JP6723002B2 - 油脂の製造方法 - Google Patents
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Description
近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
これまでに、人為的処理により変異が加えられたモルティエラ・アルピナ(Mortierella alpina)を用いて、菌体内に蓄積した油脂を菌体外に分泌させる方法が提案されている(特許文献1参照)。また、産生された炭化水素を細胞外へ分泌することが可能なボツリオコッカス・ブラウニー(Botryococcus braunii)なども知られている。しかし、これらの微生物の生産物の分泌能はいずれも、突然変異や微生物自体の特性によるものがほとんどである。
また、任意の遺伝子の改変によって、細胞外に油脂を分泌させる方法も検討されている。例えば、酵母を宿主とし長鎖アシルCoAシンセターゼをコードする遺伝子を欠損させることで脂肪酸を分泌させる方法や、シアノバクテリアを宿主とし長鎖アシルACPシンセターゼをコードする遺伝子を欠損させることで、脂肪酸を分泌させる方法が知られている(特許文献2〜4参照)。
藻体内に蓄積した油脂を利用しようとする場合、細胞を集め、これらをミル等によって処理し菌の細胞膜を破壊し、蓄積した油脂を抽出することが必要である。しかし、微細藻類は細胞構造が強固であることが知られている(非特許文献2参照)。よって、微細藻類の細胞膜を破壊し、油脂と破壊した細胞との分離、ないし油脂の抽出等の工程は複雑であり、高コストである。
よって、光合成微生物であって細胞の破壊を必要とすることなく、容易且つ安価に油脂を得ることが望まれている。
さらに本発明は、容易且つ安価な油脂の製造に好適に用いることができ、生産した油脂を細胞外に分泌する形質転換体を提供することを課題とする。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
さらに本発明は、真正眼点藻網の藻類のβ酸化能を抑制又は阻害させた、形質転換体に関する。
また本発明の形質転換体は、生産した油脂を細胞外に分泌させることができるため、容易且つ安価な油脂の製造に好適に用いることができる。
また本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法(Science,1985,vol.227,p.1435-1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook,David W.Russell.,Cold Spring Harbor Laboratory Press]記載の方法が挙げられる。例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5%SDS、5×デンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
前述のように、真正眼点藻網の藻類、特に、微細藻類、の細胞壁は強固であることが知られている。よって、通常、真正眼点藻網の藻類を用いて油脂を製造する場合、産生された油脂を回収するには、煩雑な細胞破砕操作が必要となる。
これに対して、本発明によれば、後述の実施例でも示すように、産生された油脂が細胞外に分泌され、培養上清に遊離する。よって、培養物を遠心分離や溶媒抽出などの操作により油脂を得ることができ、細胞破砕という煩雑な操作を不要とすることができる。その結果、油脂回収に係るプロセスの簡便化やコスト削減につなげることができる。
さらに、藻類のβ酸化能を抑制又は阻害することで脂肪酸の分解が抑制されるとともに、産生された油脂が細胞外に分泌される。その結果、油脂の蓄積が細胞の容量に制限されず、油脂の生産量の向上も期待される。
以下本明細書において、β酸化能を抑制又は阻害した真正眼点藻網の藻類を「形質転換体」ともいい、β酸化能を抑制又は阻害させていない真正眼点藻網の藻類を「宿主」、「野生株」又は「親微生物」ともいう。
1段目の反応ではアシルCoAからエノイルCoAが生成される。この1段目の反応では、アシルCoAデヒドロゲナーゼ(acyl-CoA dehydrogenase、以下、「ACDH」ともいう)、アシルCoAオキシダーゼ(acyl-CoA oxidase、以下、「ACOX」ともいう)などが関与し、ACDHとACOXは反応過程において過酸化水素の発生の有無によって区別される。本明細書では、ACDHとACOXとをまとめて「ACDH/ACOX」とも表記する。
2段目の反応では、1段目の反応で生成したエノイルCoAから、3-ヒドロキシアシルCoAが生成される。この2段目の反応では、エノイルCoAヒドラターゼ(enoyl-CoA hydratase)などが関与する。
3段目の反応では、2段目の反応で生成した3-ヒドロキシアシルCoAから、3-ケトアシルCoAが生成される。この3段目の反応では、3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)などが関与する。
4段目の反応では、3段目の反応で生成した3-ケトアシルCoAから、炭素原子が2個分短くなったアシルCoAと、アセチルCoAが生成される。この4段目の反応では、3-ケトアシルCoAチオラーゼ(3-ketoacyl-CoA thiolase)などが関与する。
さらに、エノイルCoAから3-ヒドロキシアシルCoAを経て3-ケトアシルCoAが生成する反応を一度に触媒するMultifunctional enzymeや、エノイルCoAから、炭素原子が2個分短くなったアシルCoAと、アセチルCoAを生成する反応を一度に触媒するTrifunctional enzymeが存在することも知られている。
ACDHは、FADを補因子として、アシルCoAをエノイルCoAに変換する反応を触媒する酵素である。
ACOXは、FADを補因子として、アシルCoAをエノイルCoAに変換し、副生成物として過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。
エノイルCoAヒドラターゼは、エノイルCoA(trans-2,3-デヒドロアシルCoA)にH2Oを付加し、β-ヒドロキシアシルCoA(3-ヒドロキシアシルCoA)に変換する反応を触媒する酵素である。
3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼは、NAD+を補因子として、β-ヒドロキシアシルCoAを酸化し、β-ケトアシルCoA(3-ケトアシルCoA)に変換する反応を触媒する酵素である。
3-ケトアシルCoAチオラーゼは、補酵素Aとともにチオール開裂を起こし、β-ケトアシルCoAから炭素原子が2個分短くなったアシルCoAと、アセチルCoAを産生する反応を触媒する酵素である。
本明細書における「β酸化関連酵素」とは、油脂又はこれを構成する脂肪酸の一連のβ酸化反応のうち、前述の1段目の反応を担う酵素を好ましく指し、具体的にはACDH及びACOXを指す。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が80%以上のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
(C)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)前記タンパク質(C)のアミノ酸配列と同一性が80%以上のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
(E)配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(F)前記タンパク質(E)のアミノ酸配列と同一性が80%以上のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
(G)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(H)前記タンパク質(G)のアミノ酸配列と同一性が80%以上のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
(I)配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(J)前記タンパク質(I)のアミノ酸配列と同一性が80%以上のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
配列番号1〜5で表されるアミノ酸配列はいずれも、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のタンパク質のアミノ酸配列である。アミノ酸配列の解析からこれらのタンパク質は、ACDH又はACOXであると推測される。
タンパク質がアシルCoAに対してACDH活性又はACOX活性を有することは、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,1992,Vol.267,No.2,pp.1034-1041や、Biochem.J.,1987,Vol.248,pp.603-607などを参照して、確認することができる。例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したDNAを宿主細胞内へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内のtrans-2,3-デヒドロアシルCoA量の変化を定法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したDNAを宿主細胞内へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、アシルCoAと補因子FADを用いてtrans-2,3-デヒドロアシルCoAの生成反応を行うことにより確認できる。
なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所(NIES)から入手することができる。
なお、本明細書において、下記DNA(a)又は(b)からなる遺伝子を「ACDH/ACOX1遺伝子」又は「NoACDH/ACOX1遺伝子」といい、下記DNA(c)又は(d)からなる遺伝子を「ACDH/ACOX2遺伝子」又は「NoACDH/ACOX2遺伝子」といい、下記DNA(e)又は(f)からなる遺伝子を「ACDH/ACOX3遺伝子」又は「NoACDH/ACOX3遺伝子」といい、下記DNA(g)又は(h)からなる遺伝子を「ACDH/ACOX4遺伝子」又は「NoACDH/ACOX4遺伝子」といい、下記DNA(i)又は(j)からなる遺伝子を「ACDH/ACOX5遺伝子」又は「NoACDH/ACOX5遺伝子」といい、これらをまとめて「ACDH/ACOX遺伝子」又は「NoACDH/ACOX遺伝子」ともいう。
(a)配列番号76で表される塩基配列からなるDNA。
(b)前記DNA(a)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号77で表される塩基配列からなるDNA。
(d)前記DNA(c)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
(e)配列番号78で表される塩基配列からなるDNA。
(f)前記DNA(e)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
(g)配列番号79で表される塩基配列からなるDNA。
