KR102569875B1

KR102569875B1 - 알콜의 호기성 생산 방법

Info

Publication number: KR102569875B1
Application number: KR1020160008542A
Authority: KR
Inventors: 토마스 하스; 토마스 뷜터; 마르틴 뎀레르; 시몬 베크
Original assignee: 에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2023-08-24
Also published as: AR103522A1; EP3050966A1; RU2016102677A3; MX2016001241A; US9920334B2; ZA201600496B; US20160215304A1; EP3050968A1; KR20160092930A; EP3050968B1; CA2919029A1; RU2016102677A; CN105821084A; BR102016001727A2; CA2919029C; CN105821084B; RU2724532C2

Abstract

- 지수 성장기의 제1 아세트산생성 미생물;
- 유리 산소; 및
- 정지기의 제2 아세트산생성 미생물
을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 아세트산생성 미생물은 탄소원을 아세테이트 및/또는 에탄올로 전환시킬 수 있는 것인, 호기성 조건에서 탄소원으로부터 에탄올 및/또는 아세테이트를 생산하기 위한 반응 혼합물을 개시한다.

Description

알콜의 호기성 생산 방법 {AN AEROBIC METHOD OF PRODUCING ALCOHOLS}

본 발명은 호기성 조건에서 탄소원으로부터 고급 알콜을 비롯한 알콜을 생산하는 반응 혼합물 및 생명공학적 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 혼합물 및 방법은 산소 및 어린 세포의 존재 하의 적어도 1종의 알콜의 생명공학적 생산에 관한 것이다.

알콜, 특히 에탄올을 생산하는 생명공학적 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 특히 에탄올 및/또는 아세테이트를 생산하기 위한 다양한 탄소원 상에서의 아세트산생성 박테리아의 사용이 널리 공지되어 있다. 그러나, 대부분의 경우에, 알콜의 생산은 단지 산소의 부재 하에 성공적으로 수행될 수 있다. 이 현상은 적어도 문헌 [Brioukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan, 2013] 등에 의해 확인되며, 여기서 아세트산생성 박테리아는 호기성 조건에서 에탄올을 성공적으로 생산하지 못하는 것으로 제시되어 있다. 따라서, 관련 기술분야에 공지된 현행 방법에서는, 스틸 밀로부터 산소를 포함하는 탄소 기질, 예컨대 폐가스를 먼저 산소가 제거되도록 처리한 후에 에탄올 및/또는 아세테이트 생산을 위한 아세트산생성 세포에 도입한다. 산소 분리 단계는 공정을 보다 고비용으로 및 시간 소모적으로 만든다. 추가로, 이 분리 단계 동안 일부 원료 손실이 있을 수 있다.

따라서 산소의 존재 하에서도 에탄올 및/또는 아세테이트를 생산하는 수단에 대한 필요성이 관련 기술분야에 존재한다. 에탄올은 이어서 고급 탄소 화합물, 예컨대 알콜, 산 등의 생산을 위한 원료로서 사용될 수 있다.

예를 들어, 부탄올 및 고급 알콜은 연료로서 사용되는 것을 비롯하여 여러 용도를 갖는다. 예를 들어, 부탄올은 향후 가솔린을 대체할 수 있는데, 이는 두 연료의 에너지 함량이 거의 동일하기 때문이다. 추가로, 부탄올은 에탄올과 비교하였을 때 대체 연료로서 여러 다른 우수한 특성을 갖는다. 이들은 보다 높은 에너지 함량을 갖는 부탄올, 에탄올 또는 가솔린보다 덜 "증발성"인 부탄올 및 에탄올과 비교하여 용이하게 수송가능한 부탄올을 포함한다. 이들 이유 등으로, 부탄올 및/또는 관련 고급 알콜에 대한 기존의 잠재적 시장이 이미 존재한다. 부탄올 및 다른 고급 알콜은 또한 산업용 용매로서 사용된다.

현재, 부탄올 및 다른 고급 알콜은 주로 석유로부터 제조된다. 이들 화합물은 환경에 나쁜 가솔린 또는 석유를 크래킹하여 수득된다. 또한, 이들 출발 물질에 대한 비용은 석유 가격과 연결되고, 향후 석유 가격은 증가할 것으로 예상되므로, 부탄올 및 다른 고급 알콜 가격이 또한 석유 가격의 증가에 비례하여 증가할 수 있다.

역사적으로 (1900년대-1950년대), 바이오부탄올은 발효 공정에서 옥수수 및 당밀로부터 제조되었으며, 상기 공정은 아세톤 및 에탄올을 또한 생산하고 전형적으로 특정 부탄올-생산 박테리아, 예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 및 클로스트리디움 베이제린크키이(Clostridium beijerinckii)를 사용하는 ABE (아세톤, 부탄올, 에탄올) 발효로서 공지되어 있다. 이 방법은 최근에 녹색 에너지에 대한 새로워진 관심으로 다시 인기를 얻었다. 그러나, "옥수수전분 부탄올 생산" 공정은 농업 옥수수-작물 경작, 옥수수-곡물 수확, 옥수수-곡물 전분 처리 및 전분→당→부탄올 발효를 비롯한 다수의 에너지-소모 단계를 요구한다. "옥수수전분 부탄올 생산" 공정은 또한 거의 그의 산물인 부탄올의 에너지 값만큼 많은 에너지의 비용이 들 수 있다.

알폴(Alfol)® 알콜 공정은 유기알루미늄 촉매를 사용하여 에틸렌으로부터 고급 알콜을 생산하는데 사용된 방법이다. 반응은 선형 장쇄 1급 알콜 (C₂-C₂₈)을 생산한다. 공정은 알루미늄 촉매를 사용하여 에틸렌을 올리고머화하고 생성된 알킬 기가 산소화되도록 한다. 그러나, 이 방법은 폭넓은 스펙트럼의 알콜을 생성하고 분포 패턴이 유지된다. 이 일정한 패턴은 단지 최대 수요를 갖거나 또는 최고의 경제적 가치를 갖는 특정한 알콜 범위만을 제조하기 위한 생산자의 능력을 제한한다. 또한, 반응에 필요한 가스는 매우 청정하여야 하고, 반응이 성공적으로 수행되기 위해서는 별개의 가스 조성물이 필요하다.

WO2009100434는 또한 탄수화물로부터 부탄올 및 헥산올을 생산하는 간접 방법을 기재한다. 방법은 아세트산 중간체를 생산한 다음에 이를 에탄올로 화학적으로 전환시키는 호모아세트산생성 발효를 포함한다. 이어서 에탄올 및 아세트산 중간체의 잔여 부분이 산생성 발효에서 기질로서 사용되어 부티르산 및 카프로산 중간체를 생산하고, 이들 중간체는 이후에 부탄올 및 헥산올로 화학적으로 전환된다. 그러나, 이 방법은 고비용 원료 탄수화물을 사용하고, 2개의 추가 공정 단계인 에스테르의 형성 및 에스테르의 화학적 수소화를 가져, 방법을 보다 길게 만들 뿐만 아니라 도중에 유용한 물질의 손실을 유발한다.

문헌 [Perez, J.M., 2012]은 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii)를 사용하여 합성가스의 존재 하에 단쇄 카르복실산을 그의 상응하는 알콜로 전환시키는 방법을 개시한다. 그러나, 단쇄 카르복실산이 상응하는 고급 알콜로의 전환을 위한 기질로서 첨가되어야 한다.

따라서 현재 이용가능한 고급 알콜 생산 방법은 가스상 기질의 발효 브로쓰 내로의 대량 전달에 있어서의 제한, 보다 낮은 생산성 및 보다 낮은 농도의 최종 산물을 가지므로, 산물 정제를 위한 보다 높은 에너지 비용을 유발한다.

따라서, 또한 환경에 대해 보다 적은 손상을 야기하는 생명공학적 수단을 통해 부탄올 및 다른 고급 알콜을 생산하기 위한 출발 물질로서, 순수하게 석유 기재 또는 옥수수 기재인 공급원 이외에 보다 지속가능한 원료를 찾는 것이 바람직하다. 특히, 지속가능한 원료로부터의 부탄올 및 다른 고급 알콜의 간단하고 효율적인 원-포트 생명공학적 생산에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 지수/대수 성장기의 아세트산생성 세포를 탄소원 및 산소를 포함하는 수성 배지에 도입하여 에탄올 및 고급 알콜을 호기성 조건에서 생산하는 수단을 제공함으로써 상기 언급된 문제를 해결한다. 지수/대수 성장기의 이들 아세트산생성 세포의 농도는 수성 배지에 산소가 일정하게 존재한다는 전제 하에 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 유지될 수 있다. 산소는 적어도 5ppm의 농도로 수성 배지에 존재할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서,

- 지수 성장기의 제1 아세트산생성 미생물;

- 유리 산소; 및

- 지수기 후의 제2 아세트산생성 미생물

을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 아세트산생성 미생물은 탄소원을 아세테이트 및/또는 에탄올로 전환시킬 수 있는 것인, 호기성 조건에서 탄소원으로부터 에탄올 및/또는 아세테이트를 생산하기 위한 반응 혼합물이 제공된다.

특히, 지수기 후의 제2 아세트산생성 미생물은 세포의 정지기에 있을 수 있다. 대수기의 아세트산생성 세포는 수성 배지 내의 임의의 다른 아세트산생성 세포가 산소의 존재 하에 아세테이트 및/또는 에탄올을 생산하도록 한다. 대수기의 아세트산생성 세포의 농도는 반응 혼합물에서 유지될 수 있다. 따라서, 반응의 임의의 시점에서, 반응 혼합물은 대수기의 아세트산생성 세포 및 또 다른 성장기, 예를 들어 정지기의 아세트산생성 세포를 포함한다.

통상의 기술자는 상이한 성장기의 미생물 및 그를 측정하고 확인하는 방법을 이해할 것이다. 특히, 회분식 배양 중 대부분의 미생물은 적어도 4개의 상이한 성장기에서 발견될 수 있으며; 즉 그것은 다음과 같다: 유도기 (A), 대수기 또는 지수기 (B), 정지기 (C) 및 사멸기 (D). 대수기는 초기 대수기 및 중기 내지 후기 대수/지수기로 추가로 분류될 수 있다. 정지기는 또한 초기 정지기 및 정지기로 추가로 구별될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cotter, J.L., 2009, Najafpour. G., 2006, Younesi, H., 2005, 및 Koepke, M., 2009]은 아세트산생성 박테리아의 상이한 성장기를 개시한다. 특히, 세포의 성장기는 적어도 문헌 [Shuler ML, 1992 및 Fuchs G., 2007]에 교시된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

유도기는 세포를 신선한 배지 내로 접종한 직후의 기이고, 집단은 일시적으로 변화하지 않은 채로 남아있다. 분명한 세포 분열 발생이 없더라도, 세포는 부피 또는 질량, 효소 합성, 단백질, RNA 등에 있어서 성장하며 대사 활성이 증가할 수 있다. 유도기의 길이는 접종물의 크기; 전달시의 물리적 손상 또는 쇼크로부터 회복하는데 필요한 시간; 필수 조효소 또는 분열 인자의 합성에 요구되는 시간; 및 배지에 존재하는 기질을 대사시키는데 필요한 새로운 (유도성) 효소의 합성에 요구되는 시간을 비롯한 매우 다양한 인자에 좌우될 수 있다.

지수 (대수) 성장기는 모든 세포가 2분열에 의해 정기적으로 분열하고 기하 진행에 의해 성장하는 균형잡힌 성장 패턴이다. 세포는 성장 배지의 조성 및 인큐베이션의 조건에 따라 일정한 속도로 분열한다. 박테리아 배양의 지수 성장의 속도는 또한 박테리아 집단의 배가 시간인 생성 시간으로 표현된다. 생성 시간 (G)은 생성당 시간 (t)으로 정의된다 (n = 생성 수). 따라서, 생성 시간의 계산을 유도하는 방정식은 G=t/n이다. 지수기는 (i) 초기 대수기 및 (ii) 중기 내지 후기 대수/지수기로 분류될 수 있다. 통상의 기술자는 언제 미생물, 특히 아세트산생성 박테리아가 대수기에 진입하는지를 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, 아세트산생성 박테리아가 대수기에 있는지의 여부를 결정하기 위해 그의 성장 속도를 계산하는 방법은 적어도 문헌 [Henstra A.M., 2007]에 교시된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 지수 성장기의 미생물은 초기 대수기 및 중기 내지 후기 대수/지수기의 세포를 포함할 수 있다.

정지기는, 지수 성장이 회분식 배양 (예를 들어 폐쇄 시스템, 예컨대 시험 튜브 또는 플라스크)에서 영원히 계속될 없으므로 지수 성장이 종료하는 기이다. 집단 성장은 다음 3개 인자 중 하나에 의해 제한된다: 1. 이용가능한 영양소의 소진; 2. 억제 대사물 또는 최종 산물의 축적; 3. 공간의 소진, 이 경우에는 "생물학적 공간"의 부족으로 불림. 정지기 동안, 생존 세포가 계수되는 경우에, 일부 세포가 사멸하고 동등한 수의 세포가 분열하는지의 여부 또는 세포 집단이 성장 및 분열을 단순히 멈추는 지의 여부는 결정될 수 없다. 정지기는 유도기와 같이 반드시 정지의 기간은 아니다. 2차 대사물, 예컨대 항생제를 생산하는 박테리아는 성장 주기의 정지기 동안 그렇게 한다 (2차 대사물은 성장의 활성 단계 후에 생산된 대사물로 정의된다).

사멸기가 정지기에 이어진다. 사멸기 동안, 생존 세포의 수는 본질적으로 대수기 동안 성장의 역으로 기하적으로 (지수적으로) 감소한다.

