BR102015031744A2 - bactérias acetogênicas. - Google Patents

Abstract

"bactérias acetogënicas". a presente invenção refere-se a um método de cultura de pelo menos uma bactéria acetogénica, que compreende o crescimento da bactéria num meio aquoso constituído por uma quantidade de cisteína e/ou cistina, em que a concentração de cisteína e/ou cistina no meio é mantida a uma concentração inferior a 0,20 g11.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “BACTÉRIAS ACETOGÊNICAS”.

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método de cultura de bactérias acetogênicas. Em particular, o método compreende o crescimento das bactérias em condições adequadas à produção de etanoí e/ou acetato a partir de uma fonte de carbono.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A produção biotecnológica de álcoois é de grande interesse e utilização no mundo atual, especialmente na produção de biocombustíveis. Estes álcoois podem também ser utilizados em processos a jusante para produzir compostos orgânicos.

[003] Há inúmeros métodos convencionais para sustentar a cultura de microrganismos produtores de álcool. No entanto, estes métodos têm muitas deficiências. Vários desses microrganismos produtores de álcool, por exemplo, as bactérias acetogênicas, são suscetíveis a mudanças delicadas nas condições em redor do meio de cultura. Isto reduz a eficiência da produção de álcool a partir de uma fonte de carbono apropriado. Por conseguinte, continuam a serem necessários métodos mais eficazes que sustentem as culturas de microrganismos acetogênicos em meio aquoso.

[004] Em particular, em processos de fermentação do gás de síntese, continua a ser necessário uma maneira de preservar a cultura em condições adequadas para que as bactérias acetogênicas funcionem ao seu nível ótimo. Há necessidade de um método para sustentar culturas quando há interrupções no processo industrial de produção de álcool.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção tenta resolver o problema anterior através de um método adequado de cultura de microrganismos acetogênicos, que permite as bactérias produzirem álcool e/ou acetato de forma eficiente. Em particular, a presente invenção oferece pelo menos um método de cultura de bactérias acetogênicas num meio que compreende uma quantidade de cisteína e/ou cistina. A cisteína e/ou a cistina podem estar presentes no meio numa concentração baixa e a concentração pode ser mantida durante todo o processo de produção ou processo de fermentação.

[006] De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de cultura de pelo menos um microrganismo acetogênico, o método compreendendo a cultura de bactérias num meio aquoso constituído por uma quantidade de cisteína e/ou cistina, em que a concentração de cisteína e/ou cistina é mantida a um valor igual ou inferior a 0,20 g/l.

[007] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de produção de acetato e/ou etanol a partir de pelo menos uma fonte de carbono, o método compreendendo a etapa de crescimento de pelo menos uma bactéria acetogênica num meio aquoso composto por uma quantidade de cisteína e/ou cistina, no qual a concentração de cisteína e/ou cistina é mantida constante a 0,20 g/l ou menos.

[008] O termo «microrganismo acetogênico» como aqui utilizado refere-se a um microrganismo que é capaz de realizar a via Wood-Ljungdahl e deste modo converter o CO, CO2 e/ou hidrogênio em acetato. Estes microrganismos incluem microrganismos que na sua forma de tipo selvagem não apresentam uma via Wood-Ljungdahl, mas adquiriram essa característica como resultado de uma modificação genética. O microrganismo acetogênico é qualquer microrganismo que possa ser autotroficamente cultivado. Entre os exemplos constam, sem lhes estar limitados, Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacterium malicum (DSM 4132), espécie de Acetobacterium no. 446 (Morinaga et ai, 1990, J. Biotechnoi, Vol. 14, p. 187-194), Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950, outrora Ruminococcus productus, outrora Peptostreptococcus productus), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Clostridium aceticum (DSM 1496), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 e DSM 23693), Clostridium carboxidivorans (DSM 15243), Clostridium coskatii (ATCC no. PTA-10522), Clostridium drakei (ATCC BA-623), Clostridium formicoaceticum (DSM 92), Clostridium glycolicum (DSM 1288), Clostridium Ijungdahlii (DSM 13528), Clostridium Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium IjungdahliiERI-2 (ATCC 55380), Clostridium Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989), Clostridium mayombei (DSM 6539), Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostridium ragsdalei (DSM 15248), Clostridium scatologenes (DSM 757), espécie de Clostridium ATCC 29797 (Schmidt et ai, 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73), Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1 (Sakai et ai, 2004, Biotechnol. Let, Vol. 29, p. 1607-1612), Moorella thermoacetica (DSM 521, outrora Clostridium thermoaceticum), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440), Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030, outrora Acetogenium kivui).