(h)前記DNA(g)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
(i)配列番号80で表される塩基配列からなるDNA。
(j)前記DNA(i)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
前記DNA(b)において、β酸化活性の点から、前記DNA(a)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(b)として、前記DNA(a)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上463個以下、好ましくは1個以上347個以下、より好ましくは1個以上231個以下、より好ましくは1個以上162個以下、より好ましくは1個以上115個以下、より好ましくは1個以上92個以下、より好ましくは1個以上69個以下、より好ましくは1個以上46個以下、さらに好ましくは1個以上23個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。さらに前記DNA(b)として、前記DNA(a)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。
前記DNA(d)において、β酸化活性の点から、前記DNA(c)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(d)として、前記DNA(c)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上428個以下、好ましくは1個以上321個以下、より好ましくは1個以上214個以下、より好ましくは1個以上149個以下、より好ましくは1個以上107個以下、より好ましくは1個以上85個以下、より好ましくは1個以上64個以下、より好ましくは1個以上42個以下、さらに好ましくは1個以上21個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。さらに前記DNA(d)として、前記DNA(c)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。
前記DNA(f)において、β酸化活性の点から、前記DNA(e)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(f)として、前記DNA(e)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上253個以下、好ましくは1個以上190個以下、より好ましくは1個以上126個以下、より好ましくは1個以上88個以下、より好ましくは1個以上63個以下、より好ましくは1個以上50個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上25個以下、さらに好ましくは1個以上12個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。さらに前記DNA(f)として、前記DNA(e)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。
前記DNA(h)において、β酸化活性の点から、前記DNA(g)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(h)として、前記DNA(g)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上259個以下、好ましくは1個以上194個以下、より好ましくは1個以上129個以下、より好ましくは1個以上90個以下、より好ましくは1個以上64個以下、より好ましくは1個以上51個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上25個以下、さらに好ましくは1個以上12個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。さらに前記DNA(h)として、前記DNA(g)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。
前記DNA(j)において、β酸化活性の点から、前記DNA(i)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(j)として、前記DNA(i)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上266個以下、好ましくは1個以上199個以下、より好ましくは1個以上133個以下、より好ましくは1個以上93個以下、より好ましくは1個以上66個以下、より好ましくは1個以上53個以下、より好ましくは1個以上39個以下、より好ましくは1個以上26個以下、さらに好ましくは1個以上13個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。さらに前記DNA(j)として、前記DNA(i)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAも好ましい。
前記藻類のβ酸化関連酵素遺伝子を欠失又は不活性化することで、β酸化経路が阻害される。その結果藻体のβ酸化能が抑制又は阻害され、油脂又はこれを構成する脂肪酸のβ酸化が抑制又は阻害される。
本発明において、欠失又は不活性化するβ酸化関連酵素遺伝子は1種であってもよいし、2種以上のβ酸化関連酵素遺伝子を欠失又は不活性化してもよい。
具体的には、標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片をPCR等の方法によって構築する。これを常法により宿主細胞内に取り込ませて、ゲノムとDNA断片との間で、ゲノムの標的遺伝子の上流側と下流側の領域で2回交差の相同組換えを起こさせる。その結果、ゲノム上の標的遺伝子を欠失あるいは他のDNA断片と置換させることができる。また、標的遺伝子の上流、下流領域を含み、塩基置換や塩基挿入等の変異を導入した標的遺伝子のDNA断片をPCR等の方法によって構築する。これを常法により宿主細胞内に取り込ませて、ゲノムとDNA断片との間で、ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の上流側と下流側の領域で2回交差の相同組換えを起こさせる。その結果、ゲノム上の標的遺伝子に変異を導入し、その機能を低下又は消失させることができる。また、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングし、得られた環状の組換えプラスミドを常法により宿主細胞内に取り込ませて、ゲノムと組換えプラスミドとの間で相同組換えを起こさせる。その結果、ゲノム上の標的遺伝子を分断して、その機能を低下又は消失させることができる。
このような相同組換えによるβ酸化関連酵素遺伝子の全部又は一部を他の任意のDNA断片で置換する方法は、例えばBesher et al.,Methods in molecular biology,1995,vol.47,p.291-302等の記載を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Oliver Kilian,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,vol.108(52)等の記載を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の遺伝子の全部又は一部を欠失又は他の任意のDNA断片で置換することができる。
また、Oliver Kilian,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,vol.108(52)の記載の方法を参考にして、前記DNA断片を含んでなる遺伝子発現カセットを用いて、親微生物に導入することもできる。
また、導入する任意のDNA断片として、前述の選択マーカーの上流側と下流側に任意のプロモーター領域やターミネーター領域を連結させたDNA断片も使用することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターやターミネーターの種類も、DNA断片を導入する親微生物の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター(例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等)、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン/クロロフィルa結合タンパク質遺伝子のプロモーター(VCP1プロモーター、VCP2プロモーター)が挙げられる。
β酸化関連酵素遺伝子の発現の抑制、又はβ酸化関連酵素遺伝子の上流に位置するプロモーター(以下、「β酸化関連酵素遺伝子プロモーター」ともいう)を欠失若しくは不活性化することで、β酸化関連酵素遺伝子の発現量が減少する(β酸化関連酵素遺伝子のダウンレギュレーション)。その結果β酸化経路が阻害され、藻体のβ酸化能が抑制又は阻害され、油脂又はこれを構成する脂肪酸のβ酸化が抑制又は阻害される。
本発明において、ダウンレギュレートするβ酸化関連酵素遺伝子は1種であってもよいし、2種以上のβ酸化関連酵素遺伝子をダウンレギュレートしてもよい。
このうち、β酸化関連酵素遺伝子プロモーター配列や転写・翻訳開始領域中に他の任意のDNA断片を挿入する方法、β酸化関連酵素遺伝子プロモーター配列や転写・翻訳開始領域の全部又は一部を他の任意のDNA断片で置換する方法、又はプロモーター競合が好ましく、β酸化関連酵素遺伝子プロモーター配列や転写・翻訳開始領域の全部又は一部を他の任意のDNA断片で置換する方法、又はプロモーター競合がより好ましく、プロモーター競合がさらに好ましい。
なお、本明細書において、下記DNA(a1)又は(b1)を「ACDH/ACOX1遺伝子プロモーター」又は「NoACDH/ACOX1遺伝子プロモーター」といい、下記DNA(c1)又は(d1)を「ACDH/ACOX2遺伝子プロモーター」又は「NoACDH/ACOX2遺伝子プロモーター」といい、下記DNA(e1)又は(f1)を「ACDH/ACOX3遺伝子プロモーター」又は「NoACDH/ACOX3遺伝子プロモーター」といい、下記DNA(g1)又は(h1)を「ACDH/ACOX4遺伝子プロモーター」又は「NoACDH/ACOX4遺伝子プロモーター」といい、下記DNA(i1)又は(j1)を「ACDH/ACOX5遺伝子プロモーター」又は「NoACDH/ACOX5遺伝子プロモーター」といい、これらをまとめて「ACDH/ACOX遺伝子プロモーター」又は「NoACDH/ACOX遺伝子プロモーター」ともいう。
(a1)配列番号81で表される塩基配列からなるDNA。
(b1)前記DNA(a1)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(A)又は(B)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
(c1)配列番号82で表される塩基配列からなるDNA。
(d1)前記DNA(c1)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(C)又は(D)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
(e1)配列番号83で表される塩基配列からなるDNA。