O₂가 본 발명의 임의의 측면에 따라 반응 혼합물에 존재하는 한 예에서, 제1 아세트산생성 박테리아는 지수 성장기에 있을 수 있고, 다른 아세트산생성 박테리아는 아세트산생성 미생물의 생활주기의 임의의 다른 성장기에 있을 수 있다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따르면, 반응 혼합물에서 아세트산생성 박테리아는 지수 성장기의 한 아세트산생성 박테리아 및 정지기의 또 다른 아세트산생성 박테리아를 포함할 수 있다. 산소의 존재 하에, 지수 성장의 아세트산생성 박테리아의 존재 없이, 정지기의 아세트산생성 박테리아는 아세테이트 및/또는 에탄올을 생산할 수 없다. 이 현상은 적어도 문헌 [Brioukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan, 2013] 등에 의해 확인된다. 따라서 본 발명자들은 놀랍게도, 지수 성장의 아세트산생성 박테리아의 존재 하에, 임의의 성장기의 아세트산생성 박테리아가 호기성 호흡하며, 반응 혼합물에 산소가 부재할 때 생산된 양 이상으로 아세테이트 및/또는 에탄올을 생산할 수 있다는 것을 발견하였다. 한 예에서, 지수 성장기의 아세트산생성 박테리아는 반응 혼합물로부터 유리 산소를 제거하여, 임의의 성장기의 아세트산생성 박테리아가 아세테이트 및/또는 에탄올을 생산하기 위해 탄소 기질을 대사시키기에 적합한 환경 (유리 산소 부재)을 제공할 수 있다.

또 다른 예에서, 수성 배지는 탄소원의 존재 하에 임의의 성장기, 특히 정지기의 아세트산생성 박테리아를 이미 포함할 수 있다. 이 예에서, 수성 배지에 공급된 탄소원에 또는 수성 배지 그 자체에 산소가 존재할 수 있다. 산소의 존재 하에, 아세트산생성 박테리아는 불활성이며, 지수 성장기의 아세트산생성 박테리아의 첨가 전에는 아세테이트 및/또는 에탄올을 생산할 수 없다. 바로 이 예에서, 지수 성장기의 아세트산생성 박테리아가 수성 배지에 첨가될 수 있다. 수성 배지에서 이미 발견된 불활성 아세트산생성 박테리아는 이어서 활성화될 수 있으며, 아세테이트 및/또는 에탄올을 생산하기 시작할 수 있다.

추가의 예에서, 임의의 성장기의 아세트산생성 박테리아는 먼저 지수 성장기의 아세트산생성 박테리아와 혼합될 수 있고, 이어서 탄소원 및/또는 산소가 첨가될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 산소의 존재 하에 성장한 지수 성장기의 미생물은 산소의 존재 하에 성장하고 대사하기 위한 적응을 획득하는 미생물을 유발할 수 있다. 특히, 미생물은 미생물 주위의 환경으로부터 산소를 제거할 수 있다. 이러한 새롭게 획득된 적응은 지수 성장기의 아세트산생성 박테리아가 환경에서 산소를 제거하고 따라서 탄소원으로부터 아세테이트 및 에탄올을 생산하도록 한다. 특히, 새롭게 획득된 적응을 갖는 아세트산생성 박테리아는 박테리아가 탄소원을 아세테이트 및/또는 에탄올로 전환시키도록 한다.

한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 반응 혼합물에서의 아세트산생성 박테리아는 다음 세포의 조합을 포함할 수 있다: 대수기의 세포 및 정지기의 세포. 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에서 대수기의 아세트산생성 세포는 0.01 내지 2 h^-1, 0.01 내지 1 h^-1, 0.05 내지 1 h^-1, 0.05 내지 2 h^-1, 0.05 내지 0.5 h^-1 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 속도를 포함할 수 있다. 한 예에서, 반응 혼합물에서의 대수기 아세트산생성 세포의 세포의 OD₆₀₀은 0.001 내지 2, 0.01 내지 2, 0.1 내지 1, 0.1 내지 0.5 등으로 이루어진 범위로부터 선택될 수 있다. 통상의 기술자는 OD₆₀₀을 측정하고, 반응 혼합물에서의 세포 및/또는 반응 혼합물에 첨가될 세포의 성장 속도를 결정하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있을 것이다. 예를 들어, [Koch (1994)]가 사용될 수 있다. 특히, 박테리아 성장은 상이한 방법을 사용하여 결정 및 모니터링될 수 있다. 가장 통상적인 것 중 하나는 현탁액 중 박테리아의 광학 밀도 (OD)에 의존하며 분광광도계를 사용하는 탁도 측정이다. OD는 UV 분광계를 사용하여 600 nm에서 측정될 수 있다.

반응 혼합물에서 제1 및 제2 아세트산생성 박테리아의 농도를 유지하기 위해, 통상의 기술자는 OD₆₀₀, pH, 산소의 농도 및 형성된 에탄올 및/또는 고급 알콜의 농도를 측정하기 위해 고정된 시점에서 샘플을 추출할 수 있다. 이어서, 통상의 기술자는 반응 혼합물에서 제1 및 제2 아세트산생성 박테리아의 농도를 유지하기 위해 및 에탄올 및/또는 아세테이트의 생산을 위한 최적 환경이 유지되도록 보장하기 위해 필요한 성분(들)을 첨가할 수 있을 것이다.

본원에 사용된 용어 "아세트산생성 박테리아"는 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로를 수행할 수 있고 따라서 CO, CO₂ 및/또는 수소를 아세테이트로 전환시킬 수 있는 미생물을 지칭한다. 이들 미생물은, 야생형 형태에서는 우드-륭달 경로를 갖지 않지만 유전자 변형의 결과 이 형질을 획득하는 미생물을 포함한다. 이러한 미생물은 이. 콜라이(E. coli) 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 미생물은 또한 일산화탄소영양 박테리아로 공지되어 있을 수 있다. 현재, 21개의 상이한 아세트산생성 박테리아 속이 관련 기술분야에 공지되어 있고 (Drake et al., 2006), 이들은 또한 일부 클로스트리디아(clostridia)를 포함할 수 있다 (Drake & Kusel, 2005). 이들 박테리아는 탄소원으로서의 이산화탄소 또는 일산화탄소를 에너지원으로서의 수소와 함께 사용할 수 있다 (Wood, 1991). 추가로, 알콜, 알데히드, 카르복실산 뿐만 아니라 다수의 헥소스가 또한 탄소원으로서 사용될 수 있다 (Drake et al., 2004). 아세테이트의 형성으로 이어지는 환원성 경로는 아세틸-CoA 또는 우드-륭달 경로로 지칭된다.

특히, 아세트산생성 박테리아는 아세토아나에로비움 노테라(Acetoanaerobium notera) (ATCC 35199), 아세토네마 롱굼(Acetonema longum) (DSM 6540), 아세토박테리움 카르비놀리쿰(Acetobacterium carbinolicum) (DSM 2925), 아세토박테리움 말리쿰(Acetobacterium malicum) (DSM 4132), 아세토박테리움 종 번호 446 (Morinaga et al., 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194), 아세토박테리움 위에링가에(Acetobacterium wieringae) (DSM 1911), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii) (DSM 1030), 알칼리바쿨룸 바키(Alkalibaculum bacchi) (DSM 22112), 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304), 블라우티아 프로둑타(Blautia producta) (DSM 2950, 이전에 루미노코쿠스 프로둑투스(Ruminococcus productus), 이전에 펩토스트렙토코쿠스 프로둑투스(Peptostreptococcus productus)), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum) (DSM 1496), 클로스트리디움 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061, DSM 19630 및 DSM 23693), 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans) (DSM 15243), 클로스트리디움 코스카티이(Clostridium coskatii) (ATCC 번호 PTA-10522), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei) (ATCC BA-623), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum) (DSM 92), 클로스트리디움 글리콜리쿰(Clostridium glycolicum) (DSM 1288), 클로스트리디움 륭달리이 (DSM 13528), 클로스트리디움 륭달리이 C-01 (ATCC 55988), 클로스트리디움 륭달리이 ERI-2 (ATCC 55380), 클로스트리디움 륭달리이 O-52 (ATCC 55989), 클로스트리디움 마이옴베이(Clostridium mayombei) (DSM 6539), 클로스트리디움 메톡시벤조보란스(Clostridium methoxybenzovorans) (DSM 12182), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei) (DSM 15248), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes) (DSM 757), 클로스트리디움 종 ATCC 29797 (Schmidt et al., 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73), 데술포토마쿨룸 쿠즈네초비이(Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115), 데술포토마쿨룸 써모베조이쿰 아종 써모신트로피쿰(Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum) (DSM 14055), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) (DSM 20543), 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans) C2A (DSM 2834), 무렐라 종(Moorella sp.) HUC22-1 (Sakai et al., 2004, Biotechnol. Let., Vol. 29, p. 1607-1612), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica) (DSM 521, 이전에 클로스트리디움 써모아세티쿰(Clostridium thermoaceticum)), 무렐라 써모아우토트로피카(Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974), 옥소박터 펜니기이(Oxobacter pfennigii) (DSM 322), 스포로무사 아에리보란스(Sporomusa aerivorans) (DSM 13326), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata) (DSM 2662), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica) (DSM 10669), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875), 스포로무사 테르미티다(Sporomusa termitida) (DSM 4440) 및 써모안아에로박터 키부이(Thermoanaerobacter kivui) (DSM 2030, 이전에 아세토게니움 키부이(Acetogenium kivui))로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 특히, 클로스트리디움 카르복시디보란스의 균주 ATCC BAA-624가 사용될 수 있다. 보다 더 특히, 예를 들어 U.S. 2007/0275447 및 U.S. 2008/0057554에 기재된 바와 같이 클로스트리디움 카르복시디보란스의 "P7" 및 "P11" 표지된 박테리아 균주가 사용될 수 있다.

또 다른 특히 적합한 박테리아는 클로스트리디움 륭달리이일 수 있다. 특히, 클로스트리디움 륭달리이 PETC, 클로스트리디움 륭달리이 ERI2, 클로스트리디움 륭달리이 COL 및 클로스트리디움 륭달리이 O-52로 이루어진 군으로부터 선택된 균주는 합성 가스의 헥산산으로의 전환에 사용될 수 있다. 이들 균주는, 예를 들어 WO 98/00558, WO 00/68407, ATCC 49587, ATCC 55988 및 ATCC 55989에 기재되어 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용된 제1 및 제2 아세트산생성 박테리아는 동일 또는 상이한 박테리아일 수 있다. 예를 들어, 한 반응 혼합물에서 제1 아세트산생성 박테리아는 대수기의 클로스트리디움 륭달리이일 수 있고, 제2 아세트산생성 박테리아는 정지기의 클로스트리디움 륭달리이일 수 있다. 또 다른 예에서, 반응 혼합물에서 제1 아세트산생성 박테리아는 대수기의 클로스트리디움 륭달리이일 수 있고, 제2 아세트산생성 박테리아는 정지기의 클로스트리디움 카르복시디보란스일 수 있다. 또 다른 예에서, 제1 유기체를 위해 선택된 아세트산생성 박테리아는 클로스트리디움 아우토에타노게눔일 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 반응 혼합물에서, 산소가 존재할 수 있다. 합성 가스를 비롯한 대부분의 폐가스가 소량 또는 대량의 산소를 포함하므로 반응 혼합물에 및/또는 반응 혼합물에 공급되는 가스 유동에 O₂를 혼입시키는 것이 유리하다. 고급 알콜의 생산을 위한 탄소원으로서 합성 가스를 사용하기 전에 이 산소를 제거하는 것은 어렵고 비용이 든다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 탄소원으로부터 임의의 미량의 산소를 먼저 제거할 필요 없이 적어도 1종의 고급 알콜의 생산을 가능하게 한다. 이것은 시간 및 돈이 절약되도록 한다.

보다 특히, 가스 유동 중 O₂ 농도는 가스 유동 중 가스의 총량의 1 부피% 미만으로 존재할 수 있다. 특히, 산소는 0.000005 내지 2 부피%의 농도 범위, 0.00005 내지 2 부피%, 0.0005 내지 2 부피%, 0.005 내지 2 부피%, 0.05 내지 2 부피%, 0.00005 내지 1.5 부피%, 0.0005 내지 1.5 부피%, 0.005 내지 1.5 부피%, 0.05 내지 1.5 부피%, 0.5 내지 1.5 부피%, 0.00005 내지 1 부피%, 0.0005 내지 1 부피%, 0.005 내지 1 부피%, 0.05 내지 1 부피%, 0.5 내지 1 부피%, 0.55 내지 1 부피%, 0.60 내지 1 부피%의 범위, 특히 0.60 내지 1.5 부피%, 0.65 내지 1 부피%, 및 0.70 내지 1 부피%의 범위로 존재할 수 있다. 특히, 아세트산생성 미생물은 가스 상/유동 중 O₂의 비율이 가스 유동 중 가스의 부피에 관하여 약 0.00005, 0.0005, 0.005, 0.05, 0.15, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2 부피%인 경우에 특히 적합하다. 통상의 기술자는 가스 유동 중 산소의 부피 농도를 측정하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 한 방법을 사용할 수 있을 것이다. 특히, 산소의 부피는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 한 예에서, 산소의 가스 상 농도는 프리센스 프리시전 센싱 게엠베하(PreSens Precision Sensing GmbH)로부터의 미량 산소 침지 프로브에 의해 측정될 수 있다. 산소 농도는 형광 켄칭에 의해 측정될 수 있으며, 여기서 켄칭의 정도는 가스 상에서 산소의 분압과 상관관계가 있다. 보다 더 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 제1 및 제2 미생물은 산소가 반응 혼합물에 공급된 가스 유동 중 가스의 총 부피의 1 부피% 미만, 약 0.015 부피%의 산소 농도를 갖는 가스 유동에 의해 공급되는 경우에 수성 배지에서 최적으로 작용할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 탄소원이 반응 혼합물에서 에탄올 및/또는 아세테이트로 전환되는 호기성 조건은 반응 혼합물 주위의 가스를 지칭한다. 가스는 총 가스의 적어도 1 부피%의 산소 및 CO, CO₂ 등과 같은 탄소원을 비롯한 다른 가스를 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 수성 배지는 산소를 포함할 수 있다. 산소는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 배지 중에 용해될 수 있다. 특히, 산소는 세포의 부재 하에 0.5mg/L로 존재할 수 있다. 특히, 수성 배지 중 유리 산소의 용존 농도는 적어도 0.01mg/L일 수 있다. 또 다른 예에서, 용존 산소는 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/L일 수 있다. 특히, 용존 산소 농도는 0.01-0.5mg/L, 0.01-0.4mg/L, 0.01-0.3mg/L, 0.01-0.1mg/L일 수 있다. 특히, 산소는 연속 가스 유동 중에서 수성 배지로 제공될 수 있다. 보다 특히, 수성 배지는 산소 및 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 탄소원을 포함할 수 있다. 보다 특히, 산소 및 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 탄소원은 연속 가스 유동 중에서 수성 배지로 제공된다. 보다 더 특히, 연속 가스 유동은 합성 가스 및 산소를 포함한다. 한 예에서, 두 가스는 동일한 유동/스트림의 일부이다. 또 다른 예에서, 각 가스는 수성 배지로 제공된 별개의 유동/스트림이다. 이들 가스는, 예를 들어 수성 배지 내로 개방되는 별개의 노즐, 프릿, 수성 배지 내로 가스를 공급하는 파이프 내의 막 등을 사용하여 나뉘어질 수 있다. 산소는 유리 산소일 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따르면, '유리 산소를 포함하는 반응 혼합물'은 원소 산소를 O₂ 형태로 포함하는 반응 혼합물을 지칭한다. O₂는 반응 혼합물에서 용존 산소일 수 있다. 특히, 용존 산소는 ≥5ppm (0.000005% vol; 5x10^-6)의 농도일 수 있다. 통상의 기술자는 용존 산소의 농도를 측정하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 한 예에서, 용존 산소는 산소 침지 프로브 (독일 레겐스부르크 소재의 프리센스 프리시전 센싱 게엠베하로부터의 타입(Type) PSt6)에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 반응 혼합물은

