KR20230163472A - 고급 선형 알칸을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조합된 생명공학적 및 화학적 방법을 사용하여 고급 선형 알칸을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고급 알카논, 즉, 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 통해 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸, 바람직하게는 운데칸을 생산하는 것에 관한 것이다.
Description
본 발명은 조합된 생명공학적 및 화학적 방법을 사용하여 고급 선형 알칸을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고급 알카논, 즉, 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 통해 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸, 바람직하게는 운데칸을 생산하는 것에 관한 것이다.
오늘날의 연료는 이산화탄소 배출을 감소시키기 위해 대체되거나 또는 개선될 필요가 있다. 국내 및 국제 규제/법률 둘 다에 의해 운송 부문에서 상당한 이산화탄소 저감이 요구된다. 이들 요구사항을 충족시키기 위해, 기존의 차량 (트럭, 버스, 제트기 등)도 그의 이산화탄소 배출을 감소시켜야 한다. 저감을 위한 하나의 해결책은 이산화탄소 및 재생가능한 수소 또는 이들을 공급원료로 하여 제조된 저급 알칸산, 예를 들어 아세트산 또는 부탄산을 사용하여 합성된 연료 또는 연료의 성분, 예를 들어 고급 선형 알칸, 예컨대 운데칸일 수 있다. 따라서, 단순 유기 화합물, 예컨대 에탄올 및/또는 저급 선형 알칸산, 예컨대 아세트산 또는 부탄산으로부터 출발하여 고급 알칸, 예컨대 운데칸을 생산하기 위한 공정의 제공에 대한 요구가 존재한다. 오늘날 대부분의 에탄올은 식물이 공기 중에서 제거한 이산화탄소로부터 이미 생산되고 있다. 사탕수수, 옥수수와 같은 식물 또는 식물 잔재가 태양광 및 공기로부터 유래한 이산화탄소로부터 글루코스 유도체를 형성하는데 사용된다. 대안적으로, 에탄올은 또한 클로스트리디아와 같은 아세트산생성 유기체를 사용하여 이산화탄소 및 수소 및 일산화탄소로부터 형성될 수 있다.
공정의 제공에 대한 요구가 에탄올 및/또는 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산으로부터 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸을 생산하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 충족된다:
(a) 에탄올 및/또는 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산 또는 그의 임의의 염을 2개-탄소 쇄 연장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉시켜 중간체로서 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산 및/또는 그의 염 및/또는 그의 에스테르를 생산하는 단계;
(b) (a)로부터의 중간체, 그의 염 및/또는 그의 에스테르를 적어도 하나의 추출제를 사용하여 추출하며, 여기서 추출제는 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 임의적으로 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 적어도 하나의 트리알킬아민 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 2 옥틸-도데칸올과 같은 분지형 고급 알콜을 포함하는 것인 단계;
(c) (b)로부터의 추출된 중간체 및/또는 그의 에스테르 및 임의적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산을 적어도 하나의 케톤화 촉매와 접촉시켜 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논을 생성하는 단계;
(d) 단계 (c)로부터의 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논을 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논의 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 2급 선형 알칸올로의 촉매적 수소화를 위해 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 단계;
(e) 산성 불균질 촉매의 존재 하에 2급 알칸올을 탈수시켜 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 선형 알켄을 형성하는 단계; 및
(f) 단계 (e)에서 수득된 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알켄을 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 2급 선형 알칸으로의 촉매적 수소화를 위해 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 단계;
또는 단계 (e) 및 (f)를 탈수 및 수소화 특성을 제공하는 촉매 또는 촉매 혼합물을 사용하여 하나의 단일 단계로 조합하여, 이로써 단계 (d)에서 수득된 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 2급 선형 알칸올을 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 선형 알칸으로 직접적으로 수소화분해하는 단계.
탄소 쇄 연장을 수행하여 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 생산할 수 있는 단계 (a)에서의 미생물은 도 1에 따른 탄소-쇄 연장이 가능할 수 있는 임의의 유기체일 수 있다 (Jeon et al. Biotechnol Biofuels (2016) 9:129). 탄소 쇄 연장 경로는 또한 문헌 [Seedorf, H., et al., 2008]에도 개시되어 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은, 그의 야생형 형태에서는 탄소 쇄 연장이 가능하지 않지만 유전자 변형의 결과로 이러한 형질을 획득한 미생물을 또한 포함할 수 있다. 특히, (a)에서의 미생물은 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans) 및 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 특히 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 클로스트리디움 클루이베리일 수 있다.
도 1은 탄소-쇄 연장을 위한 미생물 대사 경로 예컨대 (a) 클로스트리디움 및 부티리비브리오(Butyrivibrio) 속에 의한 부티르산 (C4) 생산 (Kim BH, et al. Appl Environ Microbiol. 1984;48(4):764-70) 및 (b) 메가스파에라 엘스데니이(Megasphaera elsdenii) 및 클로스트리디움 클루이베리에서 가정되는 헥산산 생산 (Khan MA. Melbourne: Victoria University; 2006)을 제시한다.
본 발명에 따른 방법에서, 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산은 아세트산일 수 있고, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산은 부탄산 및 헥산산일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산은 프로판산일 수 있고, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산은 펜탄산일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산은 부탄산일 수 있고, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산은 헥산산일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산은 펜탄산일 수 있고, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산은 헵탄산일 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산은 바람직하게는 아세트산이고, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산은 바람직하게는 헥산산 또는 그의 에스테르이고, 단계 (a) 내지 (c)에서의 중간체 알칸산은 바람직하게는 헥산산이고, 단계 (c) 및 (d)에서의 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논은 바람직하게는 6-운데카논이고, 단계 (d) 및 (e)에서의 그리고 조합된 단계 (e) 및 (f)에서의 상응하는 2급 선형 알칸올은 바람직하게는 6-운데칸올이고, 단계 (e) 및 (f)에서의 선형 알켄은 바람직하게는 5-운데센이고 선형 알칸은 바람직하게는 도데칸이다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 (b)에서의 추출 단계는 사용된 추출제의 양에 대비하여 수율의 증가를 가능하게 한다. 예를 들어, 단지 순수한 알칸만이 사용된 경우와 동일한 양의 헥산산을 추출하는데 50 중량% 미만의 추출제가 사용될 수 있다. 따라서, 적은 부피의 추출제를 사용하여, 보다 큰 수율의 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 추출될 수 있다. 추출제는 또한 미생물에 유해하지 않다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제가 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 본 발명의 임의의 측면에 따라 생명공학적으로 생산되는 경우에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 수성 배지는, 특히 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 분리하는 단계 (b) 후에, 다시 단계 (a)로 재순환될 수 있다. 이러한 재순환 단계는, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제가 미생물에 독성이 아니기 때문에, 미생물이 재순환되고 재사용되는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에서 수성 배지를 재순환시키는 이러한 단계는 제1 사이클에서 단계 (b)로부터 처음에 추출되지 않았던 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산의 잔류물이 추가로 1회 또는 수성 배지가 재순환되는 수차례의 횟수만큼 추출될 기회를 갖도록 하는 추가의 이점을 갖는다. 추가로, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산은 증류에 의해 용이하게 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제로부터 분리될 수 있다. 그 이유는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 추출제보다 유의하게 더 낮은 비점에서 적어도 증류되기 때문이고, 증류를 통한 분리 후에 추출제가 용이하게 재순환될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 또한 단리된 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 수성 배지로부터 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 단리된 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산은 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 생산되었던 배지로부터 분리될 수 있는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 지칭할 수 있다. 하나의 예에서, 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산은 수성 배지 (예를 들어, 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 탄소 공급원으로부터 특정한 세포에 의해 생산되는 발효 배지)에서 생산될 수 있다. 단리된 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산은 수성 배지로부터 추출된 헥산산을 지칭할 수 있다. 특히, 추출 단계는 수성 배지로부터의 과잉의 물의 분리를 가능하게 하여, 이로써 추출된 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 함유하는 혼합물의 형성을 초래한다.
추출제는 또한 '추출 매질' 또는 '추출용 매질'로도 지칭될 수 있다. 추출제는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 원래 생산되었던 수성 배지로부터 본 발명의 임의의 방법에 따라 생산된 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 추출/단리하기 위해 사용될 수 있다. 추출 단계가 끝나면, 수성 배지로부터 과잉의 물이 제거되어, 이로써 추출된 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 함유하는 추출제가 초래될 수 있다. 특히, 추출 단계가 끝났을 때, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 추출되고 제거되고 나서 잔류하는 것은 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 생산하기 위해 사용된 세포가 함유된 발효 배지일 수 있고, 이들 세포는 발효 배지와 함께 이어서 단계 (a)를 위해 재순환될 수 있다. 통상의 기술자라면 제1 사이클 후에 발효 배지 및/또는 세포의 보충이 필요한지를 결정할 수 있을 것이다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 제1 사이클은 한 차례의 단계 (a) 내지 (c)를 수반한다. 이어서, 배지 및/또는 세포는 앞으로의 제2 사이클로부터 재순환될 수 있다. 추출제는 수성 배지로부터 헥산산을 추출하는 효율적인 수단을 초래할 수 있는 화합물의 조합을 포함할 수 있다. 특히, 추출제는 하기를 포함할 수 있다:
- 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는
- 적어도 하나의 트리알킬아민 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸.
본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 추출제 중으로 효율적으로 추출할 수 있다. 알킬-포스핀 옥시드 또는 트리알킬아민 및 적어도 하나의 알칸의 혼합물인 이러한 추출제는, 혼합물이 발효 배지의 존재 하에 목적하는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산을 추출하는데 효율적으로 작용하기 때문에, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에 적합한 것으로 간주될 수 있다. 특히, 알킬-포스핀 옥시드 또는 트리알킬아민 및 적어도 하나의 알칸의 혼합물은 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산의 추출을 위한 관련 기술분야에 현재 공지되어 있는 임의의 방법보다 더 잘 작용하는 것으로 간주될 수 있는데, 이는 임의의 특수 장비를 작동시킬 필요가 없고 높은 산물 수율로 수행하기가 비교적 용이하기 때문이다. 추가로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 또한 단계 (a)에 따른 미생물에 독성이 아니다.
추출제 중의 알칸은 적어도 12개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 알칸은 적어도 12-18개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 하나의 예에서, 알칸은 도데칸, 트리데칸, 테트라데칸, 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸 및 옥타데칸으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가의 예에서, 추출제는 알칸의 혼합물을 포함할 수 있다. 추출제 중의 알칸은 알킬-포스핀 옥시드 및/또는 트리알킬아민을 위한 용매로서 사용될 수 있다. 추출제 중의 알칸의 존재는 반응 온도 및 추출 온도가 35℃ - 45℃에 있도록 추출 온도를 낮은 온도에서 유지할 수 있게 한다. 보다 특히, 단계 (a)의 반응 온도 및 추출 온도는 본 발명의 임의의 측면에 따른 박테리아에 대해 최적인 온도, 즉, 37-40℃, 보다 특히 약 37℃일 수 있다. 양쪽 공정의 동시 수행을 가능하게 하는 것은 추출 단계 동안 알칸산을 추출할 수 있고 보다 많은 알칸산을 생산하기 위한 추가의 반응이 수행되도록 세포를 유지하는 추가의 이점을 갖는다. (알칸산을 생산하는) 반응 및 (알칸산의) 추출 공정 둘 다가 동일한 포트에서 실시될 수 있다. 또 다른 예에서, 양쪽 공정은 2개의 상이한 포트에서 실시된다. 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 알칸은 적어도 12 내지 18개의 탄소 원자를 포함하는데, 이는 12개 미만의 탄소 원자를 갖는 알칸과 비교하여 알칸의 비점이 증가하기 때문이다. 알칸의 높은 비점은 추출제로부터의 목적 산물 (알칸산)의 분리가 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 증류에 의해 수행되는 것을 가능하게 하여, 추출제가 알칸산으로부터 분리되고 재사용될 수 있도록 한다. 증류는 150 - 350℃의 온도에서 수행될 수 있다.
