BR112014029200B1

BR112014029200B1 - Processo de fermentação de gás de síntese com redução ou remoção de elementos do meio de fermentação

Info

Publication number: BR112014029200B1
Application number: BR112014029200-0A
Authority: BR
Inventors: Syrona Scott; Ryan Senaratne; Ching-Whan Ko
Original assignee: Jupeng Bio (Hk) Limited
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2021-10-13
Also published as: US10100336B2; WO2013176947A1; MX2018010346A; JP2015519060A; WO2013176943A1; AU2013266671B2; US20160040192A1; RU2639525C2; ZA201409446B; NZ703382A; KR102133062B1; US20130316421A1; CA2874085A1; MX361320B; JP6405570B2; TW201400614A; BR112014029200A2; BR112014029200B8; MX2014014221A; EP2852674A1

Abstract

Meios e Processos de Fermentação Um processo para a fermentação de gás de síntese e um meio de fermentação proporcionam alta produtividade de etanol, ao mesmo tempo em que removem componentes do meio que foram previamente pensados serem essenciais. O processo é efetivo para proporcionar um STY específico de pelo menos cerca de 1 g de etanol / (L ? dia ? grama de células). Neste aspecto, o meio de fermentação tem uma razão de peso de NH4+ para B de cerca de 625: 1 ou mais ou uma razão em peso de NH4+ para Mn de cerca de 4050: 1 ou mais ou uma razão em peso de NH4+ para Mo de cerca de 2.500 : 1 ou mais ou uma proporção de NH4+ para Cu de cerca de 4.050: 1 ou mais; ou o meio de fermentação tem uma proporção em peso de P para B de cerca de 30: 1 ou mais ou uma proporção em peso de P para Mn de cerca de 190: 1 ou mais ou uma proporção em peso de P para Mo de cerca de 120: 1 ou mais ou uma proporção em peso de Mn de Cu de cerca de 190: 1 ou mais; ou o meio de fermentação tem uma razão de peso de K para B de cerca de 35: 1 ou (...).

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

[0001] Este Pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US n°. 61/650.098, 61/650.093, 61/650.077, 61/650.084 todos depositados em 22 de maio de 2012 e o Pedido de Patente Provisório US n°. 61/726.225 depositado em 14 de novembro de 2012, todos os quais são incorporados na sua totalidade como referência.

[0002] Processos e meios são fornecidos para a fermentação de gás de síntese. Mais especificamente, os processos e meios são fornecidos os quais fornecem um elevado nível de produtividade de etanol, mesmo após a remoção ou redução das concentrações de componentes que foram anteriormente considerados como sendo essenciais ou necessários em certos níveis de concentração.

ANTECEDENTES

[0003] As fermentações ocorrem em meios líquidos definidos. Estes meios normalmente incluem várias fontes de macro e micronutrientes que são importantes para melhorar o desempenho da fermentação. Os meios usados em conexão com os substratos menos comuns, tais como substratos gasosos, requerem meios bem definidos para otimizar o desempenho. As fermentações anaeróbicas também exigem meios bem definidos.

[0004] Os microrganismos anaeróbicos podem produzir etanol a partir de monóxido de carbono (CO) através da fermentação de substratos gasosos. As fermentações que utilizam microrganismos anaeróbicos do gênero Clostridium produzem etanol e outros produtos úteis. Por exemplo, a Patente US 5.173.429 descreve Clostridium ljungdahlii ATCC N°. 49587, um microrganismo anaeróbico que produz etanol e acetato a partir de gás de síntese. A Patente US 5.807.722 descreve um método e um aparelho para a conversão de gases residuais em ácidos orgânicos e álcoois utilizando Clostridium ljungdahlii ATCC N°. 55380. A Patente US 6.136.577 descreve um método e um aparelho para a conversão de gases residuais em etanol utilizando Clostridium ljungdahlii ATCC N°. 55988 e 55.989.

[0005] A Patente US 7.285.402 descreve meios conhecidos para uso na fermentação anaeróbica de substratos de gasosos para produzir etanol. Vários componentes e concentrações de componentes no meio são eficazes para fornecer altos níveis de produtividade de etanol. A eliminação de certos componentes e redução dos níveis de concentrações necessárias de outros componentes, mantendo a produtividade do etanol pode fornecer economias de custo significativas, especialmente em uma fermentação de escala comercial.

SUMÁRIO

[0006] Um processo para a fermentação de gás de síntese e um meio de fermentação fornece alta produtividade do etanol, ao mesmo tempo removendo os componentes do meio que anteriormente eram considerados essenciais. A remoção de certos componentes do meio e redução das concentrações de outros componentes do meio fornecem economias de custos operacionais significativas em escala comercial.

[0007] Em um aspecto, um processo de fermentação inclui gás de síntese de fermentação em um meio de fermentação. O processo é eficaz para fornecer um STY específico de pelo menos cerca de 1 g de etanol/(L • dia • gramas de células). Neste aspecto, o meio de fermentação tem menos do que cerca de 1,04 ppm de boro, menos do que cerca de 0,16 ppm de manganês, menos do que cerca de 0,26 ppm de molibdênio, ou menos do que cerca de 0,16 ppm de cobre.

[0008] Em outro aspecto, um meio de fermentação inclui, pelo menos, cerca de 112 mg de nitrogênio, por grama de células produzidas, pelo menos, cerca de 10,5 mg de fósforo por grama de células produzidas, ou, pelo menos, cerca de 26 mg de potássio por grama de células produzidas. Noutro aspecto, o meio de fermentação tem menos do que cerca de 1,04 ppm de boro, menos do que cerca de 0,16 ppm de manganês, menos do que cerca de 0,26 ppm de molibdênio, ou menos do que cerca de 0,16 ppm de cobre.

[0009] Noutro aspecto, um processo de fermentação inclui gás de síntese de fermentação em um meio de fermentação. O processo eficaz para fornecer um STY específico de pelo menos cerca de 1 grama de etanol/(L ao dia de gramas de células). O meio de fermentação tem uma razão de peso de NH4+para B de cerca de 625:1 ou mais, ou uma razão de peso de NH4+para Mn de cerca de 4050:1 ou mais, ou uma razão de peso de NH4+para Mo de cerca de 2500:1 ou mais, ou uma razão de peso de NH4+para Cu de cerca de 4050:1 ou mais; ou o meio de fermentação tem uma razão de peso de P para B de cerca de 30:1 ou mais, ou uma razão de peso de P para Mn de cerca de 190:1 ou mais, ou uma razão de peso de P para Mo de cerca de 120:1 ou mais, ou uma razão de peso de Mn para Cu de cerca de 190:1 ou mais; ou o meio de fermentação tem uma razão de peso de K para B de cerca de 35:1 ou mais, ou uma razão de peso de K para Mn de cerca de 245:1 ou mais, ou uma razão de peso de Mo para K de cerca de 150:1 ou mais, ou uma razão de peso de K para Cu de cerca de 245:1 ou mais.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0010] A descrição seguinte não deve ser tomada em um sentido limitativo, mas é feita apenas com a finalidade de descrever os princípios gerais dos aspectos exemplares. O escopo da invenção deve ser determinado com referência às Reivindicações.

[0011] Um processo e composição do meio são fornecidos os quais, surpreendente e inesperadamente fornecem um alto nível de produtividade de etanol, mesmo após a remoção ou redução de concentrações de um ou mais componentes que foram anteriormente considerados essenciais ou necessários em certos níveis de concentração. Neste aspecto, o meio pode ter os níveis de concentração reduzidos de um ou mais nutrientes que incluem B, Mn, Mo e Cu. As concentrações de nutrientes no meio podem ser como segue:

[0012] B: menos do que cerca de 1,04 ppm de B, em outro aspecto, menos do que cerca de 1,0 ppm de B, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,75 ppm de B, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,5 ppm de B e, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,025 ppm de B;

[0013] Mn: menos do que cerca de 0,16 ppm de Mn, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,15 ppm de Mn, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,10 ppm de Mn, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,05 ppm de Mn e, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,0025 ppm Mn;

[0014] Mo: menos do que cerca de 0,26 ppm de Mo, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,25 ppm de Mo, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,20 ppm de Mo, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,10 ppm de Mo e noutro aspecto, menos do que cerca de 0,001 ppm Mo; ou

[0015] Cu: menos do que cerca de 0,16 ppm de Cu, noutro aspecto, menos do que cerca de 0,15 ppm de Cu, noutro aspecto, menos do que cerca de 0,10 ppm de B, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,05 ppm de B e, em outro aspecto, menos do que cerca de 0,01 ppm B.

[0016] Noutro aspecto, as razões de peso podem ser como segue:

[0017] NH4+para B: cerca de 625:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 650:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 675:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 700:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 750:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 800:1 ou mais; ou

[0018] NH4+para Mn: cerca de 4050:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 4100:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 4200:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 4300:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 4400:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 4500:1 ou mais; ou

[0019] NH4+para Mo: cerca de 2500:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 2600:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 2700:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 2800:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 2900:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 3000:1 ou mais; ou

[0020] NH4+para Cu: cerca de 4050:1 ou mais; em outro aspecto, de cerca de 4100:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 4200:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 4300:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 4400:1 ou mais e, em outro aspecto, sobre 4500:1 ou mais; ou

[0021] P para B: cerca de 30:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 35:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 40:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 45:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 50:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 100:1 ou mais; ou

[0022] P para Mn: cerca de 190:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 200:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 225:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 250:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 275:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 300:1 ou mais; ou

[0023] P para Mo: cerca de 120:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 130:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 140:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 150:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 175:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 200:1 ou mais; ou

[0024] P para Cu: cerca de 190:1 ou mais; noutro aspecto, de cerca de 200:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 225:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 250:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 275:1 ou mais e, em outro aspecto, sobre 300:1 ou mais; ou

[0025] K para B: cerca de 35:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 40:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 45:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 50:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 75:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 100:1 ou mais; ou

[0026] K para Mn: cerca de 245:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 250:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 260:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 270:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 280:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 300:1 ou mais; ou

[0027] K para Mo: cerca de 150:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 250:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 260:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 270:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 280:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 300:1 ou mais; ou

[0028] K para Cu: cerca de 245:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 250:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 260:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 270:1 ou mais, noutro aspecto, de cerca de 280:1 ou mais e, em outro aspecto, de cerca de 300:1 ou mais.