- 에탄올 카르복실레이트 발효 경로를 수행하고 아세테이트 및/또는 에탄올을 전환시켜 산을 형성할 수 있는 제3 미생물

을 추가로 포함하며, 제1 및/또는 제2 아세트산생성 미생물은 상기 산을 상응하는 고급 알콜로 전환시킬 수 있다.

한 예에서, 아세트산생성 박테리아는 에탄올-카르복실레이트 발효 경로를 수행할 수 있는 제2 미생물과 함께 사용될 수 있다. 한 예에서, 제1 및 제2 아세트산생성 박테리아 둘 다 및 에탄올-카르복실레이트 발효 경로를 수행할 수 있는 제3 미생물을 사용하여 탄소원으로부터 고급 산을 생산할 수 있다. 산은 이어서 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 옥탄올, 노난올, 데칸올 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 상응하는 고급 알콜로 전환될 수 있다. 한 예에서 고급 알콜은 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 이소부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-헥산올, 1-옥탄올, 1-펜탄올, 1-헵탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 5-메틸-1-헵탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 5-메틸-1-헥산올, 6-메틸-1-헵탄올 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

한 예에서, 에탄올 및/또는 아세테이트는 에탄올-카르복실레이트 발효 경로를 수행할 수 있는 제3 미생물의 존재 하에 상응하는 고급 산으로 전환될 수 있다. 에탄올-카르복실레이트 발효 경로는 적어도 문헌 [Seedorf, H., et al., 2008]에 상세하게 기재되어 있다. 특히, 제3 유기체는 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri), 씨. 카르복시디보란스(C. Carboxidivorans) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 제3 미생물은, 야생형 형태에서는 에탄올-카르복실레이트 발효 경로를 갖지 않지만 유전자 변형의 결과 이 형질을 획득하는 미생물을 포함한다. 특히, 제3 미생물은 클로스트리디움 클루이베리일 수 있다.

또 다른 예에서, 제3 미생물은 E₁ 내지 E₁₁로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 효소를 발현하며, 여기서 E₁은 알콜 데히드로게나제 (adh)이고, E₂는 아세트알데히드 데히드로게나제 (ald)이고, E₃은 아세토아세틸-CoA 티올라제 (thl)이고, E₄는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제 (hbd)이고, E₅는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드라타제 (crt)이고, E₆은 부티릴-CoA 데히드로게나제 (bcd)이고, E₇은 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 (etf)이고, E₈은 조효소 A 트랜스퍼라제 (cat)이고, E₉는 아세테이트 키나제 (ack)이고, E₁₀은 포스포트랜스아세틸라제 (pta)이고, E₁₁은 트랜스히드로게나제인 야생형 유기체일 수 있다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 야생형 제3 미생물은 적어도 E₂,E₃ 및 E₄를 발현할 수 있다. 보다 더 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 야생형 제3 미생물은 적어도 E₄를 발현할 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 제3 미생물은 야생형 미생물에 비해 E₁ 내지 E₁₁로부터 선택된 적어도 1종의 효소의 증가된 발현을 가지며, 여기서 E₁은 알콜 데히드로게나제 (adh)이고, E₂는 아세트알데히드 데히드로게나제 (ald)이고, E₃은 아세토아세틸-CoA 티올라제 (thl)이고, E₄는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제 (hbd)이고, E₅는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드라타제 (crt)이고, E₆은 부티릴-CoA 데히드로게나제 (bcd)이고, E₇은 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 (etf)이고, E₈은 조효소 A 트랜스퍼라제 (cat)이고, E₉는 아세테이트 키나제 (ack)이고, E₁₀은 포스포트랜스아세틸라제 (pta)이고, E₁₁은 트랜스히드로게나제인 유전자 변형 유기체일 수 있다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형 제3 미생물은 적어도 효소 E₂, E₃ 및 E₄를 발현할 수 있다. 보다 더 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형 제3 미생물은 적어도 E₄를 발현할 수 있다. 효소 E₁ 내지 E₁₁은 클로스트리디움 클루이베리로부터 단리될 수 있다. 통상의 기술자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 이들 효소 각각의 활성을 측정할 수 있다. 특히, 효소 E₁ 및 E₂의 활성은 적어도 문헌 [Hillmer P., 1972, Lurz R., 1979]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; 효소 E₂의 활성은 또한 문헌 [Smith L.T., 1980]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; 효소 E₃ 및 E₄의 활성은 적어도 문헌 [Sliwkowski M.X., 1984]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; E₄의 활성은 또한 문헌 [Madan, V.K., 1972]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; E₅의 활성은 또한 문헌 [Bartsch, R.G., 1961]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; 효소 E₆ 및 E₇의 활성은 문헌 [Li, F., 2008]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; E₇의 활성은 또한 문헌 [Chowdhury, 2013]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; E₈의 활성은 문헌 [Stadman, 1953]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; E₉의 활성은 문헌 [Winzer, K., 1997]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; E₁₀의 활성은 문헌 [Smith L.T., 1976]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있고; E₁₁의 활성은 문헌 [Wang S, 2010]에 교시된 검정을 사용하여 측정될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 제1, 제2 및/또는 제3 미생물은 유전자 변형 미생물일 수 있다. 유전자 변형 세포 또는 미생물은 야생형 세포 또는 미생물과 유전적으로 상이할 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형 미생물과 야생형 미생물 사이의 유전적 차이는 야생형 미생물에는 부재할 수 있는 유전자 변형 미생물 내의 완전한 유전자, 아미노산, 뉴클레오티드 등의 존재일 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형 미생물은 미생물이 적어도 1종의 카르복실산을 생산하는 것을 가능하게 하는 효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형 미생물에 비해 야생형 미생물은 유전자 변형 미생물이 적어도 1종의 카르복실산을 생산하는 것을 가능하게 하는 효소가 없거나 그의 검출가능한 활성이 없는 것일 수 있다. 본원에 사용된 용어 '유전자 변형 미생물'은 용어 '유전자 변형 세포'와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형은 미생물 세포에 대해 수행될 수 있다.

세포 또는 미생물과 함께 본원에 사용된 어구 "야생형"은 야생에서 자연적으로 보이는 것과 같은 형태인 게놈 구성을 갖는 세포를 나타낼 수 있다. 상기 용어는 전체 세포 및 개별 유전자 둘 다에 적용가능할 수 있다. 따라서, 용어 "야생형"은 유전자 서열이 인간에 의해 재조합 방법을 사용하여 적어도 부분적으로 변경되어 있는 상기 세포 또는 상기 유전자는 포함하지 않는다.

통상의 기술자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 세포 또는 미생물을 유전자 변형시킬 수 있을 것이다. 본 발명의 임의의 측면에 따르면, 유전자 변형 세포는 정의된 시간 간격인 2시간 이내, 특히 8시간 또는 24시간 이내에 그것이 야생형 세포보다 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 1000배 또는 적어도 10000배 더 많은 카르복실산 및/또는 각각의 카르복실산 에스테르를 형성하도록 유전자 변형될 수 있다. 산물 형성의 증가는, 예를 들어 적합한 영양 배지에서 특정된 시간 간격 동안 동일한 조건 (동일한 세포 밀도, 동일한 영양 배지, 동일한 배양 조건) 하에 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포 및 야생형 세포를 각각 별개로 배양한 다음, 영양 배지에서의 표적 산물 (카르복실산)의 양을 결정하는 것에 의해 결정될 수 있다.

또 다른 예에서, 산은 문헌 [Steinbusch, 2011, Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen, M. C. A. A, 2013, Ding H. et al., 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B. T., et al., 1948] 등에 개시된 임의의 방법에 의해 탄소원으로부터 생산될 수 있다. 보다 더 특히, 산은 적어도 클로스트리디움 클루이베리의 존재 하에 탄소원으로부터 생산될 수 있다.

보다 더 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따르면, 산은 두 상이한 성장기의 적어도 1종의 아세트산생성 미생물 및 클로스트리디움 클루이베리의 존재 하에 생산된다. 한 예에서, 아세트산생성 미생물은 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이일 수 있다. 새롭게 형성된 산은 알콜의 존재 하에 상응하는 고급 알콜로 전환될 수 있다. 클로스트리디움 클루이베리 및 씨. 카르복시디보란스로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 미생물은 아세테이트 및/또는 에탄올을 전환시켜 새롭게 형성된 산을 형성할 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 합성 가스를 비롯한 대부분의 폐가스가 소량 또는 다량의 산소를 포함하기 때문에 상기 공정을 O₂의 존재 하에 수행하는 것 (즉, O₂를 반응 혼합물에 포함시키는 것)이 유리하다. 이 반응 혼합물은 먼저 산소를 추출하는 추가의 고비용 단계를 거칠필요 없이 폐가스로부터 고급 알콜을 생산하는 방법을 가능하게 한다.

반응 혼합물은 균질 혼합물에 2종/3종 미생물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 '균질 혼합물'은 배지에 공간적으로 균일하게 분포된 미생물의 혼합물을 지칭한다. 특히, 혼합물은 수성 배지에 고르게 분포된 상이한 성장기의 2종의 아세트산생성 미생물인 적어도 2종의 미생물을 포함할 수 있다. 한 예에서, 혼합물에 대략 동일한 수의 2종의 미생물이 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 혼합물에 대수기의 아세트산생성 미생물과 비교하여 정지기의 아세트산생성 미생물이 보다 많이 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 정지기 혼합물 중 아세트산생성 미생물과 비교하여 대수기의 아세트산생성 미생물이 보다 많이 존재할 수 있다. 모든 가능한 예에서, 미생물은 단일 균질 혼합물에 존재하며 여기서 미생물은 혼합물 전반에 걸쳐 균일하게 분포된다. 본원에 사용된 '수성 배지'는 용어 '반응 혼합물'과 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "아세테이트"는 아세트산 및 필연적으로 생성되는 그의 염 둘 다를 지칭하며, 이는 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이 미생물이 수성 환경에서 작용하고 존재하는 산과 염 사이에 항상 균형을 이루기 때문이다.

용어 "제2 미생물" 또는 "제3 미생물"은 본 발명의 임의의 측면에 따른 "제1 미생물"과 상이한 미생물을 지칭한다.

한 예에서, 제1 및 제2 미생물은 제1 발효기에 존재할 수 있고, 제3 미생물은 제2 발효기에 존재할 수 있다. 발효기 1에서, 제1 및 제2 미생물은 탄소원과 접촉하여 아세테이트 및/또는 에탄올을 생산한다. 이어서, 에탄올 및/또는 아세테이트는 발효기 2에서 제3 미생물과 접촉하여 적어도 1종의 산을 생산할 수 있다. 이어서, 산은 발효기 1 내로 다시 공급되어 적어도 1종의 알콜을 생산할 수 있다. 발효기 1에서 생산된 아세테이트 및/또는 에탄올이 발효기 2 내로 정기적으로 공급될 수 있는 사이클이 생성될 수 있으며, 발효기 2에서 아세테이트 및/또는 에탄올은 적어도 1종의 산으로 전환될 수 있고, 발효기 2에서 산은 발효기 1 내로 다시 공급될 수 있다.

유사하게, 발효기 1에서 제1 및 제2 미생물은 CO를 포함하는 탄소원과 접촉하여 아세테이트 및/또는 에탄올을 생산할 수 있다. 이어서, 에탄올 및/또는 아세테이트는 발효기 2에서 제3 미생물과 접촉하여 적어도 1종의 산을 생산할 수 있다. 이어서, 산이 임의로 추출되고 발효기 1 내로 다시 공급되어 산을 목적하는 고급 알콜로 전환시킬 수 있다. 발효기 1에서 생산된 아세테이트 및/또는 에탄올이 발효기 2 내로 정기적으로 공급될 수 있는 사이클이 생성될 수 있으며, 발효기 2에서 아세테이트 및/또는 에탄올은 적어도 1종의 산으로 전환될 수 있고, 발효기 2에서 산은 발효기 1 내로 다시 공급될 수 있다. 발효기 1 내로 공급된 CO는 아세테이트 및/또는 에탄올과 함께 발효기 2 내로 전달될 수 있다. 놀랍게도 제3 미생물이 CO의 존재 하에 아세테이트 및/또는 에탄올을 적어도 1종의 산으로 전환시킨다는 것이 밝혀짐에 따라 특별한 추출 방법은 필요하지 않을 수 있다.

