JP2021500915A - 組換え体ホストによる大環状ケトンの生産 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からジカルボン酸(DCA)を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(g)DCAからCoA活性化されたDCA(DCA−CoA)を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(h)DCAからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子;および/または
(i)DCA−CoAからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子;
を含み、
遺伝子の少なくとも1つは組換え体遺伝子である。
(a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;および
(g)DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
を含み、
組換え体ホスト細胞は1つ以上の大環状ケトン前駆体を生産する。
(a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(g)DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;および
(h)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
を含み、
組換え体ホスト細胞は1つ以上の大環状ケトンを生産する。
(a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(g)DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;および
(i)DCA−CoAからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
を含み、
組換え体ホスト細胞は1つ以上の大環状ケトンを生産する。
(a)アンテイソ脂肪酸は12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、または16−メチルオクタデカン酸であり;
(b)イソ脂肪酸はパルミチン酸であり;
(c)DCAはドデカン二酸、n−ドデカン二酸、テトラデカン二酸、n−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、n−ヘキサデカン二酸、n−メチルヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、n−オクタデカン二酸、n−メチルヘキサデカン酸、またはエイコサン酸であり;
(d)CoA活性化されたDCAはヘキサデカン二酸CoA、n−ヘキサデカン二酸CoA、n−メチルヘキサデカン二酸CoA、オクタデカン二酸CoA、またはn−オクタデカン二酸CoAである。
(a)アンテイソ脂肪酸は12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、または16−メチルオクタデカン酸であり;
(b)イソ脂肪酸はパルミチン酸であり;
(c)DCAはn−メチルヘキサデカン酸またはn−ヘキサデカン二酸であり;
(d)DCA−CoAはn−ヘキサデカン二酸CoAまたはn−メチルヘキサデカン二酸CoAである。
(a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドは、配列番号34または35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドは、配列番号36のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドは、配列番号37または38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドは、配列番号23または24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドは、配列番号25、26、27、28、29、30、31、または32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(f)アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドは、配列番号21、22、41、42、43、44、45、または46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(g)DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドは、配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(h)DCA−CoAからムスコンを合成することができるポリペプチド;および
(i)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチド。
(a)配列番号34または35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドと;
(b)配列番号36のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドと;
(c)配列番号37または38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドと;
(d)配列番号23または24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドと;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、または32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドと;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、または46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドと;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドと;
(h)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチドと;
を用い、
ポリペプチドの少なくとも1つは組換え体ポリペプチドである。
(a)配列番号34もしくは35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)配列番号36のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)配列番号37もしくは38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチルブタナールから2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)配列番号23もしくは24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、もしくは32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、もしくは46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(h)DCA−CoAからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;および/または
(i)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
によって形質転換されている。
(a)本明細書において開示される組換え体ホスト細胞、または植物由来のもしくは合成のL−イソロイシン、(S)−2−メチル酪酸、3−メチル−2−オキソペンタノエート、(S)−2−メチルブタナール、(S)−2−メチル酪酸、(S)−2−メチルブチリルCoA、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、DCA、もしくはDCA−CoAの全細胞バイオコンバージョンによって生産された、大環状ケトン、その1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと;
(b)微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース(YNB)、および/またはアミノ酸を含む補助栄養素と、
を含む。
(a)生産された大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、もしくはアンテイソ脂肪酸の少なくともある部分を得るために、上清を1つ以上の吸着樹脂と接触させるか;または
(b)生産された大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、もしくはアンテイソ脂肪酸の少なくともある部分を得るために、上清を1つ以上のイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させるか;または
(c)生産された大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、もしくはアンテイソ脂肪酸を結晶化もしくは抽出し;
それによって、生産された大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、もしくはアンテイソ脂肪酸を単離することと、
を含む。
(a)配列番号34もしくは35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチド;
(b)配列番号36のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチド;
(c)配列番号37もしくは38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する、(S)−2−メチルブタナールから2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチド;
