supera os problemas relacionados à presença de esteril glicosideos no biodiesel ao usar as enzimas recentemente descobertas ou artificialmente geradas capazes de hidrolisar esteril glicosideos □ alta temperatura, proporcionar métodos para a produção pouco dispendiosa de tais enzimas e usar tais enzimas para remover esteril glicosideos do biodiesel, precursores de biodiesel ou derivados de biodiesel.

I. Amostras

[0052] As amostras descritas no presente documento podem se referir a qualquer óleo, gordura ou biocombustivel. Os bioçombustiveis podem incluir qualquer fonte de energia derivada de material orgânico, que incluem, porém, sem limitação, etanol celulósico e biodieseis. Em algumas modalidades, uma amostra é um material de partida, precursor ou produto intermediário Usado para produção, processamento ou refinamento de biocombustível ou biodiesel. Por exemplo, um precursor de biocombustível pode se referir a qualquer ôleo ou outra amostra adequada para gerar biocombustível. Um precursor de biodiesel pode se referir a qualquer Óleo ou outra amostra adequada para gerar biodiesel. Em algumas modalidades, os óleos, gorduras, biocombustíveis ou precursores desses são derivados de uma fonte orgânica, que inclui, porém, não se limita a gorduras animais, tais como, sebo, banha de porco, gordura de galinha, gordura amarela, óleo de peixe e subprodutos de processamento de gordura animal; óleos vegetais, que incluem, porém, sem limitação, óleos de semente de colza, sojas, linho, girassol, açafrão, nasturcio, palma, COCO, cânhamo, oliva, gergelim, amendoim, coco babaçu, castor, milho, canola, jatrofa, mostarda, jojoba, farelo de arroz, semente de algodão, tlaspiácea, tremoço, algas, halófitos, tais como, quenopodiácea anã; resíduos vegetais ou outros óleos, tais como, óleos que sobraram da produção de alimentos ou produtos gerados a partir desses. Em algumas modalidades, a amostra é um produto intermediário, um produto residual ou um subproduto de refino de óleo ou gordura, que inclui, porém, não se limita a, estoque de sabão, óleo ácido, destilados de ácido graxo, gomas, subprodutos de derivados de ácido graxo Omega-3 a partir de ôleo de peixe, gordura de coletor de gordura, ácidos graxos livres, frações de óleo obtidas por separações físicas, ou quaisquer combinações desses. Em algumas modalidades, as amostras para geração de biodiesel são derivadas de algas.

[0053] Em algumas modalidades, a amostra compreende esteril glicosideos. "Esteril glicosideos", conforme usados no presente documento, referem-se s a moléculas que compreendem uma ou mais unidades de carboidrato ligadas a um grupo hidroxila de uma molécula de esterol. Os exemplos de molécula de esterol incluem, porém, sem limitação, fitoesteróis, tais como, campesterol, estigmasterol, sitosterol, avenasterol, desmosterol, fucosterol, sargasterol, brassicasterol e diidrositosterol; zoosteróis, tal como, colesterol; ou versões de "estanol" saturadas de tais esteróis. Um carboidrato pode ser uma porção de açúcar com exemplos que incluem, porém, sem limitação, glicose, sacarose, xilose, arabinose, frutose, galactose, manose, glucuronideos, esteril glicosideos ou diglicosideos sulfatados. Uma porção de açúcar pode ser ligada a uma porção de esterol através de uma ligação glicosidica. Em algumas modalidades, uma porção de açúcar é acilada ma posição de carbono 6. Os exemplos de esteril glicosideos incluem, porém, sem limitação, esteril glicosideos adiados, esteril glicosideos não adiados, esteril glucosídeos e β-sitosteril glucosideo. Quando uma porção de açúcar for glicose, o esteril glicosldeo pode ser referido como um esteril glucosideo. Na presente invenção, o termo esteril glicosldeo se destina a abranger o esteril glucosideo.

[0054] Conforme usado no presente documento, a solubilidade refere-se à quantidade de um soluto que pode ser dissolvido em um solvente. A solubilidade do soluto geralmente varia com base na temperatura, pressão e composição do solvente. A solubilidade de esteril glicosideos em biodieseis e óleos geralmente aumenta com a temperatura. A Figura 3 mostra a solubilidade de uma mistura de esteril glucosideo em biodiesel gerada a partir dè óleo de soja a temperaturas diferentes. A solubilidade de esteril glucosideo foi avaliada biodiesel de soja destilado. 100 partes por milhão ("ppm") de esteril glucosideo foram adicionadas ao biodiesel e incubadas a 100°C por 24 horas ("h") nas temperaturas indicadas e incubados por 4 h antes da determinação de solubilidade de esteril glicosideo. Em algumas modalidades, a solubilidade de esteril glucosideo na amostra é de pelo menos 30 ppm, pelo menos 40 ppm, pelo menos 50 ppm, pelo menos 60 ppm, pelo menos 70 ppm, pelo menos 80 ppm, pelo menos 90 ppm, pelo menos 100 ppm ou pelo menos 110 ppm. A solubilidade pode ser medida determinando-se a quantidade de esteril glicosideo no biodiesel ou precursor de biodiesel, excluindo qualquer esteril glicosideo precipitado. A quantidade de esteril glicosideono óleo ou gordura (por exemplo, substrato de biocombustivel) e/ou o biocombustivel pode ser determinado por qualquer processo convencional.

[0055] A quantidade de esteril glicosideo em üm óleo ou gordura pode variar dependendo da fonte de amostra. A quantidade de esteril glicosideos em óleo de soja bruto é mais alta que em alguns outros óleos; que são comumente usados para produzir biodiesel, tais como, por exemplo, semente de colza, milho, óleo de algodão ou girassol. Em algumas modalidades, a concentração de esteril glicosideo em uma amostra é de pelo menos 30 ppm, pelo menos 4 0 ppm, pelo meno-s 50 ppm, pelo menos 60 ppm, pelo menos 70 ppm, pelo menos 80 ppm, pelo menos 90 ppm, pelo menos 100 ppm, pelo menos 110 ppm, pelo menos 120 ppm, pelo menos 130 ppm, pelo menos 140 ppm, pelo menos ISO ppm, pelo menos 200 ppm, pelo menos 250 ppm ou pelo menos 300 ppm em peso. A concentração, conforme usada no presente documento, geralmente refere-se à quantidade total de uma substância (por exemplo, esteril glicosideó) em uma amostra que inclui tanto precipitados, como espécies dissolvidas. As concentrações podem ser determinadas, por exemplo, por extração de fase sólida e cromatografia gasosa, conforme descrito em Phillips et al. (2005), Journal of Pood Lipids, 12(2), 124-140, que é incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0056] A qualidade do biodiesel depende fortemente da quantidade de material insolúvel que esse contém. Essa pode ser medida usando um teste de bloqueio de filtro padrão, tal como, aquele de acordo com o método ASTM D 2068 "Standard Test Method for Filter Blocking Tendency of Distillate Fuel Oils", Teste de Contaminação Total, de acordo com o método EN12662:1998 on ASTM D7321-11, e Teste de Filtração por Imersão a Frio, de acordo com o método ASTM D7501-12. Em general, quando os esteril glicosideos forem removidos, de acordo com a presente invenção, o biodiesel será de melhor qualidade em comparação a um biodiesel de controle comparável no qual os esteril glicosideos nào foram removidos.

[0057] Em algumas modalidades, a amostra compreende outros compostos insolúveis, tais como, ésteres de esterol, ésteres de alquil esterol, glucosídeos de esterol sulfatado e ceras.

[0058] Em algumas modalidades, os métodos, conforme descrito no presente documento, são usados para remover esteril glicosideos de uma amostra antes do processamento para produzir biodiesel. Em outras modalidades, os métodos descritos são usados após a produção de biodiesel. Em algumas modalidades, os métodos são usados em combinação com outros métodos para remover componentes indesejados, tal como, destilação ou filtração.

II . Enzimas

[0059] A invenção, conforme descrito no presente documento, abrange uma variedade de enzimas para reduzir a quantidades de esteril glicosideos. Conforme usado no presente documento, uma enzima refere-se a um polipeptídeo ou ribozima que pode catalisar uma reação química.