또 다른 예에서, 배지는 발효기 1과 2 사이에 재사용되고 있다. 따라서, 발효기 1에서 생산된 에탄올 및/또는 아세테이트는 발효기 2 내로 공급될 수 있고, 발효기 2에서 생산된 산은 발효기 1 내로 다시 공급될 수 있다. 배지를 재사용하는 공정에서, 발효기 1로부터의 CO는 발효기 2 내로 도입될 수 있다. 또한, 발효기 2에서 생산된 산은 결과적으로 발효기 1 내로 재도입될 수 있다. 발효기 2에서의 제3 미생물은 발효기 1로부터 발효기 2 내로 재사용된 CO의 존재 하에 아세테이트 및 에탄올로부터 산을 계속 생산할 수 있다. 이어서, 발효기 1 및 2에 누적된 알콜은 관련 기술분야에 공지된 수단에 의해 추출될 수 있다.

추가의 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 방법을 수행하기 위해 3개의 용기가 존재할 수 있다. 제1 및 제2 미생물은 제1 발효기에 존재할 수 있고, 제3 미생물은 제2 발효기 및 제1 및 제2 미생물을 갖는 제3 발효기에 존재할 수 있다. 발효기 1에서, 제1 및 제2 미생물은 탄소원과 접촉하여 아세테이트 및/또는 에탄올을 생산한다. 이어서, 에탄올 및/또는 아세테이트는 발효기 2에서 제3 미생물과 접촉하여 적어도 1종의 산을 생산할 수 있다. 이어서, 산은 발효기 3 내로 공급되어 적어도 1종의 알콜을 생산할 수 있다.

탄소원으로부터의 산 및/또는 고급 알콜의 생산에 있어서 박테리아의 조합이 사용될 수 있다. 1종 이상의 제3 미생물과 조합되어 1종 초과의 아세트산생성 박테리아가 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 1종 초과 유형의 아세트산생성 박테리아 및 단지 1종 유형의 제3 미생물이 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 단지 1종의 아세트산생성 박테리아와 조합되어 1종 초과의 제3 미생물이 존재할 수 있다.

본원에 사용된 용어 '약'은 20 퍼센트 내의 변화를 지칭한다. 특히, 본원에 사용된 용어 "약"은 소정의 측정치 또는 값의 +/- 20%, 보다 특히 +/-10%, 보다 더 특히 +/- 5%를 지칭한다.

모든 백분율 (%)은 달리 명시되지 않는 한 부피 퍼센트이다.

본 발명의 임의의 측면에 따라 사용된 탄소원은 이산화탄소 및/또는 일산화탄소를 포함한다. 통상의 기술자는 탄소원으로서의 CO 및/또는 CO₂의 제공을 위한 많은 가능한 공급원이 존재할 것으로 이해할 것이다. 실제로, 아세테이트 및/또는 에탄올이 CO 및/또는 CO₂의 공급원으로부터 형성될 수 있도록, 본 발명의 임의의 측면에 따른 탄소원으로서 충분한 양의 탄소를 미생물에 공급할 수 있는 임의의 가스 또는 임의의 가스 혼합물이 사용될 수 있는 것으로 관찰될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 혼합 배양을 위해 탄소원은 적어도 50 부피%, 적어도 70 부피%, 특히 적어도 90 부피%의 CO 및/또는 CO₂를 포함하며, 여기서 부피에 의한 백분율 - %는 혼합 배양에서 제1 미생물에 이용가능한 모든 탄소원에 관한 것이다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 혼합 배양에서, 탄소 물질 공급원이 제공될 수 있다. 가스 형태의 탄소원의 예는 효모 발효 또는 클로스트리디움 발효에 의해 생산된 배기 가스, 예컨대 합성 가스, 연도 가스 및 석유 정유 가스를 포함한다. 이들 배기 가스는 셀룰로스-함유 물질의 가스화 또는 석탄 가스화로부터 형성된다. 한 예에서, 이들 배기 가스는 반드시 다른 과정의 부산물로서 생산되는 것은 아닐 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 임의의 측면에 따른 혼합 배양에 사용하기 위해 생산될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 탄소원은 합성 가스일 수 있다. 합성 가스는, 예를 들어 석탄 가스화의 부산물로서 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 혼합 배양의 미생물은 폐기물인 물질을 귀중한 자원으로 전환시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 합성 가스는 적어도 1종의 에탄올 및/또는 고급 알콜을 생산하기 위해 본 발명의 혼합 배양에 사용하기 위한 폭넓게 이용가능한 저비용 농업 원료의 가스화의 부산물일 수 있다.

거의 모든 형태의 식물이 이 목적에 사용될 수 있기 때문에, 합성 가스로 전환될 수 있는 원료의 수많은 예들이 존재한다. 특히, 원료는 다년생 목초, 예컨대 억새, 옥수수 잔류물, 처리 폐기물, 예컨대 톱밥 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일반적으로, 합성 가스는 주로 열분해, 부분 산화 및 증기 개질을 통해 건조된 바이오매스의 가스화 장치에서 획득될 수 있으며, 여기서 합성 가스의 주요 산물은 CO, H₂ 및 CO₂이다. 합성가스는 또한 CO₂의 전기분해의 산물일 수 있다. 통상의 기술자는 목적하는 양의 CO를 포함하는 합성가스를 생산하기 위해 CO₂의 전기분해를 수행하는 적합한 조건을 이해할 것이다.

통상적으로, 가스화 과정으로부터 획득된 합성 가스의 일부는 산물 수율을 최적화하고 타르의 형성을 피하기 위해 먼저 처리된다. 합성 가스 중 원치않는 타르 및 CO의 크래킹은 석회 및/또는 돌로마이트를 사용하여 수행될 수 있다. 이들 공정은, 예를 들어 문헌 [Reed, 1981]에 상세하게 기재되어 있다.

공급원의 혼합물은 탄소원으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 환원제, 예를 들어 수소가 탄소원과 함께 공급될 수 있다. 특히, 이 수소는 C 및/또는 CO₂가 공급되고/거나 사용되는 경우에 공급될 수 있다. 한 예에서, 수소 가스는 본 발명의 임의의 측면에 따라 존재하는 합성 가스의 일부이다. 또 다른 예에서, 합성 가스 중 수소 가스가 본 발명의 방법에 불충분한 경우에, 추가의 수소 가스가 공급될 수 있다.

통상의 기술자는 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법을 수행하는데 필요한 다른 조건을 이해할 것이다. 특히, 용기 (예를 들어 발효기) 내의 조건은 사용된 제1 및 제2 미생물에 따라 달라질 수 있다. 미생물의 최적 기능에 적합하도록 조건을 변화시키는 것은 통상의 기술자의 지식 내에 있다.

한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 pH 5 내지 8, 5.5 내지 7을 갖는 수성 배지에서 수행될 수 있다. 압력은 1 내지 10 bar일 수 있다.

본 발명의 이점은 원료의 보다 더 바람직한 CO₂/CO 혼합물이 사용될 수 있다는 것일 수 있다. 이들 다양한 공급원은 천연 가스, 바이오가스, 석탄, 오일, 식물 잔류물 등을 포함한다. 방법의 또 다른 이점은 높은 탄소 수율일 수 있다. 이것은 형성된 CO₂의 회수에 의해 가능해진다. 즉, CO₂는 제1 단계에서 반응하여 아세트산으로 돌아갈 수 있다. 또 다른 이점은 사용된 발효 조건과 관련된 보다 큰 유연성에 있는데, 이는 임의의 아세트산생성 미생물 및 에탄올-카르복실레이트 발효 경로를 수행할 수 있는 임의의 미생물이 고급 알콜의 실제 생산과 조합되어 사용될 수 있기 때문이다. 본 발명의 또 다른 이점은, 제3 미생물이 CO의 존재 하에 기능하고/거나 아세테이트 및/또는 에탄올로부터 산을 생산할 수 있기 때문에, 제1, 제2 및 제3 미생물 모두가 CO를 포함하는 탄소원으로부터 고급 알콜의 생산을 위해 균질 혼합물에 존재할 수 있다는 것일 수 있다. 제3 미생물의 이러한 특징은 CO와 같은 탄소원으로부터 고급 알콜의 생산이 1 단계 공정이 되도록 하여 공정을 보다 효율적이게 만들고 수율을 보다 크게 만든다. 놀랍게도, 제3 미생물의 이러한 이점 때문에, 고급 알콜을 만들기 위한 1 단계 절차는 중간체 분리 단계 없이 단일 발효기에서 수행될 수 있다. 또한, 이 1 단계 절차를 사용하여 최종 산물의 농도가 증가될 수 있다. 이것은 히드로게나제가 CO의 존재 하에 억제되었다는 것을 둘 다 교시하는 문헌 [Baffert C., 2011 및 Thauer, R.K., 1973]에서 놀라운 일이다. 이러한 이유 등으로, WO2013/167663은 (a) 아세트산생성 유기체의 존재 하에 CO 및/또는 CO₂로부터 아세테이트 및/또는 에탄올을 형성하는 단계 및 (b) 제2 미생물의 존재 하에 적어도 1개의 산소 원자를 포함하는 탄화수소 (예를 들어 헥산산)를 형성하는 단계 사이에 분리 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 CO로부터의 원 포트 합성에서 알콜, 특히 적어도 6개의 탄소 원자를 포함하는 알콜을 생산하는 능력은 놀라운 결과이다. 임의의 경우에서, 단계 (a) 및 (b)가 2개의 별개 단계로 (즉, 2개의 별개 용기에서) 수행되더라도, 제1 및 제3 미생물 둘 다가 기능하기 위해 모든 미량의 CO를 제거하기 위한 임의의 특정 추출 방법에 대한 필요성은 존재하지 않을 수 있다.

실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, CO의 존재는 탄소원이 적어도 CO를 포함하는 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에서 적어도 부탄올 및 헥산올이 생산되도록 한다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 탄소원은 CO를 포함한다. CO를 포함하는 탄소원은 적어도 제1 및 제2 아세트산생성 미생물 및 호기성 조건 하에서 에탄올-카르복실레이트 발효 경로를 수행할 수 있는 제3 미생물의 존재 하에 적어도 1종의 산으로 전환될 수 있다. 특히, 산은 4개 이상의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 보다 특히, 형성된 산은 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, 제1 및 제2 아세트산생성 박테리아의 존재 하에 CO를 포함하는 탄소원은 에탄올 및/또는 아세트산의 생산을 유발할 수 있다.

특히, CO는 연속 가스 유동 중에서 수성 배지에 제공될 수 있다. 가스 유동 중 CO 농도는 가스 유동 중 가스의 총량의 부피의 적어도 2 부피%로 존재할 수 있다. 특히, CO는 2 내지 99 부피%의 농도 범위, 2 내지 95 부피%, 5 내지 95 부피%, 10 내지 90 부피%, 15 내지 85 부피%의 범위, 특히 20 내지 80 부피%의 범위로 존재할 수 있다. 보다 특히, CO의 농도는 약 24 부피%일 수 있다. 탄소원 중 일산화탄소의 가스 상 농도는 열 전도율 검출기가 구비된 애질런트 테크놀로지스 인크.(Agilent Technologies Inc.)의 가스 크로마토그래프 GC 6890N을 적어도 사용하여 측정될 수 있다.

특히, 수성 배지는 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 탄소원을 포함할 수 있다. 보다 특히, CO 및/또는 CO₂를 포함하는 탄소원은 연속 가스 유동 중에서 수성 배지에 제공된다. 보다 더 특히, 연속 가스 유동은 합성 가스를 포함한다. 한 예에서, 가스는 동일한 유동/스트림의 일부이다. 또 다른 예에서, 각각의 가스는 수성 배지에 제공된 별개의 유동/스트림이다. 이들 가스는, 예를 들어 수성 배지 내로 개방되는 별개의 노즐, 프릿, 수성 배지 내로 가스를 공급하는 파이프 내의 막 등을 사용하여 나뉘어질 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 한 예에서, 탄소원은 합성 가스이고, 탄소원은 수성 배지 내로 공급되기 전에 산소 가스와 블렌딩될 수 있다. 이 블렌딩 단계는 반응에서 고급 알콜의 효율 및 생산을 개선시킬 수 있다. 본 발명의 방법의 전체 효율, 알콜 생산성 및/또는 전체 탄소 포획은 연속 가스 유동 중 CO₂, CO, H₂ 및 O₂의 화학량론에 좌우될 수 있다. 적용된 연속 가스 유동은 O₂, CO₂ 및 H₂ 조성일 수 있다. 특히, 연속 가스 유동 중, O₂의 농도 범위는 0.000005 부피% 내지 1 부피% 내일 수 있고, CO/CO₂는 약 10-50 부피%, 특히 33 부피%일 수 있고, H₂는 44 부피% 내지 84 부피%, 특히 64 내지 66.04 부피% 내일 수 있다. 보다 특히, 연속 가스 유동 중 가스의 농도는 O₂ 0.15 부피%, CO/CO₂ 32 부피% 및 H₂ 64 부피%일 수 있다. 또 다른 예에서, 연속 가스 유동은 또한 불활성 가스, 예컨대 N₂를 50 부피%의 N₂ 농도까지 포함할 수 있다.

통상의 기술자는 스트림의 조성 및 유속을 적절한 간격으로 모니터링하는 것이 필요할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 스트림의 조성의 제어는 목표하는 또는 바람직한 조성을 달성하기 위해 스트림 구성성분의 비율을 변화시켜 달성될 수 있다. 블렌딩된 스트림의 조성 및 유속은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 모니터링될 수 있다. 한 예에서, 시스템은 적어도 2개 스트림의 유속 및 조성을 연속적으로 모니터링하고, 이들을 합하여 최적 조성의 연속 가스 유동에서 단일 블렌딩된 기질 스트림을 생산하며 본 발명의 임의의 측면에 따른 혼합 배양에 최적화된 기질 스트림을 통과시키기 위한 수단을 생산하는데 적합화된다.