알킬-포스핀 옥시드는 OPX3의 화학식을 가지며, 여기서 X는 알킬이다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 적합한 알킬 포스핀 옥시드는 선형, 분지형 또는 시클릭 탄화수소로 구성된 알킬 기를 포함하며, 여기서 탄화수소는 1 내지 약 100개의 탄소 원자 및 1 내지 약 200개의 수소 원자로 구성된다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 알킬 포스핀 옥시드와 관련하여 사용된 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자, 빈번하게는 4 내지 15개의 탄소 원자, 또는 6 내지 12개의 탄소 원자를 가지며, 직쇄, 시클릭, 분지쇄, 또는 이들의 혼합물로 구성될 수 있는 탄화수소 기를 지칭할 수 있다. 알킬 포스핀 옥시드는 각각의 인 원자 상에 1 내지 3개의 알킬 기를 가질 수 있다. 하나의 예에서, 알킬 포스핀 옥시드는 P 상에 3개의 알킬 기를 갖는다. 일부 예에서, 알킬 기는 C4-C15 또는 C6-C12 알킬 기의 하나의 탄소 대신에 산소 원자를 포함할 수 있으며, 단, 산소 원자가 알킬 포스핀 옥시드의 P에 부착되지 않는다.
전형적으로, 알킬 포스핀 옥시드는 트리-옥틸포스핀 옥시드, 트리-부틸포스핀 옥시드, 옥틸포스핀 옥시드 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱더 특히, 알킬 포스핀 옥시드는 트리-옥틸포스핀 옥시드 (TOPO)일 수 있다.
트리알킬아민은 암모니아 (NH3)로부터 유래된 유기-화학 화합물로서, 그의 3개의 수소 원자가 알킬 라디칼에 의해 대체된 것이다. 트리알킬아민의 예는 디메틸에틸아민, 메틸디에틸아민, 트리에틸아민, 디메틸-n-프로필아민, 디메틸-i-프로필아민, 메틸디-n-프로필아민, 디메틸부틸아민, 트리옥틸아민 등이다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제에 사용되는 트리알킬아민은 물에 가용성이 아닐 수 있고 트리옥틸아민일 수 있다.
하나의 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 알킬-포스핀 옥시드 또는 트리알킬아민 및 적어도 하나의 알칸의 조합일 수 있다. 특히, 알칸은 적어도 12개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 보다 특히, 알칸은 12-18개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 하나의 예에서, 알칸은 도데칸, 트리데칸, 테트라데칸, 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸 및 옥타데칸으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가의 예에서, 알칸은 알칸의 혼합물일 수 있다.
추가의 예에서, 추출제는 알칸의 혼합물을 포함할 수 있다. 더욱더 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 TOPO 및 테트라데칸 또는 헥사데칸의 조합일 수 있다. 하나의 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 TOPO 및 12-18개의 탄소 원자를 포함하는 알칸의 혼합물의 조합일 수 있다.
트리옥틸포스핀 옥시드 (TOPO)는 화학식 OP(C8H17)3을 갖는 유기인 화합물이다. TOPO는 본 발명의 임의의 측면에 따른 적어도 하나의 알칸과 함께 추출제의 일부일 수 있다. 특히, TOPO 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸의 혼합물은 약 1:100 내지 1:10의 알칸에 대한 TOPO의 중량비를 포함할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제에서 TOPO 대 알칸의 중량비는 약 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:25, 1:20, 1:15, 또는 1:10일 수 있다. 더욱더 특히, TOPO 대 알칸의 중량비는 1:90 내지 1:10, 1:80 내지 1:10, 1:70 내지 1:10, 1:60 내지 1:10, 1:50 내지 1:10, 1:40 내지 1:10, 1:30 내지 1:10 또는 1:20 내지 1:10의 범위 내에서 선택될 수 있다. TOPO 대 알칸의 중량비는 1:40 내지 1:15 또는 1:25 내지 1:15일 수 있다. 하나의 예에서, TOPO 대 알칸의 중량비는 약 1:15일 수 있다. 예로서, 알칸이 헥사데칸일 수 있고, 따라서 TOPO 대 헥사데칸의 중량비가 약 1:15일 수 있다.
또 다른 예에서, 추출제가 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸에서의 TOPO의 용해도와 비교하여 추출제에 사용된 알칸에서 보다 큰 용해도를 갖는 알킬-포스핀 옥시드 또는 트리알킬아민을 포함하는 경우에, 알킬-포스핀 옥시드 (TOPO 이외의 것) 또는 트리알킬아민 대 알칸의 중량비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1일 수 있다. 하나의 예에서, 추출제는 트리헥실-포스핀 옥시드일 수 있고, 트리헥실-포스핀 옥시드 대 알칸의 비는 1:1일 수 있다. 다른 예에서, 추출제는 저급 쇄 알킬-포스핀 옥시드일 수 있고, 저급 쇄 알킬-포스핀 옥시드 대 알칸의 비는 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1일 수 있다. 이러한 경우에, 저급-쇄 알킬-포스핀 옥시드는 C1-C4 알킬 기를 갖는 포스핀 옥시드를 지칭한다. 또 다른 예에서, 추출제는 트리알킬아민일 수 있으며, 이는 알칸에서 포스핀 옥시드보다 더 큰 용해도를 갖는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 트리알킬아민은 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제에 알칸과 최대 1:1의 비로 존재할 수 있는 트리옥틸아민 (TOA)일 수 있다. 저급 쇄 길이의 아민은 훨씬 더 높은 비로 사용될 수 있다. 다른 예에서, 추출제는 저급 쇄 트리알킬아민일 수 있고, 저급 쇄 트리알킬아민 대 알칸의 비는 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1일 수 있다. 이러한 경우에, 저급-쇄 알킬-포스핀 옥시드는 C1-C4 알킬 기를 갖는 포스핀 옥시드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 '약'은 20 퍼센트 이내의 편차를 나타낸다. 특히, 본원에 사용된 용어 "약"은 주어진 측정치 또는 값의 +/- 20%, 보다 특히 +/-10%, 더욱더 특히 +/- 5%를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법의 단계 (b)에서, 알킬-포스핀 옥시드는 트리옥틸포스핀 옥시드, 옥틸포스핀 옥시드 및 그의 혼합물, 바람직하게는 트리옥틸포스핀 옥시드 (TOPO)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 알칸은 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸, 옥타데칸, 및 테트라데칸, 바람직하게는 테트라데칸으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 바람직하게는 TOPO 대 테트라데칸의 중량비는 1:100 내지 1:10이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법의 단계 (b)에서 수성 배지의 pH는 5.5 내지 8로 유지된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 단계 (a)에서, 에탄올 및/또는 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산, 예를 들어 아세트산, 프로판산, 부탄산 또는 펜탄산, 또는 그의 임의의 염은 2개-탄소 쇄 연장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉되어 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산, 부탄산 또는 펜탄산 및/또는 그의 염 및/또는 그의 에스테르를 생산한다.
하나의 예에서, 탄소 공급원은 아세테이트, 프로파노에이트, 부타노에이트 (부티레이트) 및 펜타노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 탄소 공급원과 조합된 에탄올일 수 있다. 특히, 탄소 공급원은 에탄올 및 아세테이트일 수 있다. 또 다른 예에서, 탄소 공급원은 에탄올 및 및 부티르산 (부탄산)의 조합일 수 있다. 하나의 예에서, 탄소 기질은 에탄올 단독일 수 있다. 또 다른 예에서, 탄소 기질은 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산, 예를 들어 아세테이트 단독일 수 있다.
2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산, 예를 들어 아세테이트, 및/또는 에탄올의 공급원은 이용가능성에 따라 달라질 수 있다. 하나의 예에서, 에탄올 및/또는 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산 (예를 들어 아세테이트)은 합성 가스 (합성가스) 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 탄수화물의 발효 산물일 수 있다. 특히, 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산 (예를 들어 아세테이트) 및/또는 에탄올 생산을 위한 탄소 공급원은 알콜, 알데히드, 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 덱스트로스, 락토스, 크실로스, 펜토스, 폴리올, 헥소스, 에탄올 및 합성 가스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 공급원의 혼합물이 탄소 공급원으로서 사용될 수 있다.
더욱더 특히, 탄소 공급원은 합성 가스 (합성가스)일 수 있다. 합성 가스는 적어도 하나의 아세트산생성 박테리아의 존재 하에 에탄올 및/또는 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산, 예를 들어 아세테이트로 전환될 수 있다.
이산화탄소 및/또는 일산화탄소를 포함하는 기질의 공급원과 관련하여, 통상의 기술자라면 탄소 공급원으로서 CO 및/또는 CO2를 제공하기 위한 많은 가능한 공급원이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 합성가스 또는 합성가스의 공급원이 예를 들어 수증기 개질, 부분 산화 또는 전기화학적 합성으로부터 물 또는 CO2로부터 유래될 수 있다. 실제로, 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산 (예를 들어 아세테이트) 및/또는 에탄올이 CO 및/또는 CO2의 공급원으로부터 형성될 수 있도록 충분한 양의 탄소를 미생물에 공급할 수 있는 임의의 가스 또는 임의의 가스 혼합물이 본 발명의 탄소 공급원으로서 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 아세트산생성 세포를 위한 탄소 공급원은 적어도 50 중량%, 적어도 70 중량%, 특히 적어도 90 중량%의 CO2 및/또는 CO를 포함하며, 여기서 중량 백분율 - %는 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포에 이용가능한 모든 탄소 공급원에 대한 것이다. 탄소 물질 공급원이 제공될 수 있다.
가스 형태의 탄소 공급원의 예는 효모 발효 또는 클로스트리디아 발효에 의해 생산되는 배기 가스 예컨대 합성 가스, 연도 가스 및 석유 정유 가스를 포함한다. 이들 배기 가스는 셀룰로스-함유 물질의 가스화 또는 석탄 가스화로부터 형성된다. 하나의 예에서, 이들 배기 가스가 반드시 다른 공정의 부산물로서 생산되어야 하는 것은 아니며, 특별히 본 발명의 혼합 배양물과의 사용을 위해 생산될 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 단계 (a)에서 사용되는 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산 (예를 들어 아세테이트) 및/또는 에탄올의 생산을 위한 탄소 공급원은 합성 가스일 수 있다. 합성 가스는 예를 들어 석탄 가스화의 부산물로서 생산될 수 있다. 따라서, 미생물은 폐기물인 물질을 고가치 자원으로 전환시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 합성 가스는 치환 및 비치환된 유기 화합물을 생산하기 위한 본 발명의 혼합 배양물과의 사용을 위해 광범위하게 이용가능한 저원가 농업 원료의 가스화의 부산물일 수 있다.