(d)配列番号23もしくは24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有する、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチド;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、もしくは32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチド;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、もしくは46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチド;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチド;
(h)CoA活性化されたDCAからムスコンを合成することができるポリペプチド;および/または
(i)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチド;ならびに
植物由来のまたは合成のL−イソロイシン、(S)−2−メチル酪酸、3−メチル−2−オキソペンタノエート、(S)−2−メチルブタナール、(S)−2−メチル酪酸、(S)−2−メチルブチリルCoA、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、DCA、またはDCA−CoA;
を反応混合物に追加することを含み、
ポリペプチドの少なくとも1つは組換え体ポリペプチドであり;1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを合成する。
(a)配列番号21、22、41、42、43、44、45、および46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドと;
(b)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドと;
を含み、
ポリペプチドの少なくとも1つは組換え体ポリペプチドであり;1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを合成する。
(a)1つ以上の前駆体は、12−メチルテトラデカン酸、(S)−12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、(S)−14−メチルヘキサデカノエート、16−メチルオクタデカン酸、(S)−16−メチルオクタデカン酸、ドデカン二酸(ドデカン−1,12−二酸)、(E)−2−ドデセン二酸、n−ドデセン二酸、3−ドデセン二酸(二重結合は特定しない)、テトラデカン二酸(テトラデカン−1,14−二酸)、5−テトラデセン二酸、(5Z)−n−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸(ヘキサデカン−1,16−二酸)、7−ヘキサデセン二酸、(7Z)−n−ヘキサデセン二酸、オクタデカン二酸(オクタデカン−1,18−二酸)、9−オクタデセン二酸、(9Z)−n−オクタデセン二酸、エイコサン二酸、エイコサン酸、9−エイコセン二酸、(9Z)−ヘキサデカンジオイル補酵素A、cis−9−ヘキサデセンジオイルCoA、オクタデカンジオイル補酵素A、cis−9−オクタデセンジオイルCoA、ヘキサデカン二酸CoA、n−ヘキサデセン二酸CoA、オクタデカン二酸CoA、n−メチルヘキサデカン酸、n−メチルヘキサデカン酸CoA、(S)−2−メチルブタノイルCoA、(R)−3−メチルドデカン−1,12−二酸、(R)−3−メチルドデカン−1,12−ジオイルCoA、(R)−10−メチルドデカン−1,12−ジオイルCoA、(R)−+−3−メチルヘキサデカン酸、(R)−3−メチルテトラデカン−1,14−二酸、(R)−3−メチルテトラデカン−1,14−ジオイルCoA、(R)−12−メチルテトラデカン−1,14−ジオイルCoA、(R)−3−メチルヘキサデカン−1,16−二酸、(R)−3−メチルヘキサデカン−1,16−ジオイルCoA、(R)−14−メチルヘキサデカン−1,16−ジオイルCoA、(R)−3−メチルオクタデカン−1,18−ジオイルCoA、(R)−16−メチルオクタデカン−1,18−ジオイルCoA、(S)−2−メチルブチリルCoA、3−メチルヘキサデカン二酸、3−メチルヘキサデカン二酸CoA、またはn−オクタデセン二酸CoAを包含し;
(b)アンテイソ脂肪酸は12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、または16−メチルオクタデカン酸を包含し;
(c)イソ脂肪酸はパルミチン酸であり;
(d)DCAはドデカン二酸、n−ドデカン二酸、テトラデカン二酸、n−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、n−メチルヘキサデカン酸、n−ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、n−オクタデカン二酸、またはエイコサン酸であり;
(e)DCA−CoAはヘキサデカン二酸CoA、n−メチルヘキサデカン二酸CoA、n−ヘキサデカン二酸CoA、オクタデカン二酸CoA、またはn−オクタデカン二酸CoAである。
(a)アンテイソ脂肪酸は12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、または16−メチルオクタデカン酸であり;
(b)イソ脂肪酸はパルミチン酸であり;
(c)DCAはn−メチルヘキサデカン酸またはn−ヘキサデカン二酸であり;
(d)DCA−CoAはn−メチルヘキサデカン酸CoAまたはn−ヘキサデカン二酸CoAである。
(a)組換え体ホスト細胞によって生産された1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと;
(b)微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース(YNB)、および/またはアミノ酸を含む補助栄養素と;
を含み、
1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせは少なくとも1mg/細胞培養物のリットルの濃度で存在する。
(a)組換え体ホスト細胞によって生産された1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと;
(b)微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース(YNB)、および/またはアミノ酸を含む補助栄養素と;
を含み、
1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせは少なくとも1mg/細胞培養物のリットルの濃度で存在する。
(a)配列番号34もしくは35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチド;
(b)配列番号36のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチド;
(c)配列番号37もしくは38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する、(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチド;
(d)配列番号23もしくは24のアミノ酸配列に対して少なくとも65%の配列同一性を有する、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチド;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、もしくは32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチド;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、もしくは46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチド;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチド;
(h)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチド;および/または
(i)DCA−CoAからムスコンを合成することができるポリペプチド、
をコードする核酸分子をもまた提供する。
(a)配列番号34もしくは35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有し、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを;
(b)配列番号36のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを;
(c)配列番号37もしくは38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有し、(S)−2−メチルブタナールから2−メチル酪酸を;
(d)配列番号23もしくは24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有し、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、もしくは32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有し、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、および46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有し、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からDCAを;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、DCAからDCA−CoAを;
(h)DCA−CoAからムスコンを;および/または
(i)DCAからムスコンを、
生産することができる精製されたポリペプチドまたはその触媒活性部分をもまた提供する。
l−ムスコン生合成経路