[009] O termo «cultura» como aqui utilizado refere-se ao crescimento de microrganismos em condições controladas artificialmente. Um procedimento de cultura pode ser realizado utilizando um meio adequado e condições de cultura bem conhecidas na técnica. Os peritos na especialidade saberão sem grande esforço como controlar o procedimento de cultura de acordo com as estirpes empregadas. A cultura pode ser, por exemplo, realizada de forma descontínua, contínua ou semi-contínua, mas não lhes estando limitada. Em particular, cultura refere-se ao crescimento de microrganismos acetogênicos num meio de cultura, bem como a um processo no qual as células não crescem mas assimilam, catabolizam ou convertem os substratos fornecidos ao meio de cultura. Os termos «meio de cultura» e «meio aquoso» são usados indistintamente. O meio de cultura compreende essencialmente todos os nutrientes e fatores de crescimento físicos necessários ao crescimento, replicação, manutenção, viabilidade ou atividade dos microrganismos cultivados. O termo inclui a referência a um meio de cultura fresco, em que nenhuma célula cresceu, bem como a um meio de cultura «gasto», do qual foram removidas as células. Em qualquer caso, o meio de cultura compreende cisteína e/ou cistina.

[010] Os termos «cultura» e «cultura celular» neste documento referem-se a uma população de células suspensa num meio de cultura celular em condições adequadas de sobrevivência e/ou de crescimento da população celular. Como aqui utilizado, esses termos podem referir-se à combinação da população de células {por exemplo, os microrganismos acetogênicos) e do meio em que a população está suspensa.

[011] O termo «cisteína e/ou cistina» aqui utilizado refere-se ao aminoácido cisteína ou a um análogo sintético, em que o análogo contém um grupo sulfidrilo livre e/ou a cisteína oxidada. Em particular, a cisteína é um a-aminoácido com a fórmula química H02CCH(NH2)CH2SH. É um aminoácido semiessencial e a cadeia lateral de tiol na cisteína participa frequentemente em reações enzimáticas, servindo como nucleófilo. A cisteína tem um carácter anfótero. Tanto a cisteína e/ou como a cistina podem ser incluídas no meio de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, usando um composto selecionado do grupo constituído por L-cisteína HCI, L-Cisteína, L-cisteína HCI (sem água), L-cisteína.H2O e afins. A cisteína e/ou cistina presente no meio de acordo com qualquer aspecto da presente invenção pode ser igual ou inferior a 0,20 g/l. A concentração de cisteína e/ou cistina no meto, portanto, pode ser qualquer valor igual ou inferior a 0,20 g/l, mas superior a 0,00 g/l. Num exemplo, a concentração de cisteína no meio pode ser cerca de 0,21 g/l, 0,22 g/l, 0,23 g/l, 0,24 g/l, 0,20 g/l, 0,19 g/l, 0,18 g/l, 0,17 g/l, 0,16 g/l, 0,15 g/l, 0,14 g/l, 0,13 g/l, 0,12 g/l, 0,11 g/l, 0,10 g/l, 0,09 g/l, 0,08 g/l, 0,07 g/l, 0,06 g/l, 0,05 g/l, 0,04 g/l, 0,03 g/l, 0,02 g/l, 0,01 g/l, ou parecido. Em particular, a concentração de cisteína e/ou cistina no meio pode situar-se num intervalo de concentrações selecionado entre qualquer uma das concentrações aqui referidas. Por exemplo, a concentração de cisteína e/ou cistina do meio de acordo com qualquer aspecto da presente invenção pode estar na faixa de 0,01 g/l a 0,24 g/l, de 0,01 g/l a 0,20 g/l, de 0,05 g/l a 0,20 g/l, de 0,10 g/l a 0,20 g/l, de 0,15 g/l a 0,20 g/l e afins. Num exemplo, a concentração de cisteína e/ou cistina no meio de acordo com qualquer aspecto da presente invenção pode ser inferior a 0,40 g/l, em particular inferior a 0,25 g/l, mas superior a 0,00 g/l. De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, o meio aquoso compreende uma quantidade de cisteína e/ou cistina que se refere à cisteína e/ou cistina presentes no meio numa concentração superior a pelo menos 0,00 g/l. Por conseguinte, há sempre cisteína e/ou cistina presente no meio utilizado de acordo com qualquer aspeto da presente invenção.

[012] Como aqui utilizado, os termos «cerca de» e «aproximadamente» tal como aplicados a uma ou mais condições específicas da cultura de células referem-se a uma faixa de valores semelhantes aos valores de referência indicados para essa condição ou condições de cultura. Em certos exemplos, o termo «cerca de» refere-se a uma faixa de valores que está a 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% ou menos do valor de referência indicado para essa condição ou condições de cultura. Por exemplo, uma quantidade de um componente empregado numa mistura quando alterada em «cerca de» inclui a variação e o grau de cuidados normalmente empregado na medição de uma condição experimental na unidade de produção ou laboratório. Por exemplo, a quantidade de componente de um produto quando alterada em «cerca de» inclui a variação entre os lotes de vários testes na unidade de produção ou laboratório e a variação inerente ao método analítico. Alteradas ou não em «cerca de», as quantidades incluem equivalentes a essas quantidades. Qualquer quantidade aqui indicada e alterada em «cerca de» também pode ser empregada na presente invenção como a quantidade não modificada em «cerca de». Em particular, o termo «cerca de 0,20 g/l de cisteína e/ou cistina» pode referir-se à concentração de 0,16 g/l, 0,17 g/l, 0,18 g/l, 0,19 g/l, 0,20 g/l, 0,21 g/l, 0,22 g/l, 0,23 g/l, 0,24 g/l e semelhantes. Noutro exemplo, o termo «cerca de 0,10 g/l de cisteína e/ou cistina» pode referir-se à concentração de 0,15 g/l, 0,16 g/l, 0,17 g/l, 0,18 g/l, 0,19 g/l, 0,05 g/l, 0,06 g/l, 0,07 g/l, 0,08 g/l, 0,09 g/l e semelhantes. Noutro exemplo, o termo «cerca de 0,08 g/l de cisteína e/ou cistina» pode referir-se à concentração de 0,081 g/l, 0,082 g/l, 0,083 g/l, 0,084 g/l, 0,075 g/l, 0,076 g/l, 0,077 g/l, 0,078 g/l, 0,079 g/l e semelhantes.