Definições

[0029] A menos que definido de outra forma, os seguintes termos como usados ao longo deste Relatório Descritivo para a presente descrição são definidos como segue e podem incluir tanto as formas singulares quanto plurais das definições abaixo definidas:

[0030] O termo “cerca de” que modifica qualquer quantidade refere- se à variação na quantidade encontrada em condições do mundo real, por exemplo, no laboratório, planta piloto, ou unidade de produção. Por exemplo, uma quantidade de um ingrediente ou de medição empregada em uma quantidade ou mistura quando modificada por “cerca de” inclui a variação e o grau de cuidado tipicamente empregado na medição em uma condição experimental na planta de produção ou laboratório. Por exemplo, a quantidade de um componente de um produto, quando modificada pela expressão “cerca de” inclui a variação entre bateladas em uma variedade de experimentos na planta ou no laboratório e a variação inerente ao método analítico. Sejam ou não modificados por “cerca de”, as quantidades incluem equivalentes a essas quantidades. Qualquer quantidade especificada neste documento e modificada por “cerca de” pode também ser empregue no presente Relatório Descritivo como a quantidade não modificada por “cerca de”.

[0031] O termo “syngas” ou “gás de síntese” significa gás de síntese que é o nome dado a uma mistura de gases que contém quantidades variáveis de monóxido de carbono e hidrogênio. Exemplos de métodos de produção incluem reforma a vapor do gás natural ou de hidrocarbonetos para produzir hidrogênio, a gaseificação do carvão e, em alguns tipos, de instalações de gaseificação de resíduos para produção de energia. O nome vem do seu uso como intermediários na criação de gás natural sintético (GNS) e para a produção de amônia ou metanol. O gás de síntese é inflamável e é frequentemente usado como uma fonte de combustível ou como um intermediário para a produção de outros produtos químicos.

[0032] Os termos “fermentação”, “processo de fermentação” ou “reação de fermentação” e semelhantes pretendem englobar tanto a fase de crescimento quanto a fase de biosíntese do produto do processo. Em um aspecto, a fermentação refere-se à conversão de CO para álcool.

[0033] O termo “densidade da célula” significa a massa de células de microrganismos por unidade de volume do caldo de fermentação, por exemplo, gramas/litro. Neste aspecto, o processo e os meios são eficazes para fornecer uma densidade da célula de pelo menos cerca de 1,0 g/L. A densidade da célula pode ser de cerca de 1 a cerca de 25 g/L, noutro aspecto, de cerca de 1 a cerca de 20 g/L, noutro aspecto, de cerca de 1 a cerca de 10 g/L, noutro aspecto, de cerca de 2 a cerca de 8 g/L, noutro aspecto, de cerca de 3 a cerca de 6 g/L e noutro aspecto, de cerca de 4 a cerca de 5 g/L.

[0034] O termo “reciclo de células” refere-se à separação das células microbianas a partir de um caldo de fermentação e retorno da totalidade ou parte dessas células microbianas separadas de volta ao fermentador. Geralmente, um dispositivo de filtração é usado para realizar separações.

Composição do Meio

[0035] Os processos e os meios aqui descritos são eficazes para fornecer um alto nível de produtividade. Neste aspecto, o processo é eficaz para fornecer um STY específico (rendimento de tempo no espaço específico, expresso como g de etanol/(L • dia • gramas de células) de pelo menos cerca de 1, noutro aspecto, de cerca de 1 a cerca de 10, noutro aspecto, de cerca de 2 a cerca de 8, em outro aspecto, de cerca de 3 a cerca de 7, e, noutro aspecto, de cerca de 4 a cerca de 6.

[0036] Em um aspecto relacionado, a produtividade pode ser expressa como STY (rendimento de tempo no espaço expresso em g de etanol/(L • dia). Neste aspecto, o processo é eficaz para fornecer um rendimento de STY (espaço de tempo) de pelo menos cerca de 10 g de etanol possíveis valores sTY/(L • dia). incluem cerca de 10 g de etanol/(L • dia) a cerca de 200 g de etanol/(L • dia), em outro aspecto, de cerca de 10 g de etanol/(L • dia) a cerca de 160 g de etanol/(L • dia), em outro aspecto, de cerca de 10 g de etanol/(L • dia) a cerca de 120 g de etanol/(L • dia), em outro aspecto, de cerca de 10 g de etanol/(L • dia) a cerca de 80 g de etanol/(L • dia), em outro aspecto, de cerca de 20 g de etanol/(L • dia) a cerca de 140 g de etanol/(L • dia), em outro aspecto, de cerca de 20 g de etanol/(L • dia ) a cerca de 100 g de etanol/(L • dia), em outro aspecto, de cerca de 40 g de etanol/(L • dia) a cerca de 140 g de etanol/(L • dia) e, em outro aspecto, de cerca de 40 g de etanol/(dia L •) a cerca de 100 g de etanol/(L • dia).

[0037] Noutro aspecto, o processo e os meios são eficazes para fornecer uma conversão de CO de pelo menos cerca de 5% a cerca de 99%, em outro aspecto, de cerca de 10% a cerca de 90%, em outro aspecto, de cerca de 20% a cerca de 80%, noutro aspecto, de cerca de 30% a cerca de 70% e, em outro aspecto, de cerca de 40% a cerca de 90%.

[0038] Em um aspecto, o meio inclui, pelo menos, uma ou mais de uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma ou mais fontes de fósforo e, pelo menos, uma ou mais de uma fonte de potássio. O meio pode incluir qualquer uma das três, qualquer combinação das três e em um aspecto importante, inclui todas as três. Uma fonte de nitrogênio pode incluir uma fonte de nitrogênio selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de amônio, fosfato de amônio, sulfato de amônio, nitrato de amônio e misturas dos mesmos. Uma fonte de fósforo pode incluir uma fonte de fósforo selecionada a partir do grupo que consiste em ácido fosfórico, fosfato de amônio, fosfato de potássio e misturas dos mesmos. Uma fonte de potássio pode incluir uma fonte de potássio selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de potássio, fosfato de potássio, nitrato de potássio, sulfato de potássio e misturas dos mesmos.

[0039] Em um aspecto, o meio inclui um ou mais de ferro, tungstênio, níquel, cobalto, magnésio, enxofre e tiamina. O meio pode incluir qualquer um destes componentes, qualquer combinação e em um aspecto importante, inclui todos esses componentes. Um ferro pode incluir uma fonte de ferro selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto ferroso, sulfato ferroso e misturas dos mesmos. Uma fonte de tungstênio pode incluir uma fonte de tungstênio selecionada do grupo que consiste em tungstato de sódio, tungstato de cálcio, tungstato de potássio e misturas dos mesmos. Uma fonte de níquel pode incluir uma fonte de níquel selecionada do grupo que consiste em cloreto de níquel, sulfato de níquel, nitrato de níquel e misturas dos mesmos. Uma fonte de cobalto pode incluir uma fonte de cobalto selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de cobalto, fluoreto de cobalto, brometo de cobalto, iodeto de cobalto e misturas dos mesmos. Uma fonte de magnésio pode incluir uma fonte de magnésio selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, fosfato de magnésio e misturas dos mesmos. Uma fonte de enxofre pode incluir cisteína, sulfito de sódio e misturas dos mesmos. As concentrações de vários componentes são as seguintes:

[0040] O processo de operação mantém um pH em uma faixa de cerca de 4,2 a cerca de 4,8. O meio inclui menos do que cerca de 0,01 g/L de extrato de levedura e menos do que cerca de 0,01 g/L de carboidratos.

Gás de Síntese

[0041] O gás de síntese pode ser fornecido a partir de qualquer fonte conhecida. Em um aspecto, o gás de síntese pode ser obtido a partir da gaseificação de materiais carbonáceos. A gaseificação envolve combustão parcial de biomassa em um fornecimento restrito de oxigênio. O gás resultante inclui principalmente CO e H2. Neste aspecto, o gás de síntese irá conter, pelo menos, cerca de 10% molar de CO, em um aspecto, pelo menos cerca de 20% molar, em um aspecto, de cerca de 10 a cerca de 100% molar, noutro aspecto, de cerca de 20 a cerca de 100% molar CO, noutro aspecto, de cerca de 30 a cerca de 90% molar de CO, em outro aspecto, de cerca de 40 a cerca de 80% molar de CO e noutro aspecto, de cerca de 50 a cerca de 70% molar de CO. O gás de síntese terá uma razão de CO/CO2 de pelo menos cerca de 0,75, noutro aspecto, pelo menos cerca de 1,0 e, noutro aspecto, pelo menos, cerca de 1,5. Alguns exemplos de métodos e aparelhos de gaseificação adequados são fornecidos nos números de série US 13/427.144, 13/427.193 e 13/427.247, todos os quais foram depositados em 22 de Março de 2012 e todos os quais são aqui incorporados por referência.

[0042] Noutro aspecto, o gás de síntese usado para a propagação de bactérias acetogênicas pode ser substancialmente CO. Tal como usado no presente documento, “substancialmente CO” significa pelo menos cerca de 50% molar de CO, noutro aspecto, pelo menos cerca de 60% molar de CO, noutro aspecto, pelo menos cerca de 70% molar de CO, noutro aspecto, pelo menos cerca de 80% molar de CO e noutro aspecto, pelo menos cerca de 90% molar de CO.

Operação em Bioreator

[0043] De acordo com um aspecto, o processo de fermentação é iniciado pela adição do meio ao vaso reacional. O meio é esterilizado para remover microrganismos indesejáveis e o reator é inoculado com os microrganismos desejados. Em um aspecto, os microrganismos usados incluem bactérias acetogênicas. Exemplos de bactérias acetogênicas úteis incluem as do gênero Clostridium, tais como cepas de Clostridium ljungdahlii, incluindo aquelas descritos no documento WO 2000/68407, EP 117309, Patente US n°s. 5.173.429, 5.593.886 e 6.368.819, WO 1998/00558 e WO 2002/08438, cepas de Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 e DSM 19630 de DSMZ, Alemanha), incluindo aquelas descritos no documento WO 2007/117157 e WO 2009/151342 e Clostridium ragsdalei (P11, ATCC BAA-622) e Alkalibaculum Bacchi (CP11, ATCC BAA-1772 ) incluindo aquelas descritas, respectivamente, na Patente US 7.704.723 e “Biocombustíveis e Bioprodutos a partir de Gás de Síntese gerado da Biomassa”, Hasan Atiyeh, apresentado na Conferência State Anual EPSCoR de Oklahoma, em 29 de abril de 2010 e Clostridium carboxidivorans (ATCC PTA-7827) descrito no Pedido de Patente US No. 2007/0276447. Outros microrganismos adequados incluem os do gênero Moorella, incluindo Moorella sp. HUC22-1 e os do gênero Carboxydothermus. Cada uma destas referências é aqui incorporada por referência. Podem ser usadas culturas mistas de dois ou mais microrganismos.