특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 반응 혼합물 (즉, 제1 미생물 - 대수기의 아세트산생성 유기체, 제2 미생물 - 정지기의 아세트산생성 유기체, 산소의 존재 하의 탄소원의 혼합물)은 본 발명의 임의의 측면을 수행하기 위해 임의의 공지된 생물반응기 또는 발효기에 사용될 수 있다. 반응 혼합물은 발효기에서 생산되는 고급 알콜을 생성하는 제3 미생물을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용된 '고급 알콜'은 4 내지 10개의 탄소 원자를 함유하고 다소 점성 또는 유성이며 진한 과일 냄새를 가질 수 있는 알콜을 지칭한다. 고급 알콜은 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 보다 특히, 고급 알콜은 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 이소부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-헥산올, 1-옥탄올, 1-펜탄올, 1-헵탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 5-메틸-1-헵탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 5-메틸-1-헥산올, 6-메틸-1-헵탄올 및 그의 조합으로 이루어진 군으부터 선택될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, '상응하는 고급 알콜'은 상응하는 고급 알콜을 형성시키는 산과 동일한 수의 탄소 원자를 갖는 알콜을 지칭한다. 예를 들어, 부탄산은 상응하는 알콜 - 부탄올로 전환될 수 있고; 헥산산은 상응하는 알콜 - 헥산올로 전환될 수 있고; 헵탄산은 상응하는 알콜 - 헵탄올로 전환될 수 있고; 옥탄산은 상응하는 알콜 - 옥탄올로 전환될 수 있고; 노난산은 상응하는 알콜 - 노난올로 전환될 수 있고; 데칸산은 상응하는 알콜 - 데칸올 등으로 전환될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 생산된 고급 알콜을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 기초로 상기 단계를 수행하는 수단을 알 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 호기성 조건에서 탄소원으로부터 에탄올 및/또는 아세테이트를 생산하는 방법은

(a) - 지수 성장기의 제1 아세트산생성 미생물;

- 유리 산소; 및

- 정지기의 제2 아세트산생성 미생물

을 포함하는 반응 혼합물을 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 아세트산생성 미생물은 탄소원을 아세테이트 및/또는 에탄올로 전환시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 호기성 조건에서 탄소원으로부터 적어도 1종의 고급 알콜을 생산하는 방법은

(a) 호기성 조건에서 본 발명의 임의의 측면에 따른 반응 혼합물을 탄소원과 접촉시키는 단계

를 포함한다.

도면의 간단한설명

도면 없음

실시예

상기는 바람직한 실시양태를 기재하며, 이는 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 청구범위의 범주를 벗어나지 않고도 설계, 구축 또는 작동에 있어서의 변화 또는 변형에 적용될 수 있다. 이들 변화는, 예를 들어 청구범위의 범주에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

실시예 1

산소의 부재 하에 합성 가스로부터 클로스트리디움 륭달리이를 사용한 아세테이트 및 에탄올의 생산

이 실시예에서, 아세테이트 및 에탄올을 생산하기 위해 씨. 륭달리이를 산소의 부재 하에 H₂ 및 CO₂로 이루어진 합성 가스를 갖는 복합 배지에서 혐기성 배양하였다. 씨. 륭달리이의 세포 배양을 위해 2 mL 동결배양물을 약 400 mg/L L-시스테인 히드로클로라이드 및 400 mg/L Na₂S x 9 H₂O를 갖는 200 ml의 배지 (ATCC1754 배지: pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L 효모 추출물, 0.8 g/L NaCl, 1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/L KCl, 0.1 g/L KH₂PO₄, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ x 2H₂O; 20 mg/L 니트릴로트리아세트산 10 mg/L MnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O; 0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 μg/L d-비오틴, 20 μg/L 폴산, 100 g/L 피리독신-HCl; 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O; 50 μg/L 리보플라빈; 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토테네이트; 1 μg/L 비타민 B12 ; 50 μg/L p-아미노벤조에이트; 50 μg/L 리포산, 대략 67.5 mg/L NaOH)에서 혐기성 배양하였다. 배양은 37℃, 150 rpm의 개방 수조 진탕기에서 67% H₂, 33% CO₂로 구성된 예비혼합 가스 혼합물을 갖는 방염 1 L 유리 병에서 161 h 동안 1-3 L/h의 훈증을 사용하여 화학무기독립영양으로 수행하였다. 배지 내로의 가스 진입은 반응기의 중간에 가스발생 튜브에 탑재된, 10 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 필터에 의해 수행하였다. 세포를 원심분리하고, 10 ml ATCC 배지로 세척하고, 다시 원심분리하였다.

전배양을 위해 씨. 륭달리이의 성장 배양으로부터의 다수 세척 세포를 약 400 mg/L L-시스테인 히드로클로라이드를 갖는 200 mL의 ATCC 배지 내로 옮기고, OD₆₀₀ 0.12로 성장시켰다. 배양은 37℃, 150 rpm의 개방 수조 진탕기에서 67% H₂, 33% CO₂로 구성된 예비혼합 가스 혼합물을 갖는 내압성 500ml 유리 병에서 65 h 동안 3 L/h의 통기를 사용하여 수행하였다. 배지 내로의 가스 진입은 반응기의 중간에 배치된, 10 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 필터에 의해 수행하였다. 세포를 원심분리하고, 10 ml의 생산 완충제 (pH 6.2; 0.5 g/L의 KOH, 67% H₂, 33% CO₂의 예비혼합 가스 혼합물을 사용하여 1 h 동안 1 L/hr로 통기됨)로 세척하고, 다시 세척 및 원심분리하였다.

생산 배양을 위해 씨. 륭달리이의 전배양으로부터의 다수의 세척 세포를 약 400 mg/L L-시스테인 히드로클로라이드를 갖는 200 mL의 ATCC 배지 내로 옮기고, OD₆₀₀ 0.2로 성장시켰다. 배양은 37℃, 150 rpm의 개방 수조 진탕기에서 67% H₂, 33% CO₂로 구성된 예비혼합 가스 혼합물을 갖는 내압성 500ml 유리 병에서 118 h 동안 3 L/h의 통기를 사용하여 수행하였다. 배지 내로의 가스 진입은 반응기의 중간에 배치된, 10 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 필터에 의해 수행하였다. pH가 5.0 미만으로 하락하였을 때, 140 g/l KOH 용액 1 ml를 첨가하였다. 샘플링 시에 각 5 ml 샘플을 OD₆₀₀, pH 및 산물 범위의 결정을 위해 취하였다. 산물 농도의 결정을 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트를 사용하였다 (T(M)SP).

118 h의 배양 주기에 걸쳐, 생산 배양 중 세포 밀도는 일정하게 유지되었고, 정체된 OD₆₀₀ 0.2로 인식가능하며, 성장 속도 μ = 0 hr^-1에 상응한다. 아세테이트의 농도는 4 mg/L에서 3194 mg/L로 및 에탄올의 농도는 17 mg/L에서 108 mg/L로 동시에 유의하게 증가하였다.

실시예 2

산소의 존재 하에 CO₂ 및 H₂를 포함하는 합성 가스로부터 클로스트리디움 륭달리이를 사용한 아세테이트 및 에탄올의 생산 부재

씨. 륭달리이를 합성 가스 및 산소를 갖는 복합 배지에서 배양하였다. 아세테이트 및 에탄올을 생산하기 위해 먼저 씨. 륭달리이를 산소의 부재 하에 H₂ 및 CO₂로 이루어진 합성 가스의 존재 하에 배양하였다. 배양을 위해, 세포를 부틸 고무 마개로 기밀 밀봉될 수 있는 내압성 유리 병에서 성장시켰다. 씨. 륭달리이 세포가 수반되는 모든 단계를 혐기성 조건 하에서 수행하였다.

씨. 륭달리이의 세포 배양을 위해 2 mL 동결배양물을 약 400 mg/L L-시스테인 히드로클로라이드 및 400 mg/L Na₂S x 9 H₂O를 갖는 200 ml의 배지 (ATCC1754 배지: pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L 효모 추출물, 0.8 g/L NaCl, 1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/L KCl, 0.1 g/L KH₂PO₄, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ x 2H₂O; 20 mg/L 니트릴로트리아세트산 10 mg/L MnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O; 0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 μg/L d-비오틴, 20 μg/L 폴산, 100 g/L 피리독신-HCl; 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O; 50 μg/L 리보플라빈; 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토테네이트; 1 μg/L 비타민 B12 ; 50 μg/L p-아미노벤조에이트; 50 μg/L 리포산, 대략 67.5 mg/L NaOH)에서 혐기성 배양하였다. 배양은 37℃, 150 rpm의 개방 수조 진탕기에서 67% H₂, 33% CO₂로 구성된 예비혼합 가스 혼합물을 갖는 방염 1 L 유리 병에서 161 h 동안 1-3 L/h의 훈증을 사용하여 화학무기독립영양으로 수행하였다. 배지 내로의 가스 진입은 반응기의 중간에 가스발생 튜브에 탑재된, 10 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 필터에 의해 수행하였다. 세포를 원심분리하고, 10 ml ATCC 배지로 세척하고, 다시 원심분리하였다.

전배양을 위해 씨. 륭달리이의 성장 배양으로부터의 다수 세척 세포를 약 400 mg/L L-시스테인 히드로클로라이드를 갖는 200 mL의 ATCC 배지 내로 옮기고, OD₆₀₀ 0.12로 성장시켰다. 배양은 37℃, 150 rpm의 개방 수조 진탕기에서 67% H₂, 33% CO₂로 구성된 예비혼합 가스 혼합물을 갖는 내압성 500ml 유리 병에서 24 h 동안 3 L/h의 통기를 사용하여 수행하였다. 이후, 가스 혼합물은 66.85% H₂, 33% CO₂ 및 0.15% O₂의 조성을 갖는 것으로 변화되었고, 세포를 67 h 동안 3 L/h로 추가로 가스발생시켰다. 배지 내로의 가스 진입은 반응기의 중간에 스파저에 배치된, 10 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 가스발생 프릿에 의해 수행하였다. 세포를 원심분리하고, 10 ml ATCC 배지로 세척하고, 다시 원심분리하였다. 배지 내로의 가스 진입은 반응기의 중간에 배치된, 10 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 필터에 의해 수행하였다. 세포를 원심분리하고, 10 ml의 ATCC 배지로 세척하고, 다시 원심분리하였다.

생산 배양을 위해 씨. 륭달리이의 전배양으로부터의 다수의 세척 세포를 약 400 mg/L L-시스테인 히드로클로라이드를 갖는 200 mL의 ATCC 배지 내로 옮기고, OD₆₀₀ 0.1로 성장시켰다. 배양은 37℃, 150 rpm의 개방 수조 진탕기에서 66.85% H₂, 33% CO₂ 및 0.15% O₂로 구성된 예비혼합 가스 혼합물을 갖는 내압성 500ml 유리 병에서 113 h 동안 3 L/h의 통기를 사용하여 수행하였다. 배지 내로의 가스 진입은 반응기의 중간에 배치된, 10 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 필터에 의해 수행하였다. 샘플링 시에 각 5 ml 샘플을 OD₆₀₀, pH 및 산물 범위의 결정을 위해 취하였다. 산물 농도의 결정을 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트를 사용하였다 (T(M)SP).

89 h 내지 113 h의 기간에, 인식가능한 세포 성장은 나타나지 않았다. OD₆₀₀은 0.29에서 정체되었고, 성장 속도 μ = 0 h^-1에 상응한다. 이 시간 동안 아세테이트의 농도는 89.4 mg/L에서 86.9 mg/L로 약간 증가하였고, 에탄올의 농도는 16.2 mg/L에서 11.9 mg/L로 감소하였다.

실시예 3

CO₂를 포함하는 합성 가스 및 0.15% 산소의 존재 하에 대수기의 클로스트리디움 륭달리이의 배양

씨. 륭달리이에 피드-스루 가스 상으로 H₂ 및 CO₂를 공급하여 아세테이트 및 에탄올을 형성시켰다. 배양을 위해, 부틸 고무 마개로 기밀 밀봉될 수 있는 내압성 유리 병을 사용하였다. 씨. 륭달리이 세포가 수반되는 모든 배양 단계를 혐기성 조건 하에서 수행하였다.

씨. 륭달리이의 세포 배양을 위해 5 mL 동결배양물을 약 400 mg/L L-시스테인 히드로클로라이드 및 400 mg/L Na₂S x 9 H₂O를 갖는 500 ml의 배지 (ATCC1754 배지: pH 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L 효모 추출물, 0.8 g/L NaCl, 1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/L KCl, 0.1 g/L KH₂PO₄, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ x 2H₂O; 20 mg/L 니트릴로트리아세트산 10 mg/L MnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O; 0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 μg/L d-비오틴, 20 μg/L 폴산, 100 g/L 피리독신-HCl; 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O; 50 μg/L 리보플라빈; 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토테네이트; 1 μg/L 비타민 B12 ; 50 μg/L p-아미노벤조에이트; 50 μg/L 리포산, 대략 67.5 mg/L NaOH)에서 혐기성 배양하였다. 배양은 37℃, 100 rpm의 개방 수조 진탕기에서 67% H₂, 33% CO₂로 구성된 예비혼합 가스 혼합물을 갖는 방염 1 L 유리 병에서 72 h 동안 3 L/h의 훈증을 사용하여 화학무기독립영양으로 수행하였다. 배지 내로의 가스 진입은 반응기의 중간에 가스발생 튜브에 탑재된, 10 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 필터에 의해 수행하였다. 세포를 원심분리하고, 10 ml ATCC 배지로 세척하고, 다시 원심분리하였다.

