ES2579384A1

ES2579384A1 - Producción de alcoholes grasos

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Publication number: ES2579384A1
Application number: ES201530156A
Authority: ES
Inventors: Sandy Christiane FILLET; Mª Del Carmen RONCHEL BARRENO; Beatriz Suárez González; Armando Lara Cambil; José Luis Adrio Fondevila; Javier Velasco Álvarez
Original assignee: Neol Biosolutions SA
Current assignee: Neol Biosolutions SA
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2015-02-10
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2035-02-10
Also published as: WO2016128602A1; ES2579384B1

Abstract

Producción de alcoholes grasos. La presente invención se refiere a la producción de alcoholes grasos mediante el cultivo de un microorganismo de la especie Rhodosporidium toruloides, mediante la inserción de un gen que codifica una enzima con actividad acil-Coa reductasa que permite producir alcoholes grasos en presencia de diferentes fuentes de carbono.

Description

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i) cultivar el microorganismo de la invención en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrógeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo;

5 ii) separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo; y iii) extraer los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del medio de

cultivo obtenidos en la etapa (ii) En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para obtener biosurfactantes que comprende:

10 i) cultivar un microorganismo de la invención en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrógeno en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo;

ii) separar la biomasa microbiana del caldo de cultivo; 15 iii) extraer los alcoholes grasos de la biomasa microbiana y/o del caldo de cultivo obtenidos en la etapa (ii); y iv) convertir la mezcla de alcoholes grasos obtenidos en la etapa (iii) en biosurfactantes. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso del microorganismo según la 20 invención para obtener una biomasa microbiana enriquecida en alcoholes grasos según el primer procedimiento de la invención.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso del microorganismo según la invención para obtener una preparación rica en alcoholes grasos según el segundo 25 procedimiento de la invención.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso del microorganismo según la invención para obtener biosurfactantes según el tercer procedimiento de la invención.

30 BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: plásmido integrativo pNEOL102 Figura 2: Producción de alcoholes grasos en diferentes medios de cultivo.

35 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

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Microorganismo de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un microorganismo, en adelante “microorganismo de la invención”, en donde el microorganismo pertenece a la especie Rhodosporidium toruloides modificado genéticamente con un gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa, en donde dicha enzima tiene capacidad de producir alcoholes grasos.

El término “microorganismo” o “microbio”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un organismo microscópico con capacidad de producir alcoholes grasos, que puede ser unicelular o multicelular. En particular, el microorganismo de la invención es una levadura de la especie Rhodosporidium toruloides.

El término “gen”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena de desoxirribonuclótidos que codifica una proteína. En el caso concreto de la invención, dicho término se refiere a una cadena de desoxirribonucleótidos que codifica una enzima acil-CoA reductasa con capacidad de producir alcoholes grasos.

El término “enzima”, en el contexto de la presente invención, se refiere a una proteína que funciona como un catalizador altamente selectivo, acelerando tanto la velocidad como la especificidad de la reacción metabólica para la cuál es específica.

En concreto, el microorganismo de la invención es un microorganismo modificado genéticamente. El término “microorganismo modificado genéticamente” como se usa en el presente documento, se refiere a un microorganismo cuyo material genético se ha alterado usando técnicas de ingeniería genética. Según esto, dicho microorganismo genéticamente modificado expresa una enzima que tiene una actividad acil-CoA reductasa, comparado con un microorganismo control no modificado correspondiente de la misma cepa. En el contexto de la presente invención, la enzima que tiene actividad acil-CoA reductasa puede estar codificada por un gen que codifica dicha enzima en otro organismo. Generalmente, el gen que codifica una enzima que tiene actividad acil-CoA reductasa se puede introducir en el microorganismo en cualquier forma adecuada, por ejemplo, comprendido en un vector, un plásmido o como ácido nucleico desnudo. Después de ser introducido en el microorganismo, el gen se puede expresar de modo exógeno si se expresa en un vector/plásmido en el microorganismo [es decir, fuera de del/de los cromosoma(s) microbiano(s)], o se puede incorporar en el/los cromosoma(s) microbiano(s) por recombinación aleatoria (ectópica) u

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homóloga o cualquier otro método adecuado conocido en el estado de la técnica. Técnicas apropiadas que permiten la transformación genética en levaduras incluyen pero no están limitadas a:

-Transformación de esferoplastos que supone eliminar la pared celular de la levadura 5 y poner en contacto los esferoplastos con el plásmido en presencia de PEG.

-Transformación con Li+, que supone el tratamiento de las células de levadura con cationes alcalinos monovalentes (Na+, K+, Rb+, Cs+ y Li+) en combinación con PEG para estimular la captación de ADN por las células intactas.