거의 모든 형태의 식생이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있기 때문에, 합성 가스로 전환될 수 있는 원료의 수많은 예가 존재한다. 특히, 원료는 다년생초 예컨대 억새, 옥수수짚, 가공 폐기물 예컨대 톱밥 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일반적으로, 합성 가스는 건조된 바이오매스의 가스화 장치에서, 주로 열분해, 부분 산화 및 수증기 개질을 통해 수득될 수 있으며, 여기서 합성 가스의 주요 산물은 CO, H2 및 CO2이다. 합성가스는 또한 CO2의 전기분해의 산물일 수 있다. 통상의 기술자라면 목적하는 양의 CO를 포함하는 합성가스를 생산하도록 CO2의 전기분해를 수행하기 위한 적합한 조건을 이해할 것이다.
통상적으로, 가스화 공정으로부터 수득된 합성 가스의 일부는 산물 수율을 최적화하고 타르의 형성을 피하기 위해 먼저 가공된다. 합성 가스 중 바람직하지 않은 타르 및 CO의 크래킹은 석회 및/또는 돌로마이트를 사용하여 수행될 수 있다.
전체 효율, 에탄올 및/또는 아세테이트 생산성 및/또는 전체 탄소 포집은 연속적인 가스 유동에서의 CO2, CO 및 H2의 화학량론에 따라 달라질 수 있다. 적용되는 연속적인 가스 유동은 CO2 및 H2의 조성을 가질 수 있다. 특히, 연속적인 가스 유동에서의 CO2의 농도 범위는 약 10-50 중량%, 특히 3 중량%일 수 있고, H2는 44 중량% 내지 84 중량%, 특히 64 내지 66.04 중량% 내에 있을 것이다. 또 다른 예에서, 연속적인 가스 유동은 또한 불활성 가스 예컨대 N2를, 최대 50 중량%의 N2 농도까지 포함할 수 있다.
보다 특히, CO 및/또는 CO2를 포함하는 탄소 공급원은 연속적인 가스 유동으로 아세트산생성 세포와 접촉한다. 더욱더 특히, 연속적인 가스 유동은 합성 가스를 포함한다. 이들 가스는 예를 들어 수성 배지로 개방되는 노즐, 프릿, 가스를 수성 배지로 공급하는 파이프 내의 멤브레인 등을 사용하여 공급될 수 있다.
통상의 기술자라면 스트림의 조성 및 유량을 적절한 간격으로 모니터링할 필요가 있을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 스트림의 조성의 제어는 목적하는 또는 바람직한 조성을 달성하도록 구성성분 스트림의 비율을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 블렌딩되는 스트림의 조성 및 유량이 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 모니터링될 수 있다. 하나의 예에서, 시스템은 적어도 2종의 스트림의 유량 및 조성을 연속적으로 모니터링하고 이들을 조합하여 최적의 조성의 연속적인 가스 유동으로 단일 블렌딩된 기질 스트림을 생산하도록, 그리고 최적화된 기질 스트림을 발효조로 보내도록 적합화된다.
환원제, 예를 들어 수소가 탄소 공급원과 함께 공급될 수 있다. 특히, 이러한 수소는 CO 및/또는 CO2가 공급 및/또는 사용될 때 공급될 수 있다. 하나의 예에서, 수소 가스는 존재하는 합성 가스의 일부이다. 또 다른 예에서, 합성 가스 중의 수소 가스가 불충분한 경우에, 추가의 수소 가스가 공급될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아세트산생성 박테리아"는 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로를 수행할 수 있으며, 이로써 CO, CO2 및/또는 수소를 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산, 예를 들어 아세테이트로 전환시킬 수 있는 미생물을 지칭한다. 이들 미생물은, 그의 야생형 형태에서는 우드-륭달 경로를 갖지 않지만 유전자 변형의 결과로 이러한 형질을 획득한 미생물을 포함한다. 이러한 미생물은 이. 콜라이(E. coli) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 미생물은 또한 일산화탄소영양 박테리아로서 공지되어 있을 수 있다. 현재, 아세트산생성 박테리아의 21개의 상이한 속이 관련 기술분야에 공지되어 있으며 (Drake et al., 2006), 이들은 또한 일부 클로스트리디아를 포함할 수 있다 (Drake & Kusel, 2005). 이들 박테리아는 에너지 공급원으로서의 수소와 함께, 탄소 공급원으로서 이산화탄소 또는 일산화탄소를 사용할 수 있다 (Wood, 1991). 추가로, 알콜, 알데히드, 카르복실산 뿐만 아니라 수많은 헥소스가 또한 탄소 공급원으로서 사용될 수 있다 (Drake et al., 2004). 아세테이트의 형성을 유도하는 환원성 경로를 아세틸-CoA 또는 우드-륭달 경로라 지칭한다.
특히, 아세트산생성 박테리아는 아세토아나에로비움 노테라(Acetoanaerobium notera) (ATCC 35199), 아세토네마 롱굼(Acetonema longum) (DSM 6540), 아세토박테리움 카르비놀리쿰(Acetobacterium carbinolicum) (DSM 2925), 아세토박테리움 말리쿰(Acetobacterium malicum) (DSM 4132), 아세토박테리움 종 no. 446 (Morinaga et al., 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194), 아세토박테리움 위에링가에(Acetobacterium wieringae) (DSM 1911), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii) (DSM 1030), 알칼리바쿨룸 바키(Alkalibaculum bacchi) (DSM 22112), 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304), 블라우티아 프로둑타(Blautia producta) (DSM 2950, 이전에는 루미노코쿠스 프로둑투스(Ruminococcus productus), 이전에는 펩토스트렙토코쿠스 프로둑투스(Peptostreptococcus productus)), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum) (DSM 1496), 클로스트리디움 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061, DSM 19630 및 DSM 23693), 클로스트리디움 카르복시디보란스 (DSM 15243), 클로스트리디움 코스카티이(Clostridium coskatii) (ATCC no. PTA-10522), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei) (ATCC BA-623), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum) (DSM 92), 클로스트리디움 글리콜리쿰(Clostridium glycolicum) (DSM 1288), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528), 클로스트리디움 륭달리이 C-01 (ATCC 55988), 클로스트리디움 륭달리이 ERI-2 (ATCC 55380), 클로스트리디움 륭달리이 O-52 (ATCC 55989), 클로스트리디움 마이옴베이(Clostridium mayombei) (DSM 6539), 클로스트리디움 메톡시벤조보란스(Clostridium methoxybenzovorans) (DSM 12182), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei) (DSM 15248), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes) (DSM 757), 클로스트리디움 종 ATCC 29797 (Schmidt et al., 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73), 데술포토마쿨룸 쿠즈네초비이(Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115), 데술포토마쿨룸 써모베조이쿰 아종 써모신트로피쿰(Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum) (DSM 14055), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) (DSM 20543), 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans) C2A (DSM 2834), 무렐라(Moorella) 종 HUC22-1 (Sakai et al., 2004, Biotechnol. Let., Vol. 29, p. 1607-1612), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica) (DSM 521, 이전에는 클로스트리디움 써모아세티쿰(Clostridium thermoaceticum)), 무렐라 써모아우토트로피카(Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974), 옥소박터 펜니기이(Oxobacter pfennigii) (DSM 322), 스포로무사 아에리보란스(Sporomusa aerivorans) (DSM 13326), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata) (DSM 2662), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica) (DSM 10669), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875), 스포로무사 테르미티다(Sporomusa termitida) (DSM 4440) 및 써모아나에로박터 키부이(Thermoanaerobacter kivui) (DSM 2030, 이전에는 아세토게니움 키부이(Acetogenium kivui))로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
보다 특히, 클로스트리디움 카르복시디보란스의 균주 ATCC BAA-624가 사용될 수 있다. 더욱더 특히, 예를 들어 U.S. 2007/0275447 및 U.S. 2008/0057554에 기재된 바와 같은 클로스트리디움 카르복시디보란스의 "P7" 및 "P11"로 라벨링된 박테리아 균주가 사용될 수 있다.
또 다른 특히 적합한 박테리아는 클로스트리디움 륭달리이일 수 있다. 특히, 클로스트리디움 륭달리이 PETC, 클로스트리디움 륭달리이 ERI2, 클로스트리디움 륭달리이 COL 및 클로스트리디움 륭달리이 O-52로 이루어진 군으로부터 선택된 균주가 합성 가스의 헥산산으로의 전환에 사용될 수 있다. 이들 균주는 예를 들어 WO 98/00558, WO 00/68407, ATCC 49587, ATCC 55988 및 ATCC 55989에 기재되어 있다.
4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산의 생산은 합성 가스 유래의 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산 (예를 들어 아세테이트) 및/또는 에탄올로부터의 생산이며, 탄소 쇄 연장이 가능한 미생물과 함께 아세트산생성 박테리아의 사용을 수반할 수 있다. 예를 들어, 클로스트리디움 륭달리이가 클로스트리디움 클루이베리와 동시에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 단일 아세트산생성 세포가 이들 유기체 둘 다의 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아세트산생성 박테리아는 우드-륭달 경로 및 탄소 쇄 연장 경로 둘 다를 수행할 수 있는 씨. 카르복시디보란스(C. carboxidivorans)일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 임의의 측면에 따른 단계 (a)에서 사용되는 에탄올 및/또는 아세테이트는 합성 가스의 발효 산물일 수 있거나 또는 다른 수단을 통해 수득될 수 있다. 이어서, 에탄올 및/또는 아세테이트는 단계 (a)에서 미생물과 접촉하게 될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "접촉시키는"은 미생물과 에탄올 및/또는 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산, 예를 들어 아세테이트 사이의 직접적인 접촉을 야기하는 것을 의미한다. 하나의 예에서, 에탄올이 탄소 공급원이고, 단계 (a)에서의 접촉은 에탄올을 단계 (a)의 미생물과 접촉시키는 것을 수반한다. 접촉은 직접적인 접촉일 수 있거나, 또는 세포를 에탄올로부터 분리하는 멤브레인 등을 포함할 수 있거나 또는 세포 및 에탄올이 2개의 상이한 구획에서 유지될 수 있는 등의 간접적인 접촉일 수 있다. 예를 들어, 단계 (b)에서 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산, 및 추출용 매질은 상이한 구획에 존재할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을 생산할 수 있는 미생물은 박테리아를 배양하기 위한 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있는 임의의 배양 배지, 기질, 조건, 및 공정을 사용하여 배양될 수 있다. 이는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르 (예를 들어 헥산산)가 생명공학적 방법을 사용하여 생산되도록 한다. 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르 (예를 들어 헥산산)의 생산을 위해 사용되는 미생물에 따라, 적절한 성장 배지, pH, 온도, 와동 속도, 접종물 수준, 및/또는 호기성, 미세호기성, 또는 혐기성 조건이 달라진다. 통상의 기술자라면 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법을 수행하기 위해 필요한 다른 조건을 이해할 것이다. 특히, 사용되는 미생물에 따라 용기 (예를 들어 발효조) 내의 조건이 달라질 수 있다. 미생물이 최적으로 기능을 수행하기에 적합하도록 조건을 변화시키는 것은 통상의 기술자의 지식 내에 있다.
하나의 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법, 특히 단계 (a)는 5 내지 8, 5.5 내지 8 또는 5.5 내지 7의 pH를 갖는 수성 배지에서 수행될 수 있다. 압력은 1 내지 10 bar일 수 있다. 미생물은 약 20℃ 내지 약 80℃의 범위의 온도에서 배양될 수 있다. 하나의 예에서, 미생물은 37℃에서 배양될 수 있다.