(f1)前記DNA(e1)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(E)又は(F)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
(g1)配列番号84で表される塩基配列からなるDNA。
(h1)前記DNA(g1)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(G)又は(H)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
(i1)配列番号85で表される塩基配列からなるDNA。
(j1)前記DNA(i1)の塩基配列と同一性が80%以上の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(I)又は(J)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
前記DNA(b1)において、前記DNA(a1)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(b1)として、前記DNA(a1)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上203個以下、好ましくは1個以上152個以下、より好ましくは1個以上101個以下、より好ましくは1個以上71個以下、より好ましくは1個以上50個以下、より好ましくは1個以上40個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上20個以下、さらに好ましくは1個以上10個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACDH/ACOX1遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。さらに前記DNA(b1)として、前記DNA(a1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(A)又は(B)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。
前記DNA(d1)において、前記DNA(c1)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(d1)として、前記DNA(c1)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上191個以下、好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上95個以下、より好ましくは1個以上67個以下、より好ましくは1個以上47個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上28個以下、より好ましくは1個以上19個以下、さらに好ましくは1個以上9個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACDH/ACOX2遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。さらに前記DNA(d1)として、前記DNA(c1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(C)又は(D)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。
前記DNA(f1)において、前記DNA(e1)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(f1)として、前記DNA(e1)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上198個以下、好ましくは1個以上148個以下、より好ましくは1個以上99個以下、より好ましくは1個以上69個以下、より好ましくは1個以上49個以下、より好ましくは1個以上39個以下、より好ましくは1個以上29個以下、より好ましくは1個以上19個以下、さらに好ましくは1個以上9個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACDH/ACOX3遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。さらに前記DNA(f1)として、前記DNA(e1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(E)又は(F)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。
前記DNA(h1)において、前記DNA(g1)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(h1)として、前記DNA(g1)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上202個以下、好ましくは1個以上152個以下、より好ましくは1個以上101個以下、より好ましくは1個以上70個以下、より好ましくは1個以上50個以下、より好ましくは1個以上40個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上20個以下、さらに好ましくは1個以上10個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACDH/ACOX4遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。さらに前記DNA(h1)として、前記DNA(g1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(G)又は(H)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。
前記DNA(j1)において、前記DNA(i1)の塩基配列との同一性は85%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、93%以上がより好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がより好ましく、97%以上がより好ましく、98%以上がより好ましく、99%以上がさらに好ましい。また前記DNA(j1)として、前記DNA(i1)の塩基配列において1又は複数個(例えば1個以上200個以下、好ましくは1個以上150個以下、より好ましくは1個以上100個以下、より好ましくは1個以上70個以下、より好ましくは1個以上50個以下、より好ましくは1個以上40個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上20個以下、さらに好ましくは1個以上10個以下)の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACDH/ACOX5遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。さらに前記DNA(j1)として、前記DNA(i1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(I)又は(J)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNAも好ましい。
例えば、pUC19(タカラバイオ社製)、P66(Chlamydomonas Center)、P-322(Chlamydomonas Center)、pPha-T1(Yangmin Gong,et al.,Journal of Basic Microbiology,2011,vol.51,p.666-672参照)、pJET1(コスモ・バイオ社製)が挙げられる。このうち、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。プロモーターのベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、Oliver Kilian,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,vol.108(52)の記載の方法を参考にして、プロモーター配列を含んでなるDNA断片(遺伝子発現カセット)を用いて、親微生物に導入することもできる。
目的DNA断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的DNA断片とともに親微生物中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。
β酸化関連酵素の酵素活性を阻害若しくは抑制する方法としては、薬剤を藻類の培養液中に添加することにより、β酸化関連酵素の酵素活性を停止若しくは抑制する一般的方法が挙げられる。その結果藻体のβ酸化能が抑制又は阻害され、油脂又はこれを構成する脂肪酸のβ酸化が抑制又は阻害される。
本発明において、酵素活性を阻害若しくは抑制するβ酸化関連酵素は1種であってもよいし、2種以上のβ酸化関連酵素の酵素活性を阻害若しくは抑制してもよい。
ACOXの酵素活性を阻害又は抑制する薬剤としては、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(5,5-ditiobis(2-nitro-benzoic acid)、インドール-3-酪酸(indole-3-butyric acid)、N-エチルマレイミドなどが挙げられる(P.Coudron,et al.,Arch.Biochem.Biophys.,1983,vol.226(1),p.324-336;R.Adham,et al.,The Plant Journal,2005,vol.41,p.859-874;M.Bakke,et al.,Biochim.Biophys.Acta.,2007,vol.1774(1),p.65-71参照)。
エノイルCoAヒドラターゼの酵素活性を阻害又は抑制する薬剤としては、ヨードアセトアミドなどが挙げられる(J.Fong,et al.,J.Biol.Chem.,1977,vol.252(2),p.542-547参照)。
3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼの酵素活性を阻害又は抑制する薬剤としては、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)、N-エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸などが挙げられる(R.Bradshaw,et al.,Methods Enzymol.,1975,vol.35),p.122-128参照)。
3-ケトアシルCoAチオラーゼの酵素活性を阻害又は抑制する薬剤としては、N-エチルマレイミド、ヨードアセトアミドなどが挙げられる(G.Haywood,et al.,FEMS Microbiol.Lett.,1988,vol.52),p.91-96;H.Schulz,et al.,Methods Enzymol.,1981,vol.71,p.389-403参照)。