[013] A concentração de cisteína e/ou cistina no meio utilizado de acordo com qualquer aspecto da presente invenção pode ser mantida a fim de manter a produtividade em etanol. «Produtividade em etanol» é a produtividade volumétrica de etanol calculada como a razão entre a concentração de etanol em estado estacionário e o tempo de retenção do líquido (LRT) em sistemas contínuos, ou a razão entre a concentração de etanol e o tempo necessário para produzir essa concentração em sistemas descontínuos. A frase «produtividade alta em etanol» descreve uma produtividade volumétrica de etanol superior a 10 g/l/dia. A concentração de cisteína e/ou cistina no meio de cultura utilizado de acordo com qualquer aspecto da presente invenção pode ser mantida às concentrações específicas referidas. Num exemplo, a concentração de cisteína e/ou cistina é pelo menos substancialmente mantida à concentração atrás referida, por exemplo, de pelo menos mais de 0,0 g/l e igual ou inferior a 0,20 g/l, 0,10 g/l, 0,08 g/l e semelhante. Um perito na especialidade será capaz de manter a concentração de cisteína e/ou cistina ao nível desejado por métodos conhecidos na arte. Em particular, o perito na especialidade determinará regularmente a concentração de cisteína e/ou cistina no meio de cultura e ajustará a concentração de cisteína e/ou cistina em conformidade pela adição de uma maior ou menor quantidade de cisteína e/ou cistina ao meio. Num exemplo, a cisteína e/ou cistina pode ser adicionada ao meio aquoso numa corrente contínua separada da alimentação contínua do meio aquoso. Noutro exemplo, a cisteína e/ou cistina podem ser parte do meio de cultura que está a ser fornecido. Em particular, a cisteína e/ou cistina podem ser alimentadas ao meio aquoso como parte da alimentação de nutrientes ou separadamente. Independentemente da via de alimentação da cisteína e/ou cistina ao meio aquoso, um perito na especialidade saberá como manter a concentração de cisteína e/ou cistina no meio aquoso. Num exemplo, a concentração de cisteína e/ou cistina no meio pode ser mantida por suplementação da cisteína e/ou cistina de 20 em 20 horas aproximadamente. Noutro exemplo, o reforço da cisteína e/ou cistina do meio pode ocorrer decorridas cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30 horas desde o início do processo de cultura e/ou fermentação.

[014] Num exemplo, a concentração de cisteína e/ou cistina no meio aquoso é mantida a qualquer uma das concentrações de acordo com qualquer aspecto da presente invenção durante 80% do período de reação. Noutro exemplo, a concentração de cisteína e/ou cistina é mantida durante um período de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% ou 100% do tempo de reação. A este respeito, «tempo de reação» refere-se ao período durante o qual o processo ocorre. Em particular, tempo de reação refere-se ao período desde que a reação tem início até quando termina e/ou é concluída, ou seja, durante o qual o substrato é consumido. Num exemplo, o substrato pode ser gás de síntese e a reação é concluída quando o gás de síntese no fermentador é consumido e a reação termina e não há mais gás de síntese alimentado ao fermentador. Portanto, o tempo de reação refere-se ao período desde que a fermentação começa (ou seja, quando o gás de síntese entra primeiro em contato com pelo menos uma bactéria acetogênica num fermentador em condições adequadas de fermentação) até que a fermentação termina (ou seja, quando não há mais gás de síntese no fermentador e/ou quando um outro fator limitante impede a reação de continuar). Num exemplo, o período de reação pode ser de 24 h, 42 h, 72 h, 96 h e afim. Noutro exemplo, o período de reação pode ser de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 97 h e parecido.

[015] O termo «acetato» como aqui utilizado refere-se ao ácido acético e aos seus sais que resultam inevitavelmente da reação, uma vez que, como é conhecido na técnica, os microrganismos funcionam num ambiente aquoso e haverá sempre equilíbrio entre o sal e o ácido presentes. A razão molecular de ácido acético para acetato depende do pH do sistema, ou seja, a uma concentração constante de «acetato», quanto mais baixo for o pH, maior é a concentração de ácido acético molecular em relação ao sal acetato.