[0060] As esteril glicosidases são enzimas capazes de hidro.lisar a ligação glicosidica em um esteril glicosldeo e/ou um esteril glicosldeo acilado para produzir um resíduo de açúcar livre e um esterol livre, um exemplo dessas é mostrado na Figura 1. As esteril glicosidases incluem, porém, sem limitação, enzimas glicosidase, tais como, enzimas β-glicosidase ou amiloglicosidase.

[0061] Para realizar eficientemente a redução enzimática de SGs a altas temperaturas, as esteril glicosidases termoestáveis são necessárias. As enzimas termoestáveis são enzimas que mantêm pelo menos uma porção de sua atividade a altas temperaturas. Por exemplo, as enzimas termoestáveis podem manter uma porcentagem de sua atividade de pico acima da temperatura requerida para a atividade de pico. Tais temperaturas podem se encontrar a ou acima de cerca de 50°C, 60óC, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95DC, 98°C, 100°C, 105°C, 110°C ou 115°C. Em algumas modalidades, a porcentagem da atividade mantida em qualquer uma das temperaturas acima é inferior a 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou superior a 99% da atividade de pico. Em algumas modalidades, as enzimas termoestáveis são enzimas termofilicas, em que a atividade de pico da enzima ocorre à temperatura relativamente mais alta, tal como, a ou acima de 50°C, 60°C, 65QC, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C, 98°C, 100°C, 105°C, 110°C ou 115°C. Em algumas modalidades, as enzimas termoestáveis são enzimas termofilicas, em que a atividade de pico da enzima ocorre entre 80 e 90°C.

[0062] As enzimas podem ser sequências do tipo selvagem de ocorrência natural ou variantes naturais ou artificialmente geradas. As variantes podem ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma enzima do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a enzima tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% identidade ou 100% de identidade em uma sequência listada ha Tabela 1. As variantes podem compreender qualquer tipo de variação, que incluem, porém, sem limitação, mutações genéticas, tais como, mutações, inserções, deleções ou transversões pontuais.

[0063] Em algumas modalidades, as enzimas são variantes de enzimas do tipo selvagem de ocorrência natural. Em algumas modalidades, as enzimas variantes têm atividade aumentada em comparação às enzimas do tipo selvagem. Em algumas modalidades, as enzimas variantes têm melhor atividade que as enzimas do tipo selvagem sob as condições usadas para purificar o biodiesel, tal como, teor, pressão ou temperatura iônica. Em algumas modalidades, as enzimas variantes são mais estáveis ou têm melhor atividade em determinadas faixas de temperatura em comparação às enzimas, do tipo selvagem, tais como, a temperaturas acima de cerca de 25 °C, acima de cerca de 37 °C, acima de cerca de 45°C, acima de cerca de 50“C, acima de cerca de 65 °Ç, acima de cerca de 70°C, entre cerca de 25“C e cerca de 50°C, entre cerca de 25°C e cerca de 65DC, entre cerca de 37 °C e cerca de 50*0, entre cerca de 37°C e cerca de 65°C, entre cerca de 45°C e cerca de 65°C, entre cerca de 25eC e cerca de 110°C, entre cerca de 37°C e cerca de 110°C, entre cerca de 45°C e cerca de 110°C, entre cerca de 50°C e cerca de 110°C, entre cerca de 60°C è cerca de 110°C, entre cerca de 70DC e cerca de 110°C, entre cerca de 80°C e cerca de 110°C, entre cerca de 37QC e cerca de 95°C, entre cerca de 45°C e cerca de 95°C, entre cerca de 50’C e cerca de 95°C, entre cerca de 60°C e cerca de 95°C, e entre cerca de 70°C e cerca de 95°C. Em algumas modalidades, as enzimas variantes são versões termoestáveis ou termofilicas das enzimas do tipo selvagem. Em algumas modalidades, as enzimas termoestáveis ou termofilicas podem ser enzimas do tipo selvagem, tais como, aquelas isoladas dos termófilos.

[0064] A ativiciade de esteril glicosidase pocie ser determinada medindo-se a glicose resultante da hidrólise de esteril glicosldeo, por meio de métodos colorimétricos, tal como, o ensaio de Glucose Oxidase. Em algumas modalidades, a atividade de esteril glicosidase é medida misturando-se uma esteril glicosidase em tampão apropriado à água e à enzima a ser testada. A mistura de reação é incubada a uma temperatura selecionada em uma incubadora de agitação. Os produtos de esterol são extraídos com clorofórmio, e a fase de clorofórmio removida e evaporada, tal çomo, sob nitrogênio. A amostra resultante é, então, analisada, por exemplo, usando-se HPTLC ou espectroscopia de massa, para determinar a presença e, opcionalmente, a quantidade de esterol produzida. Os detalhes adicionais de um método exemplificative de como analisar a atividade de esteril glicosidase podem ser encontrados no documento πq W02010/004423. Em algumas modalidades, a atividade enzimática é medida ao longo de uma faixa de temperaturas. Em algumas modalidades, a atividade de pico é calculada como a atividade enzimática em uma temperatura ótima na qual a enzima tem atividade roais alta.

A. Identificação de proteínas com atividade de esteril glicosidase

[0065] As preparações contendo misturas de enzimas não identificadas com atividade esteril glicosidase foram descritas, porém, nenhum polipeptídeo que transporta tal atividade especifica foi identificado. Também, existem diversas enzimas que são conhecidas por ter atividade beta- glusidase. Entretanto, não existe relato conhecido que presente invenção descobriram de maneira surpreendente que determinadas beta-glusidases também têm esteril glicosidase, algumas das quais são proporcionadas no presente documento na Tabela I, As sequências de polipèptídeo de exemplos não limitativos de enzimas capazes de hidrolisar a ligação glicosidica de esteril glicosideos ou esteril glicosideos adiados para formar um açúcar e um esterol ou esterol acilado correspondente são apresentadas na Tabela 1. Outras enzimas esteril glicosidase podem ser isoladas e/ou identificadas a partir de células ou extratos celulares usando métodos conhecidos na técnica.

[0066] As enzimas adequadas para uso com essa invenção podem ser encontradas e isoladas de uma variedade de espécies, incluindo animais, plantas, protistas, micróbios e fungos. Em algumas modalidades, as enzimas adequadas podem ser isoladas das espécies termofílicas. Os exemplos de espécies que podem conter lipases ou esteril glicosidase adequadas para uso com a invenção incluem espécies do gênero Sulfolõbus, incluindo, o. acidocaldarius, S. islandicus e S. solfa taricus; Pyrococcus, incluindo P. horikoshli e P. furiosus, Caldivirga, tal como, C. maquilingensis; Vulcanisaeta, incluindo V. distributa e V. moütnovskia; Acidilobus, tal como, A, saccharovorans; Thermoproteus, tal como, T. vzoniénsis; Thennoplasina, tal como, T. vo lean lura ; Ignisphaera, tal como, I. aggregans; Thermospbaera, tal como, T. aggregans; Tbermococcus, incluindo T. litoralis, T. kodakarensis, T, baropbilus, T. alcalipbilus e T. sibirlcus; Aciduliprofundum, tal como, A. boonei; Aspergillus, incluindo A. niger, A. aculeatus, A fumigates A. flávus, A. kawachii, A. oryzae, A. terreus; Thermomyces, tai corao, T. lanuginosa; Candida, incluindo C. Antarctica e C. albicans; Saccharoπiyces, tai como, S. cerevisiae.

[0067] As esteril glicosidases podem ser identificadas pelos métodos conhecidos na técnica, tal como, através da purificação bioquímica de extratos fracionados com atividade de glicosidase. Tais extratos fracionados podem ser tomados de amostras celulares, tais como, lisadõs ou de composições misturadas que compreendem atividade de glicosidase. Algumas tais composições misturadas são cometeiaImente disponíveis, tal como, Grindamyl®1 Ça 150 (disponível junto a Danisco A/S). Outras enzimas adequadas incluem, porém, sem limitação, amiloglicosidases, tal como, AMG8.000 (disponível junto a Danisco A/S). A atividade de glicosidase pode ser medida por qualquer método descrito no presente documento ou conhecido na técnica. Tabela 1

[0068] As β-glicosidases termofilicas adicionais, conforme apresentado no documento n“ US 6.960.454, que é incorporado a titulo de referência em sua totalidade, pódem ser diretamente usadas na presente invenção ou podem ser usadas como ponto de partida para a otimização adicional usando os métodos proporcionados no presente documento.