본배양을 위해 씨. 륭달리이의 성장 배양으로부터의 다수 세척 세포를 약 400 mg/L L-시스테인 히드로클로라이드를 갖는 500 mL의 ATCC 배지 내로 옮기고, OD₆₀₀ 0.1로 성장시켰다. 배양은 37℃, 150 rpm의 개방 수조 진탕기에서 66.85% H₂, 33% CO₂, 0.15% O₂로 구성된 예비혼합 가스 혼합물을 갖는 내압성 1 L 유리 병에서 45 h 동안 1 L/h의 통기를 사용하여 수행하였다. 배지 내로의 가스 진입은 반응기의 중간에 배치된, 10 마이크로미터의 기공 크기를 갖는 필터에 의해 수행하였다. 샘플링 시에 각 5 ml 샘플을 OD_600nm, pH 및 산물 범위의 결정을 위해 취하였다. 산물 농도의 결정을 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트를 사용하였다 (T(M)SP).

배양 기간 동안 유의한 세포 성장이 나타났으며, 이는 OD_600nm 0.10에서 0.54로의 증가에 의해 입증되고, 성장 속도 μ = 0.037 h ^-1에 상응한다. 아세테이트의 농도는 9.6 mg/L에서 3,304 mg/L로 및 에탄올의 농도는 2.2 mg/L에서 399 mg/L로 동시에 증가하였다.

실시예 4

CO를 포함하는 합성 가스 및 0.1% 산소의 존재 하에 대수기의 클로스트리디움 륭달리이의 배양

아세테이트 및 에탄올을 생산하기 위해 씨. 륭달리이를 산소의 존재 하에 CO, H₂ 및 CO₂로 이루어진 합성 가스를 갖는 복합 배지에서 독립영양으로 배양하였다.

1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/L KCl, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.8 g/L NaCl, 0.1 g/L KH₂PO₄, 20 mg/L CaCl₂ x 2 H₂O, 20 g/L MES, 1 g/L 효모 추출물, 0.4 g/L L-시스테인-HCl, 0.4 g/L Na₂S x 9 H₂O, 20 mg/L 니트릴로트리아세트산, 10 mg/L MnSO₄ x H₂O, 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.2 mg/L Na₂SeO₄, 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O, 20 μg/L 비오틴, 20 μg/L 폴산, 100 μg/L 피리독신-HCl, 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O, 50 μg/L 리보플라빈, 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토텐산, 1 μg/L 비타민 B12, 50 μg/L p-아미노벤조산, 50 μg/L 리포산으로 이루어진 복합 배지를 사용하였다.

독립영양 배양을 67.7% CO, 3.5% H₂ 및 15.6% CO₂로 이루어진 합성 가스를 사용하여 3.6 L/h의 속도로 연속적으로 가스발생시킨 1 L 혈청 병 내 500 mL 배지에서 수행하였다. 가스를 10 μm의 기공 직경을 갖는 마이크로버블 분산기에 의해 액체 상 내로 도입하였다. 혈청 병을 37℃에서 120 min^-1의 진탕 속도로 뉴브런즈윅 사이언티픽(New Brunswick Scientific)으로부터의 개방 수조 이노바(Innova) 3100에서 연속적으로 진탕하였다.

pH는 제어되지 않았다.

실험의 초기에, 씨. 륭달리이에 H₂/CO₂ 상에서 독립영양으로 성장시킨 세포를 OD₆₀₀ 0.1로 접종하였다. 따라서, 씨. 륭달리이를 500 mL 복합 배지를 갖는 1 L 혈청 병에서 67% H₂ 및 33% CO₂로 이루어진 합성 가스를 사용한 3 L/h의 속도의 에 복합 배지에서 성장시켰다. 상기 기재된 배지를 또한 이 배양에 사용하였다. 가스를 10 μm의 기공 직경을 갖는 마이크로버블 분산기에 의해 액체 상 내로 도입하였다. 혈청 병을 37℃에서 150 min^-1의 진탕 속도로 뉴브런즈윅 사이언티픽으로부터의 개방 수조 이노바 3100에서 연속적으로 진탕하였다. 세포를 혐기성 원심분리 (4500 min^-1, 4300 g, 20℃, 10 min)에 의해 OD₆₀₀ 0.49 및 pH 5.03으로 대수기에서 수거하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 상기 기재된 배지 10 mL 중에 재현탁시켰다. 이어서, 이 세포 현탁액을 배양 실험 접종에 사용하였다. 일산화탄소의 가스 상 농도는 가스 상을 샘플링하고 열 전도율 검출기가 구비된 애질런트 테크놀로지스 인크.의 가스 크로마토그래프 GC 6890N에 의한 오프라인 분석으로 측정하였다. 산소의 가스 상 농도를 프리센스 프리시전 센싱 게엠베하로부터의 미량 산소 침지 프로브에 의해 측정하였다. 산소 농도를 형광 켄칭에 의해 측정하였으며, 켄칭의 정도는 가스 상에서 산소의 분압과 상관관계가 있다. 산소 측정은 사용된 합성 가스 중 0.1% vol의 O₂ 농도를 나타냈다.

실험 동안 5 mL의 샘플을 OD₆₀₀, pH 및 산물 농도의 결정을 위해 취하였다. 후자는 정량적 ¹H-NMR-분광분석법에 의해 결정하였다.

씨. 륭달리이의 접종 후에, 세포는 성장 속도 μ 0.062 h^-1로 성장하기 시작하여, 94.5시간 후에 6.2 g/L의 농도까지 아세테이트를 연속적으로 생산하였다. 아세테이트의 생산에 동반하여, 에탄올이 아세테이트의 생산과 비교하여 보다 낮은 속도로 94.5시간 후에 1 g/L의 농도까지 생산되었다.

<표 1> 실시예 4의 결과 (n.d. = 검출되지 않음)

실시예 5

2% 산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 클로스트리디움 륭달리이에 의한 성장 및 아세테이트 생산

수소 및 이산화탄소의 아세트산으로의 생체전환을 위해, 호모아세트산생성 박테리아 클로스트리디움 륭달리이를 산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 배양하였다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.

전배양을 위해 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드 및 400 mg/L Na₂S x 9 H₂O를 갖는 500 ml 배지 (ATCC1754-배지: pH = 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L 효모 추출물, 0.8 g/L NaCl; 1 g/L NH₄Cl; 0.1 g/L KCl; 0.1 g/L KH₂PO₄; 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ x 2 H₂O; 20 mg/L 니트릴로트리아세트산; 10 mg/L MnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O; 0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 μg/L d-비오틴; 20 μg/L 폴산; 100 μg/L 피리독신-HCl; 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O; 50 μg/L 리보플라빈; 50 μg/L 니코틴산; 50 μg/L Ca-판토테네이트; 1 μg/L 비타민 B₁₂; 50 μg/L p-아미노벤조에이트; 50 μg/L 리포산; 대략 67.5 mg/L NaOH)에 씨. 륭달리이의 냉동된 동결 스톡 5 mL를 접종하였다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 100 rpm에서 72 h 동안 개방 수조 진탕기에서 67% H₂, 33% CO₂를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 3 L/h의 환기 속도로 1L 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 배지 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다.

전배양 후에, 세포 현탁액을 원심분리하고 (10 min, 4200 rpm), 펠릿을 10 ml 배지로 세척하고, 다시 원심분리하였다. 본배양을 위해, OD_600nm 0.1에 필요한 만큼의 전배양으로부터의 다수 세척 세포를 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드를 갖는 200 mL 배지에 옮겼다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 150 rpm에서 47 h 동안 개방 수조 진탕기에서 65% H₂, 33% CO₂, 2% O₂를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 1 L/h의 환기 속도로 250 mL 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 배지 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다. 배양 동안 OD_600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 산물 농도의 결정을 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다. 또한 배양 배지 중 용존 산소를 산소 침지 프로브 (옥시4트레이스(Oxy4Trace)가 구비된 PSt6, 독일 프리센스)에 의해 온라인 측정하였다.

배양 기간 동안 세포 성장은 OD_600nm 0.11에서 0.32로의 증가에 의해 관찰되었으며, 이는 성장 속도 μ = 0.022 h ^-1과 상관관계가 있다. 아세테이트의 농도는 8 mg/L에서 91 mg/L로 증가하였고, 에탄올 농도의 증가는 관찰되지 않았다. 배양 기간에 걸쳐 용존 산소 농도는 0.06 내지 0.15 mg/L 사이에서 변하였다.

동일한 파라미터 (배지 조성, 부피, 병, 가스, 환기 속도, 온도, 진탕 빈도)를 갖지만 배지 내에 세포가 없는 유사한 기술적 세팅에서, 0.50 mg/L의 용존 산소 농도가 측정되었다.

실시예 6

0.15% 산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 클로스트리디움 륭달리이에 의한 성장 및 아세테이트 생산

전배양 후에, 세포 현탁액을 원심분리하고 (10 min, 4200 rpm), 펠릿을 10 ml 배지로 세척하고, 다시 원심분리하였다. 본배양을 위해, OD_600nm 0.1에 필요한 만큼의 전배양으로부터의 다수 세척 세포를 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드를 갖는 200 mL 배지에 옮겼다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 150 rpm에서 47 h 동안 개방 수조 진탕기에서 66.85% H₂, 33% CO₂, 0.15% O₂를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 1 L/h의 환기 속도로 250 mL 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 배지 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다. 배양 동안 OD_600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 산물 농도의 결정을 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다. 또한 배양 배지 중 용존 산소를 산소 침지 프로브 (옥시4트레이스가 구비된 PSt6, 독일 프리센스)에 의해 온라인 측정하였다.

배양 기간 동안 세포 성장은 OD_600nm 0.10에서 0.45로의 증가에 의해 관찰되었으며, 이는 성장 속도 μ = 0.032 h ^-1과 상관관계가 있다. 아세테이트의 농도는 7 mg/L에서 2347 mg/L로 증가하였고, 에탄올 농도는 2 mg/L에서 319 mg/L로 증가하였다. 전체 배양 기간에 걸쳐 용존 산소 농도는 0.00 mg/L였다.

동일한 파라미터 (배지 조성, 부피, 병, 가스, 환기 속도, 온도, 진탕 빈도)를 갖지만 배지 내에 세포가 없는 유사한 기술적 세팅에서, 0.03 mg/L의 용존 산소 농도가 측정되었다.

실시예 7

수소 및 이산화탄소 상의 한정 배지에서 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 클루이베리의 공동-배양

아세테이트 및 에탄올을 생산하기 위해 제1 유기체로서의 씨. 륭달리이를 한정 배지에서 독립영양으로 배양하였다. 소정의 시간 후에, 이어서 아세테이트 및 에탄올의 부티레이트 및 헥사노에이트로의 전환을 위해 제2 유기체로서의 씨. 클루이베리를 동일한 반응기에 접종하였다. 하기에서, 이어서 씨. 륭달리이는 부티레이트를 부탄올로 전환시켰다.

2 g/L (NH₄)₂HPO₄, 0.2 g/L NaCl, 0.15 g/l KCl, 1 g/l KOH, 0.5 g/L MgCl₂ x 6 H₂O, 0.2 g/L CaCl₂ x 2 H₂O, 15 mg/L FeCl₂ x 4 H₂O, 0.4 g/L L-시스테인-HCl, 0.4 g/L Na₂S x 9 H₂O, 3 mg/L 붕산, 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 1 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.3 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.3 mg/L MnSO₄ x H₂O, 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.1 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.1 mg/L Na₂SeO₃, 106 μg/L 비오틴, 5 μg/L 폴산, 2.5 μg/L 피리독신-HCl, 266 μg/L 티아민-HCl x H₂O, 12.5 μg/L 리보플라빈, 12.5 μg/L 니코틴산, 413 μg/L Ca-판토텐산, 12.5 μg/L 비타민 B12, 12.5 μg/L p-아미노벤조산, 15 μg/L 리포산으로 이루어진 한정 배지를 두 미생물의 공동-배양을 위해 사용하였다.

독립영양 배양을 67% H₂ 및 33% CO₂로 이루어진 합성 가스를 사용하여 1 L/h의 속도로 연속적으로 가스발생시킨 500 mL 혈청 병 내 250 mL 한정 배지에서 수행하였다. 가스를 10 μm의 기공 직경을 갖는 마이크로버블 분산기에 의해 액체 상 내로 도입하였다. 혈청 병을 37℃ 및 150 min^-1의 진탕 속도로 뉴브런즈윅 사이언티픽으로부터의 개방 수조 이노바 3100에서 연속적으로 진탕하였다. pH는 KOH의 혐기성 원액 (40 g/L)의 연속 첨가에 의해 pH 5.0 - 6.5의 범위로 유지하였다.

실험의 초기에, 씨. 륭달리이에 독립영양으로 성장시킨 세포를 OD₆₀₀0.1로 접종하였다. 따라서, 씨. 륭달리이를 500 mL 복합 배지를 갖는 1 L 혈청 병에서 67% H₂ 및 33% CO₂로 이루어진 합성 가스를 사용한 3 L/h의 속도의 연속 가스발생 하에 복합 배지에서 성장시켰다. 1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/L KCl, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.8 g/L NaCl, 0.1 g/L KH₂PO₄, 20 mg/L CaCl₂ x 2 H₂O, 20 g/L MES, 1 g/L 효모 추출물, 0.4 g/L L-시스테인-HCl, 0.4 g/L Na₂S x 9 H₂O, 20 mg/L 니트릴로트리아세트산, 10 mg/L MnSO₄ x H₂O, 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.2 mg/L Na₂SeO₄, 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O, 20 μg/L 비오틴, 20 μg/L 폴산, 100 μg/L 피리독신-HCl, 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O, 50 μg/L 리보플라빈, 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토텐산, 1 μg/L 비타민 B12, 50 μg/L p-아미노벤조산, 50 μg/L 리포산으로 이루어진 복합 배지를 사용하였다. 가스를 10 μm의 기공 직경을 갖는 마이크로버블 분산기에 의해 액체 상 내로 도입하였다. 혈청 병을 37℃ 및 150 min^-1의 진탕 속도로 뉴브런즈윅 사이언티픽으로부터의 개방 수조 이노바 3100에서 연속적으로 진탕하였다. 세포를 혐기성 원심분리 (4500 min^-1, 4300 g, 20℃, 10 min)에 의해 OD₆₀₀ 0.67 및 pH 4.69로 후기-대수기에서 수거하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 상기 기재된 한정 배지 10 mL 중에 재현탁시켰다. 이어서, 이 세포 현탁액을 공동-배양 실험 접종에 사용하였다.

