JP2016501041A - 脂肪族ジカルボン酸を調製するための生物学的方法 - Google Patents

脂肪族ジカルボン酸を調製するための生物学的方法 Download PDF

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Abstract

本技術は、部分的に、脂肪族ジカルボン酸を生産する生物学的方法、およびこのような生産が可能な操作された微生物に関する。脂肪族ジカルボン酸を生産することが可能な操作された微生物およびこのような微生物によって発現された生成物が提供される。脂肪族ジカルボン酸を生産する生物学的方法も提供される。【選択図】図１７

Description

関連出願
関連出願の相互参照
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づき、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１２年１２月１９日付けで出願された米国仮特許出願第６１／７３９，６６１号の利益を主張する。
分野
本技術は、部分的に、脂肪族ジカルボン酸を生産する生物学的方法、およびこのような生産が可能な操作された微生物に関する。
微生物は、それら自身の代謝および増殖を支持するための様々な酵素によって駆動する生物学的経路を採用している。細胞は、インビボでデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から酵素などの天然タンパク質を合成する。ＤＮＡはまず、タンパク質をコードするリボヌクレオチド配列を含む相補的なリボ核酸（ＲＮＡ）に転写される。次いでＲＮＡは、リボソームなどの様々な細胞成分との相互作用によって、コードされたタンパク質の翻訳に方向付けられる。結果得られた酵素は、生物学的な触媒として、生物による分子生産に関与する経路に参加する。
これらの経路は、自然に生産された生成物を回収するのに活用できる。この経路はまた、生産を増加させたり、または商業的に有用な可能性がある異なる生成物を生産させたりするように変更させることもできる。組換え分子生物学的な方法論の進歩のため、研究者は、１種の生物からＤＮＡを単離してそれを別の生物に挿入することにより、酵素または他のタンパク質の細胞合成を変更することが可能である。また組換え分子生物学的な方法論の進歩は、微生物のゲノムＤＮＡ中に含まれる内因性遺伝子のコピー数を増加させること、したがって酵素または他のタンパク質の細胞合成を変更することも可能にする。このような遺伝子工学は、宿主生物内の生物学的経路を変化させて、宿主生物に望ましい生成物を生産させることを可能にする。微生物の工業的生産は、腐食性の化学物質の使用と毒性副産物の生産を最小化できるため、所定の化合物にとって「クリーンな」源を提供できる。適切な植物から得られた供給材料の使用は、「環境に優しい」化合物を生産しつつ、さらに石油から得られた化合物への必要性とその使用を最小化できる。
所定の形態において、（ｉ）活性な改変された内因性アシル−ｃｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは活性な改変された内因性アシル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチド；（ｉｉ）エノイルｃｏ−Ａイソメラーゼ活性を変更する遺伝学的改変；および（ｉｉｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼ（ＤＣＲ）活性を変更する遺伝学的改変を含む遺伝子改変酵母であって、該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記酵母が提供される。また、いくつかの形態において、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産するのにこのような遺伝子改変酵母を使用する方法も提供される。
また、所定の形態において、二酸を生産する方法であって、（ａ）実施態様Ａ１〜Ａ４４、Ｂ１〜Ｂ３３、Ｃ１〜Ｃ１５およびＧ１〜Ｇ６５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な不飽和植物性脂肪酸を含む供給材料と接触させることと；（ｂ）該酵母を、該供給材料から１つまたはそれより多くの不飽和を含有する二酸が生産される条件下で培養することと；および（ｃ）１つまたはそれより多くの不飽和を水素化して除去することとを含む、上記方法も提供される。
以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面において、所定の実施態様をさらに説明する。
図面の簡単な説明
図面は、本技術の実施態様を例示するが、これらに限定されない。例示の明確化および簡易化のために、図面は原寸比にはなっておらず、いくつかの場合において、特定の実施態様を理解しやすくするために、様々な形態を誇張または拡大して示す場合もある。
図１は、ベータ酸化がブロックされた微生物におけるデカンからセバシン酸への変換の概略図である。オメガ酸化中、中間体としてカプリン酸が形成される。 図２は、ベータ酸化がブロックされた微生物におけるドデカンからドデカン二酸への変換の概略図である。オメガ酸化中、中間体としてラウリン酸が形成される。 図３は、ベータ酸化がブロックされた微生物における、混合鎖長アルカンを含有する供給材料から、セバシン酸を包含する混合二酸生成物への変換の概略図である。オメガ酸化中、中間体として混合鎖長脂肪酸が形成される。セバシン酸は、適切な分離技術の使用によって他の二酸生成物から分離できる。 図４は、ベータ酸化がブロックされた微生物における、ドデカン二酸を包含する混合鎖長アルカンを含有する供給材料から混合二酸生成物への変換の概略図である。オメガ酸化中、中間体として混合鎖長脂肪酸が形成される。ドデカン二酸は、適切な分離技術の使用によって他の二酸生成物から分離できる。 図５は、ベータ酸化が部分的にブロックされた微生物における、長鎖アルカンからセバシン酸への変換の概略図である。長鎖アルカンはまず、オメガ酸化経路における活性によって長鎖脂肪酸に変換され、次いで長鎖二酸に変換される。長鎖二酸は、ベータ酸化経路における活性によってセバシン酸に変換でき、それと同時にアセチル−ＣｏＡが生成される。 図６は、ベータ酸化が部分的にブロックされた微生物における長鎖アルカンからドデカン二酸への変換の概略図である。長鎖アルカンはまず、オメガ酸化経路における活性によって長鎖脂肪酸に変換され、次いで長鎖二酸に変換される。長鎖二酸は、ベータ酸化経路における活性によってドデカン二酸に変換でき、それと同時にアセチル−ＣｏＡが生成される。 図７は、ベータ酸化が部分的にブロックされた微生物における、混合鎖長アルカンを含有する供給材料からセバシン酸への変換の概略図である。混合鎖長アルカンはまず、オメガ酸化経路における活性によって混合鎖長脂肪酸に変換され、次いで混合二酸に変換される。混合二酸は、ベータ酸化経路における活性によってセバシン酸に変換でき、それと同時にアセチル−ＣｏＡが生成される。 図８は、ベータ酸化が部分的にブロックされた微生物における、混合鎖長アルカンを含有する供給材料からドデカン二酸への変換の概略図である。混合鎖長アルカンはまず、オメガ酸化経路における活性によって混合鎖長脂肪酸に変換され、次いで混合二酸に変換される。混合二酸は、ベータ酸化経路における活性によってドデカン二酸に変換でき、それと同時にアセチル−ＣｏＡが生成される。 図９は、ベータ酸化が完全にブロックされたカンジダ属の酵母株における、デカンからセバシン酸への変換のグラフ表示である。培地をグラフに示された時間インキュベートした後、ガスクロマトグラフィーで処理した。結果から、デカンの９９％より多くがセバシン酸に変換され、ガスクロマトグラフィーによって検出されたカプリン酸量も最小であったことが示される。他のいずれの一酸または二酸の有意な蓄積もガスクロマトグラフィーでは検出されなかった。実施例１に、実験の詳細および結果を示す。 図１０は、カンジダ属の酵母株におけるカプリン酸からセバシン酸への変換のグラフ表示である。予め決められた増殖期間後、ＧＣ分析を行った。カプリン酸の開始濃度を使用したところ、添加されたカプリン酸のほぼ全てがセバシン酸に変換された。実施例２に、実験の詳細および結果を示す。 図１１は、ベータ酸化が部分的にブロックされたカンジダ・トロピカリス株（例えば、ｓＡＡ１０６）を使用した発酵条件下での、長鎖脂肪酸から混合二酸への変換中に生産された二酸の分布のグラフ表示である。実施例５に、実験の詳細および結果を示す。 図１２は、追加の遺伝学的改変を有するベータ酸化が完全にブロックされたカンジダ属の酵母株におけるデカンからセバシン酸への変換のグラフ表示である。株ｓＡＡ００３は、ベータ酸化が完全にブロックされた対照株である。＋ＣＰＲは、ベータ酸化が完全にブロックされた株がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数も包含することを示す。＋ＣＰＲ＋Ａ１２は、開始の株ｓＡＡ００３がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数の追加の遺伝学的改変を包含し、さらに、シトクロムＰ４５０Ａ１２（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１２）の増加したコピー数も包含することを示す。＋ＣＰＲ＋Ａ１８は、開始の株ｓＡＡ００３がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数の追加の遺伝学的改変を包含し、さらに、シトクロムＰ４５０Ａ１８（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１８）の増加したコピー数も包含することを示す。＋ＣＰＲ＋Ａ１９は、開始の株ｓＡＡ００３がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数の追加の遺伝学的改変を包含し、さらに、シトクロムＰ４５０Ａ１９（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１９）の増加したコピー数も包含することを示す。＋ＣＰＲ＋Ａ２０は、開始の株ｓＡＡ００３がシトクロムＰ４５０レダクターゼの増加したコピー数の追加の遺伝学的改変を包含し、さらに、シトクロムＰ４５０Ａ２０（例えば、ＣＹＰ５２Ａ２０）の増加したコピー数も包含することを示す。図１２のｙ軸は、最大理論収量のパーセントである。実施例７に、実験の詳細および結果を示す。 図１３は、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、またはモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性およびモノオキシゲナーゼ活性に対する遺伝子変更も含有するベータ酸化が完全にブロックされたカンジダ属の酵母株における、ラウリン酸メチルからドデカン二酸への変換の結果のグラフ表示である。培地を４８時間インキュベートした後、ガスクロマトグラフィーで処理した。結果から、ＣＹＰ５２Ａ１８のモノオキシゲナーゼ活性の増加したコピー数およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性（例えば、ＣＰＲ７５０）の増加したコピー数を含有するカンジダ株が、振盪フラスコ発酵実験においてドデカン二酸（例えば、ＤＤＤＡ）の最大収量をもたらすことが示される。実施例８に、実験の詳細および結果を示す。 図１４は、特異的な基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を同定するためのスクリーニングおよび／または選択方法を図式的に例示する。この方法は、変更された鎖長基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を生成および／または同定することと共に利用できる。実施例９に、スクリーニング／選択方法の詳細を示す。 図１５は、特異的な基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を同定するためのスクリーニングおよび／または選択方法を図式的に例示する。この方法は、変更された鎖長基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を生成および／または同定することと共に利用できる。実施例９に、スクリーニング／選択方法の詳細を示す。 図１６は、本明細書で説明される供給材料として様々な量のデカンを使用した発酵条件下でデカンをセバシン酸に変換する操作された微生物の結果のグラフ表示である。実施例３に、実験の詳細および結果を示す。 図１７は、本明細書で説明される発酵条件下で混合脂肪酸供給材料（例えば、混合鎖長脂肪酸）をセバシン酸に変換する操作された微生物の結果のグラフ表示である。実施例４に、実験の詳細および結果を示す。 図１８は、ＰＯＸ４プロモーターおよびＰＯＸ４ターミネーターを含有するｐＡＡ０７３と名付けられたプラスミドの略図を示す。 図１９は、ＰＣＲオーバーラップ伸長を使用したＥＣＩ１のための全長欠失カセットの生成を例示する。 図２０は、ＰＣＲオーバーラップ伸長を使用したＥＣＩ１第二の対立遺伝子のための全長欠失カセットの生成を例示する。 図２１は、カンジダ株から単離したＰｏｘ５に関するアシルＣｏＡオキシダーゼ活性プロファイルを示す。 図２２は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子に部位特異的点突然変異を導入するためのＰＣＲオーバーラップ伸長方法を例示する。 図２３は、ＡｃｏＩおよびＡｃｏＩＩのＮ末端の１８０アミノ酸の配列アライメントを示す。灰色で強調表示されたアミノ酸は、アルファヘリックス内に配置され、太字でで強調表示されたアミノ酸は、ベータシート内に配置される。中心の配列は、保存された残基を示すコンセンサス配列を表す。 図２４Ａは、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのＰｏｘ４のホットスポットウィザード分析を例示する。濃灰色または薄灰色で強調表示された残基は、突然変異誘発性の「ホットスポット」である。濃灰色の残基は、その位置において、薄灰色の残基よりも変化しやすいことを示す。太字の残基は、基質結合ポケットの内部かまたはその近傍で見出されている。 図２４Ｂは、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのＰｏｘ５のホットスポットウィザード分析を例示する。濃灰色または薄灰色で強調表示された残基は、突然変異誘発性の「ホットスポット」である。濃灰色の残基は、その位置において、薄灰色の残基よりも変化しやすいことを示す。太字の残基は、基質結合ポケットの内部かまたはその近傍で見出されている。 図２５は、ＲｎＡｃｏＩＩのホットスポットウィザード分析を例示する。濃灰色または薄灰色で強調表示された残基は、突然変異誘発性の「ホットスポット」である。濃灰色の残基は、その位置において、薄灰色の残基よりも変化しやすいことを示す。太字の残基は、基質結合ポケットの内部かまたはその近傍で見出されている。 図２６は、全ての３種のタンパク質の複数の配列アライメントを示す。ＲｎＡｃｏＩＩ（ドブネズミ（R. norvegicus）からのＡｃｏＩＩ）の下線で示した部分は、オルタナティブスプライシングされたエキソン３を表す。 図２６は、全ての３種のタンパク質の複数の配列アライメントを示す。ＲｎＡｃｏＩＩ（ドブネズミ（R. norvegicus）からのＡｃｏＩＩ）の下線で示した部分は、オルタナティブスプライシングされたエキソン３を表す。 図２７は、Ｐｏｘ５突然変異体に関連するアシルＣｏＡ活性プロファイルを示す。「Ｃ１８」と称される基質は短縮化され、Ｃ１８：１の基質に関する。 図２８は、Ｐｏｘ４突然変異体に関連するアシルＣｏＡ活性プロファイルを示す。 図２９は、ｐＡＡ２９８と名付けられたプラスミドの略図を示す。 図３０Ａは、カンジダ・ビスワナチイ（Candida viswanathii）（ＰＯＸ４およびＰＯＸ５）およびヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）（ＹｌＰＯＸ２、ＹｌＰＯＸ３およびＹｌＰＯＸ５）から選択されたアシルＣｏ−Ａ酵素のアミノ酸アライメントを示す。コンセンサス配列のアライメントも示される。 図３０Ｂは、カンジダ・ビスワナチイ（Candida viswanathii）（ＰＯＸ４およびＰＯＸ５）およびヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）（ＹｌＰＯＸ２、ＹｌＰＯＸ３およびＹｌＰＯＸ５）から選択されたアシルＣｏ−Ａ酵素のアミノ酸アライメントを示す。コンセンサス配列のアライメントも示される。 図３１は、リノール酸からのセバシン酸の合成を示す。 図３２は、ｐＡＡ９１８のプラスミドベクターマップを示す。 図３３は、ＡＴＣＣ２０３３６からのＰＯＸ４およびＰＯＸ５に加えて６種のＹ．リポリチカのアシル−ＣｏＡオキシダーゼタンパク質の活性プロファイルを示す。これらの酵素の活性プロファイルを、インビトロでのアシル−ＣｏＡオキシダーゼアッセイ（例えば、実施例４１で説明されるような）およびアシル−ＣｏＡの異なる鎖長の基質（例えば、Ｃ６、６個の炭素；Ｃ８、８個の炭素；Ｃ１０、１０個の炭素；Ｃ１２、１２個の炭素；Ｃ１４、１４個の炭素；およびＣ１８−１、１８個の炭素）を使用して決定した。 図３４は、ＡＣＯ、ＥＣＩ、ＤＣＩ（ジエノイルＣｏＡイソメラーゼ）およびＤＣＲ、加えてそれらの反応生成物および基質を包含する反応経路の略図の例を示す。
詳細な説明
所定の脂肪族ジカルボン酸（すなわち、二酸、例えばドデカン二酸またはセバシン酸）は、所定のポリアミド、ポリウレタンおよび可塑剤の作製に使用される製造プロセスにおける化学中間体であり、これらはいずれも、消毒剤、トップグレードのコーティング、ホットメルトコーティングおよび接着剤、塗料原料、腐食抑制剤、界面活性剤、エンジニアリングプラスチックなどの物品の製造において広範囲の用途を有し、さらに例えば芳香剤の製造における出発原料としても使用できる。例えばドデカン二酸はまた、１，１２ドデカン二酸、およびＤＤＤＡとしても知られており、これらは、脂肪族ジカルボン酸である炭素１２個の有機分子である。別の例において、セバシン酸はまた、１，１０デカン二酸、および１，８オクタンジカルボン酸としても知られており、これらはは、脂肪族ジカルボン酸である炭素１０個の有機分子である。
本明細書において、脂肪族ジカルボン酸（本明細書では二酸とも称される）を生産する方法が提供される。あらゆる好適な二酸を生産でき、多くの場合、生産された二酸は分子の各末端に酸部分を包含する（例えば、アルファオメガ二酸）。二酸は、時には、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸（すなわち、４個〜２４個の炭素を含有する二酸）であり、時には、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、またはＣ２０の二酸である。本明細書に記載の酵母およびプロセスは、奇数の炭素を含有する二酸を生産でき、時には、生成物は、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１１、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ１７、Ｃ１９、Ｃ２１およびＣ２３の二酸から選ばれる１個またはそれより多くの二酸を含有する。二酸の炭化水素部分は、時には完全に飽和しており、二酸は、時には１つまたはそれより多くの不飽和（例えば、二重結合）を包含する。
二酸の非限定的な例としては、オクタデカン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）および生物系を使用した他の有機中間体が挙げられる。脂肪族ジカルボン酸の非限定的な例としては、スベリン酸（すなわち、オクタン二酸、１，８−オクタン二酸、オクタン二酸、オクタン−１，８−二酸、１，６−ヘキサンジカルボン酸、カプリル二酸）、セバシン酸（すなわち、１，１０−デカン二酸、デカン二酸、デカン−１，１０−二酸、１，８−オクタンジカルボン酸、カプリン二酸）、ドデカン二酸（すなわち、ＤＤＤＡ、１，１２−ドデカン二酸、ドデカン二酸、ドデカン−１，１２−二酸、１，１０−デカンジカルボン酸、デカメチレンジカルボン酸、１，１０−ジカルボキシデカン、ラウリン二酸）、テトラデカン二酸（すなわち、ＴＤＤＡ、１，１４−テトラデカン二酸、テトラデカン二酸、テトラデカン−１，１４−二酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、ミリスチン二酸）、タプシン酸（thapsic acid）（すなわち、ヘキサデカン二酸、１，１６−ヘキサデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘキサデカン−１，１６−二酸、１，１４−テトラデカンジカルボン酸、パルミチン二酸）、シス−９−ヘキサデセン二酸（すなわち、パルミトレイン二酸）、オクタン二酸（すなわち、１，１８−オクタデカン二酸、オクタデカン二酸、オクタデカン−１，１８−二酸、１，１６−ヘキサデカンジカルボン酸、ステアリン二酸）、シス−９−オクタデセン二酸（すなわち、オレイン二酸）、シス−９，１２−オクタデセン二酸（すなわち、リノール二酸）、シス−９，１２，１５−オクタデセン二酸（すなわち、リノレン二酸）、アラキジン二酸（すなわち、エイコサン二酸、イコサン二酸）、１１−エイコセン二酸（すなわち、シス−１１−エイコセン二酸）、１３−エイコセン二酸（すなわち、シス−１３−エイコセン二酸）、アラキドン二酸（すなわち、シス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン二酸）が挙げられる。
遺伝子改変酵母は、二酸を生産するための供給材料と共に提供でき、供給材料は、時には、二酸が生産される実質的に純粋な脂肪族分子を包含する。いくつかの実施態様において、供給材料は、二酸が生産され得る脂肪族分子の混合されたセットを含有する。いくつかの実施態様において、供給材料中の脂肪族分子が、主要な脂肪族化学種であり、時にはその脂肪族分子から生産された特定の二酸が、生産された主要な二酸化学種である。主要な化学種は、一般的に、供給材料中の脂肪族分子化学種の重量に対して、５１％またはそれより高いか、または生成物中の二酸化学種の重量に対して、５１％またはそれより高い（例えば、約５５％またはそれより高い、６０％またはそれより高い、６５％またはそれより高い、７０％またはそれより高い、７５％またはそれより高い、８０％またはそれより高い、８５％またはそれより高い、９０％またはそれより高いまたは９５％またはそれより高い）。
このような生産システムは、環境への影響をより有意に少なくすることができ、現行の製造システムとの経済的な競合が可能である。したがって、本明細書において、部分的に、操作された微生物による、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の製造方法が提供される。いくつかの実施態様において、微生物は、酵素をコードする少なくとも１種の異種遺伝子が含有されるように操作され、ここで酵素は、微生物に組み込まれた新規のおよび／または変更された経路の一要素である。いくつかの実施態様において、生物は、天然の酵素の高い活性によって選択されてもよい。
微生物
選択された微生物は、多くの場合、遺伝子操作に好適であり、多くの場合、さらに目的とする脂肪族ジカルボン酸生成物の工業的生産に有用な細胞密度で培養できる。選択された微生物は、多くの場合、発酵デバイスで維持できる。
用語「操作された微生物」は、本明細書で使用される場合、開始点として利用した微生物（以降、「宿主微生物」）に存在する活性とは異なる１種またはそれより多くの活性を包含する改変微生物を指す。いくつかの実施態様において、操作された微生物は異種ポリヌクレオチドを包含し、いくつかの実施態様において、操作された生物は、宿主微生物に対して活性を変更する、または活性を導入する選択的な条件で処理されたものである。したがって、操作された微生物は、ヒトによって直接的または間接的に変更されたものである。宿主微生物は、時には天然の微生物であり、所定の程度まで操作された微生物であることもある。
いくつかの実施態様において、操作された微生物は、多くの場合、分裂して繁殖できる単細胞生物である。微生物は、以下の特徴：好気性、嫌気性、糸状、非糸状、一倍体、二倍体、栄養要求性および／または非栄養要求性のうち１つまたはそれより多くを包含していてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、原核性微生物（例えば、細菌）であり、いくつかの実施態様において、操作された微生物は、非原核性微生物である。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、真核性微生物（例えば、酵母、菌類、アメーバ）である。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、真菌である。いくつかの実施態様において、操作された生物は、酵母である。
宿主微生物、操作された微生物、遺伝子改変生物、または異種もしくは改変ポリヌクレオチドのための源として、あらゆる好適な酵母が選択できる。酵母としては、これらに限定されないが、ヤロウイア属の酵母（例えば、Ｙ．リポリチカ（Y. lipolytica）（以前はカンジダ・リポリチカとして分類された））、カンジダ属の酵母（例えば、Ｃ．レブカウフィ（C. revkaufi）、Ｃ．ビスワナチイ、Ｃ．プルケリマ（C. pulcherrima）、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．ユチリス（C. utilis））、ロドトルラ属の酵母（例えば、Ｒ．グルチナス（R. glutinus）、Ｒ．グラミニス（R. graminis））、ロドスポリディウム属の酵母（例えば、Ｒ．トルロイデス（R. toruloides））、サッカロミセス属の酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）、Ｓ．パストリアヌス（S. pastorianus）、Ｓ．カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis））、クリプトコックス属の酵母、トリコスポロン属の酵母（例えば、Ｔ．プランス（T. pullans）、Ｔ．クタネウム（T. cutaneum））、ピチア属の酵母（例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris））、およびリポマイセス属の酵母（例えば、Ｌ．スターキイ（L. starkeyii）、Ｌ．リポフェラス（L. lipoferus））が挙げられる。いくつかの実施態様において、好適な酵母は、以下の属：アラクニオタス属（Arachniotus）、アスペルギルス属、オーレオバシディウム属、アクサルスロン属（Auxarthron）、ブラストマイセス属、カンジダ属、クリソスポリウム属（Chrysosporuim）、クリソスポリウム・デバリオマイセス（Chrysosporuim Debaryomyces）、コクシジオイデス属（Coccidiodes）、クリプトコックス属、ギムノアスカス属（Gymnoascus）、ハンセヌラ属、ヒストプラスマ属、イッサチェンキア属（Issatchenkia）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、リポマイセス属、イッサチェンキア属（Lssatchenkia）、ミクロスポルム属、ミクソトリクム属（Myxotrichum）、ミクソザイマ属（Myxozyma）、オイディオデンドロン属（Oidiodendron）、パチソレン属（Pachysolen）、ペニシリウム属、ピチア属、ロドスポリディウム属（Rhodosporidium）、ロドトルラ属、ロドトルラ属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、スコプラリオプシス属、セペドニウム属（Sepedonium）、トリコスポロン属、またはヤロウイア属の酵母である。いくつかの実施態様において、好適な酵母は、以下の種：アラクニオタス・フラボルテウス（Arachniotus flavoluteus）、アスペルギルス・フラーブス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、アクサルスロン・タクステリ（Auxarthron thaxteri）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Candida dubliniensis）、カンジダ・ファマタ（Candida famata）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ギリエルモンジイ（Candida guilliermondii）、カンジダ・ケフィア（Candida kefyr）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・ランビカ（Candida lambica）、カンジダ・リポリチカ（Candida lipolytica）、カンジダ・ルシタニア（Candida lustitaniae）、カンジダ・パラシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・プルケリマ（Candida pulcherrima）、カンジダ・レブカウフィ（Candida revkaufi）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・ユチリス（Candida utilis）、カンジダ・ビスワナチイ（Candida viswanathii）、カンジダ・クセストビイ（Candida xestobii）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporuim keratinophilum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidiodes immitis）、クリプトコックス・アルビダスの変種ディフルエンス（Cryptococcus albidus var. diffluens）、クリプトコックス・ラウレンテイ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコックス・ネオフォマンス（Cryptococcus neofomans）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、ギムノアスカス・ダグウェイエンシス（Gymnoascus dugwayensis）、ハンセヌラ・アノマーラ（Hansenula anomala）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、イッサチェンキア・オクシデンタリス（Issatchenkia occidentalis）、イッサチェンキア・オリエンタリス（Isstachenkia orientalis）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）、クルイベロマイセス・ワルテイ（Kluyveromyces waltii）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、リポマイセス・スターキイ（Lipomyces starkeyii）、ミクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、ミクソトリクム・デフレクサム（Myxotrichum deflexum）、オイディオデンドロン・エキヌラタム（Oidiodendron echinulatum）、パチソレン・タノフィリス（Pachysolen tannophilis）、ペニシリウム・ノタツム（Penicillium notatum）、ピチア・アノマーラ（Pichia anomala）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・スティピティス（Pichia stipitis）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、ロドトルラ・グルチナス（Rhodotorula glutinus）、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula graminis）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、スコプラリオプシス・アクレモニウム（Scopulariopsis acremonium）、セペドニウム・クリソスペルマム（Sepedonium chrysospermum）、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporon cutaneum）、トリコスポロン・プランス（Trichosporon pullans）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、またはヤロウイア・リポリチカ（以前はカンジダ・リポリチカとして分類された）の酵母である。いくつかの実施態様において、酵母は、Ｙ．リポリチカ株であり、その例としては、これらに限定されないが、ＡＴＣＣ２０３６２、ＡＴＣＣ８８６２、ＡＴＣＣ１８９４４、ＡＴＣＣ２０２２８、ＡＴＣＣ７６９８２およびＬＧＡＭ Ｓ（７）１株が挙げられる（Papanikolaou S.、およびAggelis G.、Bioresour. Technol. 82（1）:43〜9（2002））。いくつかの実施態様において、酵母は、カンジダ種（Candida species）（すなわち、カンジダ種（Candida spp.））の酵母である。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）生産のために、あらゆる好適なカンジダ種を使用してもよいし、および／または遺伝子改変してもよい。いくつかの実施態様において、好適なカンジダ種としては、これらに限定されないが、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ドゥブリニエンシス、カンジダ・ファマタ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・ケフィア、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ランビカ、カンジダ・リポリチカ、カンジダ・ルシタニア（Candida lustitaniae）、カンジダ・パラシローシス、カンジダ・プルケリマ（Candida pulcherrima）、カンジダ・レブカウフィ、カンジダ・ルゴサ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ユチリス、カンジダ・ビスワナチイ、カンジダ・クセストビイおよび本明細書で説明される他のあらゆるカンジダ種の酵母が挙げられる。カンジダ種の株の非限定的な例としては、これらに限定されないが、ｓＡＡ００１（ＡＴＣＣ２０３３６）、ｓＡＡ００２（ＡＴＣＣ２０９１３）、ｓＡＡ００３（ＡＴＣＣ２０９６２）、ｓＡＡ４９６（ＵＳ２０１２／００７７２５２）、ｓＡＡ１０６（ＵＳ２０１２／００７７２５２）、ＳＵ−２（ｕｒａ３−／ｕｒａ３−）、Ｈ５３４３（ベータ酸化がブロックされた；米国特許第５６４８２４７号）株が挙げられる。遺伝学的改変のための親株として、カンジダ種の酵母からのあらゆる好適な株が利用できる。
酵母の属、種および株は、多くの場合、遺伝学的な内容に関して密接に関連しているため、それらを区別、分類および／または命名することが難しい場合がある。いくつかのケースにおいて、Ｃ．リポリチカおよびＹ．リポリチカの株は、区別、分類、および／または命名が難しい場合があり、いくつかのケースでは同じ生物とみなされる可能性がある。いくつかのケースにおいて、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイの様々な株は、区別、分類、および／または命名が難しい場合がある（例えば、Arieら、J. Gen. Appl.Microbiol.、46、257〜262（2000）を参照）。ＡＴＣＣから、加えて他の商業的または教育機関の源から得られたいくつかのＣ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイの株は、本明細書で説明される実施態様にとって等価で同じように好適であるとみなされる可能性がある。いくつかの実施態様において、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイのいくつかの親株は、名称に関してのみ異なるとみなされる。
宿主微生物、操作された微生物または異種ポリヌクレオチドのための源として、あらゆる好適な真菌が選択できる。菌類の非限定的な例としては、これらに限定されないが、アスペルギルス属の菌（例えば、A．パラスティカス（A. parasiticus）、A．ニデュランス（A. nidulans））、トラウストチトリウム（Thraustochytrium）菌類、シゾチトリウム（Schizochytrium）菌類およびリゾープス菌類（例えば、R．アリズス（R. arrhizus）、R．オリゼー（R. oryzae）、R．ニグリカンス（R. nigricans））が挙げられる。いくつかの実施態様において、真菌は、これらに限定されないが、ＡＴＣＣ２４６９０株などのＡ．パラスティカス株であり、いくつかの実施態様において、真菌は、これらに限定されないが、ＡＴＣＣ３８１６３株などのＡ．ニデュランス株である。
宿主微生物、操作された微生物または異種ポリヌクレオチドのための源として、あらゆる好適な原核生物が選択できる。グラム陰性またはグラム陽性細菌が選択されてもよい。細菌の例としては、これらに限定されないが、バチルス属の細菌（例えば、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis)、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium））、アシネトバクター属の細菌、ノルカルディア属の細菌、ザントバクター属の細菌、エシェリキア属の細菌（例えば、大腸菌（E. coli）（例えば、ＤＨ１０Ｂ株、Ｓｔｂｌ２株、ＤＨ５−アルファ株、ＤＢ３株、ＤＢ３．１株）、ＤＢ４、ＤＢ５、ＪＤＰ６８２およびｃｃｄＡ−ｏｖｅｒ（例えば、米国出願第０９／５１８，１８８号）））、ストレプトマイセス属の細菌、エルウィニア属の細菌、クレブシエラ属の細菌、セラチア属の細菌（例えば、Ｓ．マルセサンズ（S. marcessans））、シュードモナス属の細菌（例えば、緑膿菌（P. aeruginosa））、サルモネラ属の細菌（例えば、ネズミチフス菌（S. typhimurium）、腸チフス菌（S. typhi））、メガスファエラ属の細菌（例えば、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii））が挙げられる。また細菌としては、これらに限定されないが、光合成細菌（例えば、緑色非硫黄細菌（例えば、クロロフレクサス属（Choroflexus）の細菌（例えば、Ｃ．オーランティアカス（C. aurantiacus））、クロロネマ属（Chloronema）の細菌（例えば、Ｃ．ギガテウム（C. gigateum）））、緑色硫黄細菌（例えば、クロロビウム属の細菌（例えば、Ｃ．リミコーラ（C. limicola））、ペロディクチオン属の細菌（例えば、Ｐ．ルテオルム（P. luteolum））、紅色硫黄細菌（purple sulfur bacteria）（例えば、クロマチウム属の細菌（例えば、Ｃ．オケニイ（C. okenii）））、および紅色非硫黄細菌（purple non-sulfur bacteria）（例えば、ロドスピリルム属の細菌（例えば、Ｒ．ルブルム（R. rubrum））、ロドバクター属の細菌（例えば、Ｒ．スポロスフェロイデス（R. sphaeroides）、Ｒ．カプスラータス（R. capsulatus））、およびロドミクロビウム属の細菌（例えば、Ｒ．バネリイ（R. vanellii）））も挙げられる。
宿主微生物、操作された微生物または異種ポリヌクレオチドのための源として、微生物以外の生物からの細胞が利用できる。このような細胞の例としては、これらに限定されないが、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ属（例えば、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster））、スポドプテラ属（Spodoptera）（例えば、Ｓ．フルギペルダ（S. frugiperda）Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）およびトリコプルシア属（Trichoplusa）（例えば、ハイファイブ（High-Five）細胞）；線虫細胞（例えば、Ｃ．エレガンス（C. elegans）細胞）；鳥類細胞；両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル細胞）；爬虫類細胞；哺乳類細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、Ｃ１２７、ＢＨＫ、Ｐｅｒ−Ｃ６、ボーズ（Bowes）黒色腫およびＨｅＬａ細胞）；ならびに植物細胞（例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ニコタニア・タバカム（Nicotania tabacum）、クフェア・アンシニフォリア（Cuphea acinifolia）、クフェア・Cuphea aequipetala、クフェア・アングスチフォリア（Cuphea angustifolia）、クフェアア・ペンディキュラタ（Cuphea appendiculata）、クフェア・アビゲラ（Cuphea avigera）、クフェア・アビゲラの変種プルケリマ（Cuphea avigera var. pulcherrima）、クフェア・アクシリフロラ（Cuphea axilliflora）、クフェア・バヒエンシス（Cuphea bahiensis）、クフェア・バイロニス（Cuphea baillonis）、クフェア・ブラキポダ（Cuphea brachypoda）、クフェア・ブスタマンテ（Cuphea bustamanta）、クフェア・カルカラタ（Cuphea calcarata）、クフェア・カロフィラ（Cuphea calophylla）、クフェア・カロフィラの亜種メソステモン（Cuphea calophylla subsp. mesostemon）、クフェア・カルサゲネンシス（Cuphea carthagenensis）、クフェア・サーカエオイデス（Cuphea circaeoides）、クフェア・コンフェルティフロラ（Cuphea confertiflora）、クフェア・コルダタ（Cuphea cordata）、クフェア・クラシフロラ（Cuphea crassiflora）、クフェア・シアネア（Cuphea cyanea）、クフェア・デカンドラ（Cuphea decandra）、クフェア・デンティクラタ（Cuphea denticulata）、クフェア・ディスペルマ（Cuphea disperma）、クフェア・エピロビフォリア（Cuphea epilobiifolia）、クフェア・エリコイデス（Cuphea ericoides）、クフェア・フラバ（Cuphea flava）、クフェア・フラビセツラ（Cuphea flavisetula）、クフェア・フクシフォリア（Cuphea fuchsiifolia）、クフェア・ガウメリ（Cuphea gaumeri）、クフェア・グルチノサ（Cuphea glutinosa）、クフェア・ヘテロフィラ（Cuphea heterophylla）、クフェア・フーケリアナ（Cuphea hookeriana）、クフェア・ヒッソピフォリア（Cuphea hyssopifolia）（メキシカンヘザー（Mexican-heather））、クフェア・ヒッドポイデス（Cuphea hyssopoides）、クフェア・イグネア（Cuphea ignea）、クフェア・イングラタ（Cuphea ingrata）、クフェア・ジョルレンシス（Cuphea jorullensis）、クフェア・ランセオラタ（Cuphea lanceolata）、クフェア・リナリオイデス（Cuphea linarioides）、クフェア・ラベア（Cuphea llavea）、クフェア・ロフォストマ（Cuphea lophostoma）、クフェア・ルテア（Cuphea lutea）、クフェア・ルテセンス（Cuphea lutescens）、クフェア・メラニウム（Cuphea melanium）、クフェア・メルビラ（Cuphea melvilla）、クフェア・ミクランサ（Cuphea micrantha）、クフェア・ミクロペタラ（Cuphea micropetala）、クフェア・ミヌロイデス（Cuphea mimuloides）、クフェア・ニチドゥラ（Cuphea nitidula）、クフェア・パルストリス（Cuphea palustris）、クフェア・パーソンシア（Cuphea parsonsia）、クフェア・パスクオラム（Cuphea pascuorum）、クフェア・パウシペタラ（Cuphea paucipetala）、クフェア・プロクムベンス（Cuphea procumbens）、クフェア・シュードシレネ（Cuphea pseudosilene）、クフェア・シュードバシニウム（Cuphea pseudovaccinium）、クフェア・プルクラ（Cuphea pulchra）、クフェア・ラセモサ（Cuphea racemosa）、クフェア・レペンス（Cuphea repens）、クフェア・サリシフォリア（Cuphea salicifolia）、クフェア・サルバドレンシス（Cuphea salvadorensis）、クフェア・シュマニイ（Cuphea schumannii）、クフェア・セッシリフロラ（Cuphea sessiliflora）、クフェア・セッシリフォリア（Cuphea sessilifolia）、クフェア・セトサ（Cuphea setosa）、クフェア・スペクタビリス（Cuphea spectabilis）、クフェア・スペルマコセ（Cuphea spermacoce）、クフェア・スプレンディダ（Cuphea splendida）、クフェア・スプレンディダの変種ビリジフラバ（Cuphea splendida var. viridiflava）、クフェア・ストリグロサ（Cuphea strigulosa）、クフェア・スブリゲラ（Cuphea subuligera）、クフェア・テレアンドラ（Cuphea teleandra）、クフェア・チモイデス（Cuphea thymoides）、クフェア・トルカナ（Cuphea tolucana）、クフェア・ウレンス（Cuphea urens）、クフェア・ウトリクロサ（Cuphea utriculosa）、クフェア・ビソシッシマ（Cuphea viscosissima）、クフェア・ワトソニアナ（Cuphea watsoniana）、クフェア・ライチイ（Cuphea wrightii）、クフェア・ランセオラタ））が挙げられる。
宿主生物または異種ポリヌクレオチドのための源として使用される微生物または細胞は、市販されている。本明細書で説明される微生物および細胞、および他の好適な微生物および細胞は、例えば、インビトロジェン社（Invitrogen Corporation）（カリフォルニア州カールスバッド）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（バージニア州マナサス）、およびアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（Agricultural Research Culture Collection）（ＮＲＲＬ；イリノイ州ピオリア）から入手可能である。
宿主微生物および操作された微生物は、あらゆる好適な形態で提供されてもよい。例えば、このような微生物は、液体培養または固体培養（例えば、寒天ベースの培地）の状態で提供されてもよく、これらは初代培養物であってもよいし、または１回またはそれより多く継代されていてもよい（例えば、希釈して培養してもよい）。また微生物は、凍結した形態または乾燥形態（例えば、凍結乾燥した形態）で提供されてもよい。微生物は、あらゆる好適な濃度で提供されてもよい。
炭素のプロセシング経路および活性
図１〜８は、様々な開始炭素源または供給材料から脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産するのに使用できる操作された経路の非限定的な実施態様を図式的に例示する。図１は、ベータ酸化経路が完全にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料としてデカンを使用してセバシン酸を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。図２は、ベータ酸化経路が完全にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料としてドデカンを使用してドデカン二酸を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。図３および図４は、ベータ酸化経路が完全にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料として混合鎖長アルカンを使用して混合鎖長二酸を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。セバシン酸（図３）およびドデカン二酸（図４）は、遠心分離、有機溶媒抽出、クロマトグラフィー、および／または他の精製／分離技術の好適な組み合わせを使用して他の二酸生成物から分離および／または精製できる。図５および図６は、ベータ酸化経路が部分的にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料として長鎖アルカンを使用してセバシン酸（図５）およびドデカン二酸（図６）を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。図７および図８は、ベータ酸化経路が部分的にブロックされた微生物中で、炭素源出発原料として混合鎖長アルカンを使用してセバシン酸（図７）およびドデカン二酸（図８）を生産するための非限定的な操作された生物学的経路の実施態様を表す。
炭素源出発原料であるアルカンを、最初のうちは天然に存在するおよび／または操作された経路における天然に存在するおよび／または操作された活性を使用して代謝して中間体アルコールを産出し、次いでこれを、図１〜８に表された他の天然に存在するおよび／または操作されたオメガ酸化経路における活性の作用によってカルボン酸（例えば、脂肪酸）に変換してもよい。
シトクロムＰ４５０酵素の活性によってアルカンをオメガ−ヒドロキシル化することにより、開始のアルカン炭素源材料に対応する鎖長アルコール誘導体が生成する。いくつかの実施態様において、シトクロムＰ４５０活性は、シトクロムＰ４５０遺伝子のコピー数を増加させること（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い遺伝子のコピー）、シトクロムＰ４５０遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、またはシトクロムＰ４５０遺伝子のコピー数を増加させて、シトクロムＰ４５０遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、１種またはそれより多くのシトクロムＰ４５０酵素活性の増加のために増加する。いくつかの実施態様において、シトクロムＰ４５０酵素は、宿主微生物にとって内因性である。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くのシトクロムＰ４５０活性を、炭素源出発原料に応じて追加および／または増加してもよい。シトクロムＰ４５０は、時には、所定の供給材料または炭素源出発原料による刺激に応答して活性の増加を示す。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、選ばれた炭素源出発原料または供給材料によって刺激される１種またはそれより多くのシトクロムＰ４５０の増加したコピー数を包含する。選ばれた開始炭素源または供給材料に対するシトクロムＰ４５０の反応性は、あらゆる好適なアッセイを使用して決定できる。開始の炭素源または供給材料に対するシトクロムＰ４５０の反応性の同定に好適なアッセイの非限定的な例としては、宿主微生物を様々な時間量で選ばれた炭素源または供給材料に晒した後のＲＴ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。
シトクロムＰ４５０は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）の活性によって還元されて、それによりシトクロムＰ４５０は再利用されてさらなる酵素活性がもたらされる。いくつかの実施態様において、ＣＰＲ酵素は、宿主微生物にとって内因性である。いくつかの実施態様において、宿主のＣＰＲ活性は、ＣＰＲ遺伝子のコピー数を増加させること（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い遺伝子のコピー）、ＣＰＲ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、またはＣＰＲ遺伝子のコピー数を増加させて、ＣＰＲ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、シトクロムＰ４５０の再利用増加のために増加する。いくつかの実施態様において、プロモーターは、異種プロモーター（例えば、内因性または外因性プロモーター）であってもよい。いくつかの実施態様において、ＣＰＲ遺伝子は、異種および外因性であり、あらゆる好適な生物から単離できる。ＣＰＲ遺伝子を単離できる生物の非限定的な例としては、Ｃ．トロピカリス、Ｓ．セレビシエおよびバチルス・メガテリウムが挙げられる。
アルコールからアルデヒドへの酸化は、脂肪族アルコールオキシダーゼファミリーにおける酵素（例えば、長鎖脂肪族アルコールオキシダーゼＥＣ１．１．３．２０）、またはアルコールデヒドロゲナーゼファミリーにおける酵素（例えば、脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ；ＥＣ１．１．１．１）によって行ってもよい。アルデヒドは、酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、長鎖−アルデヒドデヒドロゲナーゼまたは脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ；ＥＣ１．２．１．４８）の活性によってカルボン酸（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）に酸化されていてもよい。いくつかの実施態様において、長鎖脂肪族アルコールオキシダーゼ、脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼおよび／または長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼは、宿主生物中に存在する。これらの二段階を介したフラックスは、時には、酵素のコピー数を増加させること、または遺伝子を転写するプロモーターの活性を増加させることによって増大される可能性がある。いくつかの実施態様において、炭素１０、１２または１４個の基質に特異的なアルコールおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼを別の生物から単離して、宿主生物に挿入してもよい。
図１は、炭素源出発原料としてデカン（例えば、Ｃ１０アルカン）を使用してセバシン酸を作製するための、操作された生物学的経路の非限定的な実施態様を表す。デカンの炭素鎖長のために、炭素１０個の二酸であるセバシン酸に到達するのに鎖を短くする必要はない。したがってベータ酸化が完全にブロックされた微生物を利用すれば、望ましい炭素１０個の二酸からそれより短い鎖長を有する二酸への変換を最小化できる。
図２は、炭素源出発原料としてドデカン（例えば、Ｃ１２アルカン）を使用してドデカン二酸を作製するための操作された生物学的経路の非限定的な実施態様を表す。ドデカンの炭素鎖長のために、炭素１２個の二酸であるドデカン二酸に到達するのに鎖を短くする必要はない。したがってベータ酸化が完全にブロックされた微生物を利用すれば、望ましい炭素１２個の二酸からより短い鎖長を有する二酸への変換を最小化できる。
図３および４は、炭素源出発原料として混合鎖長アルカンを含有する炭素源または供給材料を使用して、セバシン酸（図３）およびドデカン二酸（図４）などの二酸（脂肪族ジカルボン酸）生成物の混合された集団を生成するための、操作された生物学的経路の非限定的な実施態様を表す。あらゆる好適な混合鎖長アルカン、脂肪族アルコール、混合鎖長の脂肪族アルコール供給材料、脂肪酸、混合脂肪酸供給材料、パラフィン、脂肪または油が使用できる。いくつかの実施態様において、出発原料における炭素鎖長の分布は、混合二酸生成物における望ましい炭素鎖長分布に実質的に類似している。いくつかの実施態様において、供給材料は、望ましい鎖長が高濃度化されている。いくつかの実施態様において、高濃度化される部分は、炭素約１０個の炭素鎖長に関して高濃度化される。いくつかの実施態様において、高濃度化される部分は、炭素約１２個の炭素鎖長に関して高濃度化される。いくつかの実施態様において、生成した二酸は、炭素源出発原料中に見出される鎖長と実質的に同じ鎖長を有することから、ベータ酸化が完全にブロックされた微生物を利用すれば、望ましい鎖長の二酸からより短い鎖長の二酸への変換を最小化できる。図３および図４における経路の下の部分は、本明細書で説明される分離技術、または当業界公知の分離技術の使用による、混合二酸生成物からのセバシン酸およびドデカン二酸それぞれの分離を示す。
ベータ酸化経路が部分的にブロックされた遺伝子改変生物を含むいくつかの実施態様において（図５〜８を参照）、使用に好適な供給材料としては、これらに限定されないが、再生可能な油の脂肪酸蒸留物または石鹸原料（パーム油の脂肪酸蒸留物、ダイズ油の石鹸原料、ヤシ油の石鹸原料）、再生可能な油（ヤシ油、パーム油、パーム核油、ダイズ油、トウモロコシ油など）が挙げられ、脂肪酸の鎖長は、実質的に単一の形態（例えば、実質的に純粋な形態）または混合物の形態で、Ｃ１０に等しいかまたはそれより長く、アルカンの鎖長は、実質的に単一の形態（例えば、実質的に純粋な形態）または混合物の形態で、Ｃ１０に等しいかまたはそれより長い。
天然に存在するおよび／または操作された経路を使用して、より長い鎖長を有する炭素源（例えば、長さが１２個またはそれより長い炭素）を代謝させて、図５〜８の下の部分に示されるベータ酸化経路を使用してさらに代謝させることができる分子を産出することもできる。いくつかの実施態様において、図５〜８に示される経路におけるベータ酸化活性はまた、代謝および標的生成物の形成が強化されるように操作されてもよい（例えば、本明細書で説明されるように）。いくつかの実施態様において、ベータ酸化経路のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性のうち１種が強化されるように操作され、いくつかの実施態様において、他のアシル−ＣｏＡオキシダーゼベータ酸化経路における活性が、活性が低減または除去されるように変更され、それによって望ましい鎖長の二酸または望ましい鎖長の分布を有する二酸の生産が最適化される。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、酵素の基質特異性が変更されるように選択および／または操作される。いくつかの実施態様において、異種および／または操作されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼの基質特異性は、約１２個の炭素から約１８個の炭素の炭素鎖長に対する基質特異性であり、いくつかの実施態様において、異種および／または操作されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼは、長さが１２個未満の炭素の基質において活性を示さない。いくつかの実施態様において、望ましい鎖長への特異性を有する異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、あらゆる好適な生物から単離できる。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属（Meyerozyma）、ロデロマイセス属（Lodderomyces）、シェフェルソマイセス属（Scheffersomyces）、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属（Lachancea）、ナカセオマイセス属（Nakaseomyces））、動物（例えば、ヒト属（Homo）、クマネズミ属（Rattus））、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、ニクトタニア属（Nictotania）、クフェア属）が挙げられる。
いくつかの実施態様において、中間体または長い鎖長（例えば、約１０個の炭素から２２個の炭素）の炭素源出発原料（例えば、アルカン、脂肪酸、脂肪族アルコール、ジカルボン酸）は、ベータ酸化経路への侵入のためにアシル−ＣｏＡ誘導体に変換される。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡ誘導体は、アシル−ＣｏＡリガーゼ酵素の活性によって生成できる。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡ誘導体は、その後、天然または変更された基質特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素（例えば、アシル−ＣｏＡオキシドレダクターゼおよび脂肪族アシル−補酵素Ａオキシダーゼとしても知られている）の活性によって酸化される。トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ誘導体である長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸またはジカルボン酸はさらに、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの活性によって３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換されてもよい。３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡは、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性によって３−オキソアシル−ＣｏＡに変換できる。３−オキソアシル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（例えば、また、ベータ−ケトチオラーゼおよびベータ−ケトチオラーゼとしても知られている）の活性によって、炭素２個分短くなったアシル−ＣｏＡ分子およびアセチル−ＣｏＡに変換されてもよい。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡ分子は、望ましい炭素鎖長（例えば、１０または１２個の炭素、それぞれセバシン酸またはドデカン二酸）が得られるまで、ベータ酸化により繰り返して短くされてもよい。短くされた脂肪酸をオメガ酸化を使用してさらにプロセシングして、ジカルボン酸（例えば、ドデカン二酸）を産出することもできる。
ベータ酸化活性
用語「ベータ酸化経路」は、本明細書で使用される場合、脂肪族アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸を代謝するのに利用される一連の酵素活性を指す。脂肪族アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸を代謝するのに利用される活性としては、これらに限定されないが、アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ活性、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性およびアセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性が挙げられる。用語「ベータ酸化活性」は、脂肪族アルコール、脂肪酸またはジカルボン酸を代謝するのに利用されるベータ酸化経路における活性のいずれかを指す。
ベータ酸化−アシル−ＣｏＡリガーゼ
アシル−ＣｏＡリガーゼ酵素は、時には、宿主生物によってコードされており、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、宿主のアシル−ＣｏＡリガーゼ活性は、アシル−ＣｏＡリガーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、アシル−ＣｏＡリガーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、または該遺伝子のコピー数を増加させて、該遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産が、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡリガーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。アシル−ＣｏＡリガーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属が挙げられる。
ベータ酸化−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素は、脂肪族アシルＣｏＡ上の不飽和β−炭素へのヒドロキシル基およびプロトンの付加を触媒し、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のコピー数を増加させること、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、または該遺伝子のコピー数を増加させて、該遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属が挙げられる。
ベータ酸化−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの活性によって作製された新たに形成されたヒドロキシル基から水素を除去することによって、３−ケトアシル−ＣｏＡの形成を触媒する。いくつかの実施態様において、この活性は、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物が生成するように追加または増加させることができる。いくつかの実施態様において、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主の３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させること、または該遺伝子のコピー数を増加させて、該遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産が、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属が挙げられる。
ベータ酸化−アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ
アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ−ケトチオラーゼ）酵素は、ＣｏＡの別の分子チオール基の３−ケトアシル−ＣｏＡを切断することによって、炭素２個分短くなった脂肪族アシル−ＣｏＡの形成を触媒する。チオールがＣ−２とＣ−３との間に挿入されて、アセチルＣｏＡ分子とそれより炭素２個分短いアシルＣｏＡ分子が産出する。アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のアセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ活性は、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、またはアセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、カンジダ属、サッカロミセス属、またはヤロウイア属が挙げられる。一つのタイプのアセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼは、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（例えば、「ａｃｏａｔ」）である。
ベータ酸化−エノイルＣｏＡイソメラーゼ
脂肪酸蒸留物および石鹸原料などの供給材料は、不飽和脂肪酸、例えばオレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、およびリノレン酸（Ｃ１８：３）などを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、不飽和脂肪酸は、二重結合の位置と方向を維持するジカルボン酸に変換される。これらのタイプの不飽和脂肪酸または二酸を酸化（例えば、ベータ酸化）させるために、細胞は追加の酵素を採用する可能性がある。いくつかの場合において、酵素エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ（ＥＣＩ）は、奇数の位置における二重結合での基質のベータ酸化に必要である。いくつかの場合において、酵素ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＤＣＲ）は、偶数の位置における二重結合での基質のベータ酸化に必要である。
エノイルＣｏＡイソメラーゼ（ＥＣＩ）はまた、エノイル−ＣｏＡデルタイソメラーゼ１、ドデセノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、３，２トランス−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、アセチレン−アレンイソメラーゼ、デルタ３、デルタ２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、ドデセノイル−ＣｏＡデルタイソメラーゼ、およびＥＣ５．３．３．８（例えばヒトにおいて）としても知られている可能性がある。また数種のオルタナティブスプライシングされた転写変異体も公知である。ＥＣＩは、ヒドラターゼ／イソメラーゼスーパーファミリーのメンバーである。ＥＣＩは、不飽和脂肪酸のベータ酸化に関与する主要なミトコンドリアの酵素である可能性がある。この酵素は、様々な種からの幅広いＥＣＩ酵素において、３−シスおよび３−トランス二重結合の両方を２−トランスの形態に異性化できる。ＥＣＩは、シス−、モノ−、およびポリ不飽和脂肪酸の段階的な分解中に生じた３−シスおよび３−トランス−エノイル−ＣｏＡエステルの、２−トランス−エノイル−ＣｏＡ中間体への変換を触媒できる。ＥＣＩは多くの微生物中に存在しており、数種の酵母種は、少なくとも２種のＥＣＩ酵素を有する。以下の表１に、カンジダ・ビスワナチイ（Ｃｖ）からの２種のＥＣＩ酵素、カンジダ・トロピカリス（Ｃｔ）からの２種のＥＣＩ酵素、ヤロウイア・リポリチカ（Ｙｌ）からの１種のＥＣＩ酵素、およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓｃ）からの１種のＥＣＩ酵素のアミノ酸配列同一性パーセントを記載する。表１において、「ｐ」は、「ポリペプチド」を指す。
いくつかの実施態様において、ＥＣＩは、その活性のために、さらにいくつかの供給材料（例えば、石鹸原料および脂肪酸蒸留物）においては二重結合の正常な位置のために重要な酵素である。多くの不飽和脂肪酸は、シス−Δ９二重結合を有する。シス−Δ９二重結合を有する炭素１８個の二酸のベータ酸化中、その鎖が１２個の炭素に短縮されたときに二重結合が相対する。この段階で、炭素１２個の分子は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼの基質ではないシス−Δ３二重結合を有する可能性がある。それゆえに、いくつかの場合において、ＥＣＩは、シス−Δ３二重結合をトランス−Δ２二重結合に変換するのに必要である。いくつかの場合において、ＥＣＩ反応の生成物は、ベータ酸化における第二の工程の基質であり、ＥＣＩは、ベータ酸化の特定の回でアシル−ＣｏＡオキシダーゼを効果的に迂回できる。いくつかの場合において、株が、Ｃ１２未満またはＣ１２に等しい（すなわち、１２個の炭素）供給材料に対して活性ではないアシル−ＣｏＡオキシダーゼを含む場合でさえも、活性なＥＣＩは、ベータ酸化の１回より多くの回数の短縮化を実行する可能性があり、それによりシス−Δ９二重結合を有する基質のために炭素１０個の生成物を生産する可能性がある。それゆえに、いくつかの実施態様において、酵母において（例えば、カンジダ株において）、ＥＣＩ遺伝子の破壊により（例えば、ノックアウトまたは欠失により）、望ましい鎖長（例えば、この場合では１２個の炭素）を超えた鎖の短縮化を防ぐ。いくつかの実施態様において、ＥＣＩ遺伝子発現の破壊（例えば発現のノックアウト）は、１０〜１８個の炭素を含む脂肪族ジカルボン酸の生産の増加をもたらす可能性がある。いくつかの実施態様において、ＥＣＩ遺伝子発現の破壊（例えば発現のノックアウト）は、１０、１２、１４、１６または１８個の炭素を含む脂肪族ジカルボン酸の生産の増加をもたらす可能性がある。いくつかの実施態様において、エノイルＣｏＡイソメラーゼ発現の破壊は、所定の供給材料（例えば、所定の石鹸原料または脂肪酸蒸留物）を使用した場合、１０、１２、１４、１６または１８個の炭素を含む脂肪族ジカルボン酸の生産を増加させることができる。
いくつかの実施態様において、ＥＣＩノックアウト（すなわちｅｃｉΔ）株は、鎖長が１２個未満の炭素の基質への活性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼの存在下でさえも、オレイン酸からＤＤＤＡを生産できる。
いくつかの実施態様において、不飽和脂肪酸を含む脂肪酸供給材料から生産された炭素１２個のジカルボン酸は、完全に飽和したＤＤＤＡ生成物に到達するために水素化を必要とする。
ベータ酸化−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ
ジエノイルＣｏＡレダクターゼ（ＤＣＲ、例えば、ＥＣ１．３．１．３４）は、トランス−２、シス−４ジエノイル−ＣｏＡ基質をトランス−３−エノイル−ＣｏＡ生成物に変換する補助的な酵素である（Gurvitz Aら（1997）JBC 272：22140〜22147）。
次いでトランス−３−エノイル−ＣｏＡは、酵素エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ（ＥＣＩ）によってトランス−２−エノイル−ＣｏＡに変換され、次いでこれは、β酸化における第二の酵素の基質になる。ＤＣＲ反応は、多くの場合、偶数の位置に二重結合を有する脂肪酸（例えば、リノール酸（Ｃ１８：２）およびリノレン酸（Ｃ１８：３））の完全なβ酸化に必要である。時には、これらの脂肪酸から生産された二酸も、完全なβ酸化のためにＤＣＲの活性を必要とする。二酸は、いずれかの末端から開始して酸化される場合もあるし（二末端β酸化）、時には二重結合を処理するのに必要な酵素は、いずれの方向からも同じである。これはなぜなら、偶数の位置に二重結合を有する偶数の二酸は、いずれかの末端からも偶数の位置を維持するためである（奇数の位置における二重結合の場合も同様である）。
この反応は、リノール酸およびリノレン酸などの偶数の位置に二重結合を有する脂肪酸の完全なベータ酸化に必須である可能性がある。望ましい最終的な二酸生成物の炭素鎖長に応じて、宿主細胞または操作された生物における１種またはそれより多くのＤＣＲ酵素の活性を増幅または低減させることのいずれかが有用な場合がある。８個またはそれより長いの炭素鎖長を有する二酸生成物の場合、宿主細胞において１種または全てのＤＣＲ酵素を低減または除去することが有用であるかまたは望ましい可能性がある。炭素８個未満の炭素鎖長を有する二酸生成物の場合、宿主細胞または操作された生物において１種またはそれより多くのＤＣＲ酵素の活性を増幅することが有用であるかまたは望ましい可能性がある。
表２は、ＥＣＩおよび／またはＤＣＲに欠失を含む株を使用して不飽和脂肪酸から生産される可能性がある二酸生成物の表である。Ｄｃｒ−株は、典型的には、専らＣ８：３二酸を生産する。いくつかの実施態様において、二酸生成物（例えば、アジピン酸セバシン酸、ＤＤＤＡ）を生産するのに利用された株において、ＤＣＲポリペプチドは、例えばＤＣＲ−コーディングポリヌクレオチドを破壊することによっては減少しない。いくつかの実施態様において、ＤＣＲポリペプチド生産を増加させて（例えば、内因性ＤＣＲ−コーディングポリヌクレオチドの追加のコピー数を導入すること；異種ＤＣＲ−コーディングポリヌクレオチドの１つまたはそれより多くのコピーを導入すること）、ポリ不飽和脂肪酸、例えばダイズまたはトウモロコシ油中によくみられるポリ不飽和脂肪酸からアジピン酸を生産する。
カンジダ・トロピカリスおよびカンジダ・ビスワナチイなどの酵母には、２つのＤＣＲ相同体があり、これらは多くの場合、ＤＣＲ１およびＤＣＲ２と称される。酵母サッカロミセス・セレビジエは、１つのＤＣＲ酵素を包含するが、酵母ヤロウイア・リポリチカは、少なくとも３つのＤＣＲ相同体を包含し、これらは本明細書において「ＤＣＲ１」、「ＤＣＲ２」および「ＤＣＲ３」とも称される。以下の表３および表４に、いくつかのＤＣＲ酵素の同一性パーセントを示し、ここで接頭辞Ｃｔは、カンジダ・トロピカリスであり、Ｃｖは、カンジダ・ビスワナチイであり、Ｓｃは、サッカロミセス・セレビジエであり、ＹＩは、ヤロウイア・リポリチカである。
水素化
不飽和の二酸は、時には、不飽和脂肪酸を含む供給材料から生産され、このような状況における完全に飽和した二酸の生産は、多くの場合、不飽和二酸の水素化を必要とする。例えば、Ｅｃｉ−、ｐｏｘ４Δ株中で１つまたはそれより多くの長鎖不飽和脂肪酸から生成した不飽和Ｃ６：１二酸は、好適な方法により二重結合を還元することによって完全に飽和したＣ６：０二酸に変換できる。水素化方法の非限定的な例としては、金属の化学触媒、非金属の化学触媒、酵素触媒など、またはそれらの組み合わせの使用が挙げられる。
水素化反応の非限定的な例を以下に示す。時には、水素源は、分子状の水素から供給され（例えば、化学触媒作用のケースにおいて）、時には、水素源は、酵素の補因子から提供され、このような補因子の非限定的な例としては、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ２などまたはそれらの組み合わせが挙げられる（例えば、酵素触媒作用のケースにおいて）。
いくつかの実施態様において、接触水素化は、好適な金属触媒を用いて実行され、金属触媒の非限定的な例としては、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、ニッケルなど、またはそれらの組み合わせが挙げられる。時には、触媒は均一系触媒であり、時には、触媒は不均一系触媒である。反応速度を増加させるために、高められた温度および／または圧力が採用される可能性がある。例えば、３４００ｋＰａで２．５時間、周囲温度で、炭素上の１０％Ｐｔ触媒を使用して、不飽和二酸（例えば、シス，シス−ムコン酸）を水素化してアジピン酸に変換することができる（Niuら（2002）Biotechnol. Prog. 18:201〜211）。いくつかの実施態様において、接触水素化は、フラストレイティド・ルイスペア化合物などの非金属の触媒を用いて起こる可能性もある（Welchら（2006）Science 314:1124〜1126）。
いくつかの実施態様において、酵素による水素化は、インビボまたはインビトロで、基質または生成物として不飽和二酸または脂肪酸を用いた酸化還元反応を触媒できる好適な天然の酵素または操作された酵素を用いて行われる。いくつかの実施態様において、酵素は、インビボで、飽和二酸生成物の不飽和二酸前駆体を生産する生物において、望ましい水素化反応を触媒できる天然の酵素の発現を増加させること、または非天然の酵素を発現させることによって利用できる。時には、インビトロでの反応において、望ましい水素化反応を触媒できる酵素を含有する生物の溶解産物、または精製もしくは単離された酵素調製物が利用される。好適な天然の酵素または操作された酵素の非限定的な例としては、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．３．１．８）、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号１．３．１．４４）、ステアロイル−ＣｏＡ９−デサチュラーゼ（ＥＣ番号１．１４．１９．１）など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、望ましい反応生成物（例えば、飽和二酸）は、正方向または逆方向（例えば、正反応または逆反応）で稼働する酵素によって生産される。
ジエノイルＣｏＡイソメラーゼ
ジエノイルＣｏＡイソメラーゼ（ＤＣＩ、例えば、ＥＣ番号５．３．３、Δ３，５，Δ２，４−ジエノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、Δ３，５，Δ２，４−ジエノイル−補酵素Ａイソメラーゼ）は、Δ３，５−ジエノイル−ＣｏＡからΔ２，４−ジエノイル−ＣｏＡへの異性化を触媒する補助的なβ酸化酵素である（例えば、図３３を参照）。この反応は、３，２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ（ＥＣＩ）が、Δ２，５−ジエノイル−ＣｏＡをΔ３，５−ジエノイル−ＣｏＡに変換するときに起こる主流ではないβ酸化経路の一部である。この生成物を完全に酸化させるために、ＤＣＩは、Δ３，５−ジエノイル−ＣｏＡをΔ２，４−ジエノイル−ＣｏＡに変換し、その後者は、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＤＣＲ）の基質である。ＤＣＲ反応の生成物は３−エノイル−ＣｏＡであり、これは、β酸化を介してそれを完全に酸化可能な２−エノイル−ＣｏＡに変換するＥＣＩの基質である。
ＤＣＩ酵素を、哺乳動物系で同定した。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）の遺伝子ＹＯＲ１８０ｃがＤＣＩとして同定されているが（Gurvitzら、J. Biol. Chem.（1999）274：24514〜24521）、Ｓ．セレビシエはＤＣＩ酵素活性を含有するものの、このような活性はＹＯＲ１８０ｃの遺伝子産物によっては提供されないことも示唆されている（Ntamackら、（2009）Biochim. Biophys. Acta 1791：371〜378）。
ラットおよびマウスからの公知のＤＣＩ酵素に対するＹｏｒ１８０ｃの同一性パーセントは極めて低い（表５）。マウスＤｃｉ１ｐに対する類似性に関して、カンジダ・トロピカリスおよびカンジダ・ビスワナチイのゲノムの配列アライメント検索を行ったところ、Ｓ．セレビシエのＹｏｒ１８０ｃより大きい同一性を有する配列が同定された。このような同定された配列は全てＣ末端のペルオキシソーム標的配列を有しており、これは、それらがペルオキシソーム区画を標的とすることを示す。同定された推定のカンジダ種のＤＣＩ酵素は、ジエノイル−ＣｏＡイソメラーゼ活性を含む可能性があり、さらにはエノイル−ＣｏＡイソメラーゼ活性も含む可能性がある。これらもまた、現在機能が未知の補助的なβ酸化酵素の可能性がある。