-Bombardeo génico que supone bombardear las células con microproyectiles 10 recubiertos con el ADN exógeno.

-Electroporación, que supone administrar pulsos eléctricos a las levaduras que produce la apertura de poros en la membrana de los esferoplastos y células de levadura intactas.

-Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT) se basa en el 15 empleo de la capacidad de transferencia génica que A. tumefaciens posee de forma

natural. Los transformantes se hacen crecer en un medio nutriente adecuado y bajo condiciones de selección para asegurar la retención del ADN endógeno. La inserción del gen que codifica una acil-CoA reductasa en dichos transformantes puede determinarse mediante cualquier

20 técnica de biología molecular apropiada para ello, por ejemplo, mediante Southern blot o PCR. Métodos convencionales de detección y cuantificación de la expresión de un gen pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y cols., 2001. “Molecular cloning: a Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.

El término “acil-CoA reductasa”, o “reductasa de acil-CoA grasos” tal y como se utiliza en el

25 presente documento, se refiere a polipéptidos que tienen la capacidad de reducir las moléculas de acil-CoA grasos a los a los correspondientes alcoholes (E.C. 1.2.1.50). Las acil-CoA que reducen las moléculas de acil-CoA grasos a los correspondientes alcoholes grasos catalizan la reacción mediante la reducción de cuatro electrones de las formas activas de los ácidos grasos para dar lugar a alcoholes grasos.

30 El término “alcohol graso”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a alcoholes de cadena de entre 4 a 26 átomos de carbono, derivados de grasas y aceites naturales. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de alcoholes grasos de acuerdo a la presente invención incluyen, 1-hexanol (o alcohol hexilico), hepatanol (o alcohol heptílico). 1-octanol (o alcohol

35 caprílico), 2-etilhexanol, 1-nonanol (o alcohol pelargónico), 1-decanol (o alcohol cáprico o

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alcohol decílico), dodecanol (alcohol láurico), 1-tridecanol (alcohol tridecílico), 1tetratdecanol (alcohol miristílico), 1-pentadecanol (alcohol pentadecílico), 1-hexadecanol (alcohol cetílico o alcohol palmítico), cis-9-hexadecen-1-ol (o alcohol palmitoleico, 1heptadecanol (o alcohol pentadecílico), 1-octadecanol (o alcohol esteárilico o alcohol octadecílico), cis-9-octadecen-1ol (o alcohol oleico), 1 nonadecanol (o alcohol nonadecílico), 1-eicosanol (o alcohjol araquidílico) , docosanol (o alcohol behénico), 1-tetracosanol (alcohol lignocérico) o 1 hecacosanol (o alcohol cérico).

En una realización particular y preferida de la invención, el gen que codifica la enzima que tiene actividad acil-CoA reductasa tiene codones optimizados, para la expresión en el microorganismo recombinante, es decir en R. toruloides. En la técnica se conocen codones que pueden ser empleados para la expresión de genes en R. toruloides. Ejemplos ilustrativos no limitativos de codones optimizados que pueden ser empleados para la expresión de genes en incluyen: UUU, UUC, UUA,UUG,CUU, CUC, CUA, AUU,AUC, AUG, GUU,GUC, GUA o GUG (Codon usage database, data source: NCBI-GenBank). En este contexto de la invención, el microorganismo genéticamente modificado se cultiva en las condiciones adecuadas que permitan la expresión del gen que tiene actividad acil-CoA reductasa y de esta manera, producir alcoholes grasos. Los medios de cultivo adecuados para el crecimiento apropiado de diferentes microorganismos se conocen bien en la técnica. Normalmente dichos medios de cultivo comprenden fuentes de carbono, como, por ejemplo, glucosa, xilosa, sacarosa, glicerina, y fuentes de nitrógeno apropiadas como, por ejemplo, extracto de levadura, peptona, sales de amonio, líquido macerado de maíz, urea o glutamato sódico.

Preferiblemente, dicho gen se introduce en un vector de expresión o construcción de ADN replicativa que permite la expresión del gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa según la presente invención y que incluye una unidad transcripcional que comprende el ensamblaje de (1) elemento(s) genético(s) que desempeña(n) un papel regulador en expresión génica, por ejemplo, promotores, operadores o potenciadores, operativamente unidos a (2) la secuencia del gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa según la invención y que se transcribe a ARN mensajero y se traduce a proteína y (3) secuencias adecuadas para iniciar y terminar la transcripción y la traducción. Los vectores que se pueden usar en el contexto de la presente invención normalmente incluyen un marcador genético, un origen de replicación en bacterias o levaduras, sitios múltiples de clonación y un marcador genético. El marcador genético es habitualmente un gen que confiere resistencia a un antibiótico, por ejemplo ampicilina o geneticina, o

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US5063154, el promotor TET, cuya expresión se regula en presencia de tetraciclinas, los promotores GAL1-10, GALL, GALS que se activan en presencia de galactosa, el promotor VP16-ER, inducible por estrógenos, y el promotor de fosfatasa (PH05) cuya expresión se activa en presencia de fosfato y el promotor de la proteína

5 de choque térmico HSP150, cuya expresión se activa a alta temperatura.