B, Desenvolvimento de uma esteril glicosidase variante

[0069] Em algumas modalidades, uma enzima identificada com atividade de esteril glicosidase é usada como uma base para gerar uma enzima mutante com atividade aumentada com tal eficiência ou estabilidade catalítica maior, incluindo, porém, não limitada à termoestabilidade. Em algumas modalidades, uma enzima identificada ou enzima variante é modificada para aumentar a atividade ou estabilidade, tal como, através da modificação põs- traducional. Em algumas modalidades, a variante tem uma diferença epigenética a partir da cepa original. Era algumas modalidades, a variante é um mutante, por exemplo, a variante contém uma mutação no gene qüe codifica a esteril glicosidase. Um gene se refere a uma sequência de desoxirribonucleotídeo (DNA) que codifica um polipeptideo, tal como, uma esteril glicosidase. O DNA pode ser natural, artificial ou uma combinação de ambos.

[0070] Em algumas modalidades, a enzima mutante pode set gerada pela mutação marcada. Em algumas modalidades, as mutações podem ser determinadas com base nas informações estruturais sobre a enzima ou seus homólogos. Por exemplo, a enzima pode se tornar mais estável sob condições de calor mais altas usando-se mutações de cisteina para criar pontes de dissulfeto estabilizantes. Em algumas modalidades, as mutações estabilizantes podem se basear no aumento de interações carregadas ou hidrofóbicas entre os resíduos. Em algumas modalidades, a atividade catalítica pode ser aumentada por mutações que afetam o sítio ativo da enzima. Tais mutações podem se basear, por exemplo, em aumentar a homologia para outra enzima mais ativa. Em algumas modalidades, a enzima mutante pode ser truncada, por exemplo, para remover um domínio inibitório. Em algumas modalidades, a enzima mutante pode ser uma proteína de fusão, tal como, através da fusão a um polipeptideo, que inclui, porém, não se limita a, proteínas ou domínios totais ou parciais ou sequências de peptideo curtas.

[0071] Em algumas modalidades, a enzima variante é gerada por mutação aleatória, seguida pela seleção para a atividade desejada. Em algumas modalidades, a enzima variante é gerada por evolução dirigida. A evolução dirigida geralmente consiste na produção de uma população de variantes ao redor de uma sequência modelo ou de partida que, então, escolhe variantes com uma propriedade desejada, tal como, atividade de esteril glicosidase, atividade de lipase e/ou termoestabilidade.

[0072] Em algumas modalidades, um gene que codifica uma enzima previamente identificada é usado como um modelo para a evolução dirigida. 0 gene modelo pode ser usado para gerar cópias mutadas. Os métodos adequados para gerar cópias mutadas incluem, porém, sem limitação, replicação propensa a erros, mutagênese marcada ou mutagênese dirigida por oligonucleótideos.

[0073] Em algumas modalidades, os genes são inseridos nos vetores sob o controle de üm promotor. Em algumas modalidades, o promotor é usado para controlar a expressão de um gene variante que codifica a esteril glicosidase ou lipase. Os promotores para uso com a invenção podem ser, por exemplo, induzíveis ou constitutivamente ativos. Por "induzível" entende-se que a atividade promotora pode ser controlada por um agente indutor, tal como, um composto, peptideo, ion ou outro aditivo. Os agentes indutores incluem, porém, sem limitação, agentes orgânicos; agentes inorgânicos; álcoois; neurotransmissores; antibióticos; peptideos; carboidratos; ácidos nucleicos; hormônios; fármacps; luz; toxinas; e temperatura. Em algumas modalidades, õs promotores induziveis são ativados por um ativador. Em algumas modalidades, os promotores induziveis são reprimidos por um repressor.

[0074] Em algumas modalidades, o promotor induzivel é um comutador, por exemplo, ativo ou silenciado que depende se um agente indutor encontra-se presente. Em algumas modalidades, o promotor induzivel é ajustável, por exemplo, o nível da atividade promotora varia com base na quantidade de agente indutor que está presente. Em algumas modalidades, o promotor é linearmente ajustável. Um promotor ajustável pode controlar a expressão de enzima com base na concentração de agente indutor adicionada ao meio de triagem, o que é útil para controlar o grau de pressão de seleção, conforme descrito no presente documento.

[0075] [0001] exemplos de promotores adequados para uso na invenção incluem, porém, sem limitação, promotores induziveis por cobre e sistema de expressão dependente de beta-estradiol (UASGAL10/GEV).

'Transformação

[0076] Em algumas modalidades, as cópias mutadas do gene modelo podem ser transformadas em células hospedeiras. As células hospedeiras da presente invenção podem ser de tipos diferentes e a partir de organismos diferentes, que incluem, porém, sem limitação, bactérias, fungos (por exemplo, levedura), algas, plantas e animais. Em algumas modalidades, a célula é um microrganismo, tal como, levedura ou microalga. Em algumas modalidades, as células são células de levedura que incluem, porém, sem limitação, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardi, Pichiâ pastoris, ffansenula polymorpha e Schizosaccharomyces pombe. As células hospedeiras que compreendem qualquer um dos genes variantes da invenção podem formar cepas separadas. As cepas são, por exemplo, cepas clonais isoladas de uma colônia individual ou não clonal, por exemplo, derivadas de uma amostra de cultura liquida.

[0077] A transformação pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, que inclui, porém, não se limita a, eletroporação, transformação quimica, transfecção, uso de um plasmideo Ti, bombardeamento de partículas, transdução ou uso de agentes infecciosos. Os métodos de modificação de gene expressão ou introdução de um ou mais genes exógenos em uma célula são conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodos de transformar estavelmente células e composições que compreendem ácidos nucleicos isolados de uso são bem conhecidos na técnica e quaisquer tais métodos e composições podem ser usados na prática da presente invenção. Os métodos de transformação exemplificativos de uso podem incluir bombardeamento de microprojéteis, eletroporação, fusão de protoplastos, transformação mediada por PEG, whiskers de carboneto de silício revestidos com DNA ou uso de transformação mediada por virus (consulte, por exemplo, Sanford et a.l., 1993, Meth. Enzymol. 2171483 a 5Q9; Dunahay et al., 1997, Meth. Molec. Biol. 62:503 a 9; Patnete n° U.S. 5.270,175; 5.661.017). 0 método usado pode variar com o tipo ou espécie de célula hospedeira. Por exemplo, o bombardeamento de partículas pode ser mais adequado para atravessar as paredes celulares das células vegetais.

[0078] Em algumas modalidades, um ou mais genes exógenos são introduzidos nas células hospedeiras usando um vetor. Em geral, o vetor compreende as sequências de nucleotideo que codificam o gene exógeno e os elementos reguladores necessários para a transformação e/ou expressão de gene na célula hospedeira, tais como, as sequências promotoras proporcionadas no presente documento. Em algumas modalidades, os vetores são selecionados para otimizar a expressão nas células hospedeiras usadas. Por exemplo, o vetor de expressão de levedura YES2 pode ser usado para expressar os genes em células hospedeiras de levedura. Em algumas modalidades, os vetores da presente invenção compreendem uma sequência principal. Em algumas modalidades, os vetores da presente invenção compreendem um sitio de clonagem múltipla, ura ou mais elementos reguladores para controlar a expressão do gene de inserção, assim como, um ou mais marcadores para seleção. Os marcadores incluídos são os marcadores de resistência à paromomicina (Sizova et al., Gene 181:13 a 8 (1996J) e marcadores de resistência à higromicina B (Berthold et al., Protist 153:401 a 12 [2002)).

[0079] Em algumas modalidades, um ou mais genes exógenos são integrados ao genoma das células hospedeiras. Em algumas modalidades, um vetor contendo um gene exógeno é introduzido na célula hospedeira, e o gene exógeno subsequentemente integrado ao genoma da célula hospedeira. Em algumas modalidades, a recombinação homóloga é usada para integração. Em outras modalidades, a recombinação sitio especifica é usada, que inclui, porém, não se limita aos métodos, tal como, a recombinação Cre- Lox. Em algumas modalidadesr um sistema retroviral ou à base de transposão é usado.

