CN111699170B - 羧酸的提取 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从含水介质中提取羧酸和/或其酯的方法,该方法包括:(a)使含水介质中的羧酸和/或其酯与至少一种提取介质接触足以将羧酸和/或其酯从含水介质提取到提取介质中的时间,(b)将含有提取的羧酸和/或其酯的提取介质与含水介质分离,其中提取介质包含:‑至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)和至少一种烷烃的混合物,其中该烷烃包含至少12个碳原子。
Description
技术领域
本发明涉及从含水介质中提取羧酸和/或其酯的方法。特别地,该方法使用至少一种烷基氧化膦,优选三辛基氧化膦(TOPO),和至少一种烷烃的混合物。
发明背景
羧酸是其中氧原子(=O)已替代相应烷烃中的两个氢原子,且OH官能团已替代同一碳原子上的另一H原子的羧酸。羧酸在本领域中具有多种功能。例如,它们可用于生产聚合物、药物、溶剂和食品添加剂。
制备和提取羧酸的公知方法涉及丙二酸酯的水解和脱羧。丙二酸酯用氢氧化钠水溶液皂化以形成二钠盐和乙醇的水溶液。然后用强无机酸处理盐溶液以产生无机酸钠盐,并沉淀固体二羧酸。然后采用简单的分离程序如过滤或提取来分离该二羧酸。钠盐作为废弃物丢弃。分离的酸进一步干燥并加热到足以引起脱羧发生的温度。该程序冗长,需要许多步骤,产生废弃物,并且是设备密集的。
用于提取羧酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、琥珀酸和柠檬酸)的另一种方法是盐析提取。该方法使用由乙醇和硫酸铵组成的体系。影响提取效率的体系参数包括系线长度、相体积比、酸浓度、温度、体系pH等等。尽管采用该方法显示提高了羧酸的提取效率,但涉及的各种参数令该方法对工业使用而言太过复杂。
CA1167051公开了一种提取或再回收某些羧酸(如乙酸和甲酸)的方法。但是,该方法需要使用高温和用于逆流热交换步骤的专用设备。
因此,在本领域中需要更廉价和更有效的提取方法来提取羧酸,尤其以工业规模制得的羧酸。此外,需要可以与生产羧酸的生物技术方法结合使用的羧酸提取方法。
发明详述
本发明试图通过提供比现有技术中可用的现行方法更有效和廉价的提取羧酸和/或其酯的方式来解决上述问题。本发明还提供了可以与生产羧酸和/或其酯的生物技术方法结合使用的提取羧酸和/或其酯的方式。
根据本发明的一个方面,提供了从含水介质中提取羧酸和/或其酯的方法,该方法包括:
(a)使含水介质中的羧酸和/或其酯与至少一种提取介质接触足以将羧酸和/或其酯从含水介质提取到提取介质中的时间,
(b)将含有提取的羧酸和/或其酯的提取介质与含水介质分离,
其中该提取介质包含:
- 至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)与至少一种烷烃的混合物,
其中该烷烃包含至少12个碳原子。
特别地,根据本发明的任意方面的提取方法能够相对于所用提取剂的量提高产率。例如,小于50重量%的提取介质可用于提取相同量的羧酸和/或其酯,如同仅使用纯烷烃那样。因此,用小体积的提取介质,可以提取更大产量的羧酸和/或其酯。该提取介质还对微生物无害。因此,在以生物技术生产羧酸和/或其酯时,可以存在根据本发明的任何方面的提取介质。此外,至少当羧酸是己酸时,其可以通过蒸馏容易地与根据本发明的任何方面的提取介质分离。这是因为己酸至少在比提取介质低得多的沸点下蒸馏,并在经由蒸馏分离后,提取介质可以容易地再循环。
根据本发明的任何方面的方法可以是从含水介质中提取至少一种分离的羧酸和/或其酯的方法。分离的羧酸和/或其酯可指可从介质中分离的至少一种羧酸和/或其酯,其中所述羧酸和/或其酯由所述介质中制得。在一个实例中,羧酸和/或其酯可以在含水介质(例如发酵介质,其中由碳源通过特定细胞制得羧酸和/或其酯)中制得。分离的羧酸和/或其酯可指从含水介质中提取的羧酸和/或其酯。特别地,提取步骤能够从含水介质中分离过量的水,由此致使形成含有提取的羧酸和/或其酯的混合物。
提取介质也可以被称为“萃取介质(extraction medium)”。该萃取介质可用于从初始制得羧酸和/或其酯的含水介质中根据本发明的任何方法提取/分离制得的羧酸和/或其酯。在提取步骤结束时,可从含水介质中移除过量的水,由此产生含有提取的羧酸和/或其酯的提取介质。该提取介质可包含化合物的组合,所述化合物的组合可产生从含水介质中提取羧酸和/或其酯的有效方式。特别地,提取介质可以包含:(i)至少为包含至少12个碳原子的烷烃,和(ii)至少一种分子烷基氧化膦。根据本发明的任何方面的萃取介质可以有效地将羧酸和/或其酯提取到烷烃-烷基氧化膦提取介质中。烷基氧化膦与至少一种烷烃的混合物的这种提取介质在根据本发明的任何方面的方法中可以被认为是适合的,因为混合物有效作用于在发酵介质的存在下提取所需的羧酸和/或其酯。特别地,烷基氧化膦和至少一种烷烃的混合物可以被认为优于本领域中目前已知用于提取羧酸和/或其酯的任何方法,因为其不需要任何特殊设备来进行,并且相对容易地以高产率来实施。
烷烃可包含至少12个碳原子。特别地,烷烃可以包含12至18个碳原子。在一个实例中,烷烃可以选自十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷和十八烷。在进一步的实例中,提取介质可以包含烷烃的混合物。
烷基氧化膦具有通式OPX3,其中X为烷基。根据本发明的任何方面的合适的烷基氧化膦包括由直链、支链或环状烃组成的烷基,该烃由1至大约100个碳原子和1至大约200个氢原子组成。特别地,关于根据本发明的任何方面的烷基氧化膦所用的“烷基”可以是指具有1至20个碳原子、通常4至15个碳原子、或6至12个碳原子的烃基团,并且其可以由直链、环、支链或这些的混合物组成。该烷基氧化膦在每个磷原子上可具有1至3个烷基。在一个实例中,烷基氧化膦在P上具有三个烷基。在一些实例中,烷基可以包含氧原子以代替C4-C15或C6-C12烷基的一个碳,只要该氧原子没有连接到烷基氧化膦的P上。通常,烷基氧化膦选自三辛基氧化膦、三丁基氧化膦、己基氧化膦、辛基氧化膦及其混合物。
甚至更特别地,烷基氧化膦可以是三辛基氧化膦(TOPO)。三辛基氧化膦(TOPO)是具有式OP(C8H17)3的有机磷化合物。在萃取介质中至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)可与至少一种烷烃一起存在. 特别地,至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)与包含至少12个碳原子的烷烃的混合物可相对于烷烃包含大约1:100至1:10重量比的至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)。更特别地,根据本发明的任何方面的萃取介质中的至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)对烷烃的重量比可以大约1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:25、1:20、1:15或1:10。甚至更特别地,至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)对烷烃的重量比可以选自1:90至1:10、1:80至1:10、1:70至1:10、1:60至1:10、1:50至1:10、1:40至1:10、1:30至1:10或1:20至1:10。至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)对烷烃的重量比可以为1:40至1:15或1:25至1:15。在一个实例中,至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)对烷烃的重量比可以为大约1:15。在该实例中,烷烃可以是十六烷,并且因此至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)对十六烷的重量比可以为大约1:15。
本文中所用的术语‘大约’是指在20%内变化。特别地,本文中所用的术语“大约”是指所给测量值或值的+/-20%、更特别为+/-10%、甚至更特别为+/-5%。
在根据本发明的任何方面的步骤(a)中,含水介质中的羧酸和/或其酯可与提取介质接触足以将羧酸和/或其酯从含水介质提取到提取介质中的时间。技术人员能够确定达到分布平衡所需的时间量和优化该提取方法可能需要的正确气泡聚集。在一些实例中,所需时间可取决于可提取的羧酸和/或其酯的量。特别地,将羧酸和/或其酯从含水介质提取到提取介质中所需的时间可仅花费几分钟。在进行发酵时实施提取的实例中,提取时间等于发酵时间。
