BR102016001727A2

BR102016001727A2 - método aeróbico para produzir álcoois

Info

Publication number: BR102016001727A2
Application number: BR102016001727A
Authority: BR
Inventors: Martin Demler; Simon Beck; Thomas Bülter; Thomas Haas
Original assignee: Evonik Degussa Gmbh
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2016-08-02
Also published as: MX2016001241A; KR102569875B1; EP3050968B1; KR20160092930A; CN105821084B; US9920334B2; CA2919029A1; EP3050966A1; RU2016102677A; ZA201600496B; US20160215304A1; CA2919029C; EP3050968A1; RU2016102677A3; AR103522A1; RU2724532C2; CN105821084A

Abstract

resumo da patente de invenção para: "método aeróbico para produzir álcoois". mistura de reação para a produção de etanol e/ou acetato a partir de uma fonte de carbono em condições aeróbicas, em que a mistura compreende: - um primeiro microrganismo acetogênico em uma fase de crescimento exponencial; - oxigênio livre; e - um segundo microrganismo acetogênico em uma fase estacionária em que o primeiro e segundo microrganismos acetogênicos são capazes de converter a fonte de carbono a acetato e/ou etanol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "MÉTODO AERÓBICO PARA PRODUZIR ÁLCOOIS".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a uma mistura de reação e a um método biotecnológico de produção de álcoois, incluindo álcoois superiores, a partir de uma fonte de carbono em condições aeróbicas. Em particular, a mistura e o método se referem à produção biotecnológica de pelo menos um álcool, na presença de oxigênio e de células jovens, FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Métodos biotecnológicos de produção de álcoois, em particular o etanol, são bem conhecidos no estado da técnica. Em especial, o uso de bactérias acetogênicas com várias fontes de carbono para a produção de etanol e/ou acetato é bem conhecido. No entanto, na maioria dos casos, a produção de álcoois só pode ser realizada com sucesso na ausência de oxigênio. Este fenômeno é confirmado, pelo menos, por Bryukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan, 2013 e outros, onde é demonstrado que as bactérias acetogênicas não produzem etanol com sucesso em condições aeróbicas. Portanto, nos métodos correntes conhecidos no estado da técnica, os substratos de carbono compreendendo oxigênio, tal como gases residuais provenientes de usinas siderúrgicas, são primeiramente processados para remoção do oxigênio, antes de serem introduzidos nas células acetogênicas para produção de etanol e/ou acetato. A etapa de separação de oxigênio torna o processo mais dispendioso e demorado. Além disso, pode haver alguma perda de matérias-primas durante esta etapa de separação.

[003] Existe no estado da técnica, portanto, uma necessidade de um meio de produção de etanol e/ou acetato na presença de oxigênio. O etanol pode, então, ser usado como uma matéria-prima para a produção de compostos de carbono superiores, tais como álcool, ácidos e outros semelhantes.

[004] Por exemplo, butanol e álcoois superiores têm vários usos, incluindo serem usados como combustível. Por exemplo, no futuro o butanol poderá substituir a gasolina, já que os teores de energia dos dois combustíveis são praticamente iguais. Além disso, o butanol tem várias outras propriedades superiores como um combustível alternativo, em comparação com o etanol. Estas incluem o butanol ter maior teor de energia, o butanol ser menos "evaporativo" do que o etanol ou a gasolina e o butanol ser facilmente transportável, em comparação com o etanol. Por estas e outras razões, já existe um mercado potencial para butanol e/ou álcoois superiores relacionados. Butanol e outros álcoois superiores também são usados como solventes industriais.

[005] Atualmente, o butanol e outros álcoois superiores são fabricados principalmente a partir do petróleo. Estes compostos são obtidos por craqueamento da gasolina ou petróleo, o que é ruim para o meio ambiente. Além disso, uma vez que os custos destes materiais de partida estão ligados ao preço do petróleo, com o aumento esperado nos preços do petróleo no futuro, o preço do butanol e de outros álcoois superiores também poderá aumentar relativamente ao aumento dos preços do petróleo.

[006] Historicamente (1900-1950), biobutanol foi fabricado a partir de milho e melaço, em um processo de fermentação que também produziu acetona e etanol e que ficou conhecido como uma fermentação ABE (acetona, butanol, etanol), tipicamente com determinadas bactérias produtoras de butanol, tais como o Clostridium acetobutylicum e Clostrídium beijerinckii. Recentemente, este método ganhou popularidade novamente com o interesse renovado na energia verde. No entanto, o processo de "produção de butanol de amido de milho" requer uma série de etapas que consomem energia, incluindo o cultivo agrícola da safra de milho, a colheita do grão de milho, processamento do amido do grão de milho e a fermentação amido-para-açúcar-para-butanol. O processo de "produção de butanol de amido de milho", provavelmente, também poderá necessitar de quase tanta energia quanto o valor energético do butanol produto.

[007] Processo Alfol® para Álcool é um método usado para a produção de álcoois superiores a partir de etileno, usando um catalisador de organo-alumínio. A reação produz álcoois primários lineares de cadeia longa (C2-C28)· O processo usa um catalisador de alumínio para oligomerizar o etileno e permitir que o grupo alquila resultante seja oxigenado. No entanto, este método produz um amplo espectro de álcoois e o padrão de distribuição é mantido. Esse padrão constante limita a capacidade do produtor em produzir apenas o intervalo de álcool específico que tem maior demanda, ou que tem o melhor valor econômico. Além disso, os gases necessários à reação têm de ser muito limpos e é necessária uma composição singular de gases para a reação ser realizada com sucesso.

[008] documento W02009100434 também descreve um método indireto de produção de butanol e hexanol a partir de um carboidrato. O método inclui uma fermentação homoacetogênica para produzir um intermediário de ácido acético, que é então convertido quimicamente a etanol. O etanol e a porção restante do ácido acético intermediário são, então, usados como substrato em uma fermentação acidogênica para produzir intermediários de ácido butírico e ácido capróico que são, então, quimicamente convertidos em butanol e hexanol. No entanto, este método usa matéria-prima de carboidratos cara e tem duas etapas adicionais no processo, a formação de ésteres e a hidrogenação química dos ésteres, o que torna o método não só mais longo, mas também resulta na perda de material útil ao longo do caminho.

[009] Perez, J.M., 2012, divulga um método de conversão de ácidos carboxílicos de cadeia curta em seus álcoois correspondentes, na presença de gás de síntese, com o suso do Clostridium Ijungdahlii. No entanto, os ácidos carboxílicos de cadeia curta têm de ser adicionados como substrato para a conversão ao álcool superior correspondente.

[010] Portanto, os métodos disponíveis atualmente para a produção de álcoois superiores, têm limitações na transferência de massa dos substratos gasosos para os caldos de fermentação, menor produtividade e menor concentração de produtos finais, resultando em custos de energia mais elevados para a purificação do produto.

[011] Consequentemente, é desejável encontrar matérias-primas mais sustentáveis, além das fontes puramente a base de petróleo ou de milho, como materiais de partida para a produção de butanol e outros álcoois superiores por via biotecnológica, que também causem menos danos ao meio ambiente. Em particular, existe a necessidade de um método de produção biotecnológica de butanol e outros álcoois superiores em etapa única (one-pot) simples e eficiente, a partir de matérias-primas renováveis.

[012] DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[013] A presente invenção resolve os problemas mencionados acima pelo fornecimento de um meio de produção de etanol e álcoois superiores, em condições aeróbicas, pela introdução de células acetogênicas, na fase de crescimento exponencial/log, a um meio aquoso compreendendo uma fonte de carbono e de oxigênio. A concentração destas células acetogênicas na fase de crescimento exponencial/log pode ser mantida por qualquer meio conhecido no estado da técnica, desde que exista oxigênio constantemente presente no meio aquoso. O oxigênio pode estar presente no meio aquoso a uma concentração de, pelo menos, 5 ppm.

[014] Em um aspecto da presente invenção, é proporcionada uma mistura de reação para a produção de etanol e/ou acetato a partir de uma fonte de carbono em condições aeróbicas, em que a mistura compreende: [015] um primeiro microrganismo acetogênico em uma fase de crescimento exponencial;

[016] oxigênio livre; e [017] um segundo microrganismo acetogênico em uma fase pós-exponencial;

[018] em que o primeiro e o segundo microrganismos acetogênicos são capazes de converter a fonte de carbono a acetato e/ou etanol.

[019] Em particular, o segundo microrganismo acetogênico em uma fase pós-exponencial pode estar na fase estacionária da célula. As células acetogênicas na fase log permitem que quaisquer outras céiulas acetogênicas no meio aquoso produzam acetato e/ou etanol na presença de oxigênio. A concentração de células acetogênicas na fase log pode ser mantida na mistura de reação. Portanto, em qualquer momento da reação, a mistura de reação compreende células acetogênicas na fase log e células acetogênicas em outra fase de crescimento, por exemplo, na fase estacionária.

[020] Um especialista na técnica compreenderá as diferentes fases de crescimento de microrganismos e os métodos para medi-las e identificá-las. Em particular, a maioria dos microrganismos em cultura em lotes (bateladas) pode ser encontrada em, pelo menos, quatro fases de crescimento diferentes, nomeadamente: fase iag (A), fase log ou fase exponencial (B), fase estacionária (C) e fase de declínio (D). A fase log pode ser dividida ainda em fase log precoce e fase log/exponencial média para tardia. A fase estacionária também pode ser adicionalmente distinguida em fase estacionária precoce e fase estacionária. Por exemplo, Cotter, J.L., 2009, Najafpour. G., 2006, Younesi, H., 2005, e Kõpke, M., 2009 divulgam diferentes fases de crescimento de bactérias acetogênicas. Em particular, a fase de crescimento das células pode ser medida usando métodos descritos, pelo menos, em Shuler M.L., 1992 e Fuchs G., 2007.

[021] A fase Iag é a fase imediatamente após a inoculação das células em um meio fresco, a população permanece temporariamente inalterada. Embora não ocorra nenhuma divisão celular aparente, as células podem estar crescendo em volume ou massa, sintetizando enzimas, proteínas, RNA, etc. e aumentando a atividade metabólica. O comprimento da fase Iag pode ser dependente de uma ampla variedade de fatores, incluindo o tamanho do inóculo; o tempo necessário para a recuperação de danos físicos ou do choque da transferência; o tempo necessário para a síntese de coenzimas essenciais ou fatores de divisão; e o tempo necessário para a síntese de novas enzimas (induzíveis), que são necessárias para metabolizar os substratos presentes no meio.

[022] A fase exponencial (log) de crescimento é um padrão de crescimento equilibrado, em que todas as células estão se dividindo regularmente por fissão binária e estão crescendo em progressão geométrica. As células se dividem a uma taxa constante, dependendo da composição do meio de crescimento e das condições de incubação. A taxa de crescimento exponencial de uma cultura bacteriana é expressa como o tempo de geração e também como o tempo de duplicação da população bacteriana. O tempo de geração (G) é definido como o tempo (t) por geração (n = número de gerações). Assim, G = t/n é a equação a partir da qual são derivados os cálculos de tempo de geração. A fase exponencial pode ser dividida em (i) fase log precoce e (ii) fase log/exponencial média para tardia. Um especialista na técnica pode facilmente identificar quando um microrganismo, em particular bactérias acetogênicas, entram na fase log. Por exemplo, o método para calcular a taxa de crescimento das bactérias acetogênicas, para determinar se elas estão na fase log, pode ser realizado usando o método ensinado, pelo menos, em Henstra A.M. de 2007. Em particular, o microrganismo na fase de crescimento exponencial, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode incluir células na fase log precoce e fase log/exponencial média para tardia.

[023] A fase estacionária é a fase em que o crescimento exponencial termina, já que o crescimento exponencial não pode ser mantido para sempre em uma cultura em batelada (por exemplo, um sistema fechado tal como um tubo de ensaio ou balão). O crescimento populacional é limitado por um de três fatores: 1. exaustão de nutrientes disponíveis; 2. acumulação de metabólitos ou produtos finais inibitórios; 3. exaustão do espaço, neste caso denominado de falta de "espaço biológico". Durante a fase estacionária, se as células viáveis estiverem sendo contadas, não pode ser determinado se algumas células estão morrendo e um número igual de células está se dividindo, ou se a população de células simplesmente parou de crescer e de se dividir. A fase estacionária, como a fase lag, não é necessariamente um período de repouso/imutabilidade.

As bactérias que produzem metabólitos secundários, tais como antibióticos, o fazem durante a fase estacionária do ciclo de crescimento (metabólitos secundários são definidos como metabólitos produzidos após a fase ativa de crescimento).

[024] A fase de declínio se segue à fase estacionária. Durante a fase de declínio, o número de células viáveis diminui geometricamente (exponencialmente), essencialmente o inverso do crescimento durante a fase log.

[025] Em um exemplo, em que O2 está presente na mistura de reação de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a primeira bactéria acetogênica pode estar na fase de crescimento exponencial e as outras bactérias acetogênicas podem estar em qualquer outra fase de crescimento do ciclo de vida de um microrganismo acetogênico. Em particular, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, as bactérias acetogênicas na mistura de reação podem compreender uma bactéria acetogênica em uma fase de crescimento exponencial e outra na fase estacionária. Na presença de oxigênio, sem a presença de bactérias acetogênicas em crescimento exponencial, as bactérias acetogênicas na fase estacionária podem não ser capazes de produzir acetato e/ou etanol. Este fenômeno é confirmado, pelo menos, por Brioukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan, 2013 e outros semelhantes. Os inventores descobriram assim, surpreendentemente, que na presença de bactérias acetogênicas em crescimento exponencial, as bactérias acetogênicas em qualquer fase de crescimento podem respirar e produzir aerobicamente acetato e/ou etanol em quantidades maiores ou iguais às quantidades produzidas quando a mistura de reação não tem oxigênio. Em um exemplo, as bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial podem ser capazes de remover o oxigênio livre da mistura de reação, proporcionando um ambiente adequado (sem oxigênio livre) para as bactérias acetogênicas, em qualquer fase de crescimento, metabolizarem o substrato de carbono para produzir acetato e/ou etanol.