[0044] Alguns exemplos de bactérias úteis incluem Acetogenium kivui, Acetoanaerobium noterae, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi CP11 (ATCC BAA-1772), Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acetobutylicum P262 (DSM 19630 de DSMZ Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 de DSMZ Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 de DSMZ Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 23693 de DSMZ Alemanha), Clostridium autoethanogenum (DSM 24138 de DSMZ Alemanha), Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Clostridium coskatii (ATCC PTA- 10522), Clostridium drakei, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55889), Clostridium magnum, Clostridium pasteurianum (DSM 525 de DSMZ Alemanha), Clostridium ragsdali P11 (ATCC BAA-622), Clostridium scatologenes, Clostridium thermoaceticum, Clostridium ultunense, Desulfotomaculum kuznetsovii, Eubacterium limosum, Geobacter sulfurreducens, Methano- sarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Morrella thermoacetica, Morrella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus, Ruminococcus productus, Thermoanaerobacter kivui e misturas dos mesmos.

[0045] Após a inoculação, uma taxa de fornecimento de gás de alimentação inicial é estabelecida eficaz para o abastecimento da população inicial de microrganismos. O gás efluente é analisado para determinar o teor do gás efluente. Os resultados da análise de gás são usados para controlar as taxas de alimentação de gás. Ao atingir os níveis desejados, em fase líquida e o material celular é retirado do reator e reabastecido com meio. Neste aspecto, o biorreator é operado para manter uma densidade da célula de pelo menos cerca de 2 gramas/litro e, em outro aspecto, de cerca de 2 a cerca de 50 gramas/litro, em vários outros aspectos, cerca de 5 a cerca de 40 gramas/litro, cerca de 5 a cerca de 30 gramas/litro, cerca de 5 a cerca de 20 gramas/litro, cerca de 5 a cerca de 15 gramas/litro, cerca de 10 a cerca de 40 gramas/litro, cerca de 10 a cerca de 30 gramas/litro, cerca de 10 a cerca de 20 gramas/litro e de cerca de 10 a cerca de 15 gramas/litro. A densidade da célula pode ser controlada através de um filtro de reciclagem. Uma descrição mais detalhada da operação do biorreator é estabelecida no Pedido Provisório US n°. 61/571.564, depositado em 30 de junho de 2011, Pedido Provisório US n°. 61/571.565, depositado em 30 de junho de 2011 e no Pedido Provisório US n°. 61/573.845, depositado em 13 de setembro de 2011, todos os quais sendo aqui incorporados por referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: Fermentação com Limitações de Boro, Cobre e Manganês

[0046] Os experimentos foram conduzidos em um biorreator (New Brunswick Bioflo I ou II-c) operado como um CSTR de transporte ascendente, sem purga permeada. As condições de funcionamento do biorreator foram como segue: Tipo de Cultura foi Clostridium ljungdahlii C01. A temperatura da cultura foi mantida a 38-39°C. A agitação foi de 850 rpm em uma leitura analógica. O volume de cultura não estimulada foi ~1600 - 1650 ml. O ponto final de pH da cultura foi de 4,5. Uma solução de NaHCO3 a 7,7% foi usada para o controle do pH. O gás de alimentação era uma mistura sintética de 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO e 10% de CO2 alimentada à cultura a uma taxa de 282 ml/min. O meio foi alimentado para o reator a ~0,88 ml/min, ou ~1300 ml/dia. Os líquidos e os tempos de retenção das células foram de aproximadamente 29 - 31 horas. O meio de partida usado foi tal como descrito abaixo.

* Concentração de Na+ é de apenas NaCl. Não inclui Na+ a partir dos outros componentes, tais como Na2WO4 • 2H2O. ** Concentração de Ca+2 não inclui o cálcio do ácido pantotênico, sal de cálcio como outras fontes fornecem apenas quantidades traços ou insignificantes de cálcio.

[0047] O biorreator foi operado até que a cultura fosse obtida em um estado estacionário de alta produtividade. O estado estacionário de alta produtividade foi definido como ~2,5-3 g/L de densidade da célula, uma concentração de etanol de > 20 g/L, uma absorção de CO de > 3,0 mmol/min e um consumo de hidrogênio de > 0,5 mmol/min. No processo de obtenção de um estado estacionário de alta produtividade, a concentração de CaCl2 • 2H2O foi reduzida para zero e a concentração de amônio foi reduzida para 546 ppm.

[0048] Uma vez que a cultura estava em um estado estacionário de alta produtividade, as fontes de B, Mn e Cu foram eliminadas do meio de preparação. Imediatamente antes da remoção desses componentes, as condições/parâmetros de cultura foram como segue: Densidade da célula - 2,9 g/L Conversão de CO - 86% Conversão de H2 - 32% Absorção de CO - 3,0 mmol/min Absorção de H2 - 0,54 mmol/min Etanol - 21,8 g/L Acetil Total - 2,7 g/L Butanol - 0,35 g/L

[0049] Os parâmetros de cultura de absorção de gás, H2 e CO, concentrações do produto e a densidade de células foram, então, monitorados para quaisquer efeitos adversos. Se a remoção de B, Cu e Mn não afetasse os parâmetros depois de vários (> 3) tempos de retenção de células, eles eram considerados desnecessários para a cultura.

[0050] Após tempos de retenção de células de ~5,7 (170 horas), a concentração de boro, cobre e manganês no caldo de cultura tinha caído para ~0,41% das concentrações iniciais (0,0043 ppm de B, 0,0006 ppm de Cu e 0,0068 ppm de Mn abaixo de 1,05 ppm de B, 0,149 ppm de Cu e 1,67 ppm Mn). As demais concentrações de componentes estimadas no caldo foram determinadas por cálculos de washout usando uma concentração de cálcio de partida, MFR, LRT e quaisquer acréscimos desses componentes através de qualquer meio ou dopagem no biorreator. Não houve efeitos adversos no desempenho da cultura.

[0051] Depois de 170 horas com nenhuma adição de boro, cobre e manganês, os parâmetros/condição de cultura foram como segue: Densidade da célula - 2,9 g/L Conversão de CO - 86% Conversão de H2 - 36% Absorção de CO - 3,0 mmol/min Absorção de H2 - 0,61 mmol/min Etanol - 21,0 g/L Acetil Total - 2,9 g/L Butanol - 0,32 g/L

Exemplo 2: Fermentação com Limitações de cobalto

[0052] Os experimentos foram conduzidos em um biorreator (New Brunswick Bioflo I ou II-c) operado através de CSTR de transporte ascendente, sem circuito de reciclagem celular. As condições de funcionamento do biorreator foram como segue: Tipo de Cultura foi Clostridium ljungdahlii C01. A temperatura da cultura foi mantida a 37-39°C. A agitação era de 850 rpm em uma leitura analógica (agitação real foi de 931 rpm, com base em uma curva de calibração de tacômetro). O volume de cultura não estimulada foi ~1600 - 1650 ml. Volume de cultura estimulada foi ~1950 ml. O ponto final do pH da cultura foi de 4,5. Uma solução de NaHCO3 a 7,7% foi usada para o controle do pH. O Gás de alimentação era uma mistura sintética de 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO e 10% de CO2 alimentada à cultura a uma taxa de 286 ml/min. O meio foi alimentado para o reator a ~0,83 a ~0,86 ml/min, ou ~1220 ml/dia. Os tempos de retenção de células e líquidos foram de aproximadamente 31 - 33 horas. O meio usado foi como descrito abaixo.

Concentração de Na+ é de apenas NaCl. Não inclui Na+ a partir dos outros componentes, tais como Na2WO4 • 2H2O.

[0053] O biorreator foi operado até que a cultura fosse obtida em um estado estacionário de alta produtividade. O estado estacionário de alta produtividade foi definido como ~2,5-3 g/L de densidade da célula, uma concentração de etanol de > 20 g/L, uma absorção de CO de > 3,0 mmol/min e um consumo de hidrogênio de > 0,5 mmol/min.

[0054] Os parâmetros de cultura de absorção de gás, H2 e CO, concentrações do produto e a densidade de células foram, então, monitorados para quaisquer efeitos adversos. Se a redução na concentração de componente não afetar estes parâmetros após vários (> 3) tempos de retenção de células, a concentração pode ser ainda mais reduzida. Se, depois de uma redução em uma concentração de componente, uma queda nos parâmetros de cultura for vista, a concentração pode ser aumentada novamente para um nível que tinha anteriormente mostrado ser adequado. Se a cultura for recuperada, a concentração pode ser reduzida novamente, às vezes ao mesmo nível de antes de repetir o efeito, às vezes a um nível em algum lugar entre o que funcionou e o que causou problemas.