薬剤の添加方法としては、薬剤を培養液に添加し、培養中に藻類の菌体内に取り込ませる。これにより、β酸化関連酵素の酵素活性を阻害又は抑制し、藻類のβ酸化経路を阻害することができる。薬剤の添加量については、前述の文献の記載を参照し、適宜設定することができる。
なお、親微生物や形質転換体の分泌能については、油滴の有無、油滴の発生個数、培養液の層分離の発生の有無など、常法により判断することができる。
培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り1%(vol/vol)以上が好ましい。また、その上限値は50%(vol/vol)以下が好ましく、10%(vol/vol)以下がより好ましい。接種する藻類の量の数値範囲は、1〜50%(vol/vol)が好ましく、1〜10%(vol/vol)がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、5〜40℃の範囲である。藻類の生育促進、油脂の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、10℃以上が好ましく、15℃以上がより好ましい。またその上限値は35℃以下が好ましく、30℃以下がより好ましい。培養温度の数値範囲は、好ましくは10〜35℃であり、より好ましくは15〜30℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、油脂の生産性向上の観点から、100ルクス以上が好ましく、300ルクス以上がより好ましく、1000ルクス以上がさらに好ましい。またその上限値は、50000ルクス以下が好ましく、10000ルクス以下がより好ましく、6000ルクス以下がさらに好ましい。光照射時の照度の数値範囲は、好ましくは100〜50000ルクスの範囲、より好ましくは300〜10000ルクスの範囲、さらに好ましくは1000〜6000ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、24時間のうち明期は8時間以上が好ましく、10時間以上がより好ましい。またその上限値は、24時間以下が好ましく、18時間以下がより好ましい。明期の数値範囲は、好ましくは8〜24時間、より好ましくは10〜18時間、さらに好ましくは12時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、油脂の生産性向上の観点から0.03%(大気条件と同程度)以上が好ましく、0.05%以上がより好ましく、0.1%以上がさらに好ましく、0.3%以上がよりさらに好ましい。またその上限値は、10%以下が好ましく、5%以下がより好ましく、3%以下がさらに好ましく、1%以下がよりさらに好ましい。二酸化炭素の濃度の数値範囲は、0.03〜10%が好ましく、0.05〜5%がより好ましく、0.1〜3%がさらに好ましく、0.3〜1%がよりさらに好ましい。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、油脂の生産性向上の観点から0.01質量%以上が好ましく、0.05質量%以上がより好ましく、0.1質量%以上がさらに好ましい。またその上限値は、5質量%以下が好ましく、2質量%以下がより好ましく、1質量%以下がさらに好ましい。炭酸水素ナトリウムの濃度の数値範囲は、0.01〜5質量%が好ましく、0.05〜2質量%がより好ましく、0.1〜1質量%がさらに好ましい。
培養時間は特に限定されず、油脂を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間(例えば150日程度)行なってもよい。3日以上が好ましく、7日以上がより好ましい。またその上限値は、90日以下が好ましく、30日以下がより好ましい。培養期間の数値範囲は、好ましくは3〜90日間、より好ましくは3〜30日間、さらに好ましくは7〜30日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
浮遊する油滴や、油層を回収するための手段としては、常法より適宜選択することができる。例えば、浮遊した油滴と細胞とを分離する方法(例えば、遠心分離など)、溶媒抽出法(例えば、ヘキサン抽出)等が挙げられる。
<2>真正眼点藻網の藻類の油脂の生産性を向上させる方法であって、前記藻類のβ酸化能を抑制又は阻害する、油脂の生産性を向上させる方法。
<4>前記藻類を液体培地で培養し、培地に浮遊する油滴、又は油層を回収して油脂を得る、前記<1>〜<3>のいずれか1項に記載の方法。
<5>培地に浮遊する油滴と細胞を含む培養液とを分離する方法並びに溶媒抽出からなる群より選ばれる少なくとも1つの手段により、培地に浮遊する油滴、又は油層を回収する、前記<4>項記載の方法。
<6>β酸化関連酵素をコードする遺伝子、好ましくはACDH/ACOX遺伝子、を欠失若しくは不活性化、β酸化関連酵素をコードする遺伝子、好ましくはACDH/ACOX遺伝子、をダウンレギュレート、又はβ酸化関連酵素、好ましくはACDH/ACOX、の酵素活性を阻害若しくは抑制することにより、前記藻類のβ酸化経路を阻害し、油脂又はこれを構成する脂肪酸のβ酸化を抑制又は阻害する、前記<1>〜<5>のいずれか1項に記載の方法。
<7>前記藻類のβ酸化関連酵素をコードする遺伝子の全部又は一部が欠失している、前記<6>項に記載の方法。
<8>プロモーター競合によりβ酸化関連酵素をコードする遺伝子の転写量を低下させ、β酸化関連酵素をコードする遺伝子をダウンレギュレートさせた、前記<6>項に記載の方法。
<9>前記β酸化関連酵素が、ACDH、ACOX、エノイルCoAヒドラターゼ、3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ、及び3-ケトアシルCoAチオラーゼからなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<6>〜<8>のいずれか1項に記載の方法。
<10>前記β酸化関連酵素が、ACDH及びACOXからなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<6>〜<9>のいずれか1項に記載の方法。
<11>前記β酸化関連酵素が、下記タンパク質(A)〜(J)からなる群より選ばれる、前記<6>〜<10>のいずれか1項に記載の方法。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
(C)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)前記タンパク質(C)のアミノ酸配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
(E)配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(F)前記タンパク質(E)のアミノ酸配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
(G)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(H)前記タンパク質(G)のアミノ酸配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
(I)配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(J)前記タンパク質(I)のアミノ酸配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、のアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質。
<12>前記タンパク質(B)が、前記タンパク質(A)のアミノ酸配列に、1又は複数個、好ましくは1個以上154個以下、より好ましくは1個以上115個以下、より好ましくは1個以上77個以下、より好ましくは1個以上53個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上23個以下、より好ましくは1個以上15個以下、さらに好ましくは1個以上7個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記<11>項に記載の方法。
<13>前記タンパク質(D)が、前記タンパク質(C)のアミノ酸配列に、1又は複数個、好ましくは1個以上142個以下、より好ましくは1個以上106個以下、より好ましくは1個以上71個以下、より好ましくは1個以上49個以下、より好ましくは1個以上35個以下、より好ましくは1個以上28個以下、より好ましくは1個以上21個以下、より好ましくは1個以上14個以下、さらに好ましくは1個以上7個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記<11>項に記載の方法。
<14>前記タンパク質(F)が、前記タンパク質(E)のアミノ酸配列に、1又は複数個、好ましくは1個以上84個以下、より好ましくは1個以上63個以下、より好ましくは1個以上42個以下、より好ましくは1個以上29個以下、より好ましくは1個以上21個以下、より好ましくは1個以上16個以下、より好ましくは1個以上12個以下、より好ましくは1個以上8個以下、さらに好ましくは1個以上4個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記<11>項に記載の方法。
<15>前記タンパク質(H)が、前記タンパク質(G)のアミノ酸配列に、1又は複数個、好ましくは1個以上86個以下、より好ましくは1個以上64個以下、より好ましくは1個以上43個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上21個以下、より好ましくは1個以上17個以下、より好ましくは1個以上12個以下、より好ましくは1個以上8個以下、さらに好ましくは1個以上4個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記<11>項に記載の方法。
<16>前記タンパク質(J)が、前記タンパク質(I)のアミノ酸配列に、1又は複数個、好ましくは1個以上88個以下、より好ましくは1個以上66個以下、より好ましくは1個以上44個以下、より好ましくは1個以上31個以下、より好ましくは1個以上22個以下、より好ましくは1個以上17個以下、より好ましくは1個以上13個以下、より好ましくは1個以上8個以下、さらに好ましくは1個以上4個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記<11>項に記載の方法。
<17>前記の、β酸化関連酵素をコードする遺伝子が、下記DNA(a)〜(j)のいずれか1つからなる遺伝子である、前記<6>〜<10>のいずれか1項に記載の方法。
(a)配列番号76で表される塩基配列からなるDNA。
(b)前記DNA(a)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号77で表される塩基配列からなるDNA。
(d)前記DNA(c)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
(e)配列番号78で表される塩基配列からなるDNA。
(f)前記DNA(e)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
(g)配列番号79で表される塩基配列からなるDNA。
(h)前記DNA(g)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
(i)配列番号80で表される塩基配列からなるDNA。