[026] Em outro exemplo, o meio aquoso já pode compreender bactérias acetogênicas em qualquer fase de crescimento, particularmente na fase estacionária, na presença de uma fonte de carbono. Neste exemplo, pode haver oxigênio presente na fonte de carbono fornecida ao meio aquoso ou no meio aquoso em si. Na presença de oxigênio, as bactérias acetogênicas podem estar inativas e não produzir acetato elou etanol antes da adição das bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial. Neste mesmo exemplo, as bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial podem ser adicionadas ao meio aquoso. As bactérias acetogênicas inativas já existentes no meio aquoso podem, então, ser ativadas e podem começar a produzir acetato e/ou etanol.

[027] Em outro exemplo, as bactérias acetogênicas em qualquer fase de crescimento podem ser primeiramente misturadas com as bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial e, em seguida, a fonte de carbono e/ou oxigênio pode ser adicionada.

[028] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, um microrganismo na fase de crescimento exponencial na presença de oxigênio pode resultar na adaptação do microrganismo em crescer e metabolizar na presença de oxigênio. Em particular, o microrganismo pode ser capaz de remover o oxigênio do ambiente em torno dele. Esta adaptação recém-adquirida permite que as bactérias acetogênicas na fase de crescimento exponencial livrem o ambiente de oxigênio e, portanto, produzam acetato e etanol a partir da fonte de carbono. Em particular, as bactérias acetogênicas com a adaptação recém-adquirida permitem que as bactérias convertam a fonte de carbono em acetato e/ou etanol.

[029] Em um exemplo, as bactérias acetogênicas na mistura de reação de acordo com qualquer aspecto da presente impressão podem compreender uma combinação de células: células na fase log e células na fase estacionária. No método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, as células acetogênicas na fase log podem compreender uma taxa de crescimento selecionada do grupo que consiste em: 0,01 a 2 Ir1, 0,01 a 1 Ir1, 0,05 a 1 Ir1, 0,05 a 2 Ir1, 0,05 a 0,5 Ir1 e semelhantes. Em um exemplo, a Οϋθοο das células acetogênicas na fase log na mistura de reação pode ser selecionada do intervalo que consiste em 0,001 a 2, 0,01 a 2, 0,1 a 1, 0,1 a 0,5 e semelhantes. Um especialista na técnica será capaz de usar qualquer método conhecido no estado da técnica para medir a Οϋβοο e determinar a taxa de crescimento das células na mistura de reação e/ou a serem adicionadas na mistura de reação. Por exemplo, pode ser usado Koch (1994). Em particular, o crescimento bacteriano pode ser determinado e controlado usando métodos diferentes. Um dos mais comuns é uma medida da turbidez, que depende da densidade óptica (OD) de bactérias em suspensão e utiliza um espectrofotômetro. A OD pode ser medida a 600 nm usando um espectrômetro de UV.

[030] De modo a manter a concentração da primeira e segunda bactérias acetogênicas na mistura de reação, um especialista na técnica pode ser capaz de extrair uma amostra, em pontos fixos no tempo, para medir a Οϋβοο, pH, concentração de oxigênio e concentração de etanol e/ou álcoois superiores formados. O especialista na técnica seria, então, capaz de adicionar o(s) componente(s) necessário(s) para manter a concentração da primeira e segunda bactérias acetogênicas na mistura de reação e assegurar que seja mantido um ambiente ideal para a produção de etanol e/ou acetato.

[031] termo "bactérias acetogênicas", conforme utilizado aqui, se refere a um microrganismo que é capaz de realizar a via de Wood-Ljungdahl e, portanto, é capaz de converter CO, CO2 e/ou hidrogênio em acetato. Estes microrganismos incluem microrganismos que, na sua forma de tipo selvagem, não têm a via Wood-Ljungdahl, mas que adquiriram esta característica como resultado de modificação genética. Tais microrganismos incluem, mas não estão limitados a, células de E. coli. Estes microrganismos também podem ser conhecidos como bactérias carboxidotróficas. Atualmente, são conhecidos 21 gêneros diferentes de bactérias acetogênicas no estado da técnica (Drake et al., 2006) e estes também podem incluir alguns clostrídia (Drake & Kusel, 2005). Estas bactérias são capazes de utilizar o dióxido ou monóxido de carbono como uma fonte de carbono, com hidrogênio como uma fonte de energia (Wood, 1991). Além disso, também podem ser usados como fontes de carbono álcoois, aldeidos, ácidos carboxílicos, bem como numerosas hexoses (Drake et al., 2004). A via redutora que leva à formação de acetato é referida como via acetil-CoA ou via Wood-LjungdahI.

[032] Em particular, a bactéria acetogênica pode ser selecionada do grupo que consiste em Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacteríum malicum (DSM 4132), Acetobacteríum species n°. 446 (Morínaga et al., 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194), Acetobacteríum wieríngae (DSM 1911), Acetobacteríum woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950, formeríy Ruminococcus productus, formeríy Peptostreptococcus productus), Butyríbacteríum methylotrophicum (DSM 3468), Clostrídium aceticum (DSM 1496), Clostrídium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 e DSM 23693), Clostrídium carboxidivorans (DSM 15243), Clostrídium coskatii (ATCC no. PTA-10522), Clostrídium drakei (ATCC BA-623), Clostrídium formicoaceticum (DSM 92), Clostrídium glycolicum (DSM 1288), Clostrídium Ijungdahlii (DSM 13528), Clostrídium Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostrídium Ijungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Clostrídium Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989), Clostrídium mayombei (DSM 6539), Clostrídium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostrídium ragsdalei (DSM 15248), Clostrídium scatologenes (DSM 757), espécies de Clostrídium ATCC 29797 (Schmidt et ai, 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73), Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subesp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacteríum limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1 (Sakai et ai, 2004, Biotechnol. Let., Vol. 29, p. 1607-1612), Moorella thermoacetica (DSM 521, formeríy Clostrídium thermoaceticum), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440) e Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030, anteriormente Acetogenium kivui). Mais particularmente, pode ser usada a cepa ATCC BAA-624 do Clostridium carboxidivorans. Ainda mais particularmente, podem ser usadas as cepas bacterianas rotuladas de "P7” e "P11" do Clostridium carboxidivorans, conforme descrito, por exemplo, nos documentos US 2007/0275447 e US 2008/0057554.

[033] Outra bactéria particularmente adequada pode ser o Clostridium Ijungdahlii. Em particular, podem ser usadas cepas selecionadas do grupo que consiste em Clostridium Ijungdahlii PETC, Clostridium Ijungdahlii ERI2, Clostridium Ijungdahlii COL e Clostridium Ijungdahlii 0-52, na conversão de gás de síntese a ácido hexanóico. Estas cepas são descritas, por exemplo, nos documentos WO 98/00558, WO 00/68407, ATCC 49587, ATCC 55988 e ATCC 55989. A primeira e segunda bactérias acetogênicas, usadas de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, podem ser bactérias iguais ou diferentes. Por exemplo, em uma mistura de reação a primeira bactéria acetogênica pode ser o Clostridium Ijungdahlii na fase log e a segunda bactéria acetogênica pode ser o Clostridium Ijungdahlii na fase estacionária. Em outro exemplo, a primeira bactéria acetogênica na mistura de reação pode ser o Clostridium Ijungdahlii na fase log e a segunda bactéria acetogênica pode ser O Clostridium carboxidivorans na fase estacionária. Em outro exemplo, a bactéria acetogênica selecionada para o primeiro organismo pode ser o Clostridium autoethanogenum.

[034] Oxigênio pode estar presente na mistura de reação de acordo com qualquer aspecto da presente invenção. É vantajoso incorporar O2 na mistura de reação e/ou no fluxo de gás sendo fornecido à mistura de reação, já que a maioria dos gases residuais, incluindo gás de síntese, compreende oxigênio em quantidades pequenas ou grandes. É difícil e caro remover este oxigênio antes do uso do gás de síntese como uma fonte de carbono para a produção de álcoois superiores. O método, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, permite a produção de pelo menos um álcool superior sem a necessidade de primeiro remover qualquer traço de oxigênio da fonte de carbono. Isto permite economia de tempo e dinheiro.

[035] Mais em particular, a concentração de O2 no fluxo de gás pode ser inferior a 1 % em volume da quantidade total de gás no fluxo de gás. Em particular, o oxigênio pode estar presente em uma faixa de concentração de 0,000005 a 2 % em volume, 0,00005 a 2 % em volume, 0,0005 a 2 % em volume, 0,005 a 2 % em volume, 0,05 a 2 % em volume, 0,00005 a 1,5 % em volume, 0,0005 a 1,5 % em volume, 0,005 a 1,5 % em volume, 0,05 a 1,5 % em volume, 0,5 a 1,5 % em volume, 0,00005 a 1 % em volume, 0,0005 a 1 % em volume , 0,005 a 1% em volume, 0,05 a 1 % em volume, 0,5 a 1 % em volume, 0,55 a 1 % em volume, 0,60 a 1 % em volume, particularmente na faixa de 0,60 a 1,5 %, 0,65 a 1 % e 0,70 a 1 % em volume. Em particular, o microrganismo acetogênico é particularmente adequado quando a proporção de O2 na fase/fluxo gasoso é de cerca de 0,00005, 0,0005, 0,005, 0,05, 0,15, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2 % em volume, em relação ao volume de gás no fluxo de gás. Um especialista na técnica será capaz de usar qualquer um dos métodos conhecidos no estado da técnica para medir a concentração de oxigênio em volume no fluxo de gás. Em particular, o volume de oxigênio pode ser medido utilizando qualquer método conhecido no estado da técnica. Em um exemplo, a concentração de oxigênio em fase gasosa pode ser medida por uma sonda de imersão para detecção de oxigênio da PreSens Precision Sensing GmbH. A concentração de oxigênio pode ser medida por desativação de fluorescência, em que o grau de desativação se correlaciona com a pressão parcial de oxigênio na fase gasosa. Ainda mais em particular, o primeiro e segundo microrganismos, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, são capazes de trabalhar de forma idea! no meio aquoso quando o oxigênio é fornecido por um fluxo de gás com concentração de oxigênio inferior a 1 % em volume do total de gás, de cerca de 0,015 % em volume do volume total de gás no fluxo de gás fornecido à mistura de reação.

[036] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, as condições aeróbicas em que a fonte de carbono é convertida em etanol e/ou acetato na mistura de reação se refere ao gás circundante à mistura de reação. O gás pode compreender, pelo menos, 1 % de oxigênio em volume do total de gás e outros gases, incluindo fontes de carbono, tais como CO, CO2 e similares.

[037] meio aquoso, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode compreender oxigênio. O oxigênio pode ser dissolvido no meio por quaisquer meios conhecidos no estado da técnica. Em particular, o oxigênio pode estar presente a 0,5 mg/l, na ausência de células. Em particular, a concentração de oxigênio livre dissolvido no meio aquoso pode ser de, pelo menos, 0,01 mg/l. Em outro exemplo, o oxigênio dissolvido pode ser cerca de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 mg/l. Em particular, a concentração de oxigênio dissolvido pode ser de 0,01 a 0,5 mg/l, 0.01 a 0,4 mg/l, 0,01 a 0,3 mg/l, 0,01 a 0,1 mg/l. Em particular, o oxigênio pode ser fornecido ao meio aquoso em um fluxo contínuo de gás. Mais em particular, o meio aquoso pode compreender oxigênio e uma fonte de carbono compreendendo CO e/ou CO2. Mais em particular, o oxigênio e uma fonte de carbono compreendendo CO e/ou C02 são fornecidos ao meio aquoso em um fluxo contínuo de gás. Ainda mais em particular, o fluxo contínuo de gás compreende gás de síntese e oxigênio. Em um exemplo, ambos os gases são parte do mesmo fluxo/corrente. Em outro exemplo, cada gás é um fluxo/corrente separado fornecido ao meio aquoso. Estes gases podem ser divididos, por exemplo, usando bicos separados que se abrem para dentro do meio aquoso, fritas, membranas no interior do tubo de fornecimento do gás para o meio aquoso e semelhantes. O oxigênio pode ser oxigênio livre. De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, "uma mistura de reação compreendendo oxigênio livre" se refere à mistura de reação compreendendo oxigênio elementar na forma de O2. Ο O2 pode ser oxigênio dissolvido na mistura de reação. Em particular, o oxigênio dissolvido pode estar na concentração de > 5ppm (0,000005 % vol; 5x10'6). Um especialista na técnica será capaz de utilizar qualquer método conhecido no estado da técnica para medir a concentração de oxigênio dissolvido. Em um exemplo, o oxigênio dissolvido pode ser medido por sondas de imersão para oxigênio (do tipo PSt6 da PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Alemanha).

[038] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a mistura de reação compreende, adicionalmente, [039] um terceiro microrganismo capaz realizar a via de fermentação etanol-carboxilato e a conversão de acetato e/ou etanol para formar um ácido; e [040] em que o primeiro e/ou segundo microrganismo acetogênico é capaz de converter o ácido a um álcool superior correspondente.