[0080] Ern algumas modalidades, os genes mutados são gerados em uma célula hospedeira. Os métodos para gerar tal população variante incluem, porém, sem limitação, indução de mutações nas células hospedeiras contendo o gene modelo, tal como, cultivo das células hospedeiras em um ambiente de indução de mutação. Os ambientes de indução de mutação incluem, porém, não se limitam à radiação UV ou tratamento com agentes mutagênicos, tal como, metilmetano sulfonato (MMS). Muitos outros métodos para gerar uma população de genes mutant.es são conhecidos na técnica e são utilizáveis com a invenção.

[0081] A geração de mutações na célula hospedeira pode ser vantajosa porgue essa não requer uma etapa de transformação antes da triagem inicial. Entretanto, a geração de mutações aleatórias no genoma de célula hospedeira também pode causar mutações em outros genes, o que pode causar efeitos fenotipicos que afetam o processo de triagem. Em algumas modalidades, um gene que codifica a esteril glicosidase ou lipase alvo é isolado de uma célula hospedeira mutada. Em algumas modalidades, o gene é isolado da célula hospedeira mutada antes da triagem. Em algumas modalidades, o gene é, então, transformado em uma ou mais células hospedeiras para triagem em um fundo genético consistente. Em algumas modalidades, o gene é isolado da célula hospedeira mutada após a triagem. Em algumas modalidades, O gene isolado é testado para mutações, tal como, através da detecção de polimorfismo de nucleotideo único (SNP), análise de restrição ou sequenciamento. Em algumas modalidades, o gene nâo é isolado de uma célula hospedeira mutada. Triagem

[0082] Em algumas modalidades, após gerar uma população de variantes, as variantes com a propriedade desejada são escolhidas por métodos de seleção ou triagem, tal como por seleção positiva. O número de mutantes investigados é tipicamente muito grande, até IO11.

[0083] Em algumas modalidades, a célula hospedeira usada para a triagem é uma célula de levedura. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de levedura auxotrófica que não tem capacidade para sintetizar ergosterol, tal como DY1457 Δheml (Crisp et. al, J. Biol. Chem 278: 45.499 a 45.506). Ergosterol é um esterol natural que é um componente da cápsula de levedura. Na ausência de uma fonte externa de esterôis, tais células de levedura auxotróficas não têm capacidade para formar colônias.

[0084] Em algumas modalidades, as células de levedura auxotróficas são dispostas em placa em um meio que contém esteril glicosideo. Por exemplo, para testar um esteril glicosidase, o ergosterol glucosideo pode ser incluido no meio. Alguma quantidade de indutor também é incluida para estimular a expressão do gene esteril glicosidase variante. Quanto menor a quantidade de indutor, mais seletivo o método será. Somente células hospedeiras que expressam uma esteril glicosidase com atividade suficiente para digerir esteril glicosideo em uma quantidade viável de esterôis formará colônias. Em algumas modalidades, as células de colônias bem sucedidas são isoladas, usadas para os ciclos subsequentes de evolução dirigida, e/ou usadas para produzir enzima para tratar biodiesel. Em algumas modalidades, os genes de esteril glicosidase de colônias bem sucedidas também são isolados para análise, sequenciamento, transformação em outro tipo de célula hospedeira, ou usadas para os ciclos subsequentes de evolução dirigida.

[0085] Em algumas modalidades, as células hospedeiras auxotróficas são cultivadas em uma temperatura especifica para selecionar a termoestabilidade de enzima. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são cultivadas em aproximadamente 45 °C ou superior, em aproximadamente 50 °C ou superior, em 55 °C ou superior, em 60 ’C ou. superior, em 65 °C ou superior, em 70 °C ou superior, em 75 °C ou superior, em 80 °C ou superior, em 85 °C ou superior, em 90 °C ou superior, em 95 °C ou superior.

[0086] Mutantes auxotróficos de lipídio correspondentes, os nutrientes suplementares e os níveis de indutor conforme pode ser conhecido para um indivíduo versado na técnica podem ser usados para selecionar as lipases variantes.

[0087] Em algumas modalidades, as etapas de mutação e seleção são repetidas múltiplas vezes. Em algumas modalidades, a etapa de seleção subsequente é realizada com quantidades decrescentes de ativador de promotor, que permitem que cada rodada de evolução dirigida aumente gradualmente a atividade de enzima. Em algumas modalidades, a etapa de seleção é realizada com quantidades crescentes de um inibidor de promotor. Em algumas modalidades, as etapas de seleção subsequentes são realizadas em temperaturas crescentes para aumentar gradualmente a pressão seletiva para termoestabilidade alta. Em outras modalidades, a triagem inicial é realizada com um nivel baixo de ergosterol ou outro nutriente essencial correspondente e os ciclos de triagem subsequentes são realizados com níveis decrescentes do nutriente essencial. Esse método de triagem é mais adequado para o uso quando a enzima de partida é relativamente ineficiente.

[0088] Era algumas modalidades, entre cada ciclo de seleção, o gene variante é colocado sob o controle de um promotor mais fraco. Nessas modalidades, os promotores podem ser induziveis ou constitutivos. Em um exemplo, a etapa de seleção inicial é realizada enquanto o gene variante está sob o controle de um promotor forte. Em uma etapa de seleção subsequente, o gene variante ou uma variante do mesmo está sob o controle de um meio promotor. Ainda em uma etapa de seleção posterior, o gene variante óu uma variante do mesmo está sob o controle de um promotor fraco.

[0089] Os promotores fortes exemplificativos incluem os promotores dos genes a seguir: fator de montagem/estabilidade de Fotosistemã II, Peptidil-Prolil cis-trans isomerase, histidinol desidrogenase, malato desidrogenase (NAD+) (Mdh2) e LHC (LhcII-1.3).

[0090] Os meios promotores exemplificativos são os promotores dos genes a seguir: transportador de Formato Nitrito, subunidade proteolitica de protease CLP dependente de ATP, serina c.a rboxipe.pt ida se I, e proteína ribossômica 40S S19.

[0091] Um promotor fraco exemplificative é o promotor do gene a seguir: esterol-C-metiItransferase Ergô como proteína.

[0092] Métodos similares conforme pode ser óbvio para um indivíduo versado na técnica podem ser usados para selecionar as lipases ou fosfolipases com atividade ou termoestabilidade superior-

C. Produção de enzima

[0093] As enzimas podem ser produzidas por métodos de escala pequena, métodos de grande escala, industrial métodos, ou quaisquer outros métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a sequência do gene que codifica a enzima é uma sequência conhecida no domínio público, especificamente a sequência que codifica as sequências de proteína fornecidas no presente documento (por exemplo, na Tabela 1). Em algumas modalidades, a sequência é uma sequência que é obtida por otimização de códon. Em algumas modalidades, a sequência de gene é isolada de uma colônia examinada conforme descrito no presente documento, ou é projetada para codificar tal proteína.

[0094] Em algumas modalidades, a enzima é produzida por tradução in vitro. Em algumas modalidades, a enzima é sintetizada quimicamente. Em algumas modalidades, a enzima é expressa em uma célula hospedeira. Os genes isolados ou sintéticos que expressam uma esteril glicosidase da invenção podem ser transformados e expressos em células hospedeiras adequadas, incluindo, mas sem limitação, as bactérias (por exemplo, E. aoli), levedura, algas, fungos filamentosos, planta e células de mamífero.

[0095] Em algumas modalidades, os genes que codificam as enzimas são otimizados para expressão na célula hospedeira, por exemplo, projetando e sintetizando- se as sequências otimizadas por códon que codificam os polipeptídeos. Um sumário de uso de códon de C. reinhardtii é fornecido em Mayfield e Kindle, PNAS (1990) 87:2.987 a 2.991. O uso de códon adicional para organismos diferentes são disponíveis no Codon Usage Database (endereço web: www.kazusa.ou.jp/codon/) .