(j)前記DNA(i)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ脂肪酸のβ酸化活性(具体的には、アシルCoAに対するACDH活性又はACOX活性)を有するタンパク質をコードするDNA。
<18>前記DNA(b)が、前記DNA(a)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上463個以下、より好ましくは1個以上347個以下、より好ましくは1個以上231個以下、より好ましくは1個以上162個以下、より好ましくは1個以上115個以下、より好ましくは1個以上92個以下、より好ましくは1個以上69個以下、より好ましくは1個以上46個以下、さらに好ましくは1個以上23個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(A)又は(B)をコードするDNA、又は前記DNA(a)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(A)又は(B)をコードするDNA、である、前記<17>項に記載の方法。
<19>前記DNA(d)が、前記DNA(c)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上428個以下、より好ましくは1個以上321個以下、より好ましくは1個以上214個以下、より好ましくは1個以上149個以下、より好ましくは1個以上107個以下、より好ましくは1個以上85個以下、より好ましくは1個以上64個以下、より好ましくは1個以上42個以下、さらに好ましくは1個以上21個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(C)又は(D)をコードするDNA、又は前記DNA(c)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(C)又は(D)をコードするDNA、である、前記<17>項に記載の方法。
<20>前記DNA(f)が、前記DNA(e)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上253個以下、より好ましくは1個以上190個以下、より好ましくは1個以上126個以下、より好ましくは1個以上88個以下、より好ましくは1個以上63個以下、より好ましくは1個以上50個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上25個以下、さらに好ましくは1個以上12個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(E)又は(F)をコードするDNA、又は前記DNA(e)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(E)又は(F)をコードするDNA、である、前記<17>項に記載の方法。
<21>前記DNA(h)が、前記DNA(g)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上259個以下、より好ましくは1個以上194個以下、より好ましくは1個以上129個以下、より好ましくは1個以上90個以下、より好ましくは1個以上64個以下、より好ましくは1個以上51個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上25個以下、さらに好ましくは1個以上12個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(G)又は(H)をコードするDNA、又は前記DNA(g)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(G)又は(H)をコードするDNA、である、前記<17>項に記載の方法。
<22>前記DNA(j)が、前記DNA(i)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上266個以下、より好ましくは1個以上199個以下、より好ましくは1個以上133個以下、より好ましくは1個以上93個以下、より好ましくは1個以上66個以下、より好ましくは1個以上53個以下、より好ましくは1個以上39個以下、より好ましくは1個以上26個以下、さらに好ましくは1個以上13個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(I)又は(J)をコードするDNA、又は前記DNA(i)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ酸化活性を有する前記タンパク質(I)又は(J)をコードするDNA、である、前記<17>項に記載の方法。
<23>前記の、β酸化関連酵素をコードする遺伝子のプロモーターが、下記DNA(a1)〜(j1)のいずれか1つである、前記<8>〜<22>のいずれか1項に記載の方法。
(a1)配列番号81で表される塩基配列からなるDNA。
(b1)前記DNA(a1)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(A)又は(B)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
(c1)配列番号82で表される塩基配列からなるDNA。
(d1)前記DNA(c1)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(C)又は(D)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
(e1)配列番号83で表される塩基配列からなるDNA。
(f1)前記DNA(e1)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(E)又は(F)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
(g1)配列番号84で表される塩基配列からなるDNA。
(h1)前記DNA(g1)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(G)又は(H)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
(i1)配列番号85で表される塩基配列からなるDNA。
(j1)前記DNA(i1)の塩基配列と同一性が80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、の塩基配列からなり、かつ前記タンパク質(I)又は(J)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA。
<24>前記DNA(b1)が、前記DNA(a1)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上203個以下、より好ましくは1個以上152個以下、より好ましくは1個以上101個以下、より好ましくは1個以上71個以下、より好ましくは1個以上50個以下、より好ましくは1個以上40個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上20個以下、さらに好ましくは1個以上10個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつ前記DNA(a)又は(b)からなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、又は前記DNA(a1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(A)又は(B)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、である、前記<23>項に記載の方法。
<25>前記DNA(d1)が、前記DNA(c1)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上191個以下、より好ましくは1個以上143個以下、より好ましくは1個以上95個以下、より好ましくは1個以上67個以下、より好ましくは1個以上47個以下、より好ましくは1個以上38個以下、より好ましくは1個以上28個以下、より好ましくは1個以上19個以下、さらに好ましくは1個以上9個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつ前記DNA(c)又は(d)からなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、又は前記DNA(c1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(C)又は(D)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、である、前記<23>項に記載の方法。
<26>前記DNA(f1)が、前記DNA(e1)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上198個以下、より好ましくは1個以上148個以下、より好ましくは1個以上99個以下、より好ましくは1個以上69個以下、より好ましくは1個以上49個以下、より好ましくは1個以上39個以下、より好ましくは1個以上29個以下、より好ましくは1個以上19個以下、さらに好ましくは1個以上9個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつ前記DNA(e)又は(f)からなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、又は前記DNA(e1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(E)又は(F)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、である、前記<23>項に記載の方法。
<27>前記DNA(h1)が、前記DNA(g1)の塩基配列に、1若しくは複数個、好ましくは1個以上202個以下、より好ましくは1個以上152個以下、より好ましくは1個以上101個以下、より好ましくは1個以上70個以下、より好ましくは1個以上50個以下、より好ましくは1個以上40個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上20個以下、さらに好ましくは1個以上10個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつ前記DNA(g)又は(h)からなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、又は前記DNA(g1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(G)又は(H)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、である、前記<23>項に記載の方法。
