BR112014029571B1 - Processo para a preparação de hidrocarbonetos substituídos com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio - Google Patents

Processo para a preparação de hidrocarbonetos substituídos com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio Download PDF

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Abstract

PROCESSO DE SÍNTESE DE MULTIESTÁGIOS COM GÁS DE SÍNTESE. A invenção refere-se a um processo para a preparação de hidrocarbonetos substituídos com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio, que compreende as etapas do processo: A) reagir uma fonte de carbono que compreende pelo menos um selecionado a partir de CO2 e CO para produzir acetato e/ou etanol com um primeiro micro-organismo, B) separar o acetato e/ou etanol a partir do primeiro micro-organismo, C) reagir o acetato para produzir um hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio com um segundo micro-organismo e, opcionalmente, D) purificar o hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio.

Description

Campo da invenção
[001] A invenção refere-se a um processo para a preparação de hidrocarbonetos substituídos com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio, que compreende as etapas do processo:A) reagir uma fonte de carbono que compreende pelo menos um selecionado a partir de CO2 e CO para produzir acetato e/ou etanol com um primeiro micro-organismo,B) separar o acetato e/ou etanol a partir do primeiro micro-organismo,C) reagir o acetato e/ou etanol para produzir um hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio com um segundo micro-organismo e, opcionalmente,D) purificar o hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio.
Estado da Técnica
[002] O uso de CO2 como uma fonte de carbono para a síntese de compostos orgânicos em processos microbiológicos é, muitas vezes, descrito na literatura.
[003] Como regra geral, o estado da técnica tenta mapear duas vias metabólicas complementares de diferentes organismos em uma célula recombinante, com a ajuda das quais a substância orgânica pode então ser sintetizada.
[004] Aqui, surge o problema de que diferentes organismos cujas propriedades devem ser trazidas em conjunto constituem organismos altamente especializados a partir de nichos e é, portanto, difícil a possibilidade de combinar a soma de todas as vantagens associadas com os mesmos em uma célula. Além disso, uma falta de acessibilidade genética destes organismos dificulta a manipulação desejada. Processos alternativos para o uso de CO2 como uma fonte de carbono influencia um micro-organismo que é conhecido por ser capaz de fixar CO2 através de uma certa seleção dos parâmetros de fermentação, tal que o referido micro-organismo sintetiza a uma extensão aumentada, uma substância orgânica simples desejada, tal como, por exemplo, etanol, n-butanol ou o 2,3-butanodiol. O documento WO200068407 descreve o uso de bactérias acetogênicas para a produção de etanol, e o documento WO2012024522 descreve o uso de bactérias acetogênicas para a produção de butanodiol.
[005] Todos os processos descritos têm a desvantagem de que os rendimentos são baixos e que o uso de um único tipo de células não permite qualquer flexibilidade com as condições de fermentação.
[006] Era um objetivo da invenção fornecer um processo que fosse capaz de superar pelo menos uma desvantagem do estado da técnica.
Descrição da invenção
[007] Surpreendentemente, verificou-se que o processo de multiestágios descrito abaixo com uma separação de produção de acetato a partir de CO2 e/ou CO a partir do processamento adicional com acetato foi capaz de superar as desvantagens do estado da técnica no mais simples dos modos.
[008] Portanto, a presente invenção fornece um processo como descrito na reivindicação 1 e nas outras reivindicações independentes.
[009] Uma vantagem da presente invenção é que as misturas de CO2/CO são uma matéria-prima essencialmente mais favorável que podem, além disso, ser produzidas a partir de várias fontes, tais como o gás natural e o biogás, carvão, petróleo, e também resíduos de plantas.
[010] Uma outra vantagem do processo de acordo com a invenção é o elevado rendimento de carbono. Isto se torna possível pela reciclagem do CO2 formado. Isto é porque o CO2 pode ser reagido no primeiro estágio de novo para produzir o ácido acético.
[011] Uma outra vantagem reside na maior flexibilidade no que se refere às condições de fermentação utilizadas uma vez que para a produção real na etapa do processo C) de acordo com a invenção, um organismo diferente é utilizado então para a fixação de carbono no acetato.
[012] Ainda uma outra vantagem da presente invenção é que através do uso de acetato e/ou etanol, em particular, acetato, como fonte de carbono na etapa do processo C), diferentes composições de produtos podem surgir, então, se um açúcar é usado na etapa do processo C).
[013] A presente invenção fornece um processo para a preparação de hidrocarbonetos substituídos com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio, que compreende as etapas do processo:A) reagir uma fonte de carbono que compreende pelo menos um selecionado a partir de CO2 e CO para produzir acetato e/ou etanol, em particular, acetato, com um primeiro micro-organismo,B) separar o acetato e/ou etanol, em particular acetato, a partir do primeiro micro-organismo,C) reagir o acetato e/ou etanol, em particular, acetato, para produzir um hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio com um segundo micro-organismo e, opcionalmente,D) purificar o hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio, de preferência, com pelo menos 3, em particular, pelo menos 4 átomos de carbono.
[014] Em conexão com a presente invenção, o termo "acetato" deve ser entendido como significando tanto o ácido acético quanto também os seus sais; este surge automaticamente uma vez que os micro-organismos funcionam em meio aquoso, e não há sempre, portanto, um equilíbrio entre o sal e de ácido.
[015] Em conexão com a presente invenção, o termo "segundo micro-organismo" deve ser entendido como significando um diferente do "primeiro micro-organismo" da etapa do processo A). A menos que indicado de outra forma, todas as porcentagens mencionadas (%) são em porcentagem em massa.
[016] No processo de acordo com a invenção, na etapa do processo A) acetato e/ou o etanol é formado por um primeiro micro-organismo a partir de uma fonte de carbono compreendendo dióxido de carbono e/ou monóxido de carbono; esta formulação inclui o caso em que o acetato e/ou etanol é formado, pelo menos parcialmente, a partir de dióxido de carbono e/ou monóxido de carbono.
[017] No que se refere à fonte de dióxido de carbono e/ou monóxido de carbono de substratos, é evidente que existem muitas fontes possíveis para o fornecimento de CO e/ou CO2 como fonte de carbono. Está claro que, na prática, a fonte de carbono da presente invenção que pode ser utilizada é qualquer gás ou qualquer mistura de gás que é capaz de fornecer os micro-organismos com uma quantidade suficiente de carbono para lhes permitir formar acetato e/ou etanol.