所用提取介质对待提取的羧酸和/或其酯的量的比可根据进行提取的速度而不同。在一个实例中,提取介质的量等于包含羧酸和/或其酯的含水介质的量。在使提取介质与含水介质接触的步骤之后,使用本领域已知的任何手段分离两相(水相和有机相)。在一个实例中,使用分离漏斗来分离两相。还可使用混合-澄清器、脉冲塔等等来分离两相。在羧酸为己酸的一个实例中,考虑到己酸在显著低于提取介质的沸点下蒸馏,可使用蒸馏将提取介质与己酸分离。技术人员能够根据需要提取的羧酸和/或其酯的特性选择步骤(b)中将萃取介质与所需羧酸和/或其酯分离的最佳方法。特别地,根据本发明的任何方面的步骤(b)涉及从步骤(a)再回收羧酸。羧酸与有机提取介质接触导致形成两相,使用本领域已知的任何手段分离两相(水相和有机相)。在一个实例中,使用分离漏斗来分离两相。还可以使用混合-澄清器、脉冲塔、热分离等等来分离两相。在羧酸为己酸的一个实例中,考虑到己酸在显著低于提取介质的沸点下蒸馏,可采用蒸馏将提取介质与己酸分离。技术人员能够根据需要再回收的羧酸的特性选择将提取介质与所需羧酸分离的最佳方法。
步骤(b)优选以再次使有机吸收剂可再循环或再利用为结束,优选在步骤(0)中(参见下文)。
羧酸和/或其酯可以选自具有2至16个碳原子的羧酸。特别地,羧酸可以选自乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸和十六烷酸。更特别地,羧酸可选自具有4至16、4至14、4至12、4至10、5至16、5至14、5至12、5至10、6至16、6至14、6至12或6至10个碳原子的羧酸。甚至更特别地,羧酸是己酸。
羧酸酯的酯部分优选选自甲基、乙基、异丙基、丙基以及异丁基和丁基。
在一些实例中,能够产生羧酸和/或其酯的微生物可用本领域中通常已知用于培养细菌的任何培养基、底物、条件和工艺来培养。这使得能够采用生物技术方法来产生羧酸和/或其酯。取决于用于羧酸和/或其酯生产的微生物,适当的生长培养基、pH、温度、搅拌速率、接种量和/或好氧、微好氧或厌氧条件是不同的。技术人员将了解实施根据本发明的任何方面的方法所需的其它条件。特别地,容器(例如发酵罐)中的条件可以根据所用微生物而不同。将条件改变至适于微生物达到最佳功能在技术人员的知识范围内。
在一个实例中,根据本发明的任何方面的方法可以在pH为5至8、或5.5至7的含水介质中进行。压力可以为1至10巴。微生物可在大约20℃至大约80℃的温度下培养。在一个实例中,微生物可在37℃下培养。
在一些实例中,对微生物的生长以及对其产生羧酸和/或其酯而言,含水介质可以包含适于微生物生长或促进羧酸和/或其酯生产的任何营养物、成分和/或补充剂。特别地,含水介质可以包含以下中的至少一种:碳源,氮源,如铵盐,酵母提取物或蛋白胨;矿物质;盐;辅因子;缓冲剂;维生素;以及可以促进细菌生长的任何其它组分和/或提取物。要使用的培养基必须适合于特定菌株的要求。在“Manual of Methods for GeneralBacteriology”中给出了对于各种微生物的培养基的描述。
因此,根据本发明的任何方面的提取羧酸和/或其酯的方法可以与生产羧酸和/或其酯的任何生物技术方法一起使用。这是特别有利的,因为通常在使用生物方法的生产羧酸和/或其酯的发酵方法过程中,羧酸和/或其酯将被留下来聚集在含水介质中,并且在发酵介质中达到一定浓度后,正是此目标产物(羧酸和/或其酯)可抑制微生物的活性和生产率。这由此限制了发酵方法的总产率。使用这种提取方法,随着羧酸和/或其酯的生产对其进行提取,因此大幅减少最终产物的抑制。
根据本发明的任何方面的方法与随着羧酸和/或其酯的生成将其移除(特别是从发酵方法中)的传统方法相比更高效并具有成本效率,因为主要不依赖于蒸馏和/或沉淀来再回收羧酸和/或其酯。蒸馏或沉淀方法可导致更高的生产成本、更低的产率和更多的废弃产物,因此降低了方法的整体效率。根据本发明的任何方面的方法试图克服这些缺点。
在一个实例中,羧酸是己酸。在此实例中,己酸可以由合成气制得。
合成气可以在至少一种产乙酸菌和/或氢氧化细菌的存在下转化为己酸。特别地,可以使用本领域中已知的任何方法。可以通过至少一种原核生物由合成气生产己酸。特别地,该原核生物可选自埃希氏菌属(genus Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli);梭状芽胞杆菌属(genus Clostridia)如扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri);棒状杆菌属(genus Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum);贪铜菌属(genus Cupriavidu)如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans);假单胞菌属(genus Pseudomonas),如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans);代尔夫特菌属(genusDelftia),如食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans);芽孢杆菌属(genus Bacillus),如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis);乳杆菌属(genus Lactobacillus),如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii);或乳球菌属(genus Lactococcus),如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
在另一实例中,可通过至少一种真核生物由合成气生产己酸。在本发明方法中所用的真核生物可选自曲霉属(genus Aspergillus),如黑曲霉(genus Aspergillus);酵母属(genus Saccharomyces),如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);毕赤酵母属(genusPichia),如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris);耶氏酵母属(genus Yarrowia),如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica);伊萨酵母属(genus Issatchenkia),如东方伊萨酵母(Issathenkia orientalis);德巴利酵母属(genus Debaryomyces),如汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii);阿克苏酵母属(genus Arxula),如食腺嘌呤阿克苏酵母(Arxula adenoinivorans);或克鲁维酵母属(genus Kluyveromyces),如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
更特别地,可通过Steinbusch, 2011、Zhang, 2013、Van Eerten-Jansen, M. C.A. A, 2013、Ding H.等人, 2010、Barker H.A., 1949、Stadtman E.R., 1950、BornsteinB. T.等人, 1948等等公开的任何方法来由合成气生产己酸。甚至更特别地,可以在至少克氏梭菌的存在下由合成气生产己酸。
本文中所用的术语“产乙酸菌”是指能够进行Wood-Ljungdahl途径并由此能够将CO、CO2和/或氢气转化为乙酸盐的微生物。这些微生物包括在其野生型形式下不具有Wood-Ljungdahl途径但因遗传修饰而获得该性状的微生物。此类微生物包括但不限于大肠杆菌细胞。这些微生物也被称为一氧化碳营养菌。当前,在本领域中已知21个不同的产乙酸菌属(Drake等人, 2006),并且这些还可以包括某些梭菌(Drake & Kusel, 2005)。这些细菌能够利用二氧化碳或一氧化碳作为碳源,用氢作为能源(Wood, 1991)。此外,醇、醛、羧酸以及许多己糖也可用作碳源(Drake等人, 2004)。导致形成乙酸盐的还原途径被称为乙酰CoA或Wood-Ljungdahl途径。