[016] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, o meio aquoso pode ainda compreender uma fonte de carbono constituída por CO e/ou CO2.

[017] A fonte de carbono pode ser gás de síntese. O gás de síntese pode ser produzido, por exemplo, como um subproduto da gaseificação do carvão. Nesse sentido, o microrganismo da cultura mista de acordo com qualquer aspecto da presente invenção poderá ser capaz de converter um resíduo num recurso valioso.

[018] Noutro exemplo, o gás de síntese pode ser um subproduto da gaseificação de matérias-primas agrícolas amplamente disponíveis e de baixo custo, que podem ser utilizadas como a cultura mista da presente invenção para produzir compostos orgânicos substituídos e não substituídos.

[019] Há inúmeros exemplos de matérias-primas que podem ser convertidas em gás de síntese, uma vez que quase todas as formas de vegetação podem ser usadas para esse efeito. Em especial, as matérias-primas são selecionadas do grupo constituído por gramíneas perenes como miscanto, resíduos de milho, resíduos de processos como serradura, e afins.

[020] Em geral, 0 gás de síntese pode ser obtido num dispositivo de gaseificação de biomassa seca, principalmente através de pirólise, oxidação parcial e reformação com vapor de água, em que os produtos primários do gás de síntese são CO, H2 e CO2. Num exemplo, a fonte de carbono utilizada de acordo com qualquer aspecto da presente invenção compreende pelo menos 50% em peso de CO e/ou CO2. Noutros exemplos, a fonte de carbono usada de acordo com qualquer aspecto da presente invenção compreende pelo menos 30% em peso de CO e/ou CO2.

[021] Geralmente, uma porção do gás de síntese obtido do processo de gaseificação é primeiro processada para otimizar 0 rendimento do produto e evitar a formação de alcatrão. O craqueamento do indesejável alcatrão e CO no gás de síntese pode ser efetuado com cal e/ou dolomite. Estes processos estão descritos detalhadamente em, por exemplo, Reed, 1981.

[022] Misturas de várias fontes poderão ser utilizadas como fonte de carbono.

[023] De acordo com qualquer aspecto da presente invenção, um agente redutor, por exemplo, hidrogênio, pode ser fornecido em conjunto com a fonte de carbono. Em particular, este hidrogênio pode ser fornecido durante a alimentação ou utilização de C e/ou CO2. Num exemplo, o gás de hidrogênio faz parte do gás de síntese presente de acordo com qualquer aspeto da presente invenção. Noutro exemplo, quando 0 hidrogênio no gás de síntese é insuficiente para o método da presente invenção, gás de hidrogênio suplementar poderá ser fornecido.

[024] Um perito na especialidade saberá que outras condições são exigidas para a realização do método da presente invenção. Em particular, as condições no recipiente (por exemplo, fermentador) podem variar dependendo do primeiro e segundo microrganismos utilizados. Um perito na especialidade saberá variar as condições de acordo com a função ideal dos microrganismos.

[025] Num exemplo, o método da presente invenção pode ser realizado num meio aquoso, a um pH entre 5 e 8, e entre 5,5 e 7. A pressão pode situar-se entre 1 e 10 bar, [026] O termo «fermentador» aqui utilizado pode incluir um dispositivo de fermentação consistindo em um ou mais reatores e/ou colunas ou instalação de tubagens, que inclui um Reator Contínuo Perfeitamente Agitado (CSTR), Reator de Células Imobilizadas (ICR), Reator de Leito Gotejante (JCR), Coluna de Bolhas, Fermentador de Agitação Pneumática, Misturador Estático ou outro dispositivo apropriado para o contato gás-líquido. Em particular, o fermentador pode incluir um reator de crescimento que alimenta o caldo de fermentação a um segundo fermentador no qual a maior parte do produto etanol é produzido.

[027] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de fermentação do gás de síntese para produzir acetato e/ou etanol, em que o método compreende a cultura de pelo menos uma bactéria acetogênica num meio aquoso constituído por cisteína e/ou cistina numa concentração inferior a 0,20 g/l.

[028] O termo «fermentação» significa fermentação de CO em álcoois e acetato. Em particular, fermentação pode referir-se à fermentação do gás de síntese a fim de produzir etanol e/ou acetato. O método pode ser realizado num fermentador por um método contínuo. O termo «método contínuo» como aqui utilizado refere-se a um método de fermentação que inclui a alimentação contínua de nutrientes, a alimentação de substrato, a produção de células no fermentador, a remoção (ou purga) de células do fermentador e a recolha do produto. Estas alimentações, remoções ou produção de células de modo contínuo podem ocorrer na mesma corrente ou em diferentes correntes. Num processo contínuo, é atingido estado estacionário no fermentador. «Estado estacionário» significa que todas as variáveis mensuráveis (ou seja, caudais de alimentação, concentrações de substrato e nutrientes no fermentador, concentração de células no fermentador e remoção de células do fermentador, recolha de produto do fermentador, bem como variáveis de operação tais como temperatura e pressão) são constantes ao longo do tempo. Em particular, a concentração de cisteína pode ser mantida no fermentador.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[029] Não há figuras.