[018] No processo de acordo com a invenção, é preferível que a fonte de carbono seja fornecida por gases residuais, tais como, por exemplo, gás de síntese, gás de combustão, gases residuais da refinaria de petróleo, gases formados como resultado da fermentação de leveduras ou da fermentação de Clostridium, gases residuais a partir da gaseificação de materiais que contêm celulose ou da gaseificação do carbono.
[019] Neste contexto, é particularmente preferencial que pelo menos parte do dióxido de carbono e/ou monóxido de carbono constitua um subproduto da etapa do processo C) do processo de acordo com a invenção. Isto tem o efeito técnico de que o rendimento de carbono é 100 % ao longo de todo o processo. Estes gases residuais não têm necessariamente de ser formados como fenômenos secundários de processos diferentes, mas podem ser produzidos especialmente para utilização no processo de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferencial do processo de acordo com a invenção, a fonte de carbono é o gás de síntese.
[020] O gás de síntese pode ser fornecido, por exemplo, a partir do subproduto da gaseificação do carbono. O micro-organismo consequentemente converte uma substância que é um produto de resíduos em uma matéria-prima valiosa.
[021] Em alternativa, o gás de síntese pode ser fornecido pela gaseificação de matérias-primas agrícolas de custo eficaz para amplamente disponíveis para o processo de acordo com a invenção.
[022] Existem numerosos exemplos de matérias-primas que podem ser convertidas em gás de síntese uma vez que quase todas as formas de vegetação podem ser utilizadas para este fim. As matérias-primas preferenciais são selecionadas a partir do grupo que compreende espécies perenes, tais como Miscanthus sinensis, resíduos de cereais, resíduos de processamento, tais como serragem.
[023] Em geral, o gás de síntese é obtido em um aparelho de gaseificação da biomassa seca, principalmente, por pirólise, oxidação parcial e reformação de vapor, os produtos primários sendo CO, H2 e CO2.
[024] Normalmente, uma parte do gás do produto é processado de modo a otimizar os rendimentos do produto e para evitar a formação de alcatrão. O craqueamento do alcatrão indesejado no gás de síntese e CO pode ser efetuado com o uso de cal e/ou dolomita. Estes processos são descritos em detalhe, por exemplo, em Reed, de 1981 (Reed, T.B., 1981, Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ).
[025] Também é possível utilizar misturas de diferentes fontes, como a fonte de carbono.
[026] Em geral, prefere-se no processo de acordo com a invenção que a fonte de carbono na etapa do processo A) compreende pelo menos 50 % em peso, de preferência, pelo menos 70 % em peso, de modo particularmente preferencial, pelo menos 90 % em peso, de CO2 e/ou CO, em que a % em peso refere-se a todas as fontes de carbono que se encontram disponíveis para o micro-organismo na etapa do processo A).
[027] Na etapa do processo A), de preferência, um agente redutor, de preferência, hidrogênio é transportado juntamente com o dióxido de carbono e/ou monóxido de carbono para a reação.
[028] Consequentemente, um processo que é o preferencial de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono na etapa do processo A) compreende gás de síntese, em particular, consiste em gás de síntese.
[029] Os micro-organismos que convertem CO2 e/ou CO para acetato e/ou etanol, em particular, acetato, bem como os processos adequados e condições de processo que podem ser utilizados na etapa do processo A) são conhecidos há muito tempo. Tais processos estão descritos por exemplo nos documentos WO9800558, WO2000014052, WO2010115054 em Demler et al. Reaction engineering analysis of hydrogenotrophic production of acetic acid by Acetobacterium woodii. Biotechnol Bioeng. Fevereiro de 2011; 108(2): 470-4, em Younesia et al. Ethanol and acetate production from synthesis gas via fermentation processes using anaerobic bacterium, Clostridium ljungdahlii. Biochemical Engineering Journal, Volume 27, Issue 2, páginas 110 119, em Morinaga et al. The production of acetic acid from carbon dioxide and hydrogen by an anaerobic bacterium. Journal of Biotechnology, Volume 14, Issue 5 2, páginas 187-194, em Li Production of acetic acid from synthesis gas with mixed acetogenic microorganisms, ISSN 0493644938, em Schmidt et al. Production of acetic acid from hydrogen and carbon dioxide by clostridium species ATCC 2979. Chemical Engineering Communications, 45:1-6, 61-73, em Sim et al. Optimization of acetic acid production from synthesis gas by chemolithotrophic bacterium - Clostridium aceticum using a statistical approach. Bioresour Technol. Maio de 2008; 99(8):2724-35, em Vega et al. Study of gaseous substrate fermentations CO conversion to acetate 1 Batch culture and 2 continuous culture. Biotechnology and Bioengineering Volume 34, Issue 6, páginas 15 774 e 785, Setembro de 1989, em Cotter et al. Ethanol and acetate production by Clostridium ljungdahlii and Clostridium autoethanogenum using resting cells. Bioprocess and Biosystems Engineering (2009), 32(3), 369-380 e em Andreesen et al. Fermentation of glucose, fructose, and xylose by Clostridium thermoaceticum. Effect of metals on growth yield, enzymes, and the synthesis of acetate from carbon dioxide. Journal of Bacteriology (1973), 114(2), 743-51.
[001] O versado na técnica é oferecido a partir destes com um grande número de opções viáveis para a concepção da etapa do processo A), em que todas funcionam bem.
[002] De particular adequação, neste contexto, são bactérias acetogênicas. O grupo de bactérias acetogênicas anaeróbicas pertence aos procariotas anaeróbicos que podem utilizar o CO2 como receptor de elétrons terminais e ao fazê-lo formam o acetato e/ou etanol. Atualmente, 21 diferentes gêneros são incluídos entre os acetogenes (Drake et al., 2006), dos quais alguns também são clostrídios (Drake & Küsel, 2005). Eles são capazes de utilizar o dióxido de carbono e monóxido de carbono como também o carbono e hidrogênio como fonte de energia (Wood, 1991). Além disso, os álcoois, aldeídos, ácidos carboxílicos, e numerosos hexoses também podem ser utilizados como fonte de carbono (Drake et al., 2004). A via metabólica redutora que leva à formação de acetato é referida como via de acetil- CoA ou via de Wood-Ljungdahl.