いくつかの推定のＤＣＩタンパク質の配列は、配列番号３８０９〜３８１２に示される。いくつかの実施態様において、ＤＣＩ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｃ．ビスワナチイにおける）は、望ましい二酸生成物の鎖長に応じて低減または増幅される。例えば、アジピン酸生産の場合、ＤＣＩ活性を増加させて、宿主生物における不飽和脂肪酸の生産性を向上させることができる（例えば、ＤＣＩ活性は、ＤＣＩを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つまたはそれより多くのコピーを挿入すること（例えば、内因性または外因性ポリヌクレオチドの１つまたはそれより多くのコピーを挿入すること）によって増加させることができる）。いくつかの実施態様において、Ｃ８およびそれより長い二酸の場合、ＤＣＩ活性は低減される（例えば、（ｉ）ＤＣＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＤＣＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターの破壊、欠失またはノックアウトを導入することによって）。
オメガ酸化活性
用語「オメガ酸化活性」は、アルカン、脂肪族アルコール、脂肪酸、ジカルボン酸、または糖を代謝するのに利用されるオメガ酸化経路における活性のいずれかを指す。脂肪族アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸を代謝するのに利用される活性としては、これらに限定されないが、モノオキシゲナーゼ活性（例えば、シトクロムＰ４５０活性）、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性（例えば、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性）、アルコールデヒドロゲナーゼ活性（例えば、脂肪のアルコールデヒドロゲナーゼ活性、または長鎖アルコールデヒドロゲナーゼ活性）、脂肪族アルコールオキシダーゼ活性、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、およびチオエステラーゼ活性が挙げられる。
オメガ酸化−モノオキシゲナーゼ
シトクロムＰ４５０酵素（例えば、モノオキシゲナーゼ活性）は、多くの場合、１つの酸素原子を有機基質（ＲＨ）に挿入し、同時に他の酸素原子を水に還元することを触媒する。基質のオメガ炭素に近い酸素原子の挿入により、元の開始基質のアルコール誘導体が産出する（例えば、脂肪族アルコールが産出する）。シトクロムＰ４５０は、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。
いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のモノオキシゲナーゼ活性は、シトクロムＰ４５０遺伝子のコピー数を増加させること、またはシトクロムＰ４５０遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、シトクロムＰ４５０遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。シトクロムＰ４５０酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
オメガ酸化−モノオキシゲナーゼレダクターゼ
シトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えば、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性）は、電子をシトクロムＰ４５０に移動させることによってシトクロムＰ４５０中のヘムチオレート部分の還元を触媒する。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子のコピー数を増加させること、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
オメガ酸化−アルコールデヒドロゲナーゼ
アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、脂肪族アルコールデヒドロゲナーゼ、長鎖アルコールデヒドロゲナーゼ）は、細胞の小胞体中で、アルコールから水素を除去して、アルデヒドまたはケトンならびに水素原子およびＮＡＤＨを産出することを触媒する。アルコールデヒドロゲナーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するために追加されてもよい。いくつかの実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。アルコールデヒドロゲナーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
オメガ酸化−脂肪族アルコールオキシダーゼ
脂肪族アルコールオキシダーゼ（例えば、長鎖アルコールオキシダーゼ、ＥＣ１．１．３．２０）酵素は、細胞のペルオキシソーム中で、長鎖アルコールの２つの分子に酸素を付加して、２つの長鎖アルデヒドと２分子の水とを産出することを触媒する。脂肪族アルコールオキシダーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、脂肪族アルコールオキシダーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主の脂肪族アルコールオキシダーゼ活性は、脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、または脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。脂肪族アルコールオキシダーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
オメガ酸化−アルデヒドデヒドロゲナーゼ
脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ）酵素は、長鎖アルデヒドから長鎖カルボン酸、ＮＡＤＨおよびＨ＋への酸化を触媒する。脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主の脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、または脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
オメガ酸化−チオエステラーゼ
チオエステラーゼ酵素（例えば、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性）は、アシル−ＣｏＡまたはアシルキャリアータンパク質（例えば、エステル化脂肪酸）などの脂肪酸から補酵素Ａまたはアシルキャリアータンパク質（例えば、ＡＣＰ）を除去して、脂肪酸およびアルコールを産出することを触媒する。この反応は、水および補酵素Ａの存在下で起こるか、またはチオール基においてアシルキャリアータンパク質が特異的に除去される。チオエステラーゼは、時には、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物を生成するのに追加されてもよい。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ活性は、宿主または操作された生物中で変化しない。いくつかの実施態様において、宿主のチオエステラーゼ活性は、チオエステラーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、またはチオエステラーゼ遺伝子の転写を調節するプロモーターの活性を増加させることによって増加させることができ、それにより標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産は、経路を介した炭素フラックス増加のために増加する。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ遺伝子は、あらゆる好適な生物から単離できる。チオエステラーゼ酵素を包含するかまたはそのためのドナーとして使用できる生物の非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、メイエロザイマ属、ロデロマイセス属、シェフェルソマイセス属、クラビスポラ属、ヤロウイア属、ピチア属、クルイベロマイセス属、エレモテシウム属、チゴサッカロミセス属、ラチャンセア属、ナカセオマイセス属）、動物（例えば、ヒト属、クマネズミ属）、細菌（例えば、エシェリキア属、シュードモナス属、バチルス属）、または植物（例えば、シロイヌナズナ属、ニクトタニア属、クフェア属）が挙げられる。
操作された経路
図１〜８は、様々なアルカン、脂肪酸、脂肪族アルコールまたはそれらの組み合わせを使用してセバシン酸およびドデカン二酸を作製するための生物学的経路の実施態様を表す。供給材料として、あらゆる好適なアルカン、脂肪酸、脂肪族アルコール、植物ベースの油、種子ベースの油、石油以外から得られた石鹸原料または同種のもの（例えば、ドデカン、ラウリン酸メチル、ラウリン酸、１０個またはそれより多い炭素を有する炭素源（例えばセバシン酸生産の場合）または１２個またはそれより多くの炭素を有する炭素源（例えばドデカン二酸生産の場合））が、生物に使用できる。いくつかの実施態様において、天然に存在するおよび／または操作された経路を使用して、１２個より長い炭素を有する炭素源を代謝させて、図５〜８の下の部分に示されるベータ酸化経路を使用してさらに代謝させることができる分子を産出することもできる。いくつかの実施態様において、図１〜８に表された経路における活性は、本明細書で説明されるように、代謝および標的生成物の形成が強化されるように操作されてもよい。
いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの代謝経路における１種またはそれより多くの活性は、操作された経路を介して炭素フラックスを増加させて、望ましい生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）が生産されるように操作されてもよい。操作された活性は、１種またはそれより多くの他の操作された経路で利用できる代謝中間体の生産を増加させて、未改変の宿主生物と比べて望ましい生成物の生産の増加が達成されるように選ぶことができる。また操作された活性は、望ましい中間体または最終産物の生産を低減させて、酵素の活性が減少されるように選ぶこともできる（例えば、逆の活性）。この「炭素フラックスの管理」は、適切な経路における適切な活性を操作することによりあらゆる選ばれた供給材料ごとに最適化できる。純粋なアルカン（例えば、単一の鎖長アルカン、ドデカンなど）、混合鎖長アルカン、長鎖アルカン、純粋な脂肪酸（例えば、単一の鎖長脂肪酸、カプリン酸など）および混合鎖長脂肪酸（図１〜８を参照）を使用した非限定的な例が本明細書で示される。いくつかの実施態様において、操作された経路を介した「炭素フラックス操作」プロセスは、あらゆる所定の供給材料に関して計算された最大理論収量に近いレベルおよび比率でジカルボン酸（例えばセバシン酸またはドデカン二酸）を生産する。用語「理論収量」または「最大理論収量」は、本明細書で使用される場合、反応が完了まで行った場合に形成される可能性がある化学的または生物学的反応の生成物の収量を指す。理論収量は、出発原料が完全に消費され、望ましくない副反応が起こらず、逆反応が起こらず、ワークアップ手法中の損失がない反応の化学量論および理想的な条件に基づく。
微生物は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）経路における１種またはそれより多くの活性を包含するかまたはそれらを調節するように改変され操作されてもよい。用語「活性」は、本明細書で使用される場合、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）およびその前駆体などの様々な生成物が産出されるように微生物の天然のまたは操作された生物学的経路が機能化されることを指す。いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する活性は、あらゆる非哺乳動物源によって提供できる。このような源としては、これらに限定されないが、酵母および菌類などの真核生物、ならびに細菌などの原核生物が挙げられる。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される経路における逆の活性を変更（例えば、破壊、低減）して、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路、またはベータ酸化およびオメガ酸化経路を介した、標的生成物の生産（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）への炭素フラックスを増加させてもよい。いくつかの実施態様において、遺伝学的改変は、ベータ酸化経路における活性を破壊するか、またはベータ酸化経路における正反応を実行するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊し、それによりベータ酸化活性が検出不可能になる。用語「検出不可能」とは、本明細書で使用される場合、公知の（例えば、本明細書で説明された）検出方法またはアッセイを使用した場合、検出限界未満の分析物の量を指す。いくつかの実施態様において、遺伝学的改変は、ベータ酸化活性を部分的に低減させる。用語「ベータ酸化活性を部分的に低減させる」は、ここで使用される場合、操作された生物における活性のレベルが、宿主または開始時の生物で見出される活性のレベルよりも低くなることを指す。
いくつかの実施態様において、ベータ酸化活性は、選ばれた活性の触媒特異性が変更されるように改変してもよい。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、炭素鎖長の選択および／または特異性に関して触媒ドメインを改変することによって変更されてもよい。いくつかの実施態様において、変更された触媒特異性は、宿主生物の天然に存在する変異体または突然変異体集団をスクリーニングすることによって見出すことができる。いくつかの実施態様において、変更された触媒性は、望ましい活性に関して選択および／またはスクリーニングすることと共に、様々な変異誘発技術によって生成できる。いくつかの実施態様において、変更された触媒活性は、混合および適合アプローチを使用してキメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼを生成し、続いて望ましい触媒活性に関して選択および／またはスクリーニングすることによって生成できる。触媒活性が変更されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼを生成するために行われる実験の例が、本明細書で説明される。
本明細書で示される操作された微生物内の活性は、以下の活性：６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性；６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性；シトクロムＰ４５０活性；シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性；脂肪族アルコールオキシダーゼ活性；アシル−ＣｏＡリガーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性；エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、脂肪酸シンターゼ活性、リパーゼ活性、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ）およびチオエステラーゼ活性（例えば、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ、ベータ−ケトチオラーゼおよび同種のもの）のうち１種またはそれより多く（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４種または全て）を包含していてもよい。いくつかの実施態様において、前述の活性のうち１種またはそれより多く（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種または全て）は、遺伝学的改変によって変更される。いくつかの実施態様において、前述の活性のうち１種またはそれより多く（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４種または全て）は、（ｉ）該活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを追加すること、および／または（ｉｉ）該活性を有するポリペプチドの発現を調節する調節配列を変更または追加することによって変更される。いくつかの実施態様において、前述の活性のうち１種またはそれより多くは、（ｉ）該活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドを破壊すること（例えば、挿入変異誘発）、（ｉｉ）該活性を有するポリペプチドの発現を調節する調節配列を欠失させること、および／または（ｉｉｉ）該活性を有するポリペプチドをコードするコード配列を欠失させること（例えば、ノックアウト変異誘発）によって変更される。
用語「オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、オメガヒドロキシル脂肪酸からオメガオキソ脂肪酸への変換を指す。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性は、ポリペプチドによって提供できる。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種ヌクレオチド配列によってコードされている。いくつかの実施態様において、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する内因性ポリペプチドが宿主微生物中で同定されたら、宿主微生物を遺伝子操作して、生産されるポリペプチドの量を増加させる（例えば、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された異種プロモーターを導入する；そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる（例えば、そのポリヌクレオチドを包含するプラスミドを導入することによって））。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を付与する核酸配列は、アクチノバクター属（Actinobacter）、ノルカルディア属、シュードモナス属およびザントバクター属の細菌などの多数の源から得ることができる。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書で示されている。オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。いくつかの実施態様において、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性は、宿主微生物中で変更されず、いくつかの実施態様において、該活性は、宿主微生物と比べて、操作された微生物中で追加または増加される。
用語「モノオキシゲナーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、Ｏ２のうち一方の酸素原子を有機基質（ＲＨ）に挿入して、他方の酸素原子を水に還元することを指す。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、炭素６個の有機基質に酸素原子を取り入れることを指す。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、ヘキサノアートから６−ヒドロキシヘキサン酸への変換を指す。モノオキシゲナーゼ活性は、あらゆる好適なポリペプチド、例えばいくつかの実施態様においてはシトクロムＰ４５０ポリペプチド（以降、「ＣＹＰ４５０」）によって提供できる。ＣＹＰ４５０活性を付与する核酸配列は、バチルス・メガテリウムなどの多数の源から得てもよいし、これらに限定されないが、カンジダ・トロピカリス、ヤロウイア・リポリチカ、アスペルギルス・ニダランス、およびアスペルギルス・パラスティカスなどの生物中で誘導されてもよい。ＣＹＰ４５０活性を有するポリペプチド（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１２ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１３ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１４ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１５ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１６ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１７ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１８ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１９ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ２０ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ｄ２ポリヌクレオチド、および／またはＢＭ３ポリヌクレオチド）をコードするポリヌクレオチド配列を単離するのに利用されるオリゴヌクレオチド配列の例は、本明細書で示されている。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、宿主微生物中で変更されず、いくつかの実施態様において、該活性は、宿主微生物と比べて、操作された微生物中で追加または増加される。いくつかの実施態様において、変更されたモノオキシゲナーゼ活性は、内因性の活性であり、いくつかの実施態様において、変更されたモノオキシゲナーゼ活性は、外因性の活性である。いくつかの実施態様において、外因性の活性は、モノオキシゲナーゼとモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性との両方を有する単一のポリペプチドである（例えば、Ｂ．メガテリウムのシトクロムＰ４５０：ＮＡＤＰＨＰ４５０レダクターゼ）。
シトクロムＰ４５０活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。例えば、検出は、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ５２Ａファミリー）およびＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼを含有する反応をアッセイすることによって行うことができる（Appl Environ Microbiol 69：5983および5992を参照）。簡単に言えば、標準条件下で細胞を増殖させて、マイクロソーム生産のために回収し、ＣＹＰ活性を使用してＣＹＰ活性を検出する。トリス緩衝化スクロース（ｐＨ７．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５Ｍスクロース）中で細胞を溶解させることによりマイクロソームを調製する。まず２５，０００×ｇで、次いで１００，０００×ｇで分画遠心分離を行い、死細胞片、次いでマイクロソームをそれぞれペレット化する。マイクロソームのペレットを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁して、タンパク質をおよそ１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にする。１ｍＬ中およそ０．３ｍｇのマイクロソーム、０．１ｍＭヘキサン酸ナトリウム、０．７ｍＭのＮＡＤＰＨ、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス−ＨＣｌを含有する反応混合物をＮＡＤＰＨの添加により反応開始させ、３７℃で１０分間インキュベートする。０．２５ｍＬの５ＭのＨＣｌの添加によって反応を止め、内部標準として０．２５ｍＬの２．５ｕｇ／ｍＬの１０−ヒドロキシデカン酸（３．３ｎｍｏｌ）を添加する。この混合物を、ＮａＣｌ飽和条件下で４．５ｍＬのジエチルエーテルで抽出する。有機相を新しいチューブに移し、乾燥するまで蒸発させる。１０ｍＭの３−ブロモメチル−７−メトキシ−１，４−ベンズオキサジン−２−オン（ＢｒＭＢ）を含有するアセトニトリル中で残留物を溶解させ、アセトニトリル中０．１ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬの１８−クラウン−６をＫ２ＣＯ３で飽和させる。この溶液を４０℃で３０分間インキュベートし、その後０．０５ｍＬの２％酢酸を添加する。４３０ｎｍでの検出および３５５ｎｍでの励起を用いたＨＰＬＣにより、蛍光標識したオメガ−ヒドロキシ脂肪酸を検出する（Yamadaら、1991、Anal.Biochem 199：132〜136）。場合によっては、特異的に誘導されたＣＹＰ遺伝子は、ノーザンブロッティングおよび／または定量ＲＴ−ＰＣＲによっても検出できる（Craftら、2003、AppEnvironMicro 69：5983〜5991）。
用語「モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性」は、本明細書で使用される場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＦＭＮ、またはＦＡＤから電子を電子移動連鎖を経由して移動させ、シトクロムＰ４５０のヘム第二鉄を第一鉄の状態に還元することを指す。また用語「モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性」は、本明細書で使用される場合、電子輸送系を介して第二の電子を移動させ、二酸素付加物を負電荷を有するペルオキソ基に還元することを指す場合もある。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性は、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を有するポリペプチドのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−結合ドメインにＮＡＤ（Ｐ）Ｈが結合できる共役二工程反応で、２電子供与体のＮＡＤ（Ｐ）ＨからシトクロムＰ４５０のヘムに電子を供与することができ（例えば、モノオキシゲナーゼ活性）、電子は、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＦＡＤおよびＦＭＮを介してモノオキシゲナーゼ活性のヘムに戻ることによって、活性なモノオキシゲナーゼ活性（例えば、シトクロムＰ４５０）を再生する。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、あらゆる好適なポリペプチド、例えばシトクロムＰ４５０レダクターゼのポリペプチド（以降、「ＣＰＲ」）によって提供できる。ＣＰＲ活性を付与する核酸配列は、多数の源から得てもよいし、および／または多数の源において誘導されてもよい、このような源としては、これらに限定されないが、バチルス・メガテリウム、カンジダ・トロピカリス、ヤロウイア・リポリチカ、アスペルギルス・ニダランス、およびアスペルギルス・パラスティカスが挙げられる。ＣＰＲ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を単離するのに利用されるオリゴヌクレオチド配列の例は、本明細書で示されている。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、宿主微生物中で変更されず、いくつかの実施態様において、該活性は、宿主微生物と比べて、操作された微生物中で追加または増加される。いくつかの実施態様において、変更されたモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、内因性の活性であり、いくつかの実施態様において、変更されたモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、外因性の活性である。いくつかの実施態様において、外因性の活性は、モノオキシゲナーゼとモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性との両方を有する単一のポリペプチドである（例えば、Ｂ．メガテリウムのシトクロムＰ４５０：ＮＡＤＰＨＰ４５０レダクターゼ）。
ＣＰＲ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。例えば、宿主微生物と比べてＣＰＲ活性をコードする遺伝子の数を増加させた操作された微生物は、定量的な核酸検出方法（例えば、サザンブロッティング、ＰＣＲ、プライマー伸長など、およびそれらの組み合わせ）を使用して検出できる。宿主微生物と比べてＣＰＲ活性をコードする遺伝子の発現を増加させた操作された微生物は、定量的な発現ベースの分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、ノーザンブロット分析など、およびそれらの組み合わせ）を使用して検出できる。あるいは、酵素的なアッセイを使用してシトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を検出してもよく、この場合、酵素活性は、基質溶液の５５０ナノメートルにおける光学的吸光度を変更する（Masters, B.S.S.、Williams, C.H.、Kamin, H.（1967）Methods in Enzymology, X、565〜573）。
アシル−ＣｏＡオキシダーゼ
用語「アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、長鎖脂肪族アシル−ＣｏＡから、トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ脂肪族アルコールへの酸化を指す。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡ活性は、ペルオキシソーム由来である。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、ＰＯＸポリペプチドによって実行されたペルオキシソームのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ）活性である。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物が生成されるように変更されてもよい。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のＰＯＸ４およびＰＯＸ５遺伝子によってコードされている。いくつかの実施態様において、内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を、増加させることができる。いくつかの実施態様において、ＰＯＸ４ポリペプチドまたはＰＯＸ５ポリペプチドのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、互いに独立して変更されてもよい（例えば、ＰＯＸ４単独の活性、ＰＯＸ５単独の活性を増加させる、一方を増加させて他方を破壊する、など）。いくつかの実施態様において、一方のＰＯＸ活性の活性を増加させつつ他方のＰＯＸ活性の活性を破壊することは、炭素鎖長に関するアシル−ＣｏＡオキシダーゼの特異的な活性を変更しつつ、ベータ酸化経路を介した全体的なフラックスを維持したりまたは増加させたりすることを可能にする。
いくつかの実施態様において、ＰＯＸ遺伝子のうち１つの宿主におけるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、生産されるポリペプチドの量を遺伝学的に変更することによって（例えば、増加させることによって）（例えば、強く転写される、または構成的に発現される異種プロモーターを、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結して導入することによって）；該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させることによって（例えば、該ポリヌクレオチドを包含するプラスミドの導入、宿主ゲノムへの追加のコピーの統合によって））増加させることができる。いくつかの実施態様において、宿主のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト、挿入変異誘発など、およびそれらの組み合わせ）によって、またはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を転写するプロモーター（例えば、プロモーターまたは５’ＵＴＲへのリプレッサー配列の追加）の活性を減少させることによって、減少させることができる。
上述したように、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５をコードするヌクレオチド配列の破壊は、時には、長さが異なる炭素鎖（例えば、長さが約１〜約６０個の炭素の脂肪族アルコール、脂肪酸、パラフィン、ジカルボン酸などの炭素鎖）の代謝に関して、経路の効率、特異性および／または特異的な活性を変更する可能性がある。いくつかの実施態様において、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５のヌクレオチド配列を選択マーカーをコードするＵＲＡ３ヌクレオチド配列で破壊して、宿主微生物に導入することにより、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５活性が欠損した操作された生物が生成される。ＰＯＸ４およびＰＯＸ５をコードする核酸配列は、例えばカンジダ・トロピカリスなどの多数の源から得ることができる。ＰＯＸ４およびＰＯＸ５のアミノ酸配列およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の例は、本明細書で示されている。ＰＯＸ５遺伝子によってコードされた活性を増幅するために行われた実験は、実施例で説明される。
これも上述したように、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（例えば、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５）の触媒特異性は、様々な方法によって変更できる。アシル−ＣｏＡオキシダーゼの結合および／または触媒特異性を変更することは、鎖長認識が変更され、鎖長の触媒活性が変更された新規のアシル−ＣｏＡオキシダーゼの生成、および／または制限された、または特異的な鎖長特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の生成に関して有利であることが証明される可能性があり、それによって異なる長さの炭素鎖の代謝または特定の選ばれた供給材料で見出される炭素鎖分布の代謝に関して経路の効率、特異性および／または特異的な活性におけるさらなる増加がもたらされる。いくつかの実施態様において、（ｉ）天然に存在する変異体集団をスクリーニングすること；（ｉｉ）内因性配列の変異誘発；（ｉｉｉ）望ましい特異性を有する異種配列を導入すること；（ｉｖ）１つのポリヌクレオチド源（例えば、遺伝子、生物）からのコード配列の部分および別の源からのコード配列の部分を有するキメラ配列を生成すること、ならびに／または（ｖ）内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼを再構築するための、望ましい特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼからのヌクレオチド配列および３次元構造分析を使用したインテリジェントデザインによって、変更されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ配列が同定および／または生成され、それにより、新規の特異性酵素を生成することができる。いくつかの実施態様において、キメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼ配列は、２種またはそれより多くの源からのポリヌクレオチド配列の寄与分を有する可能性がある。いくつかの実施態様において、キメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼ配列は、内因性ポリヌクレオチドからのコード配列の部分と、異種ポリヌクレオチドからのコード配列の部分とを含む。新規の触媒性および結合特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼを同定および／または生成するのに利用される方法が、実施例で説明される。
望ましい特異性を有する異種アシルＣｏＡオキシダーゼ配列の導入
何千種ものアシルＣｏＡオキシダーゼおよびアシルＣｏＡ様オキシダーゼが、クローニングされ、配列決定され、様々な生物から単離されている（配列番号５１〜配列番号３６７３および配列番号３８１０〜配列番号３８８２）。これらの酵素の多くは、選択的な基質特異性を有する触媒活性を有することが報告されている。例えば、いくつかのアシルＣｏＡオキシダーゼ（例えば、カンジダ株からのＰｏｘ５ｐ）は、１２〜１８個の炭素を有する基質で最適な活性を示す（図２１）。いくつかの実施態様において、生物（例えば、酵母）または遺伝子改変生物（例えば、遺伝子改変酵母、例えば、β酸化活性がブロックされている酵母）は、選択的な基質特異性を有する異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼが発現されるように操作される。いくつかの実施態様において、生物（例えば、酵母）または遺伝子改変生物（例えば、遺伝子改変酵母、例えば、β酸化活性がブロックされている酵母）は、配列番号５１〜配列番号３６７３から選択されるアシル−ＣｏＡオキシダーゼまたはアシルＣｏＡ様オキシダーゼが発現されるように操作される。いくつかの実施態様において、生物（例えば、酵母）または遺伝子改変生物（例えば、遺伝子改変酵母、例えば、β酸化活性がブロックされている酵母）は、配列番号３８１０〜配列番号３８８２から選択されるアシル−ＣｏＡオキシダーゼまたはアシルＣｏＡ様オキシダーゼが発現されるように操作される。
アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。例えば、Shimizuら、1979で説明されているような酵素的なアッセイを使用して、本明細書における実施例で説明されるようにして、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５および他のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を査定できる。その代わりに、天然および／または破壊されたＰＯＸ４およびＰＯＸ５配列を表す核酸配列はまた、核酸検出方法（例えば、ＰＣＲ、プライマー伸長、核酸ハイブリダイゼーションなど、およびそれらの組み合わせ）、または定量的な発現ベースの分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、ノーザンブロット分析など、およびそれらの組み合わせ）を使用しても検出でき、この場合、改変生物は、宿主生物と比較して、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドレベルの減少を示す。
アシル−ＣｏＡオキシダーゼの遺伝学的改変
β酸化の律速段階は、酵素アシルＣｏＡオキシダーゼによって実行された経路における第一の工程である。異なるアシル−ＣｏＡオキシダーゼは、異なる鎖長基質特異性を提示する可能性がある。いくつかのアシルＣｏＡオキシダーゼは広範な鎖長特異性を提示し、基質としてあらゆる脂肪族アシルＣｏＡ（またはジアシル−ＣｏＡ）を受容できる。しかしながら、いくつかのアシルＣｏＡオキシダーゼは、狭い鎖長特異性を提示する可能性がある。
例えば、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのＰｏｘ５酵素は、Ｃ１０未満の基質には活性の減少を提示し（図２１）、Ｃ６およびＣ８の基質には低い活性を有する。唯一の機能的なアシルＣｏＡオキシダーゼとしてＰｏｘ５を有する細胞において、長鎖脂肪族アシル−ＣｏＡまたはジアシル−ＣｏＡ基質は、約８個の炭素に短縮化される可能性があり、典型的にはβ酸化の別のサイクルには侵入しない。より短い基質（例えば、Ｃ８脂肪族ジカルボン酸）は、典型的にはＰｏｘ５によって基質として認識されず、ＣｏＡはペルオキシソームのチオエステラーゼによって除去され、この細胞から脂肪族ジカルボン酸（例えば、α，ω−ジカルボン酸）生成物が分泌される。この実施態様において、アシルＣｏＡオキシダーゼの鎖長基質特異性は、生産された二酸の鎖長を効果的に制御する。
いくつかの実施態様において、酵母におけるβ酸化経路は活性であり、遺伝子改変アシルＣｏＡオキシダーゼを包含する。いくつかの実施態様において、アシルＣｏＡオキシダーゼは、脂肪族アシル−ＣｏＡまたはジアシル−ＣｏＡ基質の完全な酸化が防がれるように遺伝子改変される。アシルＣｏＡオキシダーゼの遺伝学的改変は、望ましい脂肪酸または脂肪族ジカルボン酸生成物の生産収量を増加させることができる。それゆえに、いくつかの実施態様において、特定の鎖長（例えば、望ましいまたは標的の脂肪酸もしくは脂肪族ジカルボン酸生成物の鎖長）を有する脂肪酸の代謝分解は、アシルＣｏＡオキシダーゼが遺伝子改変されると有意に低減される。いくつかの実施態様において、ベータ酸化による脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、ＤＤＤＡ）の代謝分解は、アシルＣｏＡオキシダーゼが遺伝子改変されると有意に低減される。これは、望ましい生成物の鎖長より短い鎖長に対して酵素が低い活性（例えば、酵素活性）を有するようにアシルＣｏＡオキシダーゼの基質特異性を改変することによって達成できる。
いくつかの実施態様において、Ｃ２４（すなわち、２４個の炭素）未満の鎖長を有する脂肪族分子に対して酵素が低い活性を有するように、アシルＣｏＡオキシダーゼの基質特異性が改変される。いくつかの実施態様において、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６または４個未満の炭素鎖長に対して酵素が極めて低い活性を有するように、アシルＣｏＡオキシダーゼの基質特異性が改変される。いくつかの実施態様において、１８、１６、１４、１２、１０または８個未満の炭素鎖長に対して酵素が極めて低い活性を有するように、アシルＣｏＡオキシダーゼの基質特異性が改変される。いくつかの実施態様において、Ｃ１２未満の鎖長に対して酵素が極めて低い活性を有するように、アシルＣｏＡオキシダーゼの基質特異性が改変される。いくつかの実施態様において、Ｃ１０未満の鎖長に対して酵素が極めて低い活性を有するように、アシルＣｏＡオキシダーゼの基質特異性が改変される。
いくつかの実施態様において、遺伝子改変アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子は、インビトロでの改変された酵素の基質特異性を試験するために、好適な生物（例えば、細菌（例えば、大腸菌）または酵母）中で操作されて発現される。いくつかの実施態様において、遺伝子改変アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子は、好適な酵母中で操作されて発現され、基質特異性が試験される。いくつかの実施態様において、改変されたアシルＣｏＡオキシダーゼを発現する酵母は、望ましい脂肪酸または脂肪族ジカルボン酸生成物の生産に関して試験される。改変されたアシルＣｏＡオキシダーゼは、あらゆる好適な方式で生成でき、以下にその非限定的な例を示す。
アシル−ＣｏＡオキシダーゼのランダム変異誘発
遺伝子改変アシルＣｏＡオキシダーゼのライブラリーは、当業界公知の数種の方法（例えば、部位特異的変異誘発）を使用して生成できる。次いで遺伝子改変アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子は、好適な酵母株（例えば、カンジダ属（例えば、カンジダ・ビスワナチイまたはカンジダ・トロピカリス））のβ酸化がブロックされた株に形質転換させることができる。いくつかの実施態様において、遺伝子改変アシルＣｏＡオキシダーゼは、ｐｏｘ４Δ／ｐｏｘ４Δｐｏｘ５Δ／ｐｏｘ５Δ（例えば、内因性アシルＣｏＡオキシダーゼ活性が欠失した生物）のバックグラウンドにおいて、ＰＯＸ４プロモーターまたは別の強い構成的または誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施態様において、遺伝子改変アシルＣｏＡオキシダーゼは、内因性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施態様において、遺伝子改変アシルＣｏＡオキシダーゼは、異種プロモーターの制御下で発現される。形質転換株は、対象の二酸生成物より２つ多い炭素を有する脂肪酸を含有する脂肪酸またはメチル誘導体脂肪酸中での増殖によって選択できる。例えば、アジピン酸の場合、形質転換株は、カプリル酸またはカプリル酸メチル中で増殖させることができる。例えば、ドデカン二酸の場合、形質転換株は、テトラデカン二酸中で増殖させることができる。次いで形質転換株の集団を、増殖中の細胞を殺す物質（例えば、ナイスタチン）の存在下で対象の脂肪酸（例えばドデカン二酸）である炭素源を含む培地に移し、炭素源（例えば、この例ではドデカン二酸）を代謝できない細胞を選択できる。次いで結果得られた改変された株をさらに、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性に関して特徴付けることができる。この方法は、あらゆる改変されたアシルＣｏＡオキシダーゼ（例えば、本明細書における表に列挙され、および／または説明されているもの）に関して選択するのに使用できる。加えてこの方法は、好適な生物で発現されるあらゆる異種アシルＣｏＡオキシダーゼ（例えば、配列番号５１〜３２７３および配列番号３７２８〜３８１０に列挙したもの）に関して選択するのに使用できる。
アシル−ＣｏＡオキシダーゼの合理的な変異誘発
変更された特異性に関してアシル−ＣｏＡオキシダーゼにおける試験しようとする特定の突然変異を決定するために、構造および配列の情報ならびに実験データを組わせることができる。例えば、試験されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼの一次配列を比較し、基質特異性と相関させることができる。このような分析に基づき、望ましい基質特異性を提供することに関して、単一のアミノ酸、少数の連続したアミノ酸および／またはドメインを提案できる。これらのアミノ酸位置を、特異性を向上させるための特異的またはランダム突然変異のための標的とすることができる。
またアシルＣｏＡオキシダーゼの構造を、当業界公知のモデリング方法を使用して公知の３次構造に対してモデル化してもよい。モデルは、基質の選択性に関するアミノ酸および領域を提案するのに使用できる。例えば、生化学、構造および配列のデータから、多くの場合、アシルＣｏＡオキシダーゼのＮ末端が部分的に基質特異性を決定することが示唆される。このような分析に基づいて突然変異または領域の置き換えを導入してもよいし、新しいアシルＣｏＡオキシダーゼの特異性を以前に説明されたようにして試験してもよい。新しい可能性のある突然変異を仮定するために、結果得られた情報をモデルに戻すのに使用してもよい。ランダム変異誘発に関して、基質特異性を変更するために、あらゆる好適なアシルＣｏＡオキシダーゼ（例えば、配列番号５１〜３２７３および配列番号３７２８〜３８１０で列挙されたもの）。
用語「アシルＣｏＡオキシダーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、アシルＣｏＡオキシダーゼの酵素活性（例えば、触媒活性）を指す。アシルＣｏＡオキシダーゼは、以下の化学反応を触媒できる：
アシル−ＣｏＡ＋Ｏ２⇔トランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ２。
いくつかの実施態様において、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性は、長鎖脂肪族アシル−ＣｏＡからトランス−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ脂肪族アルコールへの酸化を指す。いくつかの実施態様において、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性は、選択的な基質群におけるその酵素活性（またはそれらの欠如）を指す。アシルＣｏＡオキシダーゼの活性は、基質と結合し、基質を酸化させるかおよび／または生成物を放出するその能力によって影響を受ける可能性がある。いくつかの実施態様において、アシルＣｏＡオキシダーゼは、細胞のある区画では活性であるが、細胞の別の区画では活性ではない。いくつかの実施態様において、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性は、ペルオキシソーム由来である。いくつかの実施態様において、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性は、ＰＯＸポリペプチドによって実行されたペルオキシソームのアシルＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ）活性である。いくつかの実施態様において、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性は、宿主生物によってコードされており、時には、操作された生物が生成されるように変更されてもよい。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、カンジダ種のＰＯＸ４およびＰＯＸ５遺伝子によってコードされていてもよい。いくつかの実施態様において、内因性アシルＣｏＡオキシダーゼ活性は、増加させてもよい。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くのアシルＣｏＡオキシダーゼを含有する生物中のアシルＣｏＡオキシダーゼは、独立して改変させてもよい（例えば、１種またはそれより多くのアシルＣｏＡオキシダーゼが改変されてもよい）。いくつかの実施態様において、ＰＯＸ４ポリペプチドまたはＰＯＸ５ポリペプチドのアシルＣｏＡオキシダーゼ活性は、互いに独立して変更させてもよい（例えば、ＰＯＸ４単独の活性、ＰＯＸ５単独の活性を増加させる、一方を増加させて他方を破壊する、など）。いくつかの実施態様において、一方のＰＯＸ活性の活性を増加させつつ他方のＰＯＸ活性の活性を破壊することは、炭素鎖長に関してアシルＣｏＡオキシダーゼの特異的な活性を変更し、同時にベータ酸化経路を介した全体的なフラックスを維持またはを増加させる可能性がある。
いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くのアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の宿主活性は、生産されるポリペプチドの量を遺伝学的に変更すること（例えば、増加させること）によって増加させてもよい（例えば、強く転写されるかまたは構成的に発現される異種プロモーターを、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに導入して作動可能に連結させ；該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させる（例えば、該ポリヌクレオチドを包含するプラスミドを導入し、宿主ゲノム中に追加のコピーを統合させることによって））。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くのアシルＣｏＡオキシダーゼの宿主活性は、アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の破壊（例えば、ノックアウト、挿入変異誘発など、およびそれらの組み合わせ）によって、またはアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を転写するプロモーターの活性を減少させること（例えば、プロモーターまたは５’ＵＴＲへのリプレッサー配列の付加）によって減少させてもよい。
上述したように、１種またはそれより多くのアシルＣｏＡオキシダーゼ（例えば、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５）をコードするヌクレオチド配列の破壊は、時には、長さが異なる炭素鎖（例えば、長さが約１〜約６０個の炭素の脂肪族アルコール、脂肪酸、パラフィン、ジカルボン酸、脂肪族分子などの炭素鎖）の代謝に関して、経路の効率、特異性および／または特異的な活性を変更する可能性がある。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くのアシルＣｏＡオキシダーゼ（例えば、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、またはＰＯＸ４およびＰＯＸ５）のヌクレオチド配列を選択マーカーをコードするＵＲＡ３ヌクレオチド配列で破壊して、宿主微生物に導入することにより、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性が欠損した操作された生物が生成される。
基質特異性を変更するためのカンジダのＰｏｘ４およびＰｏｘ５の部位特異的変異誘発
いくつかの実施態様において、ＰＯＸ５の活性プロファイルを変更するために、ＰＯＸ５の基質結合ポケット（例えば、ヘリカルドメイン３（表２９を参照））中かまたはその近傍に位置するアミノ酸残基中に位置する残基が、突然変異される（例えば、欠失または置換される）。いくつかの実施態様において、ＰＯＸ５または関連酵素の活性プロファイルを変更するために、ＰＯＸ５中のアミノ酸４２８および／または４２９、または関連酵素中の対応する残基（例えば、表２９の関連酵素および対応する残基を参照）は、ヘリカルドメイン３に位置しており、独立して突然変異される（例えば、欠失または置換される）。時には、アミノ酸４２８および／または４２９は、独立して好適なアミノ酸で置換され、このようなアミノ酸の非限定的な例としては、正電荷を有し親水性のアミノ酸（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）、負電荷を有し親水性のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、硫黄を含有するアミノ酸（例えば、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン）、アミドを含有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン）、脂肪族アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、プロリン、オルニチン、セレノシステイン、タウリンなど、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
また上述したように、アシルＣｏＡオキシダーゼ（例えば、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５）の触媒特異性は、様々な方法によって変更できる。アシルＣｏＡオキシダーゼの結合および／または触媒特異性を変更することは、鎖長認識が変更され、鎖長の触媒活性が変更された新規のアシルＣｏＡオキシダーゼの生成、および／または制限された、または特異的な鎖長特異性を有するアシルＣｏＡオキシダーゼ活性の生成に関して有利であることが証明される可能性があり、それによって異なる長さの炭素鎖の代謝または特定の選ばれた供給材料で見出される炭素鎖分布の代謝に関して経路の効率、特異性および／または特異的な活性におけるさらなる増加がもたらされる。いくつかの実施態様において、（ｉ）天然に存在する変異体集団をスクリーニングすること；（ｉｉ）内因性配列の変異誘発；（ｉｉｉ）望ましい特異性を有する異種配列を導入すること（例えば、別の生物からの１つまたはそれより多くの改変されていないまたは改変されたアシルＣｏＡオキシダーゼを、１つまたはそれより多くの内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼが場合によっては破壊された宿主生物に導入すること）；（ｉｖ）１つのポリヌクレオチド源（例えば、遺伝子、生物）からのコード配列の部分と別の源からのコード配列の部分とを有するキメラ配列を生成すること、および／または（ｖ）内因性アシルＣｏＡオキシダーゼを再構築するための、望ましい特異性を有するアシルＣｏＡオキシダーゼからのヌクレオチド配列および３次元構造分析を使用したインテリジェントデザインによって、変更されたアシルＣｏＡオキシダーゼ配列が同定および／または生成され、それにより、新規の特異性酵素を生成することができる。いくつかの実施態様において、キメラアシルＣｏＡオキシダーゼ配列は、２種またはそれより多くの源からのポリヌクレオチド配列の寄与分を有する可能性がある。いくつかの実施態様において、キメラアシルＣｏＡオキシダーゼ配列は、内因性ポリヌクレオチドからのコード配列の部分と、異種ポリヌクレオチドからのコード配列の部分とを含む。新規の触媒性および結合特異性を有するアシルＣｏＡオキシダーゼを同定および／または生成するのに利用される方法が、実施例で説明される。
アシルＣｏＡオキシダーゼ（例えば、ＰＯＸ４およびＰＯＸ５）をコードする核酸配列は、あらゆる動物（例えば、哺乳動物、魚類、爬虫類、両生類など）、あらゆる植物、真菌、酵母、原生動物、細菌、ウイルス、ファージおよび同種のもの）などのあらゆる好適な源から得ることができる。好適な酵母源の非限定的な例としては、ヤロウイア属の酵母（例えば、Ｙ．リポリチカ（以前はカンジダ・リポリチカ（Candida lipolytica）として分類された））、カンジダ属の酵母（例えば、Ｃ．レブカウフィ（C. revkaufi）、Ｃ．ビスワナチイ、Ｃ．プルケリマ（C. pulcherrima）、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．ユチリス（C. utilis））、ロドトルラ属の酵母（例えば、Ｒ．グルチナス（R. glutinus）、Ｒ．グラミニス（R. graminis））、ロドスポリディウム属の酵母（例えば、Ｒ．トルロイデス（R. toruloides））、サッカロミセス属の酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）、Ｓ．パストリアヌス（S. pastorianus）（S. pastorianus）、Ｓ．カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis）（S. carlsbergensis））、クリプトコックス属の酵母、トリコスポロン属の酵母（例えば、Ｔ．プランス（T. pullans）、Ｔ．クタネウム（T. cutaneum））、ピチア属の酵母（例えば、Ｐ．パストリス（P. pastoris））、およびリポマイセス属の酵母（例えば、Ｌ．スターキイ（L. starkeyii）、Ｌ．リポフェラス（L. lipoferus））が挙げられる。いくつかの実施態様において、好適な酵母は、以下の属：アラクニオタス属（Arachniotus）、アスペルギルス属、オーレオバシディウム属、アクサルスロン属（Auxarthron）、ブラストマイセス属、カンジダ属、クリソスポリウム属（Chrysosporuim）、クリソスポリウム・デバリオマイセス（Chrysosporuim Debaryomyces）、コクシジオイデス属（Coccidiodes）、クリプトコックス属、ギムノアスカス属（Gymnoascus）、ハンセヌラ属、ヒストプラスマ属、イッサチェンキア属（Issatchenkia）、クルイベロマイセス属、リポマイセス属、イッサチェンキア属（Lssatchenkia）、ミクロスポルム属、ミクソトリクム属（Myxotrichum）、ミクソザイマ属（Myxozyma）、オイディオデンドロン属（Oidiodendron）、パチソレン属（Pachysolen）、ペニシリウム属、ピチア属、ロドスポリディウム属（Rhodosporidium）、ロドトルラ属、ロドトルラ属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、スコプラリオプシス属、セペドニウム属（Sepedonium）、トリコスポロン属、またはヤロウイア属の酵母である。いくつかの実施態様において、好適な酵母は、以下の種：アラクニオタス・フラボルテウス（flavoluteus）、アスペルギルス・フラーブス、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、アクサルスロン・タクステリ（Auxarthron thaxteri）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Candida dubliniensis）、カンジダ・ファマタ（Candida famata）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ギリエルモンジイ（Candida guilliermondii）、カンジダ・ケフィア（Candida kefyr）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・ランビカ（Candida lambica）、カンジダ・リポリチカ、カンジダ・ルシタニア（Candida lustitaniae）、カンジダ・パラシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・プルケリマ（Candida pulcherrima）、カンジダ・レブカウフィ、カンジダ・ルゴサ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ユチリス、カンジダ・ビスワナチイ、カンジダ・クセストビイ（Candida xestobii）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporuim keratinophilum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidiodes immitis）、クリプトコックス・アルビダスの変種ディフルエンス（Cryptococcus albidus var. diffluens）、クリプトコックス・ラウレンテイ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコックス・ネオフォマンス（Cryptococcus neofomans）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、ギムノアスカス・ダグウェイエンシス（Gymnoascus dugwayensis）、ハンセヌラ・アノマーラ（Hansenula anomala）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、イッサチェンキア・オクシデンタリス（Issatchenkia occidentalis）、イッサチェンキア・オリエンタリス（Isstachenkia orientalis）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）、クルイベロマイセス・ワルテイ（Kluyveromyces waltii）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、リポマイセス・スターキイ（Lipomyces starkeyii）、ミクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、ミクソトリクム・デフレクサム（Myxotrichum deflexum）、オイディオデンドロン・エキヌラタム（Oidiodendron echinulatum）、パチソレン・タノフィリス（Pachysolen tannophilis）、ペニシリウム・ノタツム（Penicillium notatum）、ピチア・アノマーラ（Pichia anomala）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・スティピティス（Pichia スティピティス）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、ロドトルラ・グルチナス（Rhodotorula glutinus）、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula graminis）、サッカロミセス・セレビジエ、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces クルベリ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、スコプラリオプシス・アクレモニウム（Scopulariopsis acremonium）、セペドニウム・クリソスペルマム（Sepedonium chrysospermum）、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporon cutaneum）、トリコスポロン・プランス（Trichosporon pullans）、ヤロウイア・リポリチカ、またはヤロウイア・リポリチカ（以前はカンジダ・リポリチカとして分類された）の酵母である。いくつかの実施態様において、好適な酵母は、Ｙ．リポリチカ株であり、その例としては、これらに限定されないが、ＡＴＣＣ２０３６２、ＡＴＣＣ８８６２、ＡＴＣＣ１８９４４、ＡＴＣＣ２０２２８、ＡＴＣＣ７６９８２およびＬＧＡＭ Ｓ（７）１株が挙げられる（Papanikolaou S.、およびAggelis G.、Bioresour. Technol. 82（1）：43〜9（2002））。いくつかの実施態様において、好適な酵母は、カンジダ種（Candida species）（すなわち、カンジダ種（Candida spp.））の酵母である。アシルＣｏＡオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ様活性またはアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性をコードするあらゆる核酸配列は、本明細書で説明されるような酵母の基質特異性を変更するのに使用できる。アシルＣｏＡオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ様およびアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の非限定的な例は、本明細書で配列番号５１〜３８１０において示される。アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子（例えば、ＰＯＸ５遺伝子）の活性を改変し増幅するのに行われた実験を、実施例で説明する。以下の表に、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６およびヤロウイア・リポリチカからのＰＯＸ４およびＰＯＸ５のアミノ酸およびヌクレオチドレベルにおける同一性パーセントを示す。
アシルＣｏＡオキシダーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。例えば、Shimizuら、1979で説明されているような酵素的なアッセイを使用して、本明細書における実施例で説明されるようにして、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を査定できる。天然および／または破壊されたアシルＣｏＡオキシダーゼ配列を表す核酸配列はまた、核酸検出方法（例えば、ＰＣＲ、プライマー伸長、核酸ハイブリダイゼーションなど、およびそれらの組み合わせ）、または定量的な発現ベースの分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、ノーザンブロット分析など、およびそれらの組み合わせ）を使用しても検出でき、この場合、改変生物は、宿主生物と比較して、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドレベルの減少を示す。
アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤ）は、細胞のミトコンドリアにおける脂肪酸のβ酸化の各サイクルにおける最初の工程を触媒するように機能できる酵素のクラスである。これらは、構造および機能においてアシルＣｏＡオキシダーゼと極めて類似している可能性がある。それらの作用により、アシル−ＣｏＡチオエステル基質のＣ２とＣ３との間へのトランス二重結合の導入が起こる。ＦＡＤは、酵素がその適切な基質に結合するためのメカニズムにおいて必要な補因子である。
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、それらの短鎖、中鎖、または長鎖脂肪酸、および超長鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ基質への特異性に基づいて４つの別個のグループに類別できる。様々なデヒドロゲナーゼが様々な鎖長の脂肪酸を標的とするが、全てのタイプのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは機構的に類似している可能性がある。ＡＣＡＤにおける差は、アミノ酸配列に沿った活性部位の位置に基づいて存在する可能性がある。
中鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、各サブユニットがおよそ４００アミノ酸と１当量のＦＡＤとを含有するホモ四量体である。この四量体は、「二量体の二量体」として分類される。
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの単一の二量体の２つの単量体間の境界面はＦＡＤ結合部位を含有し、大規模な結合相互作用を有する。対照的に、２つの二量体間の境界面には、ほとんど相互作用がない。四量体内に合計４つの活性部位があり、それらそれぞれが、単一のＦＡＤ分子とアシル−ＣｏＡ基質とを含有する。それにより、酵素的分子１つあたり合計４つのＦＡＤ分子と４つのアシル−ＣｏＡ基質とが提供される。
ＦＡＤは、単量体の３つのドメインの間に結合し、そこにはヌクレオチドの一部のみが接近可能である。ＦＡＤの結合は、全体的な酵素安定性に有意に貢献する。アシル−ＣｏＡ基質は、完全に酵素の各単量体内で結合する。いくつかのＡＣＡＤにおいて、活性部位の内側は、残基Ｆ２５２、Ｔ２５５、Ｖ２５９、Ｔ９６、Ｔ９９、Ａ１００、Ｌ１０３、Ｙ３７５、Ｙ３７５、およびＥ３７６で構成される。基質内の対象の領域がＧｌｕ３７６とＦＡＤとの間に挟まれて、反応にとって理想的な位置に分子を整列させることが可能になる。
配列番号３７２８〜３８１０にいくつかのＡＣＡＤ配列を示す。
チオエステラーゼ
用語「チオエステラーゼ活性」は、本明細書で使用される場合、ヘキサノアートからの補酵素Ａの除去を指す。用語「チオエステラーゼ活性」はまた、本明細書で使用される場合、活性化された脂肪酸（例えば、脂肪族アシル−ＣｏＡ）からの補酵素Ａの除去も指す。チオエステラーゼ活性を有する酵素の非限定的な例としては、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（例えば、ＥＣ３．１．２．２０；また、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、アシル補酵素Ａヒドロラーゼ、チオエステラーゼＢ、チオエステラーゼＩＩ、レシチナーゼＢ、リソホスホリパーゼ（lysophopholipase）Ｌ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、およびアシル−ＣｏＡチオエステラーゼとも称される）が挙げられる。脂肪族アシル−ＣｏＡ分子から補酵素Ａを除去するチオエステラーゼは、以下の反応、
アシル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ−→ＣｏＡ＋カルボキシレート
を触媒し、式中、カルボキシレートは、多くの場合、脂肪酸である。次いで放出される補酵素Ａは、他の細胞活性に再使用できる。
チオエステラーゼ活性は、ポリペプチドによって提供できる。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、コピー数を増加させる内因性ヌクレオチド配列、異種および／もしくは内因性プロモーターに作動可能に連結される内因性ヌクレオチド配列、またはコピー数を増加させ、且つ異種および／または内因性プロモーターに作動可能に連結される、内因性ヌクレオチド配列である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、宿主微生物に導入された異種ヌクレオチド配列によってコードされている。チオエステラーゼ活性を付与する核酸配列は、クフェア・ランセオラタ、Ｃ．トロピカリス（例えば、配列番号３３および３５を参照）、および大腸菌（例えば、配列番号３７を参照）などの多数の源から得ることができる。チオエステラーゼポリヌクレオチド配列ドナーとして使用できる追加の生物が、本明細書で示されている。このようなポリペプチドの例としては、これらに限定されないが、クフェア・ランセオラタ由来のアシル−（ＡＣＰ）チオエステラーゼＢ型（配列番号１を参照）、Ｃ．トロピカリス由来のアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（例えば、ＡＣＨＡおよびＡＣＨＢ、配列番号３４および３６を参照））、大腸菌由来のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（例えば、ＴＥＳＡ、配列番号３８を参照）が挙げられる。チオエステラーゼのポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブのユニフォームリソースロケータ（ＵＲＬ）であるncbi.nlm.nih.govにおいて受託番号ＣＡＢ６０８３０で照会される。
チオエステラーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。このような方法の例は、Chemistry and Biology 9：981〜988で説明されている。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ活性は、宿主微生物中で変更されず、いくつかの実施態様において、該活性は、宿主微生物と比べて、操作された微生物中で追加または増加される。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、別のポリペプチド（例えば、ヘキサノアートシンターゼＡまたはヘキサノアートシンターゼＢポリペプチド）に連結される。チオエステラーゼ活性およびチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、実施例３３で示される。
オメガ脂肪酸の変換を低減させること−概説
用語「オメガヒドロキシル脂肪酸の変換を低減させる遺伝学的改変」は、本明細書で使用される場合、オメガヒドロキシル脂肪酸を別の生成物に変換する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更を指す。いくつかの実施態様において、内因性オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性が低減する。このような変更は、有利にはジカルボン酸の量を増加させることができ、さらにこのジカルボン酸を精製してプロセシングできる。
ベータ酸化を低減させること−概説
用語「ベータ酸化活性を低減させる遺伝学的改変」は、本明細書で使用される場合、カルボン酸含有有機分子のベータ炭素を酸化させる内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更を指す。いくつかの実施態様において、有機分子は、炭素分子１０個または１２個であり、時には、分子の末端に配置された１個または２個のカルボン酸部分を含有する（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
脂肪酸合成を増加させること−概説
用語「脂肪酸合成の増加をもたらす遺伝学的改変」はまた、本明細書で使用される場合、脂肪酸を脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更も指す。いくつかの実施態様において、脂肪酸を脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換する内因性活性は低減される。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性は低減される。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
アシル−ＣｏＡシンセターゼ
多くの生物において、脂肪酸は、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（例えば、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２；ＥＣ６．２．１．３；また、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡリガーゼとも称される）の活性によって、脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換される可能性がある。アシル−ＣｏＡシンセターゼは、カンジダ種においてそれぞれＡＣＳ１、ＦＡＴ１、ＡＣＳ２Ａ、ＡＣＳ２Ｂ、ＡＣＳ２Ｃ、およびＡＣＳ２Ｄによってコードされた６つのアイソフォームを有する（例えば、Ｓ．セレビシエの場合、ＦＡＡ１、ＦＡＴ１、およびＦＡＡ２に相同）。アシル−ＣｏＡシンセターゼは、酵素のリガーゼクラスのメンバーであり、以下の反応
ＡＴＰ＋脂肪酸＋ＣｏＡ⇔ＡＭＰ＋ピロリン酸塩＋脂肪族アシル−ＣｏＡ
を触媒する。
脂肪酸および補酵素Ａは、多くの場合、様々な細胞プロセスへの侵入のために、脂肪酸の脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体への活性化で利用される。理論に制限されるつもりはないが、様々な細胞プロセスに利用可能な脂肪族アシル−ＣｏＡ量の低減は、同じ宿主生物における他の操作された経路（例えば、オメガ酸化経路、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路およびベータ酸化経路）によって、脂肪族ジカルボン酸（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）への変換に利用可能な脂肪酸量を増加させることができると考えられる。アシル−ＣｏＡシンセターゼは、あらゆる好適な手段によって不活性化できる。ＡＣＳ１活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊するための使用に好適な遺伝子のノックアウト法が、本明細書で説明される。ＡＣＳ１のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号３９で示される。ＡＣＳ１に関して欠失した突然変異体が生成するように設計された統合／破壊コンストラクトの例も実施例に示す。
アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。好適な検出方法の非限定的な例としては、酵素的なアッセイ（例えば、Lagewegら「A Fluorometric Assay for Acyl-CoA Synthetase Activity」、Analytical Biochemistry、197（2）：384〜388（1991））、ＰＣＲベースのアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、免疫学的な検出方法（例えば、アシル−ＣｏＡシンセターゼに特異的な抗体）など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
用語「脂肪酸合成の増加をもたらす遺伝学的改変」はまた、本明細書で使用される場合、長鎖および超長鎖脂肪酸を活性化された脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更も指す。いくつかの実施態様において、長鎖および超長鎖脂肪酸を活性化された脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換する内因性活性は低減される。いくつかの実施態様において、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性は低減される。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
長鎖脂肪酸（例えば、Ｃ１２〜Ｃ１８の鎖長）および超長鎖脂肪酸（例えば、Ｃ２０〜Ｃ２６）は、多くの場合、いくつかの生物において、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ（例えば、ＦＡＴ１；ＥＣ６．２．１．３；また、長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼとも称され；脂肪酸チオキナーゼ（長鎖）；アシル活性化酵素；パルミトイル−ＣｏＡシンターゼ；リグノセロイル−ＣｏＡシンターゼ；アラキドニル−ＣｏＡシンセターゼ；アシル補酵素Ａシンセターゼ；アシル−ＣｏＡリガーゼ；パルミトイル補酵素Ａシンセターゼ；チオキナーゼ；パルミトイル−ＣｏＡリガーゼ；アシル−補酵素Ａリガーゼ；脂肪酸ＣｏＡリガーゼ；長鎖脂肪族アシル補酵素Ａシンセターゼ；オレオイル−ＣｏＡシンセターゼ；ステアロイル−ＣｏＡシンセターゼ；長鎖脂肪族アシル−ＣｏＡシンセターゼ；長鎖アシルＣｏＡシンセターゼ；脂肪酸エロンガーゼ（ＥＬＯ）；ＬＣＦＡシンセターゼ；プリスタノイル−ＣｏＡシンセターゼ；ＡＣＳ３；長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼＩ；長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼＩＩ；脂肪族アシル−補酵素Ａシンセターゼ；長鎖アシル−補酵素Ａシンセターゼ；および酸：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成））のチオエステル化活性によって活性化および／または輸送される。また脂肪酸は、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼの活性によって供給材料から宿主生物に輸送される可能性もある。
