CN106190889A - 一种己酸发酵菌种及己酸提取方法 - Google Patents

一种己酸发酵菌种及己酸提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种己酸发酵菌种及己酸提取方法，所述己酸发酵菌种为js‑22‑03，js‑22‑07，js‑22‑12。本发明选育菌株传代稳定性较好，选育出的菌株比原菌株产率由1.20g/100mL提高1.90g/100mL；通过培养筛选获得高产菌株js‑22‑03，js‑22‑07，js‑22‑12三株菌种，具有发酵时间短、遗传性能稳定、产率高等特点，其发酵时间缩短到10天以内，己酸产率由原来的1.20g/100mL提高到1.90g/100mL以上。

Description

一种己酸发酵菌种及己酸提取方法
技术领域
本发明属于化学化工技术领域，尤其涉及一种己酸发酵菌种及己酸提取方法。
背景技术
20世纪60年代，研究发现浓香型窖池中的窖泥生长着大量的梭状芽孢杆菌，经筛选、培养能够产生大量的己酸。自1942年巴克(Barker)等首次报道并定名克氏梭菌(Clostridium kluyveri)以来的50多年中，国内外许多专家和学者对该细菌进行了一系列的研究。生物法生产的己酸产品广泛适用于食品添加剂、医药中间体、化妆品、香料、香精、脂肪醇行业的特点，产品极具市场竞争优势。外，随着化石性资源的枯竭以及对产品质量要求提高，化学合成产品面临新挑战，生物法生产己酸有很好开发前景。
现在已酸的生产是以化学合成的方法，通过化学法合成的己酸价格昂贵，而且环境污染严重。随着环境保护压力的日益增大，绿色化学和可持续化学概念的提出，人们把精力越来越多地投向环境友好的合成方法的研究。微生物发酵法生产己酸由于环境污染小，能耗低的特点，将成为行业发展的趋势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种己酸发酵菌种及己酸提取方法，旨在解决现在已酸的生产是以化学合成的方法，通过化学法合成的己酸价格昂贵，而且环境污染严重的问题。
本发明是这样实现的，一种己酸发酵菌种，所述己酸发酵菌种为js-22-03，js-22-07，js-22-12。
本发明的另一目的在于提供一种所述己酸发酵菌种的获取方法，所述获取方法包括：
复壮培养：保藏的己酸菌菌种活化，即热处理，将保藏菌种接入无菌水，85-90℃水浴中处理10min后，接入试管培养液中，在33-35℃培养6d，菌种在繁殖旺盛期，扩大培养到100ml三角瓶，摇匀后置于35℃恒温箱中静止培养7天；
扩大培养：取己酸菌种子100ml直接加入到三角瓶发酵培养基900mL中，包扎摇匀后置于35℃恒温箱中静止培养10天；
菌种的诱变:从分离纯化所得的菌株中，选择产酸量较高者作为出发菌，在斜面培养基上培养至对数生长期，收集细胞，用生理盐水洗涤，用缓冲液制成细胞悬液，稀释至细胞数为2×107个，取孢子悬液5mL，置于直径为90mm的平板中，垂直置于15W紫外灯下，照射距离30cm，照射时间为1min-4min，然后吸取己酸菌液lmL加入空培养皿中，倒入融化的固体培养基，待凝固后抽真空至0.08MP a，于33℃培养3d；
筛选:从经诱变处理的平板中，随机挑取生长良好的单菌落多份，分别接种到试管斜面上，33℃培养7-10d，用血球计数板测定己酸菌细胞数，从中挑选细胞数超过1亿个/mL的菌株为复筛菌株。
进一步，所述培养基组成：乙酸钠5g/L，酵母膏2g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸铵0.5g/L，碳酸钙15g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，乙醇2.5g/L。
本发明的另一目的在于提供一种所述己酸发酵菌种的发酵方法，所述发酵方法的条件为：接种量13％，培养温度35±0.5℃，初始pH 7.0，满装液量深层培养，培养周期9-10d，可获得最大产酸量为20.3g/L。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述己酸发酵菌种的己酸提取方法，所述己酸提取方法包括以下步骤：
发酵液→过滤→减压浓缩→精馏→检验→己酸。
进一步，所述提取参数控制：浓缩真空度0.09Mpa，精馏真空度0.09Mpa，顶温温度85℃、95℃。
本发明提供的己酸发酵菌种及己酸提取方法，选育菌株传代稳定性较好，选育出的菌株比原菌株产率由1.20g/100mL提高1.90g/100mL；通过培养筛选获得高产菌株js-22-03，js-22-07，js-22-12三株菌种，具有发酵时间短、遗传性能稳定、产率高等特点，其发酵时间缩短到10天以内，己酸产率由原来的1.20g/100mL提高到1.90g/100mL以上。己酸发酵生产试验，选育出高产己酸菌种1株；优化菌株从5L到500L发酵罐己酸发酵工艺条件，确定最佳工艺参数，为实现工业化发酵法生产己酸提供最适发酵工艺参数；菌株产酸在500L规模上平均达到1.80g/100ml，创新提制工艺；己酸提取收率达80％以上。接种量13％，培养温度35±0.5℃，初始pH 7.0，满装液量深层培养，培养周期9-10d，可获得最大产酸量为20.3g/L。