[041] Em um exemplo, as bactérias acetogênicas podem ser usadas em conjunto com um segundo microrganismo que pode ser capaz de realizar a via de fermentação etanol-carboxilato. Em um exemplo, ambas a primeira e segunda bactérias acetogênicas e um terceiro microrganismo, que pode ser capaz de realizar a via de fermentação etanol-carboxilato, podem ser usados para produzir um ácido superior a partir da fonte de carbono. O ácido pode, em seguida, ser convertido ao álcool superior correspondente, selecionado do grupo que consiste em butanol, pentanol, hexanol, octanol, nonanol, decanol e semelhantes. Em um exemplo, o álcool superior pode ser selecionado do grupo que consiste em 1-butanol, 2-metil-1-butanol, isobutanol, 3-metil-1-butanol, 1-hexanol, 1-octanol, 1-pentanol, 1-heptanol, 3-metil-1-pentanol, 4-metil-1-hexanol, 5-metil-1-heptanol, 4-metil-1-pentanol, 5-metil-1-hexanol, 6-metil-1-heptanol e as suas combinações.

[042] Em um exemplo, o etanol e/ou acetato podem ser convertidos no ácido superior correspondente, na presença do terceiro microrganismo capaz de realizar a via de fermentação etanol-carboxilato. A via de fermentação etanol-carboxilato é descrita em detalhes, pelo menos, em Seedorf, H., et al., 2008. Em particular, o terceiro organismo pode ser selecionado do grupo que consiste em Clostrídium kluyveri, C. Carboxidivorans e semelhantes. Estes terceiros microrganismos incluem microrganismos que, na sua forma de tipo selvagem, não têm uma via de fermentação etanol-carboxilato, mas que adquiriram esta característica como resultado de modificação genética. Em particular, o terceiro microrganismo pode ser Clostrídium kluyveri.

[043] Em outro exemplo, o terceiro microrganismo pode ser um organismo do tipo selvagem que expressa pelo menos uma enzima selecionada do grupo que consiste em Ei a Eu, em que Ei é uma álcool desidrogenase (adh), E2 é uma acetaldeído desidrogenase (ald), E3 é uma acetoacetil-CoA tiolase (thl), E4 é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (hbd), Es é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidratase (crt), Εβ é uma butiril-CoA desidrogenase (bcd), E7 é uma subunidade de transferência de elétron da flavoproteína (etf), Es é uma coenzima A transferase (cat), Eg é uma acetato quinase (ack), E10 é uma fosfotransacetilase (pta) e Eu é uma transhidrogenase. Em particular, o terceiro microrganismo do tipo selvagem, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode expressar, pelo menos, E2, E3 e E4. Ainda mais em particular, o terceiro microrganismo do tipo selvagem, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode expressar, pelo menos, E4.

[044] Em outro exemplo, o terceiro microrganismo, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser um organismo geneticamente modificado que tem a expressão de pelo menos uma enzima selecionada dentre E1 a Eu aumentada, em relação ao microrganismo de tipo selvagem, em que E1 é uma álcool desidrogenase (adh), E2 é uma acetaldeído desidrogenase (ald), E3 é uma acetoacetil-CoA tiolase (thl), E4 é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (hbd), Es é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidratase (crt), Ee é uma butiril-CoA desidrogenase (bcd), E4 é uma subunidade de transferência de elétron da flavoproteína (etf), Es é uma coenzima A transferase (cat), Eg é uma acetato quinase (ack), E10 é uma fosfotransacetilase (pta) e Eu é uma transhidrogenase. Em particular, o terceiro microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode expressar, pelo menos, E2, E3 e E4. Ainda mais em particular, o terceiro microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode expressar, pelo menos, E4. As enzimas E1 a Eu podem ser isoladas a partir de Clostrídium kluyveri. Um especialista na técnica será capaz de medir a atividade de cada uma destas enzimas, usando métodos conhecidos no estado da técnica. Em particular, a atividade das enzimas E1 e E2 pode ser medida usando os ensaios ensinados em, pelo menos, Hillmer P., 1972, Lurz R., 1979; a atividade da enzima E2 também pode ser medida usando o ensaio ensinado em Smith L. T, 1980; a atividade das enzimas E3 e E4pode ser medida usando os ensaios ensinados em, pelo menos, Sliwkowski M.X., 1984; a atividade de E4 também pode ser medida usando o ensaio ensinado em Madan, V.K., 1972; a atividade de E5 também pode ser medida usando o ensaio ensinado em Bartsch, R.G., 1961; a atividade das enzimas Εβ e E7 pode ser medida usando o ensaio ensinado em Li, F., 2008; a atividade de E7 também pode ser medida utilizando o ensaio ensinado em Chowdhury, 2013; a atividade de Es pode ser medida usando o ensaio ensinado em Stadman, 1953; a atividade de Eg pode ser medida usando o ensaio ensinado em Winzer, K., 1997; a atividade de E10 pode ser medida usando o ensaio ensinado em Smith L.T., 1976; e a atividade de Eu pode ser medida usando o ensaio ensinado em Wang S., 2,010.

[045] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, o primeiro, segundo e/ou terceiro microrganismo pode ser um microrganismo geneticamente modificado. Uma célula ou microrganismo geneticamente modificado pode ser geneticamente diferente da célula ou microrganismo de tipo selvagem. A diferença genética entre o microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, e o microrganismo de tipo selvagem pode estar na presença de um gene completo, aminoácido, nucleotídeo etc. no microrganismo geneticamente modificado, que pode estar ausente no microrganismo de tipo selvagem. Em um exemplo, o microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode compreender enzimas que permitem que o microrganismo produza pelo menos um ácido carboxílico. O microrganismo de tipo selvagem, em relação ao microrganismo geneticamente modificado, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode não ter nenhuma atividade ou nenhuma atividade detectável das enzimas que permitem que o microrganismo geneticamente modificado produza pelo menos um ácido carboxílico. Conforme utilizado aqui, o termo "microrganismo geneticamente modificado" pode ser utilizado alternadamente com o termo "célula geneticamente modificada". A modificação genética, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser realizada na célula do microrganismo.

[046] A frase "de tipo selvagem", conforme utilizada aqui em conjunto com uma célula ou microrganismo, pode denotar uma célula com um genoma manipulado, que está em uma forma presente naturalmente na natureza. O termo pode ser aplicável tanto para toda a célula como para genes individuais. O termo "de tipo selvagem", por conseguinte, não inclui tais células ou tais genes onde as sequências de genes foram alteradas, pelo menos parcialmente, pelo homem, usando métodos recombinantes.

[047] Um especialista na técnica será capaz de usar qualquer método conhecido no estado da técnica para modificar geneticamente uma célula ou um microrganismo. De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a célula geneticamente modificada pode ser geneticamente modificada de modo que, em um intervalo de tempo definido, em 2 horas, em particular, em 8 horas ou 24 horas, ela produza, pelo menos, duas vezes, especialmente, pelo menos, 10 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1.000 vezes ou pelo menos 10.000 vezes mais ácido carboxílico e/ou o respectivo éster de ácido carboxílico, do que a célula de tipo selvagem. O aumento na formação do produto pode ser determinado, por exemplo, cultivando a célula de acordo com qualquer aspecto da presente invenção e a célula de tipo selvagem, cada uma, separadamente, nas mesmas condições (mesma densidade celular, mesmo meio nutriente, mesmas condições de cultura), durante um intervalo de tempo especificado, em um meio nutriente apropriado e, em seguida, determinando a quantidade de produto alvo (ácido carboxílico) no meio nutriente.

[048] Em outro exemplo, um ácido pode ser produzido a partir da fonte de carbono por qualquer método descrito em Steinbusch, 2011, Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen, M.C.A.A., 2013, Ding H. et al, 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B.T., et al., 1948 e outros semelhantes. Ainda mais em particular, o ácido pode ser produzido a partir da fonte de carbono na presença de, pelo menos, Clostridium kluyveri.

[049] Ainda mais em particular, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, o ácido é produzido na presença de pelo menos um microrganismo acetogênico em duas fases de crescimento diferentes e de Clostridium kluyveri. Em um exemplo, o microrganismo acetogênico pode ser Clostridium Ijungdahlii ou Clostridium ragsdahlei. O ácido recém-formado pode ser convertido a um álcool superior correspondente na presença de álcool. O terceiro microrganismo, selecionado do grupo que consiste em Clostridium kluyveri e C. carboxidivorans, pode converter o acetato e/ou etanol para formar o ácido recém-formado. Conforme mencionado anteriormente, é vantajoso que este processo seja realizado na presença de O2 (ou seja, incluir O2 na mistura de reação), já que a maioria dos gases residuais, incluindo gás de síntese, compreende oxigênio em quantidades pequenas ou grandes. Esta mistura de reação permite um método de produção de álcoois superiores a partir de gases residuais, sem que seja necessária a etapa adicional cara de extração do oxigênio primeiro.

[050] A mistura de reação pode compreender os dois/três microrganismos em uma mistura homogênea. O termo "mistura homogênea", conforme utilizado aqui, se refere a uma mistura dos microrganismos distribuída espacialmente de maneira uniforme em um meio. Em particular, a mistura pode compreender, pelo menos, dois microrganismos, os dois microrganismos acetogênicos em diferentes fases de crescimento distribuídos uniformemente em um meio aquoso. Em um exemplo, pode haver um número aproximadamente igual dos dois microrganismos na mistura. Em outro exemplo, pode haver mais do microrganismo acetogênico na fase estacionária, em comparação ao microrganismo acetogênico na fase log, na mistura. Ainda em outro exemplo, pode haver mais do microrganismo acetogênico na fase log, em comparação ao microrganismo acetogênico na fase estacionária, na mistura. Em todos os exemplos possíveis, os microrganismos estão em uma única mistura homogênea, onde eles estão uniformemente distribuídos por toda a mistura. O "meio aquoso", conforme utilizado aqui, pode ser usado utilizado alternadamente com o termo "mistura de reação".

[051] termo "acetato", conforme utilizado aqui, se refere tanto ao ácido acético como a seus sais inevitavelmente resultantes, porque, conforme conhecido no estado da técnica, uma vez que os microrganismos trabalham em um ambiente aquoso, sempre existe um equilíbrio entre o sal e ácido presentes.

[052] termo "segundo microrganismo" ou "terceiro microrganismo" se refere a um microrganismo que é diferente do "primeiro microrganismo", de acordo com qualquer aspecto da presente invenção.

[053] Em um exemplo, o primeiro e segundo microrganismos podem estar presentes em um primeiro fermentador e o terceiro microrganismo em um segundo fermentador. No fermentador 1, o primeiro e segundo microrganismos entram em contato com a fonte de carbono para a produção de acetato e/ou etanol. Etanol e/ou acetato podem, então, ser colocados em contato com um terceiro microrganismo no fermentador 2, para produzir pelo menos um ácido. O ácido pode, em seguida, ser alimentado de volta para o fermentador 1, para produzir pelo menos um álcool. Pode ser criado um ciclo em que o acetato e/ou etanol produzidos no fermentador 1 podem ser alimentados regularmente ao fermentador 2, o acetato e/ou etanol no fermentador 2 podem ser convertidos em pelo menos um ácido e o ácido no fermentador 2 realimentado ao fermentador 1.

[054] Da mesma forma, no fermentador 1, o primeiro e segundo microrganismos podem entrar em contato com a fonte de carbono compreendendo CO, para produzir acetato e/ou etanol. O etanol e/ou acetato podem, então, ser colocados em contato com um terceiro microrganismo no fermentador 2, para produzir pelo menos um ácido. O ácido pode ser, então, opcionalmente extraído e alimentado de volta ao fermentador 1, para conversão do ácido no álcool superior desejado. Pode ser criado um ciclo em que o acetato e/ou etanol produzidos no fermentador 1 podem ser alimentados regularmente ao fermentador 2, o acetato e/ou etanol no fermentador 2 podem ser convertidos em pelo menos um ácido e o ácido no fermentador 2 realimentado ao fermentador 1. O CO alimentado ao fermentador 1 pode ser transferido para o fermentador 2, juntamente com o acetato e/ou etanol. Pode não ser necessário nenhum método de extração especial, já que foi descoberto que o terceiro microrganismo, surpreendentemente, pode converter acetato e/ou etanol em pelo menos um ácido, na presença de CO.

[055] Em outro exemplo, o meio é reciclado entre os fermentadores 1 e 2. Portanto, o etanol e/ou acetato produzidos no fermentador 1 podem ser alimentados ao fermentador 2 e o ácido produzido no fermentador 2 pode ser realimentado ao fermentador 1. No processo de reciclagem do meio, o CO do fermentador 1 pode ser introduzido no fermentador 2. Além disso, os ácidos produzidos no fermentador 2 podem ser, consequentemente, reintroduzidos no fermentador 1. O terceiro microrganismo no fermentador 2 pode ser capaz de continuar a produzir ácidos a partir de acetato e etanol na presença do CO reciclado do fermentador 1 para o fermentador 2. Os álcoois acumulados nos fermentadores 1 e 2 podem, então, ser extraídos por métodos conhecidos no estado da técnica.

[056] Em outro exemplo, pode haver três recipientes presentes para a realização do método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção. O primeiro e segundo microrganismos podem estar presentes em um primeiro fermentador, o terceiro microrganismo em um segundo fermentador e um terceiro fermentador com o primeiro e segundo microrganismos. No fermentador 1, o primeiro e segundo microrganismos entram em contato com a fonte de carbono para produzir acetato e/ou etanol. Etanol e/ou acetato podem, então, ser colocados em contato com um terceiro microrganismo no fermentador 2, para produzir pelo menos um ácido. O ácido pode, em seguida, ser alimentado ao fermentador 3 para produzir pelo menos um álcool.