長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼは、以下の反応、
ＡＴＰ＋長鎖カルボン酸＋ＣｏＡ＝ＡＭＰ＋二リン酸塩＋アシル−ＣｏＡ
を触媒し、式中、「アシル−ＣｏＡ」は、脂肪族アシル−ＣｏＡ分子を指す。本明細書で述べたように、脂肪酸の活性化は、多くの場合、様々な細胞プロセスへの脂肪酸の侵入に必要である（例えば、エネルギー源として、膜形成および／またはリモデリング成分として、炭素貯蔵分子として）。ＦＡＴ１の欠失突然変異体は、超長鎖脂肪酸を蓄積して、これらの脂肪酸の活性化の減少を示すことが示されている。理論に制限されるつもりはないが、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性の低減は、脂肪族アシル−ＣｏＡ中間体に変換された長鎖脂肪酸の量を低減させることができると考えられ、それによって同じ宿主生物における他の操作された経路（例えば、オメガ酸化経路、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路およびベータ酸化経路）によって、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）への変換に利用可能な脂肪酸量が増加する。長鎖−アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性は、あらゆる好適な手段によって低減または不活性化させることができる。ＦＡＴ１活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊するのに好適な遺伝子のノックアウト法が、本明細書で説明される。ＦＡＴ１のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号４１で示される。「ノックアウト」コンストラクト構築での使用に好適なＤＮＡベクターが本明細書で説明される。
長鎖−アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。好適な検出方法の非限定的な例としては、酵素的なアッセイ、結合アッセイ（例えば、Erlandら、Analytical Biochemistry 295（1）：38〜44（2001））、ＰＣＲベースのアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ）、免疫学的な検出方法（例えば、長鎖−アシル−ＣｏＡシンセターゼに特異的な抗体）など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
ＡＣＳ活性の選択的な改変
いくつかの実施態様において、ベータ酸化経路が機能的であり、選択的な基質特異性に関して改変される。いくつかの実施態様において、ベータ酸化経路は、ジアシル−ＣｏＡチオエステルに対してのみ選択的であり、いくつかの実施態様において、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０個より多くの炭素鎖長のジアシル−ＣｏＡに対してのみ選択的である。ベータ酸化の選択性は、１）ペルオキシソーム膜を通過するアシル−ＣｏＡおよび二酸の輸送における差を利用すること、２）細胞質区画中でアシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）活性を選択的にノックアウトすること、３）短鎖基質に基質特異性を有するアイソザイムに関するペルオキシソーム区画におけるＡＣＳ活性をノックアウトすること、および／または４）６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０個より長い炭素の基質にのみ作用すると予想されるベータ酸化経路を操作することによって達成できる。
Ｓ．セレビシエにおいて、細胞質内のＡＣＳ活性は、ＦＡＡ１、ＦＡＡ３、ＦＡＡ４およびＦＡＴ１によってコードされているが、一方でペルオキシソーム活性は、ＦＡＡ２によってコードされている。カンジダ株ではＦＡＡ１およびＦＡＴ１の相同体が同定されたが、ＦＡＡ３またはＦＡＡ４の相同体は同定されていない。カンジダ株では、Ｓ．セレビシエのペルオキシソームＦＡＡ２の相同体が５種も同定された。５種の相同体のうち２種は互いに９５％の同一性を示しており、同じ遺伝子の対立遺伝子である可能性がある最も高い。カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６（例えば、ＡＣＳ２Ａ〜ＡＣＳ２Ｄ）において４種のＦＡＡ２相同体が同定された。
いくつかの実施態様において、方策の１つは、ＡＣＳ酵素活性がペルオキシソーム中にのみ存在するように、ＡＣＳ酵素活性の細胞内の位置を制御することである。ＦＡＡ１およびＦＡＴ１突然変異体、ｆａａ１Δおよびｆａｔ１Δを構築し、これらは、細胞質を標的とするＡＣＳ活性はほとんどないと予想される。これらの突然変異体株において、外部から供給された長鎖遊離脂肪酸は、アシル−ＣｏＡチオエステルに活性化されない限りペルオキシソームへの輸送は不可能であるため、細胞質中に蓄積する。高濃度の遊離脂肪酸は毒性である可能性があり、したがって細胞は、遊離脂肪酸をそれよりかなり毒性が低いジカルボン酸に酸化することによってそれ自身を解毒するように作用する。長鎖脂肪酸とは異なり、長鎖ジカルボン酸は、ペルオキシソーム区画に拡散することが可能であり、そこで長鎖ジカルボン酸は、ベータ酸化経路への侵入に必要なジアシル−ＣｏＡチオエステルに活性化される可能性がある。複数のペルオキシソームのＡＣＳアイソザイムに関して、各アイソザイムが異なる基質特異性を有する可能性がある。いくつかの実施態様において、脂肪酸供給材料の鎖長に適合した基質特異性を有するが、鎖長が６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０個以下の炭素の二酸には活性がない（または低い活性しかない）ペルオキシソームのＡＣＳ酵素を保持することが望ましい。この方策では、ベータ酸化によって鎖が例えば１２個の炭素に短縮化されて、さらにその後ジカルボン酸と遊離のＣｏＡとに加水分解されるあらゆる長鎖ジカルボキシル−ＣｏＡは、さらなる鎖の短縮化のためにベータ酸化に再侵入するためにジカルボキシル−ＣｏＡを再活性化させることができない。いくつかの実施態様において、ペルオキシソームＡＣＳの基質の鎖長の特異性を制御することと組み合わせて、本発明者らの生成物の望ましい鎖長で最大活性を有するペルオキシソームのチオエステラーゼ活性が増幅される。この方策は、ベータ酸化によって生産されたジカルボン酸の鎖長を制御できる。
いくつかの実施態様において、ペルオキシソームへの脂肪酸のフローは、遺伝子ＰＸＡ１およびＰＸＡ２をノックアウトすることによって制御される。これらの遺伝子は、細胞質からペルオキシソーム膜を通過してペルオキシソームのマトリックスに長鎖脂肪族アシル−ＣｏＡを輸送することに関与するＡＴＰ結合カセット輸送体のサブユニットをコードする。いくつかの実施態様において、細胞質内ＡＣＳをコードする遺伝子がノックアウトされても、それでもなお細胞質中にペルオキシソームのＡＣＳからの多少の残留したＡＣＳ活性が存在する可能性がある。ペルオキシソームに向かうことになっているＡＣＳアイソザイムは細胞質中で翻訳され、ペルオキシソームに移行する前に十分にフォールディングされる。それゆえにペルオキシソームのＡＣＳは、少量の細胞質内ＡＣＳ活性に寄与する可能性がある。Ｐｘａ１ｐ／Ｐｘａ２ｐ輸送体の欠失は、アシル−ＣｏＡチオエステルに活性化された全ての長鎖脂肪酸が、分解のためにペルオキシソームに輸送されないようにする可能性がある。
アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ
用語「脂肪酸合成の増加をもたらす遺伝学的改変」はまた、本明細書で使用される場合、脂肪酸をコレステロールエステルに変換する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更も指す。いくつかの実施態様において、脂肪酸をコレステロールエステルに変換する内因性活性は低減される。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性は低減される。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
脂肪酸は、多くの生物において、アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２、ＥＣ２．３．１．２６；また、ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼとも称され；コレステロールアシルトランスフェラーゼ；ステロール−エステルシンターゼ；ステロール−エステルシンセターゼ；ステロール−エステルシンターゼ；アシル補酵素Ａ−コレステロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ；アシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ；ＡＣＡＴ；アシル補酵素Ａ：コレステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ；コレステロールエステルシンターゼ；コレステロールエステルシンセターゼ；およびコレステリルエステルシンセターゼ）の活性によってコレステロール−エステルに変換される可能性がある。いかなる理論にも限定されるつもりはないが、コレステロールのエステル化は、細胞膜への取り込みから脂質の貯蔵形態に脂肪酸を方向付けることに関与する可能性がある。アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼは、以下の反応
アシル−ＣｏＡ＋コレステロール＝ＣｏＡ＋コレステロールエステル
を触媒する。
コレステロールのエステル化は、細胞の膜脂質中でのその溶解性を制限し、したがって細胞質内の脂肪滴（例えば、炭素貯蔵分子の形態）におけるコレステロールエステルの蓄積を促進すると考えられる。それゆえに、いかなる理論にも限定されるつもりはないが、コレステロールのエステル化は、脂質貯蔵分子の蓄積を引き起こす可能性があり、アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼの活性の破壊は、同じ宿主生物における他の操作された経路（例えば、オメガ酸化経路、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路およびベータ酸化経路）によって、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）に変換できるアシル−ＣｏＡレベルの増加を引き起こす可能性がある。アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼは、あらゆる好適な手段によって不活性化できる。ＡＲＥ１活性、ＡＲＥ２活性またはＡＲＥ１活性およびＡＲＥ２活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊するのに好適な遺伝子のノックアウト法が、本明細書で説明される。ＡＲＥ１およびＡＲＥ２のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号４３および４５で示される。「ノックアウト」コンストラクト構築での使用に好適なＤＮＡベクターが本明細書で説明される。
アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。好適な検出方法の非限定的な例としては、酵素的なアッセイ（例えば、Chenら、Plant Physiology 145：974〜984 （2007））、結合アッセイ、ＰＣＲベースのアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、免疫学的な検出方法（例えば、長鎖−アシル−ＣｏＡシンセターゼに特異的な抗体）など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼおよびアシルトランスフェラーゼ
用語「脂肪酸合成の増加をもたらす遺伝学的改変」はまた、本明細書で使用される場合、ジアシルグリセロールのエステル化を触媒する内因性活性を低減させる宿主微生物の遺伝子変更（例えば、アシル基をジアシルグリセロールに付加して、トリアシルグリセロールを形成すること）も指す。いくつかの実施態様において、ジアシルグリセロールをトリアシルグリセロールに変換する内因性活性は低減される。いくつかの実施態様において、アシルトランスフェラーゼ活性は低減される。いくつかの実施態様においてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性は低減される。いくつかの実施態様において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＧＡ１、ＥＣ２．３．１．２０）活性およびアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＬＲＯ１）活性は低減される。このような変更は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）などの最終産物の収量を有利に増加させる可能性がある。
ジアシルグリセロールは、多くの生物において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＧＡ１；ＥＣ２．３．１．２０；また、ジグリセリドアシルトランスフェラーゼとも称され；１，２−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ；ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ；ジグリセリドＯ−アシルトランスフェラーゼ；パルミトイル−ＣｏＡ−ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ；アシル−ＣｏＡ：１，２−ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡ：１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ）の活性によってトリアシルグリセロールに変換される可能性がある。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、以下の反応
アシル−ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール＝ＣｏＡ＋トリアシルグリセロール
を触媒し、一般的には、トリグリセリド合成において最後の唯一行われる工程とみなされる。
酵母におけるＤＧＡ１遺伝子の生成物は通常、脂質粒子に局在化される。ＤＧＡ１に関して説明したジアシルグリセロールのエステル化活性に加えて、多くの生物はさらに、他のアシルトランスフェラーゼ活性の活性によってトリグリセリドも生成でき、この他のアシルトランスフェラーゼ活性の非限定的な例としては、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＬＲＯ１；ＥＣ２．３．１．４３；また、ホスファチジルコリン−ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ活性とも称され；レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性；リン脂質−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性；ＬＣＡＴ（レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ）活性；レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性；ならびにリゾレシチンアシルトランスフェラーゼ活性）およびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＣ２．３．１．１５８；また、ＰＤＡＴ活性およびリン脂質とも称される：１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ活性）が挙げられる。ＥＣ２．３．１．４３およびＥＣ２．３．１．５８ファミリーのアシルトランスフェラーゼは、一般的な反応
リン脂質＋１，２−ジアシルグリセロール＝リゾリン脂質＋トリアシルグリセロール
を触媒する。
トリアシルグリセリドは、多くの場合、炭素（例えば、脂肪酸または脂質）貯蔵分子として利用される。いかなる理論にも限定されるつもりはないが、アシルトランスフェラーゼの活性を低減させることは、ジアシルグリセロールからトリアシルグリセロールへの変換を低減させる可能性があり、それにより、同じ宿主生物における他の操作された経路（例えば、オメガ酸化経路、ベータ酸化経路、オメガ酸化経路およびベータ酸化経路）によって脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）に変換できる追加の遺伝学的改変（例えば、グリセロール主鎖から脂肪酸をさらに除去するためのリパーゼ）と共に、脂肪酸蓄積の増加が引き起こされる可能性があると考えられる。アシルトランスフェラーゼは、あらゆる好適な手段によって不活性化できる。ＤＧＡ１活性、ＬＲＯ１活性またはＤＧＡ１活性およびＬＲＯ１活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊するのに好適な遺伝子のノックアウト法が、本明細書で説明される。ＤＧＡ１のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号４７で示され、ＬＲＯ１のヌクレオチド配列は、実施例３３、配列番号４９で示される。「ノックアウト」コンストラクト構築での使用に好適なＤＮＡベクターが本明細書で説明される。
アシルトランスフェラーゼ活性の存在、非存在または量は、当業界公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。好適な検出方法の非限定的な例としては、酵素的なアッセイ（例えば、Geelen、Analytical Biochemistry 322（2）：264〜268（2003）、Dahlqvistら、PNAS 97（12）：6487〜6492（2000））、結合アッセイ、ＰＣＲベースのアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ）、免疫学的な検出方法（例えば、ＤＧＡ１またはＬＲＯ１アシルトランスフェラーゼに特異的な抗体）など、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
核酸（例えば、本明細書では核酸試薬、目的とする核酸、標的ヌクレオチド配列、対象の核酸配列または核酸の関心領域とも称される）は、あらゆる源または組成物由来ものもでもよく、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡであり、これらはあらゆる形態であってもよい（例えば、直鎖状、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖および同種のもの）。核酸はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体および／または非天然の主鎖ならびに同種のものを含有する）を含む場合もある。用語「核酸」は、特定の長さのポリヌクレオチド鎖を指したり、またはそのようなものと推定されたりすることはなく、したがってポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドも定義に包含されることが理解される。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを包含する。ＲＮＡの場合、ウラシル塩基は、ウリジンである。
核酸は、時には、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、動原体、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、または宿主細胞中で複製可能な、もしくは複製された他の核酸である。いくつかの実施態様において、核酸は、ライブラリー由来のものもでもよいし、または対象の生物からの酵素消化、剪断、または超音波破砕したゲノムＤＮＡ（例えば、フラグメント化した）から得ることもできる。いくつかの実施態様において、フラグメント化または切断処理した核酸は、約５〜約１０，０００塩基対、約１００〜約１，０００塩基対、約１００〜約５００塩基対、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００もしくは１００００塩基対の、名目上の長さ、標準的な長さ、または平均の長さを有していてもよい。フラグメントは、当業界におけるあらゆる好適な方法によって生成でき、核酸フラグメントの標準的な長さ、平均の長さまたは名目上の長さは、通常の技術を有するものによって適切なフラグメント生成手法を選択することによって制御できる。いくつかの実施態様において、フラグメント化したＤＮＡをサイズ選択して、特定のサイズ範囲の核酸フラグメントを得ることができる。
核酸は、通常の技術を有するものに公知の様々な方法によってフラグメント化でき、このような方法としては、これらに限定されないが、物理的、化学的および酵素的プロセスが挙げられる。このようなプロセスの例は、米国公開特許公報第２００５０１１２５９０号（２００５年５月２６日に公開、Van Den Boomらによる、タイトル「配列バリエーションの検出および発見のためのフラグメント化ベースの方法およびシステム（Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery）」）で説明されている。非特異的に切断されたフラグメントまたは特異的に切断されたフラグメントを生成するために、通常の技術を有するものによって所定のプロセスを選択できる。非特異的に切断されたフラグメントのサンプル核酸を生成できるプロセスの例としては、これらに限定されないが、サンプル核酸を、核酸を剪断力に晒す器具と接触させること（例えば、核酸をシリンジの針に通過させること；フレンチプレスの使用）；サンプル核酸に放射線照射すること（例えば、ガンマ、Ｘ線、ＵＶ放射線照射；フラグメントサイズは、放射線照射の強度によって制御できる）；核酸を水中で煮沸すること（例えば、約５００塩基対のフラグメントが得られる）、ならびに核酸を酸および塩基加水分解プロセスに晒すことが挙げられる。
核酸は、核酸を１種またはそれより多くの特異的な切断剤と接触させることによって特異的に切断されてもよい。用語「特異的な切断剤」は、本明細書で使用される場合、１つまたはそれより多くの特異的な部位で核酸を切断可能な物質、時には化学的な物質、または酵素を指す。特異的な切断剤は、多くの場合、特定の部位における特定のヌクレオチド配列に従って特異的に切断すると予想される。酵素的に特異的な切断剤の例としては、これらに限定されないが、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ（例えば、ＤＮアーゼＩ、ＩＩ）；ＲＮアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＥ、Ｆ、Ｈ、Ｐ）；クリーベース（Cleavase）（商標）酵素；Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ；大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩおよび真核性構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ；タイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ、例えばＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｌｕＩ、Ａｌｗ４４Ｉ、ＡｐａＩ、ＡｓｎＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｎＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＣｆｏＩ、ＣＩａＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ、ＥｃＩＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＫｐｎＩ、ＫｓｐＩ、ＭｌｕＩ、ＭＩｕＮＩ、ＭｓｐＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｄｅＩＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｃａＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ）；グリコシラーゼ（例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジン水和物−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ−ＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼ、５−ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５−ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６−エテノ−アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）；リボザイム、およびＤＮＡザイムが挙げられる。サンプル核酸は、化学物質で処置されていてもよいし、または改変されたヌクレオチドを使用して合成されてもよく、改変された核酸が切断されてもよい。非限定的な例において、サンプル核酸は、（ｉ）アルキル化剤、例えば、アルキルプリンＤＮＡ−グリコシラーゼによって認識されて切断されるＮ３−メチルアデニンおよびＮ３−メチルグアニンなどの数種のアルキル化塩基を生成するメチルニトロソウレア；（ｉｉ）ＤＮＡにおいてシトシン残基の脱アミノを引き起こしてウラシルＮ−グリコシラーゼで切断可能なウラシル残基を形成する、亜硫酸水素ナトリウム；および（ｉｉｉ）グアニンを、ホルムアミドピリミジンＤＮＡのＮ−グリコシラーゼによって切断可能なその酸化された形態である８−ヒドロキシグアニンに変換する化学物質で処置されていてもよい。化学的切断プロセスの例としては、これらに限定されないが、アルキル化（例えば、ホスホロチオエートで改変された核酸のアルキル化）；Ｐ３’−Ｎ５’−ホスホロアミデート含有核酸の酸不安定性部分の切断；ならびに核酸の四酸化オスミウムおよびピペリジン処置が挙げられる。
本明細書で使用される用語「相補的な切断反応」は、同じ標的または参照の核酸もしくはタンパク質の代替の切断パターンが生成されるように、異なる切断試薬を使用して、または同じ切断試薬の切断特異性を変更することによって、同じ核酸上で実行される切断反応を指す。いくつかの実施態様において、対象の核酸は、１つまたはそれより多くの反応容器中で、１種またはそれより多くの特異的な切断剤（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれより多くの特異的な切断剤）で処置されていてもよい（例えば、対象の核酸は、別々の容器でそれぞれの特異的な切断剤で処置される）。
本明細書で説明される実施態様での使用に好適な核酸は、時には、当業界公知のあらゆる増幅プロセス（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよび同種のもの）によって増幅される。典型的には培養が難しい生物を使用する場合（例えば、増殖が遅いこと、特殊な培養条件を必要とすること、など）、核酸増幅は、特に有益であり得る。用語「増幅する」、「増幅」、「増幅反応」、または「増幅すること」は、本明細書で使用される場合、目的とする核酸配列のコピーを増殖させるあらゆるインビトロでのプロセスを指す。増幅は、時には、目的とする核酸の「指数関数的な」増加を指す。しかしながら、「増幅すること」はまた、本明細書で使用される場合、核酸の多数の選択された目的とする配列における直線的な増加を指す場合もあるが、１回の単一プライマーによる伸長工程とは異なる。いくつかの実施態様において、予備増幅としても知られる限定的な増幅反応を行ってもよい。予備増幅は、少数のサイクル、例えば１０サイクルを行うことにより限定的な量の増幅を起こす方法である。予備増幅は、多少の増幅を引き起こす場合もあるが、対数期に入る前に増幅を止め、典型的には望ましいヌクレオチド配列の約５００コピーを生産する。また予備増幅の使用も、標準的なＰＣＲ反応における反応物の枯渇に伴う不正確さを抑える可能性もある。
いくつかの実施態様において、核酸試薬は、時には、宿主生物の染色体に安定して統合され、またはいくつかの実施態様において（例えば、宿主ゲノムの変更が、遺伝学的改変を有する望ましい生物を選択的または優先的に維持する能力を付与する遺伝子改変生物において）、核酸試薬は、宿主染色体の一部の欠失であってもよい。このような核酸試薬（例えば、変更されたゲノムが生物に選択可能な特色を付与する核酸または遺伝子改変生物）は、望ましいタンパク質または核酸分子の生産を誘導するそれらの能力に応じて選択される可能性がある。核酸試薬は、望ましい場合、コドンが、（ｉ）天然配列で特定されたｔＲＮＡとは異なるｔＲＮＡを使用して同じアミノ酸をコードするか、または（ｉｉ）通常ではないアミノ酸または非天然アミノ酸（検出可能に標識されたアミノ酸を含む）などの、正常なものとは異なるアミノ酸をコードするように変更されてもよい。用語「天然の配列」は、本明細書で説明される場合、その天然の環境で見出されるような未改変のヌクレオチド配列（例えば、生物中で見出されるようなヌクレオチド配列）を指す。
核酸または核酸試薬は、多くの場合、核酸の意図した使用に従って選択された所定の要素を含んでいてもよい。以下の要素のいずれかが核酸試薬に包含されていてもよいし、核酸試薬から除かれていてもよい。核酸試薬は、例えば、以下のヌクレオチド要素：１つまたはそれより多くのプロモーター要素、１つまたはそれより多くの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、標的ヌクレオチド配列が挿入され得る１つまたはそれより多くの領域（「挿入要素」）、１つまたはそれより多くの標的ヌクレオチド配列、１つまたはそれより多くの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および１つまたはそれより多くの選択要素のうち１種またはそれより多くまたは全てを包含していてもよい。核酸試薬は、このような要素のうち１またはそれより多くと共に提供されてもよいし、核酸が望ましい生物に導入される前に他の要素が核酸に挿入されてもよい。いくつかの実施態様において、提供された核酸試薬は、プロモーター、５’ＵＴＲ、任意選択の３’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列をヌクレオチド酸試薬に挿入（すなわち、クローニング）するための挿入要素を含む。いくつかの実施態様において、提供された核酸試薬は、プロモーター、挿入要素および任意選択の３’ＵＴＲを含み、５’ＵＴＲ／標的ヌクレオチド配列は、任意選択の３’ＵＴＲと共に挿入される。要素は、選ばれた発現系における発現（例えば、選ばれた生物における発現、または例えば細胞非含有系における発現）に好適なあらゆる順番で配置されてもよいし、いくつかの実施態様において、核酸試薬は、５’から３’の方向で、以下の要素：（１）プロモーター要素、５’ＵＴＲ、および挿入要素；（２）プロモーター要素、５’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列；（３）プロモーター要素、５’ＵＴＲ、挿入要素および３’ＵＴＲ；ならびに（４）プロモーター要素、５’ＵＴＲ、標的ヌクレオチド配列および３’ＵＴＲを含む。
プロモーター
プロモーター要素は、典型的にはＤＮＡ合成および／またはＲＮＡ合成に必要である。プロモーター要素は、多くの場合、遺伝子に対応するＲＮＡを合成するための開始部位を提供することによって特定の遺伝子の転写を容易にできるＤＮＡの領域を含む。いくつかの実施態様において、プロモーターは、一般的に、それらが調節する遺伝子の近くに配置され、遺伝子上流（例えば、遺伝子の５’）に配置され、遺伝子のセンス鎖としてＤＮＡの同じ鎖上に存在する。いくつかの実施態様において、プロモーター要素は、遺伝子または生物から単離されて、発現が変更および／または調節されるように、ポリヌクレオチド配列と機能的に連結した状態で挿入されてもよい。核酸の発現に使用される非天然のプロモーター（例えば、通常は、所定の核酸配列とは結合しないプロモーター）は、多くの場合、異種プロモーターと称される。いくつかの実施態様において、異種プロモーターおよび／または５’ＵＴＲは、本明細書で説明されるような望ましい活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結した状態で挿入されてもよい。用語「〜と作動可能に連結した」および「〜と機能的に連結した状態で」は、本明細書でプロモーターに関して使用される場合、コード配列とプロモーター要素との関係を指す。転写を介したコード配列からの発現がプロモーター要素によって調節または制御される場合、そのプロモーターは、コード配列と作動可能に連結しているか、またはコード配列と機能的に連結した状態である。用語「〜と作動可能に連結した」および「〜と機能的に連結した状態で」は、本明細書ではプロモーター要素に関して同義的に使用される。
プロモーターは、多くの場合、ＲＮＡポリメラーゼと相互作用する。ポリメラーゼは、既存の核酸試薬を使用して核酸の合成を触媒する酵素である。テンプレートがＤＮＡテンプレートである場合、ＲＮＡ分子が転写されて、その後タンパク質が合成される。本発明の方法での使用に好適なポリメラーゼ活性を有する酵素は、タンパク質を合成するために選ばれたテンプレートを含む選ばれた系中で活性なあらゆるポリメラーゼを包含する。いくつかの実施態様において、プロモーター（例えば、異種プロモーター）は、本明細書ではプロモーター要素としてとも称されるが、これは、ヌクレオチド配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結できる。プロモーター要素からの転写は、プロモーターに作動可能に連結したヌクレオチド配列またはＯＲＦ配列に対応するＲＮＡの合成を触媒でき、続いてそれにより、望ましいペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の合成が起こる。
プロモーター要素は、時には、調節コントロールに反応性を示す。またプロモーター要素は、時には、選択剤によって調節される場合もある。すなわち、プロモーター要素からの転写は、時には、環境、栄養または内部条件もしくはシグナルの変化に応答してオン、オフ、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされる可能性がある（例えば、熱誘導性プロモーター、光調節性プロモーター、フィードバック調節性プロモーター、ホルモンの影響を受けるプロモーター、組織特異的なプロモーター、酸素およびｐＨの影響を受けるプロモーター、選択剤（例えば、カナマイシン）に対応するプロモーターおよび同種のものなど）。環境、栄養または内部シグナルの影響を受けるプロモーターはしばしば、プロモーターの位置で結合するかまたはその近くに結合して、所定の条件下で目的とする配列の発現を増加または減少させるシグナル（直接的または間接的）の影響を受ける。
本明細書で説明される実施態様で使用されるプロモーター要素からの転写に影響を与えることができる選択剤または調節剤の非限定的な例としては、これらに限定されないが、（１）別の状況では毒性の化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する生成物をコードする核酸セグメント；（２）別の状況ではレシピエント細胞中で欠失している生成物（例えば、必須の生成物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定できる生成物（例えば、表現型マーカー、例えば抗生物質（例えば、β−ラクタマーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質）をコードする核酸セグメント；（５）別の状況では細胞の生存および／または機能に有害な生成物に結合する核酸セグメント；（６）別の状況では上記の１〜５番で説明された核酸セグメントのいずれかの活性を阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する生成物に結合する核酸セグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）望ましい分子を単離または同定するのに使用できる核酸セグメント（例えば、特異的なタンパク質結合部位）；（９）別の状況では非機能的な可能性がある特異的なヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の部分集団のＰＣＲ増幅のための）；（１０）存在しない場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において、毒性であるか、または比較的非毒性の化合物を毒性の化合物に変換するかのいずれかである生成物をコードする核酸セグメント（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）；（１２）それらを含有する核酸分子の複製、分割または遺伝を阻害する核酸セグメント；ならびに／または（１３）条件付きの複製機能、例えば、所定の宿主または宿主細胞株での、または所定の環境条件下での（例えば、温度、栄養条件および同種のもの）複製をコードする核酸セグメントが挙げられる。いくつかの実施態様において、調節剤または選択剤は、生物が晒される既存の増殖条件（例えば、液体培養での増殖、発酵槽での増殖、固体栄養素プレートでの増殖および同種のものなど）を変化させるのに添加されてもよい。
いくつかの実施態様において、プロモーター要素の調節は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性（例えば、酵素活性）を変更する（例えば、増加させる、追加する、減少させる、または実質的に除去する）のに使用できる。いくつかの実施態様において、例えば、微生物は、新規の活性（例えば、宿主生物では通常見出されない活性）を追加できる、または対象のヌクレオチド配列（例えば、対象の同種または異種ヌクレオチド配列）に作動可能に連結した同種または異種プロモーターからの転写を増加させることによって、既存の活性の発現を増加させる核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。いくつかの実施態様において、微生物は、対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結した同種または異種プロモーターからの転写を減少させるかまたは実質的に除去することによって活性の発現を減少させることができる核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。
いくつかの実施態様において、活性は、当業者公知の組換えＤＮＡおよび遺伝学的技術を使用して変更されてもよい。微生物を操作する方法は、本明細書でさらに説明される。本明細書に記載の表は、酸素によってアップレギュレートされる酵母プロモーター、酸素によってダウンレギュレートされる酵母プロモーター、酵母の転写リプレッサーおよびそれに関連する遺伝子、ＭＥＭＥ配列分析ソフトウェアを使用して決定されるようなＤＮＡ結合モチーフの非限定的な一覧を提供する。可能性のあるレギュレーター結合モチーフは、過剰に提示される配列においてレギュレーターに制約される遺伝子間領域を検索するためのプログラムであるＭＥＭＥを使用して同定できる。レギュレーターごとに、０．００１未満のｐ値に制約される遺伝子間領域の配列を抽出し、モチーフ発見のためのインプットとして使用した。以下の設定：６〜１８塩基の範囲のモチーフ幅、「ズープス（zoops）」分布モデル、６位のマルコフバックグラウンドモデル、および２０モチーフの発見限定を使用してＭＥＭＥソフトウェアを実行した。２つの基準：ＭＥＭＥによって計算されたＥ値と特異度スコアとによって、発見された配列モチーフを重要性に関してスコア付けした。各測定基準を使用して最良のスコアを有するモチーフをレギュレーターごとに示す。ガラクトース中で増殖させたエピトープタグを有するＧａｌ４に関するこれまで公開されたデータセットを除いて、提示された全てのモチーフは、リッチな増殖条件で生成されたデータセットから得られる。
いくつかの実施態様において、変更された活性は、活性における望ましい変化を選択する条件下で生物をスクリーニングすることによって見出すことができる。例えば、所定の微生物は、あまりよく代謝されない物質またはさらには毒性の物質を含有する培地上で生物を選択またはスクリーニングすることによって活性が増加または減少するように適合させることができる。通常あまりよく代謝されない物質中で増殖する生物の能力の増加は、例えば、その物質での増殖速度の増加をもたらす可能性がある。有毒物質に対する感受性の減少は、例えば、より高い有毒物質濃度での増殖によって証明される可能性がある。この方式で同定される遺伝学的改変は、時には、天然に存在する突然変異と称され、またはそれらを有する生物が、時には、天然に存在する突然変異体と称される場合もある。この方式で得られた改変は、プロモーター配列における変更に限定されない。すなわち、上述したような選択圧力によって微生物をスクリーニングすることは、非プロモーター配列中に発生する可能性がある遺伝子変更をもたらす可能性があり、時には、対象のヌクレオチド配列中ではないが、関連するヌクレオチド配列（例えば、同じ経路の異なる工程に関与する遺伝子、輸送遺伝子および同種のもの）中に発生する可能性もある。いくつかの実施態様において、天然に存在する突然変異体は、時には、天然に存在する変異体を固有の環境から単離することによって見出すことができる。
相同性および同一性
本明細書で示される調節されたプロモーター配列、調節配列、およびコード化ポリヌクレオチドに加えて、核酸試薬は、前述の配列（または相補的配列）に８０％またはそれより高く同一なポリヌクレオチド配列を包含していてもよい。すなわち、本明細書で説明されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％またはそれより高く、８１％またはそれより高く、８２％またはそれより高く、８３％またはそれより高く、８４％またはそれより高く、８５％またはそれより高く、８６％またはそれより高く、８７％またはそれより高く、８８％またはそれより高く、８９％またはそれより高く、９０％またはそれより高く、９１％またはそれより高く、９２％またはそれより高く、９３％またはそれより高く、９４％またはそれより高く、９５％またはそれより高く、９６％またはそれより高く、９７％またはそれより高く、９８％またはそれより高く、または９９％またはそれより高く同一なヌクレオチド配列が利用できる。用語「同一」は、本明細書で使用される場合、互いに比較した場合、実質的に同じヌクレオチド配列を有する２つまたはそれより多くのヌクレオチド配列を指す。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が実質的に同一であるかどうかを決定する試験の１つは、共通する同一なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のパーセントを決定することである。
配列同一性の計算は、以下のように行うことができる。比較目的で最適になるように配列を並べる（例えば、最適なアライメントのために第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、比較目的のために非相同配列を無視してもよい）。比較目的で並べられた参照配列の長さは、時には、参照配列の長さの、３０％またはそれより長い、４０％またはそれより長い、５０％またはそれより長い、多くの場合、６０％またはそれより長い、より多くの場合、７０％またはそれより長い、８０％またはそれより長い、９０％またはそれより長い、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチドまたはポリペプチド位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸をそれぞれ２つの配列間で比較する。第一の配列の位置が、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占められている場合、そのヌクレオチドまたはアミノ酸は、その位置において同一であるとみなされる。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入されたギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列で共通の同一な位置の数の関数である。
２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的なアルゴリズムを使用して達成できる。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０の重量残基表（weight residue table）、１２のギャップ伸長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用したＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたMeyersおよびMiller、CABIOS 4：11〜17（1989）のアルゴリズムを使用して決定できる。また２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２のマトリックスまたはＰＡＭ２５０のマトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップウェイト、および１、２、３、４、５もしくは６のレングスウェイトのいずれかを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comのｈｔｔｐアドレスで利用可能）中のギャッププログラムに組み込まれたNeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48：444〜453（1970）のアルゴリズムを使用しても決定できる。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイト、および１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ中のギャッププログラム（www.gcg.comのｈｔｔｐアドレスで利用可能）を使用して決定できる。多くの場合使用されるパラメーターのセットは、１２のＧＡＰオープンペナルティー、４のギャップ伸長ペナルティー、および５のフレームシフトギャップペナルティーを用いたＢｌｏｓｓｕｍ６２のスコアマトリックスである。
また配列同一性は、ストリンジェントな条件下で行われるハイブリダイゼーションアッセイによっても決定できる。用語「ストリンジェントな条件」は、本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を指す。ストリンジェントな条件は当業者公知であり、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ワイリー＆サンズ（John Wiley & Sons）、N.Y.、6.3.1〜6.3.6（1989）に見出すことができる。その参考文献では水性および非水性の方法が説明されており、どちらも使用できる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、続いて５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、続いて５５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、続いて６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、続いて６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。より多くの場合、ストリンジェンシー条件は、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いて６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回またはそれより多くの洗浄である。
ＵＴＲ
上述したように、核酸試薬はまた、１つまたはそれより多くの５’ＵＴＲ’、および１つまたはそれより多くの３’ＵＴＲ’を含んでいてもよい。５’ＵＴＲは、その起源となるヌクレオチド配列にとって内因性の１つまたはそれより多くの要素を含んでいてもよく、時には、１つまたはそれより多くの外因性要素を包含する。５’ＵＴＲは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのあらゆる好適な核酸に由来するものでもよいし、例えば、あらゆる好適な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、菌類、植物、昆虫または哺乳動物）に由来するものでもよい。技術者は、選ばれた発現系（例えば、選ばれた生物における発現、または例えば細胞非含有系における発現）に基づいて５’ＵＴＲに適切な要素を選択することが可能である。５’ＵＴＲは、時には、以下の当業者公知の要素：エンハンサー配列（例えば、転写または翻訳の）、転写開始部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、アクセサリータンパク質結合部位、フィードバック調節剤結合部位、プリブナウボックス、ＴＡＴＡボックス、−３５エレメント、Ｅ−ボックス（へリックス−ループ−へリックス結合要素）、リボソーム結合部位、レプリコン、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、サイレンサー要素および同種のもののうち１種またはそれより多くを含む。いくつかの実施態様において、適切な条件付きの調節に必要な全ての５’ＵＴＲ要素がプロモーター要素フラグメント中に、またはプロモーター要素フラグメントの機能的な部分配列内に含有されるように、プロモーター要素が孤立していてもよい。
核酸試薬中の５’ＵＴＲは、翻訳エンハンサーヌクレオチド配列を含んでいてもよい。翻訳エンハンサーヌクレオチド配列は、多くの場合、核酸試薬中でプロモーターと標的ヌクレオチド配列との間に配置される。翻訳エンハンサー配列は、多くの場合、リボソームに結合しており、時には、１８Ｓ ｒＲＮＡ結合リボヌクレオチド配列（すなわち、４０Ｓリボソーム結合配列）であり、時には、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳは、一般的に、多数の特異的な分子間相互作用を介して４０Ｓリボゾームサブユニットと接触する正確に配置されたＲＮＡの３次構造を有するＲＮＡの足場を形態する。リボゾームエンハンサー配列の例は公知であり、技術者により同定が可能である（例えば、Mignoneら、Nucleic Acids Research 33：D141〜D146（2005）；Paulousら、Nucleic Acids Research 31：722〜733（2003）；Akbergenovら、Nucleic Acids Research 32：239〜247（2004）；Mignoneら、Genome Biology 3（3）：総論0004.1〜0001.10（2002）；Gallie、Nucleic Acids Research 30：3401〜3411（2002）；Shaloikoら、www.interscience.wiley.comのｈｔｔｐアドレス、DOI：10.1002／bit.20267；およびGallieら、Nucleic Acids Research 15：3257〜3273（1987））。
翻訳エンハンサー配列は、時には、真核性配列、例えばコザックコンセンサス配列または他の配列（例えば、ヒドロポリプ配列、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０７１２８）である。翻訳エンハンサー配列は、時には、原核性配列、例えばシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）コンセンサス配列である。いくつかの実施態様において、翻訳エンハンサー配列は、ウイルスのヌクレオチド配列である。翻訳エンハンサー配列は、時には、例えばタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）；タバコエッチ病ウイルス（ＥＴＶ）；ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）；カブモザイク（ｐｏｔｙ）ウイルスおよびエンドウ種子伝染モザイクウイルスなどの植物ウイルスの５’ＵＴＲ由来である。いくつかの実施態様において、長さが約６７塩基のＴＭＶ由来オメガ配列が、翻訳エンハンサー配列として核酸試薬に包含される（例えば、グアノシンヌクレオチドを欠失しており、長さが２５ヌクレオチドのポリ（ＣＡＡ）中央領域を包含する）。
３’ＵＴＲは、その起源となるヌクレオチド配列にとって内因性の１つまたはそれより多くの要素を含んでいてもよく、時には、１つまたはそれより多くの外因性要素を包含する。３’ＵＴＲは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのあらゆる好適な核酸に由来するものでもよいし、例えば、あらゆる好適な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、菌類、植物、昆虫または哺乳動物）に由来するものでもよい。技術者は、選ばれた発現系（例えば、選ばれた生物における発現）に基づいて３’ＵＴＲに適切な要素を選択することが可能である。３’ＵＴＲは、時には、以下の当業者公知の要素：転写調節部位、転写開始部位、転写終結部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳終結部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、リボソーム結合部位、レプリコン、エンハンサー要素、サイレンサー要素およびポリアデノシンテールのうち１種またはそれより多くを含む。３’ＵＴＲは、多くの場合、ポリアデノシンテールを包含するが、時には包含せず、ポリアデノシンテールが存在する場合、それから１つまたはそれより多くのアデノシン部分が付加または欠失されていてもよい（例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０個のアデノシン部分が付加されてもよいし、または差し引かれてもよい）。
いくつかの実施態様において、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの改変は、プロモーターの活性を変更する（例えば、増加させる、追加する、減少させる、または実質的に除去する）のに使用できる。プロモーター活性の変更は続いて、改変された５’または３’ＵＴＲを含む作動可能に連結したプロモーター要素からの対象のヌクレオチド配列の転写を変化させることにより、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性（例えば、酵素活性）を変更できる。いくつかの実施態様において、例えば、微生物は、新規の活性（例えば、宿主生物では通常見出されない活性）を追加できる、または対象のヌクレオチド配列（例えば、対象の同種または異種ヌクレオチド配列）に作動可能に連結した同種または異種プロモーターからの転写を増加させることによって、既存の活性の発現を増加させる改変された５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。いくつかの実施態様において、微生物は、対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結した同種または異種プロモーターからの転写を減少させるかまたは実質的に除去することによって活性の発現を減少させることができる改変された５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。
標的ヌクレオチド配列
ヌクレオチド試薬は、時には、標的ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。「標的ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用される場合、対象の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードし、リボヌクレオチド配列またはデオキシリボヌクレオチド配列であってもよい。目的とする核酸は、時には、非翻訳リボ核酸であり、時には、翻訳リボ核酸である。非翻訳リボ核酸としては、これらに限定されないが、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型リボ核酸（ｓｈＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）可能な他のリボ核酸、アンチセンスリボ核酸、またはリボザイムを挙げることができる。翻訳可能な標的ヌクレオチド配列（例えば、目的とするリボヌクレオチド配列）は、時には、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードし、これらは、時には、本明細書において「標的ペプチド」、「目的とするポリペプチド」または「標的タンパク質」とも称される。
あらゆるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または１つまたはそれより多くのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質によって触媒される活性は、標的ヌクレオチド配列によってコードされていてもよいし、使用者によって選択されてもよい。代表的なタンパク質としては、酵素（例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、チオエステラーゼ、モノオキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼレダクターゼ、脂肪族アルコールオキシダーゼ、アシルトランスフェラーゼおよび同種のものなど）、抗体、血清タンパク質（例えば、アルブミン）、膜結合型タンパク質、ホルモン（例えば、成長ホルモン、エリスロポイエチン、インスリンなど）、サイトカインなどが挙げられ、さらに天然に存在するポリペプチドおよび外因的に発現されたポリペプチドの両方も挙げられる。代表的な活性（例えば、酵素、または機能的に連携して活性を提供する酵素の組み合わせ）としては、例えば、チオエステラーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、ベータ酸化活性、オメガ酸化活性および同種のものなどが挙げられる。用語「酵素」は、本明細書で使用される場合、他の化合物において化学的変化を誘導し、１種またはそれより多くの基質から１種またはそれより多くの生成物を生産する触媒として作用できるタンパク質を指す。
本明細書で説明される実施態様に有用な特異的なポリペプチド（例えば、酵素）が、本明細書で列挙される。用語「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合で連結されたアミノ酸の配列を有する分子を指す。この用語は、天然かまたは組換えかどうかに関わらず、融合タンパク質、オリゴペプチド、ペプチド、環状ペプチド、ポリペプチドおよびポリペプチド誘導体を包含し、さらにそれらのフラグメント、誘導体、相同体、および変異体も包含する。タンパク質またはポリペプチドは、時には、細胞内由来であり（例えば、インビボでは宿主細胞の細胞核、サイトゾル、または間質腔に存在する）、時には、インビボにおいて細胞膜タンパク質である。いくつかの実施態様において（上記で説明された、および下記の操作および変更方法のさらなる詳細において）、遺伝学的改変は、目的とする活性の改変（例えば、増加、実質的な増加、減少または実質的な減少）をもたらす可能性がある。
翻訳可能なヌクレオチド配列は、一般的に、開始コドン（リボ核酸ではＡＵＧおよびデオキシリボ核酸ではＡＴＧ）と終止コドン（例えば、リボ核酸ではＵＡＡ（オーカー）、ＵＡＧ（アンバー）またはＵＧＡ（オパール）、デオキシリボ核酸ではＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）との間に配置され、時には、本明細書では「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）とも称される。翻訳可能なヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）は、時には、ある生物において（例えば、ほとんどの生物は、ＣＴＧをロイシンとしてコードしている）、別の生物とは異なってコードされている（例えば、Ｃ．トロピカリスは、ＣＴＧをセリンとしてコードしている）。いくつかの実施態様において、翻訳可能なヌクレオチド配列は、ヌクレオチドドナー生物とヌクレオチドレシピエント生物（例えば、操作された生物）との間での代替の遺伝子コード（例えば、コドン使用頻度）の差が修正されるように変更される。いくつかの実施態様において、翻訳可能なヌクレオチド配列は、（ｉ）コドン使用頻度、（ｉｉ）転写効率、（ｉｉｉ）翻訳効率、（ｉｖ）その他同様のもの、およびそれらの組み合わせが改善するように変更される。
核酸試薬およびツール
核酸試薬は、時には、１つまたはそれより多くのＯＲＦを含む。ＯＲＦは、あらゆる好適な源由来でもよく、時には、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、逆転写ＲＮＡもしくは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または前述のものの１種またはそれより多くを含む核酸ライブラリー由来であってもよく、対象の核酸配列、対象のタンパク質、または対象の活性を含有するあらゆる生物種由来である。ＯＲＦを得ることができる生物の非限定的な例としては、例えば、細菌、酵母、菌類、ヒト、昆虫、線虫、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットまたはマウスが挙げられる。
核酸試薬は、時には、ＯＲＦに隣接しており、ＯＲＦと共に翻訳されてアミノ酸タグをコードするヌクレオチド配列を含む。タグをコードするヌクレオチド配列は、核酸試薬においてＯＲＦの３’および／または５’に配置されることから、ＯＲＦによってコードされたタンパク質またはペプチドのＣ末端またはＮ末端にタグがコードされる。インビトロでの転写および／または翻訳を阻止しないあらゆるタグを利用でき、技術者によって適切に選択することが可能である。タグは、培養物または発酵培地からの望ましいＯＲＦ産物の単離および／または精製を容易にする可能性がある。
タグは、時には、例えば固相の分子もしくは一部または検出可能な標識に特異的に結合するために、ＯＲＦによってコードされたタンパク質またはペプチドの単離、精製および／または検出に関する有用性を有する。いくつかの実施態様において、タグは、以下の要素：ＦＬＡＧ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫＧ）、Ｖ５（例えば、ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）、ｃ−ＭＹＣ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＨＳＶ（例えば、ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ）、インフルエンザヘマグルチニン、ＨＡ（例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、ＶＳＶ−Ｇ（例えば、ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）、細菌のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ストレプトアビジン−またはアビジン結合タグ（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）６バイオイース（6 BioEase）（商標）ゲートウェイ（Gateway）（登録商標）ビオチン化システム（インビトロジェン））、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質またはその多くの色変異体（例えば、黄色、赤色、青色）のうちの１種）、ポリリジンまたはポリアルギニン配列、ポリヒスチジン配列（例えば、Ｈｉｓ６）または金属（例えば、コバルト、亜鉛、銅）をキレート化する他の配列、ならびに／またはヒ素含有分子に結合するシステインリッチ配列のうち１種またはそれより多くを含む。いくつかの実施態様において、システインリッチタグは、アミノ酸配列ＣＣ−Ｘｎ−ＣＣを含み、ここでＸはあらゆるアミノ酸であり、ｎは１〜３であり、システインリッチ配列は、時にはＣＣＰＧＣＣである。いくつかの実施態様において、タグは、システインリッチ要素およびポリヒスチジン要素（例えば、ＣＣＰＧＣＣおよびＨｉｓ６）を含む。
タグは、多くの場合、結合パートナーに都合よく結合する。例えば、いくつかのタグは、抗体（例えば、ＦＬＡＧ）に結合し、時には、小分子に特異的に結合する。例えば、ポリヒスチジンタグは、２価金属、例えば銅、亜鉛およびコバルトを特異的にキレート化し；ポリリジンまたはポリアルギニンタグは、ジンクフィンガーに特異的に結合し；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグは、グルタチオンに結合し；システインリッチタグは、ヒ素含有分子に特異的に結合する。ヒ素含有分子としては、ＬＵＭＩＯ（商標）剤（インビトロジェン、カリフォルニア州）、例えばＦｌＡｓＨ（商標）（ＥＤＴ２［４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（１，２−エタンジチオール）２］）およびＲｅＡｓＨ試薬（例えば、Tsienらの米国特許第５，９３２，４７４号、タイトル「Target Sequences for Synthetic Molecules」；Tsienらの米国特許第６，０５４，２７１号、タイトル「Methods of Using Synthetic Molecules and Target Sequences」；全てのTsienらの、米国特許第６，４５１，５６９号および６，００８，３７８号；公開された米国特許出願第２００３／００８３３７３号、ならびに公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／２１０１３、全てのタイトル「Synthetic Molecules that Specifically React with Target Sequences」）が挙げられる。このような抗体および小分子は、時には、標的タンパク質または標的ペプチドの便利な単離のための固相に連結される。
タグは、時には、翻訳されたタンパク質またはペプチドを系中の成分に局在化する配列を含み、このような配列は、本明細書では「シグナル配列」または「局在化シグナル配列」と称される。シグナル配列は、多くの場合、標的タンパク質または標的ペプチドのＮ末端に取り込まれ、時には、Ｃ末端にも取り込まれる。シグナル配列の例は当業者公知であり、核酸試薬に容易に取り込まれ、多くの場合、核酸試薬の発現が行われる生物に従って選択される。いくつかの実施態様において、シグナル配列は、翻訳されたタンパク質またはペプチドを細胞膜に局在化する。シグナル配列の例としては、これらに限定されないが、細胞核標的シグナル（例えば、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のステロイド受容体配列およびＮ末端配列）；ミトコンドリア標的シグナル（例えば、両親媒性へリックスを形成するアミノ酸配列）；ペルオキシソーム標的シグナル（例えば、Ｓ．セレビジエ由来ＹＦＧにおけるＣ末端配列）；および分泌シグナル（例えば、インベルターゼ由来のＮ末端配列、交配因子アルファ、ＰＨＯ５およびＳ．セレビジエにおけるＳＵＣ２；Ｂ．ズブチリスタンパク質の複数のＮ末端配列（例えば、Tjalsmaら、Microbiol. Molec. Biol. Rev. 64：515〜547（2000））；アルファアミラーゼシグナル配列（例えば、米国特許第６，２８８，３０２号）；ペクチン酸リアーゼシグナル配列（例えば、米国特許第５，８４６，８１８号）；前コラーゲンシグナル配列（例えば、米国特許第５，７１２，１１４号）；ＯｍｐＡシグナル配列（例えば、米国特許第５，４７０，７１９号）；ｌａｍベータシグナル配列（例えば、米国特許第５，３８９，５２９号）；Ｂ．ブレビス（B. brevis）のシグナル配列（例えば、米国特許第５，２３２，８４１号）；ならびにＰ．パストリスのシグナル配列（例えば、米国特許第５，２６８，２７３号））が挙げられる。
タグは、時には、ＯＲＦによってコードされたアミノ酸配列と直接隣接しており（すなわち、介在配列がない）、時には、タグは、ＯＲＦでコードされたアミノ酸配列と実質的に隣接している（例えば、介在配列が存在する）。介在配列は、時には、標的タンパク質またはペプチドからタグを切断するのに有用なプロテアーゼの認識部位を包含する。いくつかの実施態様において、介在配列は、例えば、Ｘａ因子（例えば、認識部位Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ）、トロンビン（例えば、認識部位ＬＶＰＲＧＳ）、エンテロキナーゼ（例えば、認識部位ＤＤＤＤＫ）、ＴＥＶプロテアーゼ（例えば、認識部位ＥＮＬＹＦＱＧ）またはプレシジョン（PreScission）（商標）プロテアーゼ（例えば、認識部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ）によって切断される。
介在配列は、時には、本明細書では「リンカー配列」と称され、技術者によって選択されたあらゆる好適な長さを有していてもよい。リンカー配列は、時には長さが約１〜約２０アミノ酸であり、時には長さが約５〜約１０アミノ酸である。技術者であれば、リンカーの長さを選択して、標的タンパク質またはペプチドの機能を実質的に保存すること（例えば、タグは、リンカーで分離させない限り、標的タンパク質またはペプチドの機能を低減させることができる）、プロテアーゼ切断部位が存在する場合、標的タンパク質またはペプチドからのタグの解離を強化すること（例えば、リンカーが存在する場合、切断が強化される可能性がある）、およびタグ／標的タンパク質産物と固相との相互作用を強化することが可能である。リンカーは、あらゆる好適なアミノ酸含量を有していてもよく、多くの場合、比較的短い側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリンおよびスレオニン）をより高い比率で含む。
核酸試薬は、時には、タグ要素と挿入要素またはＯＲＦとの間に終止コドンを包含し、これは、タグ有りまたはタグ無しでＯＲＦを翻訳するのに有用な可能性がある。終止コドンを認識する突然変異ｔＲＮＡ分子（上記で説明した）は、翻訳の終結を抑制することから、「サプレッサーｔＲＮＡ」と名付けられている。サプレッサーｔＲＮＡは、アミノ酸の挿入および終止コドンを過ぎた後の翻訳の継続をもたらす可能性がある（例えば、２００４年７月１４日付けで出願された米国特許出願第６０／５８７，５８３号、タイトル「Production of Fusion Proteins by Cell-Free Protein Synthesis」；Eggertssonら（1988）Microbiological Review 52（3）：354〜374、およびEngleerg-Kuklaら（1996）、Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology、60章、909〜921頁、Neidhardtら編、ASMプレス（ASM Press）、ワシントンDC）。多数のサプレッサーｔＲＮＡが公知であり、例えば、これらに限定されないが、アンバー終止コドンの翻訳の終結を抑制するｓｕｐＥ、ｓｕｐＰ、ｓｕｐＤ、ｓｕｐＦおよびｓｕｐＺサプレッサー；オーカー終止コドンの機能を抑制するｓｕｐＢ、ｇｌＴ、ｓｕｐＬ、ｓｕｐＮ、ｓｕｐＣおよびｓｕｐＭサプレッサー、ならびにオパール終止コドンの機能を抑制するｇｌｙＴ、ｔｒｐＴおよびＳｕ−９サプレッサーが挙げられる。一般的に、サプレッサーｔＲＮＡは、ｔＲＮＡのアンチコドンループ中に、通常は終止コドンとして機能するコドンとｔＲＮＡが塩基対を形成することを可能にする１つまたはそれより多くの突然変異を含有する。突然変異ｔＲＮＡは、その同族アミノ酸残基で構築されていることから、終止コドンが相対したときに、その同族アミノ酸残基が翻訳ポリペプチドに挿入される。終結サプレッサーの効率を強化する（すなわち、終止コドンのリードスルーを増加させる）突然変異は同定されている。これらの突然変異としては、これらに限定されないが、ｕａｒ遺伝子（また、ｐｒｆＡ遺伝子としても知られている）における突然変異、ｕｐｓ遺伝子における突然変異、ｓｕｅＡ、ｓｕｅＢおよびｓｕｅＣ遺伝子における突然変異、ｒｐｓＤ（ｒａｍＡ）およびｒｐｓＥ（ｓｐｃＡ）遺伝子における突然変異、およびｒｐｌＬ遺伝子における突然変異が挙げられる。
したがって、ＯＲＦとタグとの間に配置された終止コドンを含む核酸試薬は、翻訳系中にサプレッサーｔＲＮＡが存在しない場合、翻訳されたＯＲＦを単独で産出することができ、翻訳系中にサプレッサーｔＲＮＡが存在する場合、翻訳されたＯＲＦ−タグ融合体を産出することができる。サプレッサーｔＲＮＡは、ｔＲＮＡをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞中で生成できる（例えば、ヒトｔＲＮＡ−Ｓｅｒサプレッサー遺伝子を含有する複製能のないアデノウイルスを、細胞にトランスフェクションさせてもよいし、または酵母または細菌のｔＲＮＡサプレッサー遺伝子を含有するＹＡＣを、酵母細胞にトランスフェクションさせてもよい）。技術者は、サプレッサーｔＲＮＡを合成するため、およびタグ有りまたはタグ無しでＯＲＦを翻訳するためのベクターを入手できる（例えば、タグ−オン−デマンド（Tag-On-Demand）（商標）キット（インビトロジェン社、カリフォルニア州）；タグ−オン−デマンド（商標）サプレッサー上清説明マニュアル、バージョンＢ、２００３年６月６日、www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/tagondemand_supernatant_man.pdfのｈｔｔｐアドレス；タグ−オン−デマンド（商標）ゲートウェイ（登録商標）ベクター説明マニュアル、バージョンＢ、２００３年６月２０日、www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/tagondemand_vectors_man.pdfのｈｔｔｐアドレス；およびCaponeら、Amber, ochre and opal suppressor tRNA genes derived from a human serine tRNA gene. EMBO J. 4：213、1985）。
核酸試薬にＯＲＦなどの要素を取り込むために、当業界公知のあらゆる便利なクローニング方策が利用可能である。挿入要素から独立してテンプレートに要素を挿入するために、公知の方法が利用でき、このような方法としては、例えば、（１）１つまたはそれより多くの既存の制限酵素部位でテンプレートを切断し、対象の要素をライゲートすること、および（２）１つまたはそれより多くの好適な制限酵素部位を包含するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズして、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅することによって、テンプレートに制限酵素部位を付加すること（本明細書でより詳細に説明される）が挙げられる。他のクローニング方策は、例えばＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション部位など、核酸試薬中に存在するかまたは核酸試薬に挿入される１つまたはそれより多くの挿入部位、および本明細書で説明される他のものを利用する方策である。いくつかの実施態様において、クローニング方策は、組換え（例えば、本明細書でさらに説明されているような、改変しようとする生物のゲノムに対象の核酸配列を含ませることによる核酸試薬の組換え）などの遺伝子操作と組み合わせることができる。いくつかの実施態様において、クローニングしたＯＲＦは、対象の１つまたはそれより多くのＯＲＦで微生物を操作することによって、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を（直接的または間接的に）生産でき、ここで上記微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、アシルトランスフェラーゼ活性、チオエステラーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性からなる群より選択される１つまたはそれより多くの変更された活性を含む。
いくつかの実施態様において、核酸試薬は、１つまたはそれより多くのリコンビナーゼ挿入部位を包含する。リコンビナーゼ挿入部位は、組換えタンパク質による統合／組換え反応に参加する核酸分子における認識配列である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列の両端にある２つの１３塩基対の逆方向反復配列（リコンビナーゼ結合部位として機能する）で構成される３４塩基対の配列である（例えば、Sauer, B.、Curr. Opin. Biotech. 5：521〜527（1994）の図１）。組換え部位の他の例としては、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列、ならびにそれらの突然変異体、フラグメント、変異体および誘導体が挙げられ、これらは、組換えタンパク質λＩｎｔによって、さらに補助的なタンパク質である組込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよび除去酵素（Ｘｉｓ）によって認識される（例えば、米国特許５，８８８，７３２第；６，１４３，５５７第；６，１７１，８６１第；６，２７０，９６９第；６，２７７，６０８第；ならびに６，７２０，１４０第；２０００年３月２日付けで出願された米国特許出願第０９／５１７，４６６号、および２００３年８月１４日付けで出願された０９／７３２，９１４号、および米国特許公報第２００２−０００７０５１−Ａ１号；Landy、Curr. Opin. Biotech. 3：699〜707（1993））。
リコンビナーゼクローニング核酸の例は、ゲートウェイ（登録商標）システム（インビトロジェン、カリフォルニア州）におけるものであり、これは、インビボまたはインビトロで望ましい核酸分子をクローニングするための少なくとも１つの組換え部位を包含する。いくつかの実施態様において、このシステムは、多くの場合バクテリオファージラムダ系（例えば、ａｔｔ１およびａｔｔ２）をベースとする少なくとも２種の異なる部位特異的な組換え部位を含有し、野生型（ａｔｔ０）部位から突然変異したベクターを利用する。各突然変異部位は、その同族パートナーである同じタイプのａｔｔ部位（すなわち、その結合パートナーの組換え部位）に対して固有の特異性を有し（例えばａｔｔＢ１とａｔｔＰ１、またはａｔｔＬ１とａｔｔＲ１）、他の突然変異体タイプの組換え部位または野生型ａｔｔ０部位とは交差反応しないと予想される。異なる部位特異性は、望ましい分子の指向性のクローニングまたはリンケージを可能にし、したがってクローニングした分子の望ましい方向性を提供する。組換え部位を両端に有する核酸フラグメントは、ゲートウェイ（登録商標）システムを使用して、時にはデスティネーションベクターとも称されるレシピエントプラスミド分子においてａｔｔ部位を両端に有する選択マーカー（例えば、ｃｃｄＢ）を置き換えることによってクローニングおよびサブクローニングされる。次いで、ｃｃｄＢ感受性宿主株の形質転換およびレシピエント分子上のマーカーでの陽性選択によって望ましいクローンを選択する。陰性選択に関する類似の方策（例えば、毒性遺伝子の使用）は、哺乳動物および昆虫におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）などの他の生物で使用できる。
酵母の操作に有用な組換え系を簡単に概説する。このような系は、ＵＲＡ３遺伝子（例えば、Ｓ．セレビジエおよびＣ．アルビカンスの場合）またはＵＲＡ４およびＵＲＡ５遺伝子（例えば、Ｓ．ポンベの場合など）、ならびにヌクレオチド類似体である５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）の毒性を利用する。ＵＲＡ３またはＵＲＡ４およびＵＲＡ５遺伝子は、オロチジン−５’−一リン酸（ＯＭＰ）デカルボキシラーゼ（orotine-5’-monophosphate (OMP) dicarboxylase）をコードする。活性なＵＲＡ３またはＵＲＡ４およびＵＲＡ５遺伝子を有する酵母（表現型ではＵｒａ＋）は、５−ＦＯＡを、酵母細胞にとって毒性のフルオロデオキシウリジンに変換する。適切な遺伝子における突然変異を有する、または適切な遺伝子のノックアウトを有する酵母は、培地にウラシルも補充される場合、５−ＦＯＡの存在下でも増殖できる。
同じヌクレオチド配列のどちらかの側の両端に同じ方向で配置されたＵＲＡ３遺伝子またはカセット（Ｓ．セレビジエの場合）を含んでいてもよい、核酸操作用コンストラクトを作製できる。ＵＲＡ３カセットは、プロモーター、ＵＲＡ３遺伝子および機能的な転写ターミネーターを含む。標的配列が、ＵＲＡ３カセットのどちらかの側に配置されたフランキング配列と隣接し接触するように、操作しようとする生物中でコンストラクトを特定の核酸の関心領域に向かわせる標的配列が付加される。酵母を操作用コンストラクトで形質転換させて、ウラシル非含有の最小培地で平板培養してもよい。コロニーをＰＣＲでスクリーニングして、ゲノムの適切な位置に操作用コンストラクトが挿入された形質転換株を決定してもよい。ｕｒａ３カセットの組換えに関して選択する前に挿入位置をチェックすることにより、手法の後段階に持ち越される不正確なクローンの数を減らすことができる。次いで正確に挿入された形質転換株を５−ＦＯＡを含有する最小培地で平板培養して複製し、コンストラクトからＵＲＡ３カセットの組換えに関して選択して、破壊された遺伝子および破壊された遺伝子の存在を検証するのに使用できる同定可能なフットプリント（例えば、核酸配列）を残すことができる。説明した技術は、遺伝子の機能を破壊または「ノックアウト」するのに有用であるが、標的化された配列特異的な方式で宿主生物のゲノムに遺伝子またはコンストラクトを挿入するためにも使用できる。