<28>前記DNA(j1)が、前記DNA(i1)の塩基配列に、1若しくは複数個、好好ましくは1個以上200個以下、より好ましくは1個以上150個以下、より好ましくは1個以上100個以下、より好ましくは1個以上70個以下、より好ましくは1個以上50個以下、より好ましくは1個以上40個以下、より好ましくは1個以上30個以下、より好ましくは1個以上20個以下、さらに好ましくは1個以上10個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつ前記DNA(i)又は(j)からなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、又は前記DNA(i1)と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記タンパク質(I)又は(J)をコードするDNAからなる遺伝子の上流に位置し、その遺伝子の発現を調整するプロモーターとして機能するDNA、である、前記<23>項に記載の方法。
<29>前記真正眼点藻網の藻類が、ユースチグマトス目の藻類、好ましくはナンノクロロプシス属の藻類、である、前記<1>〜<28>のいずれか1項に記載の方法。
<30>前記真正眼点藻網の藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・オセアニカ、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記<1>〜<29>のいずれか1項に記載の方法。
<31>前記油脂が中性脂質を含んでなる、前記<1>〜<30>のいずれか1項に記載の方法。
<32>前記中性脂質が、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、及びトリアシルグリセロールからなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<31>項に記載の方法。
<33>前記中性脂質がトリアシルグリセロールである、前記<31>又は<32>項に記載の方法。
<34>前記液体培地がf/2培地、ESM培地又はダイゴIMK培地、好ましくはf/2培地である、前記<4>〜<33>のいずれか1項に記載の方法。
<35>前記液体培地で前記藻類を振とう培養し、油脂を製造させる、前記<4>〜<34>のいずれか1項に記載の方法。
<38>β酸化関連酵素をコードする遺伝子、好ましくはACDH/ACOX遺伝子、が欠失若しくは不活性化、β酸化関連酵素をコードする遺伝子、好ましくはACDH/ACOX遺伝子、がダウンレギュレート、又はβ酸化関連酵素、好ましくはACDH/ACOX、の酵素活性が阻害若しくは抑制されており、前記藻類のβ酸化経路が阻害されている、前記<36>又は<37>項に記載の形質転換体。
<39>前記藻類のβ酸化関連酵素をコードする遺伝子の全部又は一部が欠失している、前記<38>項に記載の形質転換体。
<40>プロモーター競合によりβ酸化関連酵素をコードする遺伝子の転写量を低下させ、β酸化関連酵素をコードする遺伝子がダウンレギュレートされている、前記<38>項に記載の形質転換体。
<41>前記β酸化関連酵素が、ACDH、ACOX、エノイルCoAヒドラターゼ、3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ、及び3-ケトアシルCoAチオラーゼからなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<38>〜<40>のいずれか1項に記載の形質転換体。
<42>前記β酸化関連酵素が、ACDH及びACOXからなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<38>〜<41>のいずれか1項に記載の形質転換体。
<43>前記β酸化関連酵素が、前記タンパク質(A)〜(J)からなる群より選ばれる、前記<38>〜<42>のいずれか1項に記載の形質転換体。
<44>前記タンパク質(B)、(D)、(F)、(H)及び(J)がそれぞれ、前記<12>〜<16>のいずれか1項で規定するタンパク質である、前記<43>項に記載の形質転換体。
<45>前記の、β酸化関連酵素をコードする遺伝子が、前記DNA(a)〜(j)のいずれか1つからなる遺伝子である、前記<38>〜<44>のいずれか1項に記載の形質転換体。
<46>前記DNA(b)、(d)、(f)、(h)及び(j)がそれぞれ、前記<18>〜<22>のいずれか1項で規定するDNAである、前記<45>項に記載の形質転換体。
<47>前記の、β酸化関連酵素をコードする遺伝子のプロモーターが、前記DNA(a1)〜(j1)のいずれか1つである、前記<40>〜<46>のいずれか1項に記載の形質転換体。
<48>前記DNA(b1)、(d1)、(f1)、(h1)及び(j1)がそれぞれ、前記<24>〜<28>のいずれか1項で規定するDNAである、前記<47>項に記載の形質転換体。
<49>前記真正眼点藻網の藻類が、ユースチグマトス目の藻類、好ましくはナンノクロロプシス属の藻類、である、前記<36>〜<48>のいずれか1項に記載の形質転換体。
<50>前記藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・オセアニカ、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記<36>〜<49>のいずれか1項に記載の形質転換体。
<53>前記藻類のβ酸化関連酵素をコードする遺伝子の全部又は一部を欠失させる、前記<52>項に記載の形質転換体の作製方法。
<54>プロモーター競合によりβ酸化関連酵素をコードする遺伝子の転写量を低下させ、β酸化関連酵素をコードする遺伝子をダウンレギュレートさせる、前記<52>項に記載の形質転換体の作製方法。
<55>前記β酸化関連酵素が、ACDH、ACOX、エノイルCoAヒドラターゼ、3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ、及び3-ケトアシルCoAチオラーゼからなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<52>〜<54>のいずれか1項に記載の形質転換体の作製方法。
<56>前記β酸化関連酵素が、ACDH及びACOXからなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<52>〜<55>のいずれか1項に記載の形質転換体の作製方法。
<57>前記β酸化関連酵素が、前記タンパク質(A)〜(J)からなる群より選ばれる、前記<52>〜<56>のいずれか1項に記載の形質転換体の作製方法。
<58>前記タンパク質(B)、(D)、(F)、(H)及び(J)がそれぞれ、前記<12>〜<16>のいずれか1項で規定するタンパク質である、前記<57>項に記載の形質転換体の作製方法。
<59>前記の、β酸化関連酵素をコードする遺伝子が、前記DNA(a)〜(j)のいずれか1つからなる遺伝子である、前記<52>〜<58>のいずれか1項に記載の形質転換体の作製方法。
<60>前記DNA(b)、(d)、(f)、(h)及び(j)がそれぞれ、前記<18>〜<22>のいずれか1項で規定するDNAである、前記<59>項に記載の形質転換体の作製方法。
<61>前記の、β酸化関連酵素をコードする遺伝子のプロモーターが、前記DNA(a1)〜(j1)のいずれか1つである、前記<54>〜<60>のいずれか1項に記載の形質転換体の作製方法。
<62>前記DNA(b1)、(d1)、(f1)、(h1)及び(j1)がそれぞれ、前記<24>〜<28>のいずれか1項で規定するDNAである、前記<61>項に記載の形質転換体の作製方法。
<63>前記真正眼点藻網の藻類が、ユースチグマトス目の藻類、好ましくはナンノクロロプシス属の藻類、である、前記<51>〜<62>のいずれか1項に記載の形質転換体の作製方法。
<64>前記藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・オセアニカ、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記<51>〜<63>のいずれか1項に記載の形質転換体の作製方法。
<66>前記油脂が中性脂質を含んでなる、前記<65>のいずれか1項に記載の使用。
<67>前記中性脂質が、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、及びトリアシルグリセロールからなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<66>項に記載の使用。
<68>前記中性脂質がトリアシルグリセロールである、前記<66>又は<67>項に記載の使用。
(1)ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株のゲノム取得
国立環境研究所(NIES)からナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株を購入し、使用した。ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株をf/2液体培地(NaNO3 75mg、NaH2PO4・2H2O 6mg、ビタミンB12 0.5μg、ビオチン 0.5μg、チアミン 100μg、Na2SiO3・9H2O 10mg、Na2EDTA・2H2O 4.4mg、FeCl3・6H2O 3.16mg、FeCl3・6H2O 12μg、ZnSO4・7H2O 21μg、MnCl2・4H2O 180μg、CuSO4・5H2O 7μg、Na2MoO4・2H2O 7μg/人工海水1L)で十分培養し、f/2培地50mLに10%植菌し、25℃、二酸化炭素0.3%で人工気象機にて6日間培養した。培養後に回収したサンプルをマルチビーズショッカーにて破砕し、フェノールクロロホルム法によりゲノムを抽出した。
GenBankに登録されているナンノクロロプシス・エスピーW2J3B株のVCP1(ビオラキサンチン/クロロフィルa結合タンパク質)遺伝子のcomplete cds 配列(Accession number:JF957601.1)より、VCP1プロモーター配列(配列番号6)、VCP1ターミネーター配列(配列番号7)及びゼオシン耐性遺伝子(配列番号8)を人工合成した。合成したDNA断片を鋳型として、表1に示すプライマー番号9及びプライマー番号10のプライマー対、プライマー番号11及びプライマー番号12のプライマー対、並びにプライマー番号13及びプライマー番号14のプライマー対を用いてPCRを行い、VCP1プロモーター配列、VCP1ターミネーター配列、ゼオシン耐性遺伝子断片をそれぞれ取得した。
また、プラスミドベクターpUC19(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示すプライマー番号15及びプライマー番号16のプライマー対を用いたPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