1つの実施形態では、l−ムスコンおよびl−ムスコン前駆体生産はl−ムスコン生合成経路によって達成され得、これは(S)−2−メチル酪酸(methylbutyryl acid)CoAの生産を包含し、これがそれからアシルCoAリガーゼのプライミング単位または基質として用いられて、モノメチル分岐鎖脂肪酸(MMBCFA)またはアンテイソ脂肪酸分子を形成し得る(図1Aおよび1C〜1K参照)。MMBCFAの酸化、次に3−メチルヘキサデカン二酸などのジカルボン酸のCoA活性化は、CoA活性化されたジカルボン酸の生産をもたらす。爾後に、CoA活性化されたジカルボン酸の環化および脱炭酸によって、l−ムスコンが生産される(図1Aおよび1C〜1K参照)。
1つの実施形態では、ノルムスコンおよびノルムスコン前駆体生産は、パルミチン酸の生産を包含するノルムスコン生合成経路を含む組換え体ホストによって生産され得る。それから、パルミチン酸は酸化されてヘキサデカン二酸などのジカルボン酸を形成する。それから、ジカルボン酸中間体はCoA分子の付加によって活性化されてジカルボン酸CoA分子を形成する。終わりに、CoA活性化されたジカルボン酸の環化および脱炭酸によって、ノルムスコンが生産される(図1Bおよび1C〜1K参照)。
上に記載されているポリペプチドの機能的なホモログもまた、組換え体ホストによってムスコン、シベトン、および/またはその前駆体を生産することへの使用に好適である。機能的なホモログは、参照ポリペプチドに対する配列類似性を有し、かつ参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能(単数または複数)の1つ以上を実行するポリペプチドである。機能的なホモログおよび参照ポリペプチドは天然の存在するポリペプチドであり得、配列類似性は収斂または分岐進化的事象が原因であり得る。そのため、機能的なホモログは場合によっては文献中ではホモログまたはオーソログまたはパラログと呼称される。天然に存在する機能的なホモログのバリアント、例えば野生型コード配列の変異体によってコードされるポリペプチドは、それら自体が機能的なホモログであり得る。機能的なホモログは、ポリペプチドのコード配列の部位特異的変異導入によって、または異なる天然に存在するポリペプチドのコード配列からのドメインを組み合わせること(「ドメインスワッピング」)によってもまた作り出され得る。本明細書に記載される機能的なポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は公知であり、とりわけ、指向的進化技術、部位特異的変異導入技術、およびランダム変異導入技術を包含し、所望の様式でポリペプチドの比活性を増大させるか、基質特異性を変えるか、発現レベルを変えるか、細胞内の所在を変えるか、またはポリペプチド−ポリペプチド相互作用を改変するために有用であり得る。かかる改変されたポリペプチドは機能的なホモログと考えられる。場合によっては、用語「機能的なホモログ」は機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
本明細書に記載されるポリペプチドをコードする組換え体遺伝子は、ポリペプチドを発現することにとって好適な1つ以上の制御領域にセンスの向きで作動可能に連結されたそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物は複数の遺伝子産物をポリシストロン性mRNAから発現することができるので、それらの微生物では、所望の場合には、複数のポリペプチドが単一の制御領域のコントロール下で発現され得る。制御領域が配列の転写または翻訳を制御するために有効であるように制御領域およびコード配列が位置するときには、コード配列および制御領域は作動可能に連結されていると考えられる。典型的には、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位はモノシストロン性遺伝子の制御領域の下流の1および約50ヌクレオチドの間に位置する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え体ホスト細胞および方法は大環状ケトンおよび大環状ケトン前駆体の組成物を提供し得、組成物中の大環状ケトンの相対レベルは組換え体ホスト細胞中の大環状ケトンの相対レベルに対応し、例えば、組成物中の大環状ケトンの相対レベルは組換え体ホスト細胞中の大環状ケトンの相対レベルから10%、または9%、または8%、または7%、または6%、または5%、または4%、または3%、または2%、または1%以内である。
植物内で増殖させられる植物細胞を含む植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を包含するがこれらに限定されない組換え体ホストが、ムスコン、シベトン、および/またはそれらの前駆体の生産のためのポリペプチドを発現するために用いられ得る。
アガリクス(Agaricus)、ジベレラ(Gibberella)、およびファネロケーテ(Phanerochaete)spp.は可食の組成物の生産に普通に用いられる真菌属である。
アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)は二形性酵母であり(それは最高で42℃の温度まではパン酵母のような出芽酵母として増殖し、この閾値よりも上では、それは糸状形態で増殖する)、珍しい生化学的特徴を有する。それは幅広い範囲の基質によって増殖し得、硝酸を同化し得る。それは、天然プラスチックを生産し得る株の作出または環境サンプル中のエストロゲンのバイオセンサーの開発に首尾よく適用されている。
ロドトルラ(Rhodotorula)は有色の単細胞酵母である。油脂赤色酵母ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)はクルードなグリセロールから脂質およびカロテノイドを生産することが示されている(ゼンゲ(Saenge)ら著,2011年,プロセス・バイオケミストリー(Process Biochemistry)第46巻(1):p.210−8)。ロドトルラ・トルロイデス(Rhodotorula toruloides)株は改善されたバイオマスおよび脂質生産性のための効率的なフェッドバッチ発酵系であることが示されている(リー(Li)ら著,2007年,エンザイム・アンド・マイクロバイアルテクノロジー(Enzyme and Microbial Technology)第41巻:p.312−7)。
スキゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)は分裂酵母の属である。S.セレビシエ(cerevisiae)に類似に、スキゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)は真核細胞生物学の研究のモデル生物である。それはS.セレビシエ(cerevisiae)に対する進化距離比較を提供する。種はS.クリオフィルス(cryophilius)およびS.ポンベ(pombe)を包含するが、これらに限定されない(ホフマン(Hoffman)ら著,2015年,ジェネティクス(Genetics)第201巻(2):p.403−23参照)。
フミコラ(Humicola)は糸状菌の属である。種はH.アロパロネラ(alopallonella)およびH.シアメンシス(siamensis)を包含するが、これらに限定されない。
ブレタノマイセス(Brettanomyces)は酵母の非胞子形成性の属である。それはサッカロミケス(Saccharomycetaceae)科からであり、醸造およびワイン産業に普通に用いられる。ブレタノマイセス(Brettanomyces)は、ワイン、具体的には赤ワインの複雑さに寄与するいくつかの感覚系化合物を生産する。ブレタノマイセス(Brettanomyces)種はB.ブリュセレンシス(bruxellensis)およびB.クラウセニ(claussenii)を包含するが、これらに限定されない。例えばフーゲルサング(Fugelsang)ら著,1997年,「ワインの微生物学(Wine Microbiology)」参照。
トリコスポロン(Trichosporon)は真菌科の属である。トリコスポロン(Trichosporon)種は普通に土壌から単離される酵母であるが、ヒトおよび動物の皮膚微生物叢にもまた見いだされ得る。種は例えばT.アクアタイル(aquatile)、T.ベイゲリ(beigelii)、およびT.デルマティス(dermatis)を包含するが、これらに限定されない。
デバリオマイセス(Debaromyces)は子嚢菌酵母科の属であり、それらの種は耐塩性海洋種と表現される。種はD.ハンゼニイ(hansenii)およびD.ハンゼニウス(hansenius)を包含するが、これらに限定されない。
フィスコミトレラ(Physcomitrella)苔は、懸濁培養によって増殖させられるときには、酵母または他の真菌培養物に類似の特徴を有する。この属は植物二次代謝物質を生産するために用いられ得、これらは他の型の細胞によって生産することは困難であり得る。
サッカロマイセス(Saccharomyces)は合成生物学の幅広く用いられているシャシー生物であり、組換え体微生物プラットフォームとして用いられ得る。例えば、S.セレビシエ(cerevisiae)について利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、産物収量を向上させるための様々なモジュールの理論的設計を許す。組換え体微生物を作るための方法は公知である。サッカロマイセス(Saccharomyces)種の例はS.カステリ(castellii)を包含し、ナウモボザイマ・カステリ(Naumovozyma castelli)としてもまた公知である。
ザイゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)は酵母の属である。元々はサッカロマイセス(Saccharomyces)属に分類され、その後、それは再分類された。いくつかの種は商業的に用いられている食品保存技術に対して極めて耐性であるので、それは食品産業において幅広く公知である。種はZ.ビスポラス(bisporus)およびZ.シドリ(cidri)を包含するが、これらに限定されない(バーネット(Barnett)ら著,「酵母:特徴と同定(Yeasts: Characteristics and Identification)」,1983年参照)。
ジオトリカム(Geotrichum)は世界中の土壌、水、および下水に普通に見いだされる真菌である。多くの場合には、それは植物、穀物、および乳産物から同定される。種は、例えばG.カンジダム(candidum)およびG.クレバニ(klebahnii)を包含するが、これらに限定されない(カーマイケル(Carmichael)ら著,マイコロジカ(Mycologica),1957年,第49巻(6):p.820−830参照)。