いくつかの実施態様において、核酸試薬は、１つまたはそれより多くのトポイソメラーゼ挿入部位を包含する。トポイソメラーゼ挿入部位は、部位特異的なトポイソメラーゼで認識されて結合される定義済みのヌクレオチド配列である。例えば、ヌクレオチド配列５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ−３’は、ワクシニアウイルスＤＮＡトポイソメラーゼＩなどのほとんどのポックスウイルストポイソメラーゼと特異的に結合するトポイソメラーゼ認識部位である。認識配列に結合した後、トポイソメラーゼは、認識部位の最も３’側にあるチミジンで鎖を切断して、トポイソメラーゼ中のチロシンを介して３’リン酸に共有結合したトポイソメラーゼの複合体である５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ−ＰＯ４−ＴＯＰＯを含むヌクレオチド配列を生産する（例えば、Shuman、J. Biol. Chem. 266：11372〜11379、1991；SekiguchiおよびShuman、Nucl. Acids Res. 22：5360〜5365、1994；米国特許第５，７６６，８９１号；ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６０９９；およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１２３７２）。それに対して、ヌクレオチド配列５’−ＧＣＡＡＣＴＴ−３’は、タイプＩＡ大腸菌トポイソメラーゼＩＩＩのためのトポイソメラーゼ認識部位である。挿入しようとする要素は、多くの場合、トポイソメラーゼと反応したテンプレートと組み合わされ、それによって核酸試薬に取り込まれる（例えば、ワールドワイドウェブＵＲＬ、invitrogen.com/downloads/F-１３５１２_Topo_Flyer.pdf；ワールドワイドウェブＵＲＬ、invitrogen.com/content/sfs/brochures/710_021849%20_B_TOPOCloning_bro.pdf；ＴＯＰＯ ＴＡクローニング（TOPO TA Cloning）（登録商標）キットおよびゼロブラント（Zero Blunt）（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットの製品情報）。
核酸試薬は、時には、１つまたはそれより多くの複製起点（ＯＲＩ）要素を含有する。いくつかの実施態様において、テンプレートは、２またはそれより多くのＯＲＩを含み、その場合、一方はある生物（例えば、細菌）において効率的に機能し、他方は別の生物（例えば、真核生物、例えば酵母）において効率的に機能する。いくつかの実施態様において、ＯＲＩは、ある種（例えば、Ｓ．セレビジエ）において効率的に機能する可能性があり、別のＯＲＩは、異なる種（例えば、Ｓ．ポンベなど）において効率的に機能する可能性がある。また核酸試薬は、時には、１つまたはそれより多くの転写調節部位も包含する。
核酸試薬は、１つまたはそれより多くの選択要素（例えば、選択的に調節可能なプロモーター要素の活性化ではなく、核酸試薬の存在を選択するための要素）を包含していてもよい。選択要素は、多くの場合、核酸試薬が細胞に包含されているかどうかを決定する公知のプロセスを使用して利用される。いくつかの実施態様において、核酸試薬は、２種またはそれより多くの選択要素を包含し、その場合、一方はある生物において効率的に機能し、他方は別の生物において効率的に機能する。選択要素の例としては、これらに限定されないが、（１）別の状況では毒性の化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する生成物をコードする核酸セグメント；（２）別の状況ではレシピエント細胞中で欠失している生成物（例えば、必須の生成物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定できる生成物（例えば、表現型マーカー、例えば抗生物質（例えば、β−ラクタマーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質）をコードする核酸セグメント；（５）別の状況では細胞の生存および／または機能に有害な生成物に結合する核酸セグメント；（６）別の状況では上記の１〜５番で説明された核酸セグメントのいずれかの活性を阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する生成物に結合する核酸セグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）望ましい分子を単離または同定するのに使用できる核酸セグメント（例えば、特異的なタンパク質結合部位）；（９）別の状況では非機能的な可能性がある特異的なヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の部分集団のＰＣＲ増幅のための）；（１０）存在しない場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において、毒性であるか、または比較的非毒性の化合物を毒性の化合物に変換するかのいずれかである生成物をコードする核酸セグメント（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）；（１２）それらを含有する核酸分子の複製、分割または遺伝を阻害する核酸セグメント；ならびに／または（１３）条件付きの複製機能、例えば、所定の宿主または宿主細胞株での、または所定の環境条件下での（例えば、温度、栄養条件および同種のもの）複製をコードする核酸セグメントが挙げられる。
核酸試薬は、インビボでの転写および／または翻訳に有用なあらゆる形態を有する。核酸は、時には、プラスミド、例えばスーパーコイルプラスミドであり、時には、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）であり、時には、直鎖状の核酸（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素消化によって生産された直鎖状の核酸）であり、時には、一本鎖であり、時には、二本鎖である。核酸試薬は、時には、増幅プロセス、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスまたは転写介在増幅プロセス（ＴＭＡ）によって調製される。ＴＭＡでは、等温反応で２種の酵素を使用して、光の放出によって検出される増幅産物を生産する（例えば、Biochemistry、1996年6月25日；35（25）：8429〜38およびwww.devicelink.com/ivdt/archive/00/11/007.htmlのｈｔｔｐアドレスを参照）。標準的なＰＣＲプロセスは公知であり（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；４，６８３，１９５号；４，９６５，１８８号；および５，６５６，４９３号）、一般的に数サイクルで行われる。各サイクルは、ハイブリッド核酸が解離する熱変性；プライマーであるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする冷却；およびポリメラーゼ（すなわち、Ｔａｑポリメラーゼ）によるオリゴヌクレオチド伸長を包含する。ＰＣＲの周期的プロセスの例は、サンプルを９５℃で５分間処置すること；９５℃で１分間、５９℃で１分間、１０秒間、および７２℃で１分３０秒間を４５サイクル繰り返すこと；次いでサンプルを７２℃で５分間処置することである。複数のサイクルは、市販のサーマルサイクラーを使用して行われることが多い。ＰＣＲ増幅産物は、時には、より低温で（例えば、４℃で）所定時間保存され、時には、分析前に凍結させる（例えば、−２０℃で）。
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される核酸試薬、タンパク質試薬、タンパク質フラグメント試薬または他の試薬は、単離または精製される。用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、材料がその元の環境（例えば、それが天然に存在するものの場合は天然の環境、または外因的に発現されるものの場合は宿主細胞）から取り出されることを指し、したがって「人為的に」その元の環境から変更された材料を指す。用語「精製された」は、本明細書で分子に関して使用される場合、絶対純度を意味しない。そうではなく、「精製された」は、対象の物質以外の同じクラスに含まれる物質種（例えば、核酸またはタンパク質種）の含量が、その元となるサンプルと比較してより少なくなっている組成を有する物質を指す。「精製された」は、例えば核酸またはタンパク質の場合、対象の核酸またはタンパク質以外の核酸種またはタンパク質種の含量が、その元となるサンプルと比較してより少なくなっている組成を有する物質を指す。時には、タンパク質または核酸は「実質的に純粋」であり、これは、そのタンパク質または核酸が、組成物の質量に基づき少なくとも５０％のタンパク質または核酸で存在することを示す。多くの場合、実質的に純粋なタンパク質または核酸は、組成物の質量に基づき少なくとも７５％、時には組成物の質量に基づき少なくとも９５％である。
操作および変更方法
本明細書で説明される方法および組成物（例えば、核酸試薬）は、操作された微生物を生成するのに使用できる。上述したように、用語「操作された微生物」は、本明細書で使用される場合、改変のための開始点として利用される微生物（例えば、宿主微生物または改変されていない生物）中に存在する活性とは異なる１種またはそれより多くの活性を包含する改変された生物を指す。典型的には、通常、容易に利用できる技術を使用して当業者により導入または選択された遺伝学的改変の結果として操作された微生物が生じる。変更された活性を生成するのに有用な方法の非限定的な例としては、異種ポリヌクレオチドを導入すること（例えば、核酸または遺伝子統合、また「ノックイン」とも称される）、内因性ポリヌクレオチドを除去すること、既存の内因性核酸配列の配列を変更すること（例えば、部位特異的変異誘発）、既存の内因性核酸配列の破壊（例えば、ノックアウトおよびトランスポゾンまたは挿入要素が介在する変異誘発）、選択により安定して遺伝する可能性がある天然に存在する活性において変化が引き起こされる、変更された活性に関する選択（例えば、生物のゲノム中、または複製されて娘細胞に継承される後成的な核酸中での核酸配列の変化を引き起こす）、ＰＣＲベースの変異誘発および同種のものが挙げられる。用語「変異誘発」は、本明細書で使用される場合、その後宿主または改変された生物において生成物を生成させるのに使用される核酸（例えば、核酸試薬、または宿主染色体）へのあらゆる改変を指す。変異誘発の非限定的な例としては、欠失、挿入、置換、再構成、点突然変異、サプレッサー変異および同種のものが挙げられる。変異誘発方法は当業界公知であり、技術者にとって容易に利用できるものである。変異誘発方法の非限定的な例が本明細書で説明されており、また、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーでも見出すことができる。変異誘発の他の非限定的な例は、ストラタジーン（Stratagene）（カリフォルニア州サンディエゴ）「クイックチェンジ（QuickChange）」キットを製造元の説明書に従って使用して行うことができる。
用語「遺伝学的改変」は、本明細書で使用される場合、操作された微生物における標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産を容易にするあらゆる好適な核酸の付加、除去または変更を指す。遺伝学的改変としては、これらに限定されないが、１つまたはそれより多くの位置における宿主生物の天然の核酸中の１つまたはそれより多くのヌクレオチドの挿入、１つまたはそれより多くの位置における宿主生物の天然の核酸中の１つまたはそれより多くのヌクレオチドの欠失、１つまたはそれより多くの位置における宿主生物の天然の核酸中の１つまたはそれより多くのヌクレオチドの改変もしくは置換、宿主生物への非天然の核酸の挿入（例えば、自律複製ベクターの挿入）、および宿主生物における非天然の核酸の除去（例えば、ベクターの除去）が挙げられる。
用語「異種ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、いくつかの実施態様において、宿主微生物中に存在しないヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、宿主微生物の場合とは異なる量（例えば、異なるコピー数）で存在し、これは、例えば、宿主微生物に特定のヌクレオチド配列のより多くのコピーを導入することによって達成できる（例えば、特定のヌクレオチド配列は、宿主染色体の自律的な核酸中に存在していてもよいし、または染色体に挿入されてもよい）。異種ポリヌクレオチドは、いくつかの実施態様において、異なる生物由来であり、いくつかの実施態様において、同じタイプの生物由来であるが、外部の源（例えば、組換え源）由来である。
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される方法および核酸試薬を使用して操作された生物は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産できる。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、脂肪酸シンターゼ活性、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性からなる群より選択される１つまたはそれより多くの変更された活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明されるような操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、脂肪酸シンターゼ活性、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性およびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、変更されたチオエステラーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、チオエステラーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝子変更を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、チオエステラーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝子変更を含む操作された微生物は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。
用語「変更された活性」は、本明細書で使用される場合、操作された微生物における、宿主微生物と比べて追加または改変された活性（例えば、追加された、増加した、低減された、阻害された、または除去された活性）を指す。活性は、追加された、増加した、低減された、阻害された、または除去された活性を有する操作された微生物が産出する遺伝学的改変を宿主微生物に導入することによって変更されてもよい。
追加された活性は、多くの場合、宿主微生物では検出不可能な活性である。増加した活性は、一般的に、操作された微生物において増加した、宿主微生物において検出可能な活性である。活性は、標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産に関してあらゆる好適なレベルに増加させることができ、このような増加としては、これらに限定されないが、２倍未満（例えば、約１０％の増加から約９９％の増加；約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の増加）、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、もしくは１０倍の増加、または約１０倍より多くの増加が挙げられる。低減された活性または阻害された活性は、一般的に、操作された微生物において低減または阻害された、宿主微生物において検出可能な活性である。活性は、いくつかの実施態様において、検出不可能なレベルに低減される場合もあるし、またはいくつかの実施態様において、検出可能なレベルに低減される場合もある。活性は、標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産に関してあらゆる好適なレベルに減少させることができ、このような減少としては、これらに限定されないが、２倍未満（例えば、約１０％の減少から約９９％の減少；約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の減少）、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、もしくは１０倍の減少、または約１０倍より多くの減少が挙げられる。
用語「レベル」は、本明細書で使用される場合、多くの場合、タンパク質または核酸（例えばＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）またはＤＮＡ）のレベルまたは量（例えば、定量的な量または相対的な量）を指す。
変更された活性は、時には、宿主生物において検出不可能な活性であって、操作された生物に追加される活性である。変更された活性はまた、宿主生物において検出可能な活性であって、操作された生物において増加する活性であってもよい。いくつかの実施態様において、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させることによって追加されるかまたは増加してもよい。いくつかの実施態様において、天然ポリペプチドの活性は、改変された生物中で該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を増加させること（例えば、ポリヌクレオチドの１〜約１００個の追加のコピーを導入すること（例えば、ポリヌクレオチドの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０個またはそれより多くの追加のコピーを導入すること）によって増加させることができる。いくつかの実施態様において、活性は、追加された活性を有する異種ポリペプチドをコードする、または改変された内因性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主微生物に挿入することによって追加または増加させることができる。このような実施態様において、ポリヌクレオチドの１〜約１００個のコピーを導入してもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０個のコピーを導入してもよい）。「改変された内因性ポリペプチド」は、多くの場合、天然ポリペプチド対応物の活性とは異なる活性（例えば、異なる触媒活性および／または異なる基質特異性）を有し、多くの場合、活性である（例えば、活性（例えば、基質の転換）は、検出可能である）。いくつかの実施態様において、活性は、（ｉ）追加された活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（ｉｉ）ポリヌクレオチド生産をアップレギュレートする異種ポリヌクレオチドを宿主微生物に挿入することによって追加または増加できる。したがって、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節性ポリヌクレオチドを挿入するか、またはそれを改変することによって追加または増加できる。いくつかの実施態様において、活性は、宿主微生物を選択的な環境に晒して、標的活性の検出可能なレベルを有する微生物に関してスクリーニングすることによって追加または増加できる。選択的な環境の例としては、これらに限定されないが、宿主生物がプロセシングできる基質を含有する培地、および宿主生物がプロセシングできる基質が欠失した培地が挙げられる。
変更された活性は、時には、宿主生物において検出可能な活性であって、操作された生物において低減、阻害または除去された（すなわち、検出不可能な）活性である。いくつかの実施態様において、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数を減少させることによって低減または除去してもよい。いくつかの実施態様において、活性は、（ｉ）標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内にポリヌクレオチドを挿入すること（破壊的挿入）、および／または（ｉｉ）標的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部または全部を除去すること（それぞれ欠失またはノックアウト）によって低減または除去できる。いくつかの実施態様において、活性は、（ｉ）標的活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、（ｉｉ）ポリヌクレオチド生産をダウンレギュレートする異種ポリヌクレオチドを宿主微生物に挿入することによって低減または除去できる。したがって、活性は、標的活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節性ポリヌクレオチドを挿入するか、またはそれを改変することによって低減または除去できる。
活性はまた、（ｉ）その活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを阻害すること、または（ｉｉ）その活性を有するポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを阻害することによっても低減または除去できる。ポリヌクレオチドは、当業界公知の好適な技術によって阻害でき、例えばポリヌクレオチドによってコードされたＲＮＡを、特異的な阻害性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）と接触させることによって阻害できる。活性はまた、その活性を有するポリペプチドを、その活性を特異的に阻害する分子（例えば、酵素阻害剤、抗体）と接触させることによっても低減または除去できる。いくつかの実施態様において、活性は、宿主微生物を選択的な環境に晒し、標的活性のレベルが低減されたかまたは標的活性が除去された微生物に関してスクリーニングすることによって低減または除去できる。
いくつかの実施態様において、非翻訳リボ核酸、またはｃＤＮＡは、特定の活性または酵素の発現を低減させるのに使用できる。例えば、微生物は、対象の活性をコードする対象の核酸配列に部分的または実質的に相同なＲＮＡ分子を生産することによって活性の発現を低減させる核酸試薬を発現させる遺伝学的改変によって操作されてもよい。いくつかの実施態様において、ＲＮＡ分子は、対象の核酸配列に結合して、核酸配列がその天然の機能を発揮しないようにすることができる。いくつかの実施態様において、ＲＮＡは、対象の核酸配列がその天然の機能を発揮できなくなるような方式で（例えば、リボザイムの作用によって）対象の活性をコードする対象の核酸配列を変更する可能性がある。
いくつかの実施態様において、ヌクレオチド配列が、時には、プロモーター、５’ＵＴＲ、標的配列、または３’ＵＴＲ要素などの核酸試薬要素のうち１またはそれより多くに付加される、それらから改変または除去されることにより、このような要素が核酸試薬に取り込まれる前または後に、転写および／または翻訳が強化される、強化される可能性がある、低減される、または低減される可能性がある。いくつかの実施態様において、以下の配列：安定な２次構造を形成する配列（例えば、四重構造またはステム・ループ・ステム構造（例えば、ＥＭＢＬ配列であるＸ１２９４９、ＡＦ２７４９５４、ＡＦ１３９９８０、ＡＦ１５２９６１、Ｓ９５９３６、Ｕ１９４１４４、ＡＦ１１６６４９、またはこのようなステム・ループ・ステム構造を形成する実質的に同一な配列））；標的ヌクレオチド配列の開始コドン上流の翻訳開始コドン；標的ヌクレオチド配列の翻訳開始コドン上流の終止コドン；標的ヌクレオチド配列の翻訳開始コドン上流のＯＲＦ；鉄応答要素（ＩＲＥ）または類似の配列；および５’末端オリゴピリミジン配列（ＴＯＰ、例えば、キャップに隣接する５−１５ピリミジンからなる配列）のうち１種またはそれより多くが、５’ＵＴＲ中に存在する場合、改変または除去される可能性がある。翻訳エンハンサー配列および／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が、時には、５’ＵＴＲ（例えば、ＥＭＢＬヌクレオチド配列であるＪ０４５１３、Ｘ８７９４９、Ｍ９５８２５、Ｍ１２７８３、ＡＦ０２５８４１、ＡＦ０１３２６３、ＡＦ００６８２２、Ｍ１７１６９、Ｍ１３４４０、Ｍ２２４２７、Ｄ１４８３８およびＭ１７４４６、ならびに実質的に同一なヌクレオチド配列）に挿入される。
非センスコドンの後に続くＡＵリッチ要素（ＡＲＥ、例えば、ＡＵＵＵＡ反復配列）および／またはスプライシングジャンクションは、時には、３’ＵＴＲから除去されるか、または３’ＵＴＲにおいて改変される。ポリアデノシンテールは、時には、存在しない場合、３’ＵＴＲに挿入され、時には、存在する場合、除去され、アデノシン部分は、時には、３’ＵＴＲ中に存在するポリアデノシンテールに付加されるか、またはそれから除去される。したがって、いくつかの実施態様は、翻訳効率が増加される、増加される可能性がある、低減される、または低減される可能性がある何らかのヌクレオチド配列が要素中に存在するかどうかを決定すること、およびそれらが同定された場合、このような配列のうち１またはそれより多くを付加、除去、または改変することを含むプロセスを対象とする。所定の実施態様は、翻訳効率を増加させる、または、増加させる可能性がある何らかのヌクレオチド配列が要素中に存在しないかどうかを決定すること、および核酸試薬にこのような配列を取り込むことを含むプロセスを対象とする。
いくつかの実施態様において、活性は、ＯＲＦのヌクレオチド配列を改変することによって変更されてもよい。時には、（例えば、点変異、欠失突然変異、挿入突然変異、ＰＣＲベースの変異誘発および同種のものによって）ＯＲＦを突然変異または改変することにより、コードされたタンパク質またはペプチドの活性が、変更される、強化される、または増加される、低減される、実質的に低減もしくは除去される。改変されたＯＲＦによってコードされたタンパク質またはペプチドは、時には、より低い量で生産されるか、または検出可能なレベルで生産されない場合もあり、他の実施態様において、改変されたＯＲＦによってコードされた生成物またはタンパク質は、より高いレベルで生産される（例えば、時には、宿主生物または操作された生物において優先的に使用されるｔＲＮＡに適合するように、コドンが改変される）。相対的な活性を決定するために、突然変異したＯＲＦ（またはそれを含有する細胞）の生成物からの活性を、改変されていないＯＲＦ（またはそれを含有する細胞）によってコードされた生成物またはタンパク質の活性と比較してもよい。
いくつかの実施態様において、時には、ＯＲＦのヌクレオチド配列を突然変異または改変することにより、アミノ酸をコードするのに使用される三つ組みのヌクレオチド配列（例えば、アミノ酸コドンの三つ組み）を変更する。コドンの三つ組みを変更するためのＯＲＦのヌクレオチド配列改変は、時には、ＯＲＦまたは核酸試薬が発現されると予想される生物の好ましいコドン使用頻度をよりよくマッチングするために元の配列に見出されるコドンを変化させるのに使用される。細菌におけるコドン使用頻度、したがって核酸配列によってコードされたコドンの三つ組みは、例えば酵母または植物のような真核生物において好ましいコドン使用頻度とは異なっている可能性がある。好ましいコドン使用頻度もまた、細菌種間でも異なっている可能性がある。いくつかの実施態様において、ＯＲＦのヌクレオチド配列は、時には、コドン対が除去される、および／またはＯＲＦのヌクレオチド配列によってコードされたｍＲＮＡの翻訳中に中断を引き起こす可能性があるｍＲＮＡの２次構造が除去されるように改変される。翻訳の中断は、時には、ｍＲＮＡ中に核酸の２次構造が存在する場合に起こり、時には、リボソームの中断を引き起こすことによって翻訳速度を遅くするコドン対の存在に起因して起こる。いくつかの実施態様において、より低い存在量のコドンの三つ組みを使用すれば、リボソーム翻訳機構にｔＲＮＡを入れるのに必要な中断時間が短縮されるため、翻訳の中断を少なくすることができる。それゆえに、細菌における転写および翻訳効率を増加させるためには（例えば、転写および翻訳が同時に起こる場合）または真核生物において翻訳効率を増加させるためには（例えば、転写および翻訳が機能的に別個になっている場合）、対象のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列は、宿主および／または遺伝子改変微生物の転写および／または翻訳機構により適するように変更されてもよい。いくつかの実施態様において、リボソームを低速化したりまたは中断させたりするより低い存在量のコドンを使用することによる翻訳速度の遅延により、正確に折り畳まれたタンパク質の増加と封入体形成の低減によってより高い収量の望ましい生成物が得られる可能性がある。
ドナー生物のヌクレオチド配列のコドン分布を決定して、そのコドン分布を、レシピエントまたは宿主生物におけるコドン分布と比較することによって、所定の生物により、好ましい使用に従ってコドンを変更して最適化してもよい。次いで本明細書で説明される技術（例えば、部位特異的変異誘発および同種のもの）を使用して、それに従いコドンを変更してもよい。コドン使用頻度の比較は、手作業でなされるか、または技術者に市販されている核酸分析ソフトウェアを使用してなされる。
またＯＲＦのヌクレオチド配列の改変は、異なる生物において相違するコドンの三つ組み配列を修正するのにも使用できる。例えば、所定の酵母（例えば、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．マルトサ（C. maltosa））は、セリンをコードするためには、アミノ酸三つ組みＣＵＧ（例えば、ＤＮＡ配列ではＣＴＧ）を使用する。典型的には、ＣＵＧは、ほとんどの生物ではロイシンをコードする。得られたポリペプチドまたはタンパク質中で正しいアミノ酸を維持するために、核酸試薬が発現されると予想される生物を考慮してＣＵＧコドンを変更しなければならない。したがって、細菌ドナーからのＯＲＦを上述のカンジダ属の酵母株のいずれかで発現させようとするならば、まず異種ヌクレオチド配列を適切なロイシンコドンに変更または改変しなければならない。それゆえに、いくつかの実施態様において、ＯＲＦのヌクレオチド配列は、時には、異なる生物間のアミノ酸のコドン三つ組みの進化において生じた差が修正されるように変更または改変される。いくつかの実施態様において、コードされたアミノ酸が保存的であるか、または元々コードされていたアミノ酸と比較してアミノ酸中で中立的な変化である場合、ヌクレオチド配列を特定のアミノ酸コドンで不変のままにしてもよい。
いくつかの実施態様において、活性は、例えば終止コドンのような翻訳調節シグナルを改変することによって変更されてもよい。ＯＲＦの末端における終止コドンは、時には、上記で説明したアンバー終止コドンなどの別の終止コドンに改変される。いくつかの実施態様において、終止コドンは、時には、挿入または既存のコドンの突然変異によってＯＲＦ内に導入される。改変された末端終止コドンおよび／または内部終止コドンを含むＯＲＦは、多くの場合、終止コドンを認識するサプレッサーｔＲＮＡを含む系中で翻訳される。終止コドンを含むＯＲＦは、時には、標的タンパク質または標的ペプチドの翻訳中に非天然アミノ酸を取り込むサプレッサーｔＲＮＡを含む系中で翻訳される。標的タンパク質またはペプチドに非天然アミノ酸を取り込む方法は公知であり、このような方法としては、例えば、異種ｔＲＮＡ／シンセターゼ対を利用するプロセスが挙げられ、この場合、ｔＲＮＡは、アンバー終止コドンを認識し、非天然アミノ酸と共に充填される（例えば、ワールドワイドウェブＵＲＬのiupac.org/news/prize/2003/wang.pdf）。
変更（例えば、変異誘発、導入または欠失による）のために選ばれる核酸試薬の部分（例えば、プロモーター、５’または３’ＵＴＲ、ＯＲＩ、ＯＲＦおよび同種のもの）に応じて、上記で説明した改変は、（ｉ）フィードバック阻害メカニズムを増加または減少させること、（ｉｉ）プロモーターの開始を増加または減少させること、（ｉｉｉ）翻訳開始を増加または減少させること、（ｉｖ）翻訳効率を増加または減少させること、（ｖ）本明細書で説明される核酸試薬から発現されるペプチドまたは生成物の局在化を改変すること、または（ｖｉ）対象のヌクレオチド配列のコピー数を増加または減少させること、（ｖｉｉ）アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび同種のものの発現によって所定の活性を変更できる。いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、フィードバック阻害に関与する領域（例えば、５’ＵＴＲ、プロモーターおよび同種のもの）を変更できる。時には、フィードバックレギュレーターの結合を追加または強化できる改変がなされ、時には、フィードバックレギュレーターの結合を低減させる、阻害する、または除去することができる改変がなされる。
いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、転写開始に関与する配列（例えば、プロモーター、５’ＵＴＲおよび同種のもの）を変更できる。時には、内因性または異種プロモーター要素からの開始を強化または増加させることができる改変がなされてもよい。時には、転写開始を増加または強化して、結果として内因性または異種プロモーター要素からの転写の減少または除去を引き起こす配列を除去または破壊する改変がなされてもよい。
いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、翻訳開始または翻訳効率に関与する配列（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、より高いまたはより低い存在量のコドンの三つ組み、翻訳ターミネーター配列および同種のもの）を変更できる。時には、翻訳開始を増加または減少させて、例えばリボソーム結合部位を改変できる改変がなされてもよい。時には、翻訳効率を増加または減少させることができる改変がなされてもよい。翻訳開始および翻訳効率を変更するためになされ得る遺伝学的改変の非限定的な例は、ヘアピンを形成する配列を除去または付加して、程度の差はあるが好ましいコドンにコドンの三つ組みを変化させることである。
いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、ペプチド、タンパク質または他の望ましい生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸など）の局在化に関与する配列を変更できる。時には、細胞内の細胞器官、ペリプラスム、細胞膜、または細胞外にポリペプチド、タンパク質または生成物を標的化することに関与する配列を変更、付加、または除去できる改変がなされてもよい。異なる細胞内空間または細胞外への異種生成物の輸送は、時には、封入体（例えば、望ましい生成物の不溶性集合体）の形成を低減または除去する可能性がある。
いくつかの実施態様において、核酸試薬またはヌクレオチド配列の変更は、対象のヌクレオチド配列のコピー数を増加または減少させることに関与する配列を変更できる。時には、生物のゲノムに、または後成的な核酸試薬上に安定して統合されるＯＲＦのコピー数を増加または減少させる改変がなされてもよい。対象の配列のコピー数を増加させることができる変更の非限定的な例としては、ゲノム中の領域の複製によって（例えば、組換えによって、または宿主ゲノムの遺伝子増幅を引き起こすことによって追加のコピーを付加することなど）対象の配列のコピーを追加すること、核酸試薬上に配列の追加のコピーをクローニングすること、または後成的な核酸試薬のコピー数が増加するようにＯＲＩを変更することが挙げられる。対象の配列のコピー数を減少させることができる変更の非限定的な例としては、ゲノム中の領域の欠失または破壊によって対象の配列のコピーを除去すること、後成的な核酸試薬から該配列の追加のコピーを除去すること、または後成的な核酸試薬のコピー数が減少するようにＯＲＩを変更することが挙げられる。
いくつかの実施態様において、対象のヌクレオチド配列の発現を増加または減少させることは、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび同種のものの発現に関与する配列を変更、付加または除去することによっても達成できる。上記で説明した方法は、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよび同種のものの発現を改変するのに使用できる。
本明細書で説明される方法および核酸試薬は、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の合成に関与する細胞プロセスにおいて変更された活性を有する遺伝子改変微生物を生成するのに使用できる。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの増加したコピー数を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの増加したコピー数を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来であってもよい。いくつかの実施態様において、細菌は、アシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属またはザントバクター属の細菌であってもよい。
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来であってもよい。いくつかの実施態様において、細菌は、バチルス属の細菌であってもよい。いくつかの実施態様において、バチルス属の細菌は、Ｂ．メガテリウムである。
いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸の変換を低減させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を低減させることができる。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、ベータ酸化活性を低減させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、本明細書で説明される標的活性を低減させることができる。
いくつかの実施態様において、本明細書で説明されるような脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する操作された微生物は、変更されたモノオキシゲナーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を変更する遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの増加したコピー数を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される操作された微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来であってもよい。いくつかの実施態様において、細菌は、バチルス属の細菌であってもよい。いくつかの実施態様において、バチルス属の細菌は、Ｂ．メガテリウムである。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、ポリケチドシンターゼ活性を低減させることができる。
いくつかの実施態様において、本明細書で説明されるような脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する操作された微生物は、変更されたチオエステラーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、チオエステラーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
いくつかの実施態様において、変更されたチオエステラーゼ活性を有する操作された微生物は、変更されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、変更されたチオエステラーゼ活性を有する操作された微生物は、オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、変更されたオメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来であってもよい。いくつかの実施態様において、細菌は、アシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属またはザントバクター属の細菌であってもよい。
本明細書で説明されるような脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生産する操作された微生物は、変更されたオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を追加するかまたは増加させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、変更されたオメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、細菌由来である。いくつかの実施態様において、細菌は、アシネトバクター属、ノカルジア属、シュードモナス属またはザントバクター属の細菌であってもよい。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、真核生物であってもよい。いくつかの実施態様において、真核生物は、酵母であってもよい。いくつかの実施態様において、真核生物は、真菌であってもよい。いくつかの実施態様において、酵母は、カンジダ属の酵母であってもよい。いくつかの実施態様において、カンジダ属の酵母は、Ｃ．トロピカリスであってもよい。いくつかの実施態様において、真菌は、ヤロウイア属の真菌であってもよい。いくつかの実施態様において、ヤロウイア属の真菌は、Ｙ．リポリチカであってもよい。いくつかの実施態様において、真菌は、アスペルギルス属の真菌であってもよい。いくつかの実施態様において、アスペルギルス属の真菌は、Ａ．パラスティカスまたはＡ．ニデュランスであってもよい。いくつかの実施態様において、上述したような操作された微生物は、オメガヒドロキシル脂肪酸の変換を低減させる遺伝学的改変を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性を低減させることができる。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、ベータ酸化活性を低減させることができる。いくつかの実施態様において、該遺伝学的改変は、本明細書で説明される標的活性を低減させることができる。
操作された微生物は、上述したように、宿主ゲノム中に、または安定して維持される後成的な核酸試薬中にヌクレオチド配列を変更、導入または除去することによって調製できる。宿主ゲノムまたは後成的な核酸中にヌクレオチド配列を変更、導入または除去するのに使用される核酸試薬は、本明細書で説明される方法または技術者に利用可能な方法を使用して調製できる。
望ましい活性を有する核酸配列は、公知の参考マニュアルで説明されている溶解および核酸精製手法を使用して（例えば、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）、または市販の細胞溶解およびＤＮＡ精製試薬およびキットを使用して好適な生物の細胞から単離できる。いくつかの実施態様において、微生物を操作するのに使用される核酸は、その核酸を含有する生物をプロセシングした後に本明細書で説明される方法を行うために提供できる。例えば、対象の核酸は、サンプルから（例えば、対象の生物から、または酵母もしくは細菌などの対象の生物を複数含有する培養物から）抽出、単離、精製または増幅されてもよい。用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、その元の環境（例えば、それが天然に存在するものの場合は天然の環境、または外因的に発現されるものの場合は宿主細胞）から取り出された核酸を指し、したがって「人為的に」その元の環境から変更された核酸を指す。単離された核酸は、一般的に、源サンプル中に存在する成分の量よりも少ない量の非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）と共に提供される。単離されたサンプル核酸を含む組成物は、実質的に単離されていてもよい（例えば、非核酸成分の約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超を含まない）。用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、サンプル核酸が得られるサンプル源中よりも少ない核酸種を含有するサンプル核酸が提供されることを指す。サンプル核酸を含む組成物は、実質的に精製されていてもよい（例えば、他の核酸種の約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超を含まない）。用語「増幅された」は、本明細書で使用される場合、サンプル中の核酸のヌクレオチド配列またはそれらの一部と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を直線的または指数関数的に生成するプロセスで、細胞、生物またはサンプルの核酸を処理することを指す。上述したように、本明細書で説明されるような核酸試薬を調製するのに使用される核酸は、フラグメント化または切断されてもよい。
核酸の増幅は、時には、培養が難しい生物を扱う場合に必要である。増幅が望ましい可能性がある場合、あらゆる好適な増幅技術を利用できる。ポリヌクレオチド増幅方法の非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））；Ｑ−ベータレプリカーゼまたはテンプレート依存性ポリメラーゼの使用に基づく増幅方法（米国特許公報ＵＳ２００５０２８７５９２号を参照）；ヘリカーゼ依存性等温増幅（Vincentら、「Helicase-dependent isothermal DNA amplification」. EMBO report 5（8）：795〜800（2004））；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；好熱性ＳＤＡ核酸配列ベースの増幅（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）および転写関連増幅（ＴＡＡ）が挙げられる。ＰＣＲ増幅方法の非限定的な例としては、標準的なＰＣＲ、ＡＦＬＰ−ＰＣＲ、対立遺伝子特異的なＰＣＲ、Ａｌｕ−ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、インサイチュＰＣＲ（ＩＳＨ）、配列間特異的ＰＣＲ（Intersequence-specific PCR）（ＩＳＳＲ−ＰＣＲ）、ロングＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、シングルセルＰＣＲ、固相ＰＣＲ、それらの組み合わせ、および同種のものが挙げられる。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは市販されている。
上記で列挙した様々なタイプのＰＣＲを行うためのプロトコールは、技術者にとって容易に入手できる。ＰＣＲ条件は、プライマーの配列、標的の存在量、および増幅の望ましい量によって左右される可能性があるため、当業者は、利用可能な多数のＰＣＲプロトコールから選択することが可能である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号；およびPCR Protocols：A Guide to Methods and Applications、Innisら編、1990を参照）。ＰＣＲは、多くの場合、熱安定性酵素を用いた自動プロセスとして実行される。このプロセスにおいて、反応混合物の温度は、変性領域、プライマー−アニーリング領域、および伸長反応領域を通じて自動的にサイクル化される。この目的に特化させた機械が市販されている。本明細書で説明される実施態様に適している可能性があるＰＣＲプロトコールの非限定的な例は、９５℃で５分間サンプルを処置すること；９５℃で１分間、５９℃で１分間、１０秒間、および７２℃で１分３０秒間を４５サイクル繰り返すこと；次いでサンプルを７２℃で５分間処置することである。追加のＰＣＲプロトコールは、実施例の章で説明される。複数のサイクルは、市販のサーマルサイクラーを使用して行われることが多い。いくつかの実施態様において、当業者公知の、および当業者によって選択された好適な等温増幅プロセスが適用されてもよい。いくつかの実施態様において、望ましい活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で説明される配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドまたはプライマーを使用して望ましい活性を有する生物から望ましい配列を増幅することによって単離できる。
増幅、単離および／または精製された核酸は、本明細書における図面で説明した組換えＤＮＡベクターにクローニングしてもよいし、または好適な市販の組換えＤＮＡベクターにクローニングしてもよい。組換えＤＮＡベクターへの対象の核酸配列のクローニングは、核酸試薬調製のための核酸のさらなる操作（例えば、変異誘発、相同組換え、増幅および同種のものによるヌクレオチド配列の変更）を容易にする可能性がある。標準的なクローニング手法（例えば、酵素的消化、ライゲーションおよび同種のもの）は公知である（例えば、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーで説明されている）。
いくつかの実施態様において、単離または増幅によって調製された核酸配列を使用して、さらなる改変をまったく使用しないで微生物に活性を追加し、それによって遺伝子改変または操作された微生物を作製できる。いくつかの実施態様において、単離または増幅によって調製された核酸配列を遺伝子改変して、望ましい活性を変更する（例えば、増加または減少させる）ことができる。いくつかの実施態様において、核酸を使用して、生物に活性を追加し、時には遺伝子改変して、望ましい活性（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）をコードする異種ポリヌクレオチド配列を最適化する。用語「最適化」は、本明細書で使用される場合、好ましいコドン使用頻度によって発現を増加させるかまたは強化するための変更を指す場合がある。最適化という用語はまた、活性がポリペプチドまたはタンパク質の「天然」型と比較してより高い触媒活性を示すようにポリペプチドまたはタンパク質の活性を増加させるためのアミノ酸配列への改変を指す場合もある。
対象の核酸配列は、当業界公知の方法を使用して遺伝子改変が可能である。変異誘発技術は、スモールスケール（例えば、１、２、５、１０個またはそれより多くのヌクレオチド）またはラージスケール（例えば、５０、１００、１５０、２００、５００個、またはそれより多くのヌクレオチド）の遺伝学的改変に特に有用である。技術者は、変異誘発により、自然に（例えば、選択およびスクリーニングを使用した単離）、または実験的に化学物質、放射線もしくは不正確なＤＮＡ複製（例えば、ＰＣＲ変異誘発）の使用によってのいずれかで安定な方式で生物の遺伝情報を変更することが可能になる。いくつかの実施態様において、遺伝学的改変は、参照配列として天然のヌクレオチド配列を使用した全体規模の核酸の合成的合成、および望ましい活性の変更をもたらす可能性があるヌクレオチドの改変によって行うことができる。変異誘発方法は、時には、特異的な領域またはヌクレオチドに特異的であるか、または標的化される（例えば、部位特異的変異誘発、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発、およびインビトロでの変異誘発技術、例えばトランスプレイスメント（transplacement）およびインビボでのオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発）。変異誘発方法は、時には、遺伝学的改変の配置に関して非特異的またはランダムである（例えば、化学的突然変異誘発、挿入要素（例えば、挿入またはトランスポゾン要素）および不正確なＰＣＲベースの方法）。
部位特異的変異誘発は、ＤＮＡ分子中の特異的なヌクレオチドまたは特異的なヌクレオチドが突然変異したりまたは変更されたりする手法である。部位特異的変異誘発は、典型的には、環状のプラスミドベクターにクローニングした対象の核酸配列を使用して行われる。部位特異的変異誘発は、野生型の配列が公知であり遺伝子変更のためのプラットフォームとして使用されていることを必要とする。部位特異的変異誘発は、望ましい遺伝学的改変が対象のヌクレオチド配列の相補物に取り込まれているオリゴヌクレオチドを使用して行うことができることから、この技術は、時には、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発とも称される。野生型の配列および変更されたヌクレオチドはハイブリダイズが可能であり、ハイブリダイズした核酸をＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長して複製する。二本鎖核酸は、宿主（例えば、大腸菌）に導入され、さらなる一連の複製がインビボで実行される。次いで突然変異した核酸配列を有する形質転換細胞が選択され、および／または正確に変異誘発された配列を有する細胞に関してスクリーニングされる。部位特異的変異誘発技術のさらなる改変法は、カセット変異誘発およびＰＣＲベースの部位特異的変異誘発である。部位特異的変異誘発は、インビボで行うこともできる（例えば、トランスプレイスメント「ポップイン・ポップアウト（pop-in pop-out）」、インビボでの合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異誘発および同種のものなど）。
ＰＣＲベースの変異誘発は、望ましい突然変異または突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを使用して行うことができる。この技術は、微生物宿主におけるクローンの複製および選択の代わりにサーモサイクラーおよびＰＣＲ条件が使用されることを除いて、標準的な部位特異的変異誘発に類似した方式で機能する。ＰＣＲベースの変異誘発も環状のプラスミドベクターを使用するため、標準的な電気泳動的手法を使用して十分な回数のサーモサイクラー増幅が行われた後に、取り込まれた遺伝学的改変を含有する増幅フラグメント（例えば、直線状の核酸分子）を、テンプレート配列を含有するプラスミドから分離できる。この方法の改変は、プラスミド全体を増幅する線形増幅方法および突然変異誘発性プライマー対を使用する。この手法は、インビボで複製されたＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩに対して感受性にする大腸菌Ｄａｍメチラーゼ系を利用する。ＰＣＲ合成されたＤＮＡはメチル化されないため、ＤｐｎＩ耐性である。このアプローチは、テンプレートプラスミドを消化して遺伝子改変を残し、ＤＮＡ修復および複製のためにＰＣＲ合成されたプラスミドを単離して宿主細菌に形質転換することを可能にし、それによってそれに続くクローニングおよび同定工程を容易にする。部分的にディジェネレートプライマーを使用することによって、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発に所定量のランダム性を追加してもよい。
組換えは、時には、変異誘発のツールとして使用できる。技術者は、相同組換えによって、宿主生物の天然のＤＮＡ複製および修復酵素を使用して異種ヌクレオチド配列を挿入するために、公知の配列の領域を特異的に標的化することが可能になる。相同組換え方法は、時には、「ポップイン・ポップアウト」変異誘発、トランスプレイスメント、ノックアウト変異誘発またはノックイン変異誘発と称される。宿主ゲノムへの核酸配列の統合は、核酸試薬全体を挿入する単一のクロスオーバー事象（例えば、ポップイン）である。第二のクロスオーバー事象は、核酸試薬の全部か一部を取り除き、異種配列を残すことであり、多くの場合「フットプリント」（例えば、ポップアウト）と称される。挿入による変異誘発（例えば、ノックイン）、または破壊する異種核酸を残す二重の組換えによる変異誘発（例えば、ノックアウト）はいずれも、挿入が起こる遺伝子または核酸配列の機能を破壊または「ノックアウト」するように機能する。技術者は、選択マーカーおよび／または栄養要求性マーカーを、適切な核酸標的配列が提供されるように設計された核酸試薬と組み合わせることによって、選択可能な核酸試薬を特異的な領域に標的化し、次いで挿入された（例えば、「ポップイン」）核酸試薬の一部を「ポップアウト」する組換え事象に関して選択することが可能になる。
このような方法は、核酸またはゲノムの関心領域において、またはその近傍で公知の標的核酸配列を用いて特異的に設計された核酸試薬を利用する。ポップアウトすると、典型的には、組換え事象の後に残った残存配列である「フットプリント」が残る。残存配列は遺伝子を破壊することができ、それによってその遺伝子の発現を低減または除去する。いくつかの実施態様において、この方法は、遺伝子発現の強化または低減をもたらす可能性がある遺伝子の上流または下流に配列を挿入するのに使用できる。いくつかの実施態様において、類似の組換えまたは「ポップイン」方法を使用して、宿主生物のゲノムに新しい遺伝子を導入できる。ｕｒａ３遺伝子および５−ＦＯＡを使用した酵母の組換え系の例は上記で簡単に説明されており、さらなる詳細が本明細書で示される。
改変のための方法が、Alaniら、「A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains」、Genetics 116（4）：541〜545、1987年8月で説明されている。オリジナルの方法は、をＵＲＡ３カセットのどちらかの側に同じ方向でクローニングされた同じヌクレオチド配列の１０００塩基対（ｂｐ）を有するＵｒａ３カセット使用する。コンストラクトの各側に約５０ｂｐの標的配列が付加される。二本鎖の標的配列は、宿主生物のゲノム中の配列に相補的である。この標的配列は、関心領域中での部位特異的な組換えを可能にする。オリジナルの技術の改変は、２つの１０００ｂｐの同方向反復配列を、２つの２００ｂｐの同方向反復配列に置き換える。改変された方法においても、５０ｂｐの標的配列が使用される。この改変は、第一の変異誘発の後に残った１０００ｂｐの反復への第二のノックアウトの組換えを低減させるかまたは除去するため、ノックアウトされた酵母を増やすことが可能になる。加えて、本明細書で使用される２００ｂｐの配列は、同定可能なフットプリントをあとに残す独特に設計された自己構築型配列である。このような配列を設計するのに使用される技術は、酵母ゲノムへの低い同一性、および相互の低い同一性などの設計特色を取り入れている。それゆえに、自己構築型配列のライブラリーを生成することにより、以前のノックアウトに統合される可能性を低減または除去しながら同じ生物に複数のノックアウトをもたらすことが可能になる。
上述したように、ＵＲＡ３カセットは、機能的なＵＲＡ３遺伝子を有する酵母における５−ＦＯＡの毒性を利用する。標準的な酵母形質転換プロトコールを使用して、ウラシル合成欠損酵母を改変されたＵＲＡ３カセットで形質転換し、形質転換細胞をウラシル非含有最小培地で平板培養する。いくつかの実施態様では、ＰＣＲを使用して宿主ゲノム中の関心領域への正しい挿入を検証してもよく、所定の実施態様では、ＰＣＲ工程を省いてもよい。ＰＣＲ工程を含めることにより、ＵＲＡ３カセットが「ポップアウト」されるように対比選択する必要がある形質転換株の数を減らすことができる。次いで形質転換株（例えば、全て、または例えばＰＣＲによって正しいと決定されたもの）を、ＵＲＡ３カセットから組換えに関して選択（例えば、ポップアウト）すると予想される５−ＦＯＡ含有培地上で対比選択してもよく、そのため酵母を再びｕｒａ３欠損にして、５−ＦＯＡの毒性に耐性にすることができる。特異的な領域への組換え事象に方向付けるのに使用される標的配列は、本明細書で示されている。上記で説明した方法を改変して、染色体に遺伝子を統合させるのに使用でき、その場合、組換えの後、機能的な遺伝子は、２００ｂｐのフットプリントに隣接して残される。
いくつかの実施態様において、ＵＲＡ３（例えば、栄養要求性選択マーカー）の代わりに、選択培地および選択物質に適切に変化させることにより他の栄養要求性または優性選択マーカーも使用できる。必要な生体分子（例えば、アミノ酸またはヌクレオシド）の合成が欠損した株において、栄養要求性選択マーカーが使用される。追加の栄養要求性マーカーの非限定的な例としては、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＬＥＵ２−ｄ、およびＬＹＳ２が挙げられる。所定の栄養要求性マーカー（例えば、ＵＲＡ３およびＬＹＳ２）は、組換えコンストラクトの同方向反復配列のうちの１つを除く全てをポップアウトする第二の組換え事象に関して選択するための対比選択を可能にする。ＨＩＳ３は、ヒスチジン合成に関与する活性をコードする。ＴＲＰ１は、トリプトファン合成に関与する活性をコードする。ＬＥＵ２は、ロイシン合成に関与する活性をコードする。ＬＥＵ２−ｄは、ロイシン非含有最小培地での生存を可能にするための、増加したコピー数（例えば、遺伝子またはプラスミドのコピー数）に関して選択するＬＥＵ２の低発現型である。ＬＹＳ２は、リシン合成に関与する活性をコードし、アルファ−アミノアジピン酸塩（α−アミノアジピン酸塩）を使用したＬＹＳ２遺伝子からの組換えに関する対比選択を可能にする。
優性選択マーカーは、工業用および／または原栄養菌株の遺伝子操作への使用を可能にすることから、有用である。加えて、優性選択マーカーは、平板培養および培養増殖に富栄養培地を使用できるという利点を提供することから、増殖速度が著しく増加する。優性選択マーカーの非限定的な例としては、Ｔｎ９０３ｋａｎｒ、Ｃｍｒ、Ｈｙｇｒ、ＣＵＰ１、およびＤＨＦＲが挙げられる。Ｔｎ９０３ｋａｎｒは、カナマイシン抗生物質耐性（例えば、典型的にはネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩまたはＮＰＴＩＩ）に関与する活性をコードする。Ｃｍｒは、クロラムフェニコール抗生物質耐性（例えば、典型的にはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはＣＡＴ）に関与する活性をコードする。Ｈｙｇｒは、ハイグロマイシンＢ（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、またはＨＰＴ）のリン酸化による、ハイグロマイシン耐性に関与する活性をコードする。ＣＵＰ１は、重金属（例えば、銅）の毒性への耐性に関与する活性をコードする。ＤＨＦＲは、メトトレキセートおよびスルファニルアミド（sulfanilamde）化合物への耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ活性をコードする。
部位特異的または特異的変異誘発とは対照的に、ランダム変異誘発は、いかなる配列情報も必要とせず、数々の広く様々な方法によって達成できる。ランダム変異誘発は、多くの場合、望ましい遺伝子型または表現型に関してスクリーニングするために使用できる突然変異体ライブラリーを作製するのに使用される。ランダム変異誘発の非限定的な例としては、化学的突然変異誘発、ＵＶによって誘導された変異誘発、挿入要素またはトランスポゾンが介在する変異誘発、ＤＮＡシャフリング、エラープローンＰＣＲ変異誘発および同種のものが挙げられる。
化学的突然変異誘発は、多くの場合、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、亜硝酸、マイトマイシンＣ、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、ジエポキシブタン（ＤＥＢ）、１，２，７，８−ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）、２−メチルオキシ−６−クロロ−９（３−［エチル−２−クロロエチル］−アミノプロピルアミノ）−アクリジンジヒドロクロリド（ＩＣＲ−１７０）、２−アミノプリン（２ＡＰ）、およびヒドロキシルアミン（ＨＡ）などの化学物質を含み、これらは非限定的な例として本明細書で示される。これらの化学物質は、塩基対置換、フレームシフト突然変異、欠失、トランスバージョン突然変異、塩基転位型突然変異、不正確な複製および同種のものを引き起こす可能性がある。いくつかの実施態様において、変異誘発は、インビボで実行できる。時には、突然変異誘発プロセスは、変異誘発された塩基または塩基（複数）を取り込んで複製するために、宿主生物のＤＮＡ複製および修復メカニズムを使用することを含む。
別のタイプの化学的突然変異誘発は、塩基類似体の使用を含む。塩基類似体の使用は、不正確な塩基対形成を引き起こし、これが次の一連の複製で、開始時の配列と比較してミスマッチしたヌクレオチドに修正される。塩基類似体変異誘発は、開始時の配列中の所定のヌクレオチドで取り込まれる可能性がある特異的な塩基類似体を選択できることから、ランダム変異誘発にわずかな非ランダム性が導入される。誤対合の修正は、典型的には公知の置換をもたらす。例えば、ブロモ−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）をＤＮＡに取り込むことができ、それにより配列中のＴが置き換えられる。時には、宿主ＤＮＡの修復および複製機構により欠陥が修正される可能性もあるが、時には、ＢｒｄＵとＧとが誤対合すると予想される。次いで、次の一連の複製で、天然の配列における元のＡ−ＴからのＧ−Ｃのトランスバージョンが起こる。
紫外線（ＵＶ）によって誘導された変異誘発は、２つの隣接するチミン残基間の化学結合に紫外線が照射されたときにチミジン二量体が形成されることによって引き起こされる。宿主生物の除去修復メカニズムがＤＮＡ中の傷害を修正するが、場合によっては傷害は不正確に修復され、結果として典型的にはＣからＴの変異が起こる。
挿入要素またはトランスポゾンが介在する変異誘発は、天然に存在するまたは改変された天然に存在する可動遺伝要素を利用する。トランスポゾンは、多くの場合、転移に必要な活性（例えば、トランスポゼース活性を使用した移動）に加えて補助的な活性をコードする。多くの例において、トランスポゾンの補助的な活性は、抗生物質耐性マーカーである（例えば、上記で説明したＴｎ９０３ｋａｎｒを参照）。挿入要素は、典型的には核酸配列の移動に必要な活性だけをコードする。挿入要素およびトランスポゾンが介在する変異誘発は、多くの場合、ランダムに起こる可能性があるが、いくつかのトランスポゾンに関して特異的な標的配列が公知である。ＩＳ要素またはトランスポゾン（Ｔｎ）のような可動遺伝要素は、多くの場合、逆方向反復配列、同方向反復配列、または転移遺伝子をコードする領域の両端における逆方向反復配列と同方向反復配列との両方を有する。トランスポゼースによって触媒される組換え事象により、要素それ自身がゲノムから除去され、新しい位置に移動し、逆方向または同方向反復配列の部分が残る。トランスポゾンの典型的な例は、トウモロコシで発見された「可動遺伝要素」である。トランスポゾン変異誘発キットが市販されており、これは、５つのコドンのインサートがあとに残るように設計されている（例えば、突然変異生成システム（Mutation Generation System）キット、フィンザイム（Finnzymes）、ワールドワイドウェブＵＲＬはfinnzymes.us）。このキットにより、技術者は、ほとんどの遺伝子の機能を完全に破壊せずに挿入部位を同定することが可能である。
ＤＮＡシャフリングは、突然変異体ライブラリーのメンバーからのＤＮＡフラグメントを使用し、フラグメントをランダムにリシャッフルして、新しい突然変異配列の組み合わせを生成する方法である。フラグメントは、典型的にはＤＮアーゼＩを使用して生成され、続いてセルフプライミングＰＣＲを使用してランダムアニーリングと再結合が行われる。ＤＮＡのオーバーハングした末端は、ランダムなフラグメントのアニーリングによって生じたものであり、ＰＣＲプロセスのための「プライマー」配列を提供する。シャフリングは、上記の変異誘発方法のどれによって生成されたライブラリーにも適用できる。
エラープローンＰＣＲおよびそれから派生したローリングサークル・エラープローンＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼの忠実度を低減させるために１または２個のヌクレオチドの量を制限することと共に高いマグネシウムおよびマンガン濃度を使用する。得られた突然変異配列を野生型の開始時の配列と比較した場合、エラー率は、適切な条件下では２％もの高さになる可能性がある。増幅後、突然変異コード配列のライブラリーは、好適なプラスミドにクローニングしなければならない。エラープローンＰＣＲにおいては点突然変異が最も一般的なタイプの突然変異であるが、欠失およびフレームシフト突然変異も起こる可能性がある。利用可能な多数の市販のエラープローンＰＣＲキットがあり、例えばストラタジーンおよびクロンテック（Clontech）（例えば、それぞれワールドワイドウェブＵＲＬはstrategene.comであり、ワールドワイドウェブＵＲＬはclontech.comである）からのものが挙げられる。ローリングサークル・エラープローンＰＣＲは、エラープローンＰＣＲの改変型であり、それによれば、まず野生型配列がプラスミドにクローニングされ、次いでエラーを起こしやすい条件下でプラスミド全体が増幅される。
上述したように、変更された活性を有する生物はまた、選択培地で刺激された生物の遺伝学的選択およびスクリーニングを使用して単離してもよいし、または固有の環境から天然に存在する変異体を同定することによって単離してもよい。例えば、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、毒性のグルコース類似体である。この物質上で酵母を増殖させると、グルコース調節が解除された突然変異体が産出する。２−デオキシ−Ｄ−グルコースを使用して、輸送突然変異体、およびグルコースを枯渇させると最初にグルコースを発酵させて次いでガラクトースを発酵させる代わりに、グルコースとガラクトースを同時に発酵させる突然変異体などの多数の突然変異体が単離されている。類似の技術を使用して、実験室の環境において、または固有の環境からのいずれかで、プラスチックを代謝できる突然変異微生物（例えば、埋め立て地から）、石油化学製品を代謝できる突然変異微生物（例えば、石油流出から）および同種のものが単離されている。
いくつかの実施態様において、対象の生物において活性が比較的低いかまたはほぼ検出不可能なレベルで存在する場合、類似の方法を使用して、望ましい活性で天然に存在する突然変異を単離できる。この方法は、一般的に、液体培養中で特定の密度まで生物を増殖させること、細胞を濃縮すること、および代謝活性の増加が求められる物質の様々な濃度で細胞を平板培養することからなる。穏やかな増殖温度で５〜１０日間、細胞をインキュベートする。選択プロセスを強化するために、さらに５〜１０日間、低温でプレートを保存してもよい。低温は、時には、活性を獲得したかまたは増加させた株を増殖させ続けることを可能にし、一方で低温は他の株の増殖を阻害する。最初の選択と低温での二次的な増殖に続いて、望ましい活性に関してさらに選択するために、より高いまたはより低い選択物質濃度でプレートを重複して平板培養してもよい。
宿主生物に導入するために、核酸試薬に天然、異種または変異誘発されたポリヌクレオチドを導入してもよく、それによって操作された微生物が生成される。技術者は、標準的な組換えＤＮＡ技術（制限酵素消化、ライゲーションおよび同種のもの）を使用することにより、（ｉ）宿主生物中での選択により安定して維持すること、または（ｉｉ）宿主生物のゲノムに統合することが可能な好適な核酸試薬に、変異誘発された対象の核酸を組み込むことができる。上述したように、時には、核酸試薬は、宿主生物（例えば、酵母または真菌）への最終的な最終産物導入の前に細菌中で同じ核酸試薬を操作可能にする２つの複製起点を含む。標準的な分子生物学および組換えＤＮＡ方法は公知である（例えば、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーで説明されている）。
様々な技術を使用して核酸試薬を微生物に導入できる。様々な生物に異種核酸を導入するのに使用される方法の非限定的な例としては、形質転換、トランスフェクション、形質移入、エレクトロポレーション、超音波が介在する形質転換、粒子衝撃および同種のものが挙げられる。いくつかの場合において、キャリアー分子の付加（例えば、ビス−ベンズイミダゾリル化合物、例えば、米国特許第５５９５８９９号を参照）により、典型的には従来の方法での形質転換が難しいと考えられている細胞におけるＤＮＡの取り込みを増加させることができる。従来の形質転換方法は公知である（例えば、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーで説明されている）。
改変された活性
遺伝子組換え生物における所定の活性は、当業界公知の技術によって改変してもよい。いくつかの実施態様において、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性またはアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、またはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性およびアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を生物中で改変してもよい。いくつかの実施態様において、改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチド、改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチド、改変された異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチド、および／または改変された異種アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが生物に導入されてもよい。改変されたポリペプチドは、改変されたポリペプチドをコードする改変されたポリヌクレオチドを包含する宿主生物によって発現させることができる。改変されたポリペプチドは、多くの場合、未改変の対応物の活性とは異なる活性を有する。改変された活性は、時には、異なる触媒活性もしくは異なる基質特異性、または異なる触媒活性および異なる基質特異性である。異なる活性は、時には、未改変の対応物であるポリペプチドの活性より高いまたはより低い活性である。いくつかの実施態様において、改変されたポリペプチドの触媒活性は、特定の基質に対する未改変の対応物の触媒活性より高いかまたはより低い。いくつかの実施態様において、改変されたポリペプチドの基質特異性は、特定の基質に対する未改変の対応物の基質特異性より高いかまたはより低い。改変されたポリペプチドは、多くの場合、活性であり、改変されたポリペプチドの活性は、多くの場合、検出が可能である（例えば、基質の変換が検出可能である）。特定のポリペプチドの望ましい活性は、時には、「標的活性」と称される。
いくつかの実施態様において、遺伝子組換え生物における遺伝学的改変は、その生物で生産されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドの基質特異性を変更する。時には、基質特異性は、特定の鎖長を有する基質に対して低減される。いくつかの実施態様において、改変されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼの基質特異性は、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０基質またはそれらの組み合わせに対して低減される。いくつかの実施態様において、改変されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼの基質特異性は、Ｃ１０、Ｃ１２、またはＣ１８基質に対して低減される。
いくつかの実施態様において、遺伝子組換え生物における遺伝学的改変は、その生物中で生産されたアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドの基質特異性を変更する。時には、補因子の特異性が改変され、いくつかの実施態様において、改変されたポリペプチドは、補因子として酸素を優先的に利用する。
標的活性を有する改変されたポリペプチドを生成するために、１またはそれより多くの特定の改変を選択してもよい。改変は、多くの場合、アミノ酸改変（例えば、１つまたはそれより多くのアミノ酸の欠失、挿入）である。アミノ酸改変は、時には、アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、時には、保存的であり、その非限定的な例としては、酸性部分を含有するアミノ酸の酸性部分を含有する別のアミノ酸への置換（例えば、Ｄ、Ｅ）、塩基性部分を含有するアミノ酸の塩基性部分を含有する別のアミノ酸への置換（例えば、Ｈ、Ｋ、Ｒ）、脂肪鎖部分を含有するアミノ酸の脂肪鎖部分を含有する別のアミノ酸への置換（Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ）、環状部分を含有するアミノ酸の環状部分を含有する別のアミノ酸への置換（例えば、Ｗ、Ｆ、Ｙ）、および極性部分を含有するアミノ酸の極性部分を含有する別のアミノ酸への置換（例えば、Ｓ、Ｔ）が挙げられる。アミノ酸置換は、時には、非保存的であり、その非限定的な例としては、酸性部分を含有するアミノ酸の塩基性部分を含有するアミノ酸への置換、塩基性部分を含有するアミノ酸の酸性部分を含有するアミノ酸への置換、比較的小さい部分を含有するアミノ酸（例えば、Ｇ、Ａ）の比較的大きい部分を含有する別のアミノ酸（例えば、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）への置換、および比較的大きい部分を含有するアミノ酸の比較的小さい部分を含有する別のアミノ酸への置換が挙げられる。
当業界公知のあらゆる好適な方法を使用して特定の改変を選択することが可能である。いくつかの実施態様において、公知の活性を有する関連のポリペプチドに関する参照構造が公知であり、ポリペプチドを標的とするための改変を、参照構造に対して標的ポリペプチド構造を並べることによって導くことができる。参照構造は、時には、１次構造（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）であり、標的の１次構造は、当業界公知のアライメント方法を使用して参照構造に対して並べることができる。参照中の特定のアミノ酸と並べられる（例えば、同一であるかまたは相同である）、または参照中の特定のアミノ酸と並べられない（例えば、同一ではないかまたは相同ではない）標的中の特定のアミノ酸が、改変のために選択される可能性がある。選択は、アライメントの調査、またはアライメントに基づき改変に関してアミノ酸を同定、スコア付け、および／もしくはランク付けする当業界公知のソフトウェアによってなすことができる。
参照構造は、時には、２次構造、３次構造または４次構造であり、これらはそれぞれ、ポリペプチドに関する３次元構造である。標的ポリペプチドの１次構造は、当業界公知の３次元モデリングソフトウェアを使用して２次、３次または４次参照構造にモデル化してもよい。標的ポリペプチドの２次、３次または４次構造は、当業界公知の３次元比較用ソフトウェアを使用して２次、３次または４次参照構造と比較してもよい。参照中の特定の構造と並べられるかもしくはそこにマッピングされる、または参照中の特定の構造と並べられないかもしくはそこにマッピングされない標的中の特定の構造（例えば、特定の個々のアミノ酸；連続または非連続のアミノ酸の特定のグループ）が、改変のために選択される可能性がある。また、基質または補因子の近接にある標的中の特定の構造が、改変のために選択される可能性もある。選択は、アライメントまたはマップの調査によって、または改変のために、アライメントおよびマップに基づいてアミノ酸および／または構造を同定、スコア付けおよび／またはランク付けする当業界公知のソフトウェアによってなすことができる。
第一のポリペプチド中で改変のための特定のアミノ酸および／または構造が選択された後、第一のポリペプチド中の選択されたアミノ酸および構造と並べられた第二のポリペプチド中のアミノ酸および構造を同定してもよい。非限定的な例において、カンジダ種のＰＯＸ４およびＰＯＸ５ポリペプチドに関する特定のアミノ酸置換および構造改変（例えば、ループアミノ酸欠失／挿入）が、本明細書において開示される。別のアシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドの１次構造は、ＰＯＸ４またはＰＯＸ５ポリペプチドのアミノ酸配列またはモデル化した構造と並べてもよいし、ＰＯＸ４またはＰＯＸ５ポリペプチド中の改変のために選択されたものと並べられた他のポリペプチドの一部または全てのアミノ酸も、改変のために選択される可能性がある。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ改変を選択するための所定の基準も本明細書において説明される。
改変されたポリペプチドの１種またはそれより多くの活性は、当業界公知のあらゆる好適なアッセイを使用して特徴付けることができる。改変されたポリペプチドは、活性をアッセイするために、標的生成物が生産されると予想される標的生物以外の生物で発現させてもよい。例えば、改変されたポリペプチドを細菌（例えば、大腸菌）で発現させ、アッセイし、次いで標的二酸生産のために酵母（例えば、カンジダ種の酵母）に導入してもよい。
供給材料、培地、補助物質および添加剤