なお、本プラスミドは、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列(以下、「ゼオシン耐性遺伝子発現カセット」ともいう)と、pUC19ベクター配列からなる。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表1に示すプライマー番号17及びプライマー番号18のプライマー対、並びにプライマー番号19及びプライマー番号20のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ACDH/ACOX2遺伝子の上流側DNA断片とACDH/ACOX2遺伝子の下流側DNA断片をそれぞれ増幅した。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表1に示すプライマー番号21及びプライマー番号22のプライマー対、並びにプライマー番号23及びプライマー番号24のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ACDH/ACOX3遺伝子の上流側DNA断片とACDH/ACOX3遺伝子の下流側DNA断片をそれぞれ増幅した。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表1に示すプライマー番号25及びプライマー番号26のプライマー対、並びにプライマー番号27及びプライマー番号28のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ACDH/ACOX4遺伝子の上流側DNA断片とACDH/ACOX4遺伝子の下流側DNA断片をそれぞれ増幅した。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表1に示すプライマー番号29及びプライマー番号30のプライマー対、並びにプライマー番号31及びプライマー番号32のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ACDH/ACOX5遺伝子の上流側DNA断片とACDH/ACOX5遺伝子の下流側DNA断片をそれぞれ増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC19(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示すプライマー番号15及びプライマー番号16のプライマー対を用いたPCRを行い、プラスミドベクターpUC19断片を増幅した。
なお、本コンストラクトは、各ACDH/ACOX遺伝子の上流側DNA配列、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子断片、VCP1ターミネーター配列、及び各ACDH/ACOX遺伝子の下流側DNA配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
前記ACDH/ACOX遺伝子相同組換え用プラスミドを鋳型として、表1に示すプライマー番号35及びプライマー番号36のプライマー対、プライマー番号37及びプライマー番号38のプライマー対、プライマー番号39及びプライマー番号40のプライマー対、並びにプライマー番号41及びプライマー番号42のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ACDH/ACOX遺伝子の上流側DNA配列、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、及びACDH/ACOX遺伝子の下流側DNA配列からなる、ACDH/ACOX遺伝子欠失用断片(ACDH/ACOX2遺伝子欠失用断片、ACDH/ACOX3遺伝子欠失用断片、ACDH/ACOX4遺伝子欠失用断片、及びACDH/ACOX5遺伝子欠失用断片)を増幅した。
増幅したACDH/ACOX遺伝子欠失用断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
なおこれらのACDH/ACOX遺伝子欠失用断片は、ナンノクロロプシス・オキュラータにおいて各ACDH/ACOXの相同組換えにより導入された場合、各ACDH/ACOX遺伝子の一部又は全部が欠損し、ゼオシン耐性遺伝子発現カセットが導入される設計となっている。
f/2液体培地(NaNO3 75mg、NaH2PO4・2H2O 6mg、ビタミンB12 0.5μg、ビオチン 0.5μg、チアミン 100μg、Na2SiO3・9H2O 10mg、Na2EDTA・2H2O 4.4mg、FeCl3・6H2O 3.16mg、FeCl3・6H2O 12μg、ZnSO4・7H2O 21μg、MnCl2・4H2O 180μg、CuSO4・5H2O 7μg、Na2MoO4・2H2O 7μg/人工海水1L)にて24時間回復培養を行った。その後に、2μg/mLのゼオシン含有f/2寒天培地(f/2液体培地に0.8%寒天を添加)に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて2〜3週間培養した。得られたコロニーをそれぞれ2μg/mLのゼオシン含有f/2培地を200μLずつ分注した96ウェルプレートに植継ぎ、4日〜1週間、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて培養した。
ACDH/ACOX2遺伝子欠失株(以下、「ΔACDH/ACOX2」ともいう)の選抜は、表1に示すプライマー番号43及びプライマー番号44のプライマー対を用いたPCRにより行った。ACDH/ACOX3遺伝子欠失株(以下、「ΔACDH/ACOX3」ともいう)の選抜は、表1に示すプライマー番号45及びプライマー番号46のプライマー対を用いたPCRにより行った。ACDH/ACOX4遺伝子欠失株(以下、「ΔACDH/ACOX4」ともいう)の選抜は、表1に示すプライマー番号47及びプライマー番号48のプライマー対を用いたPCRにより行った。ACDH/ACOX5遺伝子欠失株(以下、「ΔACDH/ACOX5」ともいう)の選抜は、表1に示すプライマー番号49及びプライマー番号50のプライマー対を用いたPCRにより行った。
選抜した形質転換体を5×107cells/mLとなるようf/2液体培地25mLを注入した50mLフラスコに植継ぎ、25℃、1%又は0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて振とう培養した。
その結果、ΔACDH/ACOX2、ΔACDH/ACOX3、ΔACDH/ACOX4及びΔACDH/ACOX5のいずれにおおいても、培養開始3週間目頃から培養上清に油滴が浮遊し始め、1か月後には赤い油滴の発生が容易に確認できた。
ここで、ΔACDH/ACOX5の培養1か月後に培養液上清に浮遊する油滴の様子を示す写真を図1に示す。
展開後プレートを乾燥させ、メタノールに溶解させた0.1%プリムリン(和光純薬工業社製)を噴霧して乾燥させた後、ハンデイ型UVランプUVL-21(相互理化学硝子製作所社製)でTAG検出した。
その結果、回収した各油滴はいずれも、トリアシルグリセロールを主成分とするものであった。ここで、ΔACDH/ACOX5の培養液上清から回収した油滴のTLC分析結果を図2に示す。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145野生株を5×107cells/mLとなるようf/2液体培地25mLを注入した50mLフラスコに植継ぎ、25℃、1%又は0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて6週間振とう培養した。
その結果、培養を6週間継続しても、実施例1で見られたような油滴の浮遊は確認されなかった。
ACDH/ACOX遺伝子に代えて硝酸レダクターゼ遺伝子を欠損させた、硝酸レダクターゼ遺伝子欠失株を実施例1と同様に作製し、形質転換体による油脂の生産を行った。
ここで「硝酸レダクターゼ」とは、硝酸を還元して亜硝酸に変換する反応を触媒する酵素であり、窒素同化に関与する酵素である。硝酸レダクターゼは、本明細書で規定する「β酸化関連酵素」には含まれない。
硝酸レダクターゼ遺伝子欠失株は、Oliver Kilian,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,vol.108(52)の記載を参照し、下記に示す方法により作製した。
ここで、硝酸レダクターゼのアミノ酸配列の1例を配列番号55に、硝酸レダクターゼをコードする遺伝子(以下、「硝酸レダクターゼ遺伝子」ともいう)の塩基配列の1例を配列番号86に、それぞれ示す。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表2に示すプライマー番号51及びプライマー番号52のプライマー対、並びにプライマー番号53及びプライマー番号54のプライマー対を用いてそれぞれPCRを行い、硝酸レダクターゼ遺伝子の上流側DNA断片と硝酸レダクターゼ遺伝子の下流側DNA断片をそれぞれ増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC19(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示すプライマー番号15及びプライマー番号16のプライマー対を用いたPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
なお、本プラスミドは、硝酸レダクターゼ遺伝子の上流側DNA配列、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子断片、VCP1ターミネーター配列、及び硝酸レダクターゼ遺伝子の下流側DNA配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
前記硝酸レダクターゼ遺伝子相同組換え用プラスミドを鋳型として、表2に示すプライマー番号56及びプライマー番号57のプライマー対を用いてPCRを行い、硝酸レダクターゼ遺伝子の上流側DNA配列、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、及び硝酸レダクターゼ遺伝子の下流側DNA配列からなる、硝酸レダクターゼ遺伝子欠失用断片を増幅した。
増幅した硝酸レダクターゼ遺伝子欠失用断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
尿素添加f/2液体培地(尿素27mg、NaH2PO4・2H2O 6mg、ビタミンB12 0.5μg、ビオチン 0.5μg、チアミン 100μg、Na2SiO3・9H2O 10mg、Na2EDTA・2H2O 4.4mg、FeCl3・6H2O 3.16mg、FeCl3・6H2O 12μg、ZnSO4・7H2O 21μg、MnCl2・4H2O 180μg、CuSO4・5H2O 7μg、Na2MoO4・2H2O 7μg/人工海水1L)にて24時間回復培養を行った。その後に、2μg/mLのゼオシン含有f/2寒天培地(尿素添加f/2液体培地に0.8%寒天を添加)に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて2〜3週間培養した得られたコロニーをそれぞれ2μg/mLのゼオシン含有f/2培地(尿素添加f/2培地)を200μLずつ分注した96ウェルプレートに植継ぎ、4日〜1週間、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて培養した。
硝酸レダクターゼ遺伝子欠失株の選抜は、表2に示すプライマー番号58及びプライマー番号59のプライマー対を用いてPCRを行い、相同組換えを行った部位の塩基配列の長さを確認することで行った。
選抜した形質転換体を5×107cells/mLとなるよう尿素添加f/2液体培地25mLを注入した50mLフラスコに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて6週間振とう培養した。
(1)ナンノクロロプシス内在性NoACDH/ACOX遺伝子プロモーター競合用コンストラクトの構築