[0055] No início do experimento, a concentração de cobalto estava em níveis médios normais, ou 0,991 ppm. Os parâmetros de cultura eram estáveis a ~3 g/L de densidade da célula; 22-26 g/L de etanol; 2,7-3,7 g/L acetil; 3,1 mmol /min de absorção de CO; e 0,5-0,7 mmol/min de absorção de H2. O Cobalto foi removido a partir do meio partindo em t = 0 horas. Na medida em que o Cobalto estava sendo lavando para fora do fermentador, houve apenas uma ligeira queda na absorção de CO de 3,1 a 2,9 mmol/min. Todos os outros parâmetros permaneceram mais ou menos constantes até t = 121 horas. Naquele momento, a absorção de H2 e CO caiu para 0,16 e 2,6 mmol/min, respectivamente. O total de acetil também caiu rapidamente naquele momento para 0,77 g/L indicando que a concentração de cobalto tinha caído para, ou abaixo de, um nível de limitação. Os cálculos de washout de cobalto mostraram que pelo tempo que o nível baixo de cobalto estava afetando os parâmetros de cultura, a concentração de cobalto no reator tinha caído para 0,0222 ppm, ou 2,24% da concentração original. O Cobalto foi adicionado apenas no interior do reator, para elevar a concentração de 23,3% dos níveis normais, ou 0,231 ppm. O efeito foi imediatamente visto como um aumento na absorção de CO, H2 e absorção concentração de ácido. Nenhum Cobalto foi adicionado novamente para o meio, neste momento para deixar o Cobalto no reator para lavar novamente para níveis limitantes mais uma vez. Como visto anteriormente, os parâmetros de cultura continuaram a não mostrar nenhum sinal de emergência até que o Cobalto fosse reduzido abaixo de 0,0220 ppm. Em t = 210 horas, as absorções de H2 e CO bem como a concentração de ácido tinham caído todas, mais uma vez, mostrando os efeitos de limitação de cobalto. Neste momento, o Cobalto foi adicionado novamente ao reator e ao meio a 20% (0,198 ppm), no meio e 21,2% (0,21 ppm) no reator. Como antes, o efeito foi um aumento imediato tanto nas absorções de gás quanto na concentração do ácido.

[0056] Nos dois momentos diferentes, o cobalto foi removido do reator até que a cultura mostrou sinais de emergência resultantes em uma concentração de cobalto de ~0,022 ppm como limitantes para a cultura. Quando a concentração de cobalto foi, então, fixada em 0,023 ppm, a cultura realizada bem sem nenhum efeito adverso. Com base naquela concentração de cobalto, os parâmetros calculados usados para correlacionar a melhor adição de nutrientes versos o desempenho da cultura foram como segue: O mg de cobalto adicionado por mmol de absorção de gás foi de 0,005 (mg/mmol). O μg de cobalto adicionado por grama de células produzidas foi ~9 (μg/g).

[0057] A recuperação de uma limitação de cobalto foi rápida, sem efeitos adversos duradouros. Nenhum dano permanente foi feito para a cultura se o cobalto fosse aumentado antes dos parâmetros caírem para o ponto de problemas secundários, ou seja, a toxicidade do gás ou sem ácido presente.

[0058] A queda dos níveis de cobalto fez com que a concentração de células caísse. Não houve nenhuma correlação clara entre a limitação de cobalto e a produção de butanol. A conversão/absorção de CO e H2 foi afetada pela limitação de cobalto, mas havia pouco ou nenhum efeito visto até que a concentração de cobalto na cultura caísse para ~0,022 ppm ou inferior. Não houve queda gradual na conversão de gás. No entanto, uma vez que a concentração de cobalto caiu além do ponto de limitação, ambas as conversões de CO e H2 caíram muito rapidamente. Uma vez que o CO e H2 conversões começaram a cair, a cultura já foi passado a concentração crítica de cobalto e de cobalto deve ser adicionado rapidamente, a fim de recuperar a cultura. Um indicador do início de limitação de cobalto foi a alteração a partir do ácido para etanol na razão do produto. A concentração de ácido começou a cair e a concentração de etanol começou a aumentar, mesmo antes das conversões de gás caindo serem vistas.

Exemplo 3: Fermentação com Limitações de Níquel

[0059] Os experimentos foram conduzidos em um biorreator (New Brunswick Bioflo I ou II-c) operado através de CSTR de transporte ascendente, sem purga permeada. As condições de funcionamento do biorreator foram como segue: Tipo de Cultura foi Clostridium ljungdahlii C01. A temperatura da cultura foi mantida a 37-39°C. A agitação foi de 700 rpm em uma leitura analógica. O volume de cultura não estimulada foi ~1500 - 1650 ml. O vVolume de cultura estimulada foi ~1900 ml. O ponto final do pH da cultura foi de 4,5. Uma solução de NaHCO3 a 7,7% foi usada para o controle do pH. O gás de alimentação era uma mistura sintética de 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO e 10% de CO2 alimentada à cultura a uma taxa de 290 ml/min. O meio foi alimentado para o reator a ~0,86 a ~0,88 ml/min, ou ~1250 ml/dia. Os tempos de retenção de células e líquidos foram de aproximadamente 27 - 31 horas. O meio usado foi como descrito abaixo.

* Concentração de Na+ é de apenas NaCl. Não inclui Na+ a partir dos outros componentes, tais como Na2WO4 • 2H2O. ** Ca+2 concentração não inclui o cálcio do ácido pantotênico, sal de cálcio.

[0060] O biorreator foi operado até que a cultura fosse obtida em um estado estacionário de alta produtividade. O estado estacionário de alta produtividade foi definido como ~2,5-3 g/L de densidade da célula, uma concentração de etanol de > 20 g/L, uma absorção de CO de > 3,0 mmol/min e um consumo de hidrogênio de > 0,5 mmol/min.

[0061] Os parâmetros de cultura de absorção de gás, H2 e CO, concentrações do produto e densidade de células foram, então, monitorados para quaisquer efeitos adversos. Se a redução na concentração de componente não afetar estes parâmetros após vários (> 3) tempos de retenção de células, a concentração pode ser ainda mais reduzida. Se, depois de uma redução na concentração de um componente, uma queda nos parâmetros de cultura for vista, a concentração pode ser aumentada novamente para um nível que mostrou anteriormente ser adequado. Se a cultura for recuperada, a concentração pode ser reduzida novamente, às vezes ao mesmo nível de antes de repetir o efeito, às vezes a um nível em algum lugar entre o que funcionou e o que causou problemas.

[0062] No início deste experimento, a concentração de níquel no reator tinha caído para 56% do nível de Ni original, ou 0,11 ppm. As concentrações de níquel no reator foram baseadas em cálculos de “washout” que utilizaram a concentração de níquel no meio, adições de Ni para o meio e/ou ao reator e que o líquido flui através do sistema para calcular a alteração na concentração de níquel no reator com o tempo. Na medida em que o Ni continuou a lavar para fora do reator os parâmetros de cultura não se alteraram. A densidade da célula permaneceu ~2,8 g/L; absorção de CO foi de ~3,2 mmol/min; absorção de H2 foi de ~0,7 mmol/min; a concentração de etanol foi de 24 g/L; e o nível de acetil total foi de ~2,5 g/L. No entanto, em cerca de t = 107 horas a morfologia da célula tinha começado a piorar. A porcentagem de células longas tinha aumentado de ~5% para 5-10% e o comprimento das células longas foi aumentando. As células longas estavam agora mostrando alguma deformação. O comprimento total das células médias também foi aumentando, mas com apenas ligeira ou nenhuma deformação. A concentração de níquel no reator tinha caído para 0,0996 ppm em torno do momento em que a morfologia da célula diminuiu.

[0063] A concentração de níquel no reator foi reduzida para 50%, 0,0988 ppm, em t = ~160 horas. Como antes, os parâmetros de cultura não variam muito. No entanto, a morfologia da célula foi pior quando observada em torno de t = 250 horas. A porcentagem de células de comprimento tinha aumentado para 10-20%, juntamente com o grau de flexão ou deformação dessas células longas. O restante da cultura foi contabilizado para ligeiramente longa em comprimento com uma flexão ligeira ocasional. Não houve células severamente flexionadas, como bobinas ou molas, mas havia várias células granulosas e células de corpos ocos vistas. Mais uma vez, nenhuma alteração para os parâmetros de cultura ou concentração de níquel foi feita.

[0064] A concentração de níquel no reator manteve-se em 50%, ou 0,0988 ppm, até t = 1885 horas. Com uma vazão média de ~0,87 ml/min, a taxa de alimentação de níquel foi de 0,12 mg/dia. Os parâmetros das culturas foram relativamente constantes na densidade de células de ~2,8 g/L, absorção de CO de ~3,2 mmol/min, absorção de H2 de ~0,7 mmol/min, ~25 g/L de etanol, ~2,5 g/L de acetil total e ~0,3 g/L de butanol. Na taxa de alimentação de 50% de níquel, o Ni foi adicionado a ~34 μg por grama de células produzidas, ~0,022 μg por mmol de absorção de gás. A morfologia da célula não continuou a piorar uma vez que a concentração de níquel foi de 0,0988 ppm. Manteve-se ~10% de células longas com ligeira deformação, ~5% de células muito longas com deformação moderada e o restante das células foi contabilizado para ligeiramente longas em comprimento com deformação ocasional.

[0065] Em t = 445 horas, a concentração de níquel no meio foi reduzida para 25% da original, ou de 0,049 ppm. Quase imediatamente foi observada uma alteração lenta, mas constante, para os parâmetros de cultura. A absorção de CO manteve-se constante a ~3,2 mmol/min, mas a absorção de H2 começou a diminuir de 0,7-0,8 mmol/min para 0,6-0,7 mmol/min dentro de ~120 horas de alteração de Ni. A concentração de etanol começou a cair a partir de ~24 g/L a ~21 g/L e o nível de acetil total também começou a cair a partir de ~2,5 g/L de ~2,0 g/L dentro de ~160 horas de alteração de Ni. A concentração de butanol começou um aumento lento, mas constante, tão logo o Ni foi diminuído no meio. A concentração tinha aumentado de ~0,21 g/L a ~0,34 g/L por ~635 horas após Ni ser reduzido. A morfologia da célula era relativamente inalterada. A taxa de alimentação de Ni inferior era agora 0,062 mg/dia. Nessa taxa de alimentação o Ni foi adicionado em ~18 μg por grama de células produzidas, ~0,011μ g por mmol de absorção de gás.