[003] Portanto, é preferível que na etapa do processo A) do processo de acordo com a invenção, uma bactéria acetogênica seja utilizada como o primeiro micro-organismo. É dada particular preferência ao uso de bactérias acetogênicas selecionadas a partir do grupo que compreende Clostridium autothenogenum DSMZ 19630, Clostridium ragsdahlei ATCC n°. BAA-622, Clostridium autoethanogenum, Moorella sp HUC22-1, Moorella thermoaceticum, Moorella thermoautotrophica, Rumicoccus productus, Acetoanaerobum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Carboxydothermus, Desulphotomaculum kutznetsovii, Pyrococcus, Peptostreptococcus, Butyribacterium methylotrophicum ATCC 33266, Clostridium formicoaceticum, Clostridium butyricum, Laktobacillus delbrukii, Propionibacterium acidoprprionici, Proprionispera Arboris, succiniproducens Anaerobierspirillum, Bacterioides amylophilus, Becterioides ruminicola, Thermoanaerobacter kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium notera, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Eubacterium limosum, Peptostreptococcus productus, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ATCC 29797 e Clostridium carboxidivorans, em particular, ATCC BAA-624. Uma bactéria particularmente adequada é Clostridium carboxidivorans, em particular, aquelas cepas tais como "P7" e "P11". Tais células são descritas, por exemplo, nos documentos US 2007/0275447 e US 2008/0057554.
[004] A bactéria mais particularmente adequada é Clostridium ljungdahlii, em particular, cepas selecionadas a partir do grupo que compreende Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ERI2 ljungdahlii, Clostridium ljungdahlii C0L e Clostridium ljungdahlii S-52, estas são descritas no WO 98/00558 e WO 00/68407, e também ATCC 49587, ATCC 55988 e ATCC 55989.
[005] Em uma modalidade particularmente preferencial do processo de acordo com a invenção, na etapa de processo A) etanol é formado e o micro-organismo usado é Alkalibaculum Bacchi ATCC BAA-1772, Moorella sp. HUC22-1, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdahlei, ou Clostridium autoethanogenum. Instruções correspondentes para a realização da etapa do processo A) podem ser encontradas, por exemplo, em Saxena et al. Effect of trace metals on ethanol production from synthesis gas by the ethanologenic acetogen Clostridium ragsdalei. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology Volume 38, Número 4 (2011), 513-521, em Younesi et al. Ethanol and acetate production from synthesis gas via fermentation processes using anaerobic bacterium Clostridium ljungdahlii. Biochemical Engineering Journal Volume 27, Issue 2, 15 de dezembro de 2005, páginas 110-119, em Sakai et al. Ethanol production from H2 and CO2 by a newly isolated thermophilic bacterium, Moorella sp. HUC22-1. Biotechnology Letters Volume 26, Número 20 (2004), 1607-1612 e em Abrini et al. Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Archives of Microbiology Volume 161, Number 4 (1994), 345-351.
[006] A etapa do processo A) é, de preferência, realizada sob condições anaeróbicas.
[007] Na etapa do processo B) do processo de acordo com a invenção, o acetato e/ou etanol formado na etapa do processo A), em particular, acetato, é separado do primeiro micro-organismo. No caso mais simples, os micro-organismos são removidos, por exemplo, por métodos conhecidos, tais como sedimentação, centrifugação ou filtração sob a forma sólida a partir do meio compreendendo o acetato e/ou etanol, em particular, acetato e, opcionalmente, a fase líquida remanescente é passada diretamente para a etapa do processo C). A introdução direta tem a vantagem de que quaisquer meios constituintes adicionalmente ainda presentes na etapa do processo A), tal como, por exemplo, vitaminas, elementos traço ou indutores, estão de igual modo disponíveis para o segundo micro-organismo na etapa do processo C) e, portanto, é a preferencial. A este respeito, pode ser vantajoso e, portanto, preferencial aumentar a concentração do acetato e/ou etanol, em particular, acetato, antes da introdução na etapa do processo C), por exemplo, através da remoção de pelo menos parte da água presente. Da mesma forma, o próprio acetato pode ser removido dos micro-organismos na etapa do processo A) por meio de extração, em particular, por meio de extração in situ. Processos de extração adequados são conhecidos do versado na técnica, assim, por exemplo, a partir de EP2294206, WO2000014052, US 4405717, a partir Katikaneni et al. Purification of Fermentation-Derived Acetic Acid By Liquid-Liquid Extration and Esterification. Ind. Eng. Chem. Res. 2002, 41, 2745-2752, e de Huh et al. Selective extration of acetic acid from the fermentation broth produced by Mannheimia succiniciproducens. Biotechnol Lett. 2004 Oct; 26(20):1581-4.
[008] Extratores adequados são descritos, por exemplo, em The modified solvent and solvent/co-solvent mixture nas páginas 8 a 17 do WO2000014052.
[009] No caso de uma separação do acetato por extração, os extratantes, de preferência, presentes são, em particular as alquilaminas ou solventes de baixa ebulição, tais como o MTBE ou acetato de etila, onde as alquilaminas são, de preferência, aquelas com pelo menos 16 átomos de carbono, de preferência, trialquilaminas e as trialquilaminas particularmente preferenciais são selecionadas a partir do grupo que compreende tri- hexilamina, trioctilamina, tridecilamine, tricaprilamina, tridodecilamina. Estes extratores que compreendem trialquilaminas são, de preferência, utilizados em conjunto com uma extração in situ na etapa do processo B). Isto tem o efeito técnico de que o primeiro micro-organismo não é danificado e a vantagem adicional de que a etapa do processo B) pode ser realizada em um processo de contracorrente, que é adicionalmente preferencial.
[010] Em particular, o extratante utilizado na etapa do processo B) é uma mistura de trioctilamina e 2-etil-1- hexanol, sendo estes, de preferência, usados em quantidades idênticas. Para obter instruções detalhadas do processo, pode ser feita referência ao documento EP2294206 e às etapas do processo A) e B) nele descritas.
[011] Na etapa do processo C), o acetato e/ou etanol, em particular, acetato, é reagido com um segundo microorganismo para produzir um hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio.