附图说明
图1是本发明实施例提供的己酸发酵菌种的获取方法流程图。
图2是本发明实施例提供的己酸含量变化的规律曲线示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的己酸发酵菌种的获取方法包括以下步骤：
S101：复壮培养：保藏的己酸菌菌种活化，即热处理，将保藏菌种接入无菌水，85-90℃水浴中处理10min后，接入试管培养液中，在33-35℃培养6d，菌种在繁殖旺盛期，扩大培养到100ml三角瓶，摇匀后置于35℃恒温箱中静止培养7天；
S102：扩大培养：取己酸菌种子100ml直接加入到三角瓶发酵培养基900mL中，包扎摇匀后置于35℃恒温箱中静止培养10天；
S103：菌种的诱变:从分离纯化所得的菌株中，选择产酸量较高者作为出发菌，在斜面培养基上培养至对数生长期，收集细胞，用生理盐水洗涤，用缓冲液制成细胞悬液，稀释至细胞数为2×107个，取孢子悬液5mL，置于直径为90mm的平板中，垂直置于15W紫外灯下，照射距离30cm，照射时间为1min-4min，然后吸取己酸菌液lmL加入空培养皿中，倒入融化的固体培养基，待凝固后抽真空至0.08MP a，于33℃培养3d；
S104：筛选:从经诱变处理的平板中，随机挑取生长良好的单菌落多份，分别接种到试管斜面上，33℃培养7-10d，用血球计数板测定己酸菌细胞数，从中挑选细胞数超过1亿个/mL的菌株为复筛菌株。
本发明实施例的己酸的提取方法包括以下步骤：
发酵液→过滤→减压浓缩→精馏→检验→己酸。
提取参数控制：浓缩真空度0.09Mpa，精馏真空度0.09Mpa，顶温温度85℃、95℃，提制收得率≥80％，生产出己酸产品达到食品级标准，己酸含量≥98％。
下面结合试验对本发明的应用效果作详细的描述。
第一部分 菌种选育的研究
己酸是一种天然香料，又名单油酸，无色或澄黄色，油状液体，有不愉快气味，比重0.9265g/cm3，沸点205度，易溶于醇和醚，微溶于水。是合成己酸乙酯、烯丙酯、异戊酯等重要香料的主要原料，广泛用于化妆品、食品工业、饮料、卷烟、医药、饲料等行业。
从窖泥中自行筛选的一株梭状芽孢杆菌js-03为出发菌株，进行复合诱变处理，先后进行了紫外线照射和CO60照射以及亚硝基胍等物理化学方法诱变处理，通过培养筛选获得高产菌株js-22-03，js-22-07，js-22-12三株菌种，具有发酵时间短、遗传性能稳定、产率高等特点，其发酵时间缩短到10天以内，己酸产率由原来的1.20g/100mL提高到1.90g/100mL以上。
在选育出优良菌种基础上，开展5L罐发酵试验研究，优化发酵控制条件，5L发酵罐平均产酸达1.91g/100mL，最高达2.01g/100mL。对500L罐发酵生产己酸进行相应的发酵研究和提取研究。针对己酸这一产品的物理和化学特性，在对发酵液中产品提取方面，摸索出了一条工艺合理的己酸提制工艺路线。
1.材料与方法：
1.1 菌种
以js-03为出发菌种。
1.1.1 仪器与设备
DSP-280A手提式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SXK-103单人净化工作台：新蚌净化设备有限公司；SL-N电子天平：上海民桥精密分析仪器厂；FA/TA电子天平：上海民桥精密分析仪器厂；UB100I显微镜：重庆澳浦光电技术有限公司；HG72-1恒温干燥箱：上海市跃进医疗器件厂；HHB11厌氧培养箱：上海市跃进医疗器件厂；冰箱：容声；SC3610离心机：科大创新股份有限公司；不锈钢电热蒸馏水器：北京市中兴伟业仪器有限公司；50L全自动发酵罐：镇江东方生物工程设备技术公司；液相色谱；PHS-25酸度计：上海伟业仪器有限公司；上海三申医疗器有限公司；常规玻璃仪器。
1.2 材料
乙酸钠、乙醇、硫酸铵、酵母膏、硫酸镁、硫酸钙、磷酸二氢钾、氢氧化钠、琼脂等。均为分析纯，购自西陇化工股份有限公司。
1.3 培养基
1.3.1 斜面培养基配方(g/L)：
乙酸钠5，KH2PO4 0.4，MgSO4·7H2O 0.2，(NH4)2SO4 0.5，酵母膏2，琼脂20，调节PH6.9-7.1。
1.3.2 种子培养基配方(g/L)：
乙酸钠5，酵母膏2，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO4 8，pH 7.0，121℃灭菌20min。
碳酸钙15(单独干热灭菌，接种前加入)。
1.3.3 三角瓶发酵培养基配方(g/L)：
乙酸钠5，酵母膏2，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 8，pH 6.9，121℃灭菌20min。
碳酸钙15(单独干热灭菌，接种前加入)，接种前加入2.5％乙醇。
1.3.4 发酵培养基配方(g/L)：
乙酸钠5，酵母膏2，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 8，pH 6.9，121℃灭菌20min。