일부 예에서, 미생물의 성장 및 그의 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르 (예를 들어 헥산산)의 생산을 위한 수성 배지는 미생물의 성장에 또는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산의 생산을 촉진하기에 적합한 임의의 영양소, 구성요소, 및/또는 보충물을 포함할 수 있다. 특히, 수성 배지는 하기 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 탄소 공급원, 질소 공급원, 예컨대 암모늄 염, 효모 추출물, 또는 펩톤; 미네랄; 염; 보조인자; 완충제; 비타민; 및 박테리아의 성장을 촉진할 수 있는 임의의 다른 성분 및/또는 추출물. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요건에 적합해야 한다. 다양한 미생물을 위한 배양 배지에 관한 설명이 "Manual of Methods for General Bacteriology"에 제공되어 있다.
용어 "수성 용액" 또는 "배지"는 용매로서 물을 포함하는, 주로 물을 포함하는 임의의 용액으로서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포를 적어도 일시적으로 대사적으로 활성으로 및/또는 생존가능한 상태로 유지하는데 사용될 수 있으며, 필요한 경우에, 임의의 추가의 기질을 포함하는 용액을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 세포를 유지 및/또는 배양하기 위해 사용될 수 있는, 통상적으로 배지라 지칭되는 수많은 수성 용액의 제조에 익숙하며, 예를 들어 이. 콜라이의 경우에는 LB 배지가, 씨. 륭달리이(C. ljungdahlii)의 경우에는 ATCC1754-배지가 사용될 수 있다. 산물의 원치 않는 부산물로의 불필요한 오염을 피하기 위해, 최소 배지, 즉, 복합 배지와는 대조적으로, 세포를 대사적으로 활성으로 및/또는 생존가능한 상태로 유지하는데 필수적인 염 및 영양소의 최소한의 집합만을 포함하는 합리적으로 단순한 조성의 배지를 수성 용액으로서 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, M9 배지가 최소 배지로서 사용될 수 있다. 세포는 목적하는 산물을 생산하는데 필요한 만큼 충분히 오랫동안, 예를 들어, 적어도 1, 2, 4, 5, 10 또는 20시간 동안 탄소 공급원과 함께 인큐베이션된다. 선택되는 온도는 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포가 촉매작용이 가능하게 및/또는 대사적으로 활성으로 유지되도록 하는 온도, 예를 들어 세포가 씨. 륭달리이 세포인 경우에는 10 내지 42℃, 바람직하게는 30 내지 40℃, 특히 32 내지 38℃여야 한다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 수성 배지는 또한 헥산산이 생산되는 배지를 포함한다. 주로, 이는 용액이 물을 실질적으로 포함하는 것인 배지를 지칭한다. 하나의 예에서, 세포가 헥산산을 생산하는데 사용되는 수성 배지는 헥산산의 추출을 위해 추출제와 접촉하는 바로 그 배지이다.
본 발명의 임의의 측면에 따르면, 추출이 단계 (b)에서 수행되는 동안, 그와 동시에 발효가 단계 (a)에서 실시되는 것이 바람직하다. 이는 단계 (b)에서의 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산 및/또는 그의 에스테르의 계내 추출을 나타낸다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 단계 (b)에서, 수성 배지 중의 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르 (예를 들어 헥산산)는 헥산산을 수성 배지로부터 추출제 중으로 추출하기에 충분한 시간 동안 추출제와 접촉할 수 있다. 통상의 기술자라면 추출 공정을 최적화하기 위해 필요할 수 있는 분배 평형 및 알맞은 기포 응집에 도달하는데 필요한 시간량을 결정할 수 있다. 일부 예에서, 필요한 시간은 추출될 수 있는 헥산산의 양에 따라 달라질 수 있다. 특히, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르 (예를 들어 헥산산)를 수성 배지로부터 추출제 중으로 추출하는데 걸리는 시간으로 단지 몇 분만이 걸릴 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따르면, 단계 (a)에서 발효가 실시되면서 단계 (b)에서 추출이 수행되는 경우에, 추출을 위한 시간은 발효 시간과 같을 수 있다.
추출될 헥산산의 양에 대한 사용되는 추출제의 비는 추출이 얼마나 빠르게 수행될지에 따라 달라질 수 있다. 하나의 예에서, 추출제의 양은 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을 포함하는 수성 배지의 양과 같다. 추출제를 수성 배지와 접촉시키는 단계 후에, 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여 2개의 상 (수성 및 유기)이 분리된다. 하나의 예에서, 2개의 상은 분리 깔때기를 사용하여 분리될 수 있다. 2개의 상은 또한 혼합기-침강기, 펄스 칼럼 등을 사용하여 분리될 수 있다. 하나의 예에서, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산으로부터의 추출용 매질의 분리는, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 추출제보다 유의하게 더 낮은 비점에서 증류된다는 사실을 고려하여, 증류를 사용하여 수행될 수 있다. 통상의 기술자라면 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산의 특징에 따라, 단계 (b)에서 목적하는 헥산산으로부터 추출제를 분리하는 최상의 방법을 선택할 수 있다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을 회수하는 것을 수반한다. 유기 추출제와 접촉하게 되는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산은 2개의 상의 형성을 초래하며, 2개의 상 (수성 및 유기)은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여 분리된다. 하나의 예에서, 2개의 상은 분리 깔때기를 사용하여 분리할 수 있다. 2개의 상은 또한 혼합기-침강기, 펄스 칼럼, 열 분리 등을 사용하여 분리될 수 있다. 하나의 예에서, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산이 헥산산인 경우에, 헥산산으로부터의 추출용 매질의 분리는, 헥산산이 추출용 매질보다 유의하게 더 낮은 비점에서 증류된다는 사실을 고려하여, 증류를 사용하여 수행될 수 있다.
단계 (b)는 유기 흡수제가 다시 재순환 또는 재사용될 수 있도록 하는 것으로 끝난다.
따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 헥산산의 추출 방법은 헥산산을 생산하는 임의의 생명공학적 방법과 함께 사용될 수 있다. 이는, 통상적으로 생물학적 방법을 사용하여 헥산산을 생산하는 발효 공정 동안 헥산산이 수성 배지 중에 수집되도록 방치될 것이고, 발효 배지에서 특정 농도에 도달한 후에는 바로 그 목적 산물 (헥산산)이 미생물의 활성 및 생산성을 억제할 수 있다는 점을 고려하면 특히 유리하다. 이로 인해 발효 공정의 전체 수율이 제한된다. 이러한 추출 방법의 사용으로, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산이 그의 생산과 동시에 추출되므로, 따라서 최종-산물 억제가 현저히 감소된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 또한 헥산산의 회수를 위해 증류 및/또는 침전에 일차적으로 의존하지 않기 때문에, 특히 그것이 생산되는 발효 방법으로부터 헥산산을 제거하는 전통적인 방법보다 더 효율적이고 비용-효과적이다. 증류 또는 침전 공정은 보다 높은 제조 비용, 보다 낮은 수율, 및 보다 많은 폐기물을 유도하며, 따라서 공정의 전체 효율을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 이들 결점을 극복하고자 한다.
특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물 및 탄소 공급원의 혼합물을 임의의 공지된 생물반응기 또는 발효조에서 이용하여 본 발명의 임의의 측면을 수행할 수 있다. 하나의 예에서, 아세테이트 및/또는 에탄올로부터 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을 생명공학적으로 생산하는 것으로 시작하고 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을 추출하는 것으로 끝나는 본 발명의 임의의 측면에 따른 전체 방법이 단일 용기에서 실시된다. 따라서, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을 생산하는 단계와 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을 추출하는 단계 사이에 임의의 분리 단계가 존재하지 않을 수 있다. 이는 시간 및 비용을 절감시킨다. 특히, 발효 공정 동안, 미생물이 수성 배지에서 추출제의 존재 하에 성장될 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을 생산하는 원 포트 수단을 제공한다. 또한, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산이 그의 제조와 동시에 추출되기 때문에, 최종-산물 억제가 일어나지 않아, 헥산산의 수율이 유지되도록 보장된다. 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을 제거하기 위한 추가의 분리 단계가 수행될 수 있다. 깔때기, 칼럼, 증류 등을 사용하는 것과 같은, 관련 기술분야에 공지된 임의의 분리 방법이 사용될 수 있다. 이어서, 잔류하는 추출제 및/또는 세포는 재순환될 수 있다.
또 다른 예에서, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산의 추출 공정은 별도의 단계로서 및/또는 또 다른 포트에서 실시될 수 있다. 발효가 실시된 후에, 추출될 목적하는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 이미 생산된 경우에, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제가 발효 배지에 첨가될 수 있거나 또는 발효 배지가 추출제를 포함하는 포트에 첨가될 수 있다. 이어서, 목적하는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 깔때기, 칼럼, 증류 등을 사용하는 것과 같은, 관련 기술분야에 공지된 임의의 분리 방법에 의해 추출될 수 있다. 이어서, 잔류하는 추출제는 재순환될 수 있다. 세포가 함유된 발효 배지도 재순환될 수 있다.
방법의 또 다른 이점은 추출제가 재순환될 수 있다는 것이다. 따라서, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산이 추출제로부터 분리되고 나면, 추출제가 재순환되고 재사용되어, 폐기물이 감소될 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 방법의 단계 (c)는 (b)로부터의 추출된 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산을, 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산의 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로의 화학적 케톤화를 위한 적합한 반응 조건 하에 적어도 하나의 케톤화 촉매 및 임의적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산과 접촉시키는 것을 수반한다.
용어 "1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산"은 헥산산을 포괄하지 않는다. 바람직하게는, 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산은 4 내지 18개, 바람직하게는 5 내지 12개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 알칸산으로부터 선택된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 케톤화 촉매는 임의의 금속 산화물 촉매 또는 그의 혼합물일 수 있다. 케톤화는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산이 추가의 알칸산 및/또는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 그의 염 및/또는 그의 에스테르, 예를 들어 헥산산과 반응하고, 바람직하게는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산 (예를 들어 헥산산)의 2개의 분자가 하나의 물 및 하나의 이산화탄소의 제거와 함께 하나의 케톤 분자로 이량체화된다. 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산이 헥산산인 경우에, 헥산산 무수물 ((CH3(CH2)4)COOCO(CH2)4CH3)이 형성될 수 있는 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산의 케톤화에 수반될 수 있는 메카니즘이 적어도 문헌 [Woo, Y., Ind. Eng. Chem. Res. 2017, 56: 872-880]에 개시되어 있다. 다양한 금속 산화물 촉매의 존재 하에서의 헥산산의 케톤화가 또한 문헌 [Wang, S. J. Phys. Chem. C 2017, 121, 18030-18046]에도 제시되어 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 케톤화 촉매는 단계 (a)에 따라 생물학적으로 생산된 헥산산으로부터의 보다 높은 에너지 밀도의 케톤, 바람직하게는 C11의 효율적인 생산을 위한 불균질 촉매일 수 있다. 특히, 케톤화 촉매는 헤테로폴리산 (H3PW12O40) 촉매, 니오븀 산화물 (Nb2O5) 촉매, 티타늄 산화물 (TiO2) 촉매, 세륨 산화물 (CeO2) 촉매, 아연-크로뮴 (Zn-Cr) 혼합 산화물 촉매, 망가니즈 산화물 (MnOx) 촉매, 란타넘 산화물 (La2O3) 촉매, 마그네슘 산화물 (MgO) 촉매, 철 산화물 (FeO, FeO2, Fe2O3, Fe3O4, Fe4O5, Fe5O6, Fe5O7), 규소-알루미늄 (SiyAlzO) 혼합 산화물 촉매, 알루미늄 산화물 (Al2O3) 촉매 및 지르코니아 (ZrO2) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 금속 산화물 촉매 또는 그의 혼합물일 수 있다. MnOx에서 'x'는 1, 2 또는 4일 수 있다. SiyAlzO에서 'y' 및 'z'는 z/y의 비가 0 내지 1의 임의의 수인 임의의 수를 나타낼 수 있다. 하나의 예에서, 헥산산에 대한 케톤화가 문헌 [Pham T. N., ACS Catal. 2013, 3: 2456-2473]에 개시된 바와 같은 적합한 불균질 수소화 금속 촉매 및 적합한 반응 조건을 사용하여 수행된다. 개시된 바와 같은 조건은 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 예를 들어 6-운데카논의 효율적인 생성을 위해 사용되는 촉매에 따라 달라질 수 있다. 또 다른 예에서, 헥산산을 6-운데카논으로 케톤화하기 위해 MnO2 및/또는 Al2O3 촉매가 문헌 [Glinski, M. et al, Polish J. Chem. 2004, 78: 299-302]에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 추가의 예에서, 헥산산을 6-운데카논으로 케톤화하기 위해 Nb2O5 촉매가 US 6,265,618 B1에, 특히 실시예 3에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 통상의 기술자라면 헥산산 및 궁극적으로 또 다른 알칸산으로부터 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 생산하기 위한 적합한 촉매 및 적절한 조건을 최신 기술에 기반하여 단지 시행착오를 거치면서 확인할 수 있을 것이다. 문헌 [Orozco, L.M et al. ChemSusChem, 2016, 9(17): 2430-2442] 및 [Orozco, L.M et al. Green Chemistry, 2017, 19(6): 1555-1569]에는 또한 본 발명의 임의의 측면에 따른 케톤화 촉매로서 사용될 수 있는 다른 촉매가 개시되어 있다.