操作された微生物は、多くの場合、脂肪族ジカルボン酸（例えば、炭素８〜１８個の脂肪族ジカルボン酸）の収量を最適化する条件下で培養される。脂肪族ジカルボン酸の非限定的な例としては、スベリン酸（すなわち、オクタン二酸、１，８−オクタン二酸、オクタン二酸、オクタン−１，８−二酸、１，６−ヘキサンジカルボン酸、カプリル二酸）、セバシン酸（すなわち、１，１０−デカン二酸、デカン二酸、デカン−１，１０−二酸、１，８−オクタンジカルボン酸、カプリン二酸）、ドデカン二酸（すなわち、ＤＤＤＡ、１，１２−ドデカン二酸、ドデカン二酸、ドデカン−１，１２−二酸、１，１０−デカンジカルボン酸、デカメチレンジカルボン酸、１，１０−ジカルボキシデカン、ラウリン二酸）、テトラデカン二酸（すなわち、ＴＤＤＡ、１，１４−テトラデカン二酸、テトラデカン二酸、テトラデカン−１，１４−二酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、ミリスチン二酸）、タプシン酸（thapsic acid）（すなわち、ヘキサデカン二酸、１，１６−ヘキサデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘキサデカン−１，１６−二酸、１，１４−テトラデカンジカルボン酸、パルミチン二酸）、シス−９−ヘキサデセン二酸（すなわち、パルミトレイン二酸）、オクタン二酸（すなわち、１，１８−オクタデカン二酸、オクタデカン二酸、オクタデカン−１，１８−二酸、１，１６−ヘキサデカンジカルボン酸、ステアリン二酸）、シス−９−オクタデセン二酸（すなわち、オレイン二酸）、シス−９，１２−オクタデセン二酸（すなわち、リノール二酸）、シス−９，１２，１５−オクタデセン二酸（すなわち、リノレン二酸）、アラキジン二酸（すなわち、エイコサン二酸、イコサン二酸）、１１−エイコセン二酸（すなわち、シス−１１−エイコセン二酸）、１３−エイコセン二酸（すなわち、シス−１３−エイコセン二酸）、アラキドン二酸（すなわち、シス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン二酸）が挙げられる。培養条件は、多くの場合、以下の活性：オメガオキソ脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、オメガヒドロキシル脂肪酸デヒドロゲナーゼ活性、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、モノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、脂肪族アルコールオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡリガーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、および／またはアシルトランスフェラーゼ（例えば、アセチル−ＣｏＡ Ｃ−アシルトランスフェラーゼ）活性のうち１種またはそれより多くの活性を最適化する。一般的に、最適化される可能性がある条件の非限定的な例としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素と窒素との比率、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産期の長さ、標的生成物蓄積期の長さ、および細胞の回収時間が挙げられる。
培養培地は、一般的に、好適な炭素源を含有する。微生物の培養および／または発酵プロセスに有用な炭素源は、時には、供給材料と称される。用語「供給材料」は、本明細書で使用される場合、生物に供給される炭素源を含有する組成物を指し、これは、エネルギーと増殖に有用な代謝生成物を生産するのに生物によって使用される。供給材料は、天然物質、「人工物質」、精製または単離された物質、精製された物質の混合物、未精製の物質の混合物またはそれらの組み合わせであってもよい。供給材料は、多くの場合、人によって調製されるか、および／または人によって生物に供給され、さらに供給材料は、多くの場合、生物に投与される前に製剤化される。炭素源は、これらに限定されないが、１種またはそれより多くの以下の物質：アルカン、アルケン、モノカルボン酸、ジカルボン酸、単糖（例えば、「糖類」とも称され、例えば六炭糖（例えば、グルコース、フルクトース）、五炭糖（例えば、キシロースおよび他のペントース）および同種のものが挙げられる）、二糖類（例えば、ラクトース、スクロース）、オリゴ糖（例えば、グリカン、単糖類のホモポリマー）、多糖類（例えば、デンプン、セルロース、単糖のヘテロポリマーまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、および再生可能な供給材料（例えば、チーズ乳清の浸透液、コーンスティープリカー、砂糖大根の糖蜜、大麦の麦芽）などを含んでいてもよい。
また炭素源は、以下の非限定的な例：パラフィン（例えば、飽和パラフィン、不飽和パラフィン、置換パラフィン、直鎖パラフィン、分岐パラフィン、またはそれらの組み合わせ）；それぞれ直鎖状、分岐状、飽和、不飽和、置換またはそれらの組み合わせであってもよいアルカン（例えば、ドデカン）、アルケンまたはアルキン（以下でより詳細に説明される）；直鎖状または分岐アルコール（例えば、ドデカノール）；脂肪酸（例えば、炭素約１個から炭素約６０個、例えば遊離脂肪酸、石鹸原料など）；脂肪酸のエステル（例えばメチルエステル、エチルエステル、ブチルエステルおよび同種のもの）、例えば、これらに限定されないが、エステル、例えばカプリン酸メチル、カプリン酸エチル、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸メチル、ミリスチン酸エチル、カプロン酸メチル（methyl caprolate）、カプロン酸エチル（ethyl caprolate）、カプリル酸エチル、カプリル酸メチル、パルミチン酸メチル、またはパルミチン酸エチルなど；モノグリセリド；ジグリセリド；トリグリセリド、リン脂質のうち１種またはそれより多くからも選択できる。供給材料を調製するための生成物の非限定的な商業的供給源としては、植物、植物の油または植物製品（例えば、植物油（例えば、アーモンド油、キャノーラ油、カカオバター、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、菜種油、モワ（illipe）、オリーブ油、パーム油、パームオレイン、パーム核油、ベニバナ油、落花生油、ダイズ油、ゴマ油、シアの実の油、ヒマワリ油、クルミ油など、およびそれらの組み合わせ）、および動物性脂肪（例えば、牛脂、バター脂、ラード、タラ肝油）が挙げられる。炭素源としては、石油製品および／または石油蒸留物（例えば、ディーゼル、燃料油、ガソリン、ケロシン、パラフィンワックス、パラフィン油、石油化学製品）も挙げられる。いくつかの実施態様において、供給材料は、石油蒸留物を含む。炭素源は、脂肪酸蒸留物（例えば、パーム油の蒸留物またはトウモロコシ油の蒸留物）であってもよい。脂肪酸蒸留物は、粗製植物油の精製からの副産物であってもよい。いくつかの実施態様において、供給材料は、脂肪酸蒸留物を含む。
いくつかの実施態様において、供給材料は、石鹸原料（すなわち石鹸原料）を含む。広く実施されている食用のための粗製植物油の精製方法は、アルカリまたはカセイアルカリによる精製方法である。このプロセスは、存在する遊離脂肪酸と反応させるためにカセイソーダの希薄水溶液を採用しており、それにより石鹸の形成が起こる。石鹸は、典型的には、精製遠心分離機からの重質相放出物（heavy phase discharge）として、水和したホスファチド、ゴムおよび酸化促進性の金属と一緒に精製された油から分離され、これは、典型的には石鹸原料として知られている。
また炭素源としては、本明細書で説明される操作された経路で代謝基質として直接使用できる代謝生成物、または操作された微生物における操作されたもしくは天然の生合成経路を使用した異なる分子への変換を介して間接的に使用できる代謝生成物も挙げることができる。いくつかの実施態様において、少なくとも１種の共通の代謝および／または合成基質を有するか、および／またはそれらを生成する１種またはそれより多くの代謝経路における１種またはそれより多くの活性のレベルを増加させることによって、望ましい生成物の生産に優先的に代謝経路が偏るようにすることができる。いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）に変換できる炭素源を生成するために、糖新生、ペントースリン酸経路、解糖、脂肪酸合成、ベータ酸化、およびオメガ酸化から選択される１種またはそれより多くの代謝経路で、操作された活性（例えば、オメガ酸化活性）の代謝副産物（例えば、脂肪酸）を使用できる。
用語「パラフィン」は、本明細書で使用される場合、源（例えば、植物由来、石油由来、化学的に合成された、微生物によって発酵された源）または炭素鎖長とは無関係に、アルカン炭化水素の一般名称を指す。炭素源は、時には、パラフィンを含み、いくつかの実施態様において、パラフィンは、炭素源中の主成分である（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のパラフィン）。パラフィンは、時には、飽和しており（例えば、完全に飽和しており）、時には、１つまたはそれより多くの不飽和（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の不飽和）を包含し、時には、１つまたはそれより多くの水素以外の置換基で置換されている。水素以外の置換基の非限定的な例としては、ハロ、アセチル、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ２が挙げられ、式中Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、またはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールであり、各Ｒは、場合によってはハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ２で置換されていてもよく、式中各Ｒ’は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールである。
いくつかの実施態様において、供給材料は、培養しようとする操作された微生物の遺伝子型および／または表現型に従って選択される。本明細書で説明されるようにＰＯＸ４活性を破壊することによってベータ酸化を部分的にブロックする変更を含む酵母株を培養するためには、例えば、炭素１２個の脂肪酸、炭素１２個のジカルボン酸もしくは炭素１２個のパラフィンが豊富な供給材料、または炭素１０、１２および１４個の化合物の混合物が有用な可能性がある。１０〜１４個の炭素を有する炭素源の非限定的な例としては、脂肪（例えば、ヤシ油、パーム核油）、１０〜１４個の炭素を有するパラフィン（例えば、アルカン、アルケン、またはアルキン）（例えば、ドデカン（また、アダカン（adakane）１２、ビヘキシル、ジヘキシルおよびデュオデカン（duodecane）とも称される）；テトラデカン）、アルケンおよびアルキン誘導体）、脂肪酸（ドデカン酸、テトラデカン酸）、脂肪族アルコール（ドデカノール、テトラデカノール）、それと類似したもの、それらの非毒性の置換誘導体または組み合わせが挙げられる。
炭素源は、時には、アルキル、アルケニルまたはアルキニル化合物もしくは分子（例えば、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分を包含する化合物（例えば、アルカン、アルケン、アルキン））を含む。いくつかの実施態様において、アルキル、アルケニルもしくはアルキニル分子、またはそれらの組み合わせは、炭素源中の主成分である（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のこのような分子）。本明細書で使用されるように、用語「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」は、直鎖（本明細書では「線形」とも称される）、分岐鎖（本明細書では「非線形」とも称される）、環状の１価ヒドロカルビルラジカル、およびこれらの組み合わせを包含し、これらは、非置換の場合、Ｃ原子とＨ原子しか含有しない。アルキル部分の非限定的な例としては、メチル、エチル、イソブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、２−プロペニル、３−ブチニルおよび同種のものが挙げられる。Ｃ原子とＨ原子のみを含有し、非置換のアルキルは、時には、「飽和」と称される。一般的に、アルケニルまたはアルキニルは、それぞれ１つまたはそれより多くの二重結合または三重結合を含有するため、「不飽和」である。アルケニルは、多数の二重結合、例えば１、２、３、４または５個の二重結合を包含していてもよい。アルキニルとしては、多数の三重結合、例えば１、２、３、４または５個の三重結合を包含していてもよい。アルキル、アルケニルおよびアルキニル分子は、時には、約２〜約６０個の炭素原子（Ｃ）を含有する。例えば、アルキル、アルケニルおよびアルキニル分子は、約１個の炭素原子、約２個の炭素原子、約３個の炭素原子、約４個の炭素原子、約５個の炭素原子、約６個の炭素原子、約７個の炭素原子、約８個の炭素原子、約９個の炭素原子、約１０個の炭素原子、約１２個の炭素原子、約１４個の炭素原子、約１６個の炭素原子、約１８個の炭素原子、約２０個の炭素原子、約２２個の炭素原子、約２４個の炭素原子、約２６個の炭素原子、約２８個の炭素原子、約３０個の炭素原子、約３２個の炭素原子、約３４個の炭素原子、約３６個の炭素原子、約３８個の炭素原子、約４０個の炭素原子、約４２個の炭素原子、約４４個の炭素原子、約４６個の炭素原子、約４８個の炭素原子、約５０個の炭素原子、約５２個の炭素原子、約５４個の炭素原子、約５６個の炭素原子、約５８個の炭素原子または約６０個の炭素原子を包含していてもよい。いくつかの実施態様において、パラフィンは、炭素原子約８〜約１８個の炭素原子の平均数（例えば、約８個の炭素原子、約９個の炭素原子、約１０個の炭素原子、約１１個の炭素原子、約１２個の炭素原子、約１３個の炭素原子、約１４個の炭素原子、約１５個の炭素原子、約１６個の炭素原子、約１７個の炭素原子および約１８個の炭素原子）を有する可能性がある。単一の基が、１種より多くのタイプの複数の結合、または１個より多くの複数の結合を包含していてもよい。このような基が少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する場合、それらは用語「アルケニル」の定義に包含され、このような基が少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する場合、それらは用語「アルキニル」に包含される。アルキル、アルケニルおよびアルキニル分子は、アルキル、アルケニルおよび／またはアルキニル部分を含む分子を包含し、さらに、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分からなる分子（すなわち、アルカン、アルケンおよびアルキン分子）も包含する。
アルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基は、時には、１〜２０個のＣ（アルキル）または２〜２０個のＣ（アルケニルまたはアルキニル）を含有する。いくつかの実施態様において、これらは、約８〜２０個のＣまたは約１０〜２０個のＣを含有する可能性がある。単一の基が、１種より多くのタイプの複数の結合、または１個より多くの複数の結合を包含していてもよい。このような基が少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する場合、それらは用語「アルケニル」の定義に包含され、このような基が少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する場合、それらは用語「アルキニル」に包含される。
アルキル、アルケニルおよびアルキニル基または化合物は、時には、このような置換が合成されて存在できるような程度に置換される。典型的な置換基としては、これらに限定されないが、ハロ、アセチル、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ２が挙げられ、式中Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１１アリール、またはＣ５〜Ｃ１１ヘテロアリールであり、各Ｒは、場合によってはハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ２で置換されていてもよく、式中各Ｒ’は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールである。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基はまた、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールで置換されていてもよく、これらはそれぞれ、特定の基に適した置換基で置換されていてもよい。
「アセチレン」または「アセチル」置換基は、場合によっては置換されており式−Ｃ≡Ｃ−Ｒｉを有する２〜１０Ｃアルキニル基であり、式中Ｒｉは、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールアルキル、またはＣ６〜Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒｉ基は、場合によっては、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ２から選択される１個またはそれより多くの置換基で置換されていてもよく、式中各Ｒ’は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜１２アリールアルキル、またはＣ６〜１２ヘテロアリールアルキルであり、これらはそれぞれ、場合によってはハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアシル、ヒドロキシ、アミノ、および＝Ｏから選択される１つまたはそれより多くの基で置換されていてもよく；ここで２つのＲ’が連結して、場合によってはＮ、ＯおよびＳから選択される最大３つのヘテロ原子を含有する３〜７員環の環を形成する。いくつかの実施態様において、−Ｃ≡Ｃ−ＲｉのＲｉは、ＨまたはＭｅである。
炭素源は、時には、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよび／またはヘテロアルキニル分子もしくは化合物を含む（例えば、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよび／またはヘテロアルキニル部分を含む（例えば、ヘテロアルカン、ヘテロアルケンまたはヘテロアルキン））。「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」および同種のものは、対応するヒドロカルビル（アルキル、アルケニルおよびアルキニル）基と同様に定義されるが、「ヘテロ」という用語は、主鎖内に１〜３つのＯ、ＳもしくはＮヘテロ原子またはそれらの組み合わせを含有する基を指し、したがって対応するアルキル、アルケニル、またはアルキニル基の少なくとも１つの炭素原子が特定されたヘテロ原子のうち１つで置き換えられて、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニル基が形成される。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基のヘテロ型に関する典型例およびサイズは、一般的に対応するヒドロカルビル基に関するものと同じであり、ヘテロ型に存在する可能性がある置換基は、上記でヒドロカルビル基に関して説明したものと同じである。化学的安定性の理由で、このような基は、特に他の規定がない限り、２つより多くの連続したヘテロ原子を包含しないとも理解されているが、ニトロまたはスルホニル基としてＮまたはＳ上にオキソ基が存在する場合はこの限りではない。
用語「アルキル」は、本明細書で使用される場合、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキル基および化合物を包含し、用語「シクロアルキル」は、環炭素原子を介して連結された炭素環式の非芳香族化合物または基を説明するのに本明細書で使用される場合があり、さらに「シクロアルキルアルキル」は、アルキルリンカーを介して分子に連結された炭素環式の非芳香族化合物または基を説明するのに使用される場合もある。同様に、「ヘテロシクリル」は、環員として少なくとも１つのヘテロ原子を含有し、環原子（ここで環原子は、ＣまたはＮであってもよい）を介して分子に連結された非芳香族環式基を説明するのに使用される可能性があり；さらに「ヘテロシクリルアルキル」は、リンカーを介して別の分子に連結されたこのような基を説明するのにも使用される可能性がある。シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリルアルキル基に好適なサイズおよび置換基は、アルキル基に関して上記で説明したものと同じである。これらの用語は、本明細書で使用される場合、環が非芳香族である限り、１つの二重結合または２つの二重結合を含有する環も包含する。
炭素源は、時には、アシル化合物または部分（例えば、アシル部分を含む化合物）を含む。「アシル」は、本明細書で使用される場合、カルボニル炭素原子の２つの利用可能な原子価の位置のうち一方に付着したアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアリールアルキルラジカルを含む基を包含し、ヘテロアシルは、それに対応する基であって、カルボニル炭素以外の少なくとも１つの炭素が、Ｎ、ＯおよびＳから選ばれるヘテロ原子で置き換えられている基を指す。したがってヘテロアシルは、例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲおよび−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、加えて−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロアリールを包含する。
アシルおよびヘテロアシル基は、カルボニル炭素原子の空いた原子価を介して付着しているあらゆる基または分子に結合される。アシルおよびヘテロアシル基は、典型的にはＣ１〜Ｃ８アシル基であり、その例としては、ホルミル、アセチル、ピバロイル、およびベンゾイル、ならびにＣ２〜Ｃ８ヘテロアシル基が挙げられ、ここでＣ２〜Ｃ８ヘテロアシル基としては、メトキシアセチル、エトキシカルボニル、および４−ピリジノイルが挙げられる。アシルまたはヘテロアシル基を含むヒドロカルビル基、アリール基、およびこのような基のヘテロ型は、本明細書においてアシルまたはヘテロアシル基の対応する成分のそれぞれに関して一般的に好適な置換基として説明される置換基で置換されていてもよい。
炭素源は、時には、１つまたはそれより多くの芳香族部分および／または複素環式芳香族化合物部分を含む。「芳香族」部分または「アリール」部分は、芳香族性の周知の特徴を有する単環式または縮合二環式部分を指し、その例としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。同様に、「複素環式芳香族化合物」および「ヘテロアリール」は、このような単環式または縮合二環式環系であって、環員として１つまたはそれより多くのＯ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子を含有する単環式または縮合二環式環系を指す。ヘテロ原子を含んでいても、５員環、加えて６員環における芳香族性が認められる。典型的な複素環式芳香族化合物系としては、単環式Ｃ５〜Ｃ６芳香族基、例えばピリジル、ピリミジル、ピラジニル、チエニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、およびイミダゾリルが挙げられ、加えて、これらの単環式基の１つとフェニル環またはヘテロ芳香族単環式基のいずれかとを縮合させて、インドリル、ベンズイミダゾリル、インタゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ピラゾロピリジル、キナゾリニル、キノキサリニル、シンノリニル、および同種のものなどのＣ８〜Ｃ１０二環式基を形成することによって形成された縮合二環式部分が挙げられる。環系全体で電子分布に関して芳香族性の特徴を有するあらゆる単環式または縮合環二環式系がこの定義に包含される。これには、少なくとも分子の残部に直接付着している環が、芳香族性の特徴を有するような二環式基も包含される。典型的には、このような環系は、５〜１２環員の原子を含有する。単環式ヘテロアリールは、時には、５〜６環員を含有し、二環式ヘテロアリールは、時には、８〜１０環員を含有する。
アリールおよびヘテロアリール部分は、様々な置換基で置換されていてもよく、ここでこのような置換基としては、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ５〜Ｃ１２アリール、Ｃ１〜Ｃ８アシル、およびこれらのヘテロ型が挙げられ、これらのそれぞれは、それ自身さらに置換されていてもよく；アリールおよびヘテロアリール部分のための他の置換基としては、ハロ、または、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ２が挙げられ、式中Ｒは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールアルキル、またはＣ６〜Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒは、上記でアルキル基に関して説明したように場合によっては置換されていてもよい。アリールまたはヘテロアリール基上の置換基は、本明細書でこのような置換基の各タイプに関して、または置換基の各成分に関して好適であると説明された基でさらに置換されていてもよい。したがって、例えば、アリールアルキル置換基は、アリール部分においてアリール基に典型的な置換基で置換されていてもよいし、アリールアルキル置換基はさらに、アルキル部分においてアルキル基に典型的または好適な置換基で置換されていてもよい。
同様に、「アリールアルキル」および「ヘテロアリールアルキル」は、芳香族および芳香族複素環系であって、独立した分子（例えば、ベンゼンまたは置換ベンゼン、ピリジンまたは置換ピリジン）であるか、またはアルキレンなどの結合基、例えば置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和、環式もしくは非環式のリンカーを介して付着点に結合している芳香族および芳香族複素環系を指す。リンカーは、多くの場合、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはそれらのヘテロ型である。これらのリンカーはカルボニル基を包含する場合もあることから、アシルまたはヘテロアシル部分として置換基をもたらす可能性もある。アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基中のアリールまたはヘテロアリール環は、上記でアリール基に関して説明したのと同じ置換基で置換されていてもよい。アリールアルキル基は、時には、非置換であるか、または１もしくは２個のＣ１〜Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換された、上記でアリール基およびＣ１〜Ｃ４アルキレンに関して定義された基で場合によって置換されていてもよいフェニル環を包含し、ここでアルキルまたはヘテロアルキル基は、場合によっては環化してシクロプロパン、ジオキソラン、またはオキサシクロペンタンなどの環を形成できる。同様に、ヘテロアリールアルキル基は、多くの場合、場合によっては上記でアリール基において典型的な置換基として説明した基、および非置換のＣ１〜Ｃ４アルキレンの１またはそれより多くで置換されていてもよいＣ５〜Ｃ６単環式ヘテロアリール基を包含する。ヘテロアリールアルキル基は、時には、１または２つのＣ１〜Ｃ４アルキル基またはヘテロアルキル基で置換されるか、または場合によっては置換されていてもよいフェニル環またはＣ５〜Ｃ６単環式ヘテロアリール、および非置換であるか、または１または２つのＣ１〜Ｃ４アルキルもしくはヘテロアルキル基で置換されたＣ１〜Ｃ４ヘテロアルキレンを包含し、ここでアルキルまたはヘテロアルキル基は、場合によっては環化してシクロプロパン、ジオキソラン、またはオキサシクロペンタンなどの環を形成していてもよい。
アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基が、場合によっては置換されていてもよいと説明される場合、置換基が、基のアルキルまたはヘテロアルキル部分上に存在するか、またはアリールまたはヘテロアリール部分に存在する可能性がある。場合によってはアルキルまたはヘテロアルキル部分に存在する置換基は、時には、アルキル基に関して上記で説明したものと同じであり、場合によってはアリールまたはヘテロアリール部分に存在する置換基は、多くの場合、アリール基に関して上記で一般的に説明したものと同じである。
「アリールアルキル」基は、本明細書で使用される場合、それらが非置換である場合、ヒドロカルビル基であり、環およびアルキレンまたは類似のリンカー中の炭素原子の総数に基づき記載される。したがって、ベンジル基は、Ｃ７−アリールアルキル基であり、フェニルエチルは、Ｃ８−アリールアルキルである。
上述したような「ヘテロアリールアルキル」は、結合基を介して付着したアリール基を含む部分を指し、アリール部分の少なくとも１つの環原子または結合基中の１つの原子が、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子であるという点で「アリールアルキル」とは異なる。ヘテロアリールアルキル基は、本明細書では、環と組み合わされたリンカー中の原子の総数に基づき記載され、このような基としては、ヘテロアルキルリンカーを介して連結されたアリール基；アルキレンなどのヒドロカルビルリンカーを介して連結されたヘテロアリール基；およびヘテロアルキルリンカー介して連結されたヘテロをアリール基が挙げられる。したがって、Ｃ７−ヘテロアリールアルキルとしては、例えば、ピリジルメチル、フェノキシ、およびＮ−ピロリルメトキシが挙げられる。
「アルキレン」は、本明細書で使用される場合、２価ヒドロカルビル基を指す。アルキレンは２価であるため、２つの他の基を一緒に連結させることができる。アルキレンは、多くの場合、−（ＣＨ２）ｎ−と表され、式中ｎは、１〜２０、１〜１０、１〜８、または１〜４であってもよいが、具体的に特定された場合、アルキレンは、他の基で置換されていてもよく、他の長さを有していてもよく、空の原子価が鎖の逆側の末端に存在していなくてもよい。したがって−ＣＨ（Ｍｅ）−および−Ｃ（Ｍｅ）２−もアルキレンと称される場合があり、例えば、シクロプロパン−１，１−ジイルなどの環式基であり得る。アルキレン基が置換されている場合、置換基は、典型的には本明細書で説明したようなアルキル基上に存在する置換基を包含する。
いくつかの実施態様において、供給材料は、炭素源の混合物を包含し、ここで供給材料中の各炭素源は、操作された微生物の遺伝子型に基づき選択される。いくつかの実施態様において、混合された炭素源の供給材料は、糖、セルロース、アルカン、脂肪酸、トリアシルグリセリド、パラフィンなど、およびそれらの組み合わせから選択される１種またはそれより多くの炭素源を包含する。
窒素は、無機源（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば、尿素またはグルタメート）から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、培養培地はまた、好適な無機物、塩、補因子、緩衝液、ビタミン、金属イオン（例えば、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）および微生物培養に好適な他の成分を含有してもよい。
操作された微生物は、時には、複合培地（例えば、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））中で培養される。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、増殖に必要な成分が欠失しているために望ましい発現カセットの選択が強制的に起こる規定された最小培地（例えば、酵母窒素原礎培地（ディフコ・ラボラトリーズ（DIFCO Laboratories）、ミシガン州デトロイト））中で培養される。
いくつかの実施態様において、培養培地は、酵母窒素原礎培地（ディフコ・ラボラトリーズ、ミシガン州デトロイト）などの一般的な商業的に調製された培地である。他の規定または合成の増殖培地も使用が可能であり、特定の微生物の増殖に適切な培地は公知である。操作された微生物の生産のために様々な宿主生物を選択できる。非限定的な例としては、酵母（例えば、カンジダ・トロピカリス（例えば、ＡＴＣＣ２０３３６、ＡＴＣＣ２０９１３、ＡＴＣＣ２０９６２）、ヤロウイア・リポリチカ（例えば、ＡＴＣＣ２０２２８））および糸状菌（例えば、アスペルギルス・ニダランス（例えば、ＡＴＣＣ３８１６４）およびアスペルギルス・パラスティカス（例えば、ＡＴＣＣ２４６９０））が挙げられる。具体的な実施態様において、 酵母は、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌバクト酵母抽出物、２０ｇ／Ｌバクトペプトン、および２０ｇ／Ｌデキストロース）中で培養される。特定の実施態様において、糸状菌は、１０ｇ／Ｌデキストロース、２ｇ／Ｌバクトペプトン、１ｇ／Ｌバクト酵母抽出物、１ｇ／Ｌカザミノ酸、５０ｍＬ／Ｌの２０×硝酸塩（１２０ｇ／ＬのＮａＮＯ３、１０．４ｇ／ＬのＫＣｌ、１０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、１ｍＬ／Ｌの１０００×微量元素（２２ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、５ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・７のＨ２Ｏ、５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および５０ｇ／ＬのＮａ４ＥＤＴＡ）、および１ｍＬ／Ｌビタミン溶液（１００ｍＬの水中、それぞれ１００ｍｇのビオチン、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ｐ−アミノ安息香酸、およびニコチン酸）を含有するＣＭ（完全培地）中で増殖する。
増殖条件および発酵
発酵に好適なｐＨの範囲は、多くの場合、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ８．０であり、ここで時には、初期の培養条件として約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．０の範囲のｐＨが利用される。宿主生物に応じて、培養は、好気性または嫌気性条件下で行われる可能性があり、その場合、時には、微好気性条件が維持される。２段階プロセスが利用される場合もあり、その場合、１段階目は微生物の繁殖を促進し、他方の状況は標的分子の生産を促進する。２段階プロセスにおいて、第一の段階は、好気条件下（例えば、空気および／または酸素の導入）で行ってもよく、第二の段階は、嫌気性条件下（例えば、培養条件に空気または酸素が導入されない）で行ってもよい。いくつかの実施態様において、第一の段階は、嫌気性条件下で行ってもよく、第二の段階は、好気条件下で行ってもよい。いくつかの実施態様において、２段階プロセスは、さらに２種の生物を包含していてもよく、その場合、例えば、そのうち１種の生物は、一方の段階で中間生成物を生成し、別の生物は、他方の段階で中間生成物を標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）にプロセシングする。
様々な発酵プロセスが、標的脂肪族ジカルボン酸生成物の商業的な生物学的生産のために適用できる。いくつかの実施態様において、組換え微生物宿主からの標的脂肪族ジカルボン酸生成物の商業的生産は、例えばバッチ式、流加培養または連続発酵プロセスを使用して行われる。
バッチ発酵プロセスは、多くの場合、閉鎖系であり、その場合、プロセス開始時に培地組成が固定され、プロセス中にｐＨおよび酸素レベルの維持に必要な添加のほかにさらなる添加はなされない。培養プロセスの開始時に、望ましい生物を培地に植え付けると、培地に追加の源（すなわち、炭素および窒素源）を添加しなくても増殖または代謝活性を起こすことが可能である。バッチプロセスにおいて、培養が終わる時間まで系の代謝産物およびバイオマスの組成は絶えず変化する。典型的なバッチプロセスにおいて、細胞は変化のないラグフェーズを経て高増殖対数期に進行し、最終的に固定相に至り、ここで増殖速度は減少するかまたは停止する。未処置のまま放置すれば、固定相中の細胞は、最終的に死ぬと予想される。
標準的なバッチプロセスのバリエーションは、流加培養プロセスであり、その場合、発酵プロセスの間中、炭素源が発酵槽に継続的に添加される。流加培養プロセスは、異化生成物の抑制が、細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や、または培地中の炭素源の量が常に制限されることが望ましい場合に有用である。流加培養システムにおける炭素源濃度の測定は、ｐＨ、溶存酸素および排ガス（例えば、ＣＯ２）の分圧などの測定可能な要素の変化に基づき推定が可能である。
バッチおよび流加培養式の培養方法は、当業界公知である。このような方法の例は、Thomas D. Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology、第2版、（1989）Sinauer Associates Sunderland、Mass. and Deshpande、Mukund V.、Appl. Biochem. Biotechnol.、36：227（1992）に見出すことができる。
連続発酵プロセスでは、多くの場合、バイオリアクターに規定された培地が連続添加され、それと同時に生成物回収のために等量の体積の培養が取り出される。連続培養は、一般的に、一定の細胞密度での対数増殖期で細胞を維持する。連続または半連続培養方法は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を与える１種の要素または多数の要素の調節を許容する。例えば、炭素源を制限し、他の全てのパラメーターを代謝が適度になるようなものにすることができるアプローチが可能である。いくつかのシステムにおいて、増殖に影響を及ぼす多数の要素を連続的に変更して、同時に培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持することができる。連続的なシステムは、多くの場合、定常状態での増殖を維持し、したがって、多くの場合、細胞増殖速度は、培養物から培地が引き出されることによる細胞の損失とのバランスを保っている。連続培養プロセスのための栄養素および増殖因子の調節方法、加えて生成物形成速度を最大化する技術は公知であり、様々な方法が、上記のBrockによって詳述されている。
発酵を含むいくつかの実施態様において、発酵は、２種またはそれより多くの微生物（例えば、宿主微生物、操作された微生物、単離された天然に存在する微生物など、およびそれらの組み合わせ）を使用して実行してもよく、その場合、供給材料は、発酵（例えば、混合型の発酵）において１種またはそれより多くの生物により部分的または完全に利用され、１種またはそれより多くの生物の細胞の呼吸または代謝の生成物は、望ましい標的生成物（例えば、セバシン酸、ドデカン二酸、ヘキサン酸）を生産する１種またはそれより多くの他の生物によってさらに代謝させることができる。いくつかの実施態様において、各生物を独立して発酵させて、細胞の呼吸または代謝の生成物を精製し、別の生物と接触させて望ましい標的生成物を生産してもよい。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの生物は、代謝経路（例えば、ベータ酸化、オメガ酸化など、またはそれらの組み合わせ）が部分的または完全にブロックされており、それによって１種またはそれより多くの他の生物のための供給材料として使用できる望ましい生成物が生産される。混合型の発酵または連続的な発酵を実行するために、微生物のあらゆる好適な組み合わせが利用できる。
標的生成物の生産、単離および収量
様々な実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、培養培地から単離または精製されるか、または操作された微生物から抽出される。いくつかの実施態様において、本明細書で説明される方法による供給材料の発酵は、標的脂肪族ジカルボン酸生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）を、理論収量の約１０％〜約１００％（例えば、理論収量の約１５％、約２０％、約２５％またはそれより多く（例えば、理論収量の、２５％またはそれより多く、２６％またはそれより多く、２７％またはそれより多く、２８％またはそれより多く、２９％またはそれより多く、３０％またはそれより多く、３１％またはそれより多く、３２％またはそれより多く、３３％またはそれより多く、３４％またはそれより多く、３５％またはそれより多く、３６％またはそれより多く、３７％またはそれより多く、３８％またはそれより多く、３９％またはそれより多く、４０％またはそれより多く、４１％またはそれより多く、４２％またはそれより多く、４３％またはそれより多く、４４％またはそれより多く、４５％またはそれより多く、４６％またはそれより多く、４７％またはそれより多く、４８％またはそれより多く、４９％またはそれより多く、５０％またはそれより多く、５１％またはそれより多く、５２％またはそれより多く、５３％またはそれより多く、５４％またはそれより多く、５５％またはそれより多く、５６％またはそれより多く、５７％またはそれより多く、５８％またはそれより多く、５９％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、６１％またはそれより多く、６２％またはそれより多く、６３％またはそれより多く、６４％またはそれより多く、６５％またはそれより多く、６６％またはそれより多く、６７％またはそれより多く、６８％またはそれより多く、６９％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、７１％またはそれより多く、７２％またはそれより多く、７３％またはそれより多く、７４％またはそれより多く、７５％またはそれより多く、７６％またはそれより多く、７７％またはそれより多く、７８％またはそれより多く、７９％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、８１％またはそれより多く、８２％またはそれより多く、８３％またはそれより多く、８４％またはそれより多く、８５％またはそれより多く、８６％またはそれより多く、８７％またはそれより多く、８８％またはそれより多く、８９％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９１％またはそれより多く、９２％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９４％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９６％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、または９９％またはそれより多く）のレベルで生産できる。用語「理論収量」は、本明細書で使用される場合、反応が１００％完了した場合、出発原料から作製される可能性がある生成物の量を指す。理論収量は、出発原料が完全に消費され、望ましくない副反応が起こらず、逆反応が起こらず、ワークアップ手法中の損失がない反応の化学量論および理想的な条件に基づく。標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）濃度に関して培養培地を試験してもよいし、濃度が予め決められたレベルに達したら培養培地を引き出してもよい。検出方法は当業界公知であり、例えば、これらに限定されないが、クロマトグラフ法（例えば、ガスクロマトグラフィー）またはクロマトグラフ／マススペクトロメトリーの組み合わせ（例えば、ＧＣ−ＭＳ）方法が挙げられる。標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）は、本明細書で説明されるようなレベルの範囲で存在する可能性がある。
標的脂肪族ジカルボン酸生成物は、時には、培養プロセスが完了した後に操作された微生物内に保持され、いくつかの実施態様において、標的生成物は、微生物から培養培地に分泌される。後者の実施態様の場合、（ｉ）培養培地を培養系から引き出して、新しい培地を補充してもよいし、および／または（ｉｉ）培養プロセス中または培養プロセスが完了した後に、標的生成物を培養培地から抽出してもよい。操作された微生物は、固体培地上で、半固体培地上でまたは液状培地中で培養してもよい。いくつかの実施態様において、プレートに付着している細胞から培地を抜く。いくつかの実施態様において、当業界で知られている通りに、細胞をペレット化するのに十分であるが細胞を破壊しない速度で液体と細胞の混合物を遠心分離して、培地を抜き出す。次いで細胞を新しい培地に再懸濁してもよい。当業界公知の方法に従って、標的生成物を培養培地から精製してもよい。
本明細書において、発酵ブロスから標的生成物を回収する、および／または混合鎖長供給材料を利用する場合、非標的生成物から標的脂肪族ジカルボン酸生成物を単離する／部分的に精製するのに有用な方法の非限定的な例を示す。発酵ブロスからの脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の回収は、様々な方法を使用して達成できる。場合によっては、水相から細胞塊と脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）とを分離するために、まず遠心分離工程を採用してもよい。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、発酵条件下における水への溶解度が限られており、水の密度に類似した密度を有する。遠心分離すると、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の大部分が水のストリームから抜き出され、細胞塊ストリーム中で濃縮されると予想される。次いで濃縮した脂肪族ジカルボン酸のストリームは、ろ過工程を介してさらに濃縮されると予想される（例えば、固体のドデカン二酸はフィルターに保持され、水はそのまま通過するので、生成物が濃縮される）。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）が望ましいレベルに濃縮されたら、その融点である１３０℃より高く温度を高めると予想される。脂肪族ジカルボン酸が融解した後、残存した不純物をろ過により除去し、温度を下げて、脂肪族ジカルボン酸をそのまま凝固させて、固体生成物を収集することにより最終産物を回収する。
その代わりに、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を、まず、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）が溶解できる有機溶媒（例えば、エタノール）を用いて液体培地を抽出することによって、発酵ブロスから回収してもよい。次いで有機溶媒相を様々な膜に通過させてろ過して、脂肪族ジカルボン酸をさらに精製してもよい。それに続いて同じまたは異なる有機溶媒を用いた抽出を行ってもよく、続いて、脂肪族ジカルボン酸をさらに濃縮するために各抽出ラウンドの後に膜ろ過を行ってもよい。有機溶媒を蒸発させて、残留物として脂肪族ジカルボン酸を残してもよく、この残留物を乾燥させて、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を固体の形態で得てもよい。
いくつかの実施態様において、標的生成物は、培養された操作された微生物から抽出される。微生物細胞は、細胞膜を剪断するのに十分な速度で遠心分離することにより濃縮されてもよい。いくつかの実施態様において、細胞は、物理的に破壊してもよいし（例えば、剪断力、超音波破砕）または化学的に破壊してもよい（例えば、界面活性剤または他の溶解剤との接触）。遠心分離または当業界公知の他の方法によって相分離を行ってもよいし、公知の方法に従って標的生成物を単離してもよい。
市販用グレードの標的生成物は、時には、実質的に純粋な形態で（例えば、９０％またはそれより高く純粋な、９５％またはそれより高く純粋な、９９％またはそれより高く純粋な、または９９．５％またはそれより高く純粋な形態で）提供される。いくつかの実施態様において、標的生成物は、多数の下流生成物のいずれか１種に改変されてもよい。例えば、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）をヘキサメチレンジアミンと重縮合させてナイロンを生産してもよい。ナイロンはさらに、カーペット、自動車用タイヤコードおよび衣類における用途のための繊維に操作されてもよい。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）はまた、可塑剤、潤滑剤成分およびポリウレタン系のためのポリエステルポリオールの製造にも使用される。食品グレードの脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の様々なエステルが、芳香剤製造、ゲル化助剤、香料、酸味料、膨張剤および緩衝剤における成分として使用される。脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、２つのカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基を有することから、２種の塩を産出することができる。その誘導体、ハロゲン化アシル、無水物、エステル、アミドおよびニトリルは、さらなる置換反応、触媒還元、金属水素化物による還元、ジボランによる還元、有機金属試薬とのケト形成、酸素における求電子性の結合、および縮合を介して様々な下流生成物を作製することに使用される。
標的生成物は、標的生成物を含有する培養された微生物内に提供されてもよいし、培養された微生物は、液状培地中で新鮮な状態もしくは凍結した状態で、または乾燥させた状態で提供されてもよい。新鮮なまたは凍結した微生物は、必要に応じて温度制御可能な適切な耐湿性容器中に入れられてもよい。標的生成物は、時には、実質的に細胞を含まない培養培地中に提供される。いくつかの実施態様において、微生物から精製された標的生成物または改変された標的生成物が提供され、標的生成物は、時には、実質的に純粋な形態で提供される。いくつかの実施態様において、結晶化または粉末化した標的生成物が提供される。ドデカン二酸（１，１２ドデカン二酸；ＤＤＤＡ）は、２６０°Ｆ〜２６６°Ｆの融点を有する白色の粉末または結晶である。またセバシン酸（１，８オクタンジカルボン酸）も、２６８°Ｆ〜２７４°Ｆの融点を有する白色の粉末または結晶である。結晶化または粉末化した脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、１トンのカートン、ドラム、５０ポンドのバッグおよび同種のものなどの様々な容器中で輸送が可能である。
いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸である標的生成物（例えば、ドデカン二酸またはセバシン酸）は、添加された供給材料１グラムあたり約０．５０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．５９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．６９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．７９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．８９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９４グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９５グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９６グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９７グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９８グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり０．９９グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．０グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．１グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．２グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．３グラムの標的生成物、またはそれより多く；添加された供給材料１グラムあたり１．４グラムの標的生成物、またはそれより多く；または約添加された供給材料１グラムあたり１．５グラムの標的生成物、またはそれより多くの収量で生産される。
いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、供給材料（例えば、ドデカン、混合鎖長アルカン、ラウリン酸、混合鎖長脂肪酸、油など、または前述のものの組み合わせ）１グラムあたり約０．１５グラムより多くの収量で生産される。いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、導入されたあらゆる供給材料の最大理論収量の約１０％〜約１００％（（例えば、理論収量の、約１５％、約２０％、約２５％またはそれより多く（例えば、最大理論収量の２５％またはそれより多く、２６％またはそれより多く、２７％またはそれより多く、２８％またはそれより多く、２９％またはそれより多く、３０％またはそれより多く、３１％またはそれより多く、３２％またはそれより多く、３３％またはそれより多く、３４％またはそれより多く、３５％またはそれより多く、３６％またはそれより多く、３７％またはそれより多く、３８％またはそれより多く、３９％またはそれより多く、４０％またはそれより多く、４１％またはそれより多く、４２％またはそれより多く、４３％またはそれより多く、４４％またはそれより多く、４５％またはそれより多く、４６％またはそれより多く、４７％またはそれより多く、４８％またはそれより多く、４９％またはそれより多く、５０％またはそれより多く、５１％またはそれより多く、５２％またはそれより多く、５３％またはそれより多く、５４％またはそれより多く、５５％またはそれより多く、５６％またはそれより多く、５７％またはそれより多く、５８％またはそれより多く、５９％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、６１％またはそれより多く、６２％またはそれより多く、６３％またはそれより多く、６４％またはそれより多く、６５％またはそれより多く、６６％またはそれより多く、６７％またはそれより多く、６８％またはそれより多く、６９％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、７１％またはそれより多く、７２％またはそれより多く、７３％またはそれより多く、７４％またはそれより多く、７５％またはそれより多く、７６％またはそれより多く、７７％またはそれより多く、７８％またはそれより多く、７９％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、８１％またはそれより多く、８２％またはそれより多く、８３％またはそれより多く、８４％またはそれより多く、８５％またはそれより多く、８６％またはそれより多く、８７％またはそれより多く、８８％またはそれより多く、８９％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９１％またはそれより多く、９２％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９４％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９６％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、または９９％またはそれより多く）で生産される。いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、約５０ｇ／Ｌ（培養培地）〜約１０００ｇ／Ｌ（培養培地）の濃度範囲（例えば、約５０ｇ／Ｌ、約５５ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約６５ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約７５ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約８５ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約９５ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ、約１６０ｇ／Ｌ、約１７０ｇ／Ｌ、約１８０ｇ／Ｌ、約１９０ｇ／Ｌ、約２００ｇ／Ｌ、約２２５ｇ／Ｌ、約２５０ｇ／Ｌ、約２７５ｇ／Ｌ、約３００ｇ／Ｌ、約３２５ｇ／Ｌ、約３５０ｇ／Ｌ、約３７５ｇ／Ｌ、約４００ｇ／Ｌ、約４２５ｇ／Ｌ、約４５０ｇ／Ｌ、約４７５ｇ／Ｌ、約５００ｇ／Ｌ、約５５０ｇ／Ｌ、約６００ｇ／Ｌ、約６５０ｇ／Ｌ、約７００ｇ／Ｌ、約７５０ｇ／Ｌ、約８００ｇ／Ｌ、約８５０ｇ／Ｌ、約９００ｇ／Ｌ、約９５０ｇ／Ｌ、または約１０００ｇ／Ｌ）で生産される。
いくつかの実施態様において、脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）は、約０．５ｇ／Ｌ／時間〜約５ｇ／Ｌ／時間の速度（例えば、約０．５ｇ／Ｌ／時間、約０．６ｇ／Ｌ／時間、約０．７ｇ／Ｌ／時間、約０．８ｇ／Ｌ／時間、約０．９ｇ／Ｌ／時間、約１．０ｇ／Ｌ／時間、約１．１ｇ／Ｌ／時間、約１．２ｇ／Ｌ／時間、約１．３ｇ／Ｌ／時間、約１．４ｇ／Ｌ／時間、約１．５ｇ／Ｌ／時間、約１．６ｇ／Ｌ／時間、約１．７ｇ／Ｌ／時間、約１．８ｇ／Ｌ／時間、約１．９ｇ／Ｌ／時間、約２．０ｇ／Ｌ／時間、約２．２５ｇ／Ｌ／時間、約２．５ｇ／Ｌ／時間、約２．７５ｇ／Ｌ／時間、約３．０ｇ／Ｌ／時間、約３．２５ｇ／Ｌ／時間、約３．５ｇ／Ｌ／時間、約３．７５ｇ／Ｌ／時間、約４．０ｇ／Ｌ／時間、約４．２５ｇ／Ｌ／時間、約４．５ｇ／Ｌ／時間、約４．７５ｇ／Ｌ／時間、または約５．０ｇ／Ｌ／時間）で生産される。所定の実施態様において、操作された生物は、同一の発酵条件下で野生型または同じ株の部分的に操作された生物と比較した場合、約５倍〜約５００倍増加した脂肪族ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）生産を含む（例えば、約５倍の増加、約１０倍の増加、約１５倍の増加、約２０倍の増加、約２５倍の増加、約３０倍の増加、約３５倍の増加、約４０倍の増加、約４５倍の増加、約５０倍の増加、約５５倍の増加、約６０倍の増加、約６５倍の増加、約７０倍の増加、約７５倍の増加、約８０倍の増加、約８５倍の増加、約９０倍の増加、約９５倍の増加、約１００倍の増加、約１２５倍の増加、約１５０倍の増加、約１７５倍の増加、約２００倍の増加、約２５０倍の増加、約３００倍の増加、約３５０倍の増加、約４００倍の増加、約４５０倍の増加、または約５００倍の増加）。
いくつかの実施態様において、ベータ酸化が完全にブロックされた操作された微生物におけるドデカン二酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたラウリン酸１グラムあたり約１．１５グラムの生産されたドデカン二酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が完全にブロックされた操作された微生物におけるドデカン二酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたラウリン酸メチル１グラムあたり約１．０７グラムの生産されたドデカン二酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が部分的にブロックされた操作された微生物におけるドデカン二酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたオレイン酸１グラムあたり約０．８２グラムの生産されたドデカン二酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が部分的にブロックされた操作された微生物におけるドデカン二酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたヤシ油１グラムあたり約０．９５グラムの生産されたドデカン二酸である。ドデカン二酸が生産される条件下での操作された微生物に関するＹｍａｘのパーセンテージは、（％Ｙｍａｘ）＝Ｙｐ／ｓ／Ｙｍａｘ×１００として計算され、式中（Ｙｐ／ｓ）＝［ドデカン二酸（ｇ／Ｌ）］×フラスコ中の培養液の最終容量（Ｌ）］／［フラスコに添加された供給材料（ｇ）］である。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、最大理論収量の約１０％〜約１００％でドデカン二酸を生産する。
いくつかの実施態様において、ベータ酸化が完全にブロックされた操作された微生物におけるセバシン酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたデカン１グラムあたり約１．４２グラムの生産されたセバシン酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が完全にブロックされた操作された微生物におけるセバシン酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたカプリン酸１グラムあたり約１．１７グラムの生産されたセバシン酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が部分的にブロックされた操作された微生物におけるセバシン酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたヤシ油１グラムあたり約０．８３グラムの生産されたセバシン酸である。いくつかの実施態様において、ベータ酸化が部分的にブロックされた操作された微生物におけるセバシン酸の最大理論収量（Ｙｍａｘ）は、添加されたオレイン酸１グラムあたり約０．７２グラムの生産されたセバシン酸である。セバシン酸が生産される条件下での操作された微生物に関するＹｍａｘのパーセンテージは、（％Ｙｍａｘ）＝Ｙｐ／ｓ／Ｙｍａｘ×１００として計算され、式中（Ｙｐ／ｓ）＝［セバシン酸（ｇ／Ｌ）］×フラスコ中の培養液の最終容量（Ｌ）］／［フラスコに添加された供給材料（ｇ）］である。いくつかの実施態様において、操作された微生物は、最大理論収量の約１０％〜約１００％でセバシン酸を生産する。
以下に記載の実施例は所定の実施態様を例示したものであり、本技術を限定するものではない。以下に記載の所定の実施例は、標準的な組換えＤＮＡおよび他の当業界公知の生物工学プロトコールを利用する。多くのこのような技術は、Maniatis, T.、E. F. FritschおよびJ. Sambrook（1982）Molecular Cloning：a Laboratory Manual；コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーで詳細に説明されている。ＤＮＡ変異誘発は、ストラタジーン（カリフォルニア州サンディエゴ）「クイックチェンジ」キットを製造元の説明書に従って使用して達成できる。
微生物の組換えＤＮＡ技術および遺伝子操作の非限定的な例を本明細書で説明する。いくつかの実施態様において、望ましい標的生成物（例えば、セバシン酸またはドデカン二酸）の生産のために、本明細書で説明される天然および／または操作された経路を介した炭素フラックスの管理がさらに強化されるように、本明細書で説明される操作された生物の株は、交配されて遺伝学的背景が組み合わされている。
実施例１：振盪フラスコ発酵でのデカンからセバシン酸への変換
５０ｍＬのＳＰ９２培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌデキストロース）に、カンジダ・トロピカリスのベータ酸化が完全にブロックされた株（ＡＴＣＣ２０９６２）のシングルコロニーを植え付け、培養物を約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を捨てた。細胞を２０ｍＬのＴＢ−低窒素含有（低Ｎ）培地（硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）中に再懸濁し、新しい滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移し、以下の栄養供給スケジュールを利用して、約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした：０、１、２、３、４、および５時間にデキストロースを０．１％まで供給、３０時間にデキストロースを５％まで供給、０、５、３０、および４８時間にデカンを０．７％まで供給。０、４、３０、および７２時間に、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）分析のためにサンプルを取り出した。図９で示されるように、ＧＣプロファイルから、培養によりＣ１０ジカルボン酸（セバシン酸）が蓄積し、Ｃ１０モノカルボン酸（カプリン酸）の蓄積は極めてわずかであったことが示された。７２時間インキュベートした後セバシン酸濃度は０．９４ｇ／Ｌであり、カプリン酸濃度は０．０１ｇ／Ｌであった。他のあらゆる一酸または二酸の有意な蓄積はなかった。
実施例２：振盪フラスコ発酵でのカプリン酸からセバシン酸への変換
５ｍＬのＳＰ９２−グリセロール培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）に、カンジダ・トロピカリス（ＡＴＣＣ２０９６２）のシングルコロニーを植え付け、初発培養物を約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。ＳＰ９２培地の配合の改変は公知であり、その非限定的な例としては、デキストロースおよび／またはグリセロールなど、またはそれらの組み合わせの添加が挙げられる。ＳＰ９２培地は、本明細書で述べられる場合、デキストロースおよび／またはグリセロールを包含する場合もある。次いで初発培養物を使用して、同じ培地中の２５ｍＬの培養物を初期ＯＤ６００ｎｍが０．４になるまで植え付け、約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を捨てた。１２．５ｍＬのＴＢ−低Ｎ培地＋グリセロール（硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）中に細胞を再懸濁し、新しい滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移した。培養物に、０．０５％または０．１％カプリン酸を供給し、約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、培養物に、グリセロールを７５ｇ／Ｌまで供給し、インキュベートを続け、その後４８時間にＧＣ用のサンプリングを行った。ＧＣ分析から、図１０で示されるように、両方のカプリン酸の開始濃度下で、カプリン酸のほぼ全てがセバシン酸に変換されたことが示された。
実施例３：デカンからセバシン酸へ変換するための発酵手法
ろ過滅菌した改変ＳＰ９２−グリセロール発酵培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２０ｇ／Ｌグリセロール）を滅菌発酵容器に移した。カンジダ・トロピカリス（ＡＴＣＣ２０９６２）の増殖物を初期ＯＤ６００ｎｍが約１．０になるまで５％の接種材料で植え付け、以下：３０℃約１０００ｒｐｍで振盪しながら、１体積／分あたり１体積の通気（ｖｖｍ）、ｐＨ５．８および０．３Ｌの初期体積の条件下で増殖を実行した。増殖をおよそ８時間進行させ、２ｇ／Ｌまでデカンを添加することによって変換期を開始させた。デカンのボーラス添加と同時にデカン（１ｇ／Ｌ−ｈ）およびグルコース（１．５ｇ／Ｌ−ｈ）の連続フィードを開始させた。発酵条件を、３０℃、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、およびｐＨ５．８で４４時間に維持した。
変換期を開始させた後、４４時間でＧＣ分析のためにサンプルを収集した。図１６に示したデータは、デカンが独占的にＣ１０ジカルボン酸であるセバシン酸に変換されたことを示す。デカンフィードボトルからの有意な蒸発による損失により生成物収量の正確な決定が妨げられた。
実施例４：振盪フラスコ発酵での混合脂肪酸供給材料からセバシン酸を含有する混合二酸生成物への変換
５ｍＬのＳＰ９２−グリセロール培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）にカンジダ・トロピカリス（ＡＴＣＣ２０９６２）のシングルコロニーを植え付け、実施例２で説明されているようにして増殖させた。２５ｍＬの同じ培地を、一晩の培養により初期ＯＤ６００ｎｍが０．４になるまで植え付け、約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を捨てた。炭素源非含有のＴＢ−低Ｎ培地（硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）１２．５ｍＬに細胞を再懸濁し、新しい滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移した。培養物に０．０５％カプリン酸、０．０５％ラウリン酸メチル、および３０ｇ／Ｌグリセロールを供給し、３０℃、３００ｒｐｍでインキュベートした。２４時間インキュベート後、ＧＣ分析のために培養物をサンプリングした。
図１７に示した結果から、Ｃ１２およびＣ１０脂肪酸が、同じ鎖長を有するジカルボン酸（例えば、Ｃ１２およびＣ１０ジカルボン酸）に変換されたことが示され、二酸の鎖が短くなった証拠（例えば、有意なレベルのモノカルボン酸が検出されなかったこと）は示されなかった。
実施例５：長鎖脂肪酸から混合二酸への変換
ＳＰ９２発酵培地をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。ベータ酸化が部分的にブロックされたカンジダ・トロピカリスの株（ｓＡＡ１０６）の増殖を、１０％の接種材料（初期のＯＤ６００ｎｍ＝３．０）を用いて開始させ、以下：３０℃、約１２００ｒｐｍで振盪しながら、１ｖｖｍ、ｐＨ６．１および０．３Ｌの初期体積の条件下で増殖させた。グルコース濃度が２ｇ／Ｌ未満に落ちるまで増殖を続け、その時間に、６ＮのＫＯＨの添加によりｐＨを８．０に高めることによって、さらにミリスチン酸メチルを３０ｇ／Ｌまで添加することによって変換期を開始させた。ミリスチン酸メチルのボーラスの直後、グルコースの連続フィードを１．５ｇ／Ｌ−ｈの速度で開始させた。変換開始後の２４、４８、および７２時間に３０ｇ／Ｌミリスチン酸メチルのボーラスを用いることにより、発酵条件を３０℃、１２００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、およびｐＨ８．０で９０時間に維持した。２４、４８、７２、および９０時間にＧＣ用のサンプルを収集した。図１１で図表を用いて例示された二酸プロファイルは、セバシン酸を包含する６〜１４個の炭素長を有する鎖長の範囲のジカルボン酸が蓄積したことを示す。サイクリックβ酸化経路を介した２つの炭素の増加によって短縮化される前に、まずミリスチン酸メチル基質（ミリスチン酸のメチルエステル）がω酸化経路を介してＣ１４ジカルボン酸に変換された。発酵中に採用されたグルコースのコフィードは、全ての鎖長の二酸が蓄積されるようにβ酸化経路を抑制した。二酸鎖長分布の操作は、発酵培地中のグルコースのコフィード速度を変更することで様々なグルコース濃度下で増殖させることによって目下調査中である。
実施例６：混合長鎖脂肪酸からそれより短い鎖長の混合二酸への変換のための発酵手法
グリセロール非含有のＳＰ９２発酵培地をろ過滅菌し、滅菌発酵容器に移した。容器にオートクレーブした未処理のヤシ油を８０ｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。ベータ酸化が部分的にブロックされたカンジダ・トロピカリス株（ｓＡＡ４９６）を初期ＯＤ６００ｎｍが１．０になるまで５％の接種材料で植え付け、以下：３０℃約１２００ｒｐｍで振盪しながら、１ｖｖｍ、初期ｐＨ６．５および１．０Ｌの初期体積の条件下で増殖させた。脂肪酸の鎖長の分布に対するｐＨの作用を、発酵培地のｐＨを操作することによって決定した。発酵のｐＨは、１）ｐＨ７．５まで高めて実行中そのｐＨで制御するか、２）培養の増殖によって自然に低下させて、その後、残りの実行中、ｐＨ６．０で制御するか、または３）培養の増殖によって自然に低下させて、その後、残りの実行中、ｐＨ４．５で制御するかのいずれかであった。１４０時間の発酵時間の後にＧＣ分析のためにサンプルを収集した。表６で示されるように、生成物である二酸組成物は、ｐＨを高めることによってより長い鎖の二酸にシフトすることが示された。
実施例７：オメガ酸化経路において追加の遺伝学的改変を有するベータ酸化が完全にブロックされた株を使用した、振盪フラスコ発酵でのカプリン酸からセバシン酸への変換
カンジダ・トロピカリスの様々な遺伝子改変株を、５ｍＬのＳＰ９２培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）に植え付けた。カンジダ・トロピカリスのベータ酸化が完全にブロックされた株（ｓＡＡ００３）、加えてオメガ酸化経路の要素（例えば、様々なシトクロムＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはそれらの組み合わせ）を増幅させたｓＡＡ００３の誘導体を包含する株およびそれらの培養物を、約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。次いでこれらの初発培養物を使用して、同じ培地中の２５ｍＬの培養物を植え付け、約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を捨てた。１２．５ｍＬのＴＢ−低Ｎ培地＋グリセロール（硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）中に細胞を再懸濁し、新しい滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移した。培養物に、エタノール中５％カプリン酸溶液から０．０５％供給したおよび約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、培養物に、３０ｇ／Ｌまでのグリセロールと０．０５％カプリン酸の追加のボーラスを供給した。インキュベートを続け、その後２４、４８、および７２時間にＧＣ用のサンプリングを行った。図１２に結果を示す。ＧＣ分析から、オメガ酸化経路の特定の要素が増幅されると、より大きい比率のカプリン酸がセバシン酸に変換されたことが示された。データは、最大理論収量の％として示される。ＣＹＰＡ１８およびＣＹＰＡ１９に対する遺伝学的改変を包含する株は、カプリン酸からセバシン酸への変換における最大理論収量のおよそ８０％を達成する。＋ＣＰＲ＋Ａ１８と名付けられた株は、ＣＹＰＡ１８の約３０のコピーを有するが、それに対して＋ＣＰＲ＋Ａ１９と名付けられた株は、ＣＹＰＡ１９の約７のコピーを有する。
実施例８：振盪フラスコ発酵でのラウリン酸メチルからドデカン二酸への変換
５ｍＬのＳＰ９２グリセロール培地（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７５ｇ／Ｌグリセロール）に、カンジダ・トロピカリスのベータ酸化が完全にブロックされた株（ＡＴＣＣ２０９６２）、加えてオメガ酸化経路の要素を増幅させたこの株の改変された誘導体のシングルコロニーを植え付け、この培養物を約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。次いで初発培養物を使用して、同じ培地の２５ｍＬの培養物に植え付け、約２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を４℃で１０分間、１，０５０×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を捨てた。細胞を１２．５ｍＬのＳＰ９２グリセロール培地に再懸濁し、滅菌した２５０ｍＬガラス製バッフル付きフラスコに移した。培養物に、２％（ｖ／ｖ）ラウリン酸メチルを供給し、約３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、培養物に、グリセロールを６０ｇ／Ｌまで供給し、インキュベートを続け、その後４８時間にＧＣ用のサンプリングを行った。ＧＣ分析から、オメガ酸化経路における所定の要素が増幅されると、ドデカン二酸への変換が増加することが示された（図１３）。
実施例９：アシルＣｏＡオキシダーゼの基質特異性の変更
ペルオキシソームのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素ＰＯＸ４およびＰＯＸ５の基質特異性は、混合鎖長脂肪酸供給材料が供給されたカンジダ・トロピカリスの発酵における二酸生成物の鎖長の制御に関与することが示されている。ＰＯＸ４活性、ＰＯＸ５活性またはＰＯＸ４活性およびＰＯＸ５活性の低減または除去は、カンジダ種で生産されたジカルボン酸の炭素鎖長の分布をもたらす。アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、各サイクルで基質を２つの炭素分短くする、サイクリックベータ酸化経路における第一の酵素である。したがって、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、ベータ酸化経路に入る基質にとって経路の入り口として役立つ。望ましい炭素鎖長（例えば、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４および同種のもの）より短い炭素鎖の基質に対して活性ではなくなるようにアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の基質特異性を変更することによって、選ばれた理論限界より短く炭素鎖を短くすることを阻害することができ、望ましい標的鎖長および生成物（例えば、Ｃ１２、ドデカン二酸）の蓄積を可能にする。
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６における天然のアシル−ＣｏＡオキシダーゼアイソザイムであるＰｏｘ４ｐおよびＰｏｘ５ｐは、異なる基質特異性を有する。Ｐｏｘ４ｐアイソザイムは広範な基質特異性を有するが、Ｐｏｘ５ｐアイソザイムは、制限された基質特異性を有する。Ｐｏｘ４−、Ｐｏｘ５＋である株において、二酸生成物の鎖長は、Ｐｏｘ５ｐアイソザイムの基質特異性によって決定され、主要な生成物は、アジピン酸である。
いくつかの実施態様において、発酵においてより長い鎖長（例えば、Ｃ１２）を有する望ましい二酸生成物の生産を最大にするために、望ましい二酸生成物の鎖長に適切な基質鎖長特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を含有する遺伝子改変生物を操作してもよい。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の源またはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を操作する方法は、様々であってもよい。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の変更された基質特異性の操作での使用に好適なポリヌクレオチド配列を提供するのに使用できる生物の非限定的な例としては、植物（例えば、シロイヌナズナ属、ウリ科（例えば、カボチャ、スクワッシュ）、イネ科（Oryza）（例えば、コメ））；動物（例えば、ウシ属（Bos）（例えば、ウシ）、テンジクネズミ属（例えば、モルモット）、ハツカネズミ属（例えば、マウス）、クマネズミ属（例えば、ラット）、コアラ属（Phascolarctos）（例えば、コアラ）、霊長類（例えば、オランウータン））；糸状菌（例えば、タマホコリカビ属（例えば、粘菌））；昆虫（例えば、ショウジョウバエ）；酵母（例えば、ヤロウイア・リポリチカ、カンジダ・マルトサ、カンジダ・グラブラータ、アシュビア・ゴシッピイ（Ashbya gossypii）、デバリオマイセス・ハンセニイ、クルイベロマイセス・ラクティス、ピチア・パストリス、サッカロミセス・セレビジエ）；細菌（例えば、大腸菌（Eschericia coli））；シアノバクテリア；線虫（例えば、カエノルハブディティス属（Caenorhabditis））；およびヒトが挙げられる。
異なる基質鎖長特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、以下によって同定できる：
１）異なる基質鎖長特異性を含有する異種生物からアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を選択すること。同定された遺伝子を、全てのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性が欠失したカンジダ株に移行させることができる。このような遺伝子改変生物において検出可能なアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、異種遺伝子によって付与されたものだけであってもよい。
２）複数のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子からのドメイン交換によるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子ライブラリーの操作は、非天然キメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子ライブラリーを生産する。キメラ遺伝子のライブラリーは、全てのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性が欠失したカンジダ属の株に移行させることができる。検出可能なアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、非天然キメラアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子ライブラリーからの操作された遺伝子によって付与されたものだけであってもよい。
３）ランダム変異誘発によってアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子ライブラリーを操作すること。望ましいものに近い基質鎖長特異性を有する天然に存在する、または操作されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、望ましい基質鎖長特異性を有する変更された活性を生成し同定する目的での、ランダム変異誘発、それに続くスクリーニングおよび／または選択のための基準として使用できる。遺伝子のライブラリーは、全てのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性が欠失したカンジダ株に移行させることができる。検出可能なアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、ランダムに変異誘発されたライブラリーからの遺伝子によって付与されたものだけであってもよい。
４）置き換えようとするアミノ酸の位置および同一性を導くためにタンパク質構造情報を使用した、インテリジェントデザインおよび定方向突然変異によってアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を操作すること。操作された遺伝子は、全てのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性が欠失したカンジダ株に移行させることができる。検出可能なアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、操作された遺伝子によって付与されたものだけであってもよい。