碳酸钙15(单独干热灭菌，接种前加入)，接种前加入2.5％乙醇。
1.4、己酸菌种子培养方式
复壮培养：保藏的己酸菌菌种活化，即热处理，将保藏菌种接入无菌水，85-90℃水浴中处理10min后，接入试管培养液中，在33-35℃培养6d，菌种在繁殖旺盛期，扩大培养到100ml三角瓶，摇匀后置于35℃恒温箱中静止培养7天。
扩大培养：取己酸菌种子100ml直接加入到三角瓶发酵培养基900mL中，包扎摇匀后置于35℃恒温箱中静止培养10天。
1.5、菌种的诱变
菌种的诱变:从分离纯化所得的菌株中，选择产酸量较高者作为出发菌，在斜面培养基上培养至对数生长期，收集细胞，用生理盐水洗涤，用缓冲液制成细胞悬液，稀释至细胞数为2×107个，取孢子悬液5mL，置于直径为90mm的平板中，垂直置于15W紫外灯下，照射距离30cm左右，照射时间为1min-4min，然后吸取己酸菌液lmL加入空培养皿中，倒入融化的固体培养基，待凝固后抽真空至0.08MP a，于33℃培养3d。
筛选:从经诱变处理的平板中，随机挑取生长良好的单菌落多份，分别接种到试管斜面上，33℃培养7-10d，用血球计数板测定己酸菌细胞数，从中挑选细胞数超过1亿个/mL的菌株为复筛菌株。检测复筛所得菌株发酵液的己酸含量，选择出产酸能力，明显高于出发菌的菌株，再经分离培养，继续驯化，直至选出性能优良、遗传性状稳定的理想菌株。
1.5、分析方法
1.5.1 己酸定性分析—硫酸铜显色法
取己酸菌种液2mL，加2％硫酸铜溶液2mL、乙醚1mL，振荡摇匀后静置，使之反应分层。观察乙醚层颜色，呈现的蓝色，颜色越深，己酸含量越高。
1.5.2 己酸定量分析—比色法
1mol/L三乙醇胺：取15g含75％的三乙醇胺用蒸馏水定容至100mL。
铜试剂：取1M三乙醇胺9份，1mol/L醋酸溶液1份，6.45％硝酸铜溶液10份，在临测定前一并混合。
显色剂：取二乙基二硫代氨基甲酸钠(简称DDC)0.1g，溶于重蒸的正丁醇100mL中。
操作
先将己酸发酵液用1mol/L硫酸调pH至2～3，取稀释10倍后的该酸化液2～3mL置于分液漏斗，再加入铜试剂3mL，然后加氯仿5mL，抽提2min，静止分层。接着用水洗氯仿层，待分层后倾去水，用4000r/min离心机离心5min。取离心后的氯仿层4mL，加DDC溶液0.4mL，混匀后于450mu波长下比色，由工作曲线计算己酸含量。
工作曲线绘制法：取0.1000g己酸，用氯仿溶解定容至100mL。吸取该标准己酸氯仿液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，分别同上述操作加铜试剂及氯仿(所取氯仿量应减去标准己酸氯仿液中的氯仿量)，抽提、水洗、加DDC溶液混匀后比色，将所得数据绘制成工作曲线。
1.5.3 总酸测定
发酵结束或发酵期间，取发酵液过滤，取滤清液2ml，用0.1mol/L氢氧化钠标准滴定，计算出总酸的生成量。
1.5.4 pH值测定
将发酵液4000r/min离心8min取上清液采用PHS-25型pH计测定。
2、菌种选育
2.1、分离纯化培养
菌种选育的目的在于原料品种的改变，筛选出以适应菌种的生长繁殖，缩短发酵周期，以适应规模化工业化生产要求的菌种。基于此目的，以js-03为出发菌株，先后进行了紫外线照射和CO60照射及亚硝基胍处理，初筛到六株游动活泼、带有鼓棰状芽孢的菌株，分别编号为js-22-03、js-22-07、js-22-12、js-22-17、js-22-23、js-22-28。进一步用比色法和绘制的己酸含量标准曲线(回归方程:y＝0.3366x+0.656R2＝0.9933)，来测定各菌株发酵液己酸的含量，从而确定其产酸能力，研究发现(表1)js-22-07的产酸能力最强(1.79g/100mL)，其发酵周期缩短到10天以内，将其作为亲株进行紫外照射处理。
表1分离纯化所得己酸菌株的产酸量
2.2、紫外线处理
紫外线处理时间对致死率和正突变率的影响紫外诱变后，将被处理液稀释图平板，计算菌落数。以亲株为对照，计算致死率。
杀菌率在70％-80％或更低，诱变效果更好。本发明发现(表2)紫外处理时间为3min时，致死率为68.3％，比较接近这个范围，因此将该处理组作为下一步的筛选对象。从紫外线处理3min的这一组的平板上随机挑选生长较大的菌落做进一步的初筛，以亲株为对照，根据己酸产量，确定正负突变株，结果初步筛选到5株正突变株，正突变率为8.33％。
表2 诱变时间与致死率
项目 菌落数/cfu/L 致死率/％
对照 120 -
紫外处理 1min 100 12.0
紫外处理 2min 78 35.0
紫外处理 3min 38 68.3
紫外处理 4min 10 91.7
2.3 突变株性能的研究
2.3.1、产酸能力
将突变株在液体乙酸钠培养基中培养10d后，检测发酵液己酸含量。研究发现(表3)突变株jsuv-2和jsuv-4的产酸能力最强，分别为1.98g/100mL和2.01g/100mL，较之亲株js-22-07分别增加了37％和34％，说明诱变效果明显。接下来，将对jsuv-2和jsuv-4的遗传稳定性展开研究。
表3 突变株发酵液的己酸含量