금속 산화물 촉매 또는 그의 혼합물은 바람직하게는 헤테로폴리산 (H3PW12O40) 촉매, 티타늄 산화물 (TiO2) 촉매, 세륨 산화물 (CeO2) 촉매, 아연-크로뮴 (Zn-Cr) 혼합 산화물 촉매, 망가니즈 산화물 (MnO2) 촉매, 란타넘 산화물 (La2O3) 촉매, 마그네슘 산화물 (MgO) 촉매, 철 산화물 (FeO, FeO2, Fe2O3, Fe3O4, Fe4O5, Fe5O6, Fe5O7), 규소-알루미늄 (Si-Al) 혼합 산화물 촉매 및 지르코니아 (ZrO2) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 단계 (c)에서의 케톤화 촉매는 망가니즈 산화물 (MnOx) 촉매, 마그네슘 산화물 (MgO) 촉매, 또는 지르코니아 에어로겔 촉매이다. 특히, 단계 (c)에서의 케톤화 촉매는 망가니즈 산화물 (MnOx) 촉매 또는 마그네슘 산화물 (MgO) 촉매일 수 있다.
단계 (c)에서의 다양한 케톤화 촉매의 사용을 위한 적합한 조건을 결정하는 것은 통상의 기술자의 지식 내에 있을 것이다. 특히, 케톤화 촉매는 지르코니아 에어로겔 촉매일 수 있으며, 문헌 [Woo, Y., Ind. Eng. Chem. Res. 2017, 56: 872-880]에 개시된 바와 같이 헥산산의 케톤화에 사용될 수 있다. 지르코니아 에어로겔 촉매는 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 효율적으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 촉매의 침출을 피한다. 문헌 [Lee, Y. et al. Applied Catalysis A: General. 2015, 506: 288-293]에는 다양한 케톤화 촉매 및 헥산산의 케톤화에서의 그의 유효성이 개시되어 있다. 통상의 기술자라면 문헌 [Lee Y., et al.]에 기재된 방법을 사용하여 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 중간체 선형 알칸산, 예를 들어 헥산산의 케톤화에 사용하기에 적합한 케톤화 촉매 및/또는 조건을 매우 용이하게 결정할 수 있다.
특히, 단계 (c)의 적합한 반응 조건은 100℃ - 500℃, 100℃ - 450℃, 100℃ - 400℃, 100℃ - 350℃, 100℃ - 300℃, 100℃ - 250℃, 100℃ - 200℃, 150℃ - 500℃, 150℃ - 450℃, 150℃ - 400℃, 150℃ - 350℃, 150℃ - 300℃, 150℃ - 250℃, 150℃ - 200℃, 200℃ - 500℃, 200℃ - 450℃, 200℃ - 400℃, 200℃ - 350℃, 200℃ - 300℃, 200℃ - 250℃, 250℃ - 500℃, 250℃ - 450℃, 250℃ - 400℃, 250℃ - 350℃, 250℃ - 300℃ 등의 반응 온도를 포함한다.
바람직하게는, 단계 (c)의 적합한 반응 조건은 150℃ - 350℃의 반응 온도를 포함한다.
보다 특히, 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논은 150℃ - 350℃의 반응 온도에서, 바람직하게는 200℃ - 350℃의 반응 온도에서 케톤화 촉매로서 MgO/SiO2 촉매를 사용하여 헥산산으로부터 생산될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (d)는 단계 (c)에서 수득된 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 2급 선형 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올로의 촉매적 수소화를 위해 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 것을 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 방법의 단계 (d)는 본 발명의 임의의 측면에 따라 생산된 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 2급 선형 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올로의 촉매적 수소화를 위해 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 것을 포함한다. 고급 알칸올, 바람직하게는 2급 알콜인 6-운데칸올 (C11H24O)이 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 촉매적 수소화의 결과이며, 여기서 수소 분자가 탄소-산소 이중 결합에 첨가되어 궁극적으로 최종 산물로서 고급 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 제공한다.
수소화 금속 촉매는 균질 또는 불균질 촉매일 수 있다. 균질 금속 촉매는 관련 기술분야에 공지되어 있는 금속 착물일 수 있다. 특히, 수소화 금속 촉매는 불균질 촉매일 수 있다. 고체 촉매를 사용하는 다중상 촉매적 반응의 사용의 일부 이점은 촉매와 산물의 용이한 분리, 용이한 회수, 및 촉매 재순환, 및 상대적으로 온화한 작업 조건을 포함한다. 불균질 촉매를 사용하는 경우에는 뚜렷한 경제적 및 환경적 인센티브가 또한 존재한다. 특히, 수소화 금속 촉매는 루테늄 (Ru) 촉매, 레늄 (Re) 촉매, 니켈 (Ni) 촉매, 철 (Fe), 코발트 (Co), 팔라듐 (Pd) 촉매 및 백금 (Pt) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 특히, 촉매는 Ni, Pd 및 Pt 촉매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 수소화 금속 촉매는 문헌 [Alonso, F. Tetrahedron, 2008, 64: 1847-52]에 기재된 바와 같은 니켈 나노입자일 수 있다. 또 다른 예에서, 철(II) PNP 핀서 착물이 문헌 [Gorgas, N., Organometallics, 2014, 33 (23): 6905-6914]에 개시된 바와 같이, 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논의 고급 2급 알콜로의, 바람직하게는 6-운데카논의 6-운데칸올로의 수소화를 위한 수소화 금속 촉매로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 문헌 [Tariq Shah M., et al., ACS Applied Materials & Interfaces, 2015: 7(12), 6480-9]에 기재된 바와 같은 루테늄 (Ru) 촉매, 레늄 (Re) 촉매, 니켈 (Ni) 촉매, 철 (Fe), 코발트 (Co), 팔라듐 (Pd) 촉매 또는 백금 (Pt) 촉매의 마그네타이트 나노입자가 본 발명의 임의의 측면에 따른 불균질 수소화 금속 촉매로서 사용될 수 있다.
또 다른 예에서, 구리-포스핀 착물이 문헌 [Chen, J-X., Tetrahedron, 2000, 56: 2153-2166]에 개시된 바와 같이, 본 발명의 임의의 측면에 따른 균질 수소화 금속 촉매로서 사용된다. 추가의 예에서, 문헌 [Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2014, 388-389: 116-122]에 개시된 바와 같은 불균질 Pt 촉매, 특히 Pt/Al2O3 촉매가 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논의 고급 2급 알콜로의, 바람직하게는 6-운데카논의 6-운데칸올로의 수소화에 사용할 수 있다. 문헌 [ChemSusChem, 2017: 10(11), 2527-2533]에는 또한 다양한 불균질 촉매 예컨대 Pt/C, Ru/C, 및 Pd/C가 개시되어 있으며, 이들은 6-운데카논의 6-운데칸올로의 수소화를 위해 산 촉매와 조합되어 또는 그의 부재 하에 사용될 수 있다. 상기 내용에 기반하여, 통상의 기술자라면 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논으로부터 고급 알칸올을 생성하기 위해, 바람직하게는 6-운데카논으로부터 6-운데칸올을 생성하기 위해 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용될 적합한 수소화 촉매를 결정할 수 있다.
통상의 기술자라면 적합한 수소화 금속 촉매를 용이하게 결정할 수 있을 것이며, 6-운데카논의 수소화로부터 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 2급 선형 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 효율적으로 생산하기 위한 조건을 그에 상응하게 변화시킬 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (d)의 수소화 금속 촉매는 바람직하게는 루테늄 (Ru) 촉매, 레늄 (Re) 촉매, 니켈 (Ni) 촉매, 철 (Fe), 코발트 (Co) 및 백금 (Pt) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (e)는 산성 불균질 촉매의 존재 하에 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 2급 선형 알칸올, 예를 들어 6-운데칸올을 탈수시켜 상응하는 고급 알켄, 예를 들어 5-운데센을 형성하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 단계 (e)의 산성 불균질 촉매는 알루미노실리케이트 제올라이트를 포함하는 촉매이다. 본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, 단계 (e)의 산성 불균질 촉매는 ZSM-5를 포함한다.
ZSM-5, 즉, 제올라이트 소코니 모빌-5(Zeolite Socony Mobil-5) (ZSM-5의 프레임워크 유형 MFI)는 펜타실 계열의 제올라이트에 속하는 알루미노실리케이트 제올라이트이다. 그의 화학식은 NanAlnSi96-nO192·16H2O (0<n<27)이다. 이는 1975년에 모빌 오일 캄파니(Mobil Oil Company)가 특허를 받아, 석유 산업에서 탄화수소 이성질체화 반응을 위한 불균질 촉매로서 광범위하게 사용되고 있다.
단계 (e)의 산성 불균질 촉매는 팔라듐, 니켈, 코발트, 철, 몰리브데넘 및 망가니즈로부터 선택된 전이 금속, 바람직하게는 몰리브데넘, 바람직하게는 5 중량%의 몰리브데넘을 추가로 포함할 수 있다.
탈수 단계 (e)의 반응 온도는 약 100 내지 약 250℃, 바람직하게는 약 120 내지 약 180℃이다. 용매는 톨루엔일 수 있다.
7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 2급 선형 알칸올을 탈수시키는 단계 (e), 및 생성된 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알켄을 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 선형 알칸으로 촉매적으로 수소화하는 단계 (f)는 탈수 및 수소화 특성을 제공하는 촉매 또는 촉매 혼합물을 사용하여 단일 단계로 조합될 수 있다.
실시예
실시예 1
아세테이트 및 에탄올로부터 헥산산을 형성하는 클로스트리디움 클루이베리
에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생물변형을 위해 박테리아 클로스트리디움 클루이베리를 사용하였다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행되었다.