[057] Pode ser utilizada uma combinação de bactérias na produção de ácido e/ou álcool superior a partir da fonte de carbono. Pode haver mais de uma bactéria acetogênica presente em combinação com um ou mais terceiros microrganismos. Em outro exemplo, pode haver mais de um tipo de bactéria acetogênica presente e apenas um tipo de terceiro microrganismo. Em ainda outro exemplo, pode haver mais de um terceiro microrganismo presente em combinação com uma única bactéria acetogênica.

[058] termo "cerca de", conforme utilizado aqui, se refere a uma variação na faixa de 20 por cento. Em particular, o termo "cerca de", conforme utilizado aqui, se refere a +/- 20 %, mais em particular, +/- 10 %, ainda mais em particular, +/- 5 % de uma dada medida ou valor.

[059] Todas as percentagens (%) são, salvo indicação em contrário, percentagem em volume.

[060] A fonte de carbono, usada de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, compreende dióxido de carbono e/ou monóxido de carbono. Um especialista na técnica entende que existem muitas fontes possíveis para a provisão de CO e/ou CO2 como fonte de carbono. Pode ser visto que, na prática, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser usado como fonte de carbono, qualquer gás ou mistura de gases capazes de fornecer aos microrganismos uma quantidade suficiente de carbono, de modo que o acetato e/ou etanol possam ser formados a partir da fonte de CO e/ou CO2.

[061] Geralmente, para a cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a fonte de carbono compreende, pelo menos, 50 % em volume, pelo menos, 70 % em volume, particularmente, pelo menos, 90 % em volume de CO e/ou CO2, em que as percentagens por volume - % se referem a todas as fontes de carbono que estão disponíveis para o primeiro microrganismo na cultura mista.

[062] Na cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser proporcionado o material fonte de carbono. Exemplos de fontes de carbono em forma gasosa incluem gases de escape, tal como gás de síntese, gases de combustão e gases de refinaria de petróleo produzidos pela fermentação por levedura ou fermentação por Clostridium. Estes gases de escape são formados a partir da gaseificação de materiais que contêm celulose, ou da gaseificação do carvão. Em um exemplo, estes gases de escape podem não necessariamente ser produzidos como subprodutos de outros processos, mas podem ser produzidos, especificamente, para uso com a cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção.

[063] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a fonte de carbono pode ser o gás de síntese. O gás de síntese pode, por exemplo, ser produzido como um subproduto da gaseificação do carvão. Consequentemente, o microrganismo da cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser capaz de converter uma substância, que é um produto residual, em um recurso valioso. Em outro exemplo, o gás de síntese pode ser um subproduto da gaseificação de matérias-primas agrícolas de baixo custo e amplamente disponíveis para uso com a cultura mista da presente invenção, para produzir, pelo menos, etanol e/ou um álcool superior.

[064] Existem numerosos exemplos de matérias-primas que podem ser convertidas em gás de síntese, visto que quase todas as formas de vegetação podem ser utilizadas para este fim. Em particular, as matérias-primas são selecionadas do grupo que consiste em espécies perenes, tais como miscanthus, resíduos de milho, resíduos de processamento, tal como serragem e semelhantes.

[065] Em geral, o gás de síntese pode ser obtido em um aparelho de gaseificação de biomassa seca, principalmente por meio de pirólise, oxidação parcial e reforma a vapor, em que os produtos primários do gás de síntese são CO, H2 e CO2. O gás de síntese também pode ser um produto da eletrólise de CO2. Um especialista na técnica compreenderá as condições adequadas para realizar a eletrólise do CO2 para produzir gás de síntese compreendendo CO em uma quantidade desejada.

[066] Geralmente, uma porção do gás de síntese obtido do processo de gaseificação é primeiramente processado, de modo a otimizar os rendimentos do produto e para evitar a formação de alcatrão. O craqueamento do alcatrão indesejado e CO no gás de síntese podem ser realizados usando cal e/ou dolomita. Estes processos são descritos em detalhe, por exemplo, em Reed, 1981.

[067] Misturas de fontes podem ser usadas como uma fonte de carbono.

[068] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode ser fornecido um agente redutor, por exemplo, hidrogênio, em conjunto com a fonte de carbono. Em particular, este hidrogênio pode ser fornecido quando o C e/ou CO2 é fornecido e/ou usado. Em um exemplo, o hidrogênio gás é parte do gás de síntese, presente de acordo com qualquer aspecto da presente invenção. Em outro exemplo, onde o hidrogênio gás no gás de síntese é insuficiente para o método da presente invenção, pode ser fornecido hidrogênio gás adicional.

[069] Um especialista na técnica compreenderá as outras condições necessárias para realizar o método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção. Em particular, as condições no recipiente (p. ex,, fermentador) podem ser variadas, dependendo do primeiro e segundo microrganismos usados. As variações das condições para serem adequadas ao funcionamento ideal dos microrganismos são conhecidas por um especialista na técnica.

[070] Em um exemplo, o método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção pode ser realizado em um meio aquoso com pH entre 5 e 8, 5,5 e 7. A pressão pode estar entre 1 e 10 bar.

[071] Uma vantagem da presente invenção pode ser que podem ser usadas misturas muito mais favoráveis de CO2/CO de matérias-primas. Estas diversas fontes incluem gás natural, biogás, carvão, petróleo, resíduos vegetais e semelhantes. Outra vantagem do método pode ser o rendimento elevado de carbono. Isto é possível pelo retorno do CO2 formado. Nomeadamente, o CO2 pode ser novamente reagido na primeira etapa para formar ácido acético.

[072] Outra vantagem pode estar na maior flexibilidade com relação às condições de fermentação usadas, já que qualquer bactéria acetogênica e qualquer microrganismo capaz de realizar a via de fermentação etanol-carboxilato podem ser usados em combinação, para a produção efetiva de álcoois superiores. Outra vantagem da presente invenção pode ser que, visto que o terceiro microrganismo pode funcionar e/ou produzir um ácido a partir do acetato e/ou etanol na presença de CO, ambos o primeiro, segundo e terceiro microrganismos podem estar presentes em uma mistura homogênea, para a produção de álcoois superiores a partir de uma fonte de carbono compreendendo CO. Esta característica do terceiro microrganismo permite que a produção de álcoois superiores a partir de uma fonte de carbono como CO seja um processo de uma etapa, tornando o processo mais eficiente e o rendimento maior. Surpreendentemente, devido a esta vantagem do terceiro microrganismo, o procedimento em uma etapa para preparar álcoois superiores pode ser realizado em um único fermentador, sem uma etapa de separação intermediária. Também pode haver um aumento da concentração do produto final usando este procedimento de uma etapa. Isto é surpreendente, já que tanto Baffert C,, 2011 e Thauer, RK, 1973 ensinam que hidrogenases são inibidas na presença de CO. Por este motivo e mais, o documento WO2013/167663 compreende uma etapa de separação entre (a) uma etapa de formação de acetato e/ou etanol a partir de CO e/ou CO2 na presença de um organismo acetogênico e (b) uma etapa de formação de um hidrocarboneto compreendendo pelo menos um átomo de oxigênio (p. ex., ácido hexanóico), na presença de um segundo microrganismo. A capacidade para produzir um álcool, em particular um que compreende, pelo menos, 6 átomos de carbono, em uma síntese de etapa única a partir de CO, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção é, portanto, um resultado surpreendente. Em qualquer caso, mesmo que as etapas (a) e (b) sejam realizadas em duas etapas separadas (isto é, dois recipientes separados), pode não haver a necessidade de qualquer método de extração específico para remover todos os vestígios de CO, para que ambos o primeiro e terceiro microrganismo funcionem.

[073] Como pode ser visto nos exemplos, a presença de CO permite que sejam produzidos, pelo menos, butanol e hexanol no método de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, em que a fonte de carbono compreende, pelo menos, CO.

[074] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a fonte de carbono compreende CO. A fonte de carbono compreendendo CO pode ser convertida em pelo menos um ácido na presença de, pelo menos, o primeiro e segundo microrganismos acetogênicos e um terceiro microrganismo capaz de realizar a via de fermentação etanol-carboxilato em condições aeróbicas. Em particular, o ácido pode compreender 4 ou mais átomos de carbono. Mais em particular, o ácido formado pode ser selecionado do grupo que consiste em ácido butanoico, ácido pentanoico, ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido octanoico, ácido nonanoico, ácido decanóico e semelhantes. Em particular, a fonte de carbono compreendendo CO, na presença da primeira e segunda bactérias acetogênicas, pode resultar na produção de etanol e/ou ácido acético.

[075] Em particular, o CO pode ser fornecido ao meio aquoso em um fluxo contínuo de gás. O CO no fluxo de gás pode estar presente em uma concentração de, pelo menos, 2 % em volume do volume da quantidade total de gás no fluxo de gás. Em particular, o CO pode estar presente em uma faixa de concentração de 2 a 99 % em volume, em uma faixa de 2 a 95 % em volume, 5 a 95 % em volume, 10 a 90 % em volume, 15 a 85% em de volume, em particular na faixa de 20 a 80 % em volume. Mais em particular, a concentração de CO pode ser de cerca de 24 % em volume. A concentração de monóxido de carbono na fase gasosa da fonte de carbono pode ser medida usando pelo menos um cromatógrafo a gás GC 6890N da Agilent Technologies Inc., com um detector de condutividade térmica.

[076] Em particular, o meio aquoso pode compreender uma fonte de carbono que compreende CO e/ou CO2. Mais em particular, a fonte de carbono compreendendo CO e/ou CO2 é fornecida ao meio aquoso em um fluxo contínuo de gás. Ainda mais em particular, o fluxo contínuo de gás compreende gás de síntese. Em um exemplo, os gases são parte do mesmo fluxo/corrente. Em outro exemplo, cada gás é um fluxo/corrente separado fornecido ao meio aquoso. Estes gases podem ser divididos, por exemplo, usando bicos separados que se abrem para dentro do meio aquoso, fritas, membranas no interior do tubo de fornecimento do gás para o meio aquoso e semelhantes.

[077] Em um exemplo de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, a fonte de carbono é o gás de síntese e a fonte de carbono pode ser misturada com o oxigênio gasoso antes de ser fornecida ao meio aquoso. Este etapa de mistura pode melhorar a eficiência e a produção de álcoois superiores na reação. A eficiência global, produtividade de álcool e/ou captura geral de carbono do método da presente invenção pode ser dependente da estequiometria do CO2, CO, H2 e O2 no fluxo contínuo de gás. O fluxo contínuo de gás usado pode ser composto de O2, CO2 e H2. Em particular, no fluxo contínuo de gás, a faixa de concentração de O2 pode ser de 0,000005 % a 1 % em volume, de CO/CO2 de cerca de 10 a 50 %, em particular 33 % em volume e de H2 pode estar na faixa de 44 % a 84 %, em particular, 64 a 66,04 % em volume. Mais em particular, a concentração dos gases no fluxo contínuo de gás pode ser de 0,15 % em volume de O2, 32 % em volume de CO/CO2 e 64 % em volume de H2. Em outro exemplo, o fluxo contínuo de gás também pode incluir gases inertes, como N2, em uma concentração de N2 de até 50 % em volume.

[078] Um especialista na técnica compreenderá que pode ser necessário monitorar a composição e as vazões das correntes em intervalos relevantes. O controle da composição da corrente pode ser obtido através da variação das proporções das correntes constituintes, para atingir um alvo ou uma composição desejável. A composição e a vazão da corrente combinada podem ser monitoradas por qualquer meio conhecido no estado da técnica. Em um exemplo, o sistema está adaptado para monitorar continuamente as vazões e as composições de, pelo menos, duas correntes e combiná-las para produzir uma única corrente de substrato misturado, em um fluxo contínuo de gás com composição ideal e meios para fazer passar o fluxo de substrato ideal na cultura mista, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção.

[079] Em particular, a mistura de reação, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção (isto é, a mistura do primeiro microrganismo - o organismo acetogênico na fase log, do segundo microrganismo - o organismo acetogênico na fase estacionária, da fonte de carbono na presença de oxigênio), pode ser usada em qualquer biorreator ou fermentador conhecido, para a realização de qualquer aspecto da presente invenção. A mistura de reação pode compreender, ainda, um terceiro microrganismo, para resultar em álcoois superiores sendo produzidos no fermentador.

[080] "Álcoois superiores", conforme utilizado aqui, se refere a álcoois que contêm 4 a 10 átomos de carbono e que podem ser um pouco viscosos, ou oleosos e têm odores frutados mais fortes. Álcoois superiores podem incluir, mas não estão limitados a, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol e semelhantes. Mais em particular, o álcool superior pode ser selecionado do grupo que consiste em 1-butanol, 2-metil-1 -butanol, isobutanol, 3-metil-1 -butanol, 1-hexanol, 1-octanol, 1-pentanol, 1-heptanol, 3-metil-1-pentanol, 4-metil-1 -hexanol, 5-metil-1 -heptanol, 4-metil-1 -pentanol, 5-metil-1-hexanol, 6-metil-1-heptanol e as suas combinações.

[081] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, o "álcool superior correspondente" se refere a um álcool com o mesmo número de átomos de carbono que o do ácido a partir do qual o álcool superior correspondente é formado. Por exemplo, o ácido butanoico pode ser convertido para o álcool correspondente - butanol; ácido hexanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - hexanol; ácido heptanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - heptanol; ácido octanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - octanol; ácido nonanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - nonanol; ácido decanoico pode ser convertido ao álcool correspondente - decanol e semelhantes, [082] método, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, pode compreender ainda a etapa de extração do álcool superior produzido. Um especialista na técnica saberá os meios para fazer isso, com base nos métodos conhecidos no estado da técnica.