[012] O hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio é, de preferência, ácidos carboxílicos, ácidos dicarboxílicos, ácidos hidróxi carboxílicos, ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de ácidos hidróxi carboxílicos, álcoois, aldeídos, cetonas, em particular, os que têm 4 a 32, de preferência, 6 a 20, particularmente de preferência, 8 a 12, átomos de carbono. É dada particular preferência aos ácidos carboxílicos, ácidos hidróxi carboxílicos e ésteres de ácidos carboxílicos.
[013] O segundo micro-organismo é, de preferência, levedura ou bactéria.
[014] O segundo micro-organismo é, de preferência, uma cepa geneticamente modificada que foi geneticamente otimizada, em particular, no que se refere ao rendimento do hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio.
[015] O versado na técnica conhece do estado da técnica o segundo micro-organismos apropriado para a molécula alvo particular e as condições do processo a serem aplicadas.
[016] Assim, os documentos WO2011127409, WO2009111672 e WO2010062480 descrevem o segundo micro-organismo e os processos adequados para a preparação de álcoois graxos, WO2012017083 para a preparação dos ésteres etílicos de ácidos graxos, WO2011157848, WO2011059745, WO 2009140695, WO2007106903 e WO2009124694 para a preparação de ácidos graxos, WO2010126891 para a preparação de álcoois, ácidos graxos e ésteres de ácidos graxos, WO2010118410, WO2010021711 e WO2010022090 para a preparação de ésteres de ácidos graxos, WO2010042664 e WO 2009140695 para a preparação de aldeídos de ácidos graxos, WO2012038390, WO2007077568 e WO2011153317 para a preparação de ácidos dicarboxílicos e WO2011008232, WO 2009156214, WO2007141208, WO2004003213, GB2473755 e EP11191923.9 para a preparação de ácidos hidróxi carboxílicos.
[017] Em uma alternativa preferencial do processo de acordo com a invenção, o hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio é de ácidos graxos, em particular, ácidos graxos lineares, saturados com 4 a 32, de preferência, 6 a 20, particularmente de preferência, 8 a 12 átomos de carbono. A este respeito, o segundo micro-organismo é um microorganismo, em particular, que possui um aumento da atividade de pelo menos um tioesterase comparado com o seu tipo selvagem. O termo "um aumento da atividade em comparação com o seu tipo selvagem" deve ser entendido como significando que o micro-organismo foi geneticamente modificado de tal forma que ele tem este aumento de atividade. De preferência, isto é entendido como significando uma superexpressão de uma tioesterase ou a expressão de uma tioesterase exógena. As tioesterases preferenciais a este respeito são selecionadas de acil-ACP- tioesterases, de preferência, EC 3.1.2.14 ou EC 3.1.2.22 ou acil-CoA-tioesterases, de preferência, EC 3.1.2.2, EC 3.1.2.18, EC 3.1.2.19, EC 3.1.2.20 ou EC 3.1.2.22. Os segundos micro-organismos preferenciais os quais são utilizados na alternativa de acordo com a invenção são divulgados no WO2010118410, WO2010075483, WO2008119082 e WO2007136762, sendo expressamente feita referência ao conteúdo de divulgação destes documentos no que diz respeito a esses micro-organismos e no que diz respeito a essas tioesterases. Em uma modalidade particularmente preferencial do processo de acordo com a invenção, o ácido graxo é ácido octanóico e/ou ácido decanóico e a tioesterase é o produto do gene de fatB2 de Cuphea hookeriana.
[018] Em uma alternativa preferencial do processo de acordo com a invenção, o hidrocarboneto substituído com pelo menos um grupo que contém pelo menos um átomo de oxigênio é: ácidos hidróxi carboxílicos, em particular, os ácidos ômega-hidróxi carboxílicos ou ácidos hidróxi isobutírico, em particular, ácido 3-hidróxi isobutírico. A este respeito, com relação aos ácidos hidróxi isobutiricos, o segundo micro-organismo é, em particular, um microorganismos divulgado em WO2009156214, WO2007141208, WO2009135074 e EP11191923.9, sendo expressamente feita referência ao conteúdo da divulgação desses documentos no que diz respeito isso. Neste contexto, em relação ao ácido ômega-hidróxi carboxílico, o segundo micro-organismo é, em particular, micro-organismos que são divulgados no WO2011008232, sendo expressamente feita referência para o conteúdo da divulgação deste documento no que diz respeito a isto.
[019] É preferencial, de acordo com a invenção, que o dióxido de carbono produzido na etapa do processo C) seja retornado ao processo na etapa do processo A) e esteja, portanto, disponível como fonte de carbono. Isto tem o efeito técnico de que o rendimento de carbono é 100 %.
[020] Os exemplos listados a seguir ilustram a presente invenção, a título de exemplo, sem qualquer intenção de restringir a invenção, o escopo de aplicação da qual sendo aparente a partir da totalidade da descrição e das reivindicações, das modalidades especificadas nos exemplos. As seguintes figuras são um componente dos exemplos: Figura 1: Produção de ácidos graxos em E. coli a partir de acetato preparada de forma microbiana a partir de gás de síntese.
[021] ExemplosExemplo 1: Etapa do processo A) formação de acetato e etanol
[022] Uma cultura viva de Clostridium carboxidivorans DSMZ 15243 foi carregada para uma garrafa anaeróbica de 1 l em 200 ml de meio PETC modificado por Hurst consistindo em 1 g de extrato de levedura, 19 g de MES, 30 ml de solução de sal mineral, 10 ml de solução de elementos traço, 10 ml de solução de vitaminas em 1 l de água dd. O pH foi ajustado para um pH de 5,9 com NaOH 0,5 M. A solução de sal mineral consiste em 80 g de cloreto de sódio, 100 g de cloreto de amônio, 10 g de cloreto de potássio, 10 g de monofosfato de potássio, 20 g de sulfato de magnésio, 4 g de cloreto de cálcio por litro. A solução de vitamina consiste em 0,01 g de piridoxina, 0,005 g de tiamina, 0,005 g de riboflavina, 0,005 g de pantotenato de cálcio, 0,005 g de ácido tióctico, 0,005 g de (para) ácido aminobenzóico, 0,005 g de ácido nicotínico, 0,005 g de vitamina B12, 0,002 g de biotina, 0,002 g de ácido fólico, 0,01 g de MESNA por litro. A solução de elementos traços consiste em 2 g de ácido nitriloacético, 1 g de sulfato de manganês, 0,8 g de sulfato de amônio e ferro, 0,2 g de cloreto de cobalto, 0,2 g de sulfato de zinco, 0,02 g cloreto de cobre(II), 0,02 g de cloreto de níquel, 0,02 g de molibdato de sódio, 0,02 g de selenato de sódio, 0,02 g de tungstato de sódio por litro.