상기와 병행하여, 씨. 클루이베리를 아세테이트 및 에탄올 상에서 500 mL 혈청 병 내 200 mL 복합 배지에서 종속영양으로 성장시켰다. 0.25 g/L NH₄Cl, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.31 g/L K₂HPO₄, 0.23 g/L KH₂PO₄, 2.5 g/L NaHCO₃, 1 g/L 효모 추출물, 10 g/L K-아세테이트, 20 g/l 에탄올, 0.25 g/L L-시스테인-HCl, 1.5 mg/L FeCl₂ x 4 H₂O, 70 μg/L ZnCl₂ x 7 H₂O, 100 μg/L MnCl₂ x 4 H₂O, 6 μg/L 붕산, 190 μg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 2 μg/L CuCl₂ x 6 H₂O, 24 μg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 36 μg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 3 μg/L Na₂SeOO₃ x 5 H₂O, 4 μg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L Ca-판토텐산, 300 μg/L 피리독신-HCl, 200 μg/L 티아민-HCl x H₂O로 이루어진 복합 배지를 사용하였다. 혈청 병을 37℃ 및 100 min^-1의 진탕 속도로 뉴브런즈윅 사이언티픽으로부터의 개방 수조 이노바 3100에서 연속적으로 진탕하였다. 세포를 혐기성 원심분리 (4500 min^-1, 4300 g, 20℃, 10 min)에 의해 OD₆₀₀ 0.81 및 pH 5.96으로 후기-대수기에서 수거하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 상기 기재된 한정 배지 10 mL 중에 재현탁시켰다. 이어서, 이 세포 현탁액을 실행 실험 96시간 후에 OD₆₀₀ 0.2로의 공동-배양 실험 접종에 사용하였다.

실험 동안 OD₆₀₀, pH 및 산물 농도의 결정을 위해 5 mL의 샘플을 취하였다. 후자는 정량적 ¹H-NMR-분광분석법에 의해 결정하였다.

씨. 륭달리이의 접종 후에, 세포는 성장하기 시작하여 아세테이트를 연속적으로 생산하였다. 아세테이트의 생산에 동반하여, 에탄올이 아세테이트의 생산과 비교하여 보다 낮은 속도로 생산되었다. 96시간 후에 이어서 씨. 클루이베리를 반응기 내로 접종하고, 에탄올 농도의 감소를 하기 실험으로 측정하였다. 이어서 부티레이트 (최대 1163 mg/L) 및 헥사노에이트 (최대 136 mg/L)의 동시 생산을 하기 113시간의 실험으로 측정하였다. 씨. 클루이베리에 의한 부티레이트의 생산과 병행하여, 씨. 륭달리이는 실험의 말기에 부티레이트를 부탄올로 20 mg/L 부탄올의 최대 농도로 전환시켰다.

<표 2> 실시예 7의 결과 (n.d. = 검출되지 않음)

실시예 8

CO-함유 가스를 갖는 복합 배지에서의 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 클루이베리의 공동-배양

아세테이트 및 에탄올을 생산하기 위해 제1 유기체로서의 씨. 륭달리이를 복합 배지에서 독립영양으로 배양하였다. 소정의 시간 후에, 이어서 아세테이트 및 에탄올의 부티레이트 및 헥사노에이트로의 전환을 위해 제2 유기체로서의 씨. 클루이베리를 동일한 반응기에 접종하였다. 하기에서, 이어서 씨. 륭달리이는 부티레이트를 부탄올로 및 헥사노에이트를 헥산올로 전환시켰다.

1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/L KCl, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.8 g/L NaCl, 0.1 g/L KH₂PO₄, 20 mg/L CaCl₂ x 2 H₂O, 20 g/L MES, 1 g/L 효모 추출물, 0.4 g/L L-시스테인-HCl, 0.4 g/L Na₂S x 9 H₂O, 20 mg/L 니트릴로트리아세트산, 10 mg/L MnSO₄ x H₂O, 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.2 mg/L Na₂SeO₄, 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O, 20 μg/L 비오틴, 20 μg/L 폴산, 100 μg/L 피리독신-HCl, 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O, 50 μg/L 리보플라빈, 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토텐산, 1 μg/L 비타민 B12, 50 μg/L p-아미노벤조산, 50 μg/L 리포산으로 이루어진 복합 배지를 두 미생물의 공동-배양을 위해 사용하였다.

독립영양 배양을 5% H₂, 25% CO₂, 25% CO 및 45% N₂로 이루어진 합성 가스를 사용하여 ~12 L/h (≥0.5ppm)의 속도로 연속적으로 가스발생시킨 1 L 혈청 병 내 500 mL 복합 배지에서 수행하였다. 가스를 10 μm의 기공 직경을 갖는 마이크로버블 분산기에 의해 액체 상 내로 도입하였다. 혈청 병을 37℃ 및 120 min^-1의 진탕 속도로 뉴브런즈윅 사이언티픽으로부터의 개방 수조 이노바 3100에서 연속적으로 진탕하였다. pH는 이 실험 동안 제어되지 않았다.

실험의 초기에, 씨. 륭달리이에 독립영양으로 성장시킨 세포를 OD₆₀₀ 0.1로 접종하였다. 따라서, 씨. 륭달리이를 500 mL 복합 배지를 갖는 1 L 혈청 병에서 67% H₂ 및 33% CO₂로 이루어진 합성 가스를 사용한 3 L/h의 속도의 연속 가스발생 하에 상기 기재된 복합 배지에서 성장시켰다. 가스를 10 μm의 기공 직경을 갖는 마이크로버블 분산기에 의해 액체 상 내로 도입하였다. 혈청 병을 37℃에서 150 min^-1의 진탕 속도로 뉴브런즈윅 사이언티픽으로부터의 개방 수조 이노바 3100에서 연속적으로 진탕하였다. 세포를 혐기성 원심분리 (4500 min^-1, 4300 g, 20℃, 10 min)에 의해 OD₆₀₀ 0.51 및 pH 5.04로 후기-대수기에서 수거하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 상기 기재된 복합 배지 10 mL 중에 재현탁시켰다. 이어서, 이 세포 현탁액을 공동-배양 실험 접종에 사용하였다.

상기와 병행하여, 씨. 클루이베리를 아세테이트 및 에탄올 상에서 500 mL 혈청 병 내 200 mL 복합 배지에서 종속영양으로 성장시켰다. 0.25 g/L NH₄Cl, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.31 g/L K₂HPO₄, 0.23 g/L KH₂PO₄, 2.5 g/L NaHCO₃, 1 g/L 효모 추출물, 10 g/L K-아세테이트, 20 g/l 에탄올, 0.25 g/L L-시스테인-HCl, 1.5 mg/L FeCl₂ x 4 H₂O, 70 μg/L ZnCl₂ x 7 H₂O, 100 μg/L MnCl₂ x 4 H₂O, 6 μg/L 붕산, 190 μg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 2 μg/L CuCl₂ x 6 H₂O, 24 μg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 36 μg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 3 μg/L Na₂SeOO₃ x 5 H₂O, 4 μg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L Ca-판토텐산, 300 μg/L 피리독신-HCl, 200 μg/L 티아민-HCl x H₂O로 이루어진 복합 배지를 사용하였다. 혈청 병을 37℃에서 100 min^-1의 진탕 속도로 뉴브런즈윅 사이언티픽으로부터의 개방 수조 이노바 3100에서 연속적으로 진탕하였다. 세포를 혐기성 원심분리 (4500 min^-1, 4300 g, 20℃, 10 min)에 의해 OD₆₀₀ 0.54 및 pH 6.60으로 후기-대수기에서 수거하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 상기 기재된 복합 배지 10 mL 중에 재현탁시켰다. 이어서, 이 세포 현탁액을 실행 실험 240시간 후에 공동-배양 실험 접종에 사용하였다.

씨. 륭달리이의 접종 후에, 세포는 성장하기 시작하여 71시간 후에 아세테이트를 ~3 g/L의 농도로 및 에탄올을 ~0.5 g/L 농도로 연속적으로 생산하였다. 하기 실험의 시간 경과에서, 아세테이트는 240시간 후에 에탄올로 4.8 g/L의 농도까지 완전히 전환되었다. 240시간의 공정 시간에서, 이어서 씨. 클루이베리를 반응기 내로 접종하였다. 이 유기체가 기질로서 에탄올 이외에 아세테이트를 필요로 하므로, 씨. 클루이베리의 접종과 동시에 대략 3 g/L 아세테이트 (Na-아세테이트의 형태)를 혐기성으로 반응기 내로 가져왔다. 하기 실험의 시간 경과에서, 부티레이트 및 헥사노에이트의 각각 1.6 g/L의 농도까지의 생산을 측정하였다. 씨. 클루이베리에 의한 부티레이트 및 헥사노에이트의 생산과 병행하여, 씨. 륭달리이는 부티레이트를 부탄올로 690 mg/L 부탄올의 최대 농도로 전환시키고, 헥사노에이트를 헥산올로 1478 mg/L 헥산올의 최대 농도로 전환시켰다.

<표 3> 실시예 8의 결과 (n.d. = 검출되지 않음)

실시예 9

0.05% 산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 클로스트리디움 카르복시디보란스에 의한 아세테이트 및 다른 화합물의 성장 및 생산

수소 및 이산화탄소의 아세트산 및 다른 화합물로의 생체전환을 위해, 호모아세트산생성 박테리아 클로스트리디움 카르복시디보란스를 산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 배양하였다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.

전배양을 위해 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드 및 400 mg/L Na₂S x 9 H₂O를 갖는 500 ml 배지 (ATCC1754-배지: pH = 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L 효모 추출물, 0.8 g/L NaCl; 1 g/L NH₄Cl; 0.1 g/L KCl; 0.1 g/L KH₂PO₄; 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ x 2 H₂O; 20 mg/L 니트릴로트리아세트산; 10 mg/L MnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O; 0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 μg/L d-비오틴; 20 μg/L 폴산; 100 μg/L 피리독신-HCl; 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O; 50 μg/L 리보플라빈; 50 μg/L 니코틴산; 50 μg/L Ca-판토테네이트; 1 μg/L 비타민 B₁₂; 50 μg/L p-아미노벤조에이트; 50 μg/L 리포산; 대략 67.5 mg/L NaOH)에 씨. 카르복시디보란스의 냉동된 동결 스톡 5 mL를 접종하였다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 100 rpm에서 71 h 동안 개방 수조 진탕기에서 60% H₂, 20% CO₂, 및 20% CO를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 3 L/h의 환기 속도로 1L 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 배지 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다.

전배양 후에, 세포 현탁액을 원심분리하고 (10 min, 4200 rpm), 펠릿을 신선한 배지 중에 재현탁시켰다. 본배양을 위해, OD_600nm 0.2에 필요한 만큼의 전배양으로부터의 다수 세포를 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드를 각각 갖는 200 mL 복합 배지 (ATCC1754) 및 병행하여 200 ml 미네랄 배지 (DM4-배지: pH = 6.00, 0.5 g/L MgCl₂ x 6 H₂O, 0.2 g/L CaCl₂ x 2 H₂O, 15 mg/L FeCl₂ x 4 H₂O, 2 g/L (NH₄)H₂PO₄, 0.2 g/L NaCl, 0.15 g/L KCl, 3 mg/L H₃BO₃, 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 1 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 300 μg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 300 μg/L MnSO₄ x H₂O, 200 μg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 100 μg/L CuCl₂ x 2 H₂O, 100 μg/L Na₂SeO₃, 106 μg/L d-비오틴, 5 μg/L 폴산, 2.5 μg/L 피리독신-HCl, 266 μg/L 티아민-HCl, 12.5 μg/L 리보플라빈, 12.5 μg/L 니코틴산, 413 μg/L Ca-판토테네이트, 12.5 μg/L 비타민 B₁₂, 12.5 μg/L p-아미노벤조에이트, 15.0 μg/L 리포산, 대략 1.3 g/L KOH)에 옮겼다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 150 rpm에서 40 h 동안 개방 수조 진탕기에서 66.95% H₂, 33% CO₂, 및 0.05% O₂를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 1 L/h의 환기 속도로 1 L 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 헤드 스페이스 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다. 배양 동안 OD_600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 산물 농도의 결정을 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다. 또한 배양 배지 중 용존 산소를 산소 침지 프로브 (옥시4트레이스가 구비된 PSt6, 독일 프리센스)에 의해 온라인 측정하였다.

배양 기간 동안 세포 성장은 OD_600nm 0.20에서 0.36으로의 증가에 의해 복합 배지에서 관찰되었으며, 이는 성장 속도 μ = 0.015 h ^-1과 상관관계가 있다. 미네랄 배지에서, OD_600nm은 0.20에서 0.19로 감소하였다. 복합 배지에서 아세테이트의 농도는 29 mg/L에서 280 mg/L로, 에탄올은 3 mg/L에서 82 mg/L로, 부티레이트는 0 mg/L에서 29 mg/L로 및 부탄올은 0 mg/L에서 10 mg/L로 증가하였다. 미네랄 배지에서 아세테이트의 농도는 25 mg/L에서 110 mg/L로, 에탄올은 3 mg/L에서 5 mg/L로 및 부티레이트는 0 mg/L에서 2 mg/L로 증가하였다. 전체 배양 기간에 걸쳐 두 배양물에서 용존 산소 농도는 0.00 mg/L였다.