望ましい基質鎖長特異性を付与する遺伝子を選択するための操作後の方法の非限定的な例は、本明細書で示される。唯一の炭素源として供給される異なる鎖長の基質上での増殖によって、選択を行う。他のものではなく所定の基質上での細胞の増殖は、多くの場合、株に存在するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素の基質鎖長特異性を反映する。カンジダ・トロピカリスは、増殖のためのその唯一の炭素源として気相中に供給されるアルカンを利用できる。異なる鎖長のアルカンは、適切なアルカン中にろ紙を浸し、炭素源非含有の固体増殖培地をろ紙上で反転させて、異なるペトリ皿に各特異的炭素源（例えば、特異的な鎖長アルカン）を供給することによって提供される。各株におけるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ酵素の鎖長特異性に関する増殖選択のために、変更された特異性アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を有する連続希釈したカンジダ属を固体増殖培地上にスポッティングする。図１４および１５に、本明細書で説明されるような気相炭素源としてアルカンを供給する選択プロセスの概略図を示す。固体増殖培地は、アミノ酸または他のあらゆる炭素源を含まない酵母窒素原礎培地を含有する寒天培地である。図１４で示されるように、蒸発して気相を介して炭素源を提供する適切な鎖長のアルカンに浸したろ紙を含有する蓋の上に、平板培養した細胞を反転させる。
本明細書で説明されたように生成した変更されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を含有するカンジダ株が、本明細書で説明される方法を使用して選択および／またはスクリーニングされる。異なる変更されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を有する株（例えば、株１（Ｓ１）、株２（Ｓ２）、株３（Ｓ３）、株４（Ｓ４））を栄養培地（例えば、ＹＰＤ）で一晩増殖させる。一晩培養したものをを遠心分離し、洗浄して、微量の残留した栄養培地を全て除去し、リン酸緩衝液で細胞の連続希釈液を調製する。各株の連続希釈液を、複数のＹＮＢ寒天プレート（アミノ酸または他の炭素源を含まない増殖培地）上にスポッティングし、個々のプレートを適切な鎖長アルカンに浸したろ紙上で反転させて、プレートを３０℃でインキュベートした。株の増殖は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼの鎖長特異性に依存する。増殖のために特定のアルカンを利用するために、供給された鎖長がベータ酸化経路に侵入できなければならない。所定の株が増殖できる最も短い鎖長は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼアイソザイムの基質特異性の最も短い鎖長であることを示す。図１５にその例を示す。図１５は、株Ｓ４は、デカン上で増殖できるが、オクタン上では増殖できないことを例示する。それゆえに、株Ｓ４の改変されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性は、８炭素分子の利用を阻害する基質鎖長特異性を有し、この株を用いた発酵からの二酸生成物は、典型的には、炭素８個の二酸になる。本明細書で説明される方法を使用して、あらゆる望ましい特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性を選択および／またはスクリーニングできる。
本明細書で示された実施例は、選択／スクリーニングプロセスを説明するために使用された一般化された方法であることが理解されよう。選択およびスクリーニングプロセスに使用される供給材料は、捜しているアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性に適するように変更される。例えば、より長い鎖の基質に対する特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼの場合、より長い炭素鎖長に対する特異性を有するアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性の選択および／またはスクリーニングが可能になるように、より長い炭素鎖長を有する供給材料で代用してもよい。
実施例１０：カンジダ種の形質転換手法
５ｍＬのＹＰＤの初発培養液に、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のシングルコロニーを植え付け、約２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。翌日、０．０５％アンチフォームＢを含有する新鮮なＹＰＤ培養液２５ｍＬを初期ＯＤ６００ｎｍが０．４になるまで植え付け、培養物を、１．０〜２．０のＯＤ６００ｎｍが達成されるまで、約２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。細胞を、１，０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によってペレット化した。１０ｍＬ滅菌水に再懸濁することによって細胞を洗浄し、ペレット化し、１ｍＬ滅菌水に再懸濁して、１．５ｍＬマイクロ遠沈管に移した。次いで細胞を１ｍＬ滅菌ＴＥ／ＬｉＯＡＣ溶液、ｐＨ７．５で洗浄し、ペレット化し、０．２５ｍＬのＴＥ／ＬｉＯＡＣ溶液に再懸濁し、３０℃で３０分間振盪することによってインキュベートした。
細胞溶液を、５〜８μｇの直線状ＤＮＡおよび５μＬのキャリアーＤＮＡ（沸騰させ冷却したサケ精子ＤＮＡ、１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した１．５ｍＬチューブ中に、５０μＬのアリコートに分けた。３００μＬの滅菌ＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ３５００、１×ＴＥ、１×ＬｉＯＡＣ）を添加し、徹底的に混合し、１５分毎に穏やかに混合しながら３０℃で６０分間インキュベートした。４０μＬのＤＭＳＯを添加し、徹底的に混合し、細胞溶液を４２℃で１５分間インキュベートした。次いで細胞を、１，０００×ｇ３０秒間での遠心分離によってペレット化し、５００μＬのＹＰＤ培地に再懸濁し、約２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離によってペレット化し、１ｍＬの１×ＴＥに再懸濁し、細胞を再度ペレット化し、０．２ｍＬの１×ＴＥに再懸濁し、選択培地上で平板培養した。形質転換株の増殖のためにプレートを３０℃でインキュベートした。
実施例１１：ＵＲＡ３マーカーを再利用するための手法
カンジダ属酵母培養物ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡからＵＲＡ３遺伝子を得た。カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６は、Ｓ．セレビシエと比較して限られた数の選択マーカーしか有さないために、ＵＲＡ３を使用した複数回の選択を可能にするにはＵＲＡ３マーカーが「再利用」される。その後のカンジダ種の操作でＵＲＡ３マーカーを再利用するために、Ｕｒａ＋表現型を有するシングルコロニーを、３ｍＬのＹＰＤに植え付け、振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。次いで一晩培養したものを遠心分離によって回収し、１ｍＬのＹＮＢ＋ＹＥ（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素液体培地、３ｇ／Ｌ酵母抽出物）に再懸濁した。次いで再懸濁した細胞をＹＮＢ＋ＹＥで連続希釈し、１００μＬのアリコートをＹＰＤプレート上で平板培養し（３０℃で一晩インキュベート）、元の懸濁液の力価を決定した。加えて、希釈していない懸濁液の３連の１００μＬのアリコートを、ＳＣデキストロース（バクトアガー２０ｇ／Ｌ、ウラシル、０．３ｇ／Ｌ、デキストロース、２０ｇ／Ｌ、酵母窒素液体培地６．７ｇ／Ｌ、アミノ酸ドロップアウトミックス（Amino Acid Dropout Mix）２．１４ｇ／Ｌ）、および３種の異なる濃度（０．５、０．７５、１ｍｇ／ｍＬ）の５−ＦＯＡ上で平板培養した。
プレートを３０℃で少なくとも５日間インキュベートした。ＳＣデキストロース＋５−ＦＯＡプレート上で発生したコロニーを５０μＬ滅菌蒸留水中に再懸濁し、５μＬを利用してＹＰＤ、ＳＣ−ＵＲＡ（ウラシル非含有ＳＣデキストロース培地）プレート上に画線した。次いで、ＹＰＤでのみ増殖してＳＣ−ＵＲＡプレートでは増殖しないコロニーを、３ｍＬのＹＰＤに植え付け、振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。一晩培養したものを遠心分離によって回収し、１．５ｍＬのＹＮＢ（６．７ｇ／Ｌ酵母窒素液体培地）に再懸濁した。再懸濁した細胞をＹＮＢで連続希釈し、１００μＬのアリコートをＹＰＤプレート上で平板培養し、３０℃で一晩インキュベートして、最初の力価を決定した。それぞれの希釈していない細胞懸濁液１ｍＬもＳＣ−ＵＲＡ上で平板培養し、３０℃で最大７日間インキュベートした。ＳＣ−ＵＲＡプレート上のコロニーは復帰突然変異体であり、最も低い逆突然変異頻度（＜１０−７）を有する単離物を、その後の株の操作に使用した。
実施例１２：カンジダ属の脂肪族アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ）対立遺伝子のクローニングおよび分析
カンジダ属からの脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子の単離
プロモーター、脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＦＡＯ）およびＦＡＯ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＡＯ１ ＡＹ５３８７８０）のターミネーターを包含する配列領域を増幅するために作製されたプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、カンジダ株（ＡＴＣＣ２０３３６）脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子を単離した。以下の表７に、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６株ＡＴＣＣ２０３３６から脂肪族アルコールオキシダーゼヌクレオチド配列を増幅するのに使用されたプライマーを示す。
ＰＣＲ反応は、２５μＬの２×マスターミックス、１．５μＬのｏＡＡ０１４４およびｏＡＡ０１４５（１０ｕＭ）、３．０μＬのゲノムＤＮＡ、および１９μＬ滅菌Ｈ２０を含んでいた。使用された熱サイクルのパラメーターは、９８℃で２分間、９８℃で２０秒間、５２℃で２０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で５分間および４℃で保持であった。正しいサイズのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（pCR-Blunt II-TOPO）（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換した。ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。配列分析から４つのＦＡＯ対立遺伝子を同定し、ＦＡＯ−１３、ＦＡＯ−１７、ＦＡＯ−１８およびＦＡＯ−２０と名付けた。ＦＡＯ−１８と名付けられたクローンの配列は、ＧｅｎＢａｎｋからのＦＡＯ１の配列と実質的に同一な配列を有していた。結果得られた４つの対立遺伝子のプラスミドをそれぞれｐＡＡ０８３、ｐＡＡ０８４、ｐＡＡ０５９およびｐＡＡ０８５と名付けた。以下の表に、本明細書で説明されたようにして単離されたＦＡＯ遺伝子の配列同一性の比較を示す。
大腸菌におけるＦＡＯ対立遺伝子の発現
様々な炭素源に関してＦＡＯ酵素活性のレベルを決定するために、４つの単離されたＦＡＯ対立遺伝子をさらにクローニングし、大腸菌中で過剰発現させた。ＤＮＡテンプレートとして上述のプラスミドを使用した、ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０にはプライマーｏＡＡ０２６８とｏＡＡ０２６９、ならびにＦＡＯ−１７およびＦＡＯ−１８にはｏＡＡ０２６８とｏＡＡ０２８２を用いたＰＣＲによって、本明細書で説明されるような条件を使用してＦＡＯを増幅した。正しいサイズのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＥＴ１１ａベクターのＮｄｅＩとＢａｍＨＩ部位との間にライゲートし、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に形質転換した。対応するＦＡＯを含有するコロニーをＤＮＡの配列決定によって確認した。対照として、未改変のｐＥＴ１１ａベクターもＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。結果得られた株およびプラスミドを、それぞれｓＡＡ１５３（ｐＥＴ１１ａ）、ｓＡＡ１５４（ＦＡＯ−１３を含有するｐＡＡ０７９）、ｓＡＡ１５５（ＦＡＯ−１７を含有するｐＡＡ０８０）、ｓＡＡ１５６（ＦＡＯ−１８を含有するｐＡＡ０８１）およびｓＡＡ１５７（ＦＡＯ−２０を含有するｐＡＡ０８２）と名付けた。これらの株およびプラスミドを、大腸菌におけるＦＡＯ過剰発現のために使用した。各株の１つのコロニーを、１００□ｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地５ｍＬに移行し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩増殖させた。一晩培養したものを使用して、１００□ｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ２５ｍｌ中で０．２のＯＤ６００ｎｍになるまで新しい培養液に植え付けた。０．８のＯＤ６００ｎｍで、０．３ｍＭのＩＰＴＧで３時間細胞を誘導し、４℃、１，０５０×ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。細胞のペレットを−２０℃で保存した。
カンジダ株におけるＦＡＯの発現
ＦＡＯを過剰発現させた大腸菌の可溶性細胞抽出物の酵素アッセイから決定されたそれらの基質特異性プロファイルに基づき、カンジダ属での増幅のために、２つの対立遺伝子、ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０を選んだ。プライマーｏＡＡ０４２１およびｏＡＡ０４２２を用いたＰＣＲによって、ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０を含有するＤＮＡフラグメントを、それぞれＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＡＡ０７９およびｐＡＡ０８２を使用して増幅した。正しいサイズのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＦＡＯインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０を含有するプラスミドを、ＳａｐＩで消化し、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のＰＧＫプロモーターとターミネーターとを包含するベクターｐＡＡ１０５にライゲートした。結果得られたプラスミドを制限消化とＤＮＡ配列決定によって確認し、それぞれｐＡＡ１１５（ＦＡＯ−１３）およびｐＡＡ１１６（ＦＡＯ−２０）と名付けた。プラスミドｐＡＡ１１５およびｐＡＡ１１６をＳｐｅＩで直線状にし、コンピテントカンジダ種Ｕｒａ−株ｓＡＡ００２（ＳＵ−２、ＡＴＣＣ２０９１３）およびｓＡＡ１０３に形質転換した。ＦＡＯ−１３およびＦＡＯ−２０の統合を、プライマーｏＡＡ０４２９およびｏＡＡ０２８１を使用したコロニーＰＣＲによって確認した。結果得られた株を、ｓＡＡ２７８（株ｓＡＡ００２に統合されたｐＡＡ１１５）、ｓＡＡ２８０（ｓＡＡ００２に統合されたｐＡＡ１１６）、ｓＡＡ２８２（ｓＡＡ１０３に統合されたｐＡＡ１１５）、およびｓＡＡ２８４（ｓＡＡ１０３に統合されたｐＡＡ１１６）と名付け、これらをカンジダ種における脂肪族アルコールオキシダーゼの過剰発現に使用した。
各株の１つのコロニーを、本明細書で説明されるようにして５ｍｌのＹＰＤに植え付け、一晩増殖させた。一晩培養したものを使用して、ＯＤ６００ｎｍがおよそ０．５になるまで新しい２５ｍＬのＹＰＤ培養液に植え付けた。培地中のグルコースによって誘導され構成的に発現されたＰＧＫプロモーター／ターミネーターによってＦＡＯの過剰発現を調節した。ＦＡＯ過剰発現の陰性対照として、株ｓＡＡ００２およびｓＡＡ１０３（例えば、形質転換されていない開始時の株）を含めた。初期の対数期（ＯＤ６００ｎｍ＝約３〜約５の範囲）で、４℃、１０分間で１，０５０×ｇの遠心分離によって細胞を回収した。細胞のペレットを−２０℃で保存した。
大腸菌からの細胞抽出物の調製
２５ｍＬのＦＡＯを発現する大腸菌培養物からの細胞のペレットを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、２μＬベンゾナーゼ（Benzonase）２５Ｕ／μＬ、２０μＬの１０ｍｇ／ｍＬリゾチームを含有するリン酸−グリセロール緩衝液１０ｍＬ中に再懸濁した。次いで回転式振盪機において室温で５０分間インキュベートすることによって細胞を溶解させ、細胞懸濁液を、１５，０００×ｇを使用して、４℃で３０分間遠心分離した。上清を１．５ｍｌマイクロ遠沈管にアリコートにし、ＦＡＯ酵素活性アッセイのために−２０℃で保存した。
カンジダ属からの細胞抽出物の調製
凍結したＣ．トロピカリス細胞のペレットを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有するリン酸−グリセロール緩衝液１．２ｍｌ中に再懸濁した。再懸濁した細胞を、氷上で約５００μＬのジルコニアビーズを含有する１．５ｍＬスクリューキャップ付きチューブに移した。ビーズ式破砕機（バイオスペック（Biospec））で、氷上で２分のパルスおよび１分の休止インターバルを使用して細胞を溶解させた。このプロセスを３回繰り返した。次いで全細胞抽出物を新しい１．５ｍｌチューブに移し、１６，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、ＦＡＯ酵素活性アッセイに使用した。
タンパク質濃度の決定
ブラッドフォード試薬（カタログ番号２３２３８、サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific））を製造元の推奨に従って使用して、細胞抽出物のタンパク質濃度を決定した。
ＦＡＯ酵素活性アッセイ
Eirichら、2004の改変法を使用して、ＦＡＯ酵素活性アッセイを行った。このアッセイは、２種の酵素がカップリングされた反応（例えば、ＦＡＯとホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））を利用しており、分光光度法によるモニターが可能である。脂肪族アルコールオキシダーゼ酵素活性アッセイの標準基質として１−ドデカノールを使用した。ＦＡＯは、同時に分子酸素を過酸化水素に還元しながらドデカノールをドデカナールに酸化する。ＨＲＰは、２種の酵素がカップリングされた反応で（２，２’−アジノ−ビス３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸；ＡＢＴＳ）を還元し、ここで過酸化水素をＡＢＴＳに酸化することによって得られた電子は、４０５ｎｍでの分光分析によって測定できる。内因性カタラーゼによるＨ２Ｏ２の破壊を防ぎ、ミクロソームの断片化の必要性をなくすために、このアッセイをアミノトリアゾール（ＡＴ）を使用して改変した。ＦＡＯ酵素アッセイのための最終的な反応混合物（１．０ｍＬ）は、５００μＬの２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．６；５０μＬの脱イオン水中１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ溶液；１０μＬのアセトン中５ｍＭのドデカノール溶液；４０μＬの１ＭのＡＴおよび５μＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中の２ｍｇ／ｍＬホースラディッシュペルオキシダーゼ溶液からなっていた。抽出物を添加した後、４０５ｎｍ、室温で１０分間吸光度を測定することによって反応活性を測定した。活性が０．２〜１．０ΔＡ４０５ｎｍ／分の範囲に収まるように、反応混合物に添加された抽出物の量を変化させた。使用された抽出物の実際の量は、大腸菌が発現したＦＡＯ−１３の場合、約１．６９Ｕ／ｍｇであり、大腸菌が発現したＦＡＯ−１７の場合、０．０１８Ｕ／ｍｇであり、大腸菌が発現したＦＡＯ−１８（例えばＦＡＯ１）の場合、０．３５Ｕ／ｍｇであり、大腸菌が発現したＦＡＯ−２０の場合、０．４７Ｕ／ｍｇであり、カンジダ属（株ｓＡＡ２７８）が発現したＦＡＯ−１３の場合、０．０３６Ｕ／ｍｇであり、カンジダ属（株ｓＡＡ２８２）が発現したＦＡＯ−１３の場合、０．０１６Ｕ／ｍｇであり、カンジダ属（株ｓＡＡ２８０）が発現したＦＡＯ−２０の場合、０．０３２Ｕ／ｍｇであり、およびカンジダ属（株ｓＡＡ２８４）が発現したＦＡＯ−２０の場合、０．０２９Ｕ／ｍｇであった。ＦＡＯ活性は、総タンパク質１ｍｇあたりの活性単位（１ユニット＝１□モル（酸化された基質）／分）として報告した。ＡＢＴＳには、１８．４の４０５ｎｍにおける吸光係数を使用し、これは、０．５ｍＭの酸化された基質に等しい。以下の表に活性アッセイの結果を示す。
実施例１３：カンジダ属のシャトルベクターｐＡＡ０６１の構築
ベクターｐＡＡ０６１を、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からの選択マーカーＵＲＡ３、加えてカンジダ属のプロモーターおよびターミネーターを挿入させる改変を内包するｐＵＣ１９主鎖から構築した。カンジダ属ＡＴＣＣ２０３３６からのＵＲＡ３のプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターを含有する１，５０７ｂｐのＤＮＡフラグメントを、以下の表８に示されるプライマーｏＡＡ０１２４およびｏＡＡ０１２５を使用して増幅した。ＵＲＡ３のＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＭｌｕＩで消化し、ＮｄｅＩ／ＢｓｍＢＩで消化したｐＵＣ１９（ＭｌｕＩに適合するオーバーハングをＢｓｍＢＩによって作製した）の２，５０５ｂｐのフラグメントにライゲートした。ｌａｃプロモーターを短い２１ｂｐのリンカー配列で置き換えるために、結果得られたプラスミドをＳｐｈＩ／ＳａｐＩで消化し、オリゴｏＡＡ０１７３とｏＡＡ０１７４とをアニーリングすることによって作製されたリンカーを埋め込んだ。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ０６１と名付けた。
実施例１４：カンジダ属ＰＧＫプロモーターおよびターミネーターのクローニング
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）挿入のために介在する多重クローニング部位（ＭＣＳ）と共に、Ｃ．トロピカリスＡＴＣＣ２０３３６からのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびターミネーター領域を包含させるために、ベクターｐＡＡ１０５をベースのベクターｐＡＡ０６１から構築した。以下の表９に示されるプライマーｏＡＡ０３４７およびｏＡＡ０３４８を使用したＰＣＲによって、ＰＧＫプロモーター領域を増幅した。ＰＧＫプロモーターを含有する１，０２９ｂｐのＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＰｓｔＩ／ＸｍａＩで消化した。同様に以下の表９に示されるプライマーｏＡＡ０３５１およびｏＡＡ０３５２を使用したＰＣＲによって、ＰＧＫターミネーター領域を増幅した。ＰＧＫターミネーターを含有する３９６ｂｐのＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＸｍａＩ／ＥｃｏＲＩで消化した。スリーピースライゲーション反応で、ｐＡＡ１０５を生産するためのＰＧＫプロモーターおよびターミネーター領域と共にｐＡＡ０６１からの３，７２８ｂｐのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントを使用した。ＰＧＫプロモーターとターミネーターとの間の配列は、機能的に連結された構成的ＰＧＫプロモーターによって制御しようとするＯＲＦを取り込むための制限部位を含有する。
実施例１５：ＰＯＸ４遺伝子座のクローニング
プライマーｏＡＡ０１３８およびｏＡＡ０１４１（表１０）を生成させ、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６から調製したゲノムＤＮＡからＹＳＡＰＯＸ４遺伝子座に関するＮＣＢＩ受託番号Ｍ１２１６０の配列全体を増幅した。２，８４５ｂｐのＰＣＲ産物をベクター、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニングし、配列決定し、ｐＡＡ０５２と名付けた。
実施例１６：ＰＯＸ５遺伝子座のクローニング
プライマーｏＡＡ０１７９およびｏＡＡ０１８２（表１１）を生成させ、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６から調製したゲノムＤＮＡからＹＳＡＰＯＸ５遺伝子座に関するＮＣＢＩ受託番号Ｍ１２１６１の配列全体を増幅した。２，６２４ｂｐのＰＣＲ産物をベクター、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニングし、配列決定し、ｐＡＡ０４９と名付けた。
実施例１７：ＣＰＲおよびＣＹＰ５２遺伝子が増幅された株の構築
ＣＰＲおよびＣＹＰ５２の過剰発現がどのように二酸生産に影響するかを決定するために、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）および／またはシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ５２）遺伝子のコピー数が増加した株を構築した。
ＣＰＲ遺伝子のクローニングおよび統合
カンジダ属ＡＴＣＣ７５０からのＣＰＲプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターをコードする３，０１９ｂｐのＤＮＡフラグメントを、固有のＳａｐＩおよびＳｐｈＩ部位を組み込んだプライマーｏＡＡ０１７１およびｏＡＡ０１７２（表１２）を使用したＰＣＲによって増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントを指定された制限酵素で切断し、プラスミドｐＡＡ０６１にライゲートし（実施例１３で説明した）、プラスミドｐＡＡ０６７を生産した。プラスミドｐＡＡ０６７をＣｌａＩで直線状にし、カンジダ属Ｕｒａ−株ｓＡＡ１０３（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に形質転換した。形質転換は、プラスミドｐＡＡ０６７単独で、以下で説明されるＣＹＰ５２Ａ１５またはＣＹＰ５２Ａ１６遺伝子を含むプラスミドと組み合わせて行われた。
ＣＹＰ５２Ａ１５遺伝子のクローニングおよび統合
カンジダ属ＡＴＣＣ２０３３６からのＣＹＰ５２Ａ１５プロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターをコードする２，８４２ｂｐのＤＮＡフラグメントを、プライマーｏＡＡ０１７５およびｏＡＡ０１７８（表１２）を使用したＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ配列の検証のためにｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングしたＣＹＰ５２Ａ１５のＤＮＡフラグメントを、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩでの制限酵素消化によって単離し（２，７４２ｂｐ）、プラスミドｐＡＡ０６１にライゲートし（実施例１３で説明した）、プラスミドｐＡＡ０７７を生産した。プラスミドｐＡＡ０７７をＰｍｌＩで直線状にし、カンジダ属Ｕｒａ−株ｓＡＡ１０３（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に形質転換した。ｐＡＡ０７７を、ＣＰＲ遺伝子を含むプラスミドｐＡＡ０６７を用いて共に形質転換した。
ＣＹＰ５２Ａ１６遺伝子のクローニングおよび統合
カンジダ属ＡＴＣＣ２０３３６からのＣＹＰ５２Ａ１６プロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターをコードする２，７２８ｂｐのＤＮＡフラグメントを、プライマーｏＡＡ０１７７およびｏＡＡ０１７８（表１２）を使用したＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ配列の検証のためにｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングしたＣＹＰ５２Ａ１６ＤＮＡフラグメントを、固有のＳａｃＩ／ＸｂａＩ制限部位を組み込んだプライマーｏＡＡ０２６０およびｏＡＡ０２６１（表１２）により増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントを、ＳａｃＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、プラスミドｐＡＡ０６１にライゲートし、プラスミドｐＡＡ０７８を生産した。プラスミドｐＡＡ０７８をＣｌａＩで直線状にし、カンジダ属Ｕｒａ−株ｓＡＡ１０３（ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｐｏｘ４：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４：：ｕｒａ３、ｐｏｘ５：：ｕｒａ３／ｐｏｘ５：：ｕｒａ３）に形質転換した。ｐＡＡ０７８を、ＣＰＲ遺伝子を含むプラスミドｐＡＡ０６７を用いて共に形質転換した。
ゲノムＤＮＡの調製
ＰＣＲの検証のため、さらにサザンブロット分析のために、形質転換株からゲノムＤＮＡを調製した。単離されたコロニーを、３ｍＬのＹＰＤに植え付け、振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を遠心分離によってペレット化した。各ペレットに、２００μＬのブレイキング緩衝液（２％トリトンＸ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、および１ｍＭのＥＤＴＡ）を添加し、ペレットを再懸濁し、２００μＬの０．５ｍｍジルコニア／シリカビーズを含有する新しいチューブに移した。各チューブに２００μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加し、続いて１分間ボルテックスで混合した。各チューブに滅菌蒸留水（２００μＬ）を添加し、チューブを１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水層をエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを乾燥させた後、１００〜２００□ｌの１０ｍＭトリスに再懸濁した。サザンブロット分析用のゲノムＤＮＡの調製を、試験された各コロニーにつき２５ｍＬの培養物に対して同じ手法を使用して行った。
ＣＰＲおよびＣＹＰ５２遺伝子を増幅させた株の特徴付け
プライマーｏＡＡ０２５２およびｏＡＡ０２５６（ＣＰＲ）、ｏＡＡ０２３１およびｏＡＡ０２８１（ＣＹＰ５２Ａ１５）、ならびにｏＡＡ２４２およびｏＡＡ０２５７（ＣＹＰ５２Ａ１６）を使用したＰＣＲによって、統合された遺伝子および／または配列の検証を行った。表１３に、検証のために使用されたプライマーを示す。
ＣＰＲ、ＣＹＰ５２Ａ１５およびＣＹＰ５２Ａ１６遺伝子のコピー数を決定するために、サザンブロット分析を使用した。以下の表１４で特定した各遺伝子標的から生成したＰＣＲ産物に、ニューイングランドバイオラボ（New England BioLabs）からのＮＥブロットフォトトープ（NEBlot Phototope）キット（カタログ番号Ｎ７５５０Ｓ）を使用して、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを含むビオチン化したＤＮＡプローブを調製した。標準的な方法を使用してサザンハイブリダイゼーションを行った（例えば、Sambrook、J.およびRussell、D. W.（2001）Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第3版）、6.33〜6.64頁. コールドスプリングハーバープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press））。ニューイングランドバイオラボからのフォトトープ−スター（Phototope-Star）検出キット（カタログ番号Ｎ７０２０Ｓ）を使用して、ハイブリダイズしたプローブの検出を行った。結果得られたバンドの濃度測定によってコピー数を決定した。
実施例１８：モノオキシゲナーゼおよびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性の追加および／または増幅
シトクロムＰ４５０は、多くの場合、モノオキシゲナーゼ反応を触媒し、例えば、１つの酸素原子を有機基質（ＲＨ）に挿入しつつ、他の酸素原子を水に還元する：
ＲＨ＋Ｏ２＋２Ｈ＋＋２ｅ−→ＲＯＨ＋Ｈ２Ｏ
基質は、時には、均一な炭素鎖長を有する。モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素は、時には、特異的な炭素鎖長の基質、または同種の炭素鎖長を有する有機基質に関する炭素鎖長のサブグループを認識する。いくつかの実施態様において、新規のシトクロム活性（例えば、Ｂ．メガテリウムＢＭ３）の追加および／または所定のまたは全ての内因性もしくは異種モノオキシゲナーゼ活性（例えば、ＣＹＰ５２Ａ１２ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１３ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１４ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１５ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１６ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１７ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１８ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ１９ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ａ２０ポリヌクレオチド、ＣＹＰ５２Ｄ２ポリヌクレオチド、ＢＭ３ポリヌクレオチド）の増幅は、天然のおよび／または操作された代謝経路を介した炭素フラックスの全体的な増加に寄与する可能性がある。いくつかの実施態様において、新規のモノオキシゲナーゼの追加、または所定のまたは全ての内因性もしくは異種モノオキシゲナーゼ活性の増加は、特異的な炭素鎖長の基質または特異的な炭素鎖長の混合物を含む基質のサブグループのフラックスを増加させることができる。いくつかの実施態様において、操作された株で増幅させるためのモノオキシゲナーゼ活性の選択は、操作された株の増殖に利用される供給材料、選ばれた供給材料の代謝経路、および望ましい最終産物（例えば、ドデカン二酸）に関連する。
ドデカン二酸への変換に植物ベースの油を利用するために操作された株は、油の脂肪酸鎖長分布に適合する基質特異性を有する１種またはそれより多くのモノオキシゲナーゼ活性を有することで有利な可能性がある。例えば、ヤシ油における最も一般的な脂肪酸はラウリン酸（１２個の炭素長）であるため、ヤシ油を利用する株のために選ばれたモノオキシゲナーゼ活性は、基質としてＣ１２脂肪酸を優先的に使用する可能性がある。異なる脂肪酸鎖長分布を有する他の植物ベースの油を利用するために操作された株の場合、基質の優先性に合ったモノオキシゲナーゼ活性を増幅することがが望ましい可能性がある。いくつかの実施態様において、モノオキシゲナーゼ活性を変更する遺伝学的改変は、約１２〜約２４個の炭素の炭素鎖長を有する供給材料（例えば、混合鎖長アルカン、混合鎖長脂肪酸、石鹸原料など、およびそれらの組み合わせ）を基質として優先的に使用する１種またはそれより多くのモノオキシゲナーゼ活性の活性を増加させる。いくつかの実施態様において、遺伝学的改変は、約１０個の炭素から約１６個の炭素の範囲の炭素鎖長分布を有する脂肪酸を優先的に使用するモノオキシゲナーゼ活性の活性を増加させる。
上述したように、モノオキシゲナーゼ活性を実行する酵素は、モノオキシゲナーゼレダクターゼの活性によって還元され、それによって酵素は再生される。いくつかの実施態様において、操作された株での増幅のためのＣＰＲの選択は、どのＰ４５０が増幅されるかに依存する。いくつかの実施態様において、特定のＣＰＲは、１種またはそれより多くのモノオキシゲナーゼ活性と優先的に相互作用する可能性があるが、他のモノオキシゲナーゼとはそれほど相互作用しない可能性がある。カンジダ株ＡＴＣＣ７５０からのモノオキシゲナーゼレダクターゼ、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からの２種のモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性、およびバチルス・メガテリウムからのモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性は、本明細書で説明される追加および／または増幅したモノオキシゲナーゼを用いて活性に関して評価中である。以下の表に、モノオキシゲナーゼおよびモノオキシゲナーゼレダクターゼ活性を追加または増幅するのに使用されたヌクレオチド配列を示す。
実施例１９：選択されたベータ酸化活性の増幅
ＰＯＸ５ベータ酸化活性を増幅する方法をここで説明する。本明細書で説明されるように基質特異性が変更された非ＰＯＸ（例えば、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ）活性および／またはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性などの異なるベータ酸化活性を増幅するのに、実質的に類似した方法が利用できる。
ＰＯＸ５増幅株の構築
プラスミドｐＡＡ１６６（ＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４）
ＰＯＸ５のヌクレオチド配列を含有するＰＣＲ産物を、プライマーｏＡＡ５４０およびｏＡＡ５４１を使用して、Ｃ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ１６５と名付けた。プラスミドｐＡＡ１６５をＢｓｐＱＩで消化し、２ｋｂのフラグメントを単離した。ＰＯＸ４プロモーターおよびＰＯＸ４ターミネーターを含むプラスミドｐＡＡ０７３もＢｓｐＱＩで消化し、ゲルで精製した。単離されたフラグメントを一緒にライゲートして、プラスミドｐＡＡ１６６を生成した。プラスミドｐＡＡ１６６は、ＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４フラグメントを含有する。
プラスミドｐＡＡ２０４（チオラーゼ欠失コンストラクト）
短鎖チオラーゼ（例えば、アセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ）のヌクレオチド配列を含有するＰＣＲ産物を、プライマーｏＡＡ６４０およびｏＡＡ６４１を使用してＣ．トロピカリス２０３３６のゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ１８４と名付けた。ＵＲＡ３のＰＣＲ産物を、ｐＡＡ０６１から、プライマーｏＡＡ６６０およびｏＡＡ６６１を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、説明したようにして形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ１９２と名付けた。プラスミドｐＡＡ１８４を、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ゲルで精製した。プラスミドｐＡＡ１９２を、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩで消化し、１．５ｋｂのフラグメントをゲルで精製した。単離されたフラグメントを一緒にライゲートして、ｐＡＡ１９９を作製した。代替のＰＵＲＡ３のＰＣＲ産物を、プラスミドｐＡＡ０６１から、プライマーｏＡＡ６８４およびｏＡＡ６８５を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、説明したようにして形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ２０１と名付けた。プラスミドｐＡＡ１９９を、ＳａｌＩで消化し、ゲルで精製した。プラスミドｐＡＡ２０１を、ＳａｌＩで消化し、０．４３ｋｂのＰＵＲＡ３をゲルで精製した。単離されたフラグメントをライゲートして、ＰＵＲＡ３の同方向反復配列を含有するプラスミドｐＡＡ２０４を作製した。
プラスミドｐＡＡ２２１（チオラーゼ欠失コンストラクト中のＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４）
ＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４のヌクレオチド配列を含有するＰＣＲ産物を、プラスミドｐＡＡ１６６ＤＮＡから、プライマーｏＡＡ７２８およびｏＡＡ７２９を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯにライゲートし、説明したようにして形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、インサートの配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ２２０と名付けた。プラスミドｐＡＡ２０４を、ＢｇｌＩＩで消化し、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処置し、６．５ｋｂのフラグメントをゲルで精製した。プラスミドｐＡＡ２２０を、ＢｇｌＩＩで消化し、２．７ｋｂのＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４を含有するフラグメントをゲルで精製した。単離されたフラグメントをライゲートして、プラスミドｐＡＡ２２１を作製した。
株ｓＡＡ６１７（ｓＡＡ４５１中のＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４）
株ｓＡＡ４５１は、ｕｒａ−、β酸化が部分的にブロックされたカンジダ株（ｕｒａ３／ｕｒａ３ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ＰＯＸ５／ＰＯＸ５）である。プラスミドｐＡＡ２２１をＥｃｏＲＩで消化して、チオラーゼ欠失コンストラクト中にＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４を含有するＤＮＡフラグメントを放出させた。ＤＮＡをカラムで精製し、株ｓＡＡ４５１に形質転換して、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。２日後、コロニーをＹＰＤプレート上に画線して植え付けた、シングルコロニーを選択し、再度ＹＰＤプレート上に画線して植え付けた。第二のＹＰＤプレートからシングルコロニーを選択して、コロニーＰＣＲによって特徴付けた。株ｓＡＡ４５１へのＰＰＯＸ４ＰＯＸ５ＴＰＯＸ４の挿入、短鎖チオラーゼ遺伝子の破壊をＰＣＲによって確認し、このような株の１つを、ｓＡＡ６１７と名付けた。
株ｓＡＡ６２０
株ｓＡＡ６１７を、ＹＰＤ培地上で一晩増殖させ、ＳＣＤ＋ＵＲＡ＋５−ＦＯＡ上で平板培養して、ＵＲＡ３のループアウトに関して選択した。株ｓＡＡ６１７に関して説明したようにしてＹＰＤプレート上にコロニーを２回画線して植え付け、シングルコロニーをコロニーＰＣＲによって特徴付けた。ＰＵＲＡ３同方向反復配列によるＵＲＡ３のループアウトを、ＰＣＲによって確認した。このような株の１つを、ｓＡＡ６２０と名付けた。株ｓＡＡ６２０は、ＰＯＸ４プロモーターの制御下でＰＯＸ５の１つの追加のコピーを有する。
プラスミドｐＡＡ１５６
ＣＹＰ５２Ａ１９のヌクレオチド配列を含有するＰＣＲ産物を、カンジダ株２０３３６のゲノムＤＮＡから、プライマーｏＡＡ５２５およびｏＡＡ５２６を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯにライゲートし、説明したようにして形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ１４４と名付けた。プラスミドｐＡＡ１４４をＢｓｐＱＩで消化し、１．７ｋｂのフラグメントを単離した。ＰＯＸ４プロモーターおよびＰＯＸ４ターミネーターを包含するプラスミドｐＡＡ０７３もＢｓｐＱＩで消化し、ゲルで精製した。単離されたフラグメントを一緒にライゲートして、プラスミドｐＡＡ１５６を生成した。プラスミドｐＡＡ１５６は、ＰＰＯＸ４ＣＹＰ５２Ａ１９ＴＰＯＸ４フラグメントおよびＵＲＡ３を包含していた。
株ｓＡＡ４９６
プラスミドｐＡＡ１５６をＣｌａＩで消化し、カラムで精製した。この直線状ＤＮＡで株ｓＡＡ４５１を形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。ＣＹＰ５２Ａ１９の統合に関してコロニーをチェックした。プラスミド統合に関して陽性のコロニーをさらにｑＰＣＲによって分析し、統合されたＣＹＰ５２Ａ１９のコピー数を決定した。このような株の１つは、ｓＡＡ４９６と名付けられ、ＣＹＰ５２Ａ１９によってコードされたモノオキシゲナーゼ活性の約１３のコピーを含んでいた。
株ｓＡＡ６３２およびｓＡＡ６３５
直線状にしたｐＡＡ１５６のＤＮＡで株ｓＡＡ６２０を形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。ＣＹＰ５２Ａ１９の統合に関して数種のコロニーをチェックした。プラスミド統合に関して陽性のコロニーをさらにｑＰＣＲによって分析し、統合されたＣＹＰ５２Ａ１９のコピー数を決定した。このような株の１つは、ｓＡＡ６３２と名付けられ、ＣＹＰ５２Ａ１９によってコードされたモノオキシゲナーゼ活性の約２７のコピーを含んでいた。別の株は、ｓＡＡ６３５と名付けられ、ＣＹＰ５２Ａ１９によってコードされたモノオキシゲナーゼ活性の約１２のコピーを含んでいた。
実施例２０：カンジダ属のＡＣＨ遺伝子のクローニング
ＡＣＨのＰＣＲ産物を、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから、表１５に示したプライマーｏＡＡ１０９５およびｏＡＡ１０９６を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。
複数の形質転換株の配列分析から、ＡＣＨ遺伝子に関する対立遺伝子配列の存在が解明され、これらをＡＣＨＡおよびＡＣＨＢと名付けた。ＡＣＨＡ対立遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを生成し、ｐＡＡ３１０と名付けた（図５１を参照）。ＡＣＨＢ対立遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを生成し、ｐＡＡ３１１と名付けた。
実施例２１：カンジダ属のＦＡＴ１遺伝子のクローニング
ＦＡＴ１のＰＣＲ産物を、カンジダ属２０３３６のゲノムＤＮＡから、表１６に示したプライマーｏＡＡ１０２３およびｏＡＡ１０２４を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＦＡＴ１遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ２９６と名付けた。
実施例２２：カンジダ属のＡＲＥ１およびＡＲＥ２遺伝子のクローニング
ＡＲＥ１およびＡＲＥ２のＰＣＲ産物を、カンジダ属２０３３６のゲノムＤＮＡから、それぞれ以下の表１７に示したプライマーｏＡＡ２００６／ｏＡＡ２００７およびｏＡＡ１０１２／ｏＡＡ１０１８を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＡＲＥ１遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ３１８と名付けた。ＡＲＥ２遺伝子に関するＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ３０１と名付けた。
実施例２３：カンジダ属における発現のための最適化されたＴＥＳＡ遺伝子の構築
大腸菌のＴＥＳＡ遺伝子のための遺伝子配列を、カンジダ属における発現のためにコドンの置き換えにより最適化した。天然大腸菌のＴＥＳＡ遺伝子におけるコドンのそれぞれに関して類似の使用頻度を有するカンジダ属からのコドンを使用して新しいＴＥＳＡ遺伝子配列を構築した（ＣＴＧコドンは、カンジダ属によって利用される代替の酵母の核遺伝子コードであるためにその使用は避けた）。最適化されたＴＥＳＡ遺伝子を端にあるＢｓｐＱＩ制限部位を用いて合成し、ベクターｐＩＤＴＳＭＡＲＴ−Ｋａｎ中に入れた（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（Integrated DNA Technologies））。このベクターを、ｐＡＡ２８７と名付けた。プラスミドｐＡＡ２８７をＢｓｐＱＩで切断し、５５５ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲルで精製した。プラスミドｐＡＡ０７３もＢｓｐＱＩで切断し、直鎖状ＤＮＡフラグメントをゲルで精製した。２つのＤＮＡフラグメントを一緒にライゲートして、カンジダ属のＰＯＸ４プロモーターの制御下に最適化されたＴＥＳＡ遺伝子を入れた。結果得られたプラスミドを、ｐＡＡ２９４と名付けた。
実施例２４：カンジダ属のＤＧＡ１遺伝子のクローニング
ＤＧＡ１のＰＣＲ産物を、カンジダ属２０３３６のゲノムＤＮＡから、表１８に示したプライマーｏＡＡ９９６およびｏＡＡ９９７を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＤＧＡ１遺伝子のＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ２９９と名付けた。
実施例２５：カンジダ属のＬＲＯ１遺伝子のクローニング
ＬＲＯ１ＰＣＲ産物を、カンジダ属２０３３６のゲノムＤＮＡから、表１９に示したプライマーｏＡＡ９９８およびｏＡＡ９９９を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。ＬＲＯ１遺伝子のＤＮＡ配列を含有するベクターを、ｐＡＡ３００と名付けた。
実施例２６：カンジダ属のＡＣＳ１遺伝子のクローニングおよび欠失カセットの構築
ＡＣＳ１のＰＣＲ産物を、カンジダ属２０３３６のゲノムＤＮＡから、表２０に示したプライマーｏＡＡ９５１およびｏＡＡ９５２を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、ＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ２７５と名付けた。プラスミドｐＡＡ２８０をＢａｍＨＩで消化して、２．０ｋｂのＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３カセットを放出させた。プラスミドｐＡＡ２７５をＢｇｌＩＩで消化し、ゲルで精製した。２つの断片を一緒にライゲートして、プラスミドｐＡＡ２７６およびｐＡＡ２８２を生成した。プラスミドｐＡＡ２７６およびｐＡＡ２８２は、ＡＣＳ遺伝子に逆方向に挿入されたＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３カセットを有する。
実施例２７：株ｓＡＡ７２２（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ＡＣＳ１／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３）の構築
プラスミドｐＡＡ２７６を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ３２９（ｕｒａ３／ｕｒａ３ ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５）を、直線状ＤＮＡで形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。ＡＣＳ１破壊に関して数種のコロニーをチェックした。このような株の１つを、ｓＡＡ７２２と名付けた。
実施例２８：株ｓＡＡ７４１（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ＡＣＳ１／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３）の構築
株ｓＡＡ７２２をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、ＡＣＳ１部位中にＵＲＡ３プロモーター（ＰＵＲＡ３）のみを後に残すＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングした。分析した３０種のコロニーのうち、１種の株のみが正しい遺伝学的改変を示した。この株を、ｓＡＡ７４１と名付けた。
実施例２９：株ｓＡＡ７７６（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３）の構築
プラスミドｐＡＡ２８２を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ７４１（実施例２８を参照）を、直線状ＤＮＡで形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。二重のＡＣＳ１ノックアウトに関して数種のコロニーを挿入不活性化によってチェックした。このような株の１つを、ｓＡＡ７７６と名付けた。
実施例３０：株ｓＡＡ７７９（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３）の構築
株ｓＡＡ７７６（実施例２９を参照）をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、両方のＡＣＳ１コピーにおいてＵＲＡ３プロモーター（ＰＵＲＡ３）のみを後に残すＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングした。このような株の１つを、ｓＡＡ７７９と名付けた。
実施例３１：株ｓＡＡ８１１（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ ｕｒａ３：：３ｘＰＰＯＸ４Ｐ４５０Ａ１９）の構築
Ｐ４５０Ａ１９の統合カセットを含有するプラスミドｐＡＡ１５６をＣｌａＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ７７９（実施例３０を参照）を、直線状ＤＮＡで形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。Ｐ４５０Ａ１９の統合に関して数種のコロニーをチェックした。これらのコロニーから、ｑＰＣＲを行って、Ｐ４５０Ａ１９の統合のコピー数をチェックした。１種の株は、ｓＡＡ８１１と名付けられ、Ｐ４５０Ａ１９の３つのコピーを含んでいた。
実施例３２：株ｓＡＡ８１０（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ ｕｒａ３：：５ｘＰＰＯＸ４Ｐ４５０Ａ１９ ｕｒａ３：：８ｘＰＰＯＸ４ＴＥＳＡ）の構築
Ｐ４５０−Ａ１９の統合カセットを含有するプラスミドｐＡＡ１５６をＣｌａＩで消化し、カラムで精製した。ＴＥＳＡ統合カセットを含有するプラスミドｐＡＡ２９４もＣｌａＩで消化し、カラムで精製した。株ｓＡＡ７７９を、両方の直線状ＤＮＡを用いて共に形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。Ｐ４５０Ａ１９の統合とＴＥＳＡ統合の両方に関して数種のコロニーをチェックした。ＴＥＳＡおよびＰ４５０Ａ１９の両方に関して陽性であったコロニーをさらにｑＰＣＲによって分析した。ｑＰＣＲを行い、Ｐ４５０Ａ１９およびＴＥＳＡ統合事象のコピー数をチェックした。１種の株が、ｓＡＡ８１０と名付けられ、Ｐ４５０Ａ１９の５つのコピーとＴＥＳＡの８つのコピーを含んでいた。
実施例３３．技術および方法
増殖培地、試薬および条件
ＹＰＤ、ＳｃＤ−ｕｒａ培地およびプレート、ならびに５−ＦＯＡ含有プレートを、Methods in Yeast Genetics：a Cold Spring Harbor Laboratory Manual/David C. Amberg、Daniel J. Burke、Jeffrey Strathern、-2005年度版）で説明されているようにして作製した。
ＳＰ９２＋グリセロールを、最終容量１リットルまでの水に、アミノ酸非含有の６．７ｇのバクト酵母窒素原礎培地（BD、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）、３．０ｇのバクト酵母抽出物（BD、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）、３．０ｇの硫酸アンモニウム、１．０ｇのリン酸二水素カリウム、１．０ｇの二塩基性リン酸カリウム、および７５ｇのグリセロールを添加することによって作製した。次いで培地をろ過滅菌した。
水１リットルあたりに、硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇのバクト酵母窒素原礎培地、３ｇのバクト酵母抽出物、１ｇのリン酸二水素カリウムおよび１ｇの二塩基性リン酸カリウムを添加することによってＴＢ−低Ｎ培地を作製した。培地をろ過滅菌した。
一晩培養したものを、典型的には３０℃、約２５０ｒｐｍの振盪機で、標準的な培養チューブにより、２〜５ｍｌのＳｃＤ−ｕｒａ培地またはＹＰＤ培地のいずれかを用いて増殖させた。
分子学的方法
ＤＮＡフラグメントのゲルによる精製を、ジーンＪＥＴ（GeneJET）ゲル抽出キット（ファーメンタス社（Fermentas Inc）、米国メリーランド州グレンバーニー）またはザイモクリーン（Zymoclean）ゲルＤＮＡ回収キット（ザイモリサーチ（ZymoResearch）、米国カリフォルニア州アーバイン）のいずれかを使用して、製造元によって推奨された通りにして行った。
ＰＦＵウルトラＩＩ（PFU Ultra II）ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジーズ（Agilent Technologies）、米国カリフォルニア州サンタクララ）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）、ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックス（ファーメンタス社、米国メリーランド州グレンバーニー）またはクイックロード・ミダス・ミックス（Quick Load Midas Mix）（モンセラート（Monserate）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のいずれかを使用して、ＰＣＲを行った。各酵素を製造元の説明書に従って使用した。
制限酵素消化を各製造元によって推奨された通りに行った（ニューイングランドバイオラボ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ、またはファーメンタス社、米国メリーランド州グレンバーニー）。製造元の説明書に従って、ラピッドライゲーションキット（Rapid Ligation Kit）（ファーメンタス社、米国メリーランド州グレンバーニー）を使用するか、またはＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用するかのいずれかによって、ＤＮＡのライゲーションを行った。
実施例１０で説明されているようにして酵母の形質転換を行った。
ゲノムＤＮＡの調製
カンジダ属の酵母培養株ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから、ＵＲＡ３遺伝子を得た。
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのゲノムＤＮＡを以下のようにして調製した：約１．５ｍｌの細胞の一晩培養したもをペレット化し、これを、２％トリトンＸ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ＭＭのトリス（ｐＨ８．０）、および１ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液約２００μｌに再懸濁した。約２００μｌの酸洗浄したガラスビーズを、約８．０のｐＨで約２００μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用いて添加した。サンプルを約２分間ボルテックスで混合し、その後、約２００μｌの水を添加した。次いでサンプルを１３０００ｒｐｍで約１０分間遠心分離した。水層を新しいマイクロ遠沈管に移し、等しい体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を添加した。このサンプルを１０秒間ボルテックスで混合し、次いで１３０００ｒｐｍで約２分間遠心分離した。水層を新しいマイクロ遠心管に移し、１ｍｌのエタノールを添加した。次いでチューブを−８０℃で約１５分間置き、次いで１３０００ｒｐｍで１５分間回転させてＤＮＡをペレット化し、ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、風乾した。次いでＤＮＡを約５００μｌの水に再懸濁した。
クルイベロマイセス・ラクティス（Klyveromyces lactis）（ＡＴＣＣ８５８５）のゲノムＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（米国バージニア州マナサス）から購入した。
遺伝子のコピー数を計算するために、qＰＣＲ方法を、Jinら（Appl. Environ. Microbiol. 2003年1月、69巻、1号、495〜503）によって説明されているようにして使用した。ｑＰＣＲを、製造元の説明書に従って、ブリリアントＩＩＩウルトラ−ファストＳＹＢＲ（Brilliant III Ultra-Fast SYBR）（登録商標）グリーンＱＰＣＲマスターミックス（アジレント・テクノロジーズ、米国コロラド州イングルウッド）またはＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲ ＮｏＲＯＸキット（キアゲン（Qiagen））のいずれかを使用して行った。標準として、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのゲノムＤＮＡまたはＡＴＣＣ２０３３６からのアクチン遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡ、および対象の遺伝子を使用した。
これらの実施例全体で使用されたプライマーおよびプローブは、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（米国アイオワ州コーラルビル）により、標準的なＤＮＡ合成技術によって作製された。
実施例３４：クローニングプラスミドＡＡ０７３の構築
プラスミドｐＡＡ０７３を、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６（この株はまた、本明細書では株ｓＡＡ００１とも称される）からのＰＯＸ４プロモーターおよびターミネーターが含有されるように設計した。このプラスミドを、公共的に利用可能なアンピシリン耐性マーカーを含有するプラスミドｐＵＣ１９から誘導した。あらゆる対象の遺伝子が、ＰＯＸ４プロモーターとタンデム式に一方向にクローニングされるようにＰＯＸ４プロモーターとターミネーターとの間に配置される２つのＳａｐＩ制限酵素部位が含まれるように、ｐＡＡ０７３を設計した。カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６の、オープンリーディングフレームおよび内因性調節領域を含むＵＲＡ３遺伝子も、形質転換株のための選択マーカーとしてｐＡＡ０７３に入れた。プラスミドｐＡＡ０７３は、ＳｐｅＩ、ＣｌａＩまたはＢｓｔＺ１７１などの固有の制限酵素でプラスミドを消化することによってあらゆる対象の遺伝子の複数のコピーの直接の統合を可能にする。これらの多重クローニング部位は、ＵＲＡ３栄養要求性マーカー領域に含有されており、対象の遺伝子の切断を回避するのに使用できる（すなわち、対象の遺伝子のＤＮＡ配列を、特定の制限酵素切断部位で検索して、これらの酵素を回避できる）。加えて、このプラスミドは、ＵＲＡ３遺伝子の３’領域と５’領域との間に挿入された対象の遺伝子およびＰＯＸ４調節領域を含有する抗生物質非含有のＤＮＡカセットを作製するためのテンプレートとして役立つ可能性がある。このカセットは、テンプレートとして該プラスミドを使用してＰＣＲ増幅でき、単離されたＰＣＲ産物は、あらゆる微生物株に挿入が可能である。
図１８にｐＡＡ０７３の略図を示し、ｐＡＡ０７３の配列は、配列番号１６０として記載される。
実施例３５．ＡＴＣＣ２０３３６に関するエノイル−ＣｏＡイソメラーゼ（ＥＣＩ）遺伝子のクローニング
Ｓ．セレビシエのＳ２８８ｃからのＥｃｉ１（すなわちＥｃｉ）のアミノ酸配列（配列番号３７０５）を使用して、カンジダ種ＡＴＣＣ ＭＹＡ−３４０４およびＡＴＣＣ２０３３６からの相同体を同定した。ＢＬＡＳＴ検索からカンジダの各株における２種のＥｃｉ１ｐ相同体が解明され、これらをＥｃｉ１ｐおよびＥｃｉ２ｐと名付けた（表２１）。相同体のアミノ酸同一性パーセントを以下に示す。
配列番号３７０８のＮ末端の２４１残基をコードするＥＣＩ１遺伝子を、ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ２０３３６）から、固有のＳａｐＩ制限部位も取り込んだオリゴヌクレオチドｏＡＡ２８３５（配列番号３７１２）およびｏＡＡ２８３６（配列番号３７１３）を使用して増幅した。７７０ｂｐのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（pCR-Blunt II-TOPO）にライゲートした（ライフ・テクノロジーズ）、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌の細胞（ライフ・テクノロジーズ）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ５７４と名付けた（配列番号３７１０）。
Ｅｃｉ２ｐをコードする全長ＥＣＩ２遺伝子（配列番号３７０９）を、ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ２０３３６）から、固有のＳａｐＩ制限部位も取り込んだオリゴヌクレオチドｏＡＡ２８３７（配列番号３７１４）およびｏＡＡ２８３８（配列番号３７１５）を使用して増幅した。８５１ｂｐのＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（ライフ・テクノロジーズ）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（ライフ・テクノロジーズ）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ５７５と名付けた（配列番号３７１１）。
実施例３６−株ｓＡＡ１７６４（ｕｒａ３／ｕｒａ３ ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ ｆａｔ１−Δ１：：ＰＵＲＡ３／ｆａｔ１−Δ２：：ＰＵＲＡ３ ｅｃｉ１−Δ１：：ＵＲＡ３／ＥＣＩ１）の生成
オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）によって構築された直鎖状ＤＮＡカセットで、細胞（株ｓＡＡ８８６（ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ ｆａｔ１−Δ１：：ＰＵＲＡ３／ｆａｔ１−Δ２：：ＰＵＲＡ３ ｕｒａ３／ｕｒａ３））を形質転換することによって、第一のＥＣＩ１の対立遺伝子の欠失が達成された。株ｓＡＡ８８６中の第一のＥＣＩ１の対立遺伝子のための欠失カセットを、３つのＤＮＡフラグメントから生成した。第一のＤＮＡフラグメント（ＥＣＩ１の５’相同性）を、ＡＴＣＣ２０３３６のｇＤＮＡから、プライマーｏＡＡ３０８５（配列番号３７１６）およびｏＡＡ３０８６（配列番号３７１７）を使用して増幅した。第二のＤＮＡフラグメント（ＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３）を、プラスミドｐＡＡ２９８（図２９、および配列番号３７８４）から、プライマーｏＡＡ３０８７（配列番号３７１８）およびｏＡＡ３０８８（配列番号３７１９）を使用して増幅した。第三のＤＮＡフラグメント（ＥＣＩ１の３’相同性）を、ＡＴＣＣ２０３３６のｇＤＮＡから、プライマーｏＡＡ３０８９（配列番号３７２０）およびｏＡＡ３０９０（配列番号３７２１）を使用して増幅した。全ての３つのＤＮＡフラグメントを同じ反応液中に組み合わせ、プライマーｏＡＡ３０８５（配列番号３７１６）およびｏＡＡ３０９０（配列番号３７２１）を使用したＯＥ−ＰＣＲによって全長欠失カセットを生成した（図１９）。
株ｓＡＡ８８６を、全長欠失カセットで形質転換し、ＳＣＤ−Ｕｒａプレート上で平板培養した。数種のコロニーを、第一のＥＣＩ１の対立遺伝子における欠失カセットの統合に関してＰＣＲによってスクリーニングした。このような株の１つを、ｓＡＡ１７６４と名付けた。
実施例３７．株ｓＡＡ１８６０（ｕｒａ３／ｕｒａ３ ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ ｆａｔ１−Δ１：：ＰＵＲＡ３／ｆａｔ１−Δ２：：ＰＵＲＡ３ ｅｃｉ１−Δ１：：ＰＵＲＡ３／ＥＣＩ１）の生成
株ｓＡＡ１７６４をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、第一のＥＣＩ１の対立遺伝子においてＵＲＡ３プロモーター（ＰＵＲＡ３）のみを後に残すＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングした。このような株の１つを、ｓＡＡ１８６０と名付けた。
実施例３８．二重のＥＣＩ１のノックアウト株（ｕｒａ３／ｕｒａ３ ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ ｆａｔ１−Δ１：：ＰＵＲＡ３／ｆａｔ１−Δ２：：ＰＵＲＡ３ ｅｃｉ１−Δ１：：ＰＵＲＡ３／ｅｃｉ１−Δ２：：ＵＲＡ３）の構築
ＥＣＩ１の第二の対立遺伝子の欠失は、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）によって構築された直鎖状ＤＮＡカセットで細胞を形質転換することによって達成された。ｓＡＡ１８６０中の第二のＥＣＩ１の対立遺伝子のための欠失カセット（ｕｒａ３／ｕｒａ３ ｐｏｘ４ａ：：ｕｒａ３／ｐｏｘ４ｂ：：ｕｒａ３ ＰＯＸ５／ＰＯＸ５ ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３／ａｃｓ１：：ＰＵＲＡ３ ｆａｔ１−Δ１：：ＰＵＲＡ３／ｆａｔ１−Δ２：：ＰＵＲＡ３ ｅｃｉ１−Δ１：：ＰＵＲＡ３／ＥＣＩ１）を、３つのＤＮＡフラグメントから生成した。第一のＤＮＡフラグメント（ＥＣＩ１の５’相同性）を、ＡＴＣＣ２０３３６のｇＤＮＡから、プライマーｏＡＡ３２１２（配列番号３７２２）およびｏＡＡ３２１３（配列番号３７２３）を使用して増幅した。第二のＤＮＡフラグメント（ＰＵＲＡ３ＵＲＡ３ＴＵＲＡ３ＰＵＲＡ３）を、プラスミドｐＡＡ２９８（図２９、および配列番号３７８４）から、プライマーｏＡＡ３２１４（配列番号３７２４）およびｏＡＡ３２１５（配列番号３７２５）を使用して増幅した。第三のＤＮＡフラグメント（ＥＣＩ１の３’相同性）を、ＡＴＣＣ２０３３６のｇＤＮＡから、プライマーｏＡＡ３２１６（配列番号３７２６）およびｏＡＡ３２１７（配列番号３７２７）を使用して増幅した。全ての３つのＤＮＡフラグメントを同じ反応液中に組み合わせ、プライマーｏＡＡ３２１２（配列番号３７２２）およびｏＡＡ３２１７（配列番号３７２７）を使用したＯＥ−ＰＣＲによって全長欠失カセットを生成した（図２０）。
二重のＥＣＩ１のノックアウト株を生成するために、ｓＡＡ１８６０を全長欠失カセットで形質転換し、ＳＣＤ−Ｕｒａプレート上で平板培養した。数種のコロニーを、第二のＥＣＩ１の対立遺伝子における欠失カセットの統合に関してＰＣＲによってスクリーニングした。
実施例３９−アシルＣｏＡオキシダーゼタンパク質のクローニング
様々な生物からのアシル−ＣｏＡオキシダーゼを、カナマイシン耐性カセットを含有する大腸菌の発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（ＥＭＤ４バイオサイエンス（EMD4Biosciences）、ダルムシュタット、ドイツ）にクローニングした。アシル−ＣｏＡオキシダーゼの源、遺伝子の名称、アシルＣｏＡオキシダーゼのコード配列をｐＥＴ２６ｂにクローニングするのに使用されたプライマーおよび制限酵素、およびコード配列が本明細書で説明される。アシルＣｏＡオキシダーゼのコード配列を、その生物に対応するｃＤＮＡライブラリー、公開されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列から設計された適切なプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。テンプレート源が利用できない事象では、コード配列をｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として合成し、標準的なオーバーラップ伸長ＰＣＲによって一緒につなぎ合わせた。次いでＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩ−ブラントＴＯＰＯベクター（ライフサイエンス（Life Sciences））にクローニングし、産物を配列決定し、それらが望ましくない突然変異を含有しないことを検証した。適切な制限酵素を使用してＴＯＰＯベクターからコード配列を放出させ、同じ制限酵素で消化したｐＥＴ２６ｂにライゲートした。次いで結果得られた発現プラスミドをロゼッタＩＩ（Rosetta II）ＢＬ２１細胞（ノバジェン（Novagen））に形質転換した。
実施例４０−大腸菌におけるアシル−ＣｏＡオキシダーゼの発現
酵素を発現させるために、ロゼッタ細胞の各形質転換からのコロニーを使用して、抗生物質のカナマイシン（ｐＥＴ２６ｂに関して選択するため）およびクロラムフェニコール（大腸菌で発現される真核性タンパク質の翻訳向上を媒介するロゼッタＩＩ細胞に見出される第二のプラスミドに関して選択するため）を含有するＬＢの一晩培養したもの５ｍｌの３７℃での増殖を開始させた。翌朝、一晩培養したものを使用して、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含有する３０ｍｌのＬＢに、ＯＤ６００の読み取り値が０．１になるまで植え付けた。３０ｍＬの培養物を３７℃で２時間増殖させ、次いで氷上で１０分間置いた。発現を誘導するために、培養物に最終濃度０．１ｍＭまでイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。いくつかのケースにおいて、ノバジェンのオーバーナイト・エクスプレス・オートインダクション・システム１（Overnight Express Autoinduction System 1）（カタログ番号７１３００-３）を使用して誘導を行った。次いで細胞を１５℃で一晩振盪して、アシルＣｏＡオキシダーゼを発現させた。
実施例４１−アシル−ＣｏＡオキシダーゼ活性アッセイ
アシルＣｏＡオキシダーゼの活性を試験するために、一晩の誘導からの細胞を、５０ｍｌコニカルチューブ中で１０４６×ｇ、４℃でペレット化した。細胞のペレットを１ｍｌの５０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．６、５０μＭのＦＡＤ緩衝液中に再懸濁し、次いで２ｍｌ遠心管に移した。ミソニックス・ソニケーター３０００（Misonix Sonicator 3000）（Qソニカ（QSonica）、コネチカット州ニュータウン）を使用して、細胞を溶解させ、これを、２のパワー設定で２０秒ごとに２回のパルスで超音波破砕した。各パルス間に溶解産物を氷上に３０秒間置いた。上清を得るために、死細胞片を、４℃のマイクロ遠心分離機において１６，１００×ｇで１０分間ペレット化した。上清を１．５ｍｌ遠心管に移し、細胞溶解産物にブラッドフォードアッセイ（サーモ・サイエンティフィック（Thermoscientific））を製造元の明細書に従って行い、アシル−ＣｏＡオキシダーゼアッセイのための調製物中のタンパク質濃度を決定した。このアッセイには、ベックマン・コールター（Beckman Coulter）ＤＴＸ−８００マルチモード・デテクター（Multimode Detector）分光光度計を使用した。５００ｎｍで５分間、３０℃で読み取りが行われるように分光光度計を設定した。各反応液の体積は２００μｌであり、５０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．６、２００μｇ／ｍｌ（ＢＳＡ）、０．０５％トリトンＸ−１００、２５０μＭの脂肪族アシル−ＣｏＡ基質、５０μＭのＦＡＤ、１０Ｕのホースラディッシュペルオキシダーゼ、２５ｍＭのｐ−ヒドロキシ安息香酸および１ｍＭの４−アミノアンチピリン中の１０μｇの細胞溶解産物を含んでいた。脂肪族アシル−ＣｏＡ基質は、ヘキサノイルＣｏＡ（６個の炭素鎖長）からオレオイルＣｏＡ（１８個の炭素鎖長）に至る範囲をカバーしていた。
表２２において、網掛けされていないブロックは、サンプルが試験されなかったことを示す。濃い網掛けは、活性が検出されなかったことを示す。薄い網掛けは、０．１μｍｏｌ／分／μｇ（μｍｏｌ基質／分／μｇ総タンパク質）未満かまたはそれに等しい最小活性（すなわち不十分な活性）が検出されたことを示す。中程度の網掛けは、優れた活性が＞０．１μｍｏｌ／分／μｇで検出されたことを示す。
表２２に記載の結果から、いくつかの酵素は、大腸菌で発現させた場合、機能的ではないことが示された。さらに、大腸菌で発現された場合でも機能的である残りの酵素は広範な基質特異性を示すか、またはそれらの基質特異性においてカンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのＰｏｘ５と類似していた（すなわちＣ６基質に対してそれほど活性ではなく、Ｃ１２基質に対してピーク活性を示し、Ｃ８からＣ１８：１まで活性であった）。
実施例４２−カンジダのＰｏｘ４、Ｐｏｘ５およびドブネズミＶＬＣＡＤの遺伝学的改変
目的は、１）それらそれぞれの基質特異性を変更するために、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のＰｏｘ４およびＰｏｘ５アシルＣｏＡオキシダーゼ（それぞれＰｏｘ４およびＰｏｘ５）、ならびに２）それをアシルＣｏＡオキシダーゼに変換するために、ドブネズミの超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＶＬＣＡＤ）における突然変異を設計することであった。これらの突然変異酵素は、カンジダに導入されると、セバシン酸、ドデカン二酸またはより長鎖の二酸への脂肪酸基質の選択的な変換をベータ酸化によって仲介する可能性がある。
Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５の部位特異的変異誘発−方法論
数種のアプローチを使用して、これらの酵素の基質特異性を決定するカンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のＰｏｘ４およびＰｏｘ５の領域および／または残基を同定した。ラット肝臓において、オルタナティブスプライシングされた第三のエキソンを有する単一の遺伝子は、２種のスプライスフォーム、ＡｃｏＩ（アシルＣｏＡオキシダーゼ−Ｉ、ドブネズミ、ＲｎＡｃｏＩ）およびＡｃｏＩＩ（アシルＣｏＡオキシダーゼ−ＩＩ、ドブネズミ、ＲｎＡｃｏＩＩ）を生産し、これらは、アミノ酸の長さに関して同一であり、差次的にプライシングされたエキソンによってコードされた領域におけるアミノ酸配列に関してのみ異なる（Miyazawa, S.、Hayashi, H.、Hijikata, M.、Ishii, N.、Furuta, S.、Kagamiyama, H.、Osumi, T.、Hashimoto, T.（1987）Complete nucleotide sequence of cDNA and predicted amino acid sequence of rat acyl-CoA oxidase. J. Biol. Chem. 262（17）：8138〜43.； Osumi, T.、Ishii, N.、Miyazawa, S.、Hashimoto, T.（1987）Isolation and structural characterization of the rat acyl-CoA oxidase gene. J. Biol. Chem. 262 （17）：8138〜43; Setoyama, C.、Tamaoki, H.、Nishina, Y.、Shiga, K.、Miura, R.（1995）Functional expression of two forms of rat acyl-CoA oxidase and their substrate specificities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 217（2）：482〜7)。ＡｃｏＩおよびＡｃｏＩＩの一次アミノ酸配列の比較から、オルタナティブスプライシングされたエキソンの結果として残基９０〜１３３における差が解明された（下線で示した残基、図２３）。スプライシング事象により、異なる基質活性プロファイルを示す２種の酵素、ＡｃｏＩおよびＡｃｏＩＩが生じた。ＲｎＡｃｏＩは、より炭素が少ない基質（例えば、８または１０個の炭素を有する脂肪酸）を優先的に利用する。ＲｎＡｃｏＩＩは、より長い炭素鎖（例えば、１４個の炭素）を有する基質を優先的に利用する。ＲｎＡｃｏＩＩの結晶構造は解析されており（ＰＤＢ：１ＩＳ２（基質なし）；ＰＤＢ：２ＤＤＨ（ドデカノエート基質あり））、Ｎ末端のアルファヘリカルドメインとそれに続くベータシートドメインとの間の境界でオルタナティブスプライシングされたエキソンの末端によってコードされた領域はいずれも、アシルＣｏＡオキシダーゼ（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤ）スーパーファミリー、ＮＣＢＩ保存ドメイン受入番号ｃｌ０９９３）の特徴的な構造的特徴であり、基質特異性を決定する可能性がある領域として同定されている。