菌株编号 己酸产量g/100mL 产量增加率％
js-22-07 1.79 -
jsuv-1 1.90 6.14
jsuv-2 1.98 10.61
jsuv-3 1.85 3.35
jsuv-4 2.01 12.29
jsuv-5 1.89 5.59
2.3.2、遗传稳定性的研究
变异株经过多次传代后，容易发生回复突变，导致性能降低。为此，本发明分别将jsuv-2和jsuv-4经过斜面培养传代8次，并取第6代和第8代的菌株做己酸发酵实验，检测发酵液己酸含量。
研究发现(表4):较之突变1代，jsuv-4第6代和第8代的己酸产量都仅有1.49％和0.49％的变化，说明jsuv-4的遗传性能稳定。而jsuv-2第6代和第8代的己酸产量分别比第1代降低了7.58％和11.61％，说明jsuv-2经过多次传代后，发生了回复突变。
表4 突变株己酸产量随传代的变化
菌株编号 己酸产量g/100mL 产量变化率％
jsuv-2第1代 1.98 -
jsuv-2第6代 1.83 -7.58
jsuv-2第8代 1.75 -11.61
jsuv-4第1代 2.01 -
jsuv-4第6代 2.04 1.49
jsuv-4第8代 2.02 0.49
2.3.3、己酸菌的产酸规律
菌株于发酵培养液中，33℃培养10天，每天取样检测发酵液己酸含量，据检测结果绘制己酸含量变化的规律曲线(图2)。研究发现己酸菌突变前后，其产酸规律基本一致，第1-3天时，菌株繁殖生长，己酸含量增长较慢，第4-8天时，己酸含量增长较快，然后进入缓慢增长阶段，到第9天时，己酸含量最高之后略有下降。
突变株jsuv-4第1代和第8代的产酸规律也基本一致，进一步说明突变株的遗传性稳定。
3、发酵条件的优化研究
3.1、方法
3.1、实验方法
3.1.1、培养条件影响因素
分别从培养时间、初始pH、温度、接种量及装液量等培养条件考察各因素对该菌系生长的影响；己酸水平为考察依据。
3.1.2、培养基影响因素
分别从碳源、氮源、乙醇添加量、NaAc添加量及CaCO3添加量考察各因素对该菌系生长的影响，以产己酸水平为考察依据。
3.1.3、正交实验确定最佳培养条件
通过单因素实验结果分析，选取影响该菌系生长的关键因素进行正交实验设计，通过正交实验获得其最佳培养条件，并以最佳培养条件进行扩大培养试验研究。
3.2、结果与分析
以js-22-07为发酵菌株进行三角瓶发酵条件的研究，以期优化出菌株产酸的最佳发酵条件。由于梭状芽孢杆菌属厌氧发酵，除通风试验研究外，三角瓶均按100％装料。
3.2.1、正交实验确定最佳培养基
以单因素试验结果为基础，选取影响该己酸菌系生长的关键因素：乙酸钠、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸铵等进行正交试验，以产酸为指标。
表5 优化发酵培养基因素水平表
表6 正交试验结果分析表
编号 A B C D 己酸产量(g/L)
1 1 1 1 1 17.1
2 1 2 2 2 16.5
3 1 3 3 3 8.5
4 2 1 2 3 20.1
5 2 2 3 1 12.7
6 2 3 1 2 18.1
7 3 1 3 2 17.0
8 3 2 1 3 8.0
9 3 3 2 1 10.5
表7 正交试验结果分析
误差源 A B C D
均值1 14.033 18.067 14.400 13.433
均值2 16.967 12.400 15.700 17.200
均值3 11.833 12.367 12.733 12.200
极差 5.133 5.700 2.967 5.000
由表6、表7结果可以看出，该己酸菌的培养过程中，乙酸钠、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸铵的含量对产酸具有一定的影响。
由表5结果分析可看出，影响主次为酵母膏＞乙酸钠＞硫酸铵＞磷酸二氢钾。主要影响因素取最好水平，次要影响因素选取适当的水平，可以确定其最优培养水平组合为A2B1C2D2，即乙酸钠5g/L、酵母膏2g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸铵0.5g/L。
3.2.2、培养基碳源对己酸菌株发酵的影响
在确定了发酵最优配方后，在培养基其它条件不变的情况下，本发明对淀粉水解糖、葡萄糖、蔗糖、乙酸、乳酸、木糖等碳源对菌株产己酸的影响进行了研究，以考察碳源2.8％含量替代EAM培养基中乙醇，其它成分不变，用相同条件培养10d，对发酵液进行己酸分析，测定结果见表八。
从表八可以看出，己酸菌对碳源的要求具有专一性，且只有当培养基中同时含有乙醇和乙酸钠时，及产酸水平最高。
表8 碳源种类对己酸产量的影响
3.2.3 氮源对己酸菌发酵的影响
采用三角瓶发酵培养基，按0.05％(NH4)2SO4的含氮量折算，NH4Cl 0.04％、脲0.028％及NaNO3 0.77％替代(NH4)2SO4，其它组分不变，发酵10天后，对发酵液进行己酸分析，结果见表9。
表9 氮源对己酸菌系生长影响
氮源 NH4Cl NaNO3 脲 (NH4)2SO4