特别地,产乙酸菌可选自潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera)(ATCC 35199)、长醋丝菌(Acetonema longum)(DSM 6540)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌(Acetobacterium malicum)(DSM 4132)、醋酸杆菌属(Acetobacterium) 物种no. 446 (Morinaga等人,1990,J.Biotechnol.,第14卷,第187-194页)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)(DSM 1911)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)(DSM 1030)、巴克斯碱棒菌(Alkalibaculum bacchi)(DSM22112)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(DSM 4304)、产生布劳特氏菌(Blautia producta)(DSM 2950,原名产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus),原名产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus))、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)(DSM 3468)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)(DSM 1496)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)(DSM 15243)、克氏梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC no. PTA-10522)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)(ATCC BA-623)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)(DSM 92)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)(DSM 1288)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)(DSM 13528)、扬氏梭菌C-01(ATCC55988)、扬氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)、扬氏梭菌O-52(ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei)(DSM 6539)、食甲氧基苯甲酸梭菌(Clostridium methoxybenzovorans)(DSM 12182)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)(DSM15248)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)(DSM 757)、梭菌属(Clostridium)物种ATCC 29797(Schmidt等人,1986,Chem.Eng.Commun.,第45卷,第61-73页)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)(DSM 6115)、热苯甲酸脱硫肠状菌热互养共栖亚种(Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp.thermosyntrophicum)(DSM 14055)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)(DSM 20543)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)C2A(DSM 2834)、穆尔氏菌属(Moorella)物种HUC22-1(Sakai等人,2004,Biotechnol.Let.,第29卷,第1607-1612页)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)(DSM 521,原名热醋梭菌(Clostridium thermoaceticum))、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)(DSM 1974)、普氏醋菌(Oxobacter pfennigii)(DSM 322)、食空气鼠孢菌(Sporomusa aerivorans)(DSM 13326)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)(DSM 2662)、森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)(DSM 10669)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)(DSM 2875)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida)(DSM 4440)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)(DSM 2030,原名凯伍产醋菌(Acetogenium kivui))。
更特别地,可使用食一氧化碳梭菌的菌株ATCC BAA-624。甚至更特别地,可使用例如如U.S. 2007/0275447和U.S. 2008/0057554中所述的食一氧化碳梭菌的标记为“P7”和P11“的细菌菌株。
另一种特别合适的细菌可以是扬氏梭菌。特别地,选自扬氏梭菌PETC、扬氏梭菌ERI2、扬氏梭菌COL和扬氏梭菌O-52的菌株可用于将合成气转化为己酸。这些菌株例如描述在WO 98/00558、WO 00/68407、ATCC 49587、ATCC 55988和ATCC 55989中。
该产乙酸菌可与氢氧化细菌结合使用。在一个实例中,产乙酸菌和氢氧化细菌二者可都用于由合成气生产己酸。在另一实例中,可仅使用产乙酸菌来代谢合成气以便由合成气生产己酸。在又一实例中,在该反应中可以仅使用氢氧化细菌。
氢氧化细菌可选自无色杆菌属(Achromobacter)、嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、鱼腥藻菌属(Anabena)、产水菌属(Aquifex)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、贪铜菌属(Cupriavidus)、德克斯氏菌属(Derxia)、螺杆菌属(Helicobacter)、草螺菌属(Herbaspirillum)、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、氢棒菌属(Hydrogenobaculum)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、氢嗜热菌属(Hydrogenothermus)、氢弧菌属(Hydrogenovibrio)、艾德昂菌属物种O1 (Ideonella sp. O1)、克尔皮德氏菌(Kyrpidia)、生金球菌属(Metallosphaera)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、分枝杆菌属(Myobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、寡养菌属(Oligotropha)、副球菌属(Paracoccus)、暗单胞菌属(Pelomonas)、极单胞菌属(Polaromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、链霉菌属(Streptomyces)、荚硫菌属(Thiocapsa)、密螺旋体属(Treponema)、贪噬菌属(Variovorax)、黄色杆菌属(Xanthobacter)和沃特斯氏菌属(Wautersia)。
在由合成气生产乙酸时,可以使用细菌的组合。可以有超过一种产乙酸菌与一种或多种氢氧化细菌组合存在。在另一实例中,可仅存在超过一种类型的产乙酸菌。在又一实例中,可以仅存在超过一种的氢氧化细菌。也称为羊油酸的己酸具有通式C5H11COOH。
特别地,产生己酸的方法可以包括以下步骤:
- 使合成气与能够进行Wood-Ljungdahl途径和乙醇-羧酸盐发酵的至少一种细菌接触以生产己酸。
本文中所用的术语“接触”是指使得介质中的羧酸和/或其酯与步骤(a)中的萃取介质直接接触和/或使微生物与合成气直接接触。例如,细胞和包含碳源的介质可以在不同的隔室中。特别地,碳源可为气态,并添加到包含根据本发明的任何方面的细胞的培养基中。
在一个实例中,由合成气生产己酸可涉及将产乙酸菌与能够用乙醇-羧酸盐发酵氢氧化细菌生产己酸的细菌结合使用。在一个实例中,产乙酸菌和氢氧化细菌可用于由合成气生产己酸。例如,扬氏梭菌可与克氏梭菌同时使用。在另一实例中,可仅使用产乙酸菌来代谢合成气,从而由合成气生产己酸。在此实例中,产乙酸菌能够进行乙醇-羧酸盐发酵途径和Wood-Ljungdahl途径。在一个实例中,产乙酸菌可以是食一氧化碳梭菌,其能够进行Wood-Ljungdahl途径和乙醇-羧酸盐发酵途径二者。
乙醇-羧酸盐发酵途径至少由Seedorf, H.等人在2008详细描述。该生物可以选自克氏梭菌、食一氧化碳梭菌等等。这些微生物包括其中其野生型形式下不具有乙醇-羧酸盐发酵途径但因遗传修饰而获得该性状的微生物。特别地,该微生物可为克氏梭菌。
在一个实例中,根据本发明的任何方面使用的细菌选自克氏梭菌和食一氧化碳梭菌。