このアシルＣｏＡオキシダーゼの領域が基質特異性決定において役割を果たすことを検証するために、ホットスポットウィザード（HotSpot Wizard）アルゴリズムを利用した（Pavelka, A.、Chovancova, E.、Damborsky, J. HotSpot Wizard：a Web Server for Identification of Hot Spots in Protein Engineering, Nucleic Acids Research 37：W376〜W383、2009. http：//loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/）。ホットスポットウィザードは、基質特異性または活性を操作するためにタンパク質の領域を同定するプログラムである。このプログラムは、変異誘発の「ホットスポット」である領域および／または残基を同定するために、ＰＤＢ、ユニプロット（UniProt）およびＮＣＢＩなどの多数のデータベースからの構造的、機能的および配列相同性データを利用する。検索は、対象の酵素の結晶構造に対応するＰＤＢファイルに頼っている。Ｐｏｘ４またはＰｏｘ５のケースでは、このような構造は利用できない。それゆえに、両方のタンパク質の構造を、テンプレートとしてドブネズミのＡｃｏＩＩの結晶構造（ＰＤＢ：１ＩＳ２）を用いたモデリングによって決定した。スイス−モデル（SWISS-MODEL）プログラムを使用して、これらのモデルを生成した（Arnold K.、Bordoli L.、Kopp J.、およびSchwede T.（2006）. SWISS-MODEL Workspace：A web-based environment for protein structure homology modeling. Bioinformatics、22,195〜201；Kiefer F、Arnold K、Kunzli M、Bordoli L、Schwede T（2009）. The SWISS-MODEL Repository and associated resources．Nucleic Acids Research. 37、D387〜D392. Peitsch, M. C.（1995）Protein modeling by E-mail Bio/Technology 13：658〜660；http：//swissmodel.expasy.org/）。結果得られたモデルは、ＰＤＢファイルであり、これを「クエリー構造」としてホットスポットウィザードに入力した。図２４Ａ、２４Ｂおよび２５に、ホットスポットウィザード分析の結果を要約する）。灰色で強調表示された残基は、突然変異誘発性の「ホットスポット」として提案される。濃灰色の網掛けは、薄灰色で網掛けされた残基より変化しやすい残基を示す。太字で示された残基は、基質結合ポケットの内部かまたはその近傍で見出されている（以下で考察）。
全ての３種の酵素を並べて、相同性の領域を示した（図２６）。図２６において、薄灰色の網掛けは、全ての３種の酵素間の同一性を示す。より濃灰色の網掛けは、３種の酵素間の部分的な同一性または相同性を示す（例えば、濃灰色の網掛けは、アライメント中の３つのタンパク質のうち２つに関する同一性を示す場合がある）。いくつかのケースにおいて、濃灰色の網掛けは、配列類似性を示す（すなわち、その残基は酸性、塩基性、極性または非極性であるため、それらは類似している）。下線で示した領域（図２３および図２６）は、ＡｃｏＩＩのオルタナティブスプライシングされたエキソンを示す。
分子モデリングのアライメントを使用して、基質結合ポケットの内部かまたはその近傍で見出されているＰｏｘ４およびＰｏｘ５中の残基を同定した（太字で示される残基、図２４Ａおよび２４Ｂ）。その結晶構造から決定されたように、その基質であるドデカノエートと複合体化したＡｃｏＩＩの分子構造（ＰＤＢ：２ＤＤＨ）を、Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５の予測された分子モデルと並べた。Ｎ末端のループおよびアルファへリックスＤの第一の部分に位置する残基（表２３）は、基質の入口／出口チャネルの表面および内側にあると考えられる。Ｐｏｘ４において、これらの残基は、配列ＩＤＴＦＮＫ（カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのＰｏｘ４のアミノ酸９５〜１００）およびＰＤＱＱＡＱ（カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのＰｏｘ５のアミノ酸８０〜８５）に相当する。ホットスポットウィザードによれば、この全体の配列はカテゴリー９であり、このカテゴリーは、高度に可変性であることを意味する。
アルファヘリックスＤとＥ’との間のループに位置する残基は、基質結合ポケットの一部を形成する。これらの残基のうち炭素１２個の基質のための接触残基として同定されたものはないが、より長い基質のための接触残基でる可能性がある。この４つのアミノ酸のストレッチは、ＡＣＯ−ＩおよびＡＣＯ−ＩＩの分岐したエキソンスプライス部位内に配置される。Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５において、これらのアミノ酸のうち３つは高度に保存されている（表２４）。第四のアミノ酸は異なっている（Ｐｏｘ４では１１３Ｇ、Ｐｏｘ５ではＦ９８）。この領域における４つのアミノ酸のなかでも、分岐した残基は基質に最も近く、この残基のアミノ酸の特徴は、Ｐｏｘ４とＰｏｘ５とで大いに異なっている。この理由のために、この残基は特に興味深い。加えて、ホットスポットによれば、この残基は、高度に可変性である。
ＲｎＡＣＯＩＩの２ＤＤＨ結晶構造において、残基Ｄ１０１は、炭素６〜９個の基質のための接触残基である。この残基は、基質結合ポケットの一部であるアルファへリックスＥ’の始めに配置される。これは接触残基であり、ＡＣＯ−ＩとＡＣＯ−ＩＩとで異なる配列の小さい領域に位置することから、Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５における対応するアミノ酸（表２５）が興味深い。この残基は、炭素６〜９個の基質と接触するため興味深く、ＡＣＯ−ＩＩは、鎖長６〜１２の基質に対して、ＡＣＯ−Ｉと比較してより低い活性を有する。Ｐｏｘ４またはＰｏｘ５のいずれかがこの位置でアスパラギン酸に改変される場合、アジピン酸に対する活性の減少が起こり、より大きい二酸の収量の増加が起こることが予測される。この残基は、ホットスポットにより６のスコアを有する。
ＲｎＡＣＯＩＩの２ＤＤＨ結晶構造において、残基Ｆ２８４は、炭素１０〜１２個の基質のための接触残基である。この残基は、ＲｎＡｃｏＩとＲｎＡｃｏＩＩとの間で保存されている。
Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５における対応するアミノ酸（表２６）は、Ｐｏｘ４とＰｏｘ５とで異なる数少ない基質の接触残基のうちの１つである。ＡＣＯＩ、ＡＣＯＩＩ、およびＰｏｘ４酵素は全て、この位置に大きい疎水性残基を有するが、それに対してＰｏｘ５酵素は、小さい極性残基を有する。この残基のホットスポットスコアは、９である。
Ｃ末端からアルファへリックスＬへのループは、Ｐｏｘ５の場合、Ｐｏｘ４またはＡＣＯ−Ｉ／ＡＣＯ−ＩＩに存在するものよりもかなり小さい（表２７）。このループは、構造的なフレキシビリティーをもたらすと考えられ、基質ポケットの構造とどれだけ多くの基質−結合ポケットが「呼吸」しているかに影響を有する可能性がある。ホットスポット分析では、この領域における残基は様々であるが、Ｐｏｘ５においてこの領域のちょうど下流の残基は、全て高度に可変性である（次で示す）。
アルファへリックスＬとＭとの間のループは、Ｐｏｘ４とＰｏｘ５とで変化しているとは考えられないが（表２８）、ホットスポット分析は、この残基のストレッチに高い変異性を示す９のスコアを割り当てている。このループは、上述した前のセクションを含めて、変異誘発の標的であることが予測される。
Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５の両方に関して、分子モデリングのアライメントと組み合わされたホットスポットウィザード分析から、同じ接近した領域内の残基は、変異誘発の優れた標的であることが決定された。複数の配列アライメントから、全ての３種のアシルＣｏＡオキシダーゼにおいて、ＡｃｏＩＩのオルタナティブスプライシングされたエキソンはホットスポット残基とオーバーラップすることが示される（図２６）。
表２９に、それらの２次構造およびアミノ酸残基の位置によって示されたＲｎＡＣｏＩＩにおけるいくつかの追加の領域を示し、さらにヤロウイア・リポリチカのＰＯＸ５、ＰＯＸ４、ならびにＡｃｏ２、Ａｃｏ３およびＡｃｏ５における対応する領域も示す。
基質特異性を変更するためのカンジダのＰｏｘ４およびＰｏｘ５の部位特異的変異誘発−方法
ガイドとしてホットスポットウィザードおよび分子モデリングの結果を使用して、Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５における特定のアミノ酸を、主としてホットスポット領域中の極性または電荷を有する残基をアラニンに変換することによって突然変異させた（すなわち、付加、欠失または置換させた）。以下の表３０Ａおよび３０Ｂは、作製され試験されたカンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のＰｏｘ５およびＰｏｘ４の突然変異の要約を示す。表３０Ａおよび３０Ｂに記載の突然変異体のうちいくつかに関連するアシルＣｏＡ活性プロファイルの要約を図２７（Ｐｏｘ５）および図２８（Ｐｏｘ４）に示した。試験された各基質における炭素数を、図２７および図２８に記載の各バーの下に示す。Ｐｏｘ５突然変異体Ｉ（表３０Ａにおける灰色の強調表示）は、「ＡＣＡＤベースの変異誘発」に起因する（以下の考察を参照）。
カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６からのＰｏｘ４およびＰｏｘ５を、大腸菌における発現のためにｐＥＴ２６ｂにクローニングし、インビトロでのアシルＣｏＡオキシダーゼ活性に関してアッセイした。Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５の遺伝子改変の活性プロファイルを、野生型酵素の活性プロファイルと比較した。それらの基質の活性プロファイルを変更するために、Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５中の数種の位置で部位特異的変異誘発を行った。点変異をコードする相補的プライマーを使用して、Ｐｏｘ４またはＰｏｘ５のコード配列を増幅し、２〜４種のＰＣＲ産物を生成し、次いでオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用してこれらを互いに「交換」して、全体のコード領域を再構築した（図２２）。図２２で示されるように、プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤを使用してオーバーラップ伸長ＰＣＲを行った。プライマーＢおよびＣは相補的であり、導入された遺伝学的改変（例えば突然変異）を含有する。オリゴヌクレオチドＡおよびＢを使用してＰＣＲを行い、オリゴヌクレオチドＣおよびＤを使用して生成したＰＣＲ産物に対してオーバーラップを有する生成物を生産した。オーバーラップ伸長のために、Ａ−Ｂ生成物をＣ−Ｄ生成物のプライマーとして使用し、逆もまた同様とした。例えばＢ−Ｃプライマー対のような数種の突然変異誘発性プライマー対を使用して、互いに「交換」された異なる位置に、すなわちＡ−Ｂ、Ｃ−Ｄ、Ｅ−Ｆなどに突然変異を生産して、無傷の全長コード領域を生成した。突然変異を含有するより多くの最終産物を生産するために、プライマーＡとほとんどの３’リバースプライマーとを使用したＰＣＲを行った。プライマーＡおよびＤを使用して、Ｐｏｘ４およびＰｏｘ５の全体のコード配列を増幅し、大腸菌の発現ベクターへのクローニングのための制限酵素部位（ＲＥ１およびＲＥ２）を取り込ませた。表３１〜表４０に、Ｐｏｘ５（カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６）の部位特異的変異誘発のために使用されたプライマーを列挙した。表４１〜表４７に、Ｐｏｘ４（カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６）の部位特異的変異誘発のために使用されたプライマーを列挙した。
インビトロでのアシルＣｏＡオキシダーゼアッセイ
大腸菌溶解産物を、実施例４１で説明されているようにしてアシルＣｏＡオキシダーゼ活性に関して試験した。
Ｐｏｘ４突然変異体に関するインビトロでの活性アッセイ
表４８は、Ｐｏｘ４突然変異体に関連するアシルＣｏＡオキシダーゼ活性プロファイルを示し、表４９は、Ｐｏｘ５突然変異体に関連するアシルＣｏＡオキシダーゼ活性プロファイルを示す。データの上に、試験された基質の炭素の長さを、Ｃ６（６個の炭素）、Ｃ８（８個の炭素）、Ｃ１０（１０個の炭素）、Ｃ１２（１２個の炭素）、Ｃ１４（１４個の炭素）、Ｃ１６（１６個の炭素）およびＣ１８．１（１８個の炭素）として示す。表４８および４９において、網掛けされていないブロックは、サンプルが試験されなかったことを示す。濃い網掛けは、活性が検出されなかったことを示す。薄い網掛けは、０．１μｍｏｌ／分／μｇ（μｍｏｌ基質／分／μｇ総タンパク質）未満かまたはそれに等しい最小活性（すなわち不十分な活性）が検出されたことを示す。中程度の網掛けは、優れた活性が＞０．１μｍｏｌ／分／μｇで検出されたことを示す。
Ｐｏｘ４突然変異体Ｃは、試験された全ての基質にわたり優れた活性を示したにもかかわらず、全ての基質で全体的な活性の低減が実証された（表４８）。Ｐｏｘ４突然変異体Ｄは、類似の結果を示した。Ｐｏｘ４突然変異体Ｂ、Ａ、ＥおよびＧ（表４８）ならびにＣＴ３（示さず）では、Ｃ１２およびＣ１８：１基質に対する活性がなくなった。
Ｐｏｘ５突然変異体に関するインビトロでの活性アッセイ−結果
Ｐｏｘ５突然変異体Ｂ、Ｃ、ＦおよびＭにおいて、少なくとも基質Ｃ６、Ｃ１２およびＣ１８：１に対するアシルＣｏＡオキシダーゼ活性がなくなった（表４９）。突然変異体ＣＴ１およびＣＴ２も不活性であった（示さず）。突然変異体Ａ、ＥおよびＩは、野生型タンパク質の活性と比較した場合、変化を示さなかった。しかしながら、Ｐｏｘ５突然変異体Ｄ、Ｈ、Ｇ、およびＪは、野生型Ｐｏｘ５と比較した場合、変更された基質特異性を示した。Ｐｏｘ５突然変異体Ｄ、ＨおよびＪは、Ｃ６および／またはＣ８基質に対して低減した活性を実証した。Ｐｏｘ５突然変異体Ｇは、Ｃ１８：１基質に対して増加した活性を示した。
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼベースの変異誘発
アシル−ＣｏＡオキシダーゼおよびアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤ）はどちらも、類似した、ただし別個のメカニズムを利用して、β酸化の第一の工程で２−トランス−エノイル−ＣｏＡを生産するためにアシル−ＣｏＡ基質の脱水素を触媒する（Arent, S.、Pye, V.E.、Henriksen, A.（2008）. Structure and function of plant acyl CoA oxidases. Plant Phys. Biochem. 46：292〜301）。様々なクラスのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼがあり、これらは、それらの基質特異性：超長鎖、長鎖、中鎖および短鎖に従って分類される（それぞれＶＬＣＡＤ、ＬＣＡＤ、ＭＣＡＤ、ＳＣＡＤ）（Kim、J.J.、Miura、R.（2004）. Acyl-CoA dehydrogenases and acyl CoA oxidases. Structural basis for mechanistic similarities and differences. Eur. J. Biochem.、271（3）：483〜93）。これらの酵素のうちいくつかの結晶構造が解明されており、これらのデータは、それらそれぞれの基質特異性における差に寄与する可能性が極めて高い構造的な差を示す。ＶＬＣＡＤの結晶構造（ＰＤＢ：３Ｂ９６）から、構造的に、そしてより高い可能性として機能的にＭＣＡＤ（ＰＤＢ：３ＭＤＥ）とは異なるものにするタンパク質の領域およびアミノ酸残基が解明された（McAndrew, R.P.、Wang, Y.、Mohsen, A.W.、He, M.、Vockley, J.、Kim, J.J.（2008）. Structural basis for substrate fatty acyl chain specificity: crystal structure of human very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase. J. Biol. Chem. 283（14）：9435〜43）。いくつかのケースにおいて、より重要な差は、触媒性残基の位置である。ＭＣＡＤにおいて、触媒性グルタミン酸は、へリックスＪとＫとを連結するループ上の３７６位に配置されているが、ＬＣＡＤにおいて、触媒性グルタミン酸は、隣接するへリックスＧ上の２５５位に配置される（Nandy, A.、Kieweg, V.、Krautle, F.G.、Vock, P.、Kuchler, B.、Bross, P.、Kim, J.J.、Rasched, I.、Ghisla, S.（1996）. Medium-long-chain chimeric human Acyl-CoA dehydrogenase: medium-chain enzyme with the active center base arrangement of long-chain Acyl-CoA dehydrogenase. Biochemistry、35（38）：12402〜11；Lee, H.J.、Wang, M.、Paschke, R.、Nandy, A.、Ghisla, S.、Kim, J.J.（1996）. Crystal structures of the wild type and the Glu376Gly/Thr255Glu mutant of human medium-chain acyl-CoA dehydrogenase：influence of the location of the catalytic base on substrate specificity. Biochemistry、35（38）：12412〜20）。
またＶＬＣＡＤの結晶構造（ＰＤＢ：３Ｂ９６）から、構造的に、そしてより高い可能性として機能的にＭＣＡＤ（ＰＤＢ：３ＭＤＥ）とは異なるものにするタンパク質の領域およびアミノ酸残基も解明された（McAndrewら、2008）。ＶＬＣＡＤは、他のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのタンパク質より大きく、典型的なアシルＣｏＡオキシダーゼのような二量体を形成する。その基質結合キャビティは、他のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのタンパク質と比較して大きく、アシルＣｏＡオキシダーゼ基質結合ポケットに似ている。より大きくよりスペースが広いポケットは、それが作用を与えるより長い脂肪族アシル−ＣｏＡ基質を収容するのに必要である。しかしながら、ラットＡｃｏＩＩおよびシロイヌナズナＡＣＸ１の結晶構造（ＰＤＢ番号：１Ｗ０７）からも大きい基質結合ポケットが解明されており、この特徴は必ずしも各酵素の基質特異性を説明するものではない（Arentら、2008）。ＭＣＡＤとＶＬＣＡＤとの構造的な差から、いくつかの知見が得られる。ＭＣＡＤ基質結合ポケットの底部に、ＶＬＣＡＤ中の類似の残基（Ｇ１７５およびＧ１７８）と異なる２つの極性／電荷を有する残基（Ｑ９５およびＥ９９）がある。ＶＬＣＡＤ基質結合ポケットの底部における疎水性の増加は、ポケットのサイズおよび深さに加えて基質特異性に寄与する要因である可能性がある。カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６のＰｏｘ５における対応する残基は、Ｆ９８およびＧ１０２である。突然変異体Ｐ（Ｆ９８Ｇ）は、ＶＬＣＡＤ基質結合ポケットの底部をより厳密に再現すると予想される突然変異である。
ＭＣＡＤにおける二重の突然変異（例えば、Ｅ３７６Ｇ、Ｔ２５５Ｅ）は、その基質特異性プロファイルを変化させる可能性がある。この二重の突然変異は、いくつかのキメラ酵素（ＭＬＣＡＤ）を生産した（Nandyら、１９９６）。ＭＣＡＤは、広範な物質のプロファイル（Ｃ４〜Ｃ１８）を有し、Ｃ６およびＣ８に対してピーク活性を示した。ＬＣＡＤは、同様に広範なプロファイルを有し、Ｃ１０およびＣ１２に対してピーク活性を示した。ＭＬＣＡＤは、ＭＣＡＤまたはＬＣＡＤと比較してより明確な基質プロファイルを有し（Ｃ１０〜Ｃ１８）、Ｃ１２でピーク活性を示した。しかしながら、ＭＬＣＡＤの全体的な酵素活性も低減した（Ｃ１２基質に対するＭＬＣＡＤのＶｍａｘは、Ｃ１２基質に対するＬＣＡＤのＶｍａｘのおよそ２５％である）。
部分的に上記の研究の結果に基づき、表３０で説明されているようにＰｏｘ５を突然変異させ（突然変異体Ｉ）、より長い鎖の基質に優先的に作用するようにその基質プロファイルをシフトさせた。
ＶＬＣＡＤ変異誘発
ＶＬＣＡＤは、セバシン酸またはドデカン二酸などのより長い鎖二酸の生産に適した基質プロファイルを有する。酵素の活性は、長さが炭素１０個〜炭素２２個のアシル基質からの範囲であり、ピーク活性は、Ｃ１６基質に対して示される。しかしながら、ＶＬＣＡＤの酵素的なメカニズムは、最終的な電子受容体に関して典型的なアシルＣｏＡオキシダーゼのメカニズムとは異なっており；ＶＬＣＡＤの場合、電子移動鉄タンパク質（ＥＴＦ）によって酵素が再酸化され、酸素によってＡＯＸが再酸化されて、過酸化水素が生産される（Arentら、2008；KimおよびMiura、2004）。メカニズムの差を適合させるために、シロイヌナズナＡＣＸ１などのアシルＣｏＡオキシダーゼの基質結合ポケットのスペースを、ＶＬＣＡＤのポケットよりも広くすることにより、酸素がポケットに入って最終的な電子受容体として作用し、アシル−ＣｏＡ基質の脱水素に必要なフラビンアデニンジヌクレオチド、またはＦＡＤ、補因子が再酸化される。典型的なａｃａｄにおいて、ＥＴＦはこの機能を発揮し、酸素によるＦＡＤの再酸化は阻害されるが基質は結合する（Kumar, N.R.、Srivastava, D.K.（1995）. Facile and restricted pathways for the dissociation of octenoyl-CoA from the medium-chain fatty acyl-CoA dehydrogenase (MCAD)-FADH２-octenoyl-CoA charge-transfer complex：energetics and mechanism of suppression of the enzyme's oxidase activity. Biochemistry、34（29）：9434〜43）。これは、ＦＡＤに関して基質結合ポケットの形状に反映される。アシルＣｏＡオキシダーゼにおいて、ＦＡＤはより溶媒に晒されるが、ＭＣＡＤでは、フラビン環全体がタンパク質中に埋め込まれ、基質が存在しないときだけ溶媒に接近可能である（KimおよびMiura、2004）。ａｃａｄがオキシダーゼ活性を有するためには、基質結合ポケットがより溶媒に接近可能になり、還元されたＦＡＤ補因子の酸素による酸化が許容されなければならない。ＭＣＡＤの変異誘発研究において、この結果を達成できる残基が同定された。ＭＣＡＤにおけるチロシン３７５をリシンに変化させたところ、有意に増加した（野生型ＭＣＡＤと比べて約２００倍の増加）アシルＣｏＡオキシダーゼ活性が付与された（Zeng, J.、Liu, Y.、Wu, L.、Li, D.（2007）. Mutation of Tyr375 to Lys375 allows medium-chain acyl-CoA dehydrogenase to acquire acyl CoA oxidase activity. Biochim. Biophys. Acta、1774（12）：1628〜34）。
分子モデリングから、突然変異が、活性部位中のＦＡＤ部分近傍における溶媒の接近しやすさを増加させることが示唆される。ＶＬＣＡＤが適切な基質特異性プロファイルを有するアシルＣｏＡオキシダーゼとして機能するために、ＶＬＣＡＤにおける類似の突然変異を作製した。ＭＣＡＤにおけるチロシン３７５は、ヒトおよびラットＶＬＣＡＤにおけるフェニルアラニン４６１に対応する。ＶＬＣＡＤにおけるＦ４６１Ｋの突然変異を試験して、ＶＬＣＡＤがこの時点でアシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するのかどうかを観察した。
実施例４３：株ｓＡＡ２２２０の生成
ＥＣＩ１の第二の対立遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを、株ｓＡＡ１７６４のゲノムＤＮＡから、プライマーｏＡＡ３０９１およびｏＡＡ３０９２を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にライゲートし、コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換し、ＰＣＲインサートを含有するクローンを配列決定して、正しいＤＮＡ配列を確認した。このようなプラスミドの１つを、ｐＡＡ７５６と名付けた。
ｓＡＡ１８６０における第二のＥＣＩ１の対立遺伝子の欠失を、ＰＣＲベースのネステッド方策によって作製した。第二のＥＣＩ１の欠失カセットを、スリーピースから、プライマーｏＡＡ３２１２およびｏＡＡ３２１７を使用してＰＣＲで増幅した。第一の断片（ＥＣＩ１＿Ｎ＿Ｎｅｓｔｅｄ２）を、ｐＡＡ７５６から、プライマーｏＡＡ３２１２およびｏＡＡ３２１３を使用して増幅した。第二の断片（同方向反復配列を有するＵＲＡ３カセット）を、プラスミドｐＡＡ２９８から、プライマーｏＡＡ３２１４およびｏＡＡ３２１５を使用して増幅した。第三の断片（ＥＣＩ１＿Ｃ＿Ｎｅｓｔｅｄ２）を、ｐＡＡ７５６から、プライマーｏＡＡ３２１６およびｏＡＡ３２１７を使用して増幅した。
株ｓＡＡ１８６０を、上記で説明した第二のＥＣＩ１欠失カセットで形質転換し、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上で平板培養した。二重のＥＣＩ１欠失に関して数種のコロニーをチェックした。このような陽性株の１つを、ｓＡＡ２２２０と名付けた
実施例４４：ｓＡＡ８７５およびｓＡＡ２２２０の振盪フラスコの特徴付け
２５ｍＬのＳＰ９２培地を含有する２５０ｍＬのガラス製バッフルなしフラスコに、５ｍＬの一晩のＹＰＤ培養物を植え付け（初期のＯＤ＝０．４）、３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２４時間インキュベートした（２インチのスローインキュベーター（throw incubator））。細胞を遠心分離し、細胞のペレットを１２．５ｍＬのＴＢ−低Ｎ培地（アミノ酸非含有および硫酸アンモニウム非含有の酵母窒素原礎培地、１．７ｇ／Ｌ；酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム、１．０ｇ／Ｌ；二塩基性リン酸カリウム、１．０ｇ／Ｌ）に再懸濁し、２５０ｍＬガラス製底部バッフル付きフラスコに移した。０．２８１ｍＬのオレイン酸またはリノール酸のどちらかを添加して、アジピン酸生産を開始させ、この培養物を、３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。４８時間後、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）分析のためにサンプルを採取した。以下に、株ｓＡＡ８７５（ＥＣＩ１＋ＥＣＩ２＋）およびｓＡＡ２２２０（ｅｃｉ１−ＥＣＩ２＋）を用いてオレイン酸およびリノール酸から生産された二酸プロファイルを示す。リノール酸のケースにおいて、１つまたは２つ二重結合を有するかどうかにかかわらず全ての不飽和二酸生成物を合わせて、一価不飽和の生成物として列挙した。以下の表５１および表５２に結果を示す；「ｇ／Ｌ」は、発酵ブロス１リットルあたりの提示された二酸のグラムを指す。
実施例４５：株ｓＡＡ２４２８およびｓＡＡ１２６９の構築、
ｓＡＡ１２６９の構築
カンジダ株ｓＡＡ９８８を、ＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、ＵＲＡ３ターミネーターのみを後に残すＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングした。このような株の１つを、ｓＡＡ１２６９と名付けた。
株ｓＡＡ２４２８の構築
カンジダ株ＳＡＡ２４２８を、開始時の株ｓＡＡ８８６のゲノムからのＰＯＸ５の対立遺伝子の両方をノックアウトすることによって構築した。この株をノックアウトプラスミドコンストラクトｐＡＡ９１８で形質転換することによって、両方のＰＯＸ５対立遺伝子を欠失させた。
ノックアウトプラスミドコンストラクトｐＡＡ９１８：カンジダのＰｏｘ５遺伝子のおよそ６００ｂｐの５’フランキング領域を、オリゴｏＡＡ２６５６／ｏＡＡ２６５７およびＡＴＣＣ２０３３６からのゲノムＤＮＡを使用して増幅した。このフラグメントをゲルで精製し、ＰＣＲブラントＩＩ ＴＯＰＯベクターにクローニングして、プラスミドｐＡＡ４９４を作製した。およそ５００ｂｐのＰＯＸ５遺伝子の３’フランキング領域を、ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＡＡ２６５８／ｏＡＡ２６５９により増幅し、このフラグメントを、ＰＣＲブラントＩＩ ＴＯＰＯベクターにクローニングして、プラスミドｐＡＡ４９５を作製した。ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＡＡ４９４のフラグメント、ｐＡＡ４９５のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントおよびｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを一緒にライゲートして、プラスミドｐＡＡ４９６を構築した。その後、ＮｏｔＩ制限部位を両端に有するＵＲＡ３ターミネーター−ＵＲＡ３プロモーター−ＵＲＡ３コード配列−ＵＲＡ３ターミネーターを含有するＤＮＡフラグメントを、ｐＡＡ４９６のＮｏｔＩ部位にクローニングして、ＰＯＸ５ノックアウトコンストラクトプラスミドｐＡＡ９１８を作製した（図３２）。
実施例４６：株ｓＡＡ２２９１の生成
カンジダ株ｓＡＡ８８６を、ＰａｃＩで消化したｐＡＡ９１８のフラグメントで形質転換し、ＳＣＤ−Ｕｒａプレート上で平板培養した。数種のコロニーを、第一のＰＯＸ５対立遺伝子中の欠失カセットの統合に関してＰＣＲによってスクリーニングした。陽性コロニーを、ｓＡＡ２２９１と名付けた。
実施例４７：株ｓＡＡ２３１０の生成
株ｓＡＡ２２９１をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、ＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングして、第一のＰＯＸ５対立遺伝子中にＵＲＡ３ターミネーター（ＴＵＲＡ３）だけをあとに残した。この株を、ｓＡＡ２３１０と名付けた。
実施例４８：株ｓＡＡ２３９９の生成
第二のＰＯＸ５の対立遺伝子の欠失を、ＰａｃＩ消化したｐＡＡ９１８のフラグメントをｓＡＡ２３１０およびＳＣＤ−Ｕｒａに形質転換して、プレート上で平板培養することによって行った。ＳＣＤ−Ｕｒａプレート上で増殖したコロニーを、第二のＰＯＸ５対立遺伝子におけるノックアウトカセットの統合に関してＰＣＲでスクリーニングした。陽性コロニーを、ｓＡＡ２３９９と名付けた。
実施例４９：株ｓＡＡ２４２８の生成
株ｓＡＡ２３９９をＹＰＤ培地中で一晩増殖させ、５−ＦＯＡプレート上で平板培養した。５−ＦＯＡの存在下で増殖したコロニーを、ＵＲＡ３遺伝子のループアウトに関してＰＣＲでスクリーニングして、第二のＰＯＸ５対立遺伝子中にＵＲＡ３ターミネーター（ＴＵＲＡ３）だけをあとに残した。この株を、ｓＡＡ２４２８と名付けた。
実施例５０：株ｓＡＡ１２６９またはｓＡＡ２４２８におけるＡＴＣＣ２０３３６ＰＯＸ４およびＰＯＸ５突然変異体の構築
ＡＴＣＣ２０３３６のＰＯＸ４およびＰＯＸ５の突然変異体はすでに、大腸菌における発現のために構築されていた（上記で説明した通り）。ＡＴＣＣ２０３３６から得られた株中で発現されたときの活性に関してこれらの突然変異体を試験するために、これらをＰＣＲによってクローニングし、ベクターｐＡＡ０７３またはｐＡＡ３３５のいずれかに挿入した。
ｐＡＡ３３５ベクターを以下のようにして生成した。ＰＥＸ１１のプロモーターおよびターミネーターを、カンジダ株ＡＴＣＣ２０３３６から得られたゲノムＤＮＡから、それぞれオリゴｏＡＡ２１６４およびｏＡＡ２１３８またはｏＡＡ２１３５およびｏＡＡ２１３６を使用したＰＣＲで増幅した。２つの断片を、Ｐｓｔ１およびＳｍａＩまたはＮｄｅＩおよびＳｍａＩのいずれかで消化し、ｐＡＡ６１のＰｓｔ１およびＮｄｅＩ部位にライゲートして、ｐＡＡ３３５を形成した。
遺伝子をｐＡＡ０７３またはｐＡＡ３３５にクローニングする場合、その遺伝子は、それぞれＰＯＸ４またはＰＥＸ１１プロモーターの調節下に置かれた。オリゴヌクレオチドｏＡＡ５４０およびｏＡＡ５４１を使用して、ｐＡＡ０７３へのシームレスクローニングのためにＰＯＸ５配列を増幅した。オリゴヌクレオチドｏＡＡ２９８４およびｏＡＡ２９８５を使用して、ｐＡＡ３３５へのシームレスクローニングのためにＰＯＸ５配列を増幅した。オリゴヌクレオチドｏＡＡ３４５２およびｏＡＡ３４５３を使用して、ｐＡＡ３３５へのシームレスクローニングのためにＰＯＸ４配列を増幅した。野生型ＰＯＸ４に関するコード配列を、ＡＴＣＣ２０３３６のゲノムＤＮＡから増幅した。Ｔ２８７Ａを除いて全てのＰＯＸ５突然変異体をｓＡＡ２４２８に形質転換した。ＰＯＸ５ Ｔ２８７Ａ突然変異体に関するコンストラクトをｓＡＡ１２６９に形質転換して、株ｓＡＡ２０５８を生産した。野生型ＰＯＸ４コンストラクトをｓＡＡ２４２８に形質転換して、株ｓＡＡ２７７８〜２７８０を生産し、一方で突然変異体ＰＯＸ４ Ｄ９６ＡコンストラクトをｓＡＡ１２６９に形質転換して、株ｓＡＡ２１０９を生産した。全てのＰＣＲ増幅は、ＰｆｕウルトラＩＩ（Pfu Ultra II）ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジーズ、カリフォルニア州サンタクララ）を製造元の説明書に従って使用して行われた。クローンを、ＳＣＤ−ｕｒａプレート上での増殖によって選択し、その後、０．１％オレイン酸含有０．１％トゥイーン８０を含有する最小培地上での増殖に関して試験した。トゥイーン８０とオレイン酸とを含有する培地上でよく増殖したクローンを振盪フラスコ発酵で試験した。ＰＯＸ５のＴ２８７Ａ突然変異体およびＰＯＸ４のＤ９６Ａ突然変異体のケースでは、どれだけ多くの突然変異遺伝子のコピーが統合されたかをを決定するために、試験しようとするクローンをｑＰＣＲによって同定した。ｑＰＣＲは、ブリリアントＩＩＩウルトラ−ファストＳＹＢＲ（Brilliant III Ultra-Fast SYBR）グリーンqＰＣＲマスターミックス（アジレント・テクノロジーズ、カリフォルニア州サンタクララ）を製造元の説明書に従って使用して行われた。遺伝子のコピー数を定量化する手段として、オリゴヌクレオチドｏＡＡ２７１８およびｏＡＡ２７１９を使用して、アクチン遺伝子の一部を増幅し、一方でオリゴヌクレオチドｏＡＡ３５１５およびｏＡＡ３５１６を使用して、ＰＥＸ１１プロモーターの一部を増幅した。以下の表に、上記のクローニング手法およびｑＰＣＲで使用されたオリゴヌクレオチドの配列、ならびに形質転換によるコンストラクトの統合から得られた株を示す。
実施例５１：Ｙ．リポリチカのＰｏｘ２、Ｐｏｘ３およびＰｏｘ５に関する突然変異誘発性の標的部位
ドブネズミＡｃｏＩＩの結晶構造（ＰＤＢ番号：１ＩＳ２Ａ）をベースとしたＹ．リポリチカのＰｏｘ２、Ｐｏｘ３およびＰｏｘ５の構造モデルを、ＭＯＤＢＡＳＥ（ＭｏｄＢａｓｅ：比較のためのタンパク質構造モデルのデータベース（Database of Comparative Protein Structure Models）-http://modbase.compbio.ucsf.edu/modbase-cgi/index.cgi）から得て、これらの酵素のホットスポットウィザード分析に使用した（ホットスポットウィザード−loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/）。以下の表５８に、Ｙ．リポリチカのＰｏｘ２、Ｐｏｘ３およびＰｏｘ５の構造モデルに対するＭＯＤＢＡＳＥの識別番号（それらのユニプロットＫＢ識別番号に加えて）を示す。
全ての３種のＹ．リポリチカ酵素は、変異誘発に関して、ＡＴＣＣ２０３３６のＰＯＸ４およびＰＯＸ５の両方で見出されたものと類似の「ホットスポット」を含有する。以下の表５９は、ＡＴＣＣ２０３３６のＰＯＸ４およびＰＯＸ５に関するホットスポット、ならびに上記で示された複数の配列アライメントに基づきＹ．リポリチカのＰｏｘ２、Ｐｏｘ３およびＰｏｘ５における対応する残基を示す。表５９中で確認された１つまたはそれより多くの位置におけるアミノ酸は、基質特異性を改変する目的で非天然のアミノ酸と置換されていてもよい。
実施例５２：ＡＴＣＣ２０３３６のＰＯＸ４およびＰＯＸ５突然変異体の機能分析
ＰＯＸ５中の「ホットスポット」残基およびＰＯＸ４中の１つの残基の機能分析は、主として、それらが酵素の活性または基質特異性を変化させたかどうかを試験するためにその位置におけるアラニンまたはグリシンを置換することによって行われた。（Ｇ２８４Ｅ、Ｅ４３６Ｇ）突然変異体は、これまでに述べられたＡＣＡＤ変異誘発研究に基づく。結果得られた突然変異体を、ｐＡＡ０７３またはｐＡＡ３３５のいずれかにクローニングし、ｓＡＡ２４２８に統合した。これらのクローンを、オレイン酸の振盪フラスコ発酵で、以下のように４８または７２時間の期間にわたり試験した。試験しようとする株の初発培養物（５ｍＬ）を、ＳＰ９２グリセロール培地（６．７ｇ／Ｌのディフコ（Ｄｉｆｃｏ）酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌのディフコ酵母抽出物、３．０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１．０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、１．０ｇ／Ｌの二塩基性リン酸カリウム、７５ｇ／Ｌグリセロール）中で増殖させ、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートし、これを使用して、初期ＯＤ６００ｎｍが０．４になるまで２５ｍＬの新鮮なＳＰ９２グリセロール培地に植え付け、３０℃、３００ｒｐｍでおよそ１８時間インキュベートした。次いで細胞を、遠心分離によって４，０００×ｇ、４℃で１０分間ペレット化し、次いで１２．５ｍＬのＴＢ−低Ｎ培地（アミノ酸および硫酸アンモニウム非含有の１．７ｇ／Ｌのディフコ酵母窒素原礎培地、３．０ｇ／Ｌのディフコ酵母抽出物、１．０ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、１．０ｇ／Ｌの二塩基性リン酸カリウム）に再懸濁した。オレイン酸（５６２μｌ）を添加して、二酸生産を開始させた。以下の表０６０は、結果得られたこれらの発酵から生産された二酸を示す。
注釈：小文字で記載されているか、および／または記号Δが付いている遺伝子は、欠失した遺伝子を示す。株ｓＡＡ６１７、ｓＡＡ６２０およびｓＡＡ６３２は、「ａｃｏａｔ」の１つの対立遺伝子の欠失を含み、ａｃｏａｔ遺伝子ノックアウトに関してヘテロ接合型である（例えば、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ−／＋）。＊＊株ＡＡ２７８０は、内因性ＰＯＸ４遺伝子の欠失（すなわちｐｏｘ４Δ）およびＰＥＸ１１プロモーターの制御下に野生型ＰＯＸ４遺伝子の再導入（すなわち、ＰＯＸ４）を含む。
実施例５３：本明細書で説明された操作に使用されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列
実施例５４：追加のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
実施例５５：所定の非限定的な実施態様の例
本技術の所定の実施態様の非限定的な例を以下に列挙する。
Ａ１．活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む遺伝子改変酵母であって、該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記遺伝子改変酵母。
Ａ２．前記酵母が、遺伝子改変されたカンジダ種の酵母である、実施態様Ａ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．１．前記カンジダ種の酵母が、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイから選ばれる、実施態様Ａ２に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．２．前記カンジダ種の酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、実施態様Ａ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．３．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ４ポリペプチドである、実施態様Ａ２〜Ａ２．２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．４．前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、配列番号３０の改変されたアミノ酸配列を含む、実施態様Ａ２．３に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．５．前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、８８、９０、９６、９８、９９、１００、１０２、１０３、３０２、３０９、３１０、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４および５０５から選ばれる１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ２．３またはＡ２．４に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．６．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ５ポリペプチドである、実施態様Ａ２〜Ａ２．２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．７．前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、配列番号３２の改変されたアミノ酸配列を含む、実施態様Ａ２．６に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．８．前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８８、９３、９４、９５、９６、９８、１０２、２８４、２８７、２９０、２９１、２９２、２９４、２９５、４２８、４２９、４３６、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２および４６３から選ばれる１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ２．６またはＡ２．７に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．９．前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、ＡＣＡＤ、ＶＬＣＡＤ、ＬＣＡＤ、ＭＣＡＤおよびＳＣＡＤポリペプチドから選ばれる、実施態様Ａ２〜Ａ２．２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．１０．前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、配列番号３６８５の改変されたアミノ酸配列を含む、実施態様Ａ２．９に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．１１．前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、ＶＬＣＡＤの４６１位におけるアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ２．９またはＡ２．１０に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．１２．前記アミノ酸改変のうち少なくとも１つが、アミノ酸置換である、実施態様２．５、２．８および２．１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．１３．前記１つまたはそれより多くのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、保存的である、実施態様Ａ２．１２に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２．１４．前記１つまたはそれより多くのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、保存的ではない、実施態様Ａ２．１２に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３．前記酵母が、遺伝子改変されたヤロウイア種の酵母である、実施態様Ａ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３．１．前記ヤロウイア種の酵母が、Ｙ．リポリチカ（Y. lipolytica）である、実施態様Ａ３.１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３．２．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ１ポリペプチド、ＰＯＸ２ポリペプチド、ＰＯＸ３ポリペプチド、ＰＯＸ４ポリペプチド、ＰＯＸ５ポリペプチドまたはＰＯＸ６ポリペプチドから選ばれる、実施態様Ａ３またはＡ３．１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３．３．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、配列番号３７７８〜３７８３から選ばれる、実施態様３．２に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ４．前記酵母が、遺伝子改変されたピチア種の酵母である、実施態様Ａ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ４．１．前記ピチア種の酵母が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、Ｐ．メンブラニファシエンス（P. membranifaciens）、Ｐ．クルベリ（P. kluyveri）、Ｐ．ギリエルモンジイ（P. guilliermondii）、Ｐ．ヒーディ（P. heedii）およびＰ．サブペリキュローサ（P. subpelliculosa）から選ばれる、実施態様Ａ４.１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ５．前記酵母が、遺伝子改変されたサッカロミセス種の酵母である、実施態様Ａ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ５．１．前記サッカロミセス種の酵母が、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）、Ｓ．パストリアヌス（S. pastorianus）およびＳ．カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis）から選ばれる、実施態様Ａ５．１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ６．前記酵母が、遺伝子改変されたクルイベロマイセス種の酵母である、実施態様Ａ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ６．１．前記クルイベロマイセス種の酵母が、Ｋ．ラクティス（K. lactis）およびＫ．マルキシアヌス（K. marxianus）から選ばれる、実施態様Ａ６．１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ７．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｎ末端のループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ６．１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ８．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｄアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ９．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＤアルファへリックスとＥ’アルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１０．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素６〜９と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１１．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素１０〜１２と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１２．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｌアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１３．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｃ末端からＬアルファへリックスへのループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１４．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＬアルファへリックスとＭアルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１５．前記アミノ酸改変が、アミノ酸置換を含む、実施態様Ａ７〜Ａ１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１６．前記アミノ酸置換が、保存的である、実施態様Ａ１５に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１７．前記アミノ酸置換が、保存的ではない、実施態様Ａ１５に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１７．１．（ｉ）活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチド、および（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を変更する遺伝学的改変を含む遺伝子改変酵母であって、該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記遺伝子改変酵母。
Ａ１８．エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ１７．１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１８．１．（ｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターの破壊、欠失もしくはノックアウトを含み、それによってエノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が低減または除去される、実施態様Ａ１８に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１９．前記遺伝学的改変が、エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ａ１８．１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１９．１．エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を増加させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ１９．２．（ｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増加したコピー数、または（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに挿入されて作動可能に連結したプロモーターを含む、実施態様Ａ１９．１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２０．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、実施態様Ａ１８．１、Ａ１８．２およびＡ１９．２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２０．１．前記酵母におけるエノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドのタイプの１種もしくはそれより多くまたは全ての前記活性が変更される、実施態様Ａ１７．１〜Ａ２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２０．２．前記酵母が、２種のエノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドのタイプを含み、該ポリペプチドのタイプの一方または両方が変更される、実施態様Ａ２０．１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２１．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、カンジダ種の酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ａ１７．１〜Ａ２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２２．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、配列番号３６７５、３６７７、３８００、３８０２、３８０３または３８０５のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ａ１７．１〜Ａ２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２２．１．前記酵母が、ヤロウイア属の酵母である、実施態様Ａ１７．１〜Ａ２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２２．２．前記酵母が、Ｙ．リポリチカの酵母である、実施態様Ａ２２．１に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２２．３．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、ヤロウイア属の酵母またはＹ．リポリチカの酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ａ２２．２に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２２．４．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、配列番号３８０４または３８０６のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ａ２２．２に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２３．アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドの細胞質内の活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ２２．４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２４．アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドのペルオキシソームの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２５．前記遺伝学的改変が、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ａ２３またはＡ２４に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２６．前記遺伝学的改変が、ＡＣＳ１ポリペプチドまたはＡＣＳ２ポリペプチドを破壊する、実施態様Ａ２５に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２７．前記遺伝学的改変が、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ａ２３〜Ａ２６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２８．前記遺伝学的改変が、ＦＡＴ１ポリペプチドを破壊する、実施態様Ａ２７に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ２９．前記アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、実施態様Ａ２３〜Ａ２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３０．前記酵母が、カンジダ種の酵母である、実施態様Ａ２９に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３１．前記アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドが、配列番号８０、８２、８４、１５８および１５９から選ばれるアミノ酸配列を含む、実施態様Ａ３０に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３２．前記ＦＡＴ１ポリペプチドが、配列番号９０のアミノ酸配列を含む、実施態様Ａ３０に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３３．ＰＸＡポリペプチドの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３４．前記遺伝学的改変が、ＰＸＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ａ３３に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３５．前記ＰＸＡポリペプチドが、ＰＸＡ１ポリペプチドもしくはＰＸＡ２ポリペプチド、またはＰＸＡ１ポリペプチドおよびＰＸＡ２ポリペプチドである、実施態様Ａ３３またはＡ３４に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３６．前記ＰＸＡポリペプチドが、前記酵母にとって天然である、実施態様Ａ３３〜Ａ３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３７．前記酵母が、カンジダ種の酵母である、実施態様Ａ３６に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３８．前記ＰＸＡ１ポリペプチドが、配列番号９２のアミノ酸配列を含む、実施態様Ａ３７に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ３９．前記ＰＸＡ２ポリペプチドが、配列番号９４のアミノ酸配列を含む、実施態様Ａ３７に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ４０．活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチド、および活性ではない改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む、実施態様Ａ１〜Ａ３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ４１．活性ではない改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチド、および活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む、実施態様Ａ１〜Ａ３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ａ４２．二酸を生産する方法であって、
（１）実施態様Ａ１〜Ａ４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な少なくとも１種の不飽和植物性脂肪酸を含有する供給材料からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料と接触させることと；
（２）該供給材料から二酸が生産される条件下で該酵母を培養することと
（３）二酸を水素化して、炭素鎖中のあらゆる不飽和を除去することと
を含む、上記方法。
Ａ４３．前記不飽和植物性脂肪酸が、リノール酸またはリノレン酸である、Ａ４２に記載の方法。
Ａ４４．前記二酸が、ドデカン二酸またはセバシン酸である、Ａ４３に記載の方法。
Ｂ１．異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは異種アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む遺伝子改変酵母であって、該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記遺伝子改変酵母。
Ｂ２．前記異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、天然ポリペプチドである、実施態様Ｂ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ３．前記異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、活性な改変されたポリペプチドである、実施態様Ｂ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ４．前記異種アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、天然ポリペプチドである、実施態様Ｂ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ５．前記異種アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、活性な改変されたポリペプチドである、実施態様Ｂ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ６．前記異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、配列番号５１〜配列番号３６７３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドから選ばれる、実施態様Ｂ１またはＢ２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ７．前記異種アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、配列番号３６７９〜３６８３、３６８６、３６８９、３６９１、３６９３、３６９５、３６９７、３６９９、３７０１および３７０３から選ばれる、実施態様Ｂ１またはＢ４に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ８．カンジダ種の酵母、ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母から選ばれる、実施態様Ｂ１〜Ｂ７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ９．Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）、Ｃ．ビスワナチイ（C. viswanathii）、Ｙ．リポリチカ（Y. lipolytica）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、Ｐ．メンブラニファシエンス（P. membranifaciens）、Ｐ．クルベリ（P. kluyveri）、Ｐ．ギリエルモンジイ（P. guilliermondii）、Ｐ．ヒーディ（P. heedii）、Ｐ．サブペリキュローサ（P. subpelliculosa）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）、Ｓ．パストリアヌス（S. pastorianus）、Ｓ．カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis）、Ｋ．ラクティス（K. lactis）およびＫ．マルキシアヌス（K. marxianus）から選ばれる、実施態様Ｂ８に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１０．エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１１．前記遺伝学的改変が、エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ｂ１０に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１２．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、実施態様Ｂ１０またはＢ１１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１３．前記酵母が、カンジダ種の酵母である、実施態様Ｂ１２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１４．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドが、配列番号３６７５または３６７７のアミノ酸配列を含む、実施態様Ｂ１３に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１５．アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドの細胞質内の活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１６．アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドのペルオキシソームの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１７．前記遺伝学的改変が、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ｂ１５またはＢ１６に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１８．前記遺伝学的改変が、ＡＣＳ１ポリペプチドまたはＡＣＳ２ポリペプチドを破壊する、実施態様Ｂ１７に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ１９．前記遺伝学的改変が、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ｂ１５〜Ｂ１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２０．前記遺伝学的改変が、ＦＡＴ１ポリペプチドを破壊する、実施態様Ｂ１９に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２１．前記アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、実施態様Ｂ１５〜Ｂ２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２２．前記酵母が、カンジダ種の酵母である、実施態様Ｂ２１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２３．前記アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドが、配列番号８０、８２、８４、１５８および１５９から選ばれるアミノ酸配列を含む、実施態様Ｂ２２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２４．前記ＦＡＴ１ポリペプチドが、配列番号９０のアミノ酸配列を含む、実施態様Ｂ２１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２５．ＰＸＡポリペプチドの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ２４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２６．前記遺伝学的改変が、ＰＸＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ｂ２５に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２７．前記ＰＸＡポリペプチドが、ＰＸＡ１ポリペプチドもしくはＰＸＡ２ポリペプチド、またはＰＸＡ１ポリペプチドおよびＰＸＡ２ポリペプチドである、実施態様Ｂ２５またはＢ２６に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２８．前記ＰＸＡポリペプチドが、前記酵母にとって天然である、実施態様Ｂ２５〜Ｂ２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ２９．前記酵母が、カンジダ種の酵母である、実施態様Ｂ２８に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ３０．前記ＰＸＡ１ポリペプチドが、配列番号９２のアミノ酸配列を含む、実施態様Ｂ２９に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ３１．前記ＰＸＡ２ポリペプチドが、配列番号９４のアミノ酸配列を含む、実施態様Ｂ２９に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ３２．活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチド、および活性ではない改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｂ３３．活性ではない改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチド、および活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む、実施態様Ｂ１〜Ｂ３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ１．１種またはそれより多くの天然の内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドの活性を低減させる１種またはそれより多くの遺伝学的改変を含む、実施態様Ａ１〜Ａ４１およびＢ１〜Ｂ３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ２．全ての天然の内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ｃ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ３．前記遺伝学的改変が、ベータ酸化活性を部分的にブロックする、実施態様Ｃ１またはＣ２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ４．前記二酸が、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸である、実施態様Ａ１〜Ａ４１、Ｂ１〜Ｂ３３、およびＣ１〜Ｃ３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ５．前記二酸が、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０の二酸である、実施態様Ｃ４に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ６．前記二酸が、Ｃ１０の二酸である、実施態様Ｃ５に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ７．前記二酸が、Ｃ１２の二酸である、実施態様Ｃ５に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ８．前記二酸が、Ｃ１８の二酸である、実施態様Ｃ５に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ９．前記二酸が、不飽和を含有しない、実施態様Ｃ４〜Ｃ８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ１０．前記二酸が、１つまたはそれより多くの不飽和を含有する、実施態様Ｃ４〜Ｃ８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ１０．１．前記二酸が、二酸の混合物中の主な二酸である、実施態様Ｃ４〜Ｃ１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ１１．前記供給材料が、実質的に純粋な油を含む、実施態様Ａ１〜Ａ４１、Ｂ１〜Ｂ３３、およびＣ１〜Ｃ１０．１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ１２．前記供給材料が、複数の脂肪酸を含む、実施態様Ａ１〜Ａ４１、Ｂ１〜Ｂ３３、およびＣ１〜Ｃ１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ１３．前記供給材料が、石鹸原料を含む、実施態様Ｃ１２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ１４．前記供給材料が、脂肪酸蒸留物を含む、実施態様Ｃ１２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｃ１５．前記植物油が、パーム、パーム核、ヤシ、ダイズ、ベニバナ、キャノーラ、パーム、パーム核またはそれらの組み合わせから選ばれる植物由来である、実施態様Ａ１〜Ａ４１、Ｂ１〜Ｂ３３、およびＣ１〜Ｃ１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｄ１．二酸を生産する方法であって、
実施態様１〜Ａ４１、Ｂ１〜Ｂ３３、およびＣ１〜Ｃ１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料と接触させることと；
該供給材料から二酸が生産される条件下で該酵母を培養することと
を含む、上記方法。
Ｄ２．前記二酸が、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸である、実施態様Ｄ１に記載の方法。
Ｄ３．前記二酸が、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０の二酸である、実施態様Ｄ２に記載の方法。
Ｄ４．前記二酸が、Ｃ１０の二酸である、実施態様Ｄ３に記載の方法。
Ｄ５．前記二酸が、Ｃ１２の二酸である、実施態様Ｄ３に記載の方法。
Ｄ６．前記二酸が、Ｃ１８の二酸である、実施態様Ｄ３に記載の方法。
Ｄ７．前記二酸が、不飽和を含有しない、実施態様Ｄ１〜Ｄ６のいずれか一項に記載の方法。
Ｄ８．前記二酸が、１つまたはそれより多くの不飽和を含有する、実施態様Ｄ１〜Ｄ６のいずれか一項に記載の方法。
Ｄ８．１．前記二酸が、二酸の混合物中の主な二酸である、実施態様Ｄ２〜Ｄ８のいずれか一項に記載の方法。
Ｄ９．前記供給材料が、実質的に純粋な油を含む、実施態様Ｄ１〜Ｄ８．１のいずれか一項に記載の方法。
Ｄ１０．前記供給材料が、複数の脂肪酸を含む、実施態様Ｄ１〜Ｄ８のいずれか一項に記載の方法。
Ｄ１１．前記供給材料が、石鹸原料を含む、実施態様Ｄ１０に記載の方法。
Ｄ１２．前記供給材料が、脂肪酸蒸留物を含む、実施態様Ｄ１０に記載の方法。
Ｄ１３．前記植物油が、パーム、パーム核、ヤシ、ダイズ、ベニバナ、キャノーラ、パーム、パーム核またはそれらの組み合わせから選ばれる植物由来である、実施態様Ｄ１〜Ｄ１２のいずれか一項に記載の方法。
Ｅ１．酵母からの改変されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
Ｅ２．前記改変されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｎ末端のループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ１に記載の単離された核酸。
Ｅ３．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｄアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ１に記載の単離された核酸。
Ｅ４．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＤアルファへリックスとＥ’アルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ１に記載の単離された核酸。
Ｅ５．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素６〜９と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ１に記載の単離された核酸。
Ｅ６．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素１０〜１２と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ１に記載の単離された核酸。
Ｅ７．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｌアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ１に記載の単離された核酸。
Ｅ８．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｃ末端からＬアルファへリックスへのループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ１に記載の単離された核酸。
Ｅ９．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＬアルファへリックスとＭアルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ１に記載の単離された核酸。
Ｅ１０．前記アミノ酸改変が、アミノ酸置換を含む、実施態様Ｅ２〜Ｅ９のいずれか一項に記載の単離された核酸。
Ｅ１１．前記アミノ酸置換が、保存的である、実施態様Ｅ１０に記載の単離された核酸。
Ｅ１２．前記アミノ酸置換が、保存的ではない、実施態様Ｅ１０に記載の単離された核酸。
Ｅ１３．前記酵母が、カンジダ種の酵母、ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母から選ばれる、実施態様Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか一項に記載の単離された核酸。
Ｅ１４．前記酵母が、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．ビスワナチイ、Ｙ．リポリチカ、Ｐ．パストリス、Ｐ．メンブラニファシエンス、Ｐ．クルベリ、Ｐ．ギリエルモンジイ、Ｐ．ヒーディ、Ｐ．サブペリキュローサ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パストリアヌス、Ｓ．カールスベルゲンシス、Ｋ．ラクティスおよびＫ．マルキシアヌスから選ばれる、実施態様Ｅ１３に記載の単離された核酸。
Ｅ１５．前記酵母が、カンジダ種の酵母である、実施態様Ｅ１３に記載の単離された核酸。
Ｅ１６．前記酵母が、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイから選ばれる、実施態様Ｅ１５に記載の単離された核酸。
Ｅ１７．前記酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、実施態様Ｅ１６に記載の単離された核酸。
Ｅ１８．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ４ポリペプチドである、実施態様Ｅ１５〜Ｅ１７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
Ｅ１９．前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、配列番号３０の改変されたアミノ酸配列を含む、実施態様Ｅ１８に記載の単離された核酸。