[023] O meio foi fervido durante 20 min e, em seguida, gaseificado com nitrogênio puro durante 20 min. Foi então autoclavado durante 20 minutos a 121 °C. Após resfriamento, o meio foi carregado 3x com uma mistura gasosa de 50 % de CO, 45 % de H2 e 5 % de CO2 a uma pressão superior à atmosférica de 1 bar (100 kPa). A pressão foi então ajustada a pressão superior à atmosférica de 0,8 bar (80 kPa). Diretamente antes da inoculação, 1,5 ml de uma solução fortificante a 4 % de sulfito de sódio/ cloridrato cisteína, em cada caso, foi adicionado como agente redutor, sob condições anaeróbicas estéreis. A cultura foi cultivada a 37 °C com 100 rpm, (5 cm de excentricidade). Em cada caso, após 72 horas, a cultura foi transferida por meio de inoculação para um novo meio.
[024] O inoculo para a preparação do produto foi removido a partir de uma cultura de 48 h de envelhecimento.
[025] Para este fim, um recipiente de 2 litros agitado, Labfos 2a partir de Infors HT foi enchido com 900 ml do meio de PETC modificada acima descrito - excluindo MESNA - sem a solução de vitaminas e gaseificado com nitrogênio durante 20 minutos. O recipiente foi, em seguida, autoclavado a 121 °C durante 20 minutos. A solução de vitaminas foi então adicionada sob condições anaeróbicas estéreis.
[026] O pH foi regulado a 5,9 durante toda a fermentação com NaOH 0,5 M e HCl 0,5 M. A mistura gasosafoi ajustada para 80 % de CO e 20 % de CO2 usando umaestação de mistura de gás de WMR 4000 junto à WestphalMess- und Regeltechnik. A gaseifição foi realizadaconstantemente em 5 l/h. A velocidade do agitador foi estabelecida a uma constante de 400 rpm, o que corresponde a uma entrada de potência de 0,2 W/l.
[027] Diretamente antes da inoculação, 7,5 ml de uma solução fortificante a 4 %, em cada caso, de sulfito de sódio/cloridrato de cisteína foram adicionados como agente redutor sob condições anaeróbicas estéreis.
[028] O inoculo era de 10 % e foi igualmente adicionado em condições anaeróbicas estéreis por 30 minutos após o início da gaseificação. A OD600 inicial foi de 0,055. Através de um tubo de ascensão, 3 ml de amostra foram retirados usando uma seringa após 0 / 14,4 / 16,8 / 20,8 / 24,2 / 38,7 h.
[029] A concentração de ácido acético, etanol, ácido butírico e butanol foi determinada por meio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). A coluna Aminex HPX-87H foi utilizada como fase estacionária. O eluente utilizado foi ácido sulfúrico 5 mM a uma vazão constante de 0,6 ml/min. A temperatura da coluna foi de 40 °C. A detecção de etanol e butanol foi realizada por meio do detector de índice de refração, e o ácido butírico e ácido acético foram detectados utilizando um detector de arranjo de diodos em um comprimento de onda de 210 nm. As concentrações de material foram determinadas através da área de pico com referência a linhas de calibração retas de concentrações definidas. Depois de 38,7 horas, butanol 0 mM, butirato 1,42 mM, etanol 3,33 mM e acetato 54,26 mM foram medidos. Isto corresponde a uma fração de acetato de 91,95 %.Exemplo 2: Etapa do processo B) separação de acetato
[030] Depois de separar as células, o pH do caldo de fermentação foi reduzido para um pH abaixo de 3,0 por adição de ácido acético. Uma solução de tri-n-octilamina em 1-octanol na razão de 1:1 foi então adicionada ao caldo de fermentação e misturada a uma velocidade de agitação de pelo menos 1000 rpm a 25 °C por até 2 horas, com o caldo de fermentação. A separação de fases subsequente foi realizada por centrifugação. O ácido acético foi então destilado a partir da fase orgânica, a 120 °C e uma pressão superior à atmosférica de 500 mbar (50 kPa). O teor de ácido acético do destilado foi determinado por HPLC e a solução foi utilizada na concentração correspondente na fermentação posterior (cf. Exemplos 3 e 4 e 6).Exemplo 3: Reação de acetato para produzir ácidos graxos C8 e C10 em E. coli recombinante
[031] A cepa de E. coli JW5020-1 (ΔfadE), disponível a partir de Yale CGSC, The Coli genética Stock Center, foi inoculada com riscos usando uma agulha de inoculação de uma criocultura em uma placa de ágar LB consistindo em 5 g de extrato de levedura, 10 g de peptona, 0,5 g de cloreto de sódio e 15 g de ágar-ágar a pH 7. A cepa de E. coli JW5020- 1 (ΔfadE) pJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc] foi inoculada com riscos usando uma agulha de inoculação de uma criocultura para uma placa de LB que adicionalmente compreende 100 mg/ml de ampicilina. As placas foram incubadas durante a noite a 37 °C.
[032] A cepa de E. coli JW5020-1 (ΔfadE) pJ294 [Ptac- ChFATB2_optEc] é transformada com um vetor de expressão para o gene fatB2 de Cuphea hookeriana. Para produzir o vetor acima mencionado, este gene foi códon otimizado para a expressão em Escherichia coli. O gene foi sintetizado juntamente com um promotor tac e ao mesmo tempo um sítio de restrição a montante do promotor e um sítio de restrição a jusante do terminador foram inseridos. O fragmento de DNA sintetizado Ptac-ChFatB2 (SEQ ID NO. 1) foi digerido com as endonucleases de restrição BamHI e Notl e ligado ao vetor pJ294 clivado correspondentemente (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA, EUA). O vetor de expressão de E. coli acabado foi referido como pJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc] (ID SEQ. 2).