예비배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 DMSZ52 배지 (pH = 7.0; 10 g/L K-아세테이트, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/l NH4Cl, 0.20 g/l MgSO4x7 H2O, 1 g/L 효모 추출물, 0.50 mg/L 레자주린, 10 μl/l HCl (25%, 7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2x4H2O, 70 μg/L ZnCl2x7H2O, 100 μg/L MnCl2x4H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2x6H2O, 2 μg/L CuCl2x6H2O, 24 μg/L NiCl2x6H2O, 36 μg/L Na2MO4x2H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3x5H2O, 4 μg/L Na2WO4x2H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HClx2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 0.25 g/L 시스테인-HClxH2O, 0.25 g/L Na2Sx9H2O)에 5 ml의 클로스트리디움 클루이베리 냉동 극저온배양물을 접종하고, 37℃에서 144 h 동안 >0.2의 OD600nm까지 인큐베이션하였다.
주 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 새로운 DMSZ52 배지에 예비배양으로부터의 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm까지 접종하였다. 이러한 성장 배양물을 37℃에서 27 h 동안 >0.6의 OD600nm까지 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리하고, 생산 완충액 (pH 6.0; 0.832 g/L K-아세테이트, 5.0 g/l 에탄올)으로 세척하고, 다시 원심분리하였다.
생산 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 생산 완충액에 주 배양으로부터의 세척된 세포를 0.2의 OD600nm까지 접종하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방된 진탕 수조에서 37℃ 및 100 rpm에서 71h 동안 인큐베이션하였다. 배양 기간의 시작 및 종료 시에, 샘플을 취하였다. 이들을 광학 밀도, pH 및 다양한 분석물 (NMR에 의해 시험됨)에 대해 시험하였다.
결과는 생산 단계에서 아세테이트의 양이 0.54 g/l에서 0.03 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 5.6 g/l에서 4.9 g/l로 감소했음을 제시하였다. 또한, 부티르산의 농도는 0.05 g/l에서 0.28 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.03 g/l에서 0.79 g/l로 증가하였다.
실시예 2
부티르산 및 에탄올로부터 헥산산을 형성하는 클로스트리디움 클루이베리
에탄올 및 부티르산의 헥산산으로의 생물변형을 위해 박테리아 클로스트리디움 클루이베리를 사용하였다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행되었다.
예비배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 DMSZ52 배지 (pH = 7.0; 10 g/L K-아세테이트, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/l NH4Cl, 0.20 g/l MgSO4x7 H2O, 1 g/L 효모 추출물, 0.50 mg/L 레자주린, 10 μl/l HCl (25%, 7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2x4H2O, 70 μg/L ZnCl2x7H2O, 100 μg/L MnCl2x4H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2x6H2O, 2 μg/L CuCl2x6H2O, 24 μg/L NiCl2x6H2O, 36 μg/L Na2MO4x2H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3x5H2O, 4 μg/L Na2WO4x2H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HClx2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 0.25 g/L 시스테인-HClxH2O, 0.25 g/L Na2Sx9H2O)에 5 ml의 클로스트리디움 클루이베리 냉동 극저온배양물을 접종하고, 37℃에서 144 h 동안 >0.3의 OD600nm까지 인큐베이션하였다.
주 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 새로운 DMSZ52 배지에 예비배양으로부터의 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm까지 접종하였다. 이러한 성장 배양물을 37℃에서 25 h 동안 >0.4의 OD600nm까지 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리하고, 생산 완충액 (pH 6.16; 4.16 g/L K-아세테이트, 10.0 g/l 에탄올)으로 세척하고, 다시 원심분리하였다.
생산 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 생산 완충액에 주 배양으로부터의 세척된 세포를 0.2의 OD600nm까지 접종하였다. 제1 배양물은 초기에 1.0 g/l의 부티르산을 생산 완충액에 첨가하였고, 제2 배양물은 부티르산을 생산 완충액에 첨가하지 않았다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방된 진탕 수조에서 37℃ 및 100 rpm에서 71h 동안 인큐베이션하였다. 배양 기간의 시작 및 종료 시에, 샘플을 취하였다. 이들을 광학 밀도, pH 및 다양한 분석물 (NMR에 의해 시험됨)에 대해 시험하였다.
결과는 부티르산 보충된 배양물의 생산 단계에서 아세테이트의 양이 3.1 g/l에서 1.1 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 10.6 g/l에서 7.5 g/l로 감소했음을 제시하였다. 또한, 부티르산의 농도는 1.2 g/l에서 2.2 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.04 g/l에서 2.30 g/l로 증가하였다.
비-보충된 배양물의 생산 단계에서는, 아세테이트 양이 3.0 g/l에서 1.3 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 10.2 g/l에서 8.2 g/l로 감소하였다. 또한, 부티르산의 농도는 0.1 g/l에서 1.7 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.01 g/l에서 1.40 g/l로 증가하였다.
실시예 3
데칸 및 TOPO의 존재 하에서의 클로스트리디움 클루이베리의 배양
에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생물변형을 위해 박테리아 클로스트리디움 클루이베리를 배양하였다. 생산된 헥산산의 계내 추출을 위해, 데칸과 트리옥틸포스핀옥시드 (TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행되었다.
예비배양을 위해, 250 ml의 Veri01 배지 (pH 7.0; 10 g/L 칼륨 아세테이트, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl/L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린)에 10 ml의 클로스트리디움 클루이베리 생 배양물을 0.1의 개시 OD600nm까지 접종하였다.
배양을 개방된 수조 진탕기 내 1000 mL 내압성 유리 병에서 37℃, 150 rpm 및 100% CO2의 1 L/h의 환기율로 671 h 동안 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출시켰다. 100 g/L NaOH 용액의 자동 첨가에 의해 pH를 6.2로 유지하였다. 새로운 배지를 2.0 d-1의 희석 배수로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로(KrosFlo)® 중공 섬유 폴리에테르술폰 멤브레인 (스펙트럼랩스(Spectrumlabs), 미국 란초 도밍게즈 소재)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내의 세포를 유지하였다.
주 배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 새로운 Veri01 배지에 예비배양으로부터의 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm까지 접종하였다. 데칸 중 6% (w/w) TOPO의 혼합물 1 ml를 추가로 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방된 수조 진탕기에서 100% CO2 분위기 하에 37℃ 및 150 rpm에서 43 h 동안 인큐베이션하였다.
배양 동안 5 mL 샘플을 수회 취하여 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하였다. 산물 농도의 결정은 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행되었다. 내부 정량화 표준물로서 나트륨 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다.
주 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.14 g/L에서 2.12 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.22 g/L에서 0.91 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 15.04 g/l에서 11.98 g/l로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 6.01 g/L에서 4.23 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 상기 기간 동안 0.111에서 0.076으로 감소하였다.
실시예 4
테트라데칸 및 TOPO의 존재 하에서의 클로스트리디움 클루이베리의 배양
에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생물변형을 위해 박테리아 클로스트리디움 클루이베리를 배양하였다. 생산된 헥산산의 계내 추출을 위해, 테트라데칸과 트리옥틸포스핀옥시드 (TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행되었다.
개방된 수조 진탕기 내 1000 mL 내압성 유리 병에서 클로스트리디움 클루이베리의 예비배양을 250 ml의 EvoDM24 배지 (pH 5.5; 0.429 g/L Mg-아세테이트, 0.164 g/l Na-아세테이트, 0.016 g/L Ca-아세테이트, 2.454 g/l K-아세테이트, 0.107 mL/L H3PO4 (8.5%), 0.7 g/L NH4아세테이트, 0.35 mg/L Co-아세테이트, 1.245 mg/L Ni-아세테이트, 20 μg/L d-비오틴, 20 μg/L 엽산, 10 μg/L 피리독신-HCl, 50 μg/L 티아민-HCl, 50 μg/L 리보플라빈, 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토테네이트, 50 μg/L 비타민 B12, 50 μg/L p-아미노벤조에이트, 50 μg/L 리포산, 0.702 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 4 H2O, 1 ml/L KS-아세테이트 (93.5 mM), 20 mL/L 에탄올, 0.37 g/L 아세트산) 중에서 37℃, 150 rpm 및 25% CO2 및 75% N2의 혼합물의 1 L/h의 환기율로 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출시켰다. 2.5 M NH3 용액의 자동 첨가에 의해 pH를 5.5로 유지하였다. 새로운 배지를 2.0 d-1의 희석 배수로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 멤브레인 (스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈 소재)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내의 세포를 유지하고 ~1.5의 OD600nm를 유지하였다.
주 배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 Veri01 배지 (pH 6.5; 10 g/L 칼륨 아세테이트, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl/L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린, 2.5 mL/L HCL 25%)에 예비배양으로부터의 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm까지 접종하였다. 테트라데칸 중 6% (w/w) TOPO의 혼합물 1 ml를 추가로 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방된 수조 진탕기에서 100% CO2 분위기 하에 37℃ 및 150 rpm에서 47 h 동안 인큐베이션하였다.
배양 동안 5 mL 샘플을 수회 취하여 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하였다. 산물 농도의 결정은 반정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행되었다. 내부 정량화 표준물로서 나트륨 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다.
주 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.05 g/L에서 3.78 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.09 g/L에서 4.93 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 15.52 g/l에서 9.36 g/l로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 6.36 g/L에서 2.49 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 상기 기간 동안 0.095에서 0.685로 증가하였다.
실시예 5
헥사데칸 및 TOPO의 존재 하에서의 클로스트리디움 클루이베리의 배양
에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생물변형을 위해 박테리아 클로스트리디움 클루이베리를 배양하였다. 생산된 헥산산의 계내 추출을 위해, 헥사데칸과 트리옥틸포스핀옥시드 (TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행되었다.
예비배양을 위해, 250 ml의 Veri01 배지 (pH 7.0; 10 g/L 칼륨 아세테이트, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl/L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린)에 10 ml의 클로스트리디움 클루이베리 생 배양물을 0.1의 개시 OD600nm까지 접종하였다.
배양을 개방된 수조 진탕기 내 1000 mL 내압성 유리 병에서 37℃, 150 rpm 및 100% CO2의 1 L/h의 환기율로 671 h 동안 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출시켰다. 100 g/L NaOH 용액의 자동 첨가에 의해 pH를 6.2로 유지하였다. 새로운 배지를 2.0 d-1의 희석 배수로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 멤브레인 (스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈 소재)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내의 세포를 유지하였다.
주 배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 새로운 Veri01 배지에 예비배양으로부터의 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm까지 접종하였다. 헥사데칸 중 6% (w/w) TOPO의 혼합물 1 ml를 추가로 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방된 수조 진탕기에서 100% CO2 분위기 하에 37℃ 및 150 rpm에서 43 h 동안 인큐베이션하였다.
배양 동안 5 mL 샘플을 수회 취하여 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하였다. 산물 농도의 결정은 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행되었다. 내부 정량화 표준물로서 나트륨 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다.
주 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.14 g/L에서 2.86 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.20 g/L에서 2.37 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 14.59 g/l에서 10.24 g/l로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 5.87 g/L에서 3.32 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 상기 기간 동안 0.091에서 0.256으로 증가하였다.
실시예 6
헵타데칸 및 TOPO의 존재 하에서의 클로스트리디움 클루이베리의 배양
에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생물변형을 위해 박테리아 클로스트리디움 클루이베리를 배양하였다. 생산된 헥산산의 계내 추출을 위해, 헵타데칸과 트리옥틸포스핀옥시드 (TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행되었다.