己酸产量(g/L) 14.5 2.6 8.9 16.9
不同无机氮源对其生长及产酸能力均有不同程度的影响，最适无机氮源为(NH4)2SO4；NaNO3对其产酸能力有抑制作用。
3.2.4、PH对菌株己酸发酵的影响
采用三角瓶发酵培养基，在培养基其它条件不变的情况下，将培养基调成不同的PH，观察PH对产酸影响，用0.1％NaOH调节初始pH，为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0及7.5，接种量13％，发酵9天后，对发酵液进行己酸分析。
表10 初始PH对己酸发酵的影响
初始pH 4.0 5.0 6.0 6.5 7.0 7.5
己酸量(g/100mL) 1.21 1.45 1.70 1.92 1.98 1.76
研究结果表明，己酸的生产对PH敏感，己酸菌最适PH在6.5～7.0之间，见表10。
3.2.5、温度对菌株发酵产酸的影响
采用三角瓶发酵培养基，在培养基其它条件不变的情况下，研究发酵温度对产酸影响，温度控制为25℃、27℃、30℃、33℃、35℃、40℃、45℃，接种量13％，发酵9天后，对发酵液进行己酸分析。
表11 发酵温度对己酸发酵的影响
温度(℃) 25 27 30 33 35 40 45
己酸量(g/100mL) 1.41 1.53 1.75 1.83 1.94 1.75 1.32
己酸菌的营养细胞最适宜的发酵温度为34～36℃，在这一温度范围下，己酸菌的繁殖速度最快，产生己酸最多，发酵温度大于36℃死亡速度最快。
在不同温度下用同样培养基对己酸菌进行分别培养9天，实验结果见表7。不同发酵温度对产酸的影响结果表明，菌株发酵的最适温度为35℃。
3.2.6、接种量对己酸生长的影响
采用三角瓶发酵培养基，种子液接入量分别为5％、7％、9％、11％、12％、13％和15％，其他组分不变，培养9d后，对发酵液进行己酸分析。
表12 接种量对己酸发酵的影响
接种量(％) 5 7 9 11 12 13 15
己酸量(g/100mL) 1.72 1.76 1.80 1.83 1.94 1.95 1.89
从表12可见，不同的接种量对己酸菌系发酵产酸的影响不明显，接种量为13％范围内，培养9天后，己酸产率较好。
3.2.7、发酵时间对己酸菌株产酸的影响
在其它条件不变的情况下，培养不同时间，取出测定己酸产量。
表13 发酵时间对己酸发酵的影响试验数据
结果表明，菌株发酵第2天开始产酸，产量很慢，第6～8天后产酸速度达到高峰，第10天开始下降，第11天以后基本不产酸，因此，发酵周期在9左右天比较合适。
3.2.8、装液量系数(空气系数)对己酸菌株产酸生长的影响
采用三角瓶发酵培养，装液量分别40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％和100％，按13％的接种量，培养10天后，对发酵液进行己酸分析，结果见表14。
表14 装液量对己酸发酵的影响试验数据
从表十四结果可看出，装液量系数(空气系数)对己酸菌系生长的影响并不明显，满装液量的培养效果最好。
3.2.9、CaCO3含量对己酸菌株产酸生长的影响
采用三角瓶发酵培养基，其中CaCO3添加量分别为0、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％和3.0％，其他组分不变，接种量12％，发酵10天后，发酵液进行己酸分析测定，结果见表15。
表15 CaCO3含量对己酸发酵的影响试验数据
培养基中CaCO3含量对己酸菌生长具有一定的作用，含量达1.5％CaCO3己酸产量最高。
3.2.10、乙醇浓度对己酸菌株产酸的影响
采用三角瓶发酵培养基，其中乙醇添加量分别为0、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％，其他组分不变，接种量13％，试验结果如表16。
表16 乙醇浓度对己酸发酵的影响试验数据
乙醇浓度对己酸菌的代谢有很大的影响，乙醇是其生长必需物，该己酸菌有较好的耐乙醇性，乙醇含量在2.0％～3.0％范围内，产酸水平较高。
从表16中可看出，己酸菌适宜生长的环境乙醇浓度为2.0％～2.5％，其中乙醇浓度在2.5％时己酸产率最好。
试验结果表明，选育菌株传代稳定性较好，选育出的菌株比原菌株产率由1.20g/100mL提高1.90g/100mL。综合单因素实验与正交试验结果，确定菌株js-22-07最优培养基(g/L)组成：乙酸钠5，酵母膏2，磷酸氢二钾0.4，硫酸铵0.5，碳酸钙15，MgSO4·7H2O0.2，乙醇2.5％。
最优发酵条件：接种量13％，培养温度35±0.5℃，初始pH 7.0，满装液量深层培养，培养周期9-10d，可获得最大产酸量为20.3g/L。通过菌种选育和发酵条件实验研究，最后进行了5L罐发酵工艺研究，确定了最优的发酵条件和技术参数，为工业化生产打下了基础。
第二部分 5L罐发酵试验研究
在选育出优质高产梭状芽孢杆菌js-22-07菌株及相关的培养试验后，在取得充分数据的基础上，本发明进行了5L罐发酵试验，确定了最佳发酵配方及工艺控制条件，其发酵产酸平均达到1.91％。