[033] Pré-cultura 1: Ambas as culturas foram transferidas, em cada caso, por inoculação em 10 ml de M9, meio líquido mod-G em 100 ml de frascos de agitação com chicanas. O meio M9 mod-G consiste em 2,6 g/l de (NH4)2SO4, 0,49 g/l de MgSO4 + 7H2O, 20 g/l de glicose, 1 ml/l de elementos traços US3 dissolvidos em 800 ml de tampão M9 e 150 ml de ddH2O. O tampão M9 consiste em 6,79 g/l Na2HPO2 2H2O +, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 2 g/l de NH4Cl dissolvido em 800 ml de ddH2O. Para a cepa portadora de plasmídeo, 100 μg/ml de ampicilina foram adicionados ao meio.
[034] Uma agulha de inoculação foi utilizada em cada caso, para transferir um circuito completo de material de células a partir das placas para os meios líquidos correspondentes.
[035] As culturas foram incubadas a 37 °C e 200 rpm durante a noite. Após 20 horas, a OD foi: E.coli JW5020-1 (ΔfadE) 10,6E. coli JW5020-1 ΔfadE) pJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc] 12,8.
[036] Pré-cultura 2: 0,5 ml de pré-cultura 1 foitransferido por meio de inoculação em 20 ml de M9, mod-G em frascos de agitação de 100 ml com chicanas. O meio M9, mod- L é composto de 2,6 g/l de (NH4)2SO4, 0,49 g/l de MgSO4 + 7H2O, 60 mM de acetato de sódio (a partir do Exemplo 2), 1 ml/l de elementos traços US3 dissolvidos em 800 ml de tampão M9 e 170 ml de ddH2O. Para a cultura da cepa que transporta o plasmídeo, foram adicionados 100 ng/ml de ampicilina.
[037] As culturas foram incubadas durante a noite a 37 °C e 200 rpm. O diâmetro externo da pré-cultura 2 foi:E. coli JW5020-1 (ΔfadE)/acetato de etila 2.5E. coli JW5020-1 (ΔfadE) pJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc]/acetato de 1,75
[038] 100 ml de meio líquido M9 modificado com 60 mM de acetato por cepa em frascos de agitação de 1000 ml comchicanas foram inoculados com a pré-cultura de modo que umaDO de 0,2 foi obtida.
[039] A cultura foi incubada a 37 °C e 225 rpm.
[040] A uma OD600 de cerca de 0,5, a indução foirealizada com IPTG 1 mM a partir de uma solução de reserva de 1 M de IPTG.
[041] Para a amostragem, em cada caso, 4 ml de suspensão de células foram removidos sob condições estéreis, a OD foi determinada e a suspensão restante foi armazenada a -80 °C em tubos falcon de 15 ml de até que as amostras foram processadas.
[042] A quantificação de ácidos graxos foi realizada seguindo a derivatização como ésteres metílicos de ácidos graxos por meio de cromatografia em fase gasosa. 50 μl de ácido heptadecanóico (10 g/l em etanol dissolvido) foram adicionados como substância de referência interna para as amostras que consistem em 2 ml de caldo de cultura, após a adição de 1 ml de acetona e 2 ml de água. As amostras foram acidificadas com 200 μl de ácido acético e misturadas com 10 ml de uma mistura 1:1 (v/v) de clorofórmio/metanol. As amostras foram completamente misturadas durante pelo menos 1 min. A fase de clorofórmio foi então removida e evaporada. O resíduo seco foi retomado em 1 ml de ácido clorídrico metanólico 1,25 M e incubado durante a noite a 50 °C para esterificar os ácidos graxos presentes. A reação foi parada pela adição de 5 ml de solução de carbonato de sódio saturado (todas as substâncias da Sigma-Aldrich, Steinheim).
[043] Os ésteres metílicos dos ácidos graxos foram extraídos por adição de 1 ml de n-heptano e misturando-se vigorosamente durante 15 segundos. A fase de heptano é medida por meio de cromatografia em fase gasosa. Para a separação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos, a coluna capilar SPTM-2560 com as dimensões de 100 m x 0,25 mm e uma espessura de filme de 0,2 μm (Supelco, Sigma-Aldrich, Steinheim) foi utilizada como fase estacionária. O gás carreador utilizado foi hélio. A separação foi efetuada através do curso de 45 minutos a uma temperatura do injetor de 260 °C, temperatura do detector de 260 °C e uma temperatura de coluna de 140 °C no início, mantida durante 5 min e aumentada para 240 °C a uma taxa de 4 °C/min e mantida durante 15 min. O volume de injeção é de 1 μl, a taxa de divisão 1:20 e o rendimento do gás carreador é 1 ml/min. A detecção foi realizada por meio de detector de ionização por chamas (GC Perkin Elmer Clarus 500, Perkin Elmer, Rodgau). Ácido heptadecanóico (Sigma-Aldrich, Steinheim) foi usado como substância de referência interna para a quantificação do éster metílico de ácidos graxos. As substâncias de referência C8:0-Me éster metílico de ácido caprílico, C10:0-Me éster metílico de ácido cáprico, C12: 0-Me éster metílico de ácido láurico, C14:0-Me éster metílico de ácido mirístico, C16:0-Me éster metílico de ácido palmítico, C16:1-Me éster metílico de ácido palmitoleico, C18:0-Me éster metílico de ácido esteárico, C18:1-me éster metílico de ácido oleico (GLC Standard Mix GLC-20 1892-1AMP, GLC-30 1893-1AMP, GLC-50 1894-1AMP, Sigma-Aldrich, Steinheim) foram utilizados para a calibração. Os limites de determinação para todos os ésteres metílicos de ácidos graxos estão a uma concentração de 10 mg/l.
[044] A distribuição das concentrações de ácidos graxos para E. coli JW5020-1 (ΔfadE) pJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc] após 96 horas aparece normalizada para uma OD de 1, como mostrado na Figura 1.Exemplo 4: Reação de acetato para produzir ácido 3- hidróxi isobutirico (3-HIB) com Yarrowia lipolytica H222-41 Δ3HIBDH (ura)-8
[045] De acordo com o Exemplo 1, ponto 1 a 3 da EP 11191923,9, uma célula H222-41 de Y. lipolytica com atividade atenuada da desidrogenase de ácido 3-hidróxi isobutírico foi sintetizada; esta célula é chamada aqui a seguir H222-41 Δ3HIBDH (ura)-8.