[0096] Em algumas modalidades, as células produzem tanto os materiais brutos para a geração de biocombustíveis quanto uma enzima variante da invenção. As células hospedeiras podem ser heterólogas ou homólogas à fonte do gene original. Em algumas modalidades, as células hospedeiras têm taxas de crescimento normal ou quase normal. Em algumas modalidades, o gene variante é controlado por um promotor induzivel, e as células modificadas geneticamente têm uma taxa de crescimento normal ou quase normal enquanto o promotor não está ativo.

[0097] Em algumas modalidades, o gene variante é integrado no genoma da célula hospedeira em uma localização sob o controle de um promotor endógeno. Em algumas modalidades, o gene variante está em um vetor ou integrado no genoma da célula hospedeira juntamente com uma sequência de promotor exógeno.

[0098] Em algumas modalidades, a expressão do gene transformado na célula hospedeira é estável. Por "expressão estável" no presente documento se entende que o gene transformado é retido na célula hospedeira por pelo menos 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 gerações, e sendo transcrito em RNA e/ou expressa a proteína que o mesmo codifica. Em geral, um gene transformado estável é retido na célula hospedeira por pelo menos 1,2 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou 25 dias, ou por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses, e sendo transcrito em RNA e/ou expressa a proteína que o mesmo codifica. Em algumas modalidades, □ expressão estável é na presença de um ativador de promotor. As células que não expressam o gene transformado, mas retêm a capacidade para expressar o gene tal como na presença de quantidades suficientes de ativador, são incluídas como células de expressão estável. Em algumas modalidades, as células são armazenadas, por exemplo, como um estoque congelado por pelo menos 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses.

[0099] A expressão inclui a expressão constitutiva ou induzível. Em algumas modalidades, o gene que codifica uma enzima recombinants está sob o controle de um promotor induzível, incluindo, mas sem limitação, os promotores que podem ser ativados por IPTG ou Cu24. A célula hospedeira que contém a enzima induzível pode ser cultivada em cultura líquida, na ausência de ativadores, até que a produção de célula hospedeira esteja passando pelo crescimento exponencial. Em células hospedeiras bacterianas, a fase de crescimento exponencial é determinada tipicamente por absorvância de luz de 0,6 a 0,8 O. D. em 600 nm. 0 ativador é adicionado em seguida à cultura líquida para induzir a expressão da enzima. Após várias horas, as células são colhidas e Usadas tipicamente para liberar a enzima. Em algumas modalidades, os inibidores de protease, agentes de redução, ou outros aditivos são adicionados às células lisadas para preservar a atividade enzimática.

[0100] Em algumas modalidades, o gene que codifica a enzima recombinante está sob o controle de um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor forte. Nessas modalidades, as células podem ser Usadas diretamente para liberar a enzima, sem qualquer etapa de indução.

[0101] Em algumas modalidades, a presente invenção descreve as instalações de produção a serem usadas na produção de enzima em larga escala. Em algumas modalidades, as instalações usam células de levedura, bactérias, ou algas que expressam a enzima variante. Nas modalidades em que a levedura ou bactéria são usadas para produzir as enzimas, os métodos de cultivo da levedura e bactéria incluem fermentadores, tais como fermentadores de escala industrial.

[0102] Nas modalidades em que as algas são usadas para produzir as enzimas, os métodos de cultivo das algas incluem, mas sem limitação, tanques de fluxo continuo abertos, também conhecidos como tanques de taxa alta (HRPs), ou vasos de cultivo fechados, também conhecidos como fotobiorreatores (PBRs). Alguns exemplos de PBRs incluem sacos plásticos transparentes ou tubos de plástico com bombas para promover a circulação.

[0103] Em algumas modalidades, as enzimas expressas são usadas sem isolamento substancial, ou sem a purificação substancial das células hospedeiras. Em algumas modalidades, as enzimas expressas são isoladas das células hospedeiras. Às enzimas isoladas se referem às enzimas que são substancialmente livres de pelo menos um componente da célula hospedeira. Em algumas modalidades, as enzimas isoladas são purificadas adicionalmente, por exemplo, para pelo menos 50% de pureza, pelo menos 60% de pureza, pelo menos 75% de pureza, pelo menos 80% de pureza, pelo menos 90% de pureza, pelo menos 95% dè pureza, pelo menos 98% de pureza, ou cerca de 100% de pureza. A pureza se refere à quantidade total de enzima na composição em massa ou molaridade.

[0104] Em algumas modalidades, as enzimas isoladas são formuladas adicionalmente para o armazenamento ou para o uso no tratamento de biodiesel ou os precursores de óleo dos mesmos. As etapas de formulação incluem, mas sem limitação, a adição de cofatores, chaperonas, ou outros aditivos, a realização da modificação pós-translacional da enzima, ou a adição de conservantes tais como inibidores de protease ou agentes de redução.

D. Uso de enzimas

[0105] As enzimas da invenção são adequadas para o uso na redução da quantidade de esteril glicosideos em uma amostra. Os métodos para o uso das enzimas também são abrangidos pela invenção. Os métodos para o uso das enzimas compreendem geralmente a geração de uma mistura de reação que compreende a enzima e uma amostra que compreende alguma quantidade de esteril glicosideos.

[0106] Em algumas modalidades, o método compreende as etapas a seguir: (i) adicionar uma esteril glicosidase à amostra de biodiesel ou óleo com alguma quantidade de água, (ii) agitar a mistura em temperatura e taxa de cisalhamento determinadas por um período de tempo e (iii) separar o biodiesel ou óleo livre de esteril glicosideos. Um esquema de um procedimento exemplificative é ilustrado na Figura 2. Em algumas modalidades, a esteril glicosidase é fixada a um substrato sólido. Em algumas modalidades, a esteril glicosidase é fixada a um grânulo ou resina que é misturado com a amostra, que permite a remoção mais fácil da enzima após a reação ser concluída. Em outras modalidades, a esteril glicosidase ligada por resina é agrupada em uma coluna, e a amostra flui através da coluna. Em algumas modalidades, a esteril glicosidase é fixada a uma superfície, tais como os lados de uma cuba de reação ou a um filtro e a amostra é permitida a fluir através da superfície ou cruzar a mesma.

[0107] Em algumas modalidades, a esteril glicosidase não é isolada da célula ou lisados de célula antes do uso. Por exemplo, em algumas modalidades em que a célula hospedeira produz tanto um precursor de biocómbustível quanto a enzima recombinante, a reação de esteril glicosidase è realizada diretamente na célula ou lisado de célula. Em algumas modalidades, tais células hospedeiras secretam ou excretam o precursor de biocombustlvel que já foi tratado pela esteril glicosidase. Em outras modalidades, as células hospedeiras são lisadas para liberar o precursor de biocombustível.

[0108] Em algumas modalidades, as células hospedeiras que expressam a enzima podem secretar ou excretar a enzima. Em algumas modalidades, a enzima pode estar presente na superfície externa da célula. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é colocada em um contentor de reação ou em uma superfície de reação, e a amostra é introduzida ao contentor ou superfície. Em um exemplo, as células hospedeiras que expressam a enzima são colocadas em um cilindro, e o biodiesel ou precursor de biodiesel é forçado a fluir através do cilindro.

[0109] Era algumas modalidades, a água compreende pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30% em peso da mistura de reação. Em algumas modalidades, a água compreende aproximadamente 0,1% a cerca de 15%, aproximadamente 0,5% a cerca de 15%, aproximadamente 1% a cerca de 15%, aproximadamente 7% a cerca de 15%, aproximadamente 10% a cerca de 15%, aproximadamente 0,1% a cerca de 10%, aproximadamente 0,5% a cerca de 10%, aproximadamente 1% a cerca de 10%, aproximadamente 0,1% a cerca de 5%, aproximadamente 0,5% a cerca de 5%, aproximadamente 1% a cerca de 5%, ou aproximadamente 0,1% a cerca de 3% em peso da mistura de reação. Sem ser limitada por qualquer teoria, a água é usada na hidrólise enzimática de moléculas.

[0110] Em algumas modalidades, o metanol compreende pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, ou 10% em peso da mistura de reação. Em algumas modalidades, o metanol está presente como uma passagem do processo de transesterificação no biodiesel.