[083] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para a produção de etanol e/ou acetato a partir de uma fonte de carbono em condições aeróbicas, o método compreendendo: [084] contatar uma mistura de reação compreendendo [085] um primeiro microrganismo acetogênico em uma fase de crescimento exponenciai;

[086] oxigênio livre; e [087] um segundo microrganismo acetogênico em uma fase estacionária [088] em que o primeiro e segundo microrganismos acetogênicos são capazes de converter a fonte de carbono a acetato e/ou etanol.

[089] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de produção de pelo menos um álcool superior a partir de uma fonte de carbono em condições aeróbicas, o método compreendendo [090] contatar uma mistura de reação, de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, com uma fonte de carbono em condições aeróbicas.

[091] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[092] Não há figuras.

[093] EXEMPLOS

[094] texto acima descreve formas de realização preferidas, as quais, conforme será entendido por especialistas na técnica, podem estar sujeitas a variações ou modificações na concepção, construção e operação, sem se afastarem do escopo das reivindicações. Estas variações, por exemplo, se destinam a ser abrangidas pelo escopo das reivindicações.

[095] Exemplo 1 [096] Produção de acetato e etanol com Clostridium Ijungdahlii a partir de gás de síntese sem oxigênio [097] Neste exemplo, C. Ijungdahlii foi cultivado anaerobicamente em meio complexo com gás de síntese consistindo em H2 e CO2, na ausência de oxigênio, de modo a produzir de acetato e etanol. Para a cultura celular do C. Ijungdahlii, 2 ml de crio cultura foram cultivados anaerobicamente em 200 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCI, 1 g/l deNH4CI, 0,1 g/l de KCI, 0,1 g/l de KH2PO4, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H2O; 0,02 g/l de CaCI2 * 2 H2O; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnS04 x H2O; 8 mg/l de (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H2O; 2 mg/l de C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/l de ZnS04 x 7 H2O; 0,2 mg/l de CuCI2 x 2 H2O; 0,2 mg/l de Na2Mo04 x 2 H20; 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20; 0,2 mg/l de Na2Se04; 0,2 mg/l de Na2W04 x 2 H20; 20 pg/l de d-biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 g/l de piridoxina-HCI, 50 pg/L tiamina-HCI x H2O; 50 pg/l de riboflavina; 50 pg/I de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-pantotenato; 1 pg/l de vitamina B12; 50 pg/l de p-aminobenzoato; 50 pg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H20. O cultivo foi realizado de forma quimilitoautotrófica em um frasco de vidro à prova de chamas de 1 I, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e uma fumigação de 1-3 l/h durante 161 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, montado no centro do reator em um tubo de gaseificação. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente.

[098] Para a pré-cultura, muitas células lavadas da cultura de crescimento de C. Ijungdahlii foram transferidas para 200 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma Οϋβοο de 0,12. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 500 ml resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 3 l/h durante 65 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de tampão de produção (pH 6,2; 0,5 g/l de KOH, areado durante 1 h com uma mistura gasosa pré-misturada de 67 % de H2, 33 % de CO2 a 1 l/h), lavadas e centrifugadas novamente .

[099] Para a pré-cultura, muitas células lavadas da cultura de crescimento de C. Ijungdahlii foram transferidas para 200 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma Οϋβοο de 0,12. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 500 ml resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 3 l/h durante 118 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. Quando o pH caiu abaixo de 5,0, foi adicionado 1 ml de uma solução a 140 g/l de KOH. Ao coletar as amostras, cada amostra de 5 ml foi removida para determinação da OD600, pH e da faixa de produtos. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP).

[100] Durante o período de cultura de 118 horas, a densidade celular na cultura de produção permaneceu constante, reconhecível por uma Οϋβοο de 0,2 estagnada, que corresponde a uma taxa de crescimento de μ = 0 hr1. Ao mesmo tempo, a concentração de acetato aumentou significativamente de 4 mg/l para 3194 mg/l e a concentração de etanol de 17 mg/l para 108 mg/l.

[101] Exemplo 2 [102] Nenhuma produção de acetato e etanol com Clostridium Ijungdahlii a partir de gás de síntese compreendendo CO2 e H2 com oxigênio [103] C. Ijungdahlii foi cultivado em meio complexo com gás de síntese e oxigênio. C. Ijungdahlii foi cultivado, primeiramente, na presença de gás de síntese consistindo em H2 e CO2 na ausência de oxigênio, de modo a produzir de acetato e etanol. Para o cultivo, as células foram cultivadas em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma tampa de borracha de butila. Todas as etapas nas quais as células de C. Ijungdahlii estavam envolvidas foram realizadas em condições anaeróbicas.

[104] Para a cultura celular do C. Ijungdahlii, 2 ml de crio cultura foram cultivados anaerobicamente em 200 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCI, 1 g/l deNH4CI, 0,1 g/l de KCI, 0,1 g/l de KH2PO4, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H2O; 0,02 g/l de CaCI2 * 2 H2O; 20 mg/l de ácido nitriiotriacético,10 mg/l de MnS04 x H20; 8 mg/l de (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H2O; 2 mg/l de C0CI2 x 6 H20; 2 mg/l de ZnS04 x 7 H20; 0,2 mg/l de CuCI2 x 2 H20; 0,2 mg/l de Na2Mo04 x 2 H2O; 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20; 0,2 mg/l de Na2Se04; 0,2 mg/l de Na2W04 x 2 H20; 20 pg/l de d-biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 g/l de piridoxina-HCI, 50 pg/L tiamina-HCI x H20; 50 pg/l de riboflavina; 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-pantotenato; 1 pg/l de vitamina B12; 50 pg/l de p-aminobenzoato; 50 pg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H20. O cultivo foi realizado de forma quimilitoautotrófica em um frasco de vidro à prova de chamas de 1 I, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e uma fumigação de 1-3 l/h durante 161 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, montado no centro do reator em um tubo de gaseificação. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente.

[105] Para a pré-cultura, muitas células lavadas da cultura de crescimento de C. Ijungdahlii foram transferidas para 200 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma Οϋβοο de 0,12. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 500 ml resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composto de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 3 l/h durante 24 h. Subsequentemente, a mistura gasosa foi alterada para uma com a composição de 66,85 % de H2, 33 % de CO2 e 0,15 % de O2 e as células foram gaseificadas adicionalmente durante 67 h a 3 l/h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro de frita (Begasungsfritte) com um tamanho de poro de 10 micra, que foi colocado no centro dos reatores em um pulverizador. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente.

[106] Para a cultura de produção, muitas células lavadas da pré-cultura de C. Ijungdahlii foram transferidas para 200 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma OÜ6oode 0,1. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 500 ml resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 66,85 % de H2, 33 % de CO2 e 0,15 % de O2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 3 l/h durante 113 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. Ao coletar as amostras, cada amostra de 5 ml foi removida para determinação da ODeoo, pH e da faixa de produtos. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopía de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP).

[107] Não houve crescimento celular reconhecível no período de 89 h até 113 h. A O D 600 ficou estagnada em 0,29, correspondente a uma taxa de crescimento μ = 0 Ir1. A concentração de acetato aumentou ligeiramente durante este período, de 89,4 mg/l para 86,9 mg/l e a concentração de etanol diminuiu de 16,2 mg/l para 11,9 mg/l.

[108] Exemplo 3 [109] Cultura de Clostridium Ijungdahlii na fase log na presença de gás de síntese compreendendo CO2 e 0,15 % de oxigênio [110] C. Ijungdahlii foi alimentado com H2 e CO2 através da passagem da fase gasosa e foram formados acetato e etanol. Para o cultivo, foram usados frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma tampa de borracha de butila. Todas as etapas de cultivo nas quais as células de C. Ijungdahlii estavam envolvidas foram realizadas em condições anaeróbicas.

[111] Para a cultura celular do C. Ijungdahlii, 5 ml de crio cultura foram cultivados anaerobicamente em 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCI, 1 g/l deNhUCI, 0,1 g/l de KCI, 0,1 g/l de KH5PO4, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H2O; 0,02 g/l de CaCI2 * 2 H2O; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnS04 x H20; 8 mg/l de (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H20; 2 mg/l de CoCI2 x 6 H2O; 2 mg/l de ZnS04 x 7 H20; 0,2 mg/l de CuCI2 x 2 H2O; 0,2 mg/l de Na2Mo04 x 2 H20; 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20; 0,2 mg/l de Na2Se04; 0,2 mg/l de Na2W04 x 2 H20; 20 pg/l de d-biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 g/l de piridoxina-HCI, 50 pg/L tiamína-HCI x H20; 50 pg/l de riboflavina; 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-pantotenato; 1 pg/l de vitamina B12; 50 pg/l de p-aminobenzoato; 50 pg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cioridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H20. O cultivo foi realizado de forma quimilitoautotrófica em um frasco de vidro à prova de chamas de 1 I, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 100 rpm e uma fumigação de 3 l/h durante 72 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, montado no centro do reator em um tubo de gaseificação. As células foram centrifugadas, lavadas com 10 ml de meio ATCC e centrifugadas novamente.

[112] Para a cultura principal, muitas células lavadas da cultura de crescimento de C. Ijungdahlii foram transferidas para 500 ml de meio ATCC com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e cultivadas até uma ODeoo de 0,1. O cultivo foi realizado em um frasco de vidro de 1 I resistente à pressão, com uma mistura gasosa pré-misturada composta de 66,85 % de H2, 33 % de CO2 e 0,15 % de O2, em um agitador com banho de água aberto a 37 °C, 150 rpm e com aeração de 1 l/h durante 45 h. A entrada de gás no meio foi realizada através de um filtro com um tamanho de poro de 10 micra, colocado no centro dos reatores. Ao coletar as amostras, cada amostra de 5 ml foi removida para determinação da Οϋβοο nm, pH e da faixa de produtos. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP).

[113] Houve crescimento celular significativo durante o período de cultivo, evidenciado por um aumento da Οϋβοο nm de 0,10 para 0,54, correspondente a uma taxa de crescimento de μ = 0,037 h T Ao mesmo tempo, a concentração de acetato aumentou de 9,6 mg/l para 3.304 mg/l e a concentração de etanol de 2,2 mg/l para 399 mg/l.

[114] Exemplo 4 [115] Cultura de Clostridium Ijungdahlii na fase log na presença de gás de síntese compreendendo CO e 0,1% de oxigênio [116] C. Ijungdahlii foi cultivado autotroficamente em meio complexo com gás de síntese consistindo em H2 e CO2 na presença de oxigênio, de modo a produzir de acetato e etanol.

[117] Foi usado um meio de cultura complexo consistindo em 1 g/l de NH4CI, 0,1 g/l de KCI, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H2O, 0,8 g/l de NaCI, 0,1 g/l de KH2PO4, 20 mg/i de CaCte x 2 H2O, 20 g/l de MES, 1 g/l de extrato de levedura, 0,4 g/l de L-cisteína-HCI, 0,4 g/l de Na2S x 9 H2O, 20 mg/l de ácido nitrilotriacético, 10 mg/l de MnSÜ4 x H2O, 8 mg/L (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H2O, 2 mg/l de C0CI2 x 6 H2O, 2 mg/l de ZnSC>4 x 7 H2O, 0,2 mg/l de CuCh x 2 H2O, 0,2 mg/l de Na2MoC>4 x 2 H2O, 0,2 mg/l de NiCb x 6 H2O, 0,2 mg/l de Na2SeCM, 0,2 mg/l de Na2WC>4 x 2 H2O, 20 pg/l de biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 pg/l de piridoxina-HCI, 50 pg/l de tiamina-HCI x H2O, 50 pg/l de riboflavina, 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-ácido pantotenoico, 1 pg/l de vitamina B12, 50 pg/l de ácido p-aminobenzoico, 50 pg/l de ácido lipoico.

[118] cultivo autotrófico foi realizado em 500 ml de meio em um frasco de soro de 1 I, que foi continuamente gaseificado com gás de síntese consistindo em 67,7 % de CO, 3,5 % de H2 e 15,6 % de CO2 a uma taxa de 3,6 l/h. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 pm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 120 min'1. O pH não foi controlado.

[119] No início da experiência, C. IjungdahliHoi inoculado com uma OD600 de 0,1, com células cultivadas autotroficamente em H2/CO2. Portanto, o C. Ijungdahlii foi cultivado em meio complexo, sob gaseificação contínua com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de CO2 a uma taxa de 3 l/h, em frascos de soro de 1 I com 500 ml de meio complexo. O meio descrito acima também foi usado para este cultivo. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 pm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica, com uma OD600 de 0,49 e um pH de 5,03, por centrifugação anaeróbia (4500 min'1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio descrito acima. Esta suspensão de células foi, então, utilizada para inocular a experiência de cultivo. A concentração de monóxido de carbono na fase gasosa foi medida por amostragem desta e análise offline em um cromatógrafo a gás GC 6890N da Agilent Technologies Inc., com um detector de condutividade térmica. A concentração de oxigênio na fase gasosa foi medida por uma sonda de imersão para detecção de oxigênio da PreSens Precision Sensing GmbH. A concentração de oxigênio foi medida por desativação de fluorescência, em que o grau de desativação se correlaciona com a pressão parcial de oxigênio na fase gasosa. A medição de oxigênio indicou uma concentração de 0,1 % em volume de O2 no gás de síntese usado.

[120] Durante a experiência foram coletadas amostras de 5 ml para a determinação da ODeoo, pH e concentrações de produtos. Esta última foi determinada por espectroscopia de 1H-RMN quantitativa.