[046] H222-41 Δ3HIBDH (URA)-8 foi cultivada e comparada com a correspondente H222-41 (URA)-8 do tipo selvagem.Cultivo
[047] Ambas as cepas foram semeadas com riscos utilizando uma agulha de inoculação em condições estéreis a partir de crioculturas em placas de ágar de YEPD. As placas de ágar de YEPD consistem em 10 g de glicose, 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona e 15 g de ágar-ágar. O pH é de 5,4. A incubação foi realizada durante 80 horas a 25 °C.
Pré-cultura (biomassa de produção)
[048] Seis frascos de agitação de 1000 ml sem chicanas foram cheios com 100 ml de meio líquido YEPD que consistem em glicose, 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona a pH 5,4. Três gotas de antiespuma Delmex foram adicionadas a cada frasco de agitação.
[049] Por cepa, para cada um dos três frascos de agitação, em cada caso, dois circuitos completos de material de célula foram transferidos por inoculação em condições estéreis a partir das correspondentes placas de ágar de YEPD, utilizando uma agulha de inoculação. A incubação dos frascos de agitação foi realizada durante 20 horas a 28 °C e 180 rpm (amplitude de 2,5 cm).
Preparação do inóculo para a cultura de acetato
[050] Após 20 horas, os 3 frascos de agitação com H222- 41 Δ3HIBDH (URA)-8 de Y. lipolytica e H222-41 (ura)-8 de Y. lipolytica foram combinados. O teor de glicose foi determinado utilizando o multiparâmetro Bioanalytical System YSI 7100 de KREIENBAUM Wissenschaftiche Meβsysteme e.K. como 0 g/l. Os caldos foram divididos em tubos falcon de 50 ml e centrifugados durante 10 minutos a 5600 rpm. O sobrenadante foi descartado e os péletes foram novamente suspensos em solução fortificante de NaCl a 0,9 % ecentrifugou-se novamente durante 10 minutos a 5600 rpm. Esta operação foi repetida mais 2 vezes, a fim de remover possíveis açúcares residuais. Em seguida, os péletes foram novamente suspensos, em cada caso, em 15 ml de meio de acetato, as culturas foram combinadas de acordo com as cepas e tampou-se com meio de acetato a 50 ml em cada caso.
[051] O meio de acetato de acordo com van Uden tem a seguinte composição:
Meio base
[052] 5 g/l de (NH4)2SO4, 5 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de MgSO4 x 7H2O, 0,15 g/l de CaCl2 x 2H2O, 4 g/l de acetato de Na (do Exemplo 2), 5 ml/l de solução de vitaminas, 5 ml/l de solução de biotina, 5 ml/l de solução de elemento traço, 5 ml/l de solução B de elementos traço.
Solução de vitamina
[053] 80 mg/100 ml de pantotenato de Ca, 200 mg/100 ml de mioinositol, 160 mg/100 ml de ácido nicotínico, 160 mg/100 ml de piridoxina HCl, 16 mg/100 ml de tiamina HCl.
Solução de biotina
[054] Biotina 8 mg/l
Solução A de elemento Traço
[055] 100 mg/100 ml de H3BO3, 20 mg/100 ml de KI, 40 mg/100 ml de NaMoO4 x 2 H2O
Solução B de Elemento Traço
[056] 8 mg/100 mL de CuSO4 x 5 H2O, 40 mg/100 ml de FeCl8 x 6 H2O, 80 mg/100 ml de MnSO4 x 4 H2O, ZnSO4 x 7 H2O, HCl 0,001 N.
[057] Os constituintes sólidos do meio base foram dissolvidos em 700 ml de ddH2O, o pH foi ajustado a 5,4 e o meio foi autoclavado. As soluções foram esterilizadas por filtração e adicionadas ao meio de base após o resfriamento, o meio total foi, então, coberto de até 1000 ml com ddH2O estéril.
Condicionamento do fermentador
[058] Quatro fermentadores estéreis de 800 ml de um sistema paralelo de fermentação DASGIP foram carregados com 175 ml de meio acetato. As condições do processo foram ajustadas para 30 pO2 [%], 14 sl/h de fluxo de ar, 400-1500 rpm de velocidade de agitação, temperatura de 28 °C, e pH 5,4. O pH foi regulado com 0,5 % de H2SO4, 25 % de ácido acético e 12,5 % de NH4OH. A alimentação usada foi uma solução fortificante de acetato de Na a 14 % em pH 5,4.
Produção de 3-HIB
[059] Em cada caso, dois fermentadores foram inoculados com 25 ml de inoculo de H222-41 Δ3HIBDH (ura)-8 de Y. lipolytica e H222-41 (ura)-8 de Y. lipolytica.
[060] A amostragem foi realizada 0, 3, 5, 21, 30 e 46 horas após a inoculação. Para todas as amostras, a OD600 e o teor de acetato foram determinados com um kit de teste analítico de R-Biopharm. A alimentação foi adaptada ao consumo de acetato.
[061] Para as amostras a 0 e 46 horas, adicionalmente, uma determinação por RMN com D2O como solvente e uma supressão de água de acetato e 3HIB foi realizada.
Resultado
[062] Os aumentos de OD dentro do período experimental de, em média de 10 até média 45. O teor de acetato no início era, em média, 2250 mg/kg, e no final da fermentação 32 mg/l
[063] O teor de 3HIB no início da fermentação é 0 mg/l tanto para H222-41 Δ3HIBDH (ura)-8 de Y. lipolytica quanto para H222-41 (ura)-8 de Y. lipolytica.
[064] Após 46 horas, 0 mg/kg são medidos para H222-41 (URA)-8 de Y.lipolytica tipo selvagem. A cepa H222-41 Δ3HIBDH (URA)-8 de Y.lipolytica com o nocaute de 3-HIB desidrogenase produziu, em média, 18 mg/kg de 3HIB.Exemplo 5: Etapa do processo B) Separação de Etanol
[065] Etanol foi separado sob a forma de um concentrado aquoso por meio de destilação direta do caldo de fermentação do Exemplo 1.Exemplo 6: Reação de acetato e etanol para produzir ácido hexanóico e éster etílico do ácido hexanóico com a bactéria anaeróbica Clostridium kluyveri
[066] Para o cultivo, frascos de vidro resistentes à pressão foram utilizados os quais podem ser selados de forma estanque ao ar utilizando uma rolha de borracha butílica. Todas as etapas de cultivo foram realizadas sob condições anaeróbicas. Os frascos foram autoclavados durante 20 min a 121 °C a fim de assegurar a esterilidade.