特别地,细胞与碳源接触,所述碳源包括单糖(如葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、阿拉伯糖或木酮糖)、二糖(如乳糖或蔗糖)、寡糖和多糖(如淀粉或纤维素)、一碳底物和/或其混合物。更特别地,细胞与包含CO和/或CO2的碳源接触以生产羧酸和/或其酯。
关于包含二氧化碳和/或一氧化碳的底物来源,技术人员将理解存在许多可能用于提供CO和/或CO2作为碳源的来源。可以看出,在实践中,作为本发明的碳源,可以使用能够以充足量的碳供应微生物的任何气体或任何气体混合物,从而可以由CO和/或CO2来源形成乙酸盐和/或乙醇。
通常,对本发明的细胞而言,碳源包含至少50重量%、至少70重量%、特别是至少90重量%的CO2和/或CO,其中该重量%涉及可用于本发明的任何方面的细胞的所有碳源。可提供碳材料源。
气体形式的碳源的实例包括通过酵母发酵或梭菌发酵产生的排出气,如合成气、烟道气和石油炼厂气。这些排出气由含纤维素材料的气化或煤的气化形成。在一个实例中,这些排出气不一定作为其它方法的副产物产生,而是可以专门生产以便与本发明的混合培养物(mixed culture)一起使用。
根据本发明的任何方面,用于在根据本发明的任何方面的步骤(0)(参见下文)中生产乙酸盐和/或乙醇的碳源可为合成气。合成气例如可以作为煤气化的副产物生产。因此,根据本发明的任何方面的微生物能够将作为废弃产物的物质转化为有价值的资源。
在另一实例中,合成气可以是广泛可得的、低成本的农业原料的气化的副产物,以便与本发明的混合培养物(mixed culture)一起使用以生产取代或未取代的有机化合物。
可以转化为合成气的原材料有很多实例,因为几乎所有形式的植被均可用于这一目的。特别地,原材料选自多年生牧草,如芒草、玉米残体、加工废弃物如锯末等等。
通常,合成气可以在干燥生物质的气化设备中获得,主要通过热解、部分氧化和蒸汽重整,其中合成气的主要产物是CO、H2和CO2。合成气也可为电解CO2的产物。技术人员将了解进行CO2的电解以便生产包含需要的量的CO的合成气的合适条件。
通常,首先加工由气化过程获得的一部分合成气以优化产品产率,并避免形成焦油。合成气中不合意的焦油与CO的裂解可以用石灰和/或白云石来进行。这些过程详细描述在例如Reed, 1981中。
本发明的方法的总效率、羧酸和/或其酯的生产率和/或总碳捕获可取决于连续气流中CO2、CO和H2的化学计量。施加的连续气流可以具有CO2和H2的组成。特别地,在连续气流中,CO2的浓度范围可为大约10-50%、特别是3 重量%,并且H2将为44%至84%、特别为64至66.04 重量%。在另一实例中,连续气流还可以包含惰性气体如N2,N2浓度最高为50重量%。
来源混合物可以用作碳源。
根据本发明的任何方面的,还原剂(例如氢气)可与碳源一起提供。特别地,在供应和/或使用C和/或CO2时,可供应氢。在一个实例中,氢气是根据本发明的任何方面存在的合成气的一部分。在另一实例中,当合成气中的氢气对本发明的方法而言不足时,可供应额外的氢气。
在一个实例中,羧酸是己酸。更特别地,包含CO和/或CO2的碳源以连续气流接触细胞。甚至更特别地,该连续气流包含合成气。这些气体可例如使用向含水介质中开放的喷嘴、向含水介质中供应气体的管道中的玻璃料、膜等等来供应。
技术人员将理解,可必须在适当间隔时间处监控该物流的组成和流速。可以通过改变成分物流的比例来实现对物流组成的控制,从而实现目标组成或合意的组成。共混物流的组成和流速可以通过本领域中已知的任何手段来监控。在一个实例中,使系统适于连续监控至少两种物流的流速和组成,并将它们合并以产生具有最佳组成的连续气流形式的单个共混底物物流,以及将优化的底物物流送入发酵罐的装置。
术语“含水溶液”或“培养基”包括任何包含水的溶液,主要以水作为溶剂,其可用于将根据本发明的任何方面的细胞至少暂时地保持为代谢活性状态和/或存活状态,并在需要的情况下包含任何附加的底物。本领域技术人员熟知多种含水溶液(通常称为介质,可用于保持和/或培养细胞)的制备,例如在大肠杆菌的情况下为LB培养基,在扬式梭菌的情况下可使用ATCC1754培养基。有利的是以水溶液形式使用基本培养基,即组成相当简单的培养基,与复杂培养基相比,其仅包含使细胞保持为代谢活性状态和/或存活状态所不可缺少的盐和营养物的最小集,以避免不需要的副产物对产品造成不必要的污染。例如,M9培养基可用作基本培养基。细胞与碳源一起温育足够长的时间以生产所需产物。例如至少1、2、4、5、10或20小时。所选温度必须使得根据本发明的任何方面的细胞保持催化能力和/代谢活性,例如在细胞为扬式梭菌细胞的情况下为10至42℃、优选30至40℃、特别为32至38℃。根据本发明的任何方面的含水培养基还包括其中生产羧酸和/或其酯的培养基。其主要是指其中溶液基本包含水的培养基。在一个实例中,细胞在其中用于生产羧酸和/或其酯的含水培养基正是与萃取介质接触以便提取羧酸和/或其酯的介质。
特别地,根据本发明的任何方面的微生物和碳源的混合物可以在任何已知的生物反应器或发酵罐中使用以实施本发明的任何方面。在一个实例中,开始于生产羧酸和/或其酯并终结于提取羧酸和/或其酯的根据本发明的任何方面的完整方法在单一容器中进行。因此在生产羧酸和/或其酯的步骤与提取羧酸和/或其酯的步骤之间可以没有分离步骤。这节约了时间和成本。特别地,在发酵过程期间,微生物可在含水介质中并在萃取介质的存在下生长。根据本发明的任何方面的方法由此提供了生产羧酸和/或其酯的一锅法。同样,由于在生产羧酸和/或其酯时对其进行了提取,因此不会发生最终产物抑制作用,确保保持羧酸和/或其酯的产率。可以进行进一步的分离步骤以移除该羧酸和/或其酯。可以使用本领域中已知的任何分离方法(如使用漏斗、柱、蒸馏等等)。随后可再循环剩余的提取介质和/或细胞。
在另一实例中,提取过程可以作为单独的步骤和/或在另一罐中进行。在已进行发酵后,其中已经制得了待提取的所需羧酸和/或其酯,可以将根据本发明的任何方面的提取介质添加到发酵培养基中,或者可以将发酵培养基添加到包含提取介质的罐中。随后可通过本领域中已知的任何分离方法(如使用漏斗、柱、蒸馏等等)来提取所需的羧酸和/或其酯。随后可以再循环剩余的提取介质。
方法的另一优点在于可以再循环提取介质。因此,一旦将羧酸和/或其酯与萃取介质分离,可以再循环并再利用该萃取介质,减少了废弃物。
根据本发明的另一方面,提供了至少一种烷基氧化膦、优选三辛基氧化膦(TOPO)与烷烃的混合物用于从含水介质中提取羧酸的用途,其中烷烃包含至少12个碳原子。特别地,烷烃可包含12至18个碳原子。更特别地,烷烃可为十六烷。甚至更特别地,羧酸和/或其酯选自具有4至16个碳原子的羧酸。在一个实例中,羧酸可为己酸。
在根据本发明的优选方法中,使用乙醇和/或乙酸盐作为原材料。
根据本发明的此优选方法提取由乙醇和/或乙酸盐生产的羧酸和/或其酯 ,在步骤(a)之前包括步骤(0):
(0)使乙醇和/或乙酸盐与能够进行碳链伸长的至少一种微生物在含水介质中接触以便由乙醇和/或乙酸盐生产羧酸和/或其酯。
依照根据本发明的优选方法,含水介质在分离羧酸和/或其酯的步骤(b)之后可再循环回到步骤(0)中。该再循环步骤能够再循环和重新利用该微生物,因为本发明的提取介质对微生物无毒。再循环含水介质的步骤在根据本发明的方法中具有以下的进一步优点:能够给予一开始未能在首次循环中在步骤(a)和(b)中被提取的残余羧酸和/或其酯再次或以含水介质再回收次数提取的机会。
在(0)中能够进行碳链伸长以生产羧酸的微生物可为能够进行碳链伸长的任何生物(比较Jeon等人 Biotechnol Biofuels (2016) 9:129)。Seedorf, H.等人在2008也公开了碳链伸长途径。根据本发明的任何方面的微生物还可以包括在其野生型形式下不能进行碳链伸长但因遗传修饰而已获得该性状的微生物。特别地,(0)中的微生物可选自食一氧化碳梭菌、克氏梭菌和帕鲁斯梭菌(C.pharus)。特别地,根据本发明的任何方面的微生物可为克氏梭菌。
在根据本发明的任何方面的步骤(0)中,使乙醇和/或乙酸盐与能够进行碳链伸长的至少一种微生物接触以便由乙醇和/或乙酸盐生产羧酸和/或其酯。在一个实例中,碳源可以是乙醇和至少一种其它碳源的组合,所述其它碳源选自乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐和己酸盐。特别地,碳源可为乙醇和乙酸盐。在另一实例中,碳源可以是丙酸和乙醇、乙酸盐和乙醇、异丁酸和乙醇或丁酸和乙醇的组合。在一个实例中,碳底物可为单独的乙醇。在另一实例中,碳底物可为单独的乙酸盐。
乙酸盐和/或乙醇的来源可以根据可用性而不同。在一个实例中,乙醇和/或乙酸盐可为合成气或本领域中已知的任何碳水化合物的发酵产物。特别地,用于生产乙酸盐和/或乙醇的碳源可选自醇、醛、葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、木糖、戊糖、多元醇、己糖、乙醇和合成气。来源的混合物可以用作碳源。
甚至更特别地,碳源可为合成气。合成气可在至少一种产乙酸菌的存在下转化为乙醇和/或乙酸盐。