EXEMPLOS

[030] O precedente descreve formas de realização preferenciais, as quais, como será compreendido pelos peritos na especialidade, estão sujeitas a variações ou modificações na concepção, construção ou operação sem fugir ao âmbito das reivindicações. Estas variações serão abrangidas pelo âmbito de aplicação das reivindicações. EXEMPLO 1 [031] Produção autotrófica em tampão de carbonato de C, Ijungdahlii e gás de síntese com concentrações variáveis de L-cisteína HCI

[032] A estirpe Clostridium Ijungdahlii do tipo selvagem é usada em condições limitativas do crescimento para a formação de produto autotróficos em tampão de carbonato a diferentes concentrações de cloridrato de L-cisteína.

[033] Para a produção, utilizou-se tampão de carbonato anaeróbico (ajustado com KOH, 1,4 g/l). A única adição ao tampão foi L-cisteína HCI em diferentes concentrações [034] Para produçoes autotróficas idênticas, encheram-se garrafas de septo de 500 ml com 100 mL de tampão de carbonato e agitaram-se a 150 mim 1 num banho de água agitado aberto Innova 3100 da New Brunswick Scientific. As reações foram realizadas a 37 °C, com controlo manual de pH. Quando o pH desceu abaixo de 5,5, KOH foi fornecido a partir de uma solução de reserva a 140 g/l. Nos presentes testes, o pH de ambos os reatores foi verificado decorridas 50,3 h e 73,3 h e foi corrigido pela adição manual de 1,4 g/l de KOH.

[035] Os reatores foram inoculados com uma mistura de gás de síntese de 67% de H2 e 33% de CO2 e uma pressão de 0,8 bar foi aplicada. Para repor o gás exaurido, o gás à superfície dos reatores foi substituído uma vez por dia e a pressão foi levada novamente a 0,8 bar.

[036] O reator 1 continha uma concentração de L-cisteína HCI de 0,1 g/l e 0 reator 2 continha uma concentração de L-cisteína HCI de 0,4 g/l.

[037] O reator foi iniciado pela inoculação de células autotróficas cultivadas a uma DO de 0,2. A précultura foi realizada continuamente num frasco de 1 L com 500 ml de meio complexo. O meio complexo consistia em 1 g/l NH4CI, 0,1 g/l KCI, 0,2 g/l MgS04 x 7 H2O, 0,8 g/l NaCI, 0,1 g/l KH2PO4, 20 mg/l CaCL x 2 H2O, 20 g/l MES, 1 g/l extrato de levedura, 0,4 g/l L-cisteína HCI, 20 mg/l ácido nitriiotriacético, 10 mg/l MnSC»4 x H2O, 8 mg/l (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H2O, 2 mg/l C0CI2 x 6 H2O, 2 mg/l ZnS04 x 7 H2O, 0,2 mg/l CuCI2 x 2 H2O, 0,2 mg/l Na2Mo04 x 2 H2O, 0,2 mg/l N1CI2 x 6 H2O, 0,2 mg/l Na2SeC>4, 0,2 mg/l Na2WÜ4 x 2 H2O, 20 pg/l d-Biotina, 20 pg/l ácido fólico, 100 pg/l piridoxina HCi, 50 pg/l de tiamina-HCI x H2O, 50 pg/l de riboflavina, 50 pg/l ácido nicotínico, 50 g/l pantotenato-Ca, 1 pg/l de vitamina B12, 50 pg/l p-aminobenzoato, 50 pg/l ácido lipóico. A cultura foi então continuamente gaseificada com gás de síntese (67% de H2, 33% de CO2X a um caudal de 3 l/h através de um filtro com um tamanho de poro de 10 pm. As células em crescimento na fase logarítmica tardia, a uma DO de 0,37, foram centrifugadas anaerobicamente (4500 rpm, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento celular foi novamenfe suspenso em 10 ml de tampão de carbonato. As células assim preparadas foram em seguida utilizadas na inoculação levada a cabo nos testes reais.

[038] Durante a amostragem, colheu-se 5 ml de amostra para determinação da DOeoo, pH e espectro do produto. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopia quantitativa de RMN de 1H. Como padrão interno de quantificação utilizou-se trimetilsililpropionato de sódio (T(M)SP).

[039] O consumo de gás em ambos os reatores foi determinado desde o início do consumo. O consumo total de gás no reator 1 com L-cisteína HCI a uma concentração de 0,1 g/l durante um período de teste de 92,3 h foi superior ao consumo do reator a uma concentração de L-cisteína HCI de 0,4 g/l. As concentrações de etanol e acetato na mistura com uma concentração de L-cisteína HCI de 0,1 g/l eram superiores às da mistura com uma concentração de 0,4 g/l de L-cisteína HCI após 92,3 h (Tabela 1).