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表3に示すプライマー番号61及びプライマー番号62のプライマー対を用いてPCRを行い、ACDH/ACOX1遺伝子のプロモーター配列(配列番号81)を含む領域のゲノム断片を増幅した。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表3に示すプライマー番号63及びプライマー番号64のプライマー対を用いてPCRを行い、ACDH/ACOX2遺伝子のプロモーター配列(配列番号82)を含む領域のゲノム断片を増幅した。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表3に示すプライマー番号65及びプライマー番号66のプライマー対を用いてPCRを行い、ACDH/ACOX3遺伝子のプロモーター配列(配列番号83)を含む領域のゲノム断片を増幅した。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表3に示すプライマー番号67及びプライマー番号68のプライマー対を用いてPCRを行い、ACDH/ACOX4遺伝子のプロモーター配列(配列番号84)を含む領域のゲノム断片を増幅した。
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より抽出したゲノムを鋳型として、表3に示すプライマー番号69及びプライマー番号70のプライマー対を用いてPCRを行い、ACDH/ACOX5遺伝子のプロモーター配列(配列番号85)を含む領域のゲノム断片を増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC19(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示すプライマー番号15及びプライマー番号16のプライマー対を用いたPCRを行い、プラスミドベクターpUC19断片を増幅した。
なお、本プラスミドは、各ACDH/ACOX遺伝子プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
前記ACDH/ACOX遺伝子プロモーター競合用プラスミドを鋳型として、表3に示すプライマー番号71及び表1に示すプライマー番号34のプライマー対、表3に示すプライマー番号72及び表1に示すプライマー番号34のプライマー対、表3に示すプライマー番号73及び表1に示すプライマー番号34のプライマー対、表3に示すプライマー番号74及び表1に示すプライマー番号34のプライマー対、並びに表3に示すプライマー番号75及び表1に示すプライマー番号34のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ACDH/ACOX遺伝子のプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、及びVCP1ターミネーター配列からなる、ACDH/ACOX遺伝子プロモーター競合用断片(ACDH/ACOX1遺伝子プロモーター競合用断片、ACDH/ACOX2遺伝子プロモーター競合用断片、「ACDH/ACOX3遺伝子プロモーター競合用断片、ACDH/ACOX4遺伝子プロモーター競合用断片、ACDH/ACOX5遺伝子プロモーター競合用断片)を増幅した。
増幅したACDH/ACOX遺伝子プロモーター競合用断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
実施例1と同様にして、前記ACDH/ACOX遺伝子プロモーター競合用断片をナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株へ導入し、形質転換体を作製した。
そして、得られた形質転換体を用いて、実施例1と同様に油脂の生産と油滴の回収を行い、TLC分離を実施した。
また、これらの油滴を回収してTLCにて展開したところ、いずれもトリアシルグリセロールを主成分とするものであった。
Claims (10)
- ナンノクロロプシス(Nannochloropsis)属の藻類を培養して油脂を製造する方法であって、アシルCoAデヒドロゲナーゼ(acyl-CoA dehydrogenase)及びアシルCoAオキシダーゼ(acyl-CoA oxidase)からなる群より選ばれる少なくとも1種のβ酸化関連酵素をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化、又はアシルCoAデヒドロゲナーゼ(acyl-CoA dehydrogenase)及びアシルCoAオキシダーゼ(acyl-CoA oxidase)からなる群より選ばれる少なくとも1種のβ酸化関連酵素をコードする遺伝子をダウンレギュレートすることにより、前記藻類のβ酸化能を抑制又は阻害し、油脂又はこれを構成する脂肪酸のβ酸化を抑制又は阻害する、油脂の製造方法。
- 生産された油脂を前記藻類の細胞外に分泌させる、請求項1に記載の油脂の製造方法。
- 前記藻類を液体培地で培養し、培地に浮遊する油滴、又は油層を回収して油脂を得る、請求項1又は2に記載の油脂の製造方法。
- 前記β酸化関連酵素が、下記タンパク質(A)〜(J)からなる群より選ばれる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の油脂の製造方法。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(C)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)前記タンパク質(C)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(E)配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(F)前記タンパク質(E)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(G)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(H)前記タンパク質(G)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(I)配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(J)前記タンパク質(I)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記の、β酸化関連酵素をコードする遺伝子が、下記DNA(a)〜(j)のいずれか1つからなる遺伝子である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の油脂の製造方法。
(a)配列番号76で表される塩基配列からなるDNA。
(b)前記DNA(a)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号77で表される塩基配列からなるDNA。
(d)前記DNA(c)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(e)配列番号78で表される塩基配列からなるDNA。
(f)前記DNA(e)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(g)配列番号79で表される塩基配列からなるDNA。
(h)前記DNA(g)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(i)配列番号80で表される塩基配列からなるDNA。
(j)前記DNA(i)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 前記油脂が中性脂質を含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の油脂の製造方法。
- ナンノクロロプシス(Nannochloropsis)属の藻類の、アシルCoAデヒドロゲナーゼ(acyl-CoA dehydrogenase)及びアシルCoAオキシダーゼ(acyl-CoA oxidase)からなる群より選ばれる少なくとも1種のβ酸化関連酵素をコードする遺伝子が欠失若しくは不活性化、又はアシルCoAデヒドロゲナーゼ(acyl-CoA dehydrogenase)及びアシルCoAオキシダーゼ(acyl-CoA oxidase)からなる群より選ばれる少なくとも1種のβ酸化関連酵素をコードする遺伝子がダウンレギュレートされており、β酸化経路の阻害により前記藻類のβ酸化能が抑制又は阻害されている、形質転換体。
- 前記藻類が生産した油脂を細胞外に分泌する、請求項7に記載の形質転換体。
- 前記β酸化関連酵素が、下記タンパク質(A)〜(J)からなる群より選ばれる、請求項7又は8に記載の形質転換体。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)前記タンパク質(A)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(C)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)前記タンパク質(C)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(E)配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(F)前記タンパク質(E)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(G)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(H)前記タンパク質(G)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(I)配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(J)前記タンパク質(I)のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記の、β酸化関連酵素をコードする遺伝子が、下記DNA(a)〜(j)のいずれか1つからなる遺伝子である、請求項7〜9のいずれか1項に記載の形質転換体。
(a)配列番号76で表される塩基配列からなるDNA。
(b)前記DNA(a)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号77で表される塩基配列からなるDNA。
(d)前記DNA(c)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(e)配列番号78で表される塩基配列からなるDNA。
(f)前記DNA(e)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(g)配列番号79で表される塩基配列からなるDNA。
(h)前記DNA(g)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(i)配列番号80で表される塩基配列からなるDNA。
(j)前記DNA(i)の塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつアシルCoAに対するアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性又はアシルCoAオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
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