[0066] Para acelerar o efeito de uma concentração de Ni baixa sobre a cultura, o nível de Ni no meio caiu para 10% ou para a concentração original, ou 0,0198 ppm, em t = 638 horas. As mesmas tendências dos parâmetros de cultura continuaram como anteriormente, mas a uma taxa mais rápida. A absorção de H2 e a concentração de ácido continuou a diminuir. A densidade da célula e a absorção de CO não se alterou e a concentração de butanol continuou a subir. Ainda não houve alteração na densidade da célula, uma vez que permaneceu ~2,8 g/L. A absorção de hidrogênio foi ~0,5-0,6 mmol/min. A absorção de monóxido de carbono ainda foi ~3,2 mmol/min. As concentrações do produto foram ~21 g/L de etanol, ~1,5 g/L de acetil total e ~0,65 g/L de butanol. A concentração de Ni foi mantida a 10% durante mais 86 horas para determinar um efeito de prazo mais longo sobre os parâmetros e morfologia da célula. Não houve declíneo ainda maior nos parâmetros da cultura. A morfologia da cultura piorou um pouco mostrando um aumento no número de células longas, bem como um aumento do comprimento total das células. Aproximadamente 10-15% das células foram classificadas como longas com a deformação. O restante das células era de curtas a ligeiramente longas com a maioria das células em um comprimento médio e sem deformação. Com 10%, ou 0,01975 ppm, da concentração de Ni no meio, a taxa de alimentação de Ni foi de 0,025 mg/dia. Isto forneceu ~7 μg de Ni adicionado por grama de células produzidas, ou ~0,0048 μg de Ni adicionado por mmol de absorção de gás. Em t = 2270 horas, a concentração de níquel foi aumentada até 50%, ou 0,0988 ppm. A absorção de hidrogênio aumentou para ~0,7 mmol/min. A absorção de CO permaneceu ~3,2 mmol/min. Etanol subiu para ~24 g/L. Ácido aumentou para ~2,5 g/L. Butanol caiu para ~0,24 g/L e a densidade da célula permaneceu inalterada em ~2,9 g/L. A morfologia da célula também melhorou mostrando uma diminuição global no comprimento de células, bem como no número de células longas. Aproximadamente 5-10% das células foram classificadas como longas com leve deformação. O restante das células eram curtas a ligeiramente longas em comprimento com a maior parte delas com um comprimento médio apenas com deformação leve ocasional.

[0067] A diminuição da concentração de níquel no reator para 0,0988 ppm, ou 50%, não causou nenhuma alteração perceptível nos parâmetros de cultura. No entanto, a morfologia da célula piorou, mostrando um aumento do comprimento total da cultura em que até 20% das células foram consideradas longas com deformação de leve a moderada. A morfologia da célula não continuou a piorar, enquanto na concentração de 50% de Ni mostrando que a cultura podia se manter em estado estacionário sob essa condição.

[0068] Quando a concentração de níquel no meio foi caída para 25% da normal, ou 0,049 ppm, a concentração total de etanol e de acetil e a absorção de H2, todos começaram a cair. Ao mesmo tempo, a concentração de butanol começou a aumentar lentamente. Estas eram todas as indicações de que a cultura era limitada por Ni, mas a morfologia da célula permaneceu relativamente inalterada.

[0069] Com base na concentração de níquel calculada no reator na medida em que os parâmetros de cultura e a morfologia da célula começaram a diminuir, a morfologia foi a primeira a piorar na medida em que o Ni foi removido até 50%, ou 0,099 ppm. Na medida em que a concentração de níquel baixou ainda mais para 36%, ou 0,072 ppm, a concentração de butanol piorou. Em 29% de Ni, ou 0,057 ppm, a absorção de H2 começou a cair. Em seguida, finalmente, a 25% de Ni, ou 0,050 ppm, as concentrações de etanol e de ácido começaram a declinar. A 50% de Ni, apenas a morfologia da cultura foi afetada. Uma vez que o nível de Ni caiu ainda mais, a absorção da cultura e a produtividade diminuíram. Isto significa que uma concentração de níquel a 50% no meio, ou a uma taxa de alimentação de 0,12 mg/dia, era muito perto da limitação de Ni. Com base nos parâmetros de cultura e na taxa de alimentação de 0,12 mg/dia de Ni, o Ni foi adicionado a ~34 μg por grama de células produzidas, ~0,022 μg por mmol de absorção de gás.

[0070] Os sinais de limitação de Ni foram diminuídos com a absorção de H2, diminuição do nível de ácido e aumento do butanol seguido por uma concentração de etanol diminuída. Não houve alteração na densidade da célula observada. Eventualmente, a morfologia da célula foi afetada demonstrando um aumento no número total de células longas e no comprimento total dessas células longas. Em geral, na medida em que o comprimento das células aumentou, a célula tornou-se mais flexionada ou deformada.

Exemplo 4: Fermentação com Limitações de Tungstênio

[0071] Os experimentos foram conduzidos em um biorreator (New Brunswick Bioflo I ou II-c) operado através de CSTR de transporte ascendente, sem purga permeada. As condições de funcionamento do biorreator foram como segue: Tipo de Cultura foi Clostridium ljungdahlii C01. A temperatura da cultura foi mantida a 38-39°C. A agitação foi de 700 rpm em uma leitura analógica. O volume de cultura não estimulada foi ~1550 - 1700 ml. O volume de cultura estimulada foi ~1900 ml. O ponto final do pH da cultura foi de 4,5. Uma solução de NaHCO3 a 7,7% foi usada para o controle do pH. O gás de alimentação era uma mistura sintética de 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO e 10% de CO2 alimentado à cultura a uma taxa de 290 ml/min. O meio foi alimentado para o reator a ~0,86 a ~0,88 ml/min, ou ~1250 ml/dia. Os tempos de retenção de células e líquidos foram de aproximadamente 28-31 horas. O meio usado foi como descrito abaixo.

[0072] O biorreator foi operado até que a cultura fosse obtida em um estado estacionário de alta produtividade. O estado estacionário de alta produtividade foi definido como ~2,5-3 g/L de densidade da célula, uma concentração de etanol de > 20 g/L, uma absorção de CO de > 3,0 mmol/min e um consumo de hidrogênio de > 0,5 mmol/min.

[0073] Os parâmetros de cultura da absorção de gás, H2 e CO, concentrações do produto e a densidade de células foram, então, monitorados para quaisquer efeitos adversos. Se a redução na concentração de componente não afetar estes parâmetros após vários (> 3) tempos de retenção de células, a concentração pode ser ainda mais reduzida. Se, depois de uma redução na concentração de um componente, uma queda nos parâmetros de cultura for vista, a concentração pode ser aumentada novamente para um nível que mostrou anteriormente ser adequado. Se a cultura for recuperada, a concentração pode ser reduzida novamente, às vezes ao mesmo nível de antes de repetir o efeito, às vezes a um nível em algum lugar entre o que funcionou e o que causou problemas.

[0074] Durante o teste de fósforo, o tungstênio foi removido a partir do meio em t = 0 horas. A cultura não estava se recuperando como previsto, durante o teste de fósforo, apesar da adição de P novamente para dentro do reator e para dentro do meio de preparação. Quando uma série de tentativas para melhorar a cultura falhou, um tungstênio de recurso duradouro foi adicionado novamente para o reator a um nível normal ou 50%, ou 0,56 ppm, em t = 812 horas por adição de 8 mL de uma solução aquosa de 0,2 g/l de Na2WO4• 2H2O de 1,6 litros de cultura. Cálculos de remoção de tungstênio mostraram que o nível de tungstênio no reator tinha reduzido para <0,0001 ppm. Após a adição de tungstênio, a cultura respondeu quase imediatamente. A absorção de H2 começou a aumentar. Com as conversões de H2 melhoradas a vazão de gás de alimentação foi aumentada novamente para a configuração original de ~290 ml/min, por t = 885 horas. Isso aumentou as absorções de CO e H2 de volta para 3,2 e ~0,75 mmol/min, respectivamente. Com o aumento da absorção de gás a densidade de células aumentou para ~2,7 g/L e o nível de etanol aumentou para ~22 g/L. Os níveis totais de acetil e butanol permaneceram os mesmos em ~3,5 e ~0,45 g/L, respectivamente. Outra alteração na cultura foi uma melhora na morfologia da célula. Com a adição de tungstênio, o comprimento global da célula diminuiu significativamente e houve menos flexão e deformação das células.

[0075] Nenhum tungstênio foi adicionado novamente para o meio, a fim de reduzir o nível no reator de volta, a fim de tentar e determinar o nível de tungstênio exigido pela cultura. Na medida em que o tungstênio estava reduzindoa absorção de H2 iniciada para tendência de queda em torno de t = 904 horas. Nenhum tungstênio foi adicionado em qualquer reator ou meio. Por volta de t = 981 horas a concentração de butanol começou a aumentar lentamente. Em seguida, em torno de t = 1030 horas, a concentração de etanol começou a cair. Ainda nenhum tungstênio foi adicionado. Por t = 1100 horas a absorção de H2 foi de ~0,2 mmol/min; etanol foi de ~17 g/L; e butanol foi de ~0,74 g/L. A absorção de CO não foi afetada e a densidade da célula foi a mesma.

[0076] No instante t = 1100 horas o tungstênio foi adicionado ao reator a 50% do normal ou 0,56 ppm. Como visto anteriormente, a cultura começou a melhorar quase que imediatamente. A absorção de H2 começou a aumentar; a concentração de etanol aumentou; o nível de ácido caiu; a densidade da célula aumentou ligeiramente; e a concentração de butanol começou a diminuir. Até o final do período de relato a densidade da célula foi de ~3,3 g/L; a absorções de CO e H2 e foram ~3,2 e ~0,75 mmol/min, respectivamente; etanol foi de 22 g/L; ácido foi de ~2,5 g/L; e butanol foi de 0,52 g/L. O nível de tungstênio no reator reduziu novamente para 0,045 ppm, ou 4,0% da concentração original, até o final do período de relato.

[0077] A limitação de tungstênio foi cerca de 2,7% da concentração original anteriormente adicionada, ou 0,030 ppm. A cultura primeiro começou a mostrar sinais de emergência como uma diminuição da absorção de H2 quando o tungstênio reduziu novamente o reator para abaixo de 0,030 ppm. Naquela concentração, o tungstênio foi adicionado a 10 μg por grama de células produzidas, 0,0068 μg por mmol de absorção de gás.

Exemplo 5: Fermentação com Limitações de Boro, Cobre, Manganês e Molibdênio

[0078] Um reator New Brunswick Bioflow Cellii Gen 115 contendo um meio que não incluía qualquer um de B, Cu, Mn ou Mo (meio designado A) ou um meio conhecido (meio designado 402) que incluiu B, Cu, Mn e Mo foi inoculado com 0,39 g/L de crescimento ativamente da cepa de Clostridium ljungdahlii CO-1.