[121] Após a inoculação do C. Ijungdahlii, as células começaram a crescer a uma taxa de crescimento μ de 0,062 Ir1 e produziram acetato continuamente, até uma concentração de 6,2 g/l após 94,5 horas. Concomitante à produção de acetato, foi produzido etanol a uma taxa mais baixa em comparação com a produção de acetato, até uma concentração de 1 g/l, após 94,5 horas.

[122] Tabela 1. Resu tados do exemplo 4 (n.d. = não detectado) [123] Exemplo 5 [124] Crescimento e produção de acetato por Clostridium Ijungdahlii em gás de síntese com 2% de oxigênio [125] Para a biotransformação de hidrogênio e dióxido de carbono em ácido acético, a bactéria homoacetogênica Clostridium Ijungdahlii foi cultivada em gás de síntese com oxigênio, Todas as etapas de cultivo foram realizadas em condições anaeróbicas, em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila.

[126] Para a pré-cultura, 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCI, 1 g/l deNHUCI, 0,1 g/l de KCI, 0,1 g/i de KH2PO4, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H20; 0,02 g/l de CaCI2 * 2 H20; 20 mg/l de ácido nitrílotriacético,10 mg/l de MnS04 x H20; 8 mg/l de (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H20; 2 mg/l de CoCI2 x 6 H20; 2 mg/l de ZnS04 x 7 H20; 0,2 mg/l de CuCI2 x 2 H20; 0,2 mg/l de Na2Mo04 x 2 H20; 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20; 0,2 mg/l de Na2Se04; 0,2 mg/l de Na2W04 x 2 H20; 20 pg/l de d-biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 pg/l de piridoxina-HCI, 50 pg/L tiamina-HCI x H20; 50 pg/l de riboflavina; 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-pantotenato; 1 pg/l de vitamina B12; 50 pg/l de p-aminobenzoato; 50 pg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cioridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H20 foram inoculados com 5 ml de padrão crio congelado de C. Ijungdahlii. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em um frasco de vidro resistente à pressão de 1 I, a 37 °C, 100 rpm e uma taxa de ventilação de 3 l/h com um gás pré-misturado com 67 % de H2, 33 % de C02, em um agitador com banho de água aberto durante 72 h. O gás foi descarregado no meio através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 pm, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH.

[127] Após a pré-cultura, a suspensão de células foi centrifugada (10 min, 4200 rpm) e o sedimento foi lavado com 10 ml de meio e centrifugado novamente. Para a cultura principal, tantas células lavadas da pré-cultura quanto necessárias para uma ODeoonmde 0,1 foram transferidas para 200 ml de meio com 400 mg/l adicionais de cioridrato de L-cisteína. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em frascos de vidro resistentes à pressão de 250 ml a 37 °C, 150 rpm e uma taxa de ventilação de 1 l/h com um gás pré-misturado com 65 % de H2, 33 % de C02, 2 % de 02 em um agitador com banho de água aberto durante 47 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 micra, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH. Durante o cultivo, foram tomadas várias amostras de 5 ml para a determinação da Οϋβοο nm, pH e formação de produto. A determinação das concentrações de produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP). Além disso, o oxigênio dissolvido no meio de cultivo foi medido on-line por sondas de imersão para medição de oxigênio (PSt6 com Oxy4Trace, PreSens, Alemanha).

[128] Durante o período de cultivo, o crescimento de células foi observado por um aumento da ODeoonm de 0,11 para 0,32, que se correlaciona com uma taxa de crescimento de μ = 0,022 Ir1. A concentração de acetato aumentou de 8 mg/l até 91 mg/l; não foi observado um aumento da concentração de etanol. Durante o período de cultivo, a concentração de oxigênio dissolvido variou entre 0,06 e 0,15 mg/l.

[129] Em uma configuração técnica semelhante, com os mesmos parâmetros (composição do meio, volume, frasco, gás, taxa de ventilação, temperatura, frequência de agitação), mas sem células no meio, foi medida uma concentração de oxigênio dissolvido de 0,50 mg/l.

[130] Exemplo 6 [131] Crescimento e produção de acetato por Clostridium Ijungdahlii em gás de síntese com 0,15 % de oxigênio [132] Para a biotransformação de hidrogênio e dióxido de carbono em ácido acético, a bactéria homoacetogênica Clostridium Ijungdahlii foi cultivada em gás de síntese com oxigênio. Todas as etapas de cultivo foram realizadas em condições anaeróbicas, em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila.

[133] Para a pré-cultura, 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCI, 1 g/l deNHUCI, 0,1 g/l de KCI, 0,1 g/l de KH2P04, 0,2 g/l de MgS04 x 7 ΗζΟ; 0,02 g/l de CaCI2 * 2 H20; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnS04 x H2O; 8 mg/l de (NH4)2Fe(S04)2 X 6 H2Q; 2 mg/l de C0CI2 x 6 H20; 2 mg/l de ZnS04 x 7 H20; 0,2 mg/l de CuCh x 2 H2O; 0,2 mg/l de Na2MoC>4 x 2 H2O; 0,2 mg/l de NiCh x 6 H2O; 0,2 mg/l de Na2Se04í 0,2 mg/l de Na2WÜ4 x 2 H2O; 20 pg/l de d-biotina, 20 Mg/l de ácido fólico, 100 pg/l de piridoxina-HCI, 50 pg/L tiamina-HCI x H2O; 50 Mg/l de riboflavina; 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-pantotenato; 1 pg/l de vitamina B12; 50 pg/l de p-aminobenzoato; 50 pg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cioridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H2O foram inoculados com 5 ml de padrão crio congelado de C. Ijungdahlii. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em um frasco de vidro resistente à pressão de 1 I, a 37 °C, 100 rpm e uma taxa de ventilação de 3 l/h com um gás pré-misturado com 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto durante 72 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 micra, que foi montado no centro do reator. A cultura foi realizada sem controle de pH.

[134] Após a pré-cultura, a suspensão de células foi centrifugada (10 min, 4200 rpm) e o sedimento foi lavado com 10 ml de meio e centrifugado novamente. Para a cultura principal, tantas células lavadas da pré-cultura quanto necessárias para uma ODeoonm de 0,1 foram transferidas para 200 ml de meio com 400 mg/I adicionais de cioridrato de L-cisteina. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em frascos de vidro resistentes à pressão de 250 ml a 37 °C, 150 rpm e uma taxa de ventilação de 1 l/h com um gás pré-misturado com 66,85% de H2, 33 % de CO2, 0,15 % de O2 em um agitador com banho de água aberto durante 47 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 micra, que foi montado no centro do reator. A cultura foi realizada sem controle de pH. Durante o cultivo, foram tomadas várias amostras de 5 ml para a determinação da ODeoonm, pH e formação de produto. A determinação das concentrações de produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP). Além disso, o oxigênio dissolvido no meio de cultivo foi medido on-line por sondas de imersão para medição de oxigênio (PSt6 com Oxy4Trace, PreSens, Alemanha).

[135] Durante o período de cultivo, o crescimento celular foi observado por um aumento da ODeoonm de 0,10 para 0,45, que se correlaciona com uma taxa de crescimento de μ = 0,032 Ir1. A concentração de acetato aumentou de 7 mg/l para 2347 mg/l e a concentração de etanol aumentou de 2 mg/í para 319 mg/l. Durante todo o período de cultivo, a concentração do oxigênio dissolvido foi de 0,00 mg/l.

[136] Em uma configuração técnica semelhante, com os mesmos parâmetros (composição do meio, volume, frasco, gás, taxa de ventilação, temperatura, frequência de agitação), mas sem células no meio, foi medida uma concentração de oxigênio dissolvido de 0,03 mg/l.

[137] Exemplo 7 [138] Co-cultivo de Clostrídium Ijungdahlii e Clostridium kluyveri em meio definido com hidrogênio e dióxido de carbono [139] C. Ijungdahlii, como primeiro organismo, foi cultivado autotroficamente em meio definido, de modo a produzir acetato e etanol. Depois de determinado tempo, C. kluyveri como segundo organismo foi, então, inoculado no mesmo reator, para a conversão de acetato e etanol em butirato e hexanoato. Subsequentemente, C. Ijungdahlii converte butirato em butanol.

[140] Foi usado um meio definido para o pré-cultivo de ambos os microrganismos consistindo em 2 g/l de (NhU^HPCU, 0,2 g/l de NaCI, 0,15 g/l de KCI, 1 g/l de KOH, 0,5 g/l de MgCI2 x 6 H20, 0,2 g/l de CaCI2 x 2 H20, 15 mg/l de FeCI2 x 4 H20, 0,4 g/l de L-cisteína-HCI, 0,4 g/l de Na2S x 9 H20, 3 mg/l de ácido bórico, 2 mg/l de C0CI2 x 6 H2O, 1 mg/l de ZnSC>4 x 7 H20, 0,3 mg/l de Na2MoC>4 x 2 H20, 0,3 mg/l de MnSC>4 x H2O, 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20, 0,1 mg/l de CuCI2 x 2 H20, 0,1 mg/l de Na2Se03, 106 pg/l de biotina, 5 pg/L de ácido fólico, 2,5 pg/l de piridoxina-HCI, 266 pg/l de tiamina-HCI x H20, 12,5 pg/l de riboflavina, 12,5 pg/l de ácido nicotínico, 413 pg/l de ácido Ca-pantotenoico, 12,5 pg/l de vitamina B12, 12,5 pg/l de ácido p-aminobenzoico, 15 pg/L ácido lipoico.

[141] cultivo autotrófico foi realizado em 250 ml de meio definido em um frasco de soro de 500 ml, que foi continuamente gaseificado com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de CO2, a uma taxa de 1 l/h. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 pm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min·1. O pH foi mantido em uma faixa de pH 5,0 - 6,5 por adição contínua de uma solução padrão anaeróbica de KOH (40 g/l).

[142] No início da experiência, C. Ijungdahlii foi inoculado com uma ODõoo de 0,1, com células cultivadas de forma autotrófica. Portanto, o C. Ijungdahlii foi cultivado em meio complexo, sob gaseificação contínua com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de C02 a uma taxa de 3 l/h, em frascos de soro de 1 I com 500 ml de meio complexo. Foi usado um meio de cultura complexo consistindo em 1 g/l de NH4CI, 0,1 g/l de KCI, 0,2 g/l de MgSC>4 x 7 H2O, 0,8 g/l de NaCS, 0,1 g/l de KH2PO4, 20 mg/l de CaCI2 x 2 H2O, 20 g/L MES, 1 g/l de extrato de levedura, 0,4 g/l de L-cisteína-HCI, 0,4 g/l de Na2S x 9 H2O, 20 mg/l de ácido nitrilotriacético, 10 mg/l de MnSC>4 x H2O, 8 mg/L (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H2O, 2 mg/l de C0CI2 x 6 H2O, 2 mg/l de ZnS04 x 7 H2O, 0.2 mg/l de CuCI2 x 2 H20, 0,2 mg/l de Na2MoC>4 x 2 H20, 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20, 0,2 mg/l de Na2SeC>4, 0,2 mg/l de Na2WÜ4 x 2 H20, 20 pg/l de biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 pg/l de piridoxina-HCI, 50 pg/l de tiamina-HCI x H20, 50 pg/l de riboflavina, 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-ácido pantotenoico, 1 pg/l de vitamina B12, 50 pg/l de ácido p-aminobenzoico, 50 pg/l de ácido lipoico. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 pm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min·1. As células foram colhidas na fase logaritmica tardia, com uma Οϋβοο de 0,67 e um pH de 4,69, por centrifugação anaeróbia (4500 min·1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio descrito acima. Esta suspensão de células foi, então, utilizada para inocular a experiência de co-cultura.

[143] Paralelo a isso, C. kluyveri foi cultivado heterotroficamente em 200ml de meio complexo em frascos de soro de 500 ml em acetato e etanol. Foi usado um meio complexo consistindo em 0,25 g/I de NH4CI, 0,2 g/l de MgSCU x 7 H20, 0,31 g/l de K2HPO4, 0,23 g/l de KH2PO4, 2,5 g/l de NaHCOs, 1 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de K-acetato, 20 g/l de etanol, 0,25 g/l de L-cisteína-HCI, 1,5 mg/l de FeCI2 x 4 H20, 70 pg/l de ZnCh x 7 H20, 100 pg/l de MnCI2 x 4 H20, 6 pg/l de ácido bórico, 190 pg/l de C0CI2 x 6 H2O, 2 pg/l de CuCI2 x 6 H20, 24 pg/l de N1CI2 x 6 H2O, 36 pg/l de Na2Mo04 x 2 H2O, 3 pg/l de Na2Se003 x 5 H2O, 4 pg/l de Na2WC>4 x 2 H2O, 100 pg/l de vitamina B12, 80 pg/l de ácido p-aminobenzoico, 20 pg/l de biotina, 200 pg/l de ácido nicotínico, 100 pg/le de ácido Ca-pantotenoico, 300 pg/l de piridoxina-HCI, 200 pg/l de tiamina-HCI x H2O. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 100 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica tardia, com uma Οϋθοο de 0,81 e um pH de 5,96, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 “C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio descrito acima. A suspensão de células foi, então, usada para inocular a experiência de co-cultura com uma Οϋβοο de 0,2, após 96 horas de duração da experiência.

[144] Durante a experiência foram coletadas amostras de 5 ml para a determinação da Οϋβοο, pH e concentrações de produtos. Esta última foi determinada por espectroscopia de 1H-RMN quantitativa.