在一个实例中,由乙酸盐和/或乙醇来生产羧酸和/或其酯,所述乙酸盐和/或乙醇来自合成气,并可涉及产乙酸菌与能够碳链伸长的微生物的组合使用。例如,扬氏梭菌可以与克氏梭菌同时使用。在另一实例中,单个产乙酸细胞可同时具有两种生物的活性。例如,产乙酸菌可以是食一氧化碳梭菌,其既能进行Wood-Ljungdahl途径,又能进行碳链伸长途径。
根据本发明的任何方面的步骤(0)中使用的乙醇和/或乙酸盐可为合成气的发酵产物,或可以通过其它手段获得。乙醇和/或乙酸盐随后可在步骤(0)中与微生物接触。
本文中所用的术语“接触”是指使得微生物与乙醇和/或乙酸盐直接接触。在一个实例中,乙醇是碳源,并且在步骤(0)中的接触涉及乙醇与步骤(0)的微生物的接触。该接触可以是直接接触或间接接触,所述间接接触可包括膜或类似物,以使细胞和乙醇分离,或其中细胞和细胞可保持在两个不同的隔室中等等。例如,在步骤(a)中,羧酸和/或其酯与提取介质可在不同的隔室中。
根据本发明的任何方面,其中在步骤(a)中进行提取,并在步骤(0)中进行发酵,提取时间可等于发酵时间。
实施例
前面描述了优选实施方案,其如本领域技术人员将理解的那样,可以在设计、结构或操作方面施以改变或修改,而不背离权利要求的范围。这些改变例如意在为权利要求的范围所覆盖。
实施例1
由乙酸盐和乙醇通过克氏梭菌形成丁酸
为了将乙醇和乙酸盐生物转化为丁酸,使用细菌克氏梭菌。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
对于预培养,将在250毫升瓶内的100毫升DMSZ52培养基(pH = 7.0;10 g/L乙酸钾,0.31 g/L K2HPO4,0.23 g/L KH2PO4,0.25 g/l NH4Cl,0.20 g/l MgSO4x7H2O,1 g/L酵母提取物,0.50 mg/L刃天青,10 μl/l HCl (25%, 7.7 M),1.5 mg/L FeCl2 x 4H2O,70 µg/LZnCl2 x 7H2O,100 µg/L MnCl2 x 4H2O,6 µg/L H3BO3,190 μg/L CoCl2 x 6H2O,2 µg/LCuCl2 x 6H2O,24 µg/L NiCl2 x 6H2O,36 µg/L Na2MO4 x 2H2O,0.5 mg/L NaOH,3 µg/LNa2SeO3 x 5H2O,4 μg/L Na2WO4 x 2H2O,100 µg/L维生素B12,80 µg/L对氨基苯甲酸,20 µg/L D(+)生物素,200 μg/L烟酸,100 µg/L D-泛酸钙,300 μg/L盐酸吡哆醇,200 μg/l硫胺素-HCl x 2H2O,20 ml/L乙醇,2.5 g/L NaHCO3,0.25 g/L半胱氨酸-HCl x H2O,0.25 g/LNa2S x 9H2O)用5毫升克氏梭菌的冷冻培养物(frozen cryoculture)接种并在37℃下温育144小时至OD600nm >0.2。
对于主培养,将在500毫升瓶内的200毫升新鲜DMSZ52培养基用来自预培养的离心细胞接种至OD600nm为0.1。此生长的培养物在37℃下温育27小时至OD600nm >0.6。然后将细胞悬浮液离心,用生产缓冲液(pH 6.0;8.32 g/L乙酸钾,0.5 g/l乙醇)洗涤,并再次离心。
为了生产培养物,将在500毫升瓶内的200毫升生产缓冲液用来自主培养的洗涤细胞接种至OD600nm为0.2。将培养物用丁基橡胶塞封盖并在开放式水浴振荡器中在37℃和100rpm下温育71小时。在培养期开始和结束时,采取样品。测试了它们的光密度、pH和不同的分析物(通过NMR测试)。
结果表明,在生产阶段,乙酸盐的量由5.5 g/l降低至5.0 g/l,并且乙醇的量由0.5 g/l降低至0.0 g/l。此外,丁酸的浓度由0.05 g/l提高至0.8 g/l,并且己酸的浓度由0.005 g/l提高至0.1 g/l。
实施例2
由乙酸盐和乙醇通过克氏梭菌形成己酸
为了将乙醇和乙酸盐生物转化为己酸,使用细菌克氏梭菌。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
对于预培养,将在250毫升瓶内的100毫升DMSZ52培养基(pH = 7.0;10 g/L乙酸钾,0.31 g/L K2HPO4,0.23 g/L KH2PO4,0.25 g/l NH4Cl,0.20 g/l MgSO4 x 7H2O,1 g/L酵母提取物,0.50 mg/L刃天青,10 μl/l HCl (25%, 7.7 M),1.5 mg/L FeCl2 x 4H2O,70 µg/L ZnCl2 x 7H2O,100 µg/L MnCl2 x 4H2O,6 µg/L H3BO3,190 μg/L CoCl2 x 6H2O,2 µg/LCuCl2 x 6H2O,24 µg/L NiCl2 x 6H2O,36 µg/L Na2MO4 x 2H2O,0.5 mg/L NaOH,3 µg/LNa2SeO3 x 5H2O,4 μg/L Na2WO4 x 2H2O,100 µg/L维生素B12,80 µg/L对氨基苯甲酸,20 µg/L D(+)生物素,200 μg/L烟酸,100 µg/L D-泛酸钙,300 μg/L盐酸吡哆醇,200 μg/l硫胺素-HCl x 2H2O,20 ml/L乙醇,2.5 g/L NaHCO3,0.25 g/L半胱氨酸-HCl x H2O,0.25 g/LNa2S x 9H2O)用5毫升克氏梭菌的冷冻培养物接种,并在37℃下温育144小时至OD600nm >0.2。
对于主培养,将在500毫升瓶内的200毫升新鲜DMSZ52培养基用来自预培养的离心细胞接种至OD600nm为0.1。此生长的培养物在37℃下温育27小时至OD600nm >0.6。然后将细胞悬浮液离心,用生产缓冲液(pH 6.0;0.832 g/L乙酸钾,5.0 g/l乙醇)洗涤,并再次离心。
为了生产培养物,将在500毫升瓶内的200毫升生产缓冲液用来自主培养的洗涤细胞接种至OD600nm为0.2。将培养物用丁基橡胶塞封盖并在开放式水浴振荡器浴中在37℃和100 rpm下温育71小时。在培养期开始和结束时,采取样品。测试了它们的光密度、pH和不同的分析物(通过NMR测试)。
结果表明,在生产阶段,乙酸盐的量由0.54 g/l降低至0.03 g/l,并且乙醇的量由5.6 g/l降低至4.9 g/l。此外,丁酸的浓度由0.05 g/l提高至0.28 g/l,并且己酸的浓度由0.03 g/l提高至0.79 g/l。
实施例3
由丁酸和乙醇通过克氏梭菌形成己酸
为了将乙醇和丁酸生物转化为己酸,使用细菌克氏梭菌。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
对于预培养,将在250毫升瓶内的100毫升DMSZ52培养基(pH = 7.0;10 g/L乙酸钾,0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4,0.25 g/l NH4Cl,0.20 g/l MgSO4 x 7H2O,1 g/L酵母提取物,0.50 mg/L刃天青,10 μl/l HCl (25%, 7.7 M),1.5 mg/L FeCl2 x 4H2O,70 µg/L ZnCl2 x 7H2O,100 µg/L MnCl2 x 4H2O,6 µg/L H3BO3,190 μg/L CoCl2 x 6H2O,2 µg/LCuCl2 x 6H2O,24 µg/L NiCl2 x 6H2O,36 µg/L Na2MO4 x 2H2O,0.5 mg/L NaOH,3 µg/LNa2SeO3 x 5H2O,4 μg/L Na2WO4 x 2H2O,100 µg/L维生素B12,80 µg/L对氨基苯甲酸,20 µg/L D(+)生物素,200 μg/L烟酸,100 µg/L D-泛酸钙,300 μg/L盐酸吡哆醇,200 μg/l硫胺素-HCl x 2H2O,20 ml/L乙醇,2.5 g/L NaHCO3,0.25 g/L半胱氨酸-HCl x H2O,0.25 g/LNa2S x 9H2O)用5毫升克氏梭菌的冷冻培养物接种,并在37℃下温育144小时至OD600nm >0.3。
对于主培养,将在500毫升瓶内的200毫升新鲜DMSZ52培养基用来自预培养的离心细胞接种至OD600nm为0.1。此生长的培养物在37℃下温育25小时至OD600nm >0.4。然后将细胞悬浮液离心,用生产缓冲液(pH 6.16;4.16 g/L乙酸钾,10.0 g/l乙醇)洗涤,并再次离心。
为了生产培养物,将在500毫升瓶内的200毫升生产缓冲液用来自主培养的洗涤细胞接种至OD600nm为0.2。在第一培养物中,在开始时,向生产缓冲液中添加1.0 g/l丁酸,在第二培养物中,不向生产缓冲液中添加丁酸。将培养物们用丁基橡胶塞封盖并在开放式水浴振荡器中在37℃和100 rpm下温育71小时。在培养期开始和结束时,采取样品。测试了它们的光密度、pH和不同的分析物(通过NMR测试)。
结果表明,在丁酸补充培养的生产阶段,乙酸盐的量由3.1 g/l降低至1.1 g/l,并且乙醇的量由10.6 g/l降低至7.5 g/l。此外,丁酸的浓度由1.2 g/l提高至2.2 g/l,并且己酸的浓度由0.04 g/l提高至2.30 g/l。