[040] Tabela 1. Resultados da produção de acetato e etanol com diferentes concentrações de cisteína. (n.d.- não detectado) EXEMPLO 1b [041] O Exemplo 1 anterior foi repetido com apenas uma diferença, nomeadamente na velocidade de agitação dos frascos de septo para as produções autotróficas. A velocidade de agitação foi de 100 min-1.

[042] Um erro de anotação foi detectado no Exemplo 1, onde os resultados da cisteína nos reatores 1 e 2 foram trocados, Os resultados reais obtidos neste exemplo são dados na Tabela 1b.

[043] Tabela 1b. Resultados da produção de acetato e etanol com diferentes concentrações de cisteína. (n.d.- não detectado) EXEMPLO 2 [044] Produção autotrófica em tampão de carbonato de C. Ijungdahlii e gás de síntese com 0,4 g/l de L-Cisteína HCI e sem L-Cisteína HCI

[045] A estirpe Clostridium Ijungdahlii do tipo selvagem foi usada sob condições de crescimento limitado para a formação autotrófica de produtos em tampão de carbonato com 0,4 g/l de cloridrato de L-cisteína.

[046] Na produção, utilizou-se tampão de carbonato anaeróbico (ajustado com KOH, 1,87 g/l). A única adição ao tampão foi L-cisteína HCI a uma concentração de 0,4 g/l ou então sem qualquer adição.

[047] Produções autotróficas idênticas foram realizadas em frascos de septo de 500 ml com 100 mL de carbonato num banho de água aberto agitado (Innova 3100 da New Brunswick Scientific) a 100 min'1. As produções foram realizadas a 37 °C, com controlo manual do pH Quando o pH desceu abaixo de 5,5, KOH foi doseado de uma solução de reserva de 187 g/l. Nos presentes testes, o pH em ambos os reatores foi medido decorridas 50,3 h e 73,3 h e foi corrigido pela adição de 1,87 g/l de KOH a cada um manualmente.

[048] Os reatores foram inoculados com uma mistura de gás de síntese de 67% de H2 e 33% de CO2 pressurizada com uma sobrepressão de 0,8 bar. Para repor o gás consumido, a atmosfera do espaço livre dos reatores era completamente substituída uma vez por dia e os reatores eram pressurizados novamente para 0,8 bar.

[049] O reator 1 continha uma concentração de L-cisteína HCI de 0 g/l e o reator 2 uma concentração de L-cisteína HCI de 0,4 g/l.

[050] Os reatores foram iniciados com células autotróficas a uma OD de 0,2. A précultura foi realizada continuamente num frasco de 1 L com 500 ml de meio complexo. O meio complexo continha 1 g/l NH4CI, 0,1 g/l KCI, 0,2 g/l MgS04 x7 Η2θ, 0,8 g/l NaCI, 0,1 g/l KH2PO4, 20 mg/l CaCI2 x 2 H2O, 20 g/l MES, 1 g/l extrato de levedura, 0,4 g/l L-cisteína HCI, 20 mg/l ácido nitrilotriacético, 10 mg/l MnS04 H2O x, 8 mg/l (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H20, 2 mg/l C0CI2 x 6 H2O, 2 mg/l 2nSÜ4 x 7 H20, 0,2 mg/l CuCI2 * 2H20, 0,2 mg/l Na2MoC>4 x 2 H2O, 0,2 mg/l N1CI2 x 6 H2O, 0,2 mg/l Na2Se04, 0,2 mg/l Na2WC>4 x 2 H2O, 20 pg/l d-biotina, 20 pg/l ácido fólico, 100 pg/l piridoxina HCI, 50 pg/l tiamina-HCI x H20. 50 pg/l de riboflavina, 50 pg/l ácido nicotínico, 50 pg/l pantotenato-Ca, 1 pg/l de vitamina B12, 50 pg/l p-aminobenzoato, 50 pg/l ácido lipóico. A gaseificação da cultura com gás de síntese (67 % H2, 33 % CO2) foi realizada continuamente a um caudal de 3 l/h através de um filtro com um tamanho de poro de 10 pm. As células em crescimento na fase logarítmica tardia, a uma DO de 0,23, foram centrifugadas anaerobicamente (4500 rpm, 4300 g, 20 °C, 10 min). O sobrenadante foi descartado e o sedimento celular foi novamente suspenso em 10 ml de tampão de carbonato. As células assim preparadas foram em seguida utilizadas na inoculação levada a cabo nos testes reais.

[051] Durante a amostragem, colheu-se 5 ml de amostra para determinação da ΟΟθοο, pH e espectro do produto. A determinação da concentração do produto foi realizada por espectroscopia quantitativa de RMN de 1H. Como padrão interno de quantificação utilizou-se trimetilsililpropionato de sódio (T(M)SP).

[052] O consumo de gás em ambos os reatores foi determinado desde o início. O consumo total de gás no reator 2 com L-cisteína HCI a uma concentração de 0,4 g/l durante um período de teste de 98,8 h foi superior ao consumo do reator a uma concentração de L-cisteína HCI de 0 g/l. As concentrações de etanol e acetato formadas com uma concentração de L-cisteína HCI de 0,4 g/l no final de 98,8 h de reação eram superiores às produzidas no reator em que nenhuma L-cisteína HCI foi adicionada.