カザフスタニア(Kazachstania)はサッカロミケス(Sacchromycetaceae)科の酵母属である。
トルラスポラ(Torulaspora)は酵母の属であり、種はT.フランシスカ(franciscae)およびT.グロボーサ(globosa)を包含するが、これらに限定されない。
アスペルギルス(Aspergillus)種、例えばA.オリゼー(oryzae)、A.ニガー(niger)、およびA.ソーヤ(sojae)は食品生産において幅広く用いられている微生物であり、組換え体微生物プラットフォームとしてもまた用いられ得る。A.ニデュランス(nidulans)、A.フミガタス(fumigatus)、A.オリゼー(oryzae)、A.クラバタス(clavatus)、A.フラバス(flavus)、A.ニガー(niger)、およびA.テレウス(terreus)のゲノムについては、ヌクレオチド配列が利用可能であり、フラックスを向上および産物収量を増大させるための内在性の経路の理論的設計および改変を許す。アスペルギルス(Aspergillus)については、トランスクリプトミクス研究およびプロテオミクス研究、ならびに代謝モデルが開発されている。
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)は二形性酵母であり(アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)参照)、半子嚢菌科に属する。ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の全ゲノムは公知である。ヤロウィア(Yarrowia)種は好気性であり、非病原性であると考えられている。ヤロウィア(Yarrowia)は疎水性基質(例えば、アルカン、脂肪酸、および油)を用いることにおいて効率的であり、糖によって増殖し得る。それは産業用途への高いポテンシャルを有し、油脂微生物である。ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolyptica)はその乾燥細胞重量のおよそ40%までの脂質含量を蓄積し得、脂質蓄積および再移動のモデル生物である。例えば、ニコー(Nicaud)著,2012年,イースト(Yeast)第29巻(10):p.409−18;ベオプーロス(Beopoulos)ら著,2009年,ビオシミー(Biochimie)第91巻(6):p.692−6;バンカー(Bankar)ら著,2009年,アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー(Applied Microbiology and Biotechnology)第84巻(5):p.847−65参照。
ロドスポリジウム・トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)は油脂酵母であり、脂質生産経路を人工するために有用である(例えばシュー(Zhu)ら著,2013年,ネイチャー・コミュニケーションズ(Nature Communications)第3巻:p.1112;アヘイトス(Ageitos)ら著,2011年,アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー(Applied Microbiology and Biotechnology)第90巻(4):p.1219−27参照)。
カンジダ・ボイジニ(Candida boidinii)はメチロトローフ酵母である(それはメタノールによって増殖し得る)。ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの他のメチロトローフ種のように、それは異種蛋白質を生産するための優れたプラットフォームを提供する。分泌される異種蛋白質のマルチグラム範囲での収量が報告されている。最近、コンピュテーション方法IPROは、カンジダ・ボイジニ(Candida boidinii)キシロースレダクターゼの補因子特異性をNADPHからNADHへと実験的に切り替える変異を予測した。例えば、マタノビッチ(Mattanovich)ら著,2012年,メソッズ・イン・モレキュラーバイオロジー(Methods in Molecular Biology)第824巻:p.329−58;コーリー(Khoury)ら著,2009年,プロテイン・サイエンス(Protein Science)第18巻(10):p.2125−38参照。
ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)はメチロトローフ酵母である(カンジダ・ボイジニ(Candida boidinii)参照)。さらにその上、それは幅広い範囲の他の基質によって増殖し得る;それは耐熱性であり、硝酸を同化し得る(また、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)参照)。それは、B型肝炎ワクチン、インスリン、およびC型肝炎の処置のためのインターフェロンアルファ−2aを生産するために、さらにその上、広範囲の工業用酵素に適用されている。例えば、シュー(Xu)ら著,2014年,バイロロジカ・シニカ(Virologica Sinica)第29巻(6):p.403−9参照。
カンジダ・クルーセイ(Candida krusei)(科学名イサチェンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis))はチョコレート生産に幅広く用いられる。C.クルーセイ(krusei)は、カカオ豆の苦味を取り除き、分解するために用いられる。チョコレート生産へのこの種の関わりに加えて、C.クルーセイ(krusei)は真菌院内病原体として免疫低下者に普通に見いだされる(マストロマリノ(Mastromarino)ら著,ニュー・マイクロバイオロジカ(New Microbiologica),第36巻:p.229−238;2013年参照)。
クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)はケフィアの生産によく適用される酵母である。それは、いくつかの糖、最も重要には牛乳および乳清中に存在するラクトースによって増殖し得る。それは、中でも、チーズを生産するためのキモシン(牛の胃に通常存在する酵素)を生産するために首尾よく適用されている。生産は発酵器によって40,000Lスケールで起こる。例えばファン・オーイェン(van Ooyen)ら著,2006年,FEMSイースト・リサーチ(FEMS Yeast Research)第6巻(3):p.381−92参照。
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)はメチロトローフ酵母である(カンジダ・ボイジニ(Candida boidinii)およびハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)参照)。それは普通にはコマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)ともまた言われる。それは異種蛋白質を生産するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォームの要素はキットとして利用可能であり、それは世界中で蛋白質を生産するためにアカデミアにおいて用いられている。複雑なヒトNグリカンを生産し得る株が人工されている(酵母グリカンはヒトに見いだされるものに類似であるが、同一ではない)。例えばピーライネン(Piirainen)ら著,2014年,ニュー・バイオテクノロジー(New Biotechnology)第31巻(6):p.532−7参照。
シェフェルソマイセス・スティピティス(Scheffersomyces stipitis)(ピキア・スティピティス(Pichia stipites)としてもまた公知)は半数体形態で見いだされるホモタリック酵母である。代替的な呼吸系からもたらされるその向上した呼吸能が原因で、S.セレビシエ(cerevisiae)の代わりに普通に用いられる(パピーニ(Papini)ら著,マイクロバイアル・セル・ファクトリーズ(Microbial Cell Factories),第11巻:p.136(2012年)参照)。
合成生物学の別の幅広く用いられているプラットフォーム生物、E.コーライ(coli)もまた組換え体微生物プラットフォームとして用いられ得る。サッカロマイセス(Saccharomyces)に類似に、E.コーライ(coli)について利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、産物収量を向上させるための様々なモジュールの理論的設計を許す。組換え体E.コーライ(coli)微生物を作るためには、サッカロマイセス(Saccharomyces)について上に記載されているものに類似の方法が用いられ得る。
LC−MS分析はウォーターズACQUITY−UPLC(超高速高分離液体クロマトグラフィー系)によるウォーターズACQUITY−UPLC(超高速高分離液体クロマトグラフィー系;ウォーターズ・コーポレーション(Waters Corporation))によって行った。UPLC−MSによる化合物の定量:5μlの抽出物を、質量検出器のウォーターズXevo−G2−XS−TとカップリングされたウォーターズAcquity超高速高分離液体クロマトグラフィー系(ミルフォード,マサチューセッツ,USA)に注入した。化合物の分離は50℃にキープされたウォーターズAcquity−UPLC(登録商標)HSS−T3−C18カラム(1.7μm,2.1mm×50mm)によって達成した。移動相は1%アセトニトリル、99%水、5mM酢酸アンモニウム(A)、および10%アセトニトリル、90%イソプロパノール、5mM酢酸アンモニウム(B)であった。1分以内の100%Aから90%Aの溶出勾配、次に0.5ml/minの流量での別の1分以内の0%Aへのrampを用いた。質量分析器はエレクトロスプレー源を備え、ネガティブモードで作動した。キャピラリー電圧は1.0kVであり;ソースは150℃にキープし、脱溶媒和温度は500℃であった。脱溶媒和およびコーンガス流はそれぞれ800l/hおよび100l/hであった。0.05Daの質量ウィンドウ内のそれぞれの[M−H]−イオンの抽出されたイオンクロマトグラムを計算することによって、目当ての化合物をトラッキングした。各化合物のピーク面積を計算し、正規の標準による直線状の検量線(0.03125mg/lから4mg/lの範囲である)を用いて化合物を定量した。