동일한 파라미터 (배지 조성, 부피, 병, 가스, 환기 속도, 온도, 진탕 빈도)를 갖지만 배지 내에 세포가 없는 유사한 기술적 세팅에서, 0.01 mg/L의 용존 산소 농도가 두 배지에서 측정되었다.

실시예 10

0.05% 산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 클로스트리디움 아우토에타노게눔에 의한 아세테이트 및 에탄올의 성장 및 생산

수소 및 이산화탄소의 아세트산 및 에탄올로의 생체전환을 위해, 호모아세트산생성 박테리아 클로스트리디움 아우토에타노게눔을 산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 배양하였다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.

전배양을 위해 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드 및 400 mg/L Na₂S x 9 H₂O를 갖는 500 ml 배지 (ATCC1754-배지: pH = 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L 효모 추출물, 0.8 g/L NaCl; 1 g/L NH₄Cl; 0.1 g/L KCl; 0.1 g/L KH₂PO₄; 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ x 2 H₂O; 20 mg/L 니트릴로트리아세트산; 10 mg/L MnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O; 0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 μg/L d-비오틴; 20 μg/L 폴산; 100 μg/L 피리독신-HCl; 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O; 50 μg/L 리보플라빈; 50 μg/L 니코틴산; 50 μg/L Ca-판토테네이트; 1 μg/L 비타민 B₁₂; 50 μg/L p-아미노벤조에이트; 50 μg/L 리포산; 대략 67.5 mg/L NaOH)에 씨. 아우토에타노게눔의 냉동된 동결 스톡 5 mL를 접종하였다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 100 rpm에서 72 h 동안 개방 수조 진탕기에서 67% H₂, 33% CO₂를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 3 L/h의 환기 속도로 1L 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 배지 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다.

전배양 후에, 세포 현탁액을 원심분리하고 (10 min, 4200 rpm), 펠릿을 신선한 배지 중에 재현탁시켰다. 본배양을 위해, OD_600nm 0.1에 필요한 만큼의 전배양으로부터의 다수 세포를 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드를 갖는 500 mL 배지에 옮겼다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 150 rpm에서 41 h 동안 개방 수조 진탕기에서 66.95% H₂, 33% CO₂, 및 0.05% O₂를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 1 L/h의 환기 속도로 1 L 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 배지 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다. 배양 동안 OD_600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 산물 농도의 결정을 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다. 또한 배양 배지 중 용존 산소를 산소 침지 프로브 (옥시4트레이스가 구비된 PSt6, 독일 프리센스)에 의해 온라인 측정하였다.

배양 기간 동안, 세포 성장은 41 h 내에 OD_600nm 0.08에서 0.76으로의 증가에 의해 관찰되었으며, 이는 성장 속도 μ = 0.054 h ^-1과 상관관계가 있다. 아세테이트의 농도는 37 mg/L에서 6600 mg/L로 증가하였고, 에탄올 농도는 4 mg/L에서 120 mg/L로 증가하였다. 전체 배양 기간에 걸쳐 용존 산소 농도는 0.00 mg/L였다.

동일한 파라미터 (배지 조성, 부피, 병, 가스, 환기 속도, 온도, 진탕 빈도)를 갖지만 배지 내에 세포가 없는 유사한 기술적 세팅에서, 0.01 mg/L의 용존 산소 농도가 측정되었다.

실시예 11

0.6% 산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 클로스트리디움 륭달리이에 의한 성장 및 아세테이트 생산

전배양 후에, 세포 현탁액을 원심분리하고 (10 min, 4200 rpm), 펠릿을 10 ml 배지로 세척하고, 다시 원심분리하였다. 본배양을 위해, OD_600nm 0.1에 필요한 만큼의 전배양으로부터의 다수 세척 세포를 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드를 갖는 200 mL 배지에 옮겼다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 150 rpm에서 91 h 동안 개방 수조 진탕기에서 66.85% H₂, 33% CO₂, 0.6% O₂를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 1 L/h의 환기 속도로 250 mL 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 배지 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다. 배양 동안 OD_600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 산물 농도의 결정을 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다. 또한 배양 배지 중 용존 산소를 산소 침지 프로브 (옥시4트레이스가 구비된 PSt6, 독일 프리센스)에 의해 온라인 측정하였다.

배양 기간 동안, 세포 성장은 OD_600nm 0.10에서 0.16으로의 증가에 의해 관찰되었으며, 이는 성장 속도 μ = 5 x 10^-3 h ^-1과 상관관계가 있다. 아세테이트의 농도는 9 mg/L에서 476 mg/L로 증가하였고, 에탄올 농도는 6 mg/L에서 61 mg/L로 증가하였다. 전체 배양 기간에 걸쳐 용존 산소 농도는 0.01 내지 0.10 mg/L였다.

동일한 파라미터 (배지 조성, 부피, 병, 가스, 환기 속도, 온도, 진탕 빈도)를 갖지만 배지 내에 세포가 없는 유사한 기술적 세팅에서, 0.15 mg/L의 용존 산소 농도가 측정되었다.

실시예 12

산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 아세토박테리움 우디이에 의한 성장 및 아세테이트의 생산

수소 및 이산화탄소의 아세트산으로의 생체전환을 위해, 호모아세트산생성 박테리아 아세토박테리움 우디이를 산소의 존재 하에 합성 가스 상에서 배양하였다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다. 전배양을 위해 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드 및 400 mg/L Na₂S x 9 H₂O를 갖는 500 ml 배지 (ATCC1754-배지: pH = 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L 효모 추출물, 0.8 g/L NaCl; 1 g/L NH₄Cl; 0.1 g/L KCl; 0.1 g/L KH₂PO₄; 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ x 2 H₂O; 20 mg/L 니트릴로트리아세트산; 10 mg/L MnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O; 0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 μg/L d-비오틴; 20 μg/L 폴산; 100 μg/L 피리독신-HCl; 50 μg/L 티아민-HCl x H₂O; 50 μg/L 리보플라빈; 50 μg/L 니코틴산; 50 μg/L Ca-판토테네이트; 1 μg/L 비타민 B₁₂; 50 μg/L p-아미노벤조에이트; 50 μg/L 리포산; 대략 67.5 mg/L NaOH)에 에이. 우디이의 냉동된 동결 스톡 5 mL를 접종하였다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 100 rpm에서 72 h 동안 개방 수조 진탕기에서 67% H₂, 33% CO₂를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 3 L/h의 환기 속도로 1L 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 배지 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다.

전배양 후에, 세포 현탁액을 원심분리하고 (10 min, 4200 rpm), 펠릿을 신선한 배지 중에 재현탁시켰다. 본배양을 위해, OD_600nm 0.1에 필요한 만큼의 전배양으로부터의 다수 세포를 추가의 400 mg/L L-시스테인-히드로클로라이드를 갖는 500 mL 배지에 옮겼다. 화학무기독립영양 배양을 37℃, 150 rpm에서 41 h 동안 개방 수조 진탕기에서 66.95% H₂, 33% CO₂, 0.05% O₂를 갖는 예비혼합 가스를 사용하여 1 L/h의 환기 속도로 1 L 내압성 유리 병에서 수행하였다. 가스를 반응기의 중앙에 탑재된, 10 μm의 기공 크기를 갖는 스파저를 통해 배지 내로 방출시켰다. 배양을 pH 제어 없이 수행하였다. 배양 동안 OD_600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 산물 농도의 결정을 반-정량적 1H-NMR 분광분석법에 의해 수행하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트 (T(M)SP)를 사용하였다. 또한 배양 배지 중 용존 산소를 산소 침지 프로브 (옥시4트레이스가 구비된 PSt6, 독일 프리센스)에 의해 온라인 측정하였다.

배양 기간 동안, 세포 성장은 OD_600nm의 증가에 의해 관찰되었다. 또한, 아세테이트의 농도는 증가하였다.

참고문헌

Claims

- 지수 성장기의 제1 아세트산생성 미생물;
- 유리 산소; 및
- 정지기의 제2 아세트산생성 미생물
을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 아세트산생성 미생물은 탄소원을 아세테이트, 또는 에탄올, 또는 아세테이트 및 에탄올 둘 모두로 전환시킬 수 있는 것인, 호기성 조건에서 탄소원으로부터 에탄올, 또는 아세테이트, 또는 에탄올 및 아세테이트 둘 모두를 생산하기 위한 반응 혼합물.
제1항에 있어서, 제1 및 제2 미생물이 ATCC 35199의 아세토아나에로비움 노테라(Acetoanaerobium notera), DSM 6540의 아세토네마 롱굼(Acetonema longum), DSM 2925의 아세토박테리움 카르비놀리쿰(Acetobacterium carbinolicum), DSM 4132의 아세토박테리움 말리쿰(Acetobacterium malicum), 아세토박테리움 종 번호 446, DSM 1911의 아세토박테리움 위에링가에(Acetobacterium wieringae), DSM 1030의 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), DSM 22112의 알칼리바쿨룸 바키(Alkalibaculum bacchi), DSM 4304의 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), DSM 2950의 블라우티아 프로둑타(Blautia producta), DSM 3468의 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), DSM 1496의 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), DSM 10061, DSM 19630 및 DSM 23693의 클로스트리디움 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), DSM 15243의 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), ATCC 번호 PTA-10522의 클로스트리디움 코스카티이(Clostridium coskatii), ATCC BA-623의 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), DSM 92의 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), DSM 1288의 클로스트리디움 글리콜리쿰(Clostridium glycolicum), DSM 13528의 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), ATCC 55988의 클로스트리디움 륭달리이 C-01, ATCC 55380의 클로스트리디움 륭달리이 ERI-2, ATCC 55989의 클로스트리디움 륭달리이 O-52, DSM 6539의 클로스트리디움 마이옴베이(Clostridium mayombei), DSM 12182의 클로스트리디움 메톡시벤조보란스(Clostridium methoxybenzovorans), DSM 15248의 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), DSM 757의 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리디움 종 ATCC 29797, DSM 6115의 데술포토마쿨룸 쿠즈네초비이(Desulfotomaculum kuznetsovii), DSM 14055의 데술포토마쿨룸 써모베조이쿰 아종 써모신트로피쿰(Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum), DSM 20543의 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), DSM 2834의 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans) C2A, 무렐라 종(Moorella sp.) HUC22-1, DSM 521의 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), DSM 1974의 무렐라 써모아우토트로피카(Moorella thermoautotrophica), DSM 322의 옥소박터 펜니기이(Oxobacter pfennigii), DSM 13326의 스포로무사 아에리보란스(Sporomusa aerivorans), DSM 2662의 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), DSM 10669의 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), DSM 2875의 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), DSM 4440의 스포로무사 테르미티다(Sporomusa termitida) 및 DSM 2030의 써모안아에로박터 키부이(Thermoanaerobacter kivui)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 혼합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 지수 성장기의 제1 아세트산생성 미생물이 0.01 내지 2 h^-1의 성장 속도를 갖는 것인 혼합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 지수 성장기의 제1 아세트산생성 미생물이 0.01 내지 2의 OD₆₀₀을 갖는 것인 혼합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 호기성 조건이 0.000005 부피% - 1 부피%의 농도로 존재하는 산소로 인한 것인 혼합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 혼합물이
- 에탄올 카르복실레이트 발효 경로를 수행하고 아세테이트, 또는 에탄올, 또는 아세테이트 및 에탄올 둘 모두를 전환시켜 산을 형성할 수 있는 제3 미생물
을 추가로 포함하며, 제1 아세트산생성 미생물, 또는 제2 아세트산생성 미생물, 또는 제1 및 제2 아세트산생성 미생물 둘 모두가 상기 산을 상응하는 고급 알콜로 전환시킬 수 있는 것인 혼합물.
제6항에 있어서, 제3 미생물이 E₁ 내지 E₁₁로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 효소를 발현하며, 여기서 E₁이 알콜 데히드로게나제 (adh)이고, E₂가 아세트알데히드 데히드로게나제 (ald)이고, E₃이 아세토아세틸-CoA 티올라제 (thl)이고, E₄가 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제 (hbd)이고, E₅가 3-히드록시부티릴-CoA 데히드라타제 (crt)이고, E₆이 부티릴-CoA 데히드로게나제 (bcd)이고, E₇이 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 (etf)이고, E₈이 조효소 A 트랜스퍼라제 (cat)이고, E₉가 아세테이트 키나제 (ack)이고, E₁₀이 포스포트랜스아세틸라제 (pta)이고, E₁₁이 트랜스히드로게나제인 혼합물.
제6항에 있어서, 제3 미생물이 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri) 및 씨. 카르복시디보란스(C. Carboxidivorans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 혼합물.
제6항에 있어서, 제1 미생물, 또는 제2 미생물, 또는 제1 및 제2 미생물 둘 모두가 클로스트리디움 륭달리이이고, 제3 미생물이 클로스트리디움 클루이베리인 혼합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 탄소원이 CO를 포함하는 것인 혼합물.
제6항에 있어서, 고급 알콜이 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 이소부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-헥산올, 1-옥탄올, 1-펜탄올, 1-헵탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-헥산올, 5-메틸-1-헵탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 5-메틸-1-헥산올, 6-메틸-1-헵탄올 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 혼합물.
(a) - 지수 성장기의 제1 아세트산생성 미생물;
- 유리 산소; 및
- 정지기의 제2 아세트산생성 미생물
을 포함하는 반응 혼합물을 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 아세트산생성 미생물은 탄소원을 아세테이트, 또는 에탄올, 또는 아세테이트 및 에탄올 둘 모두로 전환시킬 수 있는 것인, 호기성 조건에서 탄소원으로부터 에탄올, 또는 아세테이트, 또는 에탄올 및 아세테이트 둘 모두를 생산하는 방법.
제12항에 있어서, 반응 혼합물이 제2항에 따른 혼합물인 방법.
(a) 호기성 조건에서 제6항에 따른 반응 혼합물을 탄소원에 접촉시키는 것
을 포함하는, 호기성 조건에서 탄소원으로부터 적어도 1종의 고급 알콜을 생산하는 방법.