Ｅ２０．前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、８８、９０、９６、９８、９９、１００、１０２、１０３、３０２、３０９、３１０、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４および５０５から選ばれる１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ１８またはＥ１９に記載の単離された核酸。
Ｅ２１．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ５ポリペプチドである、実施態様Ｅ１５〜Ｅ１７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
Ｅ２２．前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、配列番号３２の改変されたアミノ酸配列を含む、実施態様Ｅ２１に記載の単離された核酸。
Ｅ２３．前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８８、９３、９４、９５、９６、９８、１０２、２８４、２８７、２９０、２９１、２９２、２９４、２９５、４３６、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２および４６３から選ばれる１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、実施態様Ｅ２１またはＥ２２に記載の単離された核酸。
Ｅ２４．前記アミノ酸改変のうち少なくとも１つが、アミノ酸置換である、実施態様Ｅ２０またはＥ２３に記載の単離された核酸。
Ｅ２５．前記アミノ酸置換のうち少なくとも１つが、保存的である、実施態様Ｅ２４に記載の単離された核酸。
Ｅ２６．前記アミノ酸置換のうち少なくとも１つが、非保存的である、実施態様Ｅ２４に記載の単離された核酸。
Ｆ１．発現ベクターである、実施態様Ｅ１〜Ｅ２６のいずれか一項に記載の単離された核酸。
Ｆ２．実施態様Ｅ１〜Ｆ１のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
Ｆ３．細菌である、実施態様Ｆ２に記載の細胞。
Ｆ４．酵母である、実施態様Ｆ２に記載の細胞。
Ｆ５．カンジダ種の酵母である、実施態様Ｆ４に記載の細胞。
Ｆ６．前記カンジダ種の酵母が、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイから選ばれる、実施態様Ｆ５に記載の細胞。
Ｆ７．前記カンジダ種の酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、実施態様Ｆ６に記載の細胞。
Ｆ８．ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母から選ばれる、実施態様Ｆ４に記載の細胞。
Ｆ９．Ｙ．リポリチカ、Ｐ．パストリス、Ｐ．メンブラニファシエンス、Ｐ．クルベリ、Ｐ．ギリエルモンジイ、Ｐ．ヒーディ、Ｐ．サブペリキュローサ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パストリアヌス、Ｓ．カールスベルゲンシス、Ｋ．ラクティスおよびＫ．マルキシアヌスから選ばれる、実施態様Ｆ８に記載の細胞。
Ｇ１．（ｉ）活性な改変された内因性アシル−ｃｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは活性な改変された内因性アシル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチド；（ｉｉ）エノイルｃｏ−Ａイソメラーゼ活性を変更する遺伝学的改変；および（ｉｉｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼ（ＤＣＲ）活性を変更する遺伝学的改変を含む遺伝子改変酵母であって、ここで該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記遺伝子改変酵母。
Ｇ２．前記供給材料が、少なくとも１種の長鎖不飽和脂肪酸を含む、実施態様Ｇ１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３．前記長鎖不飽和脂肪酸が、リノール酸またはリノレン酸である、実施態様Ｇ２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４．エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５．（ｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターの破壊、欠失もしくはノックアウトを含み、それによってエノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が低減または除去される、実施態様Ｇ４に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ６．前記遺伝学的改変が、エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ｇ５に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ７．エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を増加させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ８．（ｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増加したコピー数、または（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに挿入されて作動可能に連結したプロモーターを含む、実施態様Ｇ７に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ９．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、実施態様Ｇ５、Ｇ６およびＧ８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１０．前記酵母におけるエノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドのタイプの１種もしくはそれより多くまたは全ての前記活性が変更される、実施態様Ｇ１〜Ｇ９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１１．前記酵母が、２種のエノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドのタイプを含み、該ポリペプチドのタイプの一方または両方が変更される、実施態様Ｇ１０に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１２．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、カンジダ種の酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ｇ１〜Ｇ１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１３．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、配列番号３６７５、３６７７、３８００、３８０２、３８０３または３８０５のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ｇ１〜Ｇ１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１４．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、ヤロウイア属の酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ｇ１〜Ｇ１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１５．前記ヤロウイア種の酵母が、Ｙ．リポリチカの酵母である、実施態様Ｇ１４に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１６．前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、配列番号３８０４または３８０６のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ｇ１〜Ｇ１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１７．ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性を低減させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１８．（ｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドに作動可能に連結したプロモーターをコードするポリヌクレオチドの破壊、欠失もしくはノックアウトを含み、それによってジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性は低減または除去される、実施態様Ｇ１７に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ１９．前記遺伝学的改変が、ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、実施態様Ｇ１８に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２０．ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性を増加させる遺伝学的改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２１．（ｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増加したコピー数、または（ｉｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに挿入されて作動可能に連結したプロモーターを含む、実施態様Ｇ２０に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２２．前記ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、実施態様Ｇ１８、Ｇ１９およびＧ２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２３．前記酵母におけるジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドのタイプの１種もしくはそれより多くまたは全ての前記活性が変更される、実施態様Ｇ１〜Ｇ２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２４．前記酵母が、２種のジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドのタイプを含み、該ポリペプチドのタイプの一方または両方が変更される、実施態様Ｇ２３に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２５．前記ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性が、カンジダ種の酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ｇ１〜Ｇ２４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２６．前記ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性が、配列番号３７８９、３７９１、３７９２または３７９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ｇ１〜Ｇ２５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２７．前記ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性が、ヤロウイア属の酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ｇ１〜Ｇ２６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２８．前記ヤロウイア種の酵母が、Ｙ．リポリチカの酵母である、実施態様Ｇ２７に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ２９．前記ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性が、配列番号３７９４または３７９５のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、実施態様Ｇ１〜Ｇ２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３０．前記酵母が、遺伝子改変されたカンジダ種の酵母である、実施態様Ｇ１〜Ｇ２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３１．前記カンジダ種の酵母が、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイから選ばれる、実施態様Ｇ３０に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３２．前記カンジダ種の酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、実施態様Ｇ３０に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３３．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ４ポリペプチドである、実施態様Ｇ３０〜Ｇ３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３４．前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、配列番号３０の改変されたアミノ酸配列を含む、実施態様Ｇ３３に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３５．前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、８８、９０、９６、９８、９９、１００、１０２、１０３、３０２、３０９、３１０、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４および５０５から選ばれる１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ３３またはＧ３４に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３６．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ５ポリペプチドである、実施態様Ｇ３０〜Ｇ３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３７．前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、配列番号３２の改変されたアミノ酸配列を含む、実施態様Ｇ３６に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３８．前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８８、９３、９４、９５、９６、９８、１０２、２８４、２８７、２９０、２９１、２９２、２９４、２９５、４２８、４２９、４３６、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２および４６３から選ばれる１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ３６またはＧ３７に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ３９．前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、ＡＣＡＤ、ＶＬＣＡＤ、ＬＣＡＤ、ＭＣＡＤおよびＳＣＡＤポリペプチドから選ばれる、実施態様Ｇ１〜Ｇ３８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４０．前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、配列番号３６８５の改変されたアミノ酸配列を含む、実施態様Ｇ３９に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４１．前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、ＶＬＣＡＤの４６１位におけるアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ３９またはＧ４０に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４２．前記アミノ酸改変のうち少なくとも１つが、アミノ酸置換である、実施態様Ｇ３５、Ｇ３８およびＧ４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母、。
Ｇ４３．前記１つまたはそれより多くのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、保存的である、実施態様Ｇ４２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４４．前記１つまたはそれより多くのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、保存的ではない、実施態様Ｇ４２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４５．前記酵母が、遺伝子改変されたヤロウイア種の酵母である、実施態様Ｇ１〜Ｇ２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４６．前記ヤロウイア種の酵母が、Ｙ．リポリチカである、実施態様Ｇ４２に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４７．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ１ポリペプチド、ＰＯＸ２ポリペプチド、ＰＯＸ３ポリペプチド、ＰＯＸ４ポリペプチド、ＰＯＸ５ポリペプチドまたはＰＯＸ６ポリペプチドから選ばれる、実施態様Ｇ４５またはＧ４６に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４８．前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、配列番号３７７８〜３７８３から選ばれる、実施態様Ｇ４７に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ４９．前記酵母が、遺伝子改変されたピチア種の酵母である、実施態様Ｇ１〜Ｇ２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５０．前記ピチア種の酵母が、Ｐ．パストリス、Ｐ．メンブラニファシエンス、Ｐ．クルベリ、Ｐ．ギリエルモンジイ、Ｐ．ヒーディおよびＰ．サブペリキュローサから選ばれる、実施態様Ｇ４９に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５１．前記酵母が、遺伝子改変されたサッカロミセス種の酵母である、実施態様Ｇ１〜Ｇ２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５２．前記サッカロミセス種の酵母が、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パストリアヌスおよびＳ．カールスベルゲンシスから選ばれる、実施態様Ｇ５１に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５３．前記酵母が、遺伝子改変されたクルイベロマイセス種の酵母である、実施態様Ｇ１〜Ｇ２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５４．前記クルイベロマイセス種の酵母が、Ｋ．ラクティスおよびＫ．マルキシアヌスから選ばれる、実施態様Ｇ５３に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５５．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｎ末端のループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ５４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５６．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｄアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ５５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５７．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＤアルファへリックスとＥ’アルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ５６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５８．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素６〜９と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ５７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ５９．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素１０〜１２と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ５８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ６０．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｌアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ５９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ６１．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｃ末端からＬアルファへリックスへのループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ６０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ６２．前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＬアルファへリックスとＭアルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、実施態様Ｇ１〜Ｇ６１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ６３．前記アミノ酸改変が、アミノ酸置換を含む、実施態様Ｇ５５〜Ｇ６２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ６４．前記アミノ酸置換が、保存的である、実施態様Ｇ６３に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ６５．前記アミノ酸置換が、保存的ではない、実施態様Ｇ６３に記載の遺伝子改変酵母。
Ｇ６６．二酸を生産する方法であって、
（ａ）実施態様Ｇ１〜Ｇ６５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、植物油を含む供給材料と接触させることと；
（ｂ）該供給材料から二酸が生産される条件下で該酵母を培養することと
を含む、上記方法。
Ｇ６７．前記酵母から二酸を精製することを含む、実施態様Ｇ６６に記載の方法。
Ｈ１．二酸を生産する方法であって、
（ａ）実施態様Ａ１〜Ａ４４、Ｂ１〜Ｂ３３、Ｃ１〜Ｃ１５およびＧ１〜Ｇ６５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な不飽和植物性脂肪酸を含む供給材料と接触させることと；
（ｂ）該酵母を、該供給材料から１つまたはそれより多くの不飽和を含有する二酸が生産される条件下で培養することと；
（ｃ）１つまたはそれより多くの不飽和を水素化して除去することと
を含む、上記方法。
Ｈ２．前記不飽和植物性脂肪酸が、リノール酸またはリノレン酸である、実施態様Ｈ１に記載の方法。
Ｈ３．前記二酸が、ドデカン二酸またはセバシン酸である、実施態様Ｈ２に記載の方法。
本明細書で参照された各特許、特許出願、出版物および文書の全体は、参照により本明細書に組み入れられる。上記の特許、特許出願、出版物および文書の引用は、前述の全てのものが関連する従来技術であることを承認するものではないし、またこれらの出版物または文書の内容もしくは日付に関するいかなる承認も構成しない。
本技術の基本的な形態から逸脱することなく、前述のものに改変をなすことができる。１つまたはそれより多くの具体的な実施態様を参照しながら本技術を実質的に詳細に説明したが、当業者であれば、本出願において具体的に開示された実施態様を変化させることが可能であることをを認識しているものと予想され、これらの改変および向上は、本技術の範囲および本質の範囲内である。
本明細書で例証として説明した技術は、好適には、本明細書で具体的に開示されていない何らかの要素が存在しなくても実施できる。したがって、例えば、本明細書におけるいずれの場合においても、「〜を含む」、「本質的に〜からなる」、および「〜からなる」という用語のどれかが、他の２つの用語のいずれかによって置き換えられてもよい。採用された用語および表現は、限定のためではなく説明のための用語として使用され、このような用語および表現の使用は、示され説明された特色またはそれらの部分のあらゆる等価体を排除せず、特許請求された技術の範囲内で様々な改変が可能である。用語「a」または「an」は、それが修飾する要素が１つかまたは複数であることを指す可能性がある（例えば、「試薬（a reagent）」は、文脈上、明らかにその要素のうちの１つか、または１つより多くの要素のどちらかが記載されていない限り、１種またはそれより多くの試薬を意味し得る。用語「約」は、本明細書で使用される場合、基礎となるパラメーターの１０％以内（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）の値を指し、一連の値の始めにおける用語「約」の使用は、値のそれぞれを修飾する（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラムと１１０グラムとの間の重さを包含する可能性がある。さらに、値の列挙が本明細書で記載される場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、その一覧は、それらの全ての中間の値および小数値（例えば、５４％、８５．４％）を包含する。したがって、本発明の技術は、代表的な実施態様および任意選択の特色によって具体的に開示されたが、当業者により本明細書で開示された概念の改変およびバリエーションが用いられてもよく、このような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内とみなされることが理解されるものとする。
本技術の所定の実施態様は、以下に示す特許請求の範囲に記載される。

Claims (202)

  1. （ｉ）活性な改変された内因性アシル−ｃｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは活性な改変された内因性アシル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチド；（ｉｉ）天然のエノイルｃｏ−Ａイソメラーゼ活性を変更する遺伝学的改変；および（ｉｉｉ）天然のジエノイルＣｏＡレダクターゼ（ＤＣＲ）活性を変更する遺伝学的改変を含む、遺伝子改変されたヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipoytica）酵母であって、ここで該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記酵母。
  2. 活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む遺伝子改変酵母であって、該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記遺伝子改変酵母。
  3. 前記酵母が、遺伝子改変されたカンジダ種の酵母である、請求項２に記載の遺伝子改変酵母。
  4. 前記カンジダ種の酵母が、Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）およびＣ．ビスワナチイ（C. viswanathii）からなる群より選択される、請求項３に記載の遺伝子改変酵母。
  5. 前記カンジダ種の酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、請求項に記載の遺伝子改変酵母。
  6. 前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ４ポリペプチドである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  7. 前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、配列番号３０の改変されたアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の遺伝子改変酵母。
  8. 前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、８８、９０、９６、９８、９９、１００、１０２、１０３、３０２、３０９、３１０、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４および５０５からなる群より選択される１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、請求項６または７に記載の遺伝子改変酵母。
  9. 前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ５ポリペプチドである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  10. 前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、配列番号３２の改変されたアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の遺伝子改変酵母。
  11. 前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８８、９３、９４、９５、９６、９８、１０２、２８４、２８７、２９０、２９１、２９２、２９４、２９５、４２８、４２９、４３６、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２および４６３からなる群より選択される１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、請求項９または１０に記載の遺伝子改変酵母。
  12. 前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、ＡＣＡＤ、ＶＬＣＡＤ、ＬＣＡＤ、ＭＣＡＤおよびＳＣＡＤポリペプチドからなる群より選択される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  13. 前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、配列番号３６８５の改変されたアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子改変酵母。
  14. 前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、ＶＬＣＡＤの４６１位におけるアミノ酸改変を含む、請求項１２または１３に記載の遺伝子改変酵母。
  15. 前記アミノ酸改変のうち少なくとも１つが、アミノ酸置換である、請求項８、１１および１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  16. 前記１つまたはそれより多くのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、保存的である、請求項１５に記載の遺伝子改変酵母。
  17. 前記１つまたはそれより多くのアミノ酸置換のうち少なくとも１つが、保存的ではない、請求項１５に記載の遺伝子改変酵母。
  18. 前記酵母が、遺伝子改変されたヤロウイア種の酵母である、請求項２に記載の遺伝子改変酵母。
  19. 前記ヤロウイア種の酵母が、Ｙ．リポリチカ（Y. lipolytica）である、請求項１８に記載の遺伝子改変酵母。
  20. 前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ１ポリペプチド、ＰＯＸ２ポリペプチド、ＰＯＸ３ポリペプチド、ＰＯＸ４ポリペプチド、ＰＯＸ５ポリペプチドまたはＰＯＸ６ポリペプチドからなる群より選択される、請求項１８または１９に記載の遺伝子改変酵母。
  21. 前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、配列番号３７７８〜３７８３からなる群より選択される、請求項２０に記載の遺伝子改変酵母。
  22. 前記酵母が、遺伝子改変されたピチア種の酵母である、請求項２に記載の遺伝子改変酵母。
  23. 前記ピチア種の酵母が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、Ｐ．メンブラニファシエンス（P. membranifaciens）、Ｐ．クルベリ（P. kluyveri）、Ｐ．ギリエルモンジイ（P. guilliermondii）、Ｐ．ヒーディ（P. heedii）およびＰ．サブペリキュローサ（P. subpelliculosa）からなる群より選択される、請求項２２に記載の遺伝子改変酵母。
  24. 前記酵母が、遺伝子改変されたサッカロミセス種の酵母である、請求項２に記載の遺伝子改変酵母。
  25. 前記サッカロミセス種の酵母が、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．バヤヌス（S. bayanus）、Ｓ．パストリアヌス（S. pastorianus）およびＳ．カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis）からなる群より選択される、請求項２４に記載の遺伝子改変酵母。
  26. 前記酵母が、遺伝子改変されたクルイベロマイセス種の酵母である、請求項２に記載の遺伝子改変酵母。
  27. 前記クルイベロマイセス種の酵母が、Ｋ．ラクティス（K. lactis）およびＫ．マルキシアヌス（K. marxianus）からなる群より選択される、請求項２６に記載の遺伝子改変酵母。
  28. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｎ末端のループ中にアミノ酸改変を含む、請求項２〜２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  29. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｄアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、請求項２〜２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  30. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＤアルファへリックスとＥ’アルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  31. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素６〜９と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  32. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素１０〜１２と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、請求項２〜３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  33. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｌアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、請求項２〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  34. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｃ末端からＬアルファへリックスへのループ中にアミノ酸改変を含む、請求項２〜３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  35. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＬアルファへリックスとＭアルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、請求項２〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  36. 前記アミノ酸改変が、アミノ酸置換を含む、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  37. 前記アミノ酸置換が、保存的である、請求項３６に記載の遺伝子改変酵母。
  38. 前記アミノ酸置換が、保存的ではない、請求項３６に記載の遺伝子改変酵母。
  39. （ｉ）活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチド、および（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を変更する遺伝学的改変を含む、遺伝子改変酵母であって、ここで該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記遺伝子改変酵母。
  40. エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項２〜３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  41. （ｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターの破壊、欠失もしくはノックアウトを含み、それによってエノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が低減または除去される、請求項４０に記載の遺伝子改変酵母。
  42. 前記遺伝学的改変が、エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項４１に記載の遺伝子改変酵母。
  43. エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を増加させる遺伝学的改変を含む、請求項２〜４２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  44. （ｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増加したコピー数、または（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに挿入されて作動可能に連結したプロモーターを含む、請求項４３に記載の遺伝子改変酵母。
  45. 前記エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  46. 前記酵母におけるエノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドのタイプの１種もしくはそれより多くまたは全ての前記活性が変更される、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  47. 前記酵母が、２種のエノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドのタイプを含み、該ポリペプチドのタイプの一方または両方が変更される、請求項４６に記載の遺伝子改変酵母。
  48. 前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、カンジダ種の酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  49. 前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、配列番号３６７５、３６７７、３８００、３８０２、３８０３または３８０５のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  50. 前記酵母が、ヤロウイア属の酵母である、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  51. 前記酵母が、Ｙ．リポリチカの酵母である、請求項５０に記載の遺伝子改変酵母。
  52. 前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、ヤロウイア属の酵母またはＹ．リポリチカの酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、請求項５１に記載の遺伝子改変酵母。
  53. 前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、配列番号３８０４または３８０６のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、請求項５１に記載の遺伝子改変酵母。
  54. アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドの細胞質内の活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項２〜５３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  55. アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドのペルオキシソームの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項２〜５４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  56. 前記遺伝学的改変が、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項５４または５５に記載の遺伝子改変酵母。
  57. 前記遺伝学的改変が、ＡＣＳ１ポリペプチドまたはＡＣＳ２ポリペプチドを破壊する、請求項５６に記載の遺伝子改変酵母。
  58. 前記遺伝学的改変が、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  59. 前記遺伝学的改変が、ＦＡＴ１ポリペプチドを破壊する、請求項５８に記載の遺伝子改変酵母。
  60. 前記アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  61. 前記酵母が、カンジダ種の酵母である、請求項６０に記載の遺伝子改変酵母。
  62. 前記アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドが、配列番号８０、８２、８４、１５８および１５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の遺伝子改変酵母。
  63. 前記ＦＡＴ１ポリペプチドが、配列番号９０のアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の遺伝子改変酵母。
  64. ＰＸＡポリペプチドの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項２〜６３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  65. 前記遺伝学的改変が、ＰＸＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項６４に記載の遺伝子改変酵母。
  66. 前記ＰＸＡポリペプチドが、ＰＸＡ１ポリペプチドもしくはＰＸＡ２ポリペプチド、またはＰＸＡ１ポリペプチドおよびＰＸＡ２ポリペプチドである、請求項６４または６５に記載の遺伝子改変酵母。
  67. 前記ＰＸＡポリペプチドが、前記酵母にとって天然である、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  68. 前記酵母が、カンジダ種の酵母である、請求項６７に記載の遺伝子改変酵母。
  69. 前記ＰＸＡ１ポリペプチドが、配列番号９２のアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の遺伝子改変酵母。
  70. 前記ＰＸＡ２ポリペプチドが、配列番号９４のアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の遺伝子改変酵母。
  71. 活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドを含み、および活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含まない、請求項２〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  72. 活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドを含まず、および活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む、請求項２〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  73. 二酸を生産する方法であって、
    （１）請求項１〜７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な少なくとも１種の不飽和植物性脂肪酸を含有する供給材料からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料と接触させることと；
    （２）該供給材料から二酸が生産される条件下で該酵母を培養することと；
    （３）二酸を水素化して、炭素鎖中のあらゆる不飽和を除去することと
    を含む、上記方法。
  74. 前記不飽和植物性脂肪酸が、リノール酸またはリノレン酸である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記二酸が、ドデカン二酸またはセバシン酸である、請求項７４に記載の方法。
  76. 異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは異種アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む遺伝子改変酵母であって、該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記遺伝子改変酵母。
  77. 前記異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、天然ポリペプチドである、請求項７６に記載の遺伝子改変酵母。
  78. 前記異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、活性な改変されたポリペプチドである、請求項７６に記載の遺伝子改変酵母。
  79. 前記異種アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、天然ポリペプチドである、請求項７６に記載の遺伝子改変酵母。
  80. 前記異種アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、活性な改変されたポリペプチドである、請求項７６に記載の遺伝子改変酵母。
  81. 前記異種アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、配列番号５１〜配列番号３６７３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項７６または７７に記載の遺伝子改変酵母。
  82. 前記異種アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、配列番号３６７９〜３６８３、３６８６、３６８９、３６９１、３６９３、３６９５、３６９７、３６９９、３７０１および３７０３からなる群より選択される、請求項７６または７９に記載の遺伝子改変酵母。
  83. カンジダ種の酵母、ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母からなる群より選択される、請求項７６〜８２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  84. Ｃ．トロピカリス、Ｃ．ビスワナチイ、Ｙ．リポリチカ、Ｐ．パストリス、Ｐ．メンブラニファシエンス、Ｐ．クルベリ、Ｐ．ギリエルモンジイ、Ｐ．ヒーディ、Ｐ．サブペリキュローサ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パストリアヌス、Ｓ．カールスベルゲンシス、Ｋ．ラクティスおよびＫ．マルキシアヌスからなる群より選択される、請求項８３に記載の遺伝子改変酵母。
  85. エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項７６〜８４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  86. 前記遺伝学的改変が、エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項８５に記載の遺伝子改変酵母。
  87. 前記エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、請求項８５または８６に記載の遺伝子改変酵母。
  88. 前記酵母が、カンジダ種の酵母である、請求項８７に記載の遺伝子改変酵母。
  89. 前記エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドが、配列番号３６７５または３６７７のアミノ酸配列を含む、請求項８８に記載の遺伝子改変酵母。
  90. アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドの細胞質内の活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項７６〜８９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  91. アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドのペルオキシソームの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項７６〜９０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  92. 前記遺伝学的改変が、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項９０または９１に記載の遺伝子改変酵母。
  93. 前記遺伝学的改変が、ＡＣＳ１ポリペプチドまたはＡＣＳ２ポリペプチドを破壊する、請求項９２に記載の遺伝子改変酵母。
  94. 前記遺伝学的改変が、長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  95. 前記遺伝学的改変が、ＦＡＴ１ポリペプチドを破壊する、請求項９４に記載の遺伝子改変酵母。
  96. 前記アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドが、前記酵母にとって天然のポリペプチドである、請求項９０〜９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  97. 前記酵母が、カンジダ種の酵母である、請求項９６に記載の遺伝子改変酵母。
  98. 前記アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）ポリペプチドが、配列番号８０、８２、８４、１５８および１５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９７に記載の遺伝子改変酵母。
  99. 前記ＦＡＴ１ポリペプチドが、配列番号９０のアミノ酸配列を含む、請求項９６に記載の遺伝子改変酵母。
  100. ＰＸＡポリペプチドの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項７６〜９９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  101. 前記遺伝学的改変が、ＰＸＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項１００に記載の遺伝子改変酵母。
  102. 前記ＰＸＡポリペプチドが、ＰＸＡ１ポリペプチドもしくはＰＸＡ２ポリペプチド、またはＰＸＡ１ポリペプチドおよびＰＸＡ２ポリペプチドである、請求項１００または１０１に記載の遺伝子改変酵母。
  103. 前記ＰＸＡポリペプチドが、前記酵母にとって天然である、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  104. 前記酵母が、カンジダ種の酵母である、請求項１０３に記載の遺伝子改変酵母。
  105. 前記ＰＸＡ１ポリペプチドが、配列番号９２のアミノ酸配列を含む、請求項１０４に記載の遺伝子改変酵母。
  106. 前記ＰＸＡ２ポリペプチドが、配列番号９４のアミノ酸配列を含む、請求項１０４に記載の遺伝子改変酵母。
  107. 活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドを含み、および活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含まない、請求項７６〜１０６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  108. 活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドを含まず、および活性な改変された内因性アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドを含む、請求項７６〜１０６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  109. １種またはそれより多くの天然の内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドの活性を低減させる１種またはそれより多くの遺伝学的改変を含む、請求項１〜１０８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  110. 全ての天然の内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドの活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項１０９に記載の遺伝子改変酵母。
  111. 前記遺伝学的改変が、ベータ酸化活性を部分的にブロックする、請求項１０９または１１０に記載の遺伝子改変酵母。
  112. 前記二酸が、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸である、請求項１〜１１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  113. 前記二酸が、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０の二酸である、請求項１１２に記載の遺伝子改変酵母。
  114. 前記二酸が、Ｃ１０の二酸である、請求項１１３に記載の遺伝子改変酵母。
  115. 前記二酸が、Ｃ１２の二酸である、請求項１１３に記載の遺伝子改変酵母。
  116. 前記二酸が、Ｃ１８の二酸である、請求項１１３に記載の遺伝子改変酵母。
  117. 前記二酸が、不飽和を含有しない請求項１１２〜１１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  118. 前記二酸が、１つまたはそれより多くの不飽和を含有する、請求項１１２〜１１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  119. 前記二酸が、二酸の混合物中の主な二酸である、請求項１１２〜１１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  120. 前記供給材料が、実質的に純粋な油を含む、請求項１〜１１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  121. 前記供給材料が、複数の脂肪酸を含む、請求項１〜１２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  122. 前記供給材料が、石鹸原料を含む、請求項１２１に記載の遺伝子改変酵母。
  123. 前記供給材料が、脂肪酸蒸留物を含む、請求項１２１に記載の遺伝子改変酵母。
  124. 前記植物油が、パーム、パーム核、ヤシ、ダイズ、ベニバナ、キャノーラ、パーム、パーム核またはそれらの組み合わせからなる群より選択される植物由来である、請求項１〜１２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  125. 望ましい二酸を生産する方法であって、
    請求項１〜１２４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料と接触させることと；
    該酵母を、該供給材料から望ましい二酸が生産される条件下で培養することと
    を含む、上記方法。
  126. 前記望ましい二酸が、Ｃ４〜Ｃ２４の二酸である、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記望ましい二酸が、不飽和を含有しない、請求項１２５〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記望ましい二酸が、１つまたはそれより多くの不飽和を含有する、請求項１２５〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記望ましい二酸が、二酸の混合物中の主な二酸である、請求項１２５〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記供給材料が、実質的に純粋な油を含む、請求項１２５〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記供給材料が、複数の脂肪酸を含む、請求項１２５〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記供給材料が、石鹸原料を含む、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記供給材料が、脂肪酸蒸留物を含む、請求項１３１に記載の方法。
  134. 前記植物油が、パーム、パーム核、ヤシ、ダイズ、ベニバナ、キャノーラ、パーム、パーム核またはそれらの組み合わせからなる群より選択される植物由来である、請求項１２５〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 酵母からの改変されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
  136. 前記改変されたアシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｎ末端のループ中にアミノ酸改変を含む、請求項１３５に記載の単離された核酸。
  137. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｄアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、請求項１３５に記載の単離された核酸。
  138. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＤアルファへリックスとＥ’アルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、請求項１３５に記載の単離された核酸。
  139. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素６〜９と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、請求項１３５に記載の単離された核酸。
  140. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素１０〜１２と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、請求項１３５に記載の単離された核酸。
  141. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｌアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、請求項１３５に記載の単離された核酸。
  142. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｃ末端からＬアルファへリックスへのループ中にアミノ酸改変を含む、請求項１３５に記載の単離された核酸。
  143. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＬアルファへリックスとＭアルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、請求項１３５に記載の単離された核酸。
  144. 前記酵母が、カンジダ種の酵母、ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母からなる群より選択される、請求項１３５〜１４３のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  145. 前記酵母が、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．ビスワナチイ、Ｙ．リポリチカ、Ｐ．パストリス、Ｐ．メンブラニファシエンス、Ｐ．クルベリ、Ｐ．ギリエルモンジイ、Ｐ．ヒーディ、Ｐ．サブペリキュローサ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パストリアヌス、Ｓ．カールスベルゲンシス、Ｋ．ラクティスおよびＫ．マルキシアヌスからなる群より選択される、請求項１４４に記載の単離された核酸。
  146. 前記酵母が、Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイからなる群より選択されるカンジダ種の酵母である、請求項１４４に記載の単離された核酸。
  147. 前記酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、請求項１４６に記載の単離された核酸。
  148. 前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ４ポリペプチドである、請求項１４４〜１４７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  149. 前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、配列番号３０の改変されたアミノ酸配列を含む、請求項１４８に記載の単離された核酸。
  150. 前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、８８、９０、９６、９８、９９、１００、１０２、１０３、３０２、３０９、３１０、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４および５０５からなる群より選択される１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、請求項１４８または１４９に記載の単離された核酸。
  151. 前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ５ポリペプチドである、請求項１４４〜１４７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  152. 前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、配列番号３２の改変されたアミノ酸配列を含む、請求項１４１に記載の単離された核酸。
  153. 前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８８、９３、９４、９５、９６、９８、１０２、２８４、２８７、２９０、２９１、２９２、２９４、２９５、４３６、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２および４６３からなる群より選択される１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、請求項１５１または１５２に記載の単離された核酸。
  154. 請求項１３５〜１５３のいずれか一項に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
  155. 請求項１３５〜１５３のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
  156. Ｃ．トロピカリスおよびＣ．ビスワナチイからなる群より選択されるカンジダ種の酵母細胞である、請求項１５５に記載の宿主細胞。
  157. 前記カンジダ種の酵母が、遺伝子改変ＡＴＣＣ２０３３６酵母である、請求項１５６に記載の宿主細胞。
  158. ヤロウイア種の酵母、ピチア種の酵母、サッカロミセス種の酵母およびクルイベロマイセス種の酵母からなる群より選択される、請求項１５５に記載の宿主細胞。
  159. Ｙ．リポリチカ、Ｐ．パストリス、Ｐ．メンブラニファシエンス、Ｐ．クルベリ、Ｐ．ギリエルモンジイ、Ｐ．ヒーディ、Ｐ．サブペリキュローサ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．バヤヌス、Ｓ．パストリアヌス、Ｓ．カールスベルゲンシス、Ｋ．ラクティスおよびＫ．マルキシアヌスからなる群より選択される、請求項１５８に記載の宿主細胞。
  160. （ｉ）活性な改変された内因性アシル−ｃｏＡオキシダーゼのポリペプチドまたは活性な改変された内因性アシル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチド；（ｉｉ）エノイルｃｏ−Ａイソメラーゼ活性を変更する遺伝学的改変；および（ｉｉｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼ（ＤＣＲ）活性を変更する遺伝学的改変を含む遺伝子改変酵母であって、ここで該酵母は、植物油からの１種またはそれより多くの成分を含む供給材料から二酸を生産することが可能である、上記遺伝子改変酵母。
  161. 前記供給材料が、少なくとも１種の長鎖不飽和脂肪酸を含む、請求項１６０に記載の遺伝子改変酵母。
  162. 前記長鎖不飽和脂肪酸が、リノール酸またはリノレン酸である、請求項１６１に記載の遺伝子改変酵母。
  163. エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項１６０〜１６２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  164. （ｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターの破壊、欠失もしくはノックアウトを含み、それによってエノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が低減または除去される、請求項１６３に記載の遺伝子改変酵母。
  165. 前記遺伝学的改変が、エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項１６４に記載の遺伝子改変酵母。
  166. エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を増加させる遺伝学的改変を含む、請求項１６０〜１６５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  167. （ｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増加したコピー数、または（ｉｉ）エノイルＣｏＡイソメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに挿入されて作動可能に連結したプロモーターを含む、請求項１６６に記載の遺伝子改変酵母。
  168. 前記エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、配列番号３６７５、３６７７、３８００、３８０２、３８０３または３８０５のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、請求項１６０〜１６７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  169. エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、ヤロウイア属の酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、請求項１６０〜１６７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  170. 前記ヤロウイア種の酵母が、Ｙ．リポリチカの酵母である、請求項１６９に記載の遺伝子改変酵母。
  171. エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性が、配列番号３８０４または３８０６のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、請求項１６０〜１６７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  172. ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性を低減させる遺伝学的改変を含む、請求項１６０〜１７１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  173. （ｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドに作動可能に連結したプロモーターをコードするポリヌクレオチドの破壊、欠失もしくはノックアウトを含み、それによってジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性は低減または除去される、請求項１７２に記載の遺伝子改変酵母。
  174. 前記遺伝学的改変が、ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを破壊する、請求項１７３に記載の遺伝子改変酵母。
  175. ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性を増加させる遺伝学的改変を含む、請求項１６０〜１７１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  176. （ｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増加したコピー数、または（ｉｉ）ジエノイルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに挿入されて作動可能に連結したプロモーターを含む、請求項１７５に記載の遺伝子改変酵母。
  177. 前記ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性が、配列番号３７８９、３７９１、３７９２または３７９３のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、請求項１６０〜１７６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  178. 前記ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性が、ヤロウイア属の酵母中に存在するポリペプチドによってもたらされる、請求項１６０〜１７７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  179. 前記ヤロウイア種の酵母が、Ｙ．リポリチカの酵母である、請求項１７８に記載の遺伝子改変酵母。
  180. 前記ジエノイルＣｏＡレダクターゼ活性が、配列番号３７９４または３７９５のアミノ酸配列を含むポリペプチドによってもたらされる、請求項１６０〜１７７のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  181. 前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ４ポリペプチドである、請求項１６０〜１８０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  182. 前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、配列番号３０の改変されたアミノ酸配列を含む、請求項１８１に記載の遺伝子改変酵母。
  183. 前記ＰＯＸ４ポリペプチドが、８８、９０、９６、９８、９９、１００、１０２、１０３、３０２、３０９、３１０、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４および５０５からなる群より選択される１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、請求項１８１または１８２に記載の遺伝子改変酵母。
  184. 前記内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＰＯＸ５ポリペプチドである、請求項１６０〜１８０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  185. 前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、配列番号３２の改変されたアミノ酸配列を含む、請求項１８４に記載の遺伝子改変酵母。
  186. 前記ＰＯＸ５ポリペプチドが、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８８、９３、９４、９５、９６、９８、１０２、２８４、２８７、２９０、２９１、２９２、２９４、２９５、４２８、４２９、４３６、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２および４６３からなる群より選択される１つまたはそれより多くのアミノ酸位置におけるアミノ酸改変を含む、請求項１８４に記載の遺伝子改変酵母。
  187. 前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、ＡＣＡＤ、ＶＬＣＡＤ、ＬＣＡＤ、ＭＣＡＤおよびＳＣＡＤポリペプチドからなる群より選択される、請求項１６０〜１８６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  188. 前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼのポリペプチドが、配列番号３６８５の改変されたアミノ酸配列を含む、請求項１８７に記載の遺伝子改変酵母。
  189. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｎ末端のループ中にアミノ酸改変を含む、請求項１６０〜１８８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  190. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｄアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、請求項１６０〜１８９のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  191. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＤアルファへリックスとＥ’アルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、請求項１６０〜１９０のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  192. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素６〜９と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、請求項１６０〜１９１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  193. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、供給材料成分中の炭素１０〜１２と有効に接触するアミノ酸へのアミノ酸改変を含む、請求項１６０〜１９２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  194. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｌアルファへリックス中にアミノ酸改変を含む、請求項１６０〜１９３のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  195. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、Ｃ末端からＬアルファへリックスへのループ中にアミノ酸改変を含む、請求項１６０〜１９４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  196. 前記改変された内因性アシル−ＣｏＡオキシダーゼのポリペプチドが、ＬアルファへリックスとＭアルファへリックスとの間のループ中にアミノ酸改変を含む、請求項１６０〜１９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母。
  197. 二酸を生産する方法であって、
    （ａ）請求項１６０〜１９６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、植物油を含む供給材料と接触させることと；
    （ｂ）該供給材料から二酸が生産される条件下で該酵母を培養することと
    を含む、上記方法。
  198. 前記酵母から二酸を精製することを含む、請求項１９７に記載の方法。
  199. 二酸を生産する方法であって、
    （ａ）請求項１〜１２４および１６０〜１９８のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母を、該酵母により二酸に変換可能な不飽和植物性脂肪酸を含む供給材料と接触させることと；
    （ｂ）該酵母を、該供給材料から１つまたはそれより多くの不飽和を含有する二酸が生産される条件下で培養することと；
    （ｃ）１つまたはそれより多くの不飽和を水素化して除去することと
    を含む、上記方法。
  200. 前記不飽和植物性脂肪酸が、リノール酸またはリノレン酸である、請求項１９９に記載の方法。
  201. 請求項１９９〜２００のいずれか一項に記載の方法によって得られた二酸。
  202. 前記二酸が、ドデカン二酸またはセバシン酸である、請求項２０１に記載の二酸。
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