[053] Tabela 2 Formação de produtos de culturas de Closfridium Ijungdahlii em meio complexo com gás de síntese a 67% H2 e 33% CO2 para diferentes concentrações iniciais de L-cisteína. (n.d. = não detectado) EXEMPLO 3 [054] Formação de ácido acético e etanol a partir de gás de síntese com Clostridium Ijungdahlii e suplementação de cisteína [055] Para a biotransformação de hidrogênio e dióxido de carbono em ácido acético e etanol, a bactéria homoacetogênica Clostridium Ijungdahlii foi cultivada em gás de síntese com suplementação de cisteína. Todas as etapas de cultura foram realizadas em condições anaeróbias em frascos de vidro resistentes à pressão que podiam ser fechados hermeticamente com uma rolha de borracha butílica [056] Para a précultura de C. Ijungdahlii, 500 ml de meio {meio ATCC1754: pH = 6.0; 20 g/l MES; 1 g/l extrato de levedura, 0,8 g/l NaCI; 1 g/l NH4CI; 0,1 g/l KCI; 0,1 g/l KH2PO4; 0,2 g/l MgS04 x 7 H2O; 0,02 g/l CaCI2 x 2 H20; 20 mg/l ácido nitrilotriacético; 10 mg/l MnSC>4 x H20; 8 mg/l (NH4)2Fe(S04)2 x 6 H20; 2 mg/l CoCI2 x 6 H20; 2 mg/l ZnSCk x 7 H2O; 0,2 mg/l CuCl2 x 2 H2O; 0,2 mg/l Na2MoÜ4 x 2 H2O; 0,2 mg/l N1CI2 x 6 H2O; 0,2 mg/l Na2SeÜ4; 0,2 mg/l Na2WÜ4 x 2 H2O; 20 pg/l d-biotina; 20 pg/l ácido fólico; 100 Mg/l piridoxina-HCI; 50 pg/l tiamina-HCI x H2O; 50 pg/l riboflavina; 50 pg/l ácido nicotínico; 50 pg/l pantotenato-Ca; 1 pg/l vitamina B12; 50 pg/l p-aminobenzoato; 50 pg/l ácido lipóico; aprox. 67,5 mg/l NaOH), com mais 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e 400 mg/l Na2S x 9 H2O foram inoculados com 5 mL de um caldo Cryo congelado. A cultura quimiolitoautotrófica foi realizada num frasco de vidro de 1 L resistente à pressão, a 37 °C, 100 rpm e um caudal de ventilação de 3 l/h de uma pré-mistura gasosa com 67% de H2, 33% de CO2, num banho de água agitado aberto, durante 69 h, até uma DOeoonm > 0,4. O gás era introduzido no meio através de um difusor com um tamanho de poros de 10 pm montado no centro dos reatores. Em seguida, a suspensão de células foi centrifugada e o sedimento celular foi ressuspenso em meio mineral CGF1 fresco como divulgado a seguir.

[057] Para a fase de produção, células lavadas da précultura de C. Ijungdahlii, tantas quantas necessárias para atingir uma DOeoonm de 0,2, foram adicionadas a 100 ml de meio mineral (meio CGF1, pH 6.5, 1.4 g/l KOFI, 2 g/l (NH4)2S04, 1 g/l KH2PO4, 1 g/l K2HPO4, 10 mg/l FeS04 X 7 H2O, 3,8 mg/l MnS04 X 1 H2O, 246 mg/l MgSCU x 7 H2O, ventilado durante 30 min com uma pré-mistura gasosa de 67% H2 e 33% CO2). No início, a cultura A (apresentada na Tabela 3) foi suplementada com mais 400 mg/l de cloridrato de L-cisteína e as culturas B e C com 200 mg/l de cloridrato de L-cisteína cada uma. A cultura foi realizada em frascos de vidro resistentes à pressão, de 500 mL, a 37 °C e 150 rpm, num banho de água aberto agitado, durante 163 h, que foram ventilados para uma sobrepressão de 0,8 bar com uma pré-mistura gasosa de 67% H2, 33% CO2 , uma vez por dia. Manteve-se um pH > 5,0 por adições intermitentes de uma solução de KOFI a 140 g/l. Durante a cultura, colheram-se várias amostras de 5 ml para determinar a DOeoonm, pH e formação de produtos. A cultura C foi suplementada com 200 mg/l de cloridrato de L-cisteína após 18, 41, 65 e 89 h de cultura. A determinação das concentrações de produtos, incluindo a concentração de L-cisteína, foi realizada por espectroscopia semiquantitativa de 1H-NMR. Como padrão interno de quantificação utilizou-se trimetilsililpropionato de sódio (T(M)SP).

[058] Durante a fase de produção, as concentrações de acetato e etanol na cultura C aumentaram mais do que na cultura A e B (ver Tabela 3), e a cultura C apresentava também maior crescimento de células do que as culturas A e B. Em todas as três culturas, a L-cisteína adicionada foi consumida na totalidade.