-Promotores represibles tales como, por ejemplo, el promotor del gen de la enolasa (ENO-1) de S. cerevisiae, cuya expresión se puede reprimir cuando el microorganismo se cultiva en una fuente de carbono no fermentable, así como promotores cuya expresión está sometida a represión de glucosa de modo que la

10 expresión se reprimirá cuando parte de la lactosa se haya hidrolizado y la concentración de glucosa en el medio empiece a aumentar, el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de R.toruloides, y el promotor de galactoquinasa (GAL1).

15 Preferiblemente, en esos casos en los que se sospecha que la proteína heteróloga es tóxica para la célula huésped, el promotor usado para regular su expresión es aconsejablemente un promotor inducible de modo que la expresión de la proteína de interés se pueda retrasar hasta que se hayan alcanzado suficientes niveles de biomasa. En una forma de realización preferida, el gen que codifica para una enzima acil-CoA reductasa con capacidad para

20 producir alcoholes grasos de acuerdo a la presente invención, se expresa bajo el control de un promotor constitutivo. Al construir plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también se ligan en el vector de expresión 3’ de la secuencia deseada que se va a expresar para proporcionar poliadenilación del ARNm y terminación. Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada

25 por condiciones de crecimiento son la región promotora para alcohol deshidrogenasa-2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, y la anteriormente mencionada gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Cualquier vector plasmídico que contenga un promotor, origen de replicación y terminación compatibles con levadura, es

30 adecuado.

Los vectores de levaduras adecuados para la presente invención se pueden basar en los siguientes tipos de plásmidos:

-Plásmidos autónomos multicopia: estos plásmidos contienen secuencias que permiten generar múltiples copias de dichos vectores. Estas secuencias pueden ser la denominada 2µ tal como la que aparece en plásmidos episomales (YEp o

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uno o más aminoácidos siempre y cuando se mantenga sustancialmente la función de dicha enzima. En concreto, las variantes funcionalmente equivalentes mantendrán la capacidad producir alcoholes grasos a partir de los acil-CoA grasos correspondientes. Métodos para determinar la producción de alcoholes grasos a partir de acil-CoA grasos son conocidos en el estado de la técnica. A modo ilustrativo, la determinación de la producción de ácidos grasos puede llevarse a cabo mediante cualquier método que permita detectar componentes orgánicos en una muestra como por ejemplo, métodos cromatográficos que incluyen cromatografía de gases y cromatografía de masas. El ejemplo 5 de la presente solicitud detalla la determinación de alcoholes grasos en una muestra mediante cromatografía de gases-masas. Si es necesario, puede llevarse a cabo una extracción previa de los alcoholes grasos del interior celular mediante cualquier método apropiado para ello. Técnicas que permiten la extracción de alcoholes grasos del interior celular son conocidas en el estado de la técnica y comprenden métodos de extracción mecánica como filtración o centrifugación y métodos de extracción sólido-líquido.

Variantes funcionalmente equivalentes de dicha acil-CoA reductasa incluyen aquellas que muestran al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%,al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de acil-CoA reductasa indicada anteriormente. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales mencionados en el contexto del primer método de la invención tales como, por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. Basic Local Alignment Search Tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10). El experto en la materia entenderá que las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en esta descripción pueden estar modificadas químicamente, por ejemplo, mediante modificaciones químicas que son fisiológicamente relevantes, tales como, fosforilaciones, acetilaciones, etc.

En una realización preferida de la invención, dicho gen que codifica una enzima con actividad acil-CoA reductasa consiste en la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1

En una realización particular, El microorganismo de la invención se refiere a un mutante de la cepa Rhodosporidium toruloides CECT 13085. El término “cepa”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una variante genética o subtipo de un organismo determinado.

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gen DAG1 en R. toruloides, preferiblemente en R. toruloides CECT 13085, pude llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en el estado de la técnica que permita detectar la actividad enzimática de DAG1.