[0111] Em algumas modalidades, o método compreende adicionar adicionalmente outras enzimas. Em algumas modalidades, uma lipase ou fosfolipãse é adicionada para reduzir as quantidades de SMGs. Em algumas modalidades, a reação de lipase cu fosfolipãse ocorre simultaneamente com a reação de glicosidase. Em algumas modalidades, o método usa uma lipase ou fosfolipase sem usar uma esteril glicosidase. Em algumas modalidades, o método usa mais do que uma esteril glicosidase, lipase, e/ou fosfolipase. Em algumas modalidades, uma aciltransferase é usada com uma estéril glicosidase ou no lugar da mesma. Uma aciltransferase acila um esteril glicosldeo não ãcilado para formar um esteril glicosldeo acilado, que é mais solúvel do que os esteril glicosideos não adiados. Em algumas modalidades, outra enzima ou aditivo é adicionada para facilitar a(s) reação(ões) ou tratar de outro modo o biodiesel ou precursor de biodiesel. Em algumas modalidades, as enzimas ou catalisadores responsáveis pela reação de transesterificação são adicionados. Em algumas modalidades, os aditivos tais como emulsificantes Ou cofatores são adicionados. Em algumas modalidades, tais enzimas ou aditivos são termoestáveis.

[0112] As reações enzimáticas da invenção são conduzidas sob condições adequadas para a atividade de enzima, opcionalmente com a mistura. Em algumas modalidades, as reações são conduzidas em uma temperatura entre cerca de 50 °C e aproximadamente 110 °C. Em algumas modalidades, a reação é conduzida em temperaturas acima de aproximadamente 50 °C, acima de aproximadamente 55 °C, acima de aproximadamente 60 cC, acima de aproximadamente 65 °C, acima de aproximadamente 70 °C, acima de aproximadamente 7.5 °C, acima de aproximadamente 80 °C, acima de aproximadamente 85 °C, acima de aproximadamente 90 °C, acima de aproximadamente 95 °C, ou acima de aproximadamente 100 °C. Em algumas modalidades, a reação é realizada em aproximadamente 80 °C ou superior. Outras temperaturas apropriadas podem ser selecionadas com base na enzima específica usada, tal como com base no pico de atividade de uma enzima termoestável ou termofilica. Em algumas modalidades, a reação ocorre ao longo de mais do que uma temperatura durante o curso da reação, tal como ao longo de uma faixa de temperaturas.

[0113] A agitação da reação pode ser realizada em qualquer taxa de ci.salhamento aceitável. Em algumas modalidades, a taxa de cisalhamento é suffcientemente vigorosa para permitir a circulação total do liquido na cuba de mistura. Em algumas modalidades, a taxa de cisalhamento é entre 10 e 5.000 s-1.

[0114] A reação pode ser realizada por qualquer duração adequada para a redução da quantidade de esteril glicosideos na amostra. O tempo de reação pode depender de uma variedade de fatores que incluem, mas sem limitação, a composição ou o volume da amostra a ser tratada, a viscosidade da amostra, a taxa de mistura, a quantidade de esteril glicosideos a ser digerida, a temperatura e a quantidade ou atividade da enzima usada. Como alguns exemplos não limitantes, a reação pode ser realizada por pelo menos 10, 15, 20, 25, ou 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 7 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 9 horas, pelo menos 10 horas, pelo menos 11 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 16 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 24 horas, ou por mais do que 24 horas. De modo similar, o volume de amostra, a taxa de mistura, a quantidade de enzima e a temperatura usadas na reação podem depender de qualquer um dos fatores listados no presente documento, incluindo a duração dã reação. Em algumas modalidades, o pH das reações está entre cerca de 3,0 e 8,0, tal como entre cerca de 4,0 e aproximadamente 7,6, entre 5,0 e 7,0, ou aproximadamente pH 7,5.

[0115] Em algumas modalidades, o tratamento com uma esteril glicosidase que inclui, mas sem limitação, uma esteril glicosidase termoestável, ocorre antes, durante e/ou após a reação de transesterificação. Em algumas modalidades, uma esteril glicosidase é adicionada a um precursor de biodiesel adequado ao mesmo tempo em que um catalisador usado para a transesterificação.

[0116] Em algumas modalidades, há menos esteril glicosideo após o tratamento de esteril glicosidase em comparação ao biodiesel ou precursor de biodiesel não tratado. O tratamento de esteril glicosidase pode reduzir a quantidade de um esteril glicosideo no biodiesel ou precursor de biodiesel em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou em aproximadamente 100%. Quando referente a "reduzir" ou uma "redução" da quantidade de esteril glicosideo em um óleo ou gordura (por exemplo, um substrato de biocombustível) ou um biocombustível - o termo "reduzir" ou "redução" significa em comparação a um óleo ou gordura comparável (por exemplo, substrato de biocombustível) ou o biocombustível que é o mesmo que o substrato de biocombustível ou biocombustível reivindicado exceto que nenhuma enzima(s) de acordo com a presente invenção foi adicionada.

[0117] Em algumas modalidades, após o tratamento, a concentração de esteril glicosideos é menor do que 100 ppm, menor do que 90 ppm, menor do que 80 ppm, menor do que 7 0 ppm, menor do que 60 ppm, menor dõ que 50 ppm, menor do que 40 ppm, menor do que 30 ppm, menor do que 29 ppm, menor do que 28 ppm, menor do que 27 ppm, menor do que 26 ppm, menor do que 25 ppm, menor do que 24 ppm, menor do que 2 3 ppm, menor do que 22 ppm, menor do que 21 ppm, menor do que 20 ppm, menor do que 15 ppm, menor dõ que 10 ppm, ou menor do que 5 ppm em peso.

[0118] Em algumas modalidades, após o tratamento com esteril glicosidase, o biodiesel ou precursor de biodiesel resultante é coletado para a venda, armazenamento, transporte, ou processamento adicional ou refinação.

[0119] III. Produção de Biodiesel.

[0120] Os métodos de produção de biodiesel da invenção compreendem a produção de biocombustíveis a. partir de ácidos graxos ou óleos, e para a redução enzimática da quantidade de esteril glicosideos no biocombustivel.

[0121] A maioria do biodiesel é produzida por interesterificação de triqlicerídeos {por exemplo, óleo e/ou gorduras) com um álcool, frequentemente na presença de um catalisador, para formar ésteres e glicerol. O catalisador é normalmente hidróxido de sódio ou potássio. Como metanol e etanol são os álcoois usados mais comumente na produção de biodiesel comercial, o biodiesel produzido mais comercialmente compreende ésteres de metila ou etila de ácidos graxos (chamados FAME e FAEE, respectivamente). Entretanto, álcoois de cadeia mais longa também podem ser usados. Em algumas modalidades, a amostra a ser tratada compreende um biocombustível ou biodiesel, tais como FAME ou FAEE. Em algumas modalidades, a amostra a ser tratada compreende um biocombustível ou precursor de biodiesel.

[0122] Em algumas modalidades, a amostra que contém esteril glicosideos e pelo menos uma esteril glicosidase é combinada em uma reação ou cuba de reação e misturadas para formar uma mistura de reação, em que a remoção enzimática de esteril glicosideos ocorre. Em algumas modalidades, outros aditivos para realçar a atividade de enzima, a termoestabilidade de enzima, ou a solubilidade de esteril glicosideos são incluídos na mistura de reação. Em algumas modalidades, uma proteína chaperona é adicionada para realçar a termoestabilidade da enzima.

[0123] Em algumas modalidades, tal aquela representada na Figura 2, a água também é adicionada à mistura de reação. Em algumas modalidades, a água é incluída com o material de entrada usado para produzir o biocombustível. Em algumas modalidades, a água ou outros aditivos são removidos do biodiesel após a reação enzimática ser concluída. Como exemplos não limitantes, a reação pode ser realizada por pelo menos 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelõ menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 1 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 9 horas, pelo menos 10 horas, pelo menos 11 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 16 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 24 horas, ou por mais do que 24 horas.

[0124] Em algumas modalidades, a reação é mantida em uma temperatura definida. A temperatura definida pode ser determinada com base na atividade dependente de temperatura da esteril glicosidase. Os exemplos não limitantes de temperaturas adequadas incluem as temperaturas de aproximadamente ou acima de 32 °C, 37 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C, 98 °C, 100 °C, 105 °C, 110 °C, ou 115 °C.