[0079] Depois, a inoculação da velocidade de agitação do reator foi regulada para 800 rpm. O gás e as amostras líquidas retirados do reator a intervalos aproximadamente de 1 hora foram analisados para consumo ou produção de vários componentes do gás, a concentração de caldo de ácido acético, concentração de caldo de etanol e a densidade óptica da cultura. Além disso, a composição dos vários gases no gás de síntese foi medida diariamente e o fluxo de gás de síntese para o reator foi medido em tempo real pelo controlador de fluxo de massa de regulação de gás de síntese para o reator. O fluxo de gás real foi calculado usando a equação obtida pela calibração do controlador de fluxo de massa. Os cálculos foram realizados para determinar a taxa de fluxo de gás necessária ao reator para manter uma porcentagem constante de absorção de H2 a partir de H2 no influxo de gás para o reator ou em outras palavras, neste experimento particular, a taxa de gás que flui para dentro do reator era manter de modo que a absorção de H2 da cultura é de 4,5% das moléculas totais de gás que flui para dentro do reator. Em seguida, o reator foi alimentado com gás a uma taxa calculada acima (para manter a porcentagem de absorção de H2 a partir da entrada para 4,5% do total das moléculas de gás).

[0080] Para todos os três experimentos, o sistema de reciclagem de células foi fixo ao reator antes da inoculação e teve meios que circulam através do sistema para toda a duração do experimento. Para o primeiro experimento com meio A, em 2,75 horas após a inoculação (após conversões de CO terem atingido 80% ou acima), o fluxo do meio do reator foi iniciado a 1,0 ml/min e o permeado foi tirado para fora do reator a 1,0 ml/min. A 6,83 horas após a inoculação, o fluxo do meio para o reator foi aumentado para 2,0 ml/min e o permeado foi tirado para fora do reator a 2,0 ml/min.

[0081] Para o segundo experimento com o meio 402, em 1,9 horas após a inoculação (após conversão de gás de CO ter atingido os 80% ou acima), o fluxo do meio ao reator foi iniciado a 2,0 ml/min e o o permeado foi retirado do reator a 2,0 ml/min.

[0082] Para o terceiro experimento, o meio A, a 2,0 horas após a inoculação (após conversões de gás de CO terem atingido 80% ou acima), o fluxo do meio para o reator foi iniciado a 2,0 ml/min e o permeado foi retirado do reator a 2,0 ml/min. Para todos os três experimentos, a introdução do sistema de reciclagem de células foi aplicada para remover rápida acumulação de etanol no reator.

[0083] O meio A e o meio 402 forneceram desempenhos próximos ou iguais para a absorção de hidrogênio com C. ljungdahlii.

Exemplo 6: Fermentação com Limitações de Molibdênio

[0084] Os experimentos foram conduzidos em um biorreator (New Brunswick Bioflo I ou II-c) operado através de CSTR de transporte ascendente, sem purga permeada. As condições de funcionamento do biorreator foram como segue: Tipo de Cultura foi Clostridium ljungdahlii C01. A temperatura da cultura foi mantida a 38-39°C. A agitação era de 850 rpm em uma leitura analógica. O volume de cultura não estimulada foi ~1600 - 1650 ml. O volume de cultura estimulada foi ~1900 ml. O ponto final do pH da cultura foi de 4,5. Uma solução de NaHCO3 a 7,7% foi usada para o controle do pH. O gás de alimentação era uma mistura sintética de 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO e 10% de CO2 alimentada à cultura a uma taxa de 282 ml/min. O meio foi alimentado para o reator a ~0,88 ml/min, ou ~1300 ml/dia. Os tempos de retenção de células e líquidos foram de aproximadamente 29-31 horas. O meio usado foi como descrito abaixo

[0085] O biorreator foi operado até que a cultura fosse obtida em um estado estacionário de alta produtividade. O estado estacionário de alta produtividade foi definido como ~2,5-3 g/L de densidade da célula, uma concentração de etanol de > 20 g/L, uma absorção de CO de > 3,0 mmol/min e um consumo de hidrogênio de > 0,5 mmol/min.

[0086] Os parâmetros de cultura de absorção de gás, H2 e CO, concentrações do produto e densidade de células foram, então, monitorados para quaisquer efeitos adversos. Se a redução na concentração de componente não afetar estes parâmetros após vários (> 3) tempos de retenção de células, a concentração pode ser ainda mais reduzida. Se, depois de uma redução na concentração de um componente, uma queda nos parâmetros de cultura for vista, a concentração pode ser aumentada novamente para um nível que mostrou anteriormente ser adequado. Se a cultura for recuperada, a concentração pode ser reduzida novamente, às vezes ao mesmo nível de antes de repetir o efeito, às vezes a um nível em algum lugar entre o que funcionou e o que causou problemas.

[0087] O teste de requisito de molibdênio foi iniciado em t = 0 hora, eliminando Na2MoO4 • 2H2O a partir da preparação do meio. Imediatamente antes da remoção desses componentes, as condições/parâmetros de cultura foram como segue: A densidade da célula - 3,2 g/L Conversão de CO - 86% Conversão de H2 - 36% A absorção de CO - 3,0 mmol/min A absorção de H2 - 0,56 mmol/min Etanol - 21,8 g/L Acetil Total - 2,3 g/L Butanol - 0,32 g/L

[0088] Após tempos de retenção de células de ~9,7 292 horas) a concentração de molibdênio contida no caldo de cultura caiu para < 0,0001% da concentração de início de 0,238 ppm de Mo. As concentrações dos componentes restantes estimadas no caldo foram determinadas por cálculos de washout utilizando uma concentração de partida de cálcio, MFR, LRT e quaisquer adições de Mo, quer através de meio ou de dopagens no biorreator. Não houve efeitos adversos no desempenho da cultura. Depois de 292 horas com nenhuma adição de molibdênio, os parâmetros/condição da cultura foram como segue: A densidade da célula - 2,9 g/L Conversão de CO - 86% Conversão de H2 - 36% A absorção de CO - 3,0 mmol/min A absorção de H2 - 0,61 mmol/min Etanol - 21,0 g/L Total de Acetil - 2,9 g/L Butanol - 0,32 g/L

Exemplo 7: Fermentação com Limitações de Magnésio

[0089] Os experimentos foram conduzidos em um biorreator (New Brunswick Bioflo I ou II-c) operado através de CSTR de transporte ascendente, sem circuito de reciclagem celular. As condições de funcionamento do biorreator foram como segue: Tipo de Cultura foi Clostridium ljungdahlii C01. Temperatura da cultura foi mantida a 37-39°C. A agitação foi feita a 880-890 rpm em uma leitura analógica. O volume de cultura não estimulada foi ~1275 ml. O volume de cultura estimulada foi ~1900 ml. O ponto final do pH da cultura foi de 4,2. Uma solução de NaHCO3 a 7,7% foi usada para o controle do pH. O gás de alimentação era uma mistura sintética de 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO e 10% de CO2 alimentada à cultura a uma taxa de 232 ml/min. O meio foi alimentado para o reator a ~0,70 ml/min, ou ~1008 ml/dia. Os tempos de retenção de células e líquidos foram de aproximadamente 29 - 31 horas. O meio usado foi como descrito abaixo.

[0090] O biorreator foi operado até que a cultura fosse obtida em um estado estacionário de alta produtividade. O estado estacionário de alta produtividade foi definido como ~2,5-3 g/L de densidade da célula, uma concentração de etanol de > 20 g/L, uma absorção de CO de > 3,0 mmol/min e um consumo de hidrogênio de > 0,5 mmol/min.

[0091] Os parâmetros de cultura de absorção de gás, H2 e CO, concentrações do produto e a densidade de células foram, então, monitorados para quaisquer efeitos adversos. Se a redução na concentração de componente não afetar estes parâmetros após vários (> 3) tempos de retenção de células, a concentração pode ser ainda mais reduzida. Se, depois de uma redução na concentração de um componente, uma queda nos parâmetros de cultura for vista, a concentração pode ser aumentada novamente para um nível que mostrou anteriormente ser adequado. Se a cultura for recuperada, a concentração pode ser reduzida novamente, às vezes ao mesmo nível de antes de repetir o efeito, às vezes a um nível em algum lugar entre o que funcionou e o que causou os problemas.

[0092] No início do experimento a concentração de magnésio era em níveis médios normaisde etanol ou 59,77 ppm. Os parâmetros de cultura eram estáveis em ~3,1 g/L de densidade da célula; 20,5 g/L de etanol; 3,0 g/L de acetil; 2,4 mmol/min de absorção de CO; e 0,42 mmol/min de absorção de H2. A concentração de magnésio foi diminuída para 14,97 ppm no meio de partida em t = 0 horas. Na medida em que o magnésio estava sendo removido do fermentador, todos os parâmetros foram monitorados para os efeitos potenciais sobre o desempenho da cultura. Depois de ~300 horas ou ~10 tempos de retenção de células, não houve efeitos negativos observados no desempenho da cultura. Houve uma queda quase imediata na concentração de acetil após a diminuição de magnésio, mas esta foi devido a um problema de alimentação do meio. Uma vez que o problema foi corrigido, a concentração de acetil aumentou para níveis semelhantes aos observados quando a concentração de Mg estava a 59,77 ppm. Concluiu-se que uma alimentação do meio contendo 14,97 ppm de Mg era capaz de sustentar uma cultura em ~3 g/L de densidade da célula a um tempo de retenção de células de ~30 horas. Mg a 59,77 ppm Densidade da célula - 3,1 g/L Conversão de CO - 84% Conversão de H2 - 32% A absorção de CO - 2,4 mmol/min A absorção de H2 - 0,42 mmol/min Etanol - 20,5 g/L Acetil total - 2,4 g/L Mg a 14,94 ppm Densidade da célula - 3,0 g/L Conversão de CO - 84% Conversão de H2 - 34% Absorção de CO - 2,4 mmol/min Absorção de H2 - 0,45 mmol/min Etanol - 21,0 g/L Acetil Total - 2,7 g/L

[0093] A concentração de magnésio foi reduzida ainda mais para 7,47 ppm no meio iniciando em t = 403 horas. Na medida em que o magnésio estava sendo removido do fermentador, todos os parâmetros foram monitorados para os efeitos potenciais sobre o desempenho da cultura. Depois de apenas 20 horas, a conversão e a absorção de hidrogênio começaram a diminuir. A concentração de Mg calculada na cultura foi de ~11 ppm. O desempenho da cultura continuou a diminuir com quedas nas conversões/absorção de CO, aumentando a concentração de acetil, diminuindo a concentração de etanol e uma queda constante na densidade da célula, apesar de várias adições de magnésio, tanto para a cultura quanto para o meio. A cultura foi eventualmente perdida. Concluiu-se que uma alimentação do meio contendo 7,47 ppm de Mg não foi suficiente para sustentar uma cultura de 3 g/l a um tempo de retenção de células de 30 horas.