アジレント5975C−MSDを有しかつレステック(Restek)Rxi−5msカラム25m×250μm×0.25μmを備えたアジレント7890A−GC系を用いて、ペレットおよび上清の有機抽出物をガスクロマトグラフィー/質量分析(GC/MS)分析に付した)。GC分析に用いたプログラムは次の通りであった:45℃における3minの初期ホールド;5℃/minでの50℃へのrampおよび3minのホールド;100℃/minでの300℃へのrampおよび3minのホールド。ヘリウムをキャリアガスとして用い、7.14psiの定圧で流した。インジェクターは250℃に維持し、イオン源温度は230℃にセットした。注入体積はスプリットレスモードで1.0μlであった。脂肪酸アシルメチルエステル標準の保持時間および質量スペクトルとの比較ならびに/または公開されたデータ(NIST/EPA/NIH質量スペクトルライブラリーバージョン2.0g)との質量スペクトルの比較によって、該当のGCピークを同定した。データ分析はアジレントEnhanced−Data−AnalysisおよびMassFinder−4(ドクター・ホッホムート・サイエンティフィック・コンサルティング(Dr. Hochmuth Scientific Consulting))ソフトウェアを用いて行った。
インビボサンプル
DCAおよびDCA−CoA分子のインビボ生産後に、脂肪酸鎖長および濃度を分析した。1:50希釈の最終ΟD600を測定し、100OD単位相当の細胞を収穫した。500μlのメタノールをペレットに追加することと、この懸濁液を10分に渡って60℃でインキュベーションすることとによって、DCAおよびDCA−CoAを抽出した。4000gでの5分の遠心後に、上清をUPLC−MS分析に付した。
DCAおよびDCA−CoA分子のインビボ生産後に、脂肪酸鎖長および濃度を分析した。100μlメタノールを追加することによって100μlのインビトロアッセイサンプルを抽出した。上清を12000×gでの手早い遠心によって回収し、分析に先行して注入バイアル中に置いた。
いくつかの分岐および非分岐長鎖脂肪酸メチルエステル分子を生産した。生産された脂肪酸の型を決定するために、インビボサンプルに対する分析を行った。1:50希釈の最終OD600を測定し、100OD単位相当の酵母細胞を6000rpmでの10minの遠心によって収穫した。上清を捨てた。1mLの10%塩酸−メタノール(v/v)を残りの細胞ペレットに追加し、1minに渡ってボルテックスし、62℃で3時間に渡ってインキュベーションしてFAをメチル化した。室温への冷却後に、反応混合物を4minに渡って14krpmで遠心した。細胞ペレットを取り除き、爾後に、もたらされた脂肪酸メチルエステルを、1mlヘキサンによって、1minのボルテックスによって上清から抽出した(2回)。上側の有機相を取り除き、組み合わせ、1mlのMQ水によって洗浄し、硫酸ナトリウムによって乾燥した。
酵母細胞を例4に記載されている通り収穫した。ペレットおよび上清を短鎖脂肪酸(SCFA)の存在について分析した。ペレットをパラグラフ0005に記載されている通り処置した。上清をキープし、上清の1mLを1.1mLの10%塩酸−メタノール(v/v)によって希釈し、1minに渡ってボルテックスし、62℃で3時間に渡ってインキュベーションしてSCFAをメチル化した。爾後に、メチル化反応上清を、1mLヘキサンによって、1minのボルテックスによって抽出した(2回)。上側の有機相を取り除き、組み合わせ、1mLのMQ水によって洗浄し、硫酸ナトリウムによって乾燥した。穏やかな窒素流を用いて溶媒を蒸発させることによって、有機相中のSCFAメチルエステルを濃縮した。
シベトン、l−およびノルムスコン経路上のDCA形成はシベトン、l−およびノルムスコン最終産物の下流の生産を許す。P450モノオキシゲナーゼ(例えばC.マルトーサ(maltose)CYP52A3−A(配列番号47;41)、C.マルトーサ(maltosa)CYP52A9、C.ボンビコラ(bombicola)CYP52N1(配列番号48;42)、C.トロピカリス(tropicalis)CYP52A1(配列番号50;44)、およびC.トロピカリス(tropicalis)CYP52A17(配列番号51;45))ならびにそれらの対応するレダクターゼ(C.マルトーサ(maltose)NCP1、S.ボンビコラ(bombicola)NCP1、C.トロピカリス(tropicalis)NCP1((配列番号52;46)、およびS.ボンビコラ(bombicola)CPR(配列番号49;43))をコードする異なる種特異的な遺伝子の共発現を有する、自律複製配列(ARS)および酵母セントロメア(CEN)を含有するプラスミド(ARS−CENプラスミド)によって、組換え体SC288C酵母株を共形質転換した(表1)。遺伝子は、恒常的プロモーターのグリセロール3リン酸デヒドロゲナーゼ1、GPD1のコントロール下にあった。
pox1Δ0欠失、野生型、キサンチンデヒドロゲナーゼ(XDH)mut−GPD1−CYClt、またはpox1Δ0欠失およびXDHmut−GPD1−CYCltを有するコントロール酵母株では、DCA形成は複数の実験のうち単一の事例において検出限界ぎりぎりで観察された。この結果は偽陽性であると思われ、偽陽性の読取値よりも200倍多大なDCAを一貫して生産する株と比較して有意だとは考えられない。最も高いDCA16:0形成はXDHmut−GPD1−CYCltを発現する酵母株で見られ(2.7μg/gCDW)、他の条件では、検出不可能な量のDCAが観察された(図2)。
表1のP450モノオキシゲナーゼをコードする様々な遺伝子の発現は、異なるレベルのDCA形成をもたらした。pox1Δ0欠失ならびにC.トロピカリス(tropicalis)CYP52遺伝子(CYP52A17またはCYP52A1)およびC.トロピカリス(tropicalis)_CPR遺伝子を有する人工された酵母によるDCA形成は、最も高い量のDCA14:0、DCA16:0(ヘキサデカン二酸)、およびDCA16:1脂肪酸を生産した。他のDCA;DCA18:0(オクタデカン二酸)およびDCA18:1(オクタデセン二酸)の発現はほとんどから全くまでなかった。pox1Δ0欠失を有しかつCYP52A17およびその対応するレダクターゼを発現する酵母株は、5μg/gCDW未満のDCA14:0、DCA16:0、およびDCA16:1を生産した。他の条件では、検出不可能な量のDCAが見られた(図3)。
POX1野生型またはpox1Δ0欠失、S.ボンビコラ(bombicola)CYP52遺伝子(CYP52N1)およびS.ボンビコラ(bombicola)_CPRを有する人工された酵母によるDCA形成は、DCA14:0、DCA16:0、DCA16:1、DCA18:0、DCA18:1の生産をもたらした。pox1Δ0の欠失ありおよびなしの人工された酵母株は両方とも、DCA16:0の増大した生産(それぞれ〜40μg/CDWおよび32μg/CDW)、次にDCA16:1の形成(それぞれ〜28μg/CDWおよび〜20μg/CDW)を見せた。両方の酵母株によるDCA14:0の形成は〜5μg/CDWであった(図4)。
POX1野生型またはpox1Δ0欠失、C.マルトーサ(maltosa)CYP52遺伝子(CYP52A3またはCYP52A9)、およびC.マルトーサ(maltosa)_CPRを有する人工された酵母によるDCA形成は、DCA14:0、DCA16:0、DCA16:1、DCA18:0、DCA18;1の生産をもたらした。DCA16:0は各条件において最も高かった。CYP52A3およびCm_CPRの共発現は〜300μg/gCDWのDCA16:0を生産し、CYP52A9およびCm_CPRは〜500μg/gCDWを生産した。pox1Δ0欠失下においては、CYP52A3およびCm_CPRの共発現は〜100μg/gCDWのDCA16:0の優位な形成をもたらし、CYP52A9およびCm_CPRの共発現は〜400μg/gCDWのDCA16:0の形成をもたらした(図5)。
様々なDCAを生産するために、DCA経路を、酵母、例えばS.セレビシエ(cerevisiae)にインテグレーションし得る。DCA16:0(ヘキサデカン二酸)の生産はムスコンの下流生産のために必要とされる上流分子である。
l−およびノルムスコン生産の形成のための基質として利用されるためには、ジカルボン酸分子はCoA活性化されなければならない。ヘキサデカン二酸からのヘキサデカン二酸CoAの合成はCoA分子による活性化を要求する。
CoAリガーゼ活性による2−メチル酪酸からの(S)−2−メチルブチリルCoAの形成は、下流の脂肪酸シンターゼ(FAS)活性のためのプライミング単位または出発材料を許す。
天然にはS.セレビシエ(cerevisiae)に内在的に存在しない2−(S)−メチルブチリルCoAを生産する能力は、fas1欠失バックグラウンドにおいてこれらの遺伝子を安定に発現する酵母株を人工することによって達成された。FAS1の不在は、酵母のモノメチル分岐脂肪酸組み立て経路を確立するための追加の遺伝子のさらなる改変およびインテグレーションのための第1ステップであった。
奇数鎖脂肪酸合成の経路のためのプライミング単位として2−(S)−メチルブチリルCoAを作出するfas1欠失バックグラウンドを有する酵母株を、インシリコ設計されたS.セレビシエ(cerevisiae)脂肪酸シンターゼ変異体を持ついくつかのプラスミドの導入のために選んだ。FAS1遺伝子の改変を行って、代替的なプライミング単位の最も良好な受容性および結合特性とFFA−C17:0を生産する能力とを評価した。
MMBCFAを生産するために、DCA生産経路をS.セレビシエ(cerevisiae)にインテグレーションした。P450モノオキシゲナーゼ/レダクターゼ複合体およびfas1変異体の組み合わせを酵母株に組み込んで、有意な量のDCAを生産した。
上流のムスコン中間体DCA16:0−CoAの増大した生産は最終産物ムスコンの向上した生産をもたらし得る。
S.セレビシエ(cerevisiae)には、脂肪酸の搬入、活性化、および代謝に関わる4つの内在性の長鎖アシルCoAシンターゼ酵素がある。内在性の酵母アシルCoAシンターゼを過剰発現する酵母によるDCAのCoA活性化を決定することは、異なる量のDCA16:0−CoAをもたらした。
(R)および(S)−2−メチル酪酸などの分岐短鎖脂肪酸はムスコンを生産するための出発分子として用いられ得るので、追加の定性およびキラル分析を行って、どのキラルな2−メチル酪酸サンプルが最も高い量の2−メチル酪酸エチルエステルを生産するかを同定した。