[0125] Em algumas modalidades, a concentração de esteril glicosidase é cerca de 0,1 a 15 g/ton (grama de enzima por tonelada de biodiesel).

[0126] Em algumas modalidades, a reação é realizada na presença de aditivo apropriado, tal como polirricinolato de poliglicerol (ADMULTM), e emulsificantes, tal como lecitina.

[0127] Em algumas modalidades, o calor residual, tal como aquele produzido a partir de geradores elétricos, é usado para manter ou ajudar a manter a temperatura da reação. Em algumas modalidades, o calor solar ou geotérmico é usado para manter ou ajudar a manter a temperatura da reação.

[0128] Em algumas modalidades, os produtos químicos que resultam da reação de esteril glicosidase sào removidos da amostra tratada. Em outras modalidades, os produtos que resultam das reações enzimáticas não sào removidos. Em algumas modalidades, outros métodos para a remoção de glicosideos ou outros precipitados, tais como filtração, centrifugação ou destilação, também s. Alguns exemplos não limitantes de métodos suplementares para a remoção de esteril glicosideos são descritos nas Publicações de PCT n- W02007/Ü76163, WO2007/0175091 e W02008/051984, incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade. Taís métodos suplementares podem ser realizados antes, após, ou durante os métodos enzimáticos da invenção. Em algumas modalidades, a filtração é realizada no biodiesel, tal como com o uso de um filtro com um corte de peso molecular de menos do que 1.000.000 g/mol. Em algumas modalidades, os adjuvantes de filtração são usados, tais como adsorventes, ácido bórico, sabão, açúcares (incluindo sacarose e glicose), saís tais como cloreto de sódio, ácido cítrico, silicato de magnésio, argila, terra de diatomáceas, lecitina, proteínas, carbono, celulose, hidrogel de sílica, ou combinações dos mesmos, para ajudar a remover esteril glicosideos do biodiesel. Os adjuvantes de filtração tendem a aumentar precipitação ou agregação dos esteril glicosideos, o que reduz o tempo necessário para filtrar toda a mistura. Em algumas modalidades, a centrifugação é usada para separar os precipitados do biodiesel. Em algumas modalidades, os adjuvantes de filtração são usados para reduzir o tempo de centrifugação.

[0129] Os sistemas de produção de biodiesel da invenção podem incorporar os sistemas ou componentes de sistema de outros sistemas de produção de biodiesel ou biocombustivel conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o sistema dé produção de biodiesel compreende uma cuba de. reação para conter e/ou misturar a reação. Em algumas modalidades, o sistema de produção de biodiesel compreende um substrato sólido ao qual a enzima é fixada. Em algumas modalidades, a enzima é ligada a um filtro è a reação enzimática ocorre à medida que a amostra flui através do filtro. Em algumas modalidadesr a enzima é fixada a um grânulo ou resina, tal como em uma coluna, e a reação enzimática ocorre à medida que a amostra flui através da resina. Em algumas modalidades, a reação ocorre no interior de uma célula hospedeira que produz tanto a amostra quanto a enzima. Exemplos de sistemas e métodos para o processamento de lipídios em biocombustível, podem ser encontrados nas seguintes publicações de patente, cujos conteúdos completos estão incorporados a titulo de referência no presente documento: Publicações de Patente n— U.S. 2007/0010682, 2007/0131579, 2007/0135316, 2007/0135663, 2007/0135666, 2007/0135669 e 2007/0299291.

[0130] Os biodiesels produzidos pelos métodos descritos no presente documento podem ser usados como um combustível alternativo ao diesel de petróleo, ou podem ser usados como ura aditivo em diesel de petróleo. Frequentemente, uma mescla de biodiesel/diesel de petróleo compreende 20% de biodiesel.

[0131] Embora modalidades preferenciais da presente invenção tenham sido mostradas e descritas no presente documento, será evidente para aqueles indivíduos versados na técnica que tais modalidades são fornecidas somente a título de exemplo. Inúmeras variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles indivíduos versados na técnica sem sair da invenção. Deve-se entender que várias alternativas às modalidades da invenção descrita no presente documento podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro dõ escopo dessas reivindicações e os equivalentes das mesmas sejam cobertos pelas mesmas.

EXEMPLOS Exemplo 1 Medir a atividade de esteril glicosidase

[0132] A atividade de esteril glicosidase é medida como a seguir:

[0133] a) Preparar uma solução de estoque de esteril glicosideo dissolvendo-se 10 miligramas (mg) de esteril glicosideo em 1 mililitro (ml) de uma mistura 3:1 de tetraidrofurano:água.

[0134] b) Adicionar o esteril glicosideo a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro (μg/ml) em 1 ml de uma mistura de reação que contém 50 milimolar (mH) de tampão de Fosfato em pH 6,5 e 5 μg de esteril glicosidase em um tubo Eppendorf.

[0135] c) Colocar a mistura de reação em uma incubadora agitadora e incubar em 80 °C por 4 h.

[0136] d) Extrair a mistura de reação com 1 ml de acetato de etila e evaporar até a secura a vácuo.

[0137] e) RedissOlver a amostra em 10 microlitros (μl) de acetato de etila

[0138] fj Analisar por cromatografia em camada fina (TLC) ã presença de esterôis livres, gerados como resultado de hidrólise de esteril glicosideo após o tratamento enzimático, com o uso de Hexano:Metanol 85:15 como tampão corrente e desenvolver com p-anisaldeido

[0139] d) Alternativamente, analisar 50 μl de amostra da mistura de reação para a presença de glicose com uso de um ensaio com base no método de 6-P-desidrogenase de Hexoquinase/Glicose: a glicose gerada por hidrólise de esteril glicosideo é convertida por Hexoquinase (ou Glicoquinase) em 6-fosfato de glicose. O 6-fosfato de glicose é oxidado adicionalmente por 6-P desidrogenase de Glicose, reduzindo simultaneamente NADP+ para NADPH. O NADPH gerado é detectado por fluorescência (Xex: 338 nm, Àem: 461 nm) e permite a detecção de níveis de glicose abaixo de 1 ppm. 0 ensaio pode ser adaptado à escala de microplacas e detectado em um leitor de microplaca de Sinergia

Exemplo 2 Identificação de uma esteril glicosidase

[0140] 0 seguinte é um exemplo de como identificar uma esteril glicosidase:

[0141] a) Clonar um gene de esteril glicosidase suposto em um vetor de expressão de E. coli pET28a.

[0142] b) Transformar os plasmídeos resultantes por transformação química em uma cepa de E. coli BL21(DE3).

[0143] G) Cultivar uma colônia do clone recombinante em 100 ml de LB em 37 ’C até que a densidade de célula alcance um OD^oo=Or6.

[0144] d) Adicionar 0,5 mM de IPTG à cultura e incubar em 24 °C por 10 h.

[0145] e) Quebrar o caldo de células de E. coli com três ciclos de compressão/descompressão em 100.000 kPa (1.000 bar): em um homogoneizador de APV.

[0146] f) Aquecer o líquido resultante a 80 °C, incubar por 10 minutos e centrifugar até a clarificação para separar os materiais sólidos em uma centrífuga Sharpies em 5.000 g.

[0147] g) Coletar o sobrenadante e analisar quanto à atividade de esteril glicosidase conforme descrito no Exemplo 1.

[0148] Algumas das proteínas exemplificativas listadas na Tabela 1 foram determinadas como sendo esteril glicosidases, conforme representado na Figura 4.

Exemplo 3 Geração de uma esteril glicosidase mais ativa

[0149] O seguinte é um exemplo de como gerar uma esteril glicosidase mais ativa com o uso de evolução dirigida:

[0150] a) Gríar uma biblioteca de genes de esteril glicosidase mutadõs com o uso de PCR propensa a erros.

[0151] b) Inserir a biblioteca de genes mutados em um vetor de expressão de levedura pCU.Pl, que está sob o controle de um promotor que é induzivel linearmente por Cu2t.

[0152] c) Transformar os plasmideõs resultantes por transformação química em uma célula mutante de levedura auxotrófica que não tem capacidade para sintetizar ergosterol, o esterol natural presente na cápsula de levedura.