예비배양을 위해, 250 ml의 Veri01 배지 (pH 7.0; 10 g/L 칼륨 아세테이트, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl/L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린)에 10 ml의 클로스트리디움 클루이베리 생 배양물을 0.1의 개시 OD600nm까지 접종하였다.
배양을 개방된 수조 진탕기 내 1000 mL 내압성 유리 병에서 37℃, 150 rpm 및 100% CO2의 1 L/h의 환기율로 671 h 동안 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출시켰다. 100 g/L NaOH 용액의 자동 첨가에 의해 pH를 6.2로 유지하였다. 새로운 배지를 2.0 d-1의 희석 배수로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 멤브레인 (스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈 소재)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내의 세포를 유지하였다.
주 배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 새로운 Veri01 배지에 예비배양으로부터의 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm까지 접종하였다. 헵타데칸 중 6% (w/w) TOPO의 혼합물 1 ml를 추가로 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방된 수조 진탕기에서 100% CO2 분위기 하에 37℃ 및 150 rpm에서 43 h 동안 인큐베이션하였다.
배양 동안 5 mL 샘플을 수회 취하여 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하였다. 산물 농도의 결정은 반정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행되었다. 내부 정량화 표준물로서 나트륨 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다.
주 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.15 g/L에서 2.82 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.19 g/L에서 2.85 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 14.34 g/l에서 9.58 g/l로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 5.88 g/L에서 3.20 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 상기 기간 동안 0.083에서 0.363으로 증가하였다.
실시예 7
도데칸 및 TOPO의 존재 하에서의 클로스트리디움 클루이베리의 배양
에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생물변형을 위해 박테리아 클로스트리디움 클루이베리를 배양하였다. 생산된 헥산산의 계내 추출을 위해, 도데칸과 트리옥틸포스핀옥시드 (TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행되었다.
예비배양을 위해, 250 ml의 Veri01 배지 (pH 7.0; 10 g/L 칼륨 아세테이트, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl/L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린)에 10 ml의 클로스트리디움 클루이베리 생 배양물을 0.1의 개시 OD600nm까지 접종하였다.
배양을 개방된 수조 진탕기 내 1000 mL 내압성 유리 병에서 37℃, 150 rpm 및 100% CO2의 1 L/h의 환기율로 671 h 동안 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출시켰다. 100 g/L NaOH 용액의 자동 첨가에 의해 pH를 6.2로 유지하였다. 새로운 배지를 2.0 d-1의 희석 배수로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 멤브레인 (스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈 소재)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내의 세포를 유지하였다.
주 배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 새로운 Veri01 배지에 예비배양으로부터의 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm까지 접종하였다. 도데칸 중 6% (w/w) TOPO의 혼합물 1 ml를 추가로 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방된 수조 진탕기에서 100% CO2 분위기 하에 37℃ 및 150 rpm에서 43 h 동안 인큐베이션하였다.
배양 동안 5 mL 샘플을 수회 취하여 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하였다. 산물 농도의 결정은 반정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행되었다. 내부 정량화 표준물로서 나트륨 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다.
주 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.14 g/L에서 2.62 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.22 g/L에서 2.05 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 14.62 g/l에서 10.64 g/l로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 5.92 g/L에서 3.54 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 상기 기간 동안 0.091에서 0.259로 증가하였다.
실시예 8
물 및 헥사데칸과 TOPO의 혼합물 사이의 헥산산에 대한 분배 계수의 결정
실험의 모든 스테이지 동안 양쪽 상에서 샘플을 취하여 pH 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 헥산산의 농도를 결정하였다. 5 g/kg 헥산산의 수성 용액 100 g 및 헥사데칸 중 6% 트리옥틸포스핀옥시드 (TOPO)의 혼합물 33 g을 분리 깔때기에 충전하고, 37℃에서 1분 동안 혼합하였다. 이어서, 깔때기를 삼각대 고리에 위치시키고, 에멀젼을 정치해 두어 자발적으로 분리되도록 하였다. 수성 상의 pH를 측정하였다. 이어서, 1M NaOH 용액을 깔때기에 첨가하고, 혼합하였다. 분리 및 샘플링 단계를 수성 상에서 6.2의 pH에 도달할 때까지 반복하였다. 이 시점에서 후속 분석을 위한 샘플을 양쪽 상에서 취하였다. 수성 상은 HPLC에 의해 직접 분석될 수 있었다. 유기 상의 분석을 위해서는, 희석된 헥산산을 먼저 물로 재추출한 후에 (1 M NaOH의 첨가에 의해 pH 12.0), HPLC에 의한 분석이 이어졌다. 물 및 헥사데칸 중 6% TOPO의 시스템에서의 헥산산의 분배 계수 KD를 양쪽 상에서의 헥산산의 농도로부터 계산하였다.
pH 6.2에서 물 및 헥사데칸 중 6% TOPO의 시스템에서의 헥산산에 대한 KD는 4.7이었다.
실시예 9
물 및 헵타데칸과 TOPO의 혼합물 사이의 헥산산에 대한 분배 계수의 결정
실험의 모든 스테이지 동안 양쪽 상에서 샘플을 취하여 pH 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 헥산산의 농도를 결정하였다. 5 g/kg 헥산산의 수성 용액 100 g 및 헵타데칸 중 6% 트리옥틸포스핀옥시드 (TOPO)의 혼합물 33 g을 분리 깔때기에 충전하고, 37℃에서 1분 동안 혼합하였다. 이어서, 깔때기를 삼각대 고리에 위치시키고, 에멀젼을 정치해 두어 자발적으로 분리되도록 하였다. 수성 상의 pH를 측정하였다. 1M NaOH 용액을 깔때기에 첨가하고, 혼합하였다. 분리 및 샘플링 단계를 수성 상에서 6.2의 pH에 도달할 때까지 반복하였다. 이 시점에서 후속 분석을 위한 샘플을 양쪽 상에서 취하였다. 수성 상은 HPLC에 의해 직접 분석될 수 있었다. 유기 상의 분석을 위해서는, 희석된 헥산산을 먼저 물로 재추출한 후에 (1 M NaOH의 첨가에 의해 pH 12.0), HPLC에 의한 분석이 이어졌다. 물 및 헵타데칸 중 6% TOPO의 시스템에서의 헥산산의 분배 계수 KD를 양쪽 상에서의 헥산산의 농도로부터 계산하였다.
pH 6.2에서 물 및 헵타데칸 중 6% TOPO의 시스템에서의 헥산산에 대한 KD는 5.0이었다.
실시예 10
물 및 테트라데칸과 TOPO의 혼합물 사이의 헥산산에 대한 분배 계수의 결정
실험의 모든 스테이지 동안 양쪽 상에서 샘플을 취하여 pH 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 헥산산의 농도를 결정하였다. 5 g/kg 헥산산 + 0.5 g/kg 아세트산의 수성 용액 130 g 및 테트라데칸 중 6% 트리옥틸포스핀옥시드 (TOPO)의 혼합물 15 g을 분리 깔때기에 충전하고, 37℃에서 1분 동안 혼합하였다. 이어서, 깔때기를 삼각대 고리에 위치시키고, 에멀젼을 정치해 두어 자발적으로 분리되도록 하였다. 수성 상의 pH를 측정하였다. 1M NaOH 용액을 깔때기에 첨가하고, 혼합하였다. 분리 및 샘플링 단계를 수성 상에서 6.2의 pH에 도달할 때까지 반복하였다. 이 시점에서 후속 분석을 위한 샘플을 양쪽 상에서 취하였다. 수성 상은 HPLC에 의해 직접 분석될 수 있었다. 유기 상의 분석을 위해서는, 희석된 헥산산을 먼저 물로 재추출한 후에 (1 M NaOH의 첨가에 의해 pH 12.0), HPLC에 의한 분석이 이어졌다. 물 및 테트라데칸 중 6% TOPO의 시스템에서의 헥산산의 분배 계수 KD를 양쪽 상에서의 헥산산의 농도로부터 계산하였다.
pH 6.9에서 물 및 테트라데칸 중 6% TOPO의 시스템에서의 헥산산에 대한 KD는 1.3이었다.
실시예 11
클로스트리디움 클루이베리의 배양 및 헥산산의 추출
에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생물변형을 위해 박테리아 클로스트리디움 클루이베리를 배양하였다. 생산된 헥산산의 계내 추출을 위해, 테트라데칸과 트리옥틸포스핀옥시드 (TOPO)의 혼합물을 연속적으로 배양을 통해 통과시켰다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행되었다.
개방된 수조 진탕기 내 1000 mL 내압성 유리 병에서 클로스트리디움 클루이베리의 예비배양을 250 ml의 EvoDM45 배지 (pH 5.5; 0.004 g/L Mg-아세테이트, 0.164 g/l Na-아세테이트, 0.016 g/L Ca-아세테이트, 0.25 g/l K-아세테이트, 0.107 mL/L H3PO4 (8.5%), 2.92 g/L NH4아세테이트, 0.35 mg/L Co-아세테이트, 1.245 mg/L Ni-아세테이트, 20 μg/L d-비오틴, 20 μg/L 엽산, 10 μg/L 피리독신-HCl, 50 μg/L 티아민-HCl, 50 μg/L 리보플라빈, 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토테네이트, 50 μg/L 비타민 B12, 50 μg/L p-아미노벤조에이트, 50 μg/L 리포산, 0.702 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 4 H2O, 1 ml/L KS-아세테이트 (93.5 mM), 20 mL/L 에탄올, 0.37 g/L 아세트산) 중에서 37℃, 150 rpm 및 25% CO2 및 75% N2의 혼합물의 1 L/h의 환기율로 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출시켰다. 2.5 M NH3 용액의 자동 첨가에 의해 pH를 5.5로 유지하였다. 새로운 배지를 2.0 d-1의 희석 배수로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 멤브레인 (스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈 소재)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내의 세포를 유지하고 ~1.5의 OD600nm를 유지하였다.
주 배양을 위해, 1000 ml 병 내의 150 ml의 EvoDM39 배지 (pH 5.8; 0.429 g/L Mg-아세테이트, 0.164 g/l Na-아세테이트, 0.016 g/L Ca-아세테이트, 2.454 g/l K-아세테이트, 0.107 mL/L H3PO4 (8.5%), 1.01 mL/L 아세트산, 0.35 mg/L Co-아세테이트, 1.245 mg/L Ni-아세테이트, 20 μg/L d-비오틴, 20 μg/L 엽산, 10 μg/L 피리독신-HCl, 50 μg/L 티아민-HCl, 50 μg/L 리보플라빈, 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토테네이트, 50 μg/L 비타민 B12, 50 μg/L p-아미노벤조에이트, 50 μg/L 리포산, 0.702 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 4 H2O, 1 ml/L KS-아세테이트 (93.5 mM), 20 mL/L 에탄올, 8.8 mL NH3 용액 (2.5 mol/L), 27.75 ml/L 아세트산 (144 g/L))에 예비배양으로부터의 100 ml의 세포 브로쓰를 0.71의 OD600nm까지 접종하였다.
배양을 개방된 수조 진탕기에서 37℃, 150 rpm 및 25% CO2 및 75% N2의 혼합물의 1 L/h의 환기율로 65 h 동안 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출시켰다. 2.5 M NH3 용액의 자동 첨가에 의해 pH를 5.8로 유지하였다. ~0.5의 OD600nm를 유지하도록 새로운 배지를 0.5 d-1의 희석 배수로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 반응기로부터 연속적으로 제거하였다. 테트라데칸 중 6% (w/w) TOPO의 혼합물 120 g을 발효 브로쓰에 추가로 첨가하였다. 이어서, 이러한 유기 혼합물을 반응기에 연속적으로 공급하고, 유기 상을 또한 1 d-1의 희석 배수로 반응기로부터 연속적으로 제거하였다.