Exemplo 8: Fermentação com Limitações de Potássio

[0094] Os experimentos foram conduzidos em um biorreator (New Brunswick Bioflo I ou II-c) operado através de CSTR de transporte ascendente, sem circuito de reciclagem celular. As condições de funcionamento do biorreator foram como segue: Tipo de Cultura foi Clostridium ljungdahlii C01. Temperatura da cultura foi mantida a 38-39°C. A agitação foi 950 - 1000 rpm em uma leitura analógica. O volume de cultura estimulada foi ~1550 ml. O ponto final do pH da cultura foi de 4,2. Uma solução de NaHCO3 a 7,5% foi usada para o controle do pH. Gás de alimentação era uma mistura sintética de 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO e 10% de CO2 alimentada à cultura a uma taxa de 279 ml/min. O meio foi alimentado para o reator a ~0,80-0,85 ml/min, ou ~1220 ml/dia. Os tempos de retenção de células e líquidos foram aproximadamente 28-30 horas. O meio usado foi como descrito abaixo.

* Concentração de Na+ é de apenas NaCl. Não inclui Na+ a partir dos outros componentes, tais como Na2WO4 • 2H2O.

[0095] O biorreator foi operado até que a cultura fosse obtida em um estado estacionário de alta produtividade. O estado estacionário de alta produtividade foi definido como ~2,5-3 g/L de densidade da célula, uma concentração de etanol de > 20 g/L, uma absorção de CO de > 3,0 mmol/min e um consumo de hidrogênio de > 0,5 mmol/min.

[0096] Os parâmetros de cultura de absorção de gás, H2 e CO, concentrações do produto e a densidade de células foram, então, monitorados para quaisquer efeitos adversos. Se a redução na concentração de componente não afetar estes parâmetros após vários (> 3) tempos de retenção de células, a concentração pode ser ainda mais reduzida. Se, depois de uma redução na concentração de um componente, for vista uma queda nos parâmetros de cultura, a concentração pode ser aumentada novamente para um nível que mostrou anteriormente ser adequado. Se a cultura for recuperada, a concentração pode ser reduzida novamente, às vezes ao mesmo nível de antes de repetir o efeito, às vezes a um nível em algum lugar entre o que funcionou e o que causou problemas.

[0097] No início do experimento a concentração de potássio estava em níveis médios normais de etanol ou 78,7 ppm. Os parâmetros de cultura eram estáveis a ~3 g/L de densidade da célula; ~22 g/L de etanol; ~2,6 g/L de acetil; 0,5 g/L de butanol; 3,1 mmol/min de absorção de CO; e 0,5-0,6 mmol/min de absorção de H2. O potássio foi reduzido para 39,3 ppm no meio de partida em t = 0 horas. Na medida em que o potássio foi removido do fermentador, os parâmetros de cultura foram monitorados quanto às alteraçãos. Depois de aproximadamente 30 horas, a absorção H2 começou a cair, seguida por uma queda na absorção de CO. A absorção de hidrogênio caiu para 0,078 mmol/min e a absorção de CO caiu para um valor mínimo de 2,8 mmol/min. A concentração de ácido acético também diminuiu abaixo de 0,78 g/L a cerca de 40 horas após a redução de potássio seguido por uma queda na concentração de etanol a 19,2 g/L. As concentrações de butanol aumentaram para 0,67 g/L. A densidade da célula foi também afetada como visto por uma diminuição de 2,3 g/L, mas que pode ter sido o resultado de uma queda acidental do tempo de retenção de células de 27 horas imediatamente após a queda de potássio. O potássio foi adicionado ao reator para elevar a concentração de 78,7 ppm. O efeito foi imediatamente visto como um aumento na absorção de CO, absorção de H2, etanol e concentração de ácido. Os níveis butanol diminuíram lentamente novamente para abaixo de ~0,53 g/L, com o aumento do potássio.

[0098] Uma vez que a cultura parecia recuperar novamente os níveis observados antes do potássio ser limitado, a concentração de potássio no meio caiu para 59,0 ppm em t = 139 horas. Mais uma vez, os parâmetros de cultura foram monitorados para quaisquer alterações. Como antes, a absorção de H2 começou a diminuir ~8 horas após a redução de potássio. No entanto, desta vez a absorção de CO não foi afetada. Houve um pequeno aumento em butanol para ~0,57 g/L. Houve uma queda na concentração de ácido acético, mas esta foi uma continuação de uma tendência de dimnuição que foi vista antes da queda dos níveis de potássio. Os níveis de etanol permaneceram de ~22 g/L. A densidade da célula mostrou uma pequena queda com a diminuição nos níveis de potássio a partir de aproximadamente 3,0 g/L a 2,8 g/L. A dispersão dos dados permitiram apenas que as concentrações de densidade da célula aproximada fossem relatadas. O potássio foi adicionado ao reator para elevar a concentração de 78,7 ppm. O efeito foi imediatamente visto como um aumento da absorção de H2, concentração de etanol, a concentração de ácido e densidade de células, confirmando que a cultura era de limitada por potássio.

[0099] O efeito global da queda de potássio para 59,0 ppm foi menor do que foi a queda para 39,3 ppm, mas o nível ainda foi considerado limitativo. Um nível de potássio de 78,7 ppm no meio foi, portanto, considerado próximo da limitação. Para determinar se o nível, de fato, era limitando, a concentração de potássio no meio foi aumentada para 98,3 ppm a t = 243 horas. Com o aumento do potássio, a absorção de H2 ~subiu de 0,61 mmol/min para ~0,71 mmol/min. Houve também um aumento na densidade de células de ~3,0 a ~3,3 g/l. O ácido acético foi maior em ~3,3 g/L, em comparação com 2,6 quando potássio estava a 78,7 ppm. As concentrações de butanol foram mais ou menos constantes dentro da dispersão dos dados. Os níveis de etanol pareciam mostrar um pequeno aumento de 24 g/l, mas a dispersão dos dados tornou difícil a determinação. Uma vez que houve alguns efeitos positivos do aumento do potássio para 98,3 ppm, a concentração de potássio aumentou ainda mais para 118 ppm em t = 375 horas. O único efeito definitivo visto nos parâmetros de cultura foi um aumento adicional da densidade da célula de ~3,9 g/L. Todos os outros parâmetros permaneceram constantes dentro da dispersão dos dados.

Exemplo 9: Fermentação com Limitações de Cisteína

[0100] Os experimentos foram conduzidos em um biorreator (New Brunswick Bioflo I ou II-c) operado através de CSTR de transporte ascendente, sem circuito de reciclagem celular. As condições de funcionamento do biorreator foram como segue: Tipo de Cultura foi Clostridium ljungdahlii C01. Temperatura da cultura foi mantida 38-39°C. A agitação foi de 900 rpm em uma leitura analógica. O volume de cultura estimulada foi ~1650 ml. O ponto final do pH da cultura foi de 4,5. Uma solução de NaHCO3 a 7,5% foi usada para o controle do pH. O gás de alimentação era uma mistura sintética de 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO e 10% de CO2 alimentada à cultura a uma taxa de 279 ml/min. O meio foi alimentado para o reator a ~0,83-0,86 ml/min, ou ~1220 ml/dia. Os tempos de retenção de células e líquidos foram aproximadamente 28-30 horas. O meio usado foi como descrito abaixo.

[0101] No início do experimento, a concentração de cisteína estava em níveis médios normais de etanol, ou 250 ppm. Os parâmetros de cultura eram estáveis a ~3 g/L de densidade da célula; 23 g/L de etanol; 2,4 g/L de acetil; 3,1 mmol/min de absorção de CO; e 0,56 mmol/min absorção de H2. A cisteína foi diminuída para 187,5 ppm no meio partindoa em t = 0 horas. À medida que a cisteína foi removida do fermen- tador, todos os parâmetros foram monitorados para os sinais de limitação. A concentração de cisteína foi mantida nesse nível por 167 horas ou 5 XRTs. Todos os parâmetros permaneceram constantes. A concentração de 187,5 ppm de cisteína foi suficiente para sustentar uma cultura de 3 g/L com um tempo de retenção de células de 33 horas.

[0102] A concentração de cisteína foi diminuída ainda mais no meio a partir de 187,5 ppm para 125 ppm em t = 167 horas. Quase imediatamente, a absorção e conversões de H2 começaram a cair, juntamente com uma concentração decrescente de ácido acético. A absorção e conversões e a densidade das células de CO foram constantes. A absorção de H2 caiu para 0,36 mmol/min, a conversão de H2 caiu para 21% e ácido acético diminuiu para 1,7 g/L. A concentração de cisteína tanto no meio quanto no biorreator foi aumentada para 187,5 ppm, em seguida, para 250 ppm. A cultura se recuperou rapidamente. Uma concentração de 125 ppm de cisteína não foi suficiente para sustentar uma cultura de 3 g/L a um tempo de retenção de células de 33 horas.

[0103] Após a cultura ter sido recuperada totalmente, a limitação de cisteína foi testada novamente. Em t = 407 horas, a cisteína no meio caiu para 162,5 ppm. Como visto antes, as conversões e absorção de H2 começaram a cair quase que imediatamente. A concentração de ácido acético voltou a cair, mas não tão rápido ou tão longe como quando a concentração de cisteína foi de 125 ppm. A absorção de H2 caiu para 0,49 mmol/min, a conversão de H2 caiu para 29% e o ácido acético diminuiu de 3,0 a 2,7 g/L. Uma concentração de 162,5 ppm de cisteína não foi suficiente para sustentar uma cultura de 3 g/L a um tempo de retenção de células de 33 horas.