[0153] d) Dispor em placa as células transformadas em um meio suplementado com esteril glicosideos a uma concentração de 20 mg/1 e uma concentração inicial do indutor de 100 micromolares (pM) de CuSO4.

[0154] e) Recuperar q gene de est'erii glicosidase de uma colônia resultante.

[0155] f) Usar a esteril glicosidase para um novo ciclo de mutagênese aleatória e repetir o processo descrito acima de uma maneira iterativa. Em cada nova seleção, adicionar uma concentração inferior de 10 pM do indutor ao meio.

Exemplo 4 Produção de esteril glicosidase em grande escala

[0156] O seguinte é um exemplo de como produzir uma esteril glicosidase termoestável em uma grande escala:

[0157] a) Um DMA sintético que codifica uma versão otimizada por códon de um gene que codifica qualquer proteína listada na Tabela 1 é clonado nos sítios Ndel- EcoRT do plasmídeo pET24b (Novagen, USA).

[0158] b) 0 plasmídeo resultante é transformado por eletroporação na cepa de E. coli BL21(DE3).

[0159] c) Uma colônia do clone recombinante é cultivada em 100 ml de LB em 37 °C até a densidade de célula alcançar um OD5oo=2.

[0160] d) A cultura obtida acima é transferida para um fermentador de semente que contém 10 litros (1) de meio de HM (descrito abaixo) e cultivada por 10 h em 35 °C.

[0161] e) A cultura é transferida para um fermentador de 1.000 1 que contém 600 1 de meio de HM e cultivada em 35 °C até que a exaustão de glicose. Uma alimentação exponencial de uma solução de nutriente que contém 600 g/1 de glicose e 15 g/1 de MgSO,j é iniciada em seguida em uma taxa suficiente para manter a taxa de crescimento específica em um valor de 0,3 5 h-1 ± 0,05, Quando OD600 alcança um valor de 80, 1 mM de IPTG é adicionado e a solução de nutriente é alimentada em uma taxa constante de 25 ± 1 1/h por 10 h. A concentração de Oxigênio dissolvido é mantida em todo o tempo acima de 30% de saturação por enriquecimento da corrente de ar com oxigênio puro quando necessário. O pH é mantido em 7 pela adição de NH^OH.

[0162] f) No final do processo de fermentação, o caldo é tratado com três ciclos de compressão/descompressão em 1,000.000 kPa (1.000 bar) em um homogeneizàdór de APV para quebrar as células de E. coli.

[0163] g) O líquido resultante é aquecido a 80 °C, incubado por 10 minutos e centrifugado até a clarificação para separar os materiais sólido-s em uma centrífuga Sharpies em 5.000 g.

[0164] h) (NH^sSO^ é adicionado em 80% de saturação ao liquido clarificado, a mistura é incubada em 8 °C por 3 h e centrifugada em seguida em uma centrifuga Sharpies em 5.000 g para obter uma pasta marrom.

[0165] i) A pasta obtida é seca ao ar e o pó resultante contém üma esteril glicosidase com uma pureza acima de 70% conforme determinado por análise de eletroforese de gel. de poliacrilamida (PAGE) .

[0166] Meio de HM: Glicose 10 g/1, Na2HPO4.7H2O 0,6 g/1, KHsPOj 6 g/1, K2HPO4 4 g/L, (NH4)2 HPO^ 3 g/1, SO4Mg.7H2O 2 g/1 e 1 ml/1 de solução de oligoelemento que contém (era g/1): SO^Fe 10, ZnSO4.7H2O 2,5, CUSO.1.5H2O 1, MnSO4.5H20 1, Na2B407.10H2O 0,2, CaCl2.2H2O 5, NaMo04.2H20 1 COC12.6H2O 1; dissolvido em 5 M de HC1.

Exemplo 5 Uso de esteril glicosidase para remover esteril glicosideos de uma mistura de biodiesel

[0167] O seguinte é um exemplo de como usar uma esteril glicosidase para remover esteril glicosideos de uma mistura de biodiesel:

[0168] a) Uma amostra de biodiesel destilado de 42,5 ml que contém 100 ppm de esteril glicosideos é misturada com 7,5 ml de uma solução de água que contém 50 mM de tampão de Fosfato em pH 6,5 e 300 μg de esteril glicosidase. Alternativamente, 5% do emulsificador polirricinolato de poliglicerol (ADMULTM) são adicionados à mistura de reação.

[0169] b) Transferir a mistura para um vaso de 50 ml e incubar em um bloco de aquecimento com um agitador magnético por 4 h em 80 °C, acompanhado por agitação.

[0170] c) Enquanto a reação ocorre, tirar amostras de 1 ml a cada hora, separar: a fase aquosa e analisar quanto à presença de glicose conforme descrito no Exemplo 1.

[0171] d) Após a reação sé concluída, separar as fases aquosa e orgânica e analisar quanto à presença de glicose na fase aquosa conforme descrito no Exemplo 1, e quanto ao consumo de SG por detecção de GC-FID na fase orgânica conforme descrito em outro lugar (J. Food Lipids 12 (2005) 124 a 140).

[0172] Os experimentos foram realizados com o uso de duas esteril glicosidases diferentes selecionadas entre aquelas descritas na Tabela 1: LacS de S. solfataricus (SEQ ID NO. : 2) e TL de T. litoralis (SEQ ID NO.: 17). LacS pode exibir somente hidrólise de esteril glicosideo quando as reações foram realizadas na presença de ADMULTM (Figura 5 e Figura 6). Os experimentos realizados com a enzima TL mostraram uma hidrólise superior e mais rápida em emulsões de Bio/água + ADMUL que o LacS (dados não mostrados). Além disso, o TL pode hidrolisar esteril glicosideos sem a adição de qualquer emulsificador, alcançando quase 100% de hidrólise em 3 h (Figura 6 e Figura 7).

Exemplo 6 Avaliação de hidrólise de esteril glicosideo em biodiesel bruto

[0173] O seguinte é um exemplo de como usar uma esteril glicosidase para remover esteril glicosideos de biodiesel bruto:

[0174] a) Uma amostra de biodiesel bruto de 850 ml que contém cerca de 70 ppm de esteril glicosideos é misturada com 150 ml de uma solução de água que contém 50 mM de tampão de Fosfato em pH 6,5 e 8 mg de esteril glicosidase.

[0175] b) Transferir a mistura em um erlenmeyer de 2 1 e incubar por 4 h em 80 ’C, acompanhado por agitação.

[0176] c) Enquanto a reação ocorre, tirar amostras de 1 ml a cada, separar a fase aquosa e analisar quanto a presença de glicose conforme descrito no Exemplo 1.

[0177] d) Após a reação ser concluída, separar a fase orgânica e analisar quanto à presença de esteril glicosideo por GC-FID e avaliar a qualidade do biodiesel resultante pelos métodos usados concomitantemente na indústria de biodiesel (isto é, o Teste de Contaminação Total de acordo com EN12662:1998 e o Teste de Filtração de Infiltração a Frio de acordo com ASTM D7501-12),

[0178] Experimentos foram realizados com o uso de TL de T. litoralis (SEQ ID No.: 17) . O TL pode hidrolisar completamente os esteril glicosideos em 3 h (Figura 8).

Claims

1. Método para a redução de esteril glicosídeo em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende: em uma mistura de reação, misturar uma enzima termoestável que consiste na sequência de aminoácido SEQ. ID NO. 17 com uma amostra que compreende esteril glicosídeo a uma temperatura acima de 50 °C sob uma condição adequada para a dita enzima termoestável por um período de tempo adequado para degradar o dito esteril glicosídeo, reduzindo desse modo, o esteril glicosídeo na dita amostra para obter uma amostra processada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita amostra compreende óleo, gordura ou biocombustível.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito esteril glicosídeo tem uma solubilidade que é maior do que 50 ppm.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita enzima termoestável tem capacidade para hidrolisar a ligação glicosídica de um esteril glucosídeo ou esteril glucosídeo acilado.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade do dito esteril glicosídeo é reduzida em pelo menos 20%.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita amostra processada compreende menos do que 20 ppm do dito esteril glicosídeo.