[145] Após a inoculação de C. Ijungdahlii, as células começaram a crescer e a produzir acetato continuamente. Concomitante à produção de acetato, foi produzido etanol a uma taxa mais baixa, em comparação com a produção de acetato. Após 96 horas, C. kluyveri foi inoculado no reator e foi medida uma diminuição na concentração do etanol na sequencia da experiência. A produção simultânea de butirato (máx. 1163 mg/l) e hexanoato (máx. 136 mg/l) foi, então, medida nas 113 horas seguintes da experiência de. Paralelamente à produção de butirato pelo C. kluyveri, C. Ijungdahlii converteu o butirato em butanol até uma concentração máxima de 20 mg/l de butanol no final da experiência.

[146] Tabela 2. Resultados do exemplo 7 (n.d. = não detectado) [147] Exemplo 8 [148] Co-cultivo de Clostridium Ijungdahlii e Clostridium kluyveri em meio complexo com gás contendo CO

[149] C. Ijungdahlii, como primeiro organismo, foi cultivado autotroficamente em meio complexo, de modo a produzir acetato e etanol. Depois de determinado tempo, C. kluyveri como segundo organismo foi, então, inoculado no mesmo reator, para a conversão de acetato e etanol em butirato e hexanoato. Subsequentemente, C. Ijungdahlii converte butirato em butanol e hexanaoto em hexanol.

[150] Foi usado um meio complexo para o co-cultivo de ambos os microrganismos, consistindo em 1 g/l de NH4CI, 0,1 g/l de KCI, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H20, 0,8 g/l de NaCI, 0,1 g/l de KH2PO4, 20 mg/l de CaCI2 x 2 H20, 20 g/L MES, 1 g/l de extrato de levedura, 0,4 g/l de L-cisteína-HCI, 0,4 g/l de Na2S x 9 H20, 20 mg/l de ácido nitrilotriacético, 10 mg/l de MnS04 x H2O, 8 mg/L (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H2O, 2 mg/l de C0CI2 x 6 H2O, 2 mg/l de ZnS04 x 7 H20, 0.2 mg/l de CuCI2 x 2 H20, 0,2 mg/l de Na2Mo04 x 2 H20, 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20, 0,2 mg/l de Na2Se04, 0,2 mg/l de Na2W04 x 2 H20, 20 pg/l de biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 pg/l de piridoxina-HCI, 50 pg/l de tiamina-HCI x H20, 50 pg/l de riboflavina, 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-ácido pantotenoico, 1 pg/l de vitamina B12, 50 pg/l de ácido p-aminobenzoico, 50 pg/l de ácido lipoico.

[151] cultivo autotrófico foi realizado em 500 ml de meio complexo em um frasco de soro de 1 I, que foi continuamente gaseificado com gás de síntese consistindo em 5 % de H2, 25 % de CO2 e 45 % N2 a uma taxa de ~12 l/h (> 0,5 ppm). O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 pm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 120 min·1. O pH não foi controlado durante esta experiência.

[152] No início da experiência, C. IjungdahliMoi inoculado com uma OD600 de 0,1, com células cultivadas autotroficamente. Portanto, o C. Ijungdahlii foi cultivado no meio complexo descrito acima, sob gaseificação contínua com gás de síntese consistindo em 67 % de H2 e 33 % de CO2 a uma taxa de 3 l/h, em frascos de soro de 1 I com 500 ml de meio complexo. O gás foi introduzido na fase líquida por um dispersor de microbolhas com um diâmetro de poro de 10 pm. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 150 min'1. As células foram colhidas na fase logarítmica tardia, com uma OD600 de 0,51 e um pH de 5,04, por centrifugação anaeróbia (4500 min·1, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 m! do meio complexo descrito acima. Esta suspensão de células foi, então, utilizada para inocuiar a experiência de co-cultura.

[153] Paralelo a isso, C. kluyveri foi cultivado heterotrofi ca mente em 200 ml de meio complexo em frascos de soro de 500 ml em acetato e etanol. Foi usado um meio complexo consistindo em 0,25 g/I de NH4CI, 0,2 g/l de MgSCU x 7 H20, 0,31 g/l de K2HPO4, 0,23 g/l de KH2PO4, 2,5 g/l de NaHCOs, 1 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de K-acetato, 20 g/l de etanol, 0,25 g/l de L-cisteína-HCI, 1,5 mg/l de FeCI2 x 4 H20, 70 pg/l de ZnCh x 7 H20, 100 pg/l de MnCI2 x 4 H20, 6 pg/l de ácido bórico, 190 pg/l de C0CI2 x 6 H2O, 2 pg/l de CuCI2 x 6 H20, 24 pg/l de N1CI2 x 6 H2O, 36 pg/l de Na2Mo04 x 2 H2O, 3 pg/l de Na2Se003 x 5 H2O, 4 pg/l de Na2WC>4 x 2 H2O, 100 pg/l de vitamina B12, 80 pg/l de ácido p-aminobenzoico, 20 pg/l de biotina, 200 pg/l de ácido nicotínico, 100 pg/le de ácido Ca-pantotenoico, 300 pg/l de piridoxina-HCI, 200 pg/l de tiamina-HCI x H2O. O frasco de soro foi continuamente agitado em um banho de água aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific, a 37 °C e uma velocidade de agitação de 100 min-1. As células foram colhidas na fase logarítmica tardia, com uma Οϋθοο de 0,54 e um pH de 6,60, por centrifugação anaeróbia (4500 min-1, 4300 g, 20 “C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml do meio complexo descrito acima. A suspensão de células foi, então, usada para inocuiar a experiência de co-cultura após 240 horas de duração da experiência.

[154] Durante a experiência foram coletadas amostras de 5 ml para a determinação da Οϋβοο, pH e concentrações de produtos. Esta última foi determinada por espectroscopia de 1H-RMN quantitativa.

[155] Após a inoculação do C. Ijungdahlii, as células começaram a crescer e a produzir acetato continuamente até uma concentração de ~ 3 g/l e etanol até uma concentração de ~0,5 g/l, após 71 horas. No decurso de tempo seguinte da experiência, o acetato foi completamente convertido em etanol até uma concentração de 4,8 g/l, após 240 horas. Em um tempo de processo de 240 horas, C. kluyveri foi então inoculado no reator. Como este organismo necessita de acetato além do etanol como substrato, simultaneamente à inoculação do C. kluyveri foram adicionados anaerobicamente ao reator aproximadamente 3 g/l de acetato (na forma de Na-acetato). No decurso de tempo seguinte da experiência, foi medida a produção de butirato e hexanoato até concentrações de 1,6 g/l de cada. Paraleiamente à produção de butirato e hexanoato pelo C. kluyveri, C. Ijungdahlii converteu butirato em butanol, até uma concentração máxima de 690 mg/l de butanol e converteu hexanoato em hexanol até uma concentração máxima de 1478 mg/l de hexanol.

[156] Tabela 3. Resultados do Exemplo 8 (n.d. = não detectado) [157] Exemplo 9 [158] Crescimento e produção de acetato e outros compostos por Clostridium carboxidivorans com gás de síntese com 0,05% de oxigênio [159] Para a biotransformação de hidrogênio e dióxido de carbono em ácido acético e outros compostos, a bactéria homoacetogênica Clostridium carboxidivorans foi cultivada em gás de síntese com oxigênio. Todas as etapas de cultivo foram realizadas em condições anaeróbicas, em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila.

[160] Para a pré-cultura, 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCI, 1 g/l deNhUCI, 0,1 g/l de KCI, 0,1 g/l de KH2PO4, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H20; 0,02 g/l de CaCI2 * 2 H20; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnS04 x H20; 8 mg/l de (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H20; 2 mg/l de CoCI2 x 6 H20; 2 mg/l de ZnS04 x 7 H20; 0,2 mg/l de CuCI2 x 2 H20; 0,2 mg/l de Na2Mo04 x 2 H20; 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20; 0,2 mg/l de Na2Se04; 0,2 mg/l de Na2W04 x 2 H20; 20 pg/l de d-biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 pg/l de piridoxina-HCI, 50 pg/L tiamina-HCI x H20; 50 pg/l de riboflavina; 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-pantotenato; 1 pg/l de vitamina B12; 50 pg/l de p-aminobenzoato; 50 pg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cioridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H20 foram inoculados com 5 ml de padrão crio congelado de C. Ijungdahlii. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em um frasco de vidro resistente à pressão de 1 I, a 37 °C, 100 rpm e uma taxa de ventilação de 3 l/h com um gás pré-misturado com 60 % de H2, 20 % de C02 e 20 % CO, em um agitador com banho de água aberto durante 71 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 pm, que foi montado no centro do reator. A cultura foi realizada sem controle de pH.

[161] Após a pré-cultura, a suspensão de células foi centrifugada (10 min, 4200 rpm) e o sedimento foi ressuspenso em meio fresco. Para a cultura principal, tantas células da pré-cultura quantas necessárias para uma ODeoonm de 0,2 foram transferidas para 200 ml de meio complexo (ATCC1754) e, paralelamente, para 200 ml de meio mineral (meio DM4: pH = 6,00, 0,5 g/l de MgCI2 x 6 H20, 0,2 g/l de CaCI2 x 2 H20, 15 mg/l de FeCI2 x 4 H20, 2 g/l de (NH4)H2P04, 0,2 g/l de NaCI, 0,15 g/l de KCI, 3 mg/l de H3BO3, 2 mg/l de CoCI2 x 6 H20, 1 mg/l de ZnS04 x 7 H20, 300 pg/l de Na2Mo04 x 2 H20, 300 pg/l de MnS04 x H20, 200 pg/l de NiCte x 6 H20, 100 pg/l de CuCI2 x 2 H20, 100 pg/l de Na2Se03, 106 pg/l de d-biotina, 5 pg/l de acido fólico, 2,5 pg/l de piridoxina-HCI, 266 pg/l de tiamina-HCI, 12,5 pg/i de riboflavina, 12,5 pg/L de ácido nicotínico, 413 pg/l de Ca-pantotenato, 12,5 pg/l de vitamina Bi2, 12,5 pg/l de p-aminobenzoato, 15,0 pg/l de ácido lipoico, aprox. 1,3 g/l de KOH), com 400 mg/l adicionais de cloridrato de L-cisteína, cada. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em frascos de vidro resistentes à pressão de 1 I a 37 °C, 150 rpm e uma taxa de ventilação de 1 l/h com um gás pré-misturado com 66,95% de H2, 33 % de C02, 0,05 % de 02 em um agitador com banho de água aberto durante 40 h, O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 pm, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH. Durante o cultivo, foram tomadas várias amostras de 5 ml para a determinação da OD6oonm, pH e formação de produto. A determinação das concentrações de produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP). Além disso, o oxigênio dissolvido no meio de cultivo foi medido on-line por sondas de imersão para medição de oxigênio (PSt6 com Oxy4Trace, PreSens, Alemanha).

[162] Durante o período de cultivo, o crescimento das células foi observado no meio complexo por um aumento da ODeoonm de 0,20 para 0,36, que se correlaciona com uma taxa de crescimento de p = 0,015 Ir1. No meio mineral, a ODeoonm diminuiu de 0,20 para 0,19. No meio complexo a concentração de acetato aumentou de 29 mg/l para 280 mg/l, a de etanol de 3 mg/l para 82 mg/l, a de butirato de 0 mg/l para 29 mg/l e a de butanol de 0 mg/l para 10 mg/l. No meio mineral a concentração de acetato aumentou de 25 mg/l para 110 mg/l, a de etanol de 3 mg/l para 5 mg/l e a de butirato de 0 mg/l para 2 mg/l. Durante todo o período de cultivo, a concentração do oxigênio dissolvido em ambas as culturas foi de 0,00 mg/l. Em uma configuração técnica semelhante, com os mesmos parâmetros (composição do meio, volume, frasco, gás, taxa de ventilação, temperatura, frequência de agitação), mas sem células no meio, foi medida uma concentração de oxigênio dissolvido de 0,01 mg/l.

[163] Exemplo 10 [164] Crescimento e produção de acetato e etanol por Clostridium autoethanogenum em gás de síntese com 0,05% de oxigênio [165] Para a biotransformação de hidrogênio e dióxido de carbono em ácido acético e etanol, a bactéria homoacetogênica Clostridium autoethanogenum foi cultivada em gás de síntese com oxigênio. Todas as etapas de cultivo foram realizadas em condições anaeróbicas, em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila.

[166] Para a pré-cultura, 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCI, 1 g/l deNhUCI, 0,1 g/l de KCI, 0,1 g/i de KH2PO4, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H2O; 0,02 g/l de CaCI2 * 2 H20; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnSC>4 x H2O; 8 mg/l de (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H20; 2 mg/l de C0CI2 x 6 H2O; 2 mg/l de ZnS04 x 7 H20; 0,2 mg/l de CuCI2 x 2 H20; 0,2 mg/l de Na2Mo04 x 2 H20; 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20; 0,2 mg/l de Na2Se04; 0,2 mg/l de Na2WC>4 x 2 H20; 20 pg/l de d-biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 pg/l de piridoxina-HCI, 50 pg/L tiamina-HCI x H2O; 50 pg/l de riboflavina; 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-pantotenato; 1 pg/l de vitamina B12; 50 pg/l de p-aminobenzoato; 50 pg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cíoridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H20 foram inoculados com 5 ml de padrão crio congelado de C. autoethanogenum. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em um frasco de vidro resistente à pressão de 1 I, a 37 °C, 100 rpm e uma taxa de ventilação de 3 l/h com um gás pré-misturado com 67 % de H2, 33 % de CO2, em um agitador com banho de água aberto durante 72 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 pm, que foi montado no centro do reator. A cultura foi realizada sem controle de pH.