试制产品纯度达98％以上，完全达到了合同要求的技术指标。
材料与方法：
一、菌种：
梭状芽孢杆菌js-22-07。
二、原辅材料
乙醇、乙酸钠、硫酸铵、酵母膏、硫酸镁、硫酸钙、磷酸二氢钾仪器设备5L发酵罐、分析仪器等。
三、配方
乙酸钠5，酵母膏2，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO4 8，pH 6.9。
碳酸钙15(单独干热灭菌，接种前加入)，接种前加入2.5％乙醇。
上述培养基灭菌条件：1kgf/cm2，蒸汽灭菌30分钟。
四、发酵工艺控制条件
1、投料体积：90％以上；
2、起始PH：7.0；
3、接种量：13％；
4、发酵温度：35±0.5℃；
5、搅拌速度：间歇搅拌；
6、发酵PH控制：6.8～7.1；
7、发酵时间：10天。
五、分析方法
1、总酸：用0.1N标准NaOH滴定；
2、PH值：用酸度计测定；
3、己酸含量：分光光度计下比色。
六、试验结果与讨论
5L罐发酵试验结果：
5L罐本发明进行了多批次发酵试验，其结果如表所示：
表1 5L罐发酵试验
试验编号 PH值 己酸含量(g/100ml) 发酵周期(天)
05 7.0 1.78 9
07 7.0 1.86 9.5
10 6.9 1.80 9.5
13 6.9 1.87 9.5
14 6.9 1.89 10
15 7.0 1.84 9.5
平均值 1.84
从表中可以看出梭状芽孢杆菌js-22-07菌株当己酸产量可达1.80％以上，平均为1.91％，说明该菌株的培养条件和发酵工艺合理，菌株活性稳定，产酸水平较高。
在5L罐发酵试验过程中，定期观察了梭状芽孢杆菌js-22-07菌株代谢变化情况，定期取样测定其PH值、己酸浓度等，结果如下：
表1 第13批次发酵罐发酵
表2 第14批次发酵罐发酵
表3 第15批次发酵罐发酵
结论：
5L罐发酵的各项指标为：
1、通过发酵生产试验，选育出了优质高产的己酸菌株js-22-07，发酵平均产酸1.91/100mL，发酵周期在9.5天左右，提取的己酸产品纯度达98％以上。
2、通过发酵生产试验，确定了发酵工艺条件及最佳工艺参数。
3、菌株产酸水平在5L规模一直稳定在1.85g/100mL以上，为下一步500L发酵罐的试验研究打下了良好的基
第三部分 500L罐发酵试验研究
在选育出优质高产己酸js-22-07菌株及相关的培养试验后，进行了5L罐发酵研究，在取得充分数据的基础上，进行了500L罐发酵条件试验研究，确定了较佳发酵配方及工艺控制条件。
其发酵产酸平均达到1.87g/100ml，试制产品纯度达98％以上，完全达到了合同要求的技术指标。
材料与方法：
一、菌种：
梭状芽孢杆菌js-22-07。
二、原辅材料
乙醇、乙酸钠、硫酸铵、酵母膏、硫酸镁、硫酸钙、磷酸二氢钾。
三、仪器设备
500L发酵罐、、分析仪器等。
四、配方
乙酸钠5，酵母膏2，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO4 8，pH 6.9。
碳酸钙15(单独干热灭菌，接种前加入)，接种前加入2.5％乙醇。
上述培养基灭菌条件：1kgf/cm2，蒸汽灭菌30分钟。
五、发酵工艺控制条件
1、投料体积：90％以上
2、起始PH：7.0
3、接种量：13％
4、发酵温度：35±0.5℃
5、搅拌速度：间歇搅拌
6、发酵pH控制：6.8～7.1
7、发酵时间：10天。
六、分析方法
4、总酸：用0.1N标准NaOH滴定
5、PH值：用酸度计测定
6、己酸含量：分光光度计下比色
七、试验结果与讨论
500L罐发酵试验结果
500L罐本发明进行了多批次发酵试验，其结果如表所示：
通过多批次发酵研究，连续三批次己酸发酵达到项目研究目标，梭状芽孢杆菌js-03-07菌株在500L发酵罐己酸产酸可达1.80g/100ml以上，平均为1.87g/100ml，发酵时间在10天(235小时)以内，说明该菌株的培养条件和发酵工艺合理，菌株活性稳定，产酸水平较高。
发酵情况
在500L罐发酵试验过程中，观察了梭状芽孢杆菌js-22-07代谢变化情况，定期取样测定其PH值、己酸浓度、总糖等，结果如下：
其它因素对发酵情况的影响
1、种子旺盛：种子嫩和老均直接影响发酵，最好的种子应该是生命力旺盛，活动性能强，外观无怪味，混而不黑，镜检形状粗壮，菌形整齐，具有一定数量为佳。
2、接种量：一般说来接种量在11～13％，接种量大可以缩短发酵周期，产酸快而高。
3、防止杂菌：培养基要彻底灭菌，种子罐和发酵罐必须严格灭菌，消除杂菌死角。
4、温度：影响正常大罐培养温度为35℃左右，温度过低，发酵缓慢，温度过高，杂菌易感染，对己酸起到抑制作用，因而适宜的温度是个关键，在操作中温度不要波动过大，最好采用自动控制。
5、厌气条件：己酸发酵时，应尽可能造成一种厌气条件，密闭发酵，发酵液尽量满罐，间歇搅拌，减少空气流通。
结论
500L罐发酵的各项指标为：
在5L发酵罐取得充分数据的基础上，进行了500L罐发酵中试研究，确定了最佳发酵配方及工艺控制条件，间歇搅拌，控制发酵pH值为7.0，温度为35℃，己酸产率在1.80g/100mL以上，平均产酸1.87g/100mL，发酵时间10天以内，达到国内领先水平，为己酸产业化生产打下了良好基础。