ジカルボン酸からムスコンなどの大環状化合物を生産するためのいくつかの方法が公知であり、例えば照沼ら(ザ・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(The Journal of Organic Chemistry),Vol.52,No.8,1987年,p.1630−1632)に記載されている。1つのかかる方法はディークマン縮合反応である。縮合反応の具体的なジカルボン酸基質の慎重な提供または選択によって、価値ある大環状ケトンの様々な種が生産され得る。
Claims (35)
- 1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトンを生産する組換え体ホスト細胞であって:
(a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からジカルボン酸(DCA)を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(g)DCAからCoA活性化されたDCA(DCA−CoA)を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(h)DCAからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子;および/または
(i)DCA−CoAからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子;
を含み、
遺伝子の少なくとも1つが組換え体遺伝子である、組換え体ホスト細胞。 - (a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;および
(g)DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
を含み、
組換え体ホスト細胞が1つ以上の大環状ケトン前駆体を生産する、
請求項1に記載の組換え体ホスト細胞。 - (a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(g)DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;および
(h)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
を含み、
組換え体ホスト細胞が1つ以上の大環状ケトンを生産する、
請求項1に記載の組換え体ホスト細胞。 - (a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(g)DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;および
(i)DCA−CoAからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
を含み、
組換え体ホスト細胞が1つ以上の大環状ケトンを生産する、
請求項1に記載の組換え体ホスト細胞。 - 組換え体ホスト細胞が、1つ以上のムスコン前駆体を酸化することができるポリペプチドをコードする遺伝子座位の欠失を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞。
- 1つ以上のムスコン前駆体を酸化することができるポリペプチドをコードする遺伝子座位が、ペルオキシソームアシルCoAオキシダーゼ(POX1)遺伝子を含む、請求項5に記載の組換え体ホスト細胞。
- (a)アンテイソ脂肪酸が12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、または16−メチルオクタデカン酸であり;
(b)イソ脂肪酸がパルミチン酸であり;
(c)DCAがドデカン二酸、n−ドデカン二酸、テトラデカン二酸、n−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、n−ヘキサデカン二酸、n−メチルヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、n−オクタデカン二酸、n−メチルヘキサデカン酸、またはエイコサン酸であり;
(d)CoA活性化されたDCAがヘキサデカン二酸CoA、n−ヘキサデカン二酸CoA、n−メチルヘキサデカン二酸CoA、オクタデカン二酸CoA、またはn−オクタデカン二酸CoAである、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞。 - (a)アンテイソ脂肪酸が12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、または16−メチルオクタデカン酸であり;
(b)イソ脂肪酸がパルミチン酸であり;
(c)DCAがn−メチルヘキサデカン酸またはn−ヘキサデカン二酸であり;
(d)DCA−CoAがn−ヘキサデカン二酸CoAまたはn−メチルヘキサデカン二酸CoAである、
請求項1〜7のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞。 - (S)−2−メチル酪酸が少なくとも80%eeの光学純度を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞。
- (a)L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドが、配列番号34または35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(b)3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドが、配列番号36のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(c)(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドが、配列番号37または38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(d)(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドが、配列番号23または24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(e)(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドが、配列番号25、26、27、28、29、30、31、または32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(f)アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドが、配列番号21、22、41、42、43、44、45、または46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(g)DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドが、配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドを含み;
(h)CoA活性化されたDCAからムスコンを合成することができるポリペプチド;
(i)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチド、
請求項1〜9のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞。 - 1つ以上の大環状ケトン前駆体が、12−メチルテトラデカン酸、(S)−12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、(S)−14−メチルヘキサデカノエート、16−メチルオクタデカン酸、(S)−16−メチルオクタデカン酸、ドデカン二酸(ドデカン−1,12−二酸)、(E)−2−ドデセン二酸、n−ドデセン二酸、3−ドデセン二酸(二重結合は特定しない)、テトラデカン二酸(テトラデカン−1,14−二酸)、5−テトラデセン二酸、(5Z)−n−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸(ヘキサデカン−1,16−二酸)、7−ヘキサデセン二酸、(7Z)−n−ヘキサデセン二酸、オクタデカン二酸(オクタデカン−1,18−二酸)、9−オクタデセン二酸、(9Z)−n−オクタデセン二酸、エイコサン二酸、エイコサン酸、9−エイコセン二酸、(9Z)−ヘキサデカンジオイル補酵素A、cis−9−ヘキサデセンジオイルCoA、オクタデカンジオイル補酵素A、cis−9−オクタデセンジオイルCoA、ヘキサデカン二酸CoA、n−ヘキサデセン二酸CoA、オクタデカン二酸CoA、(S)−2−メチルブタノイルCoA、(R)−3−メチルドデカン−1,12−二酸、(R)−3−メチルドデカン−1,12−ジオイルCoA、(R)−10−メチルドデカン−1,12−ジオイルCoA、(R)−3−メチルテトラデカン−1,14−二酸、(R)−(+)−3−メチルヘキサデカン酸、(R)−3−メチルテトラデカン−1,14−ジオイルCoA、(R)−12−メチルテトラデカン−1,14−ジオイルCoA、(R)−3−メチルヘキサデカン−1,16−二酸、(R)−3−メチルヘキサデカン−1,16−ジオイルCoA、(R)−14−メチルヘキサデカン−1,16−ジオイルCoA、(R)−3−メチルオクタデカン−1,18−ジオイルCoA、(R)−16−メチルオクタデカン−1,18−ジオイルCoA、(S)−2−メチルブチリルCoA、3−メチルヘキサデカン二酸、3−メチルヘキサデカン二酸CoA、またはn−オクタデセン二酸CoAである、請求項1、2、または5〜10のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞。
- 1つ以上の大環状ケトンがl−ムスコン、ノルムスコン、またはシベトンである、請求項1または3〜10のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞。
- 組換え体ホスト細胞が植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または細菌細胞である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞。
- 遺伝子が発現される条件下で細胞培養物によって請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞を培養することを含み;1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが組換え体ホスト細胞によって生産される、