在未补充培养的生产阶段,乙酸盐的量由3.0 g/l降低至1.3 g/l,并且乙醇的量由10.2 g/l降低至8.2 g/l。此外,丁酸的浓度由0.1 g/l提高至1.7 g/l,并且己酸的浓度由0.01 g/l提高至1.40 g/l。
实施例4
在癸烷和TOPO的存在下培养克氏梭菌
培养细菌克氏梭菌DSM555(German DSMZ)用于将乙醇和乙酸盐生物转化为己酸。为了原位提取制得的己酸,向培养物中添加癸烷与三辛基氧化膦(TOPO)的混合物。所有培养步骤都在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
对于预培养,将250毫升Veri01培养基(pH 7.0;10 g/L乙酸钾,0.31 g/L K2HPO4,0.23 g/L KH2PO4,0.25 g/L NH4Cl,0.20 g/L MgSO4 X 7H2O,10 µl /L HCl (7.7 M),1.5mg/L FeCl2 X 4H2O,36 µg/L ZnCl2,64 µg/L MnCl2 X 4H2O,6 µg/L H3BO3,190 µg/L CoCl2 X 6H2O,1.2 µg/L CuCl2 X 6H2O,24 µg/L NiCl2 X 6H2O,36 µg/L Na2MO4 X 2H2O,0.5 mg/LNaOH,3 µg/L Na2SeO3 X 5H2O,4 µg/L Na2WO4 X 2H2O,100 µg/L维生素B12,80 µg/L对氨基苯甲酸,20 µg/L D(+)生物素,200 μg/L烟酸,100 µg/L D-泛酸钙,300 μg/L盐酸吡哆醇,200 μg/l硫胺素-HCl x 2H2O,20 ml/L乙醇,2.5 g/L NaHCO3,65 mg/L甘氨酸,24 mg/L组氨酸,64.6 mg/L异亮氨酸,93.8 mg/L亮氨酸,103 mg/L赖氨酸,60.4 mg/L精氨酸,21.64 mg/L L-半胱氨酸-HCl,21 mg/L蛋氨酸,52 mg/L脯氨酸,56.8 mg/L丝氨酸,59 mg/L苏氨酸,75.8 mg/L缬氨酸)用10毫升克氏梭菌的活培养物接种至起始OD600nm为0.1。
在1000毫升耐压玻璃瓶中在37℃、150 rpm以及100% CO2的1 L/h的通风速率下在开放式水浴振荡器中进行培养671小时。气体排放到反应器的顶部空间。通过自动添加100g/L NaOH溶液将pH保持在6.2。将新鲜的培养基连续进料到反应器中,稀释率为2.0 d-1,并通过孔隙尺寸为0.2 µm的KrosFlo®中空纤维聚醚砜膜(Spectrumlabs, RanchoDominguez, USA)从反应器中连续除去发酵液,以便将细胞保留在反应器中。
对于主培养,在250毫升瓶中的100毫升新鲜Veri01培养基用来自预培养的离心细胞接种至OD600nm为0.1。添加额外的1毫升的6%(w/w)TOPO在癸烷中的混合物。该培养物用丁基橡胶塞封盖,并在100% CO2气氛下,在37℃和150 rpm下在开放式水浴振荡器中温育43小时。
在培养过程中,采取了几个5毫升样品以确定OD600nm、pH和产物形成。通过半定量1H-NMR光谱法来实现产物浓度测定。使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)作为内部定量标准。
在主培养过程中,丁酸盐的浓度由0.14 g/L提高至2.12 g/L,并且己酸盐的浓度由0.22 g/L提高至0.91 g/L,而乙醇的浓度由15.04降低至11.98 g/l,并且乙酸盐的浓度由6.01降低至4.23 g/L。
在该时间过程中OD600nm由0.111降低至0.076。
实施例5
在十四烷和TOPO的存在下培养克氏梭菌
培养细菌克氏梭菌用于将乙醇和乙酸盐生物转化为己酸。为了原位提取制得的己酸,向培养物中添加十四烷与三辛基氧化膦(TOPO)的混合物。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
克氏梭菌的预培养在1000毫升耐压玻璃瓶内在250毫升EvoDM24培养基(pH 5.5;0.429 g/L乙酸镁,0.164 g/l乙酸钠,0.016 g/L乙酸钙,2.454 g/l乙酸钾,0.107 mL/LH3PO4(8.5%),0.7 g/L乙酸铵,0.35 mg/L乙酸钴,1.245 mg/L乙酸镍,20 µg/L d-生物素,20µg/L叶酸,10 µg/L盐酸吡哆醇,50 µg/L硫胺素-HCl,50 µg/L核黄素,50 µg/L烟酸,50 µg/L泛酸钙,50 µg/L维生素B12,50 µg/L对氨基苯甲酸盐,50 µg/L硫辛酸,0.702 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 X 4H2O,1 ml/L KS-乙酸盐(93.5 mM),20 ml/L乙醇,0.37 g/L乙酸)中在37℃、150 rpm以及25% CO2和75% N2的混合物的1 L/h的通风速率下,在开放式水浴振荡器中进行。气体排放到反应器的顶部空间。通过自动添加2.5 M NH3溶液将pH保持在5.5。将新鲜的培养基连续进料到反应器中,稀释率为2.0 d-1,并通过孔隙尺寸为0.2 µm的KrosFlo®中空纤维聚醚砜膜(Spectrumlabs, Rancho Dominguez, USA)从反应器中连续除去发酵液,以便将细胞保留在反应器中,并保持OD600nm为~1.5。
对于主培养,将在250毫升瓶内的100毫升Veri01培养基(pH 6.5;10 g/L乙酸钾,0.31 g/L K2HPO4,0.23 g/L KH2PO4,0.25 g/L NH4Cl,0.20 g/L MgSO4 X 7H2O,10 µl /LHCl(7.7 M),1.5 mg/L FeCl2 X 4H2O,36 µg/L ZnCl2,64 µg/L MnCl2 X 4H2O,6 µg/LH3BO3,190 µg/L CoCl2 X 6H2O,1.2 µg/L CuCl2 X 6H2O,24 µg/L NiCl2 X 6H2O,36 µg/LNa2MO4 X 2H2O,0.5 mg/L NaOH,3 µg/L Na2SeO3 X 5H2O,4 µg/L Na2WO4 X 2H2O,100 µg/L维生素B12,80 µg/L对氨基苯甲酸,20 µg/L D(+)生物素,200 μg/L烟酸,100 µg/L D-泛酸钙,300 μg/L盐酸吡哆醇,200 μg/l硫胺素-HCl X 2H2O,20 ml/L乙醇,2.5 g/L NaHCO3,65mg/L甘氨酸,24 mg/L组氨酸,64.6 mg/L异亮氨酸,93.8 mg/L亮氨酸,103 mg/L赖氨酸,60.4 mg/L精氨酸,21.64 mg/L L-半胱氨酸-HCl,21 mg/L蛋氨酸,52 mg/L脯氨酸,56.8mg/L丝氨酸,59 mg/L苏氨酸,75.8 mg/L缬氨酸,2.5 mL/L HCL 25%)用来自预培养的离心细胞接种至OD600nm为0.1。添加额外的1毫升的6%(w/w)TOPO在十四烷中的混合物。将培养物用丁基橡胶塞封盖,并在100% CO2气氛下,在37℃和150 rpm下在开放式水浴振荡器中温育47小时。
在培养过程中,采取了几个5毫升样品以测定OD600nm、pH和产物形成。通过半定量1H-NMR光谱法来实现产物浓度测定。使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)作为内部定量标准。
在主培养过程中,丁酸盐的浓度由0.05 g/L提高至3.78 g/L,并且己酸盐的浓度由0.09 g/L提高至4.93 g/L,而乙醇的浓度由15.52降低至9.36 g/l,并且乙酸盐的浓度由6.36降低至2.49 g/L。
在该时间过程中OD600nm由0.095提高至0.685。
实施例6
在十六烷和TOPO的存在下培养克氏梭菌
培养细菌克氏梭菌用于将乙醇和乙酸盐生物转化为己酸。为了原位提取制得的己酸,向培养物中添加十六烷与三辛基氧化膦(TOPO)的混合物。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
对于预培养,将250毫升Veri01培养基(pH 7.0;10 g/L乙酸钾,0.31 g/L K2HPO4,0.23 g/L KH2PO4,0.25 g/L NH4Cl,0.20 g/L MgSO4 X 7H2O,10 µl /L HCl(7.7 M),1.5mg/L FeCl2 X 4H2O,36 µg/L ZnCl2,64 µg/L MnCl2 X 4H2O,6 µg/L H3BO3,190 µg/L CoCl2X 6H2O,1.2 µg/L CuCl2 X 6H2O,24 µg/L NiCl2 X 6H2O,36 µg/L Na2MO4 X 2H2O,0.5 mg/LNaOH,3 µg/L Na2SeO3 X 5H2O,4 µg/L Na2WO4 X 2H2O,100 µg/L维生素B12,80 µg/L对氨基苯甲酸,20 µg/L D(+)生物素,200 μg/L烟酸,100 µg/L D-泛酸钙,300 μg/L盐酸吡哆醇,200 μg/l硫胺素-HCl X 2H2O,20 ml/L乙醇,2.5 g/L NaHCO3,65 mg/L甘氨酸,24 mg/L组氨酸,64.6 mg/L异亮氨酸,93.8 mg/L亮氨酸,103 mg/L赖氨酸,60.4 mg/L精氨酸,21.64 mg/L L-半胱氨酸-HCl,21 mg/L蛋氨酸,52 mg/L脯氨酸,56.8 mg/L丝氨酸,59 mg/L苏氨酸,75.8 mg/L缬氨酸)用10毫升克氏梭菌的活培养物接种至起始OD600nm为0.1。