第四部分己酸提制工艺的研究
己酸是发酵产生有机酸，发酵液是复杂，其中除了所培养的微生物菌体及自溶成分外，还有未被微生物完全利用的糖类、蛋白质、无机盐以及微生物的各种代谢产物等。
己酸发酵液中，含有较多的蛋白质、无机盐等杂质，结合本产品的实际要求，拟采用浓缩、精馏提制手段除去这些杂质，由于发酵液中要提取的己酸起始浓度较低，而最后成品要求达到的纯度又较高，因此常需多步操作，而操作步骤越多目的物损失也越大，由此可见，尽量减少提取步骤是相当重要的。经研究开发，获得一条可行的提取工艺路线，产品总回收率达到80％以上。
1、工艺
根据己酸的性质采用蒸馏技术分离纯化己酸，提取工艺流程：
发酵液→过滤→减压浓缩→精馏→检验→己酸产品。
试验放大至中间试验规模，提取总收率≥80％，得到产品己酸含量达到98％以上无色或淡黄色油状液体。
2、主要设备
恒温水浴锅、真空旋转蒸发器、离心机、板框过滤机、真空浓缩系统、离心泵、不同大小精馏塔、冷凝器，真空泵等。
3、提取试验研究
3.1、5L发酵罐小试研究
3.1.1、5L发酵罐发酵液过滤
发酵液在罐中用冷水冷却，然后以8000rpm离心机离心弃掉沉淀，清除菌体等水不溶杂质，收集液体。
表1 5L发酵罐过滤试验研究
3.1.2、5L发酵罐滤清液浓缩
5L发酵罐发酵液经过滤后真空浓缩，将三批滤清液置于旋转蒸发器烧瓶中，装量30-35％，65℃水浴恒温，浓缩真空度0.09Mpa。
浓缩至己酸含量达到30-35％左右，时间6小时左右。
表2 5L发酵罐浓缩试验研究
3.1.2、5L发酵罐浓缩液精馏
浓缩到总酸含量约30-35％，进入精馏塔精馏分离己酸，精馏真空度0.09Mpa，初始顶温控制85℃，调整控制回流，再提高到95℃，收集己酸，检测己酸含量。
表3 5L发酵罐精馏试验研究
采用蒸馏技术分离纯化己酸，提取工艺流程短，各工序损耗较小，对5L发酵罐的研究表明，各工序的收率在90％以上，总收率达到76.34％。
提取参数控制：浓缩真空度0.09Mpa，精馏真空度0.09Mpa，顶温温度85℃、95℃。
3.2、500L发酵罐扩大试验研究
3.2.1、500L发酵罐发酵液过滤
发酵液放罐后，由于大量营养物质的存在易于感染杂菌，这些都会引起产品的破坏，故发酵液不宜存放过久，应尽快进行提取。
过滤前首先检查过滤设备、滤布等是否正常，在正常的情况下才启动设备，缓缓进料。待形成滤层后，保持正常压力，进行过滤。过滤的滤液必须清亮透彻，过滤结束时，滤饼必须洗至含酸＜0.1％，压滤液非不溶性物质小于0.1％。
表4 500L发酵罐过滤试验研究
3.2.2.、滤清液的浓缩
500L发酵罐发酵液(3批)经过滤后真空浓缩，将滤清液置于真空浓缩罐中进行浓缩，装量30-35％，温度控制在64-68℃，浓缩真空度0.09Mpa。
浓缩至己酸含量达到33-38％左右，时间6-8小时左右。
表5 500L发酵罐浓缩试验研究
3.2.3、精馏
将浓缩液(分三批)进入精馏塔精馏分离己酸，精馏真空度0.09Mpa，初始顶温控制85℃，调整控制回流，再提高到95℃，收集己酸，检测己酸含量。
表6 500L发酵罐精馏试验研究
3.4、小结
根据己酸的性质采用蒸馏技术分离纯化己酸，提取工艺流程：
发酵液→过滤→减压浓缩→精馏→检验→己酸。
提取参数控制：浓缩真空度0.09Mpa，精馏真空度0.09Mpa，顶温温度85℃、95℃，提制收得率≥80％，生产出己酸产品达到食品级标准，己酸含量≥98％。
4、己酸产品标准
4.1、己酸产品标准
产品的主要理化指标见下表。
4.2、相对密度
按照GB/11540 香料 相对密度测定方法。
4.2、折光指数
按照GB/T14454.1 香料 折光指数测定方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种己酸发酵菌种，其特征在于，所述己酸发酵菌种为js-22-03，js-22-07，js-22-12。
2.一种如权利要求1所述己酸发酵菌种的获取方法，其特征在于，所述获取方法包括：
复壮培养：己酸菌菌种活化，将菌种接入无菌水，85-90℃水浴中处理10min后，接入试管培养液中，在33-35℃培养6d，菌种在繁殖旺盛期，扩大培养到100ml三角瓶，摇匀后置于35℃恒温箱中静止培养7天；
扩大培养：取己酸菌种子100ml直接加入到三角瓶发酵培养基900mL中，包扎摇匀后置于35℃恒温箱中静止培养10天；
菌种的诱变:从分离纯化所得的菌株中，选择产酸量高者作为出发菌，在斜面培养基上培养至对数生长期，收集细胞，用生理盐水洗涤，用缓冲液制成细胞悬液，稀释至细胞数为2×107个，取孢子悬液5mL，置于直径为90mm的平板中，垂直置于15W紫外灯下，照射距离30cm，照射时间为1min-4min，然后吸取己酸菌液lmL加入空培养皿中，倒入融化的固体培养基，待凝固后抽真空至0.08MPa，于33℃培养3d；
筛选:从经诱变处理的平板中，随机挑取生长良好的单菌落多份，分别接种到试管斜面上，33℃培养7-10d，用血球计数板测定己酸菌细胞数，从中挑选细胞数超过1亿个/mL的菌株为复筛菌株。