細胞培養物によって1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、ジカルボン酸(DCA)、CoA活性化されたDCA(DCA−CoA)、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを生産する方法。 - 遺伝子が恒常的に発現されるおよび/または遺伝子の発現が誘導される、請求項14に記載の方法。
- 組換え体ホスト細胞が発酵器によってある温度である期間に渡って増殖させられ、温度および期間は1つ以上の大環状ケトン前駆体および/またはその1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせの生産を容易化する、請求項14または15のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞の細胞培養物による植物由来のまたは合成のL−イソロイシン、(S)−2−メチル酪酸、3−メチル−2−オキソペンタノエート、(S)−2−メチルブタナール、(S)−2−メチル酪酸、(S)−2−メチルブチリルCoA、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、DCA、またはDCA−CoAの全細胞バイオコンバージョンを含み、
(a)配列番号34または35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドと;
(b)配列番号36のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドと;
(c)配列番号37または38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドと;
(d)配列番号23または24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドと;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、または32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドと;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、または46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドと;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドと;
(h)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチドと;
を用い、
ポリペプチドの少なくとも1つが組換え体ポリペプチドである、
1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、ジカルボン酸(DCA)、CoA活性化されたDCA(DCA−CoA)、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを生産する方法。 - 1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが、透過処理された組換え体ホスト細胞によって生産され、これが:
(a)配列番号34もしくは35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(b)配列番号36のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(c)配列番号37もしくは38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチルブタナールから2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(d)配列番号23もしくは24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、もしくは32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、もしくは46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;
(h)DCA−CoAからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子;および/または
(i)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
によって形質転換されている、
請求項17に記載の方法。 - 細胞培養物が:
(a)請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞、または植物由来のもしくは合成のL−イソロイシン、(S)−2−メチル酪酸、3−メチル−2−オキソペンタノエート、(S)−2−メチルブタナール、(S)−2−メチル酪酸、(S)−2−メチルブチリルCoA、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、DCA、もしくはDCA−CoAの全細胞バイオコンバージョンによって生産された、大環状ケトン、その1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと;
(b)微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース(YNB)、および/またはアミノ酸を含む補助栄養素と、
を含む、
請求項14〜18のいずれか1項に記載の方法。 - (S)−2−メチル酪酸が少なくとも80%eeの光学純度を有する、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、1つ以上の大環状ケトン前駆体および/またはその1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを単離することを含む、請求項14〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 単離ステップが、生産された大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、もしくはアンテイソ脂肪酸を含む上清を得るために細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離することと:
(a)生産された大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、もしくはアンテイソ脂肪酸の少なくともある部分を得るために、上清を1つ以上の吸着樹脂と接触させるか;または
(b)生産された大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、もしくはアンテイソ脂肪酸の少なくともある部分を得るために、上清を1つ以上のイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させるか;または
(c)生産された大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、もしくはアンテイソ脂肪酸を結晶化もしくは抽出し;
それによって、生産された大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、もしくはアンテイソ脂肪酸を単離することと、
を含む、請求項21に記載の方法。 - さらに、大環状ケトン、その1つ以上の大環状前駆体、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸単独、またはそれらの組成物を細胞培養物から回収することを含む、請求項14〜20のいずれか1項に記載の方法。
- (a)配列番号34もしくは35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチド;
(b)配列番号36のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチド;
(c)配列番号37もしくは38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する、(S)−2−メチルブタナールから2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチド;
(d)配列番号23もしくは24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有する、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチド;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、もしくは32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチド;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、もしくは46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチド;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチド;
(h)CoA活性化されたDCAからムスコンを合成することができるポリペプチド;および/または
(i)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチド;ならびに
植物由来のまたは合成のL−イソロイシン、(S)−2−メチル酪酸、3−メチル−2−オキソペンタノエート、(S)−2−メチルブタナール、(S)−2−メチル酪酸、(S)−2−メチルブチリルCoA、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、DCA、またはDCA−CoA;
を反応混合物に追加し、ポリペプチドの少なくとも1つが組換え体ポリペプチドであることと;
1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを合成することと、
を含む、