Exemplo 10: Fermentação com Limitações de Tiamina

[0104] Os experimentos foram conduzidos em um biorreator (New Brunswick Bioflo I ou II-c) operado através de CSTR de transporte ascendente. As condições de funcionamento do biorreator foram como segue: Tipo de Cultura foi Clostridium ljungdahlii C01. A temperatura da cultura foi mantida a 38-39°C. A agitação foi de 950 rpm em uma leitura analógica. O volume de cultura estimulada foi ~1950 ml. O ponto final do pH da cultura foi de 4,5. Uma solução de NaHCO3 a 7,5% foi usada para o controle do pH. O gás de alimentação era uma mistura sintética de 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO e 10% de CO2 alimentada à cultura a uma taxa de 279 ml/min. O meio foi alimentado para o reator a ~0,84-0,86 ml/min, ou ~1220 ml/dia. Os tempos de retenção de células e líquidos foram de aproximadamente 30 - 32 horas. O meio usado foi como descrito abaixo.

[0105] A solução de vitaminas normalmente adicionada ao meio foi uma solução de 0,0505 g/L de pantotenato, 0,040 g/L de biotina e 0,10 g/L de tiamina. Para este estudo, a solução de vitamina foi separada em três soluções, uma para cada componente. As concentrações das soluções foram mantidas a mesma que na mistura de vitaminas original. Desta forma, a concentração de cada componente pode ser ajustada conforme necessário, sem alterar as outras concentrações de vitamina.

[0106] No início do presente experimento, a concentração de ácido pantotênico no meio foi de 0,03535 ppm ou 0,7 ml de uma solução de ácido pantotênico a 0,0505 g/L por litro de meio. A concentração de biotina no meio foi de 25% da concentração de vitamina normal ou 0,0070 ppm no meio. Este era o equivalente de 0,175 ml da solução de 0,04 g/L de biotina adicionada por litro de meio. O nível de tiamina no meio foi de 25% da concentração normal de vitamina, ou 0,0175 ppm. Este era o equivalente a 0,175 ml de uma solução de 0,10 g/L de tiamina adicionada por litro de meio. Em t = 0 horas, a concentração de tiamina no meio caiu para 15% do normal, ou 0,0105 ppm. Não houve efeito imediato visto na densidade da célula. No entanto, a absorção de H2, a concentração total de acetil e a concentração de etanol, totas começaram a cair quase que imediatamente, indicando que a concentração de tiamina anterior de 0,0175 ppm já estava perto da limitação. Ao mesmo tempo, a absorção de CO aumentou ligeiramente de 3,1-3,2 mmol/min. Isto pode ser uma indicação de um aumento na transferência de massa durante esse tempo mesmo que a taxa de agitação permaneça constante. Para verificar a causa da diminuição da produtividade da cultura, 0,5 ml da solução de ácido pantotênico foi adicionado primeiro ao reator a t = 43 horas. Quando este não teve nenhum efeito sobre a cultura, 0,115 ml de solução de tiamina foi adicionado novamente para o reator a T = 84 horas para aumentar o nível de tiamina no reator de ~0,0175 ppm. Isto teve um efeito imediato sobre a cultura. A absorção de hidrogênio, os níveis de ácido e a concentração de etanol todos começaram a aumentar. A cultura necessitou de tiamina adicional.

[0107] Nenhuma alteração adicional ao reator foi feita a fim de remover o ácido pantotênico e tiamina adicionados para fora do reator novamente para a concentração de 0,0354 ppm de ácido pantotênico e 0,0105 ppm de tiamina vindo da adição do meio. Ao longo das 228 horas seguintes, na medida em que as vitaminas eram removidas, a absorção de H2 aumentou primeiro para ~0,53 mmol/min, em seguida, caiu para uma concentração abaixo de ~0,31 mmol/min supostamente como o pantotenato extra e tiamina removidos novamente para fora do reator. No entanto, com nenhuma alteração aos níveis de vitamina ou quaisquer outras alteraçãos de cultura, a absorção de H2 começou a aumentar de forma estacionária atingindo ~0,5 mmol/min em torno de t = 273 horas. As concentrações de ácido e etanol não seguiram um padrão definido, mas variaram em torno de 25 g/L de etanol e 1,1-2,4 g/L de ácido. A absorção de CO permaneceu constante a 3,2 mmol/min e a densidade da célula permaneeu razoavelmente constante a 2,8-3,0 g/L.

[0108] No início do experimento, quando o nível de tiamina no meio caiu de 0,0175 ppm para 0,0105 ppm, o efeito sobre os parâmetros da cultura foi quase imediato o que indica que o nível de tiamina de 0,0175 ppm já estava perto da limitação. Os parâmetros calculados usados para correlacionar melhor a adição de nutrientes versus o desempenho da cultura antes da queda para 0,0105 ppm de tiamina foram os seguintes: O μg de tiamina adicionado por mmol de absorção de gás foi ~0,0041 μg/mmol. O μg de tiamina adicionado por grama de células produzidas foi ~6,5 μg/g. A confirmação adicional de que a tiamina foi de fato limitante a 0,0105 ppm foi a melhoria imediata nos parâmetros de cultura, quando o nível de tiamina no reator foi temporariamente aumentado para 0,0175 ppm no reator.

[0109] Embora a invenção divulgada no presente documento tenha sido descrita por meio de aspectos, exemplos e aplicações específicas dos mesmos, numerosas modificações e variações podem ser feitas à mesma por aqueles versado na técnica sem se distanciar do escopo da invenção estabelecido nas Reivindicações.

Claims

1. Processo de Fermentação de Gás de Síntese com Redução ou Remoção de Elementos do Meio de Fermentação, caracterizado por que compreende gás de síntese de fermentação num meio de fermentação com bactérias acetogênicas, o processo sendo eficaz para fornecer um STY específico de pelo menos 1 grama de etanol/(L • dia • gramas de células), em que o meio de fermentação inclui pelo menos 112 a 125 mg de nitrogênio por grama de células, pelo menos 10,5 a 15 mg de fósforo por grama de células e pelo menos 26 a 36 mg de potássio por grama de células, em que o meio de fermentação tem de 0 a 0,025 ppm de boro, de 0 a 0,0025 ppm de manganês, de 0 a 0,001 ppm de molibdênio e de 0 a 0,01 ppm de cobre e em que o meio de fermentação tem de 0 a 0,01 g/L de carboidratos e de 0 a 0,01 g/L de extrato de levedura, desde que a quantidade de pelo menos um dos componentes seja diferente de 0; e em que o nitrogênio é fornecido a partir de uma fonte de nitrogênio selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de amônio, fosfato de amônio, sulfato de amônio, nitrato de amônio e misturas dos mesmos.

2. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o fósforo é fornecido a partir de uma fonte de fósforo selecionada a partir do grupo que consiste em ácido fosfórico, fosfato de amônio, fosfato de potássio e misturas dos mesmos e o potássio é fornecido a partir de uma fonte de potássio selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de potássio, fosfato de potássio, nitrato de potássio, sulfato de potássio e misturas dos mesmos.

3. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o meio de fermentação inclui um ou mais de 2,7 a 5 mg de ferro por grama de células, de 10 a 30 μg de tungsténio por grama de células de 34 a 40 μg de níquel por grama de células, de 9 a 30 μg de cobalto por grama de células, de 4,5 a 10 mg de magnésio por grama de células, de 11 a 20 mg de enxofre por grama de células e de 6,5 a 20 μg de tiamina por grama de células.

4. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por que o meio de fermentação inclui um ou mais de 2,7 a 5 mg de ferro por grama de células, de 10 a 30 μg de tungstênio por grama de células de 34 a 40 μg de níquel por grama de células, de 9 a 30 μg de cobalto por grama de células, de 4,5 a 10 mg de magnésio por grama de células, de 11 a 20 mg de enxofre por grama de células e de 6,5 a 20 μg de tiamina por grama de células.

5. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por que o ferro é fornecido a partir de uma fonte de ferro selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de ferro, sulfato de ferro e misturas dos mesmos, o tungstênio é fornecido a partir de uma fonte de tungstênio selecionada a partir do grupo que consiste em tungstato de sódio, tungstato de cálcio, tungstato de potássio e misturas dos mesmos, o níquel é fornecido a partir de uma fonte de níquel selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de níquel, sulfato de níquel, nitrato de níquel e misturas dos mesmos, o cobalto é fornecido a partir de uma fonte de cobalto selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de cobalto, fluoreto de cobalto, brometo de cobalto, iodeto de cobalto e misturas dos mesmos, o magnésio é fornecido a partir de uma fonte de magnésio selecionada a partir do grupo que consiste em cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, fosfato de magnésio e o enxofre é fornecido a partir de uma fonte de enxofre selecionada a partir do grupo que consiste em cisteína, sulfito de sódio e misturas dos mesmos.

6. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que um pH do meio de fermentação é mantido numa faixa de 4,2 a 4,8.

7. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o gás de síntese tem uma razão de CO/CO2 de pelo menos 0,75.

8. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a bactéria acetogênica é selecionada a partir do grupo que consiste em Acetogenium kivui, Acetoanaerobium noterae, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchi CP11 ATCC BAA-1772, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum DSM 19630 de DSMZ Alemanha, Clostridium autoethanogenum DSM 10061 de DSMZ Alemanha, Clostridium autoethanogenum DSM 23693 de DSMZ Alemanha, Clostridium autoethanogenum DSM 24138 de DSMZ Alemanha, Clostridium carboxidivorans P7 ATCC PTA-7827, Clostridium coskatii ATCC PTA-10522, Clostridium drakei, Clostridium ljungdahlii PETC ATCC 49587, Clostridium ljungdahlii ERI2 ATCC 55380, Clostridium ljungdahlii C-01 ATCC 55988, Clostridium ljungdahlii O-52 ATCC 55889, Clostridium magnum, Clostridium pasteurianum DSM 525 de DSMZ Alemanha, Clostridium ragsdali P11 ATCC BAA-622, Clostridium scatologenes, Clostridium thermoaceticum, Clostridium ultunense, Desulfotomaculum kuznetsovii, Eubacterium limosum, Geobacter sulfurreducens, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Morrella thermoacetica, Morrella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus, Ruminococcus productus, Thermoanaerobacter kivui e misturas dos mesmos.

9. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o processo é eficaz para fornecer uma densidade de células de pelo menos 1,0 g/L.

10. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o processo é eficaz para fornecer uma conversão de CO de pelo menos de 5 a 99%.

11. Processo de Fermentação, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as fontes B, Mn, Mo ou Cu são eliminadas das preparações do meio.