[167] Após a pré-cultura, a suspensão de células foi centrifugada (10 min, 4200 rpm) e o sedimento foi ressuspenso em meio fresco. Para a cultura principal, tantas células da pré-cultura quanto necessárias para uma ODeoonm de 0,1 foram transferidas para 500 ml de meio com 400 mg/l adicionais de cloridrato de L-cisteína. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em frascos de vidro resistentes à pressão de 1 I a 37 °C, 150 rpm e uma taxa de ventilação de 1 l/h com um gás pré-misturado com 66,95 % de H2, 33 % de CO2, 0,05 % de 02 em um agitador com banho de água aberto durante 41 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 pm, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH. Durante o cultivo, foram tomadas várias amostras de 5 ml para a determinação da ODeoonm, pH e formação de produto. A determinação das concentrações de produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP). Além disso, o oxigênio dissolvido no meio de cultivo foi medido on-line por sondas de imersão para medição de oxigênio (PSt6 com Oxy4Trace, PreSens, Alemanha).

[168] Durante o período de cultivo, o crescimento das células foi observado por um aumento da ODeoonm de 0,08 para 0,76 em 41 h, que se correlaciona com uma taxa de crescimento de p = 0,054 Ir1. A concentração de acetato aumentou de 37 mg/l para 6600 mg/l e a concentração de etanol aumentou de 4 mg/l para 120 mg/l. Durante todo o período de cultivo, a concentração do oxigênio dissolvido foi de 0,00 mg/í.

[169] Em uma configuração técnica semelhante, com os mesmos parâmetros (composição do meio, volume, frasco, gás, taxa de ventilação, temperatura, frequência de agitação), mas sem células no meio, foi medida uma concentração de oxigênio dissolvido de 0,01 mg/l.

[170] ExemploH

[171] Crescimento e produção de acetato por Clostridium Ijungdahlii em gás de síntese com 0,6% de oxigênio [172] Para a biotransformação de hidrogênio e dióxido de carbono em ácido acético, a bactéria homoacetogênica Clostridium Ijungdahlii foi cultivada em gás de síntese com oxigênio, Todas as etapas de cultivo foram realizadas em condições anaeróbicas, em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila.

[173] Para a pré-cultura, 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCI, 1 g/l deNhUCI, 0,1 g/l de KCI, 0,1 g/l de KH2P04, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H20; 0,02 g/l de CaCI2 * 2 H20; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnS04 x H20; 8 mg/l de (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H20; 2 mg/l de CoCI2 x 6 H20; 2 mg/l de ZnS04 x 7 H20; 0,2 mg/l de CuCI2 x 2 H20; 0,2 mg/l de Na2Mo04 x 2 H20; 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20; 0,2 mg/l de Na2Se04; 0,2 mg/l de Na2W04 x 2 H20; 20 pg/l de d-biotina, 20 Mg/l de ácido fólico, 100 pg/l de piridoxina-HCI, 50 pg/L tiamina-HCI x H20; 50 pg/l de riboflavina; 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-pantotenato; 1 pg/l de vitamina B12; 50 pg/l de p-aminobenzoato; 50 pg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H20 foram inoculados com 5 ml de padrão crio congelado de C. Ijungdahlii. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em um frasco de vidro resistente à pressão de 1 I, a 37 °C, 100 rpm e uma taxa de ventilação de 3 l/h com um gás pré-misturado com 67 % de H2, 33 % de C02, em um agitador com banho de água aberto durante 72 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 micra, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH.

[174] Após a pré-cultura, a suspensão de células foi centrifugada (10 min, 4200 rpm) e o sedimento foi lavado com 10 ml de meio e centrifugado novamente. Para a cultura principal, tantas células lavadas da pré-cultura quanto necessárias para uma ODôoonm de 0,1 foram transferidas para 200 ml de meio com 400 mg/l adicionais de cloridrato de L-cisteína. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em frascos de vidro resistentes à pressão de 250 ml a 37 °C, 150 rpm e uma taxa de ventilação de 1 l/h com um gás pré-misturado com 66,85 % de H2, 33 % de CO2, 0,6 % de O2 em um agitador com banho de água aberto durante 91 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 micra, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH.

[175] Durante o cultivo, foram tomadas várias amostras de 5 ml para a determinação da OD6oonm, pH e formação de produto. A determinação das concentrações de produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP). Além disso, o oxigênio dissolvido no meio de cultivo foi medido on-line por sondas de imersão para medição de oxigênio (PSt6 com Oxy4Trace, PreSens, Alemanha).

[176] Durante o período de cultivo, o crescimento das células foi observado por um aumento da ODeoonm de 0,10 para 0,16, que se correlaciona com uma taxa de crescimento de μ = 5 x 10'3 h -1. A concentração de acetato aumentou de 9 mg/l para 476 mg/l e a concentração de etanol aumentou de 6 mg/l para 61 mg/l. Durante o período de cultivo, a concentração de oxigênio dissolvido variou entre 0,01 e 0,10 mg/l.

[177] Em uma configuração técnica semelhante, com os mesmos parâmetros (composição do meio, volume, frasco, gás, taxa de ventilação, temperatura, frequência de agitação), mas sem células no meio, foi medida uma concentração de oxigênio dissolvido de 0,15 mg/l.

[178] Exemplo 12 [179] Crescimento e produção de acetato por Acetobacterium woodii em gás de síntese com oxigênio [180] Para a biotransformação de hidrogênio e dióxido de carbono em ácido acético, a bactéria homoacetogênica Acetobacterium woodii foi cultivada em gás de síntese com oxigênio. Todas as etapas de cultivo foram realizadas em condições anaeróbicas, em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila.

[181] Para a pré-cuttura, 500 ml de meio (meio ATCC1754: pH 6,0; 20 g/l de MES; 1 g/l de extrato de levedura, 0,8 g/l de NaCI, 1 g/l deNHUCI, 0,1 g/I de KCI, 0,1 g/l de KH2P04, 0,2 g/l de MgS04 x 7 H20; 0,02 g/l de CaCI2 * 2 H20; 20 mg/l de ácido nitrilotriacético,10 mg/l de MnSC>4 x H20; 8 mg/l de (NH4)2Fe(SC>4)2 x 6 H20; 2 mg/l de CoCI2 x 6 H20; 2 mg/l de ZnS04 x 7 H20; 0,2 mg/l de CuCI2 x 2 H20; 0,2 mg/l de Na2Mo04 x 2 H20; 0,2 mg/l de NiCI2 x 6 H20; 0,2 mg/l de Na2Se04í 0,2 mg/l de Na2WÜ4 x 2 H20; 20 pg/l de d-biotina, 20 pg/l de ácido fólico, 100 pg/l de piridoxina-HCI, 50 pg/L tiamina-HCI x H20; 50 pg/l de riboflavina; 50 pg/l de ácido nicotínico, 50 pg/l de Ca-pantotenato; 1 pg/l de vitamina B12; 50 pg/l de p-aminobenzoato; 50 pg/l de ácido lipoico, aproximadamente 67,5 mg/l de NaOH) com cerca de 400 mg/l de cioridrato de L-cisteína e 400 mg/l de Na2S x 9 H20 foram inoculados com 5 ml de padrão crio congelado de A, woodii. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em um frasco de vidro resistente à pressão de 1 I, a 37 °C, 100 rpm e uma taxa de ventilação de 3 l/h com um gás pré-misturado com 67 % de H2, 33 % de C02, em um agitador com banho de água aberto durante 72 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 micra, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de pH.

[182] Após a pré-cultura, a suspensão de células foi centrifugada (10 min, 4200 rpm) e o sedimento foi ressuspenso em meio fresco. Para a cultura principal, tantas células da pré-cultura quanto necessárias para uma ODeoonm de 0,1 foram transferidas para 500 ml de meio com 400 mg/l adicionais de cioridrato de L-cisteína. O cultivo quimilitoautotrófico foi realizado em frascos de vidro resistentes à pressão de 1 ml a 37 °C, 150 rpm e uma taxa de ventilação de 1 l/h com um gás pré-misturado com 66,95% de H2, 33 % de C02, 0,05% de Ü2 em um agitador com banho de água aberto durante 41 h. O gás foi descarregado através de um pulverizador com um tamanho de poro de 10 pm, que foi montado no centro dos reatores. A cultura foi realizada sem controle de PH.

[183] Durante o cultivo, foram tomadas várias amostras de 5 ml para a determinação da ODeoonm, pH e formação de produto. A determinação das concentrações de produto foi realizada por espectroscopia de 1H-RMN semiquantitativa. Propionato de trimetilsilila de sódio foi usado como padrão interno de quantificação (T (M) SP). Além disso, o oxigênio dissolvido no meio de cultivo foi medido on-line por sondas de imersão para medição de oxigênio (PSt6 com Oxy4Trace, PreSens, Alemanha).

[184] Durante o período de cultivo, o crescimento celular foi observado por um aumento da ODeoonm- A concentração de acetato também aumenta.

[185] Em uma configuração técnica semelhante, com os mesmos parâmetros (composição do meio, volume, frasco, gás, taxa de ventilação, temperatura, frequência de agitação), mas sem células no meio, foi medida uma concentração de oxigênio dissolvido de 0,01 mg/l.

[186] REFERÊNCIAS

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Claims

1. Mistura de reação para a produção de etanol e/ou acetato a partir de uma fonte de carbono em condições aeróbicas, caracterizada por a mistura compreender: - um primeiro microrganismo acetogênico em uma fase de crescimento exponenciai; - oxigênio livre; e - um segundo microrganismo acetogênico em uma fase estacionária em que o primeiro e o segundo microrganismo acetogênico são capazes de converter a fonte de carbono a acetato e/ou etanol.

2. Mistura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o primeiro e segundo microrganismos serem selecionados do grupo que consiste em Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacteríum carbinolicum (DSM 2925), Acetobacteríum malicum (DSM 4132), Acetobacterium species n° 446, Acetobacteríum wieríngae (DSM 1911), Acetobacteríum woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950), Butyríbacteríum methylotrophicum (DSM 3468), Clostrídium aceticum (DSM 1496), Clostrídium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 and DSM 23693), Clostrídium carboxidivorans (DSM 15243), Clostrídium coskatii (ATCC n° PTA-10522), Clostrídium drakei (ATCC BA-623), Clostrídium formicoaceticum (DSM 92), Clostrídium glycolicum (DSM 1288), Clostrídium Ijungdahlii (DSM 13528), Clostrídium Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostrídium Ijungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Clostrídium Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989), Clostrídium mayombei (DSM 6539), Clostrídium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostrídium ragsdalei (DSM 15248), Clostrídium scatologenes (DSM 757), Clostrídium species ATCC 29797, Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1, Moorella thermoacetica (DSM 521), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440) e Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030).

3. Mistura, de acordo a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por o primeiro microrganismo acetogênico na fase de crescimento exponencial ter uma taxa de crescimento de 0,01 a 2 Ir1.

4. Mistura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por o primeiro microrganismo acetogênico na fase de crescimento exponencial ter uma OÜ6oode 0,01 a 2.

5. Mistura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por as condições aeróbicas serem um resultado do oxigênio estar a uma concentração de 0,000005 % a 1 % em volume.

6. Mistura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por a mistura de reação compreender, adicionalmente, - um terceiro microrganismo capaz realizar a via de fermentação etanol-carboxilato e a conversão de acetato e/ou etanol para formar um ácido; e em que o primeiro e/ou segundo microrganismo acetogênico é capaz de converter o ácido a um álcool superior correspondente.

7. Mistura, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o terceiro microrganismo expressar pelo menos uma enzima selecionada do grupo que consiste em Ei a Eu, em que Ei é uma álcool desidrogenase (adh), E2 é uma acetaldeido desidrogenase (ald), E3 é uma acetoacetil-CoA tiolase (thl), E4 é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (hbd), E5 é uma 3-hidroxibutiril-CoA desidratase (crt), Εβ é uma butiril-CoA desidrogenase (bcd), E4 é uma subunidade de flavoproteína de transferência de elétron (etf), Es é uma coenzima A transferase (cat), Eg é uma acetato quinase (ack), E10 é uma fosfotransacetilase (pta) e Eu é uma transhidrogenase.

8. Mistura, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada por o terceiro microrganismo ser selecionado do grupo que consiste em Clostridium kluyveri e C.Carboxidivorans.

9. Mistura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada por o primeiro e/ou segundo microrganismos serem Clostridium Ijungdahlii e o terceiro microrganismo ser Clostridium kluyveri.

10. Composição, de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por a fonte de carbono compreender CO.

11. Mistura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizada por o álcool superior ser selecionado do grupo que consiste em 1-butanol, 2-metil-1-butanol, isobutanol, 3-metil-1-butanoi, 1-hexanol, 1-octanol, 1-pentanol, 1-heptanol, 3-metil-1-pentanol, 4-metil-1-hexanol, 5-metil-1-heptanol, 4-metil-1-pentanol, 5-metil-1-hexanol, 6-metil-1-heptanol e as suas combinações.

12. Método para a produção de etanol e/ou acetato a partir de uma fonte de carbono em condições aeróbicas, caracterizado por o método compreender: (a) contatar uma mistura de reação compreendendo - um primeiro microrganismo acetogênico em uma fase de crescimento exponenciat; - oxigênio livre; e - um segundo microrganismo acetogênico em uma fase estacionária em que o primeiro e o segundo microrganismos acetogênicos são capazes de converter a fonte de carbono a acetato e/ou etanol.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a mistura de reação ser uma mistura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

14. Método de produção de pelo menos um álcool superior a partir de uma fonte de carbono em condições aeróbicas, caracterizado por o método compreender (a) contatar uma mistura de reação, tal como descrito em qualquer uma das reivindicações 6 a 11, com uma fonte de carbono em condições aeróbicas.