1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、ジカルボン酸(DCA)、CoA活性化されたDCA(DCA−CoA)、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを生産するためのインビトロの方法。 - 反応混合物が:
(a)配列番号21、22、41、42、43、44、45、および46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチドと;
(b)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチドと;
を含み、
ポリペプチドの少なくとも1つが組換え体ポリペプチドであり;1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを合成する、
請求項24に記載の方法。 - 1つ以上の大環状ケトンがl−ムスコン、ノルムスコン、またはシベトンである、請求項14〜25のいずれか1項に記載の方法。
- (a)1つ以上の前駆体が、12−メチルテトラデカン酸、(S)−12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、(S)−14−メチルヘキサデカノエート、16−メチルオクタデカン酸、(S)−16−メチルオクタデカン酸、ドデカン二酸(ドデカン−1,12−二酸)、(E)−2−ドデセン二酸、n−ドデセン二酸、3−ドデセン二酸(二重結合は特定しない)、テトラデカン二酸(テトラデカン−1,14−二酸)、5−テトラデセン二酸、(5Z)−n−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸(ヘキサデカン−1,16−二酸)、7−ヘキサデセン二酸、(7Z)−n−ヘキサデセン二酸、オクタデカン二酸(オクタデカン−1,18−二酸)、9−オクタデセン二酸、(9Z)−n−オクタデセン二酸、エイコサン二酸、エイコサン酸、9−エイコセン二酸、(9Z)−ヘキサデカンジオイル補酵素A、cis−9−ヘキサデセンジオイルCoA、オクタデカンジオイル補酵素A、cis−9−オクタデセンジオイルCoA、ヘキサデカン二酸CoA、n−ヘキサデセン二酸CoA、オクタデカン二酸CoA、n−メチルヘキサデカン酸、n−メチルヘキサデカン酸CoA、(S)−2−メチルブタノイルCoA、(R)−3−メチルドデカン−1,12−二酸、(R)−3−メチルドデカン−1,12−ジオイルCoA、(R)−10−メチルドデカン−1,12−ジオイルCoA、(R)−+−3−メチルヘキサデカン酸、(R)−3−メチルテトラデカン−1,14−二酸、(R)−3−メチルテトラデカン−1,14−ジオイルCoA、(R)−12−メチルテトラデカン−1,14−ジオイルCoA、(R)−3−メチルヘキサデカン−1,16−二酸、(R)−3−メチルヘキサデカン−1,16−ジオイルCoA、(R)−14−メチルヘキサデカン−1,16−ジオイルCoA、(R)−3−メチルオクタデカン−1,18−ジオイルCoA、(R)−16−メチルオクタデカン−1,18−ジオイルCoA、(S)−2−メチルブチリルCoA、3−メチルヘキサデカン二酸、3−メチルヘキサデカン二酸CoA、またはn−オクタデセン二酸CoAを包含し;
(b)アンテイソ脂肪酸が12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、または16−メチルオクタデカン酸であり;
(c)イソ脂肪酸がパルミチン酸であり;
(d)DCAがドデカン二酸、n−ドデカン二酸、テトラデカン二酸、n−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、n−メチルヘキサデカン酸、n−ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、n−オクタデカン二酸、またはエイコサン酸であり;
(e)DCA−CoAがヘキサデカン二酸CoA、n−メチルヘキサデカン二酸CoA、n−ヘキサデカン二酸CoA、オクタデカン二酸CoA、またはn−オクタデカン二酸CoAである、
請求項14〜26のいずれか1項に記載の方法。 - (a)アンテイソ脂肪酸が12−メチルテトラデカン酸、14−メチルヘキサデカン酸、または16−メチルオクタデカン酸であり;
(b)イソ脂肪酸がパルミチン酸であり;
(c)DCAがn−メチルヘキサデカン酸またはn−ヘキサデカン二酸であり;
(d)DCA−CoAがn−メチルヘキサデカン酸CoAまたはn−ヘキサデカン二酸CoAである、
請求項27に記載の方法。 - 組換え体ホスト細胞または全細胞が植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または細菌細胞を含む、請求項14〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞培養物が、さらに:
(a)組換え体ホスト細胞によって生産された1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと;
(b)微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース(YNB)、および/またはアミノ酸を含む補助栄養素と;
を含み、
1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが少なくとも1mg/細胞培養物のリットルの濃度で存在する、
請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞を含む細胞培養物。 - (a)組換え体ホスト細胞によって生産された1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと;
(b)微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース(YNB)、および/またはアミノ酸を含む補助栄養素と;
を含み、
1つ以上の大環状ケトン前駆体および/または1つ以上の大環状ケトン、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが少なくとも1mg/細胞培養物のリットルの濃度で存在する、
細胞培養物中の増殖した請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞からの細胞培養物ライセート。 - (a)配列番号34もしくは35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチド;
(b)配列番号36のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを合成することができるポリペプチド;
(c)配列番号37もしくは38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する、(S)−2−メチルブタナールから(S)−2−メチル酪酸を合成することができるポリペプチド;
(d)配列番号23もしくは24のアミノ酸配列に対して少なくとも65%の配列同一性を有する、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを合成することができるポリペプチド;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、もしくは32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチド;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、もしくは46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からDCAを合成することができるポリペプチド;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、DCAからDCA−CoAを合成することができるポリペプチド;
(h)DCAからムスコンを合成することができるポリペプチド;および/または
(i)DCA−CoAからムスコンを合成することができるポリペプチド、
をコードする核酸分子。 - 核酸分子がcDNAである、請求項32に記載の核酸分子。
- (a)配列番号34もしくは35のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有し、L−イソロイシンから3−メチル−2−オキソペンタノエートを;
(b)配列番号36のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、3−メチル−2−オキソペンタノエートから(S)−2−メチルブタナールを;
(c)配列番号37もしくは38のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有し、(S)−2−メチルブタナールから2−メチル酪酸を;
(d)配列番号23もしくは24のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも65%の配列同一性を有し、(S)−2−メチル酪酸から(S)−2−メチルブチリルCoAを;
(e)配列番号25、26、27、28、29、30、31、もしくは32のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有し、(S)−2−メチルブチリルCoAからアンテイソ脂肪酸を;
(f)配列番号21、22、41、42、43、44、45、および46のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列同一性を有し、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からDCAを;
(g)配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、DCAからDCA−CoAを;
(h)DCA−CoAからムスコンを;および/または
(i)DCAからムスコンを、
生産することができる精製されたポリペプチドまたはその触媒活性部分。 - 請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換え体ホスト細胞または請求項14〜29のいずれか1項に記載の方法によって生産される、大環状ケトン、1つ以上の大環状ケトン前駆体、DCA、DCA−CoA、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを含む組成物。
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