[059] Tabela 3: Crescimento celular e formação de produtos de culturas de Clostridium Ijungdahlii em meio mineral CGF1 com gás de síntese a 67% H2 e 33% CO2 para diferentes concentrações iniciais de L-cisteína e realimentação parcial de L-cisteína. (n,d. = não detectado) REIVINDICAÇÕES

Claims (15)

1. Método de cultura de pelo menos uma bactéria acetogênica, sendo o método caracterizado por compreender o crescimento da bactéria num meio aquoso constituído por uma quantidade de cisteína e/ou cistina, em que a concentração de cisteína e/ou cistina no meio é mantida num intervalo de concentração de 0,05 g/l a 0,20 g/l.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a concentração de cisteína e/ou cistina no meio ser mantida a cerca de 0,10 g/l.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a concentração de cisteína e/ou cistina no meio ser mantida a cerca de 0,08 g/l.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o meio compreender adicionalmente uma fonte de carbono constituída por CO e/ou CO2.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a fonte de carbono compreender pelo menos 50% em peso de CO e/ou CO2.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a bactéria acetogênica ser selecionada do grupo constituído por Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacierium malicum (DSM 4132), espécie de Acetobacterium no. 446, Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Clostridium aceticum (DSM 1496), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 e DSM 23693), Clostridium carboxidivorans (DSM 15243), Clostridium coskatii (ATCC no. PTA-10522), Clostridium drakei (ATCC BA-623), Clostridium formicoaceticum (DSM 92), Clostridium glycolicum (DSM 1288), Clostridium Ijungdahlii (DSM 13528), Clostridium Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium Ijungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Clostridium Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989), Clostridium mayombei (DSM 6539), Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostridium ragsdalei (DSM 15248), Clostridium scatologenes (DSM 757), espécie de Clostridium ATCC 29797, Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1, Moorella thermoacetica (DSM 521), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440), Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030).

7. Método de produção de acetato e/ou etanol a partir de pelo menos uma fonte de carbono, sendo o método caracterizado por compreender a etapa de crescimento de pelo menos uma bactéria acetogênica num meio aquoso constituído por uma quantidade de cisteína e/ou cistina, em que a concentração de cisteína e/ou cistina no meio é mantida num intervalo de concentração de 0,05 g/l de 0,20 g/l.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a concentração de cisteína e/ou cistina no meio ser mantida a cerca de 0,10 g/l.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a concentração de cisteína e/ou cistina no meio ser mantida a cerca de 0,08g/l.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizado por a fonte de carbono compreender pelo menos 50% em peso de CO e/ou CO2.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, caracterizado por a bactéria acetogênica ser selecionada do grupo constituído por Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacterium malicum (DSM 4132), espécie de Acetobacterium no. 446, Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Clostridium aceticum (DSM 1496), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 e DSM 23693), Clostridium carboxidivorans (DSM 15243), Clostridium coskatii (ATCC no. PTA-10522), Clostridium drakei (ATCC BA-623), Clostridium formicoaceticum (DSM 92), Clostridium glycolicum (DSM 1288), Clostridium Ijungdahlii (DSM 13528), Clostridium Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium Ijungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Clostridium Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989), Clostridium mayombei (DSM 6539), Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostridium ragsdalei (DSM 15248), Clostridium scatologenes (DSM 757), espécie de Clostridium ATCC 29797, Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1, Moorella thermoacetica (DSM 521), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440), Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030).

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 11, caracterizado por a cisteína e/ou cistina presente no meio ser adicionada como um composto selecionado do grupo constituído por L-cisteína HCI, L-Cisteína, L-cisteína HCI (sem água) e L-Cisteína.H20.

13. Método de fermentação de gás de síntese para produzir acetato e/ou etanol, sendo o método caracterizado por compreender a cultura de pelo menos uma bactéria acetogênica num meio aquoso constituído por uma quantidade de cisteína e/ou cistina, no qual a cisteína e/ou cistina é mantida num intervalo de concentração de 0,05 g/l de 0,20 g/l.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a concentração de cisteína e/ou cistina no meio ser mantida a cerca de 0,10 g/l.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 ou 14, caracterizado por a bactéria acetogênica ser selecionada do grupo constituído por Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacterium malicum (DSM 4132), espécie de Acetobacterium no. 446, Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Ciostridium aceticum (DSM 1496), Ciostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 e DSM 23693), Ciostridium carboxidivorans (DSM 15243), Ciostridium coskatii (ATCC no. PTA-10522), Ciostridium drakei (ATCC BA-623), Ciostridium formicoaceticum (DSM 92), Ciostridium glycolicum (DSM 1288), Ciostridium Ijungdahlii (DSM 13528), Ciostridium Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988), Ciostridium Ijungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Ciostridium Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989), Ciostridium mayombei (DSM 6539), Ciostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Ciostridium ragsdalei (DSM 15248), Ciostridium scatologenes (DSM 757), espécie de Ciostridium ATCC 29797, Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium iimosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), Moorella sp. HUC22-1, Moorella thermoacetica (DSM 521), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440), Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030).