El término “mutación” se refiere a sustituciones, inserciones o deleciones que se producen a nivel de la secuencia nucleotídica. Por “inserción”, se entiende la ganancia de uno o más nucleótidos. Dentro de la inserción se encuentra las duplicaciones que consisten en la repetición de un segmento de ADN del interior de una secuencia, pudiendo producirse tres (triplicación) o más veces. Por “deleción” tal y como se usa el presente documento, se entiende la pérdida de uno o más nucleótidos. Las deleciones pueden ser totales o parciales. Por “deleción total” de la secuencia de un gen, según se emplea en la presente invención, se refiere a la pérdida del 100% de los nucleótidos que constituyen la secuencia nucleotídica de dicho gen. Por “deleción parcial” de la secuencia de un gen, según se emplea en la presente invención se refiere a la pérdida de al menos 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 99% de los nucleótidos que componen la secuencia nucleotídica de dicho gen. Como el experto en la materia sabe, en la técnica existen métodos apropiados para realizar mutaciones en la secuencia de un gen como la mutagénesis de sitio dirigido por PCR o mutagénesis de sitio dirigido por PCR en un plásmido.

En otra realización particular, el gen LRO1P del microrganismo de la invención no es funcional. El término “LRO1P”, tal y como se utiliza en el presente documento se refiere a la fosofolípido acilglicerol aciltransferasa. La reacción catalizada por dicha enzima comprende transferir un residuo de acil-CoA de un fosfolípido a una molécula de diacilglicerol dando como resultado una molécula de triacilglicerol y un lisofosfolípido. La secuencia de la proteína LRO1P de R. toruloides está depositada en la base de datos Uniprot bajo el número de acceso RHTO_01945 (versión del 29 de mayo de 2013).

En una realización preferida, la expresión “el gen LROP1 no es funcional” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a que dicho gen codifica una proteína LROP1 cuya capacidad de realizar la síntesis de triglicéridos a partir de un fosfolípido y acil-CoA grasos, está disminuida con respecto a la capacidad de llevar a cabo dicha síntesis por una proteína codificada por dicho gen LROP1 funcional. De acuerdo a la presente invención, el microorganismo de la invención presenta un gen LROP1 no funcional si la capacidad de sintetizar triglicéridos por la proteína LROP1 codificada por dicho gen LROP1 no funcional está reducida al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% al

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menos un 90%, al menos un 95% o más con respecto a dicha síntesis realizada por un gen LROP1 funcional. El gen LROP1 de R. toruloides, preferiblemente de R. toruloides CECT 13085 puede ser no funcional consecuencia de una mutación en la secuencia de dicho gen.

En otra realización preferida, la expresión “gen LROP1 no es funcional” también se refiere a que dicho gen está ausente en el genoma del microorganismo de la invención, consecuencia de una deleción total de la secuencia de dicho gen. En una realización preferida de la invención, el microrganismo de la invención presenta el gen LROP1 delecionado en su totalidad. La determinación de la funcionalidad del gen LROP1 en R. toruloides, preferiblemente en R. toruloides CECT 13085, puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en el estado de la técnica que permita detectar la actividad enzimática de LROP1.

En otra realización particular, el gen DAG3 del microrganismo de la invención no es funcional. El término “DAG3””, “DGAT3”, o “delta-1-pirrolín carboxilato deshidrogenasa” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a la isoforma soluble de la enzima diacilglicerol acil transferasa que cataliza la etapa final de la síntesis de triglicéridos a partir de diacilglicerol y acil-CoA grasos y cuya localización es citosólica. La secuencia de la proteína DAG3 de R. toruloides está depositada en la base de datos Uniprot bajo el número de acceso RTHO_07378 (versión del 29 de mayo de 2013).

En una realización preferida la expresión “el gen DAG3 no es funcional” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a que dicho gen codifica una proteína DAG3 cuya capacidad de realizar la síntesis de triglicéridos a partir de un fosfolípido y acil-CoA grasos, está disminuida con respecto a la capacidad de llevar a cabo dicha síntesis por una proteína codificada por dicho gen DAG3 funcional. De acuerdo a la presente invención, el microorganismo de la invención presenta un gen DAG3 no funcional si la capacidad de sintetizar triglicéridos por la proteína DAG3 codificada por dicho gen DAG3 no funcional está reducida al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% al menos un 90%, al menos un 95% o más con respecto a dicha síntesis realizada por un gen DAG3 funcional. El gen DAG3 de R. toruloides, preferiblemente de R. toruloides CECT 13085 puede ser no funcional consecuencia de una mutación en la secuencia de dicho gen.

En otra realización preferida, la expresión “gen DAG3 no es funcional” también se refiere a que dicho gen está ausente en el genoma del microorganismo de la invención, consecuencia de una deleción total de la secuencia de dicho gen. En una realización

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