[067] Para as culturas, quatro frascos de vidro resistentes à pressão (volume 500 ml) foram carregados com 200 ml de meio anaeróbico que é recomendado por DSMZ como meio para 52 C. kluyveri. O acetato e etanol necessários foram utilizados a partir dos Exemplos 2 e 5. As culturas foram então inoculadas, em cada caso, com 10 ml de uma cultura de C. kluyveri. As culturas foram, em cada caso, fechadas com uma rolha de borracha butílica e incubadas durante 116,2 horas a 35°. As amostras foram tomadas no início e no final do cultivo. Estas foram analisadas quanto à densidade óptica e vários analitos por meio de RMN. Uma vez que o ácido hexanóico e éster etílico do ácido hexanóico podem ser determinados por meio de RMN apenas como parâmetro cumulativo, a confirmação da presença de ambas as substâncias individuais nas amostras finais foi realizada por meio de análise por GC/MS.
[068] Ao longo do tempo de cultivo, uma diminuição no caso do acetato de 5,4 g/l para 1,4 g/l e, no caso de etanol, de 14,2 g/L para 5,8 g/l foi verificada em média, durante quatro repetições. Ao mesmo tempo, uma formação de ácido butírico foi verificada; aqui, o valor aumentou de 0,13 g/l para 2,5 g/l, e assim também foi uma formação de éster etílico de ácido hexanóico/ácido hexanóico; aqui, o valor aumentou em um total de 0,05 g/L para 7,6 g/l.

Claims (19)

1. Processo para a preparação de hidrocarbonetos substituídos com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio caracterizado pelo fato de que compreende:A) reagir uma fonte de carbono que consiste em pelo menos um de CO2 eCO com um primeiro micro-organismo tal que pelo menos um de acetato e etanol é produzido a partir do pelo menos um de CO2 eCO, em que o primeiro micro-organismo é um micro-organismo acetogênico;B) separar o pelo menos um de acetato e etanol a partir do primeiro micro-organismo,C) reagir o pelo menos um de acetato e etanol separados em B) com um segundo micro-organismo tal que o hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio é produzido a partir do pelo menos um de acetato e etanol; e opcionalmenteD) purificar o hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio,em que o açúcar não é usado na reação em C), eo hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio produzido em C) é selecionado a partir do grupo que consiste em um ácido carboxílico que possui 8 a 32 átomos de carbono, um ácido dicarboxílico, um ácido hidróxi carboxílico, um éster de ácido carboxílico, um éster de ácido hidróxi carboxílico, um álcool que possui 8 a 32 átomos de carbono, um aldeído e uma cetona.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro micro-organismo é pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em Clostridium autothenogenum DSMZ 19630, Clostridium ragsdahlei ATCC n°. BAA-622, Clostridium autoethanogenum, Moorella sp HUC22-1, Moorella thermoaceticum, Moorella thermoautotrophica, Rumicoccus productus, Acetoanaerobum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Carboxydothermus, Desulphotomaculum kutznetsovii, Pyrococcus, Peptostreptococcus, Butyribacterium methylotrophicum ATCC 33266, Clostridium formicoaceticum, Clostridium butyricum, Laktobacillus delbrukii, Propionibacterium acidoprprionici, Proprionispera arboris, Anaerobierspirillum succiniproducens, Bacterioides amylophilus, Becterioides ruminicola, Thermoanaerobacter kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium notera, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, Moorella thermoacetica, Eubacterium limosum, Peptostreptococcus productus, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ATCC 29797 e Clostridium carboxidivorans.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a separação na etapa B) compreende remover o primeiro micro-organismo do meio compreendendo o pelo menos um de acetato e etanol por sedimentação, centrifugação ou filtração.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a separação na etapa B) compreende remover o acetato por extração, com um extratante.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o extratante compreende pelo menos uma alquilamina selecionada a partir do grupo que consiste em tri-hexilamina, trioctilamina, tridecilamina, tricaprilamina e tridodecilamina.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio produzido na etapa C) compreende um ácido graxo, e o segundo micro-organismo tem uma atividade aumentada de uma tioesterase em comparação com o seu tipo selvagem.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio produzido na etapa C) compreende um ácido hidróxi carboxílico.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a reação na etapa C) forma dióxido de carbono, que é retornado à reação na etapa A) como a fonte de carbono.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio produzido na etapa C) compreende um ácido ômega-hidróxi carboxílico, um ácido hidróxi isobutírico, ou ambos.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio produzido na etapa C) que possui 8 a 12 átomos de carbono e é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido carboxílico, um ácido dicarboxílico, um ácido hidróxi carboxílico, um éster de ácido carboxílico, um éster de ácido hidróxi carboxílico, um álcool, um aldeído, e uma cetona.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio produzido na etapa C) que possui 8 a 12 átomos de carbono e é selecionado a partir do grupo que consiste em um ácido carboxílico, um ácido hidróxi carboxílico, e um éster de ácido carboxílico.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um de acetato e etanol compreende acetato.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um de acetato e etanol compreende acetato e etanol.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na reação na etapa C), uma fonte de carbono reagida com o segundo micro-organismo consiste em pelo menos um de acetato e etanol.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono na etapa A) compreende pelo menos 90% em peso de CO2.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio produzido na etapa C) que possui 8 a 32 átomos de carbono e é selecionado a partir do grupo que consiste em um ácido carboxílico, um ácido dicarboxílico, um ácido dicarboxílico, um ácido hidróxi carboxílico, um éster de ácido carboxílico, um éster de ácido hidróxi carboxílico, um álcool, um aldeído, e uma cetona.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo micro-organismo é levedura ou uma bactéria.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hidrocarboneto substituído com um grupo compreendendo um átomo de oxigênio produzido na etapa C) é ácido octanóico, ácido decanóico ou ambos.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a tioesterase é codificada por um gene de fatB2 de Cuphea hookeriana.
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