배양 동안 수성 상 및 유기 상 둘 다로부터 5 mL 샘플을 수회 취하여 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하였다. 산물 농도의 결정은 반정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행되었다. 내부 정량화 표준물로서 나트륨 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다.
주 배양 동안, 수성 상에서 8.18 g/L의 에탄올, 3.20 g/L의 아세테이트, 1.81 g/L의 부티레이트 및 0.81 g/L의 헥사노에이트의 항정 상태 농도에 도달하였다. OD600nm는 0.5에서 안정하게 유지되었다. 유기 상에서는 0.43 g/kg의 에탄올, 0.08 g/kg의 아세테이트, 1.13 g/kg의 부티레이트 및 8.09 g/kg의 헥사노에이트의 항정 상태 농도에 도달하였다. 실험 후에 세포는 생존가능하게 유지되었으며, 그와 동시에 추가의 배양으로 전달되었다.
수성 배지 및 테트라데칸 중 6% TOPO의 시스템에서의 기질 및 산물의 분배 계수 KD를 양쪽 상에서의 농도로부터 계산하였다.
항정 상태에서 KD는 에탄올에 대해 0.05이고, 아세트산에 대해 0.03이며, 부티르산에 대해 0.62이고, 헥산산에 대해 9.99였다.
실시예 12
헥산산의 케톤화
케톤화를 가열된 연속 유동층 반응기에서 수행하였다. 먼저, 반응기에 실리카 상의 마그네슘 산화물 (50 wt.%, 14.00 g)을 충전하고, 아르곤 유동 (54 mL/min) 하에 330℃에서 1시간 동안 가열하였다. 온도를 360℃로 상승시켰다. 이어서, 테트라데칸 중 헥산산의 혼합물 (v/v: 3/1)을 3.3 mL/h의 속도로 반응기에 연속적으로 공급하였다. 가스상 유출 스트림을 물 및 드라이 아이스와 이소프로판올의 혼합물로 냉각되는 2개의 냉각 트랩에 의해 수집하였다. 수집된 분획을 칭량하고, 그의 조성에 대해 가스 크로마토그래피 (GC)에 의해 분석하였다. 총 370.65 g의 헥산산이 반응기에 공급되었으며, 이는 271.70 g의 6-운데카논 및 부산물로서의 28.75 g의 물 및 70.21 g의 이산화탄소의 최대 이론적 수율에 해당된다. 6-운데카논의 수득된 양은 267.67 g이고, 물의 양은 28.32 g이었다. 이는 완전 전환 시 99%의 물질 회수에 상응한다. 단지 미량의 헥산산이 검출되었으며 부산물은 검출되지 않았기 때문에, 높은 생산성 및 선택성이 일반 GC 측정에 의해 확증되었다.
실시예 13
헥산산의 팔미트산과의 교차 케톤화.
교차 케톤화의 기술적 절차는, 기질 공급물의 조성을 제외하고는 헥산산의 단독 케톤화 (실시예 12)와 동일하다. 공급물이 기질로서의 헥산산 (116.16 g, 1.00 mol) 및 팔미트산 (256.43 g, 1.00 mol) 및 내부 표준물로서의 테트라데칸 (124.20 g)으로 이루어진다. 기질 공급물을 3.3 mL/h의 속도로 첨가하고, 360℃의 온도에서 반응시켰다. 2종의 알칸산의 존재는 3종의 케톤: 6-운데카논, 6-헨에이코사논 및 16-헨트리아콘타논의 산물 혼합물을 유도하였다. 완전 전환 시 수득된 양은 42.58 g의 6-운데카논, 155.29 g의 6-헨에이코사논 및 112.71 g의 16-헨트리아콘타논이었다.
실시예 14
헥산산의 아세트산과의 교차 케톤화.
교차 케톤화의 기술적 절차는, 기질 공급물의 조성을 제외하고는 헥산산의 단독 케톤화 (실시예 12)와 동일하다. 공급물이 기질로서의 헥산산 (232.32 g, 2.00 mol) 및 아세트산 (120.10 g, 2.00 mol) 및 내부 표준물로서의 테트라데칸 (117.47 g)으로 이루어진다. 기질 공급물을 3.3 mL/h의 속도로 첨가하고, 360℃의 온도에서 반응시켰다. 2종의 알칸산의 존재는 3종의 케톤: 2-프로파논, 2-헵타논 및 6-운데카논의 산물 혼합물을 유도하였다. 완전 전환 시 수득된 양은 29.04 g의 2-프로파논, 114.19 g의 2-헵타논 및 85.15 g의 6-운데카논이었다.
실시예 15
고급 선형 알카논의 상응하는 고급 선형 알칸으로의 수소화
C11 케톤 (6-운데카논)의 선형 알칸 (운데칸)으로의 수소화 반응을 300 ml 오토클레이브 반응기 (파르 인스트루먼트 캄파니(PARR Instrument Company))에서 수행하였다. 반응기를 알루미늄 블록에 위치시키고, 온도를 반응기 내부에 위치하는 열전쌍에 의해 제어하였다. 전형적으로, 30 mg의 고체 촉매, 170.3 mg, 1.0 mmol의 기질을 오븐 건조된 자기 교반기를 갖는 4 ml 유리 바이알에 첨가하였다. 2.0 ml의 건조 톨루엔을 용매로서 사용하였고, 바이알에 스크류 캡이 장착되었으며 니들이 격막을 통해 삽입되었다. (바이알은 반응기에 위치한다.) 반응기를 10 bar의 H2로 3회 퍼징하고, 이어서 압력을 20 bar로 증가시켰다. 반응기를 20 h 동안 목적하는 온도 (120℃)로 가열하였다. 반응 후에, 반응기를 빙조를 사용하여 5℃로 냉각시키고, 가스 상을 서서히 방출시키고, 잔류하는 액체를 고체 촉매로부터 조심스럽게 분리하여, 내부 표준물 (100 μL n-헥사데칸)을 사용하여 개별적으로 분석하였다.
케톤 수소화는 지지된 불균질 촉매인 3.0Co@γ-Al2O3 및 첨가된 H-ZSM5 제올라이트에 대해 조사되었다. 이 혼합물은 99%의 케톤 전환 및 98%의 알칸 수율을 제시하였다.
금속 촉매 제조 방법은 하기와 같다:
3wt%Co@γ-Al2O3, H2O 중 환원제로서의 아스코르브산 및 캡핑제로서의 글루코스 사용, 2 h 동안의 800℃에서의 열분해, Co 염은 코발트(II) 니트레이트 6수화물이다. 전형적인 합성에서, 149 mg, 0.51 mmol의 Co(NO3)2.6H2O를 20 ml의 D.I H2O에 용해시키고, 이어서 265 mg, 3.0 mmol의 아스코르브산 및 92 mg, 1 mmol의 D-(+)-글루코스의 수성 용액을 단계적으로 첨가하였다. 내용물을 2-3 h 동안 90℃에서 교반하였다. 그 다음에, 1.0 g의 γ-Al2O3 지지체를 첨가하고, 슬러리를 R.T.에서 밤새 교반하였다. 과잉의 물을 원심분리를 통해 제거하고, 고체를 10 h 동안 120℃의 오븐에서 건조시키고, 이어서 아르곤 분위기 하에 2 h 동안 800℃에서 열분해시켰다.
Claims (14)
- 에탄올 및/또는 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산으로부터 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸을 생산하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하며:
(a) 에탄올 및/또는 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산 또는 그의 임의의 염을 2개-탄소 쇄 연장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉시켜 중간체로서 4 내지 7개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알칸산 및/또는 그의 염 및/또는 그의 에스테르를 생산하는 단계;
(b) (a)로부터의 중간체, 그의 염 및/또는 그의 에스테르를 적어도 하나의 추출제를 사용하여 추출하며, 여기서 추출제는 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 임의적으로 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 적어도 하나의 트리알킬아민 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 2 옥틸-도데칸올과 같은 분지형 고급 알콜을 포함하는 것인 단계;
(c) (b)로부터의 추출된 중간체 및/또는 그의 에스테르 및 임의적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 선형 알칸산을 적어도 하나의 케톤화 촉매와 접촉시켜 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논을 생성하는 단계;
(d) 단계 (c)로부터의 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논을 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알카논의 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 2급 선형 알칸올로의 촉매적 수소화를 위해 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 단계;
(e) 산성 불균질 촉매의 존재 하에 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 2급 선형 알칸올을 탈수시켜 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 선형 알켄을 형성하는 단계; 및
(f) 단계 (e)에서 수득된 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알켄을 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 2급 선형 알칸으로의 촉매적 수소화를 위해 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 단계;
또는 단계 (e) 및 (f)를 탈수 및 수소화 특성을 제공하는 촉매 또는 촉매 혼합물을 사용하여 하나의 단일 단계로 조합하여, 이로써 단계 (d)에서 수득된 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 2급 선형 알칸올을 7 내지 28개의 탄소 원자를 포함하는 상응하는 선형 알칸으로 직접적으로 수소화분해하는 단계,
여기서 알킬-포스핀 옥시드는 트리옥틸포스핀 옥시드, 옥틸포스핀 옥시드 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 알칸은 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸, 옥타데칸, 테트라데칸 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인
방법. - 제1항에 있어서, (c)의 케톤화 촉매가 금속 산화물 촉매 또는 그의 혼합물인 방법.
- 제2항에 있어서, 금속 산화물 촉매 또는 그의 혼합물이 헤테로폴리산 (H3PW12O40) 촉매, 티타늄 산화물 (TiO2) 촉매, 세륨 산화물 (CeO2) 촉매, 아연-크로뮴 (Zn-Cr) 혼합 산화물 촉매, 망가니즈 산화물 (MnO2) 촉매, 란타넘 산화물 (La2O3) 촉매, 마그네슘 산화물 (MgO) 촉매, 철 산화물 (FeO, FeO2, Fe2O3, Fe3O4, Fe4O5, Fe5O6, Fe5O7), 규소-알루미늄 (Si-Al) 혼합 산화물 촉매 및 지르코니아 (ZrO2) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서의 케톤화 촉매가 망가니즈 산화물 (MnO2) 촉매 또는 마그네슘 산화물 (MgO) 촉매인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 적합한 반응 조건이 150℃ - 350℃의 반응 온도를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (a)에서의 미생물이 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans) 및 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬-포스핀 옥시드가 트리옥틸포스핀 옥시드 (TOPO)이고, 알칸이 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸, 옥타데칸, 및 테트라데칸의 혼합물인 방법.
- 제7항에 있어서, TOPO 대 알칸의 혼합물의 중량비가 1:100 내지 1:10인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (b)에서의 수성 배지의 pH가 5.5 내지 8로 유지되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 수소화 금속 촉매가 루테늄 (Ru) 촉매, 레늄 (Re) 촉매, 니켈 (Ni) 촉매, 철 (Fe), 코발트 (Co) 및 백금 (Pt) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)의 산성 불균질 촉매가 알루미노실리케이트 제올라이트를 포함하는 촉매인 방법.
- 제11항에 있어서, 단계 (e)의 산성 불균질 촉매가 ZSM-5를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)의 촉매가 전이 금속을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 전이 금속이 몰리브데넘인 방법.
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