3.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述培养基组成：乙酸钠5g/L，酵母膏2g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸铵0.5g/L，碳酸钙15g/L，MgS04·7H2O 0.2g/L，乙醇2.5g/L。
4.一种如权利要求1所述己酸发酵菌种的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法的条件为：接种量13％，培养温度35±0.5℃，初始pH 7.0，满装液量深层培养，培养周期9-10d，获得最大产酸量为20.3g/L。
5.一种利用如权利要求1所述己酸发酵菌种的己酸提取方法，其特征在于，所述己酸提取方法的提取参数控制：浓缩真空度0.09Mpa，精馏真空度0.09Mpa，顶温温度85℃、95℃。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834177A (zh) * 2017-02-21 2017-06-13 中国科学院成都生物研究所 一株瘤胃菌及其应用
CN108865942A (zh) * 2018-07-18 2018-11-23 安徽金种子酒业股份有限公司 一种不加CaCO3培养己酸菌的配方及己酸菌培养方法
CN109971686A (zh) * 2019-04-29 2019-07-05 四川轻化工大学 一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法
CN111100882A (zh) * 2020-01-17 2020-05-05 江南大学 一种强化混合菌群产己酸的方法
CN111218484A (zh) * 2020-01-16 2020-06-02 江南大学 一种通过外源添加无机碳源对己酸发酵强化的方法
CN111699170A (zh) * 2018-02-15 2020-09-22 赢创运营有限公司 羧酸的提取
CN113373182A (zh) * 2021-06-17 2021-09-10 四川剑南春（集团）有限责任公司 一种回收生物发酵液中己酸的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1772878A (zh) * 2005-09-01 2006-05-17 马荣山 窖泥己酸菌培养技术
CN101074419A (zh) * 2006-05-18 2007-11-21 姚云 人工老窖培养己酸菌技术
CN101942405A (zh) * 2010-07-27 2011-01-12 湖北工业大学 一种己酸菌
CN105820983A (zh) * 2016-05-03 2016-08-03 泸州职业技术学院 一种己酸培养基及其己酸菌酯化液的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1772878A (zh) * 2005-09-01 2006-05-17 马荣山 窖泥己酸菌培养技术
CN101074419A (zh) * 2006-05-18 2007-11-21 姚云 人工老窖培养己酸菌技术
CN101942405A (zh) * 2010-07-27 2011-01-12 湖北工业大学 一种己酸菌
CN105820983A (zh) * 2016-05-03 2016-08-03 泸州职业技术学院 一种己酸培养基及其己酸菌酯化液的制备方法

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834177A (zh) * 2017-02-21 2017-06-13 中国科学院成都生物研究所 一株瘤胃菌及其应用
CN106834177B (zh) * 2017-02-21 2019-11-08 中国科学院成都生物研究所 一株瘤胃菌及其应用
CN111699170A (zh) * 2018-02-15 2020-09-22 赢创运营有限公司 羧酸的提取
CN111699170B (zh) * 2018-02-15 2024-02-02 赢创运营有限公司 羧酸的提取
CN108865942A (zh) * 2018-07-18 2018-11-23 安徽金种子酒业股份有限公司 一种不加CaCO3培养己酸菌的配方及己酸菌培养方法
CN109971686A (zh) * 2019-04-29 2019-07-05 四川轻化工大学 一种己酸菌增殖培养基、己酸发酵和己酸菌筛选方法
CN111218484A (zh) * 2020-01-16 2020-06-02 江南大学 一种通过外源添加无机碳源对己酸发酵强化的方法
CN111218484B (zh) * 2020-01-16 2021-10-22 江南大学 一种通过外源添加无机碳源对己酸发酵强化的方法
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