在1000毫升耐压玻璃瓶中在37℃、150 rpm和100% CO2的1 L/h的通风速率下,在开放式水浴振荡器中进行培养671小时。将气体排放到反应器的顶部空间。通过自动添加100 g/L NaOH溶液将pH保持在6.2。将新鲜的培养基连续进料到反应器中,稀释率为2.0 d-1,并通过孔隙尺寸为0.2 µm的KrosFlo®中空纤维聚醚砜膜(Spectrumlabs, RanchoDominguez, USA)从反应器中连续除去发酵液,以便将细胞保留在反应器中。
对于主培养,将在250毫升瓶内的100毫升新鲜Veri01培养基用来自预培养的离心细胞接种至OD600nm为0.1。添加额外的1毫升的6%(w/w)TOPO在十六烷中的混合物。培养物用丁基橡胶塞封盖,并在100% CO2气氛下,在37℃和150 rpm下在开放式水浴振荡器中温育43小时。
在培养过程中,采取了几个5毫升样品以测定OD600nm、pH和产物形成。通过半定量1H-NMR光谱法来实现产物浓度测定。使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)作为内部定量标准。
在主培养过程中,丁酸盐的浓度由0.14 g/L提高至2.86 g/L,并且己酸盐的浓度由0.20 g/L提高至2.37 g/L,而乙醇的浓度由14.59降低至10.24 g/l,并且乙酸盐的浓度由5.87降低至3.32 g/L。
在该时间过程中,OD600nm由0.091提高至0.256。
实施例7
在十七烷和TOPO的存在下培养克氏梭菌
培养细菌克氏梭菌用于将乙醇和乙酸盐生物转化为己酸。为了原位提取制得的己酸,向培养物中添加十七烷与三辛基氧化膦(TOPO)的混合物。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
对于预培养,将250毫升Veri01培养基(pH 7.0;10 g/L乙酸钾,0.31 g/L K2HPO4,0.23 g/L KH2PO4,0.25 g/L NH4Cl,0.20 g/L MgSO4 X 7H2O,10 µl /L HCl(7.7 M),1.5mg/L FeCl2 X 4H2O,36 µg/L ZnCl2,64 µg/L MnCl2 X 4H2O,6 µg/L H3BO3,190 µg/L CoCl2X 6H2O,1.2 µg/L CuCl2 X 6H2O,24 µg/L NiCl2 X 6H2O,36 µg/L Na2MO4 X 2H2O,0.5 mg/LNaOH,3 µg/L Na2SeO3 X 5H2O,4 µg/L Na2WO4 X 2H2O,100 µg/L维生素B12,80 µg/L对氨基苯甲酸,20 µg/L D(+)生物素,200 μg/L烟酸,100 µg/L D-泛酸钙,300 μg/L盐酸吡哆醇,200 μg/l硫胺素-HCl X 2H2O,20 ml/L乙醇,2.5 g/L NaHCO3,65 mg/L甘氨酸,24 mg/L组氨酸,64.6 mg/L异亮氨酸,93.8 mg/L亮氨酸,103 mg/L赖氨酸,60.4 mg/L精氨酸,21.64 mg/L L-半胱氨酸-HCl,21 mg/L蛋氨酸,52 mg/L脯氨酸,56.8 mg/L丝氨酸,59 mg/L苏氨酸,75.8 mg/L缬氨酸)用10毫升克氏梭菌的活培养物接种至起始OD600nm为0.1。
在1000毫升耐压玻璃瓶中在37℃、150 rpm和100% CO2的1 L/h的通风速率下,在开放式水浴振荡器中进行培养671小时。气体排放到反应器的顶部空间。通过自动添加100g/L NaOH溶液将pH保持在6.2。将新鲜的培养基连续进料到反应器中,稀释率为2.0 d-1,并通过孔隙尺寸为0.2 µm的KrosFlo®中空纤维聚醚砜膜(Spectrumlabs, RanchoDominguez, USA)从反应器中连续除去发酵液,以便将细胞保留在反应器中。
对于主培养,将在250毫升瓶内的100毫升新鲜Veri01培养基用来自预培养的离心细胞接种至OD600nm为0.1。添加额外的1毫升的6%(w/w)TOPO在十七烷中的混合物。将培养物用丁基橡胶塞封盖,并在100% CO2气氛下,在37℃和150 rpm下在开放式水浴振荡器中温育43小时。
在培养过程中,采取了几个5毫升样品以测定OD600nm、pH和产物形成。通过半定量1H-NMR光谱法来进行产物浓度测定。使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)作为内部定量标准。
在主培养过程中,丁酸盐的浓度由0.15 g/L提高至2.82 g/L,并且己酸盐的浓度由0.19 g/L提高至2.85 g/L,而乙醇的浓度由14.34降低至9.58 g/l,并且乙酸盐的浓度由5.88降低至3.20 g/L。
在该时间过程中OD600nm由0.083提高至0.363。
实施例8
在十二烷和TOPO的存在下培养克氏梭菌
培养细菌克氏梭菌用于将乙醇和乙酸盐生物转化为己酸。为了原位提取制得的己酸,向培养物中添加十二烷与三辛基氧化膦(TOPO)的混合物。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
对于预培养,将250毫升Veri01培养基(pH 7.0;10 g/L乙酸钾,0.31 g/L K2HPO4,0.23 g/L KH2PO4,0.25 g/L NH4Cl,0.20 g/L MgSO4 X 7H2O,10 µl /L HCl(7.7 M),1.5mg/L FeCl2 X 4H2O,36 µg/L ZnCl2,64 µg/L MnCl2 X 4H2O,6 µg/L H3BO3,190 µg/L CoCl2X 6H2O,1.2 µg/L CuCl2 X 6H2O,24 µg/L NiCl2 X 6H2O,36 µg/L Na2MO4 X 2H2O,0.5 mg/LNaOH,3 µg/L Na2SeO3 X 5H2O,4 µg/L Na2WO4 X 2H2O,100 µg/L维生素B12,80 µg/L对氨基苯甲酸,20 µg/L D(+)生物素,200 μg/L烟酸,100 µg/L D-泛酸钙,300 μg/L盐酸吡哆醇,200 μg/l硫胺素-HCl X 2H2O,20 ml/L乙醇,2.5 g/L NaHCO3,65 mg/L甘氨酸,24 mg/L组氨酸,64.6 mg/L异亮氨酸,93.8 mg/L亮氨酸,103 mg/L赖氨酸,60.4 mg/L精氨酸,21.64 mg/L L-半胱氨酸-HCl,21 mg/L蛋氨酸,52 mg/L脯氨酸,56.8 mg/L丝氨酸,59 mg/L苏氨酸,75.8 mg/L缬氨酸)用10毫升克氏梭菌的活培养物接种至起始OD600nm为0.1。
在1000毫升耐压玻璃瓶中在37℃、150 rpm以及100% CO2的1 L/h的通风速率下,在开放式水浴振荡器中进行培养671小时。将气体排放到反应器的顶部空间。通过自动添加100 g/L NaOH溶液将pH保持在6.2。将新鲜的培养基连续进料到反应器中,稀释率为2.0 d-1,并通过孔隙尺寸为0.2 µm的KrosFlo®中空纤维聚醚砜膜(Spectrumlabs, RanchoDominguez, USA)从反应器中连续除去发酵液,以便将细胞保留在反应器中。
对于主培养,将在250毫升瓶内的100毫升新鲜Veri01培养基用来自预培养的离心细胞接种至OD600nm为0.1。添加额外的1毫升的6%(w/w)TOPO在十二烷中的混合物。将培养物用丁基橡胶塞封盖,并在100% CO2气氛下,在37℃和150 rpm下在开放式水浴振荡器中温育43小时。
在培养过程中,采取了几个5毫升样品以测定OD600nm、pH和产物形成。通过半定量1H-NMR光谱法来测定产物浓度。使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)作为内部定量标准。
在主培养过程中,丁酸盐的浓度由0.14 g/L提高至2.62 g/L,并且己酸盐的浓度由0.22 g/L提高至2.05 g/L,而乙醇的浓度由14.62降低至10.64 g/l,并且乙酸盐的浓度由5.92降低至3.54 g/L。
在该时间过程中OD600nm由0.091提高至0.259。
实施例9
测定己酸在水和十六烷与TOPO的混合物之间的分配系数
在试验的所有阶段的过程中,从两个相中材取样本以测定pH和通过高效液相色谱法(HPLC)测定己酸的浓度。将100克5 g/kg己酸的水溶液和33克6%三辛基氧化膦(TOPO)在十六烷中的混合物装入分液漏斗,并在37℃下混合1分钟。然后将漏斗放置在三脚架环中并令乳液静置以自发分离。测量水相的pH。随后向漏斗中加入1M NaOH溶液并混合。重复分离和取样的步骤,直到水相中的pH达到6.2。此时从两相中采取样品以便随后进行分析。水相可以直接通过HPLC来分析。为了分析有机相,首先将稀释的己酸重新提取到水中(通过添加1 M NaOH使pH为12.0)并随后通过HPLC进行分析。由己酸在两相中的浓度计算己酸在水和具有6%的TOPO的十六烷的体系中的分配系数KD。
己酸在水和具有6%的TOPO的十六烷的体系中的分配系数KD在pH 6.2下为4.7。
实施例10
测定己酸在水和十七烷与TOPO的混合物之间的分配系数
在试验的所有阶段的过程中,从两个相中采取样本以测定pH和通过高效液相色谱法(HPLC)测定己酸的浓度。将100克5 g/kg己酸的水溶液和33克6%三辛基氧化膦(TOPO)在十七烷中的混合物装入分液漏斗,并在37℃下混合1分钟。随后将漏斗放置在三脚架环中并令乳液静置以自发分离。测量水相的pH。然后向漏斗中加入1M NaOH溶液并混合。重复分离和取样的步骤,直到水相中的pH达到6.2。此时从两相中采取样本以便随后进行分析。水相可以直接通过HPLC来分析。为了分析有机相,首先将稀释的己酸重新提取到水中(通过添加1 M NaOH使pH为12.0)并随后通过HPLC进行分析。由己酸在两相中的浓度计算己酸在水和具有6%的TOPO的十七烷的体系中的分配系数KD。
己酸在水和具有6%的TOPO的十七烷的体系中的分配系数KD在pH 6.2下为5.0。
实施例11
测定己酸在水和十四烷与TOPO的混合物之间的分配系数
在试验的所有阶段的过程中,从两个相中提取样本以测定pH和通过高效液相色谱法(HPLC)测定己酸的浓度。将130克5 g/kg己酸加0.5 g/kg乙酸的水溶液和15克6%三辛基氧化膦(TOPO)在十四烷中的混合物装入分液漏斗,并在37℃下混合1分钟。随后将漏斗放置在三脚架环中并令乳液静置以自发分离。测量水相的pH。然后向漏斗中加入1M NaOH溶液并混合。重复分离和取样的步骤,直到水相中的pH达到6.2。此时从两相中提取样本以便随后进行分析。水相可以直接通过HPLC来分析。为了分析有机相,首先将稀释的己酸重新提取到水中(通过添加1 M NaOH使pH为12.0)并随后通过HPLC进行分析。由己酸在两相中的浓度计算己酸在水和具有6%的TOPO的十四烷的体系中的分配系数KD。
己酸在水和具有6%的TOPO的十四烷的体系中的分配系数KD在pH 6.9下为1.3。
实施例12
在原位提取己酸的情况下培养克氏梭菌
培养细菌克氏梭菌用于将乙醇和乙酸盐生物转化为己酸。为了原位提取制得的己酸,将十四烷与三辛基氧化膦(TOPO)的混合物连续进行培养。所有培养步骤在厌氧条件下在可以用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中进行。
克氏梭菌的预培养在1000毫升耐压玻璃瓶内在250毫升EvoDM45培养基(pH 5.5;0.004 g/L乙酸镁,0.164 g/l乙酸钠,0.016 g/L乙酸钙,0.25 g/l乙酸钾,0.107 mL/LH3PO4(8.5%), 2.92 g/L乙酸铵,0.35 mg/L乙酸钴,1.245 mg/L乙酸镍,20 µg/L D-生物素,20 µg/L叶酸,10 µg/L盐酸吡哆醇,50 µg/L硫胺素-HCl,50 µg/L核黄素,50 µg/L烟酸,50µg/L泛酸钙,50 µg/L维生素B12,50 µg/L对氨基苯甲酸盐,50 µg/L硫辛酸,0.702 mg/L(NH4)2Fe(SO4)2 x 4H2O,1 ml/L KS-乙酸盐(93.5 mM),20 ml/L乙醇,0.37 g/L乙酸)中在37℃、150 rpm以及25% CO2和75% N2的混合物的1 L/h的通风速率下在开放式水浴振荡器中进行。将气体排放到反应器的顶部空间。通过自动添加2.5 M NH3溶液将pH保持在5.5。将新鲜的培养基连续进料到反应器中,稀释率为2.0 d-1,并通过孔隙尺寸为0.2 µm的KrosFlo®中空纤维聚醚砜膜(Spectrumlabs, Rancho Dominguez, USA)从反应器中连续除去发酵液,以便将细胞保留在反应器中,并保持OD600nm为~1.5。
对于主培养,将在1000毫升瓶内的150毫升EvoDM39培养基(pH 5.8;0.429 g/L乙酸镁,0.164 g/l乙酸钠,0.016 g/L乙酸钙,2.454 g/l乙酸钾,0.107 mL/L H3PO4(8.5%),1.01 mL/L乙酸,0.35 mg/L乙酸钴,1.245 mg/L乙酸镍,20 µg/L D-生物素,20 µg/L叶酸,10 µg/L盐酸吡哆醇,50 µg/L硫胺素-HCl,50 µg/L核黄素,50 µg/L烟酸,50 µg/L泛酸钙,50 µg/L维生素B12,50 µg/L对氨基苯甲酸盐,50 µg/L硫辛酸,0.702 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2x 4H2O,1 ml/L KS-乙酸盐(93.5 mM),20 ml/L乙醇,8.8 mL NH3溶液(2.5 mol/L),27.75ml/L乙酸(144 g/L))用100毫升来自预培养的细胞肉汤接种至OD600nm为0.71。
在37℃、150 rpm以及25% CO2和75% N2的混合物的1 L/h的通风速率下,在开放式水浴振荡器中进行培养65小时。将气体排放到反应器的顶部空间。通过自动添加2.5 M NH3溶液将pH保持在5.8。将新鲜的培养基连续进料到反应器中,稀释率为0.5 d-1,并通过保持OD600nm为~0.5从反应器中连续除去发酵液。向发酵液中添加附加的120克6%(w/w) TOPO在十四烷中的混合物。随后将该有机混合物连续进料到反应器中,并还从反应器中连续除去有机相,稀释率为1 d-1。
在培养过程中,从两相(水相和有机相)中采取了几个5毫升样品以确定OD600nm、pH和产物形成。通过半定量1H-NMR光谱法来对产物浓度进行测定。使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)作为内部定量标准。
在主培养过程中,在水相中,达到了8.18 g/L乙醇、3.20 g/L乙酸盐、1.81 g/L丁酸盐和0.81 g/L己酸盐的稳态浓度。OD600nm保持稳定在0.5。在有机相中,达到了0.43 g/kg乙醇、0.08 g/kg乙酸盐、1.13 g/kg丁酸盐和8.09 g/kg己酸盐的稳态浓度。在试验后,细胞保持存活,并转移至进一步培养。
由在两相中的浓度计算底物和产物在含水介质和具有6%的TOPO的十四烷的体系中的分配系数KD。
稳态下的KD对乙醇为0.05,对乙酸为0.03,对丁酸为0.62,对己酸为9.99。
Claims (12)
1.从含水发酵介质中提取己酸和/或其酯的方法,其中所述己酸和/或其酯由碳源通过特定细胞制得,所述方法包括:
(a)使所述含水发酵介质中的所述己酸和/或其酯与至少一种提取介质接触足以将所述己酸和/或其酯从所述含水发酵介质提取到所述提取介质中的时间,
(b)将具有提取的己酸和/或其酯的提取介质与含水发酵介质分离,
(c)通过使用漏斗、柱或蒸馏将所述提取介质与所述己酸和/或其酯分离,
其中所述提取介质包含:
- 至少一种烷基氧化膦和至少一种烷烃的混合物,
其中所述烷烃包含至少12个碳原子,
其中在生产羧酸和/或其酯时对其进行提取,
其中至少一种烷基氧化膦是三辛基氧化膦。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述烷烃包含12至18个碳原子。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述烷烃是十六烷。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述己酸由合成气产生,所述己酸的产生方法包括:
- 使合成气与能够进行Wood-Ljungdahl途径和乙醇-羧酸盐发酵的至少一种细菌接触以产生己酸。
5.如权利要求4所述的方法,其中细菌选自克氏梭菌和食一氧化碳梭菌。
6.如权利要求1或2所述的方法,其中至少一种烷基氧化膦对烷烃的重量比为1:100至1:10。
7.如权利要求1或2所述的方法,其中所述含水介质的pH保持在5.5至7之间。
8.如权利要求1或2所述的方法,其中在步骤(c)中,通过使用蒸馏将所述提取介质与所述己酸和/或其酯分离。
9.如权利要求1或2所述的方法,其中将所述提取介质再循环。
10.至少一种烷基氧化膦和烷烃的混合物用于从含水发酵介质中提取己酸和/或其酯的用途,其中所述己酸和/或其酯由碳源通过特定细胞制得,其中所述烷烃包含至少12个碳原子,其中所述从含水发酵介质中提取己酸和/或其酯通过根据权利要求1-9中任一项所述的方法来进行,其中至少一种烷基氧化膦是三辛基氧化膦(TOPO)。
11.如权利要求10所述的用途,其中所述烷烃包含12至18个碳原子。
12.如权利要求10或11所述的用途,其中所述烷烃是十六烷。
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