MX2010009983A - Método para sostener cultivo de microorganismos en un proceso de fermentación con gas sintético en concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con métodos para sostener el cultivo de microorganismos en un reactor para fermentación con gas sintético en concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos que comprenden: agregar dióxido de carbono y opcionalmente alcohol; mantener las concentraciones de ácido acético libre; y realizar los pasos mencionados anteriormente dentro del tiempo especificado.

Description

MÉTODO PARA SOSTENER CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN UN PROCESO DE FERMENTACION CON GAS SINTETICO EN CONCENTRACION DISMINUIDA O AUSENCIA DE DIVERSOS SUSTRATOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a mejoras n los métodos para fermentación microbiana para la producción de alcohol a partir de un sustrato gaseoso que contiene al menos un gas reductor que contiene al menos un microorganismo acetogénico .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Para sostener un cultivo de microorganismos existen muchos métodos convencionales. Sin embargo, estos métodos adolecen de muchas ineficiencias . Sigue habiendo una necesidad por métodos más efectivos adicionales para sostener cultivo de microorganismos en ausencia de diversos sus.tra,tos en un proceso de fermentación con gas sintético. Se han descrito tres cepas de acetógenos (Drake, 1994) para utilizarse en la producción de combustibles líquidos a partir de gas sintético: Butyribactétium methylotrophicum (Grethlein et al., 1990; Jain et al., 1994b); Clostridium a toethanogenum (Abrini et al., 1994); Clostridium Ijungdahlii (Arora et al, 1995; Barik et al., 1988; Barik et al. 1990; y Tanner et al., 1993). De éstos, Clostridium Ijungdahlii y Clostridium autoethanogenum se sabe que convierten el CO a etanol. La patente de los Estados Unidos No. 5,173,429 de Gaddy et al., expone Clostridium Ijungdahlii ATCC No. 49587, un microorganismo anaeróbico que produce etanol y acetato a partir de CO y H.sub.20 y/o CO.sub.2 y H.sub.2 en gas de síntesis . La patente de los Estados Unidos No. 5,192,673 de Jain et al., expone una cepa mutante de Clostridium acetobytylicum y un proceso para producir butanol con la cepa. La patente de los Estados Unidos No. 5,593,886 de Gaddy et al., expone Clostridium Ijungdahlii ATCC No. 553B0. Este microorganismo puede producir anaeróbicamente acetato y etanol utilizando gas residual (por ejemplo, gas residual de negro de humo) como un sustrato. La patente de los Estados Unidos No. 5,807,722 de Gaddy et al., expone un método y un aparato para convertir gases residuales en productos útiles tales como ácidos orgánicos y alcoholes utilizando bacterias anaerobias, tales como Clostridium Ijungdahlii ATCC No. 55380. La patente de los Estados Unidos No. 6,136,577 de Gaddy et al., expone un método y un aparato para convertir gases residuales en productos útiles tales como ácidos orgánicos y alcoholes (en particular etanol) utilizando bacterias anaerobias, tales como Clostridium Ijungdahlii ATCC Nos. 55988 y 55989. La patente de los Estados Unidos No. 6,136,577 de Gaddy et al., expone un método y un aparato para convertir gases residuales en productos útiles tales como ácidos orgánicos y alcoholes (en particular ácido acético) utilizando cepas anaerobias de Clostridium Ijungdahlii. La patente de los Estados Unidos No. 6,753,170 de Gaddy et al., expone un proceso para fermentación microbiana anaeróbica para la producción de ácido acético. La patente de los Estados Unidos No. 7,285,402 de Gaddy et al., expone un proceso para la fermentación microbiana anaeróbica para la producción de alcohol. También se han descrito otras cepas de acetógehos para utilizarse en la producción de combustibles líquidos a partir de gas de síntesis, por ejemplo: Butyribacterium Methylotrophicum (Grethlein et al., 1990, Appl . Biochem. Biotech. 24/24: 875-884); y Clostridium autoethanogenum (Abrini et al., 1994, Arch. Microbiol. 161:345-351). Sigue habiendo una necesidad en la técnica en la conservación de cultivos en el proceso para fermentación con gas sintético en concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos. Existe una necesidad para sostener cultivos en caso de diversas interrupciones en el proceso industrial de la producción de alcohol. En particular, . siegue habiendo una necesidad para sostener cultivo de microorganismos en caso de disminuir: CO, H2, o CO y H2 en diversas concentraciones.

SUMARIO DE IA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para sostener cultivo de microorganismo en un reactor para fermentación con gas sintético en concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos que comprenden: agregar dióxido de carbono y opcionalmente alcohol; mantener las concentraciones de ácido acético libre; y realizar los pasos mencionados anteriormente dentro del tiempo especificado. La presente invención contempla además un método para evitar la rápida pérdida del cultivo de microorganismos en una reactor para fermentación con gas sintético en concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos que comprenden: agregar dióxido de carbono y opcionalmente alcohol; disminuir la temperatura de la temperatura de operación; mantener las concentraciones de ácido acético libre; y realizar los pasos mencionados anteriormente dentro del tiempo especificado.

La presente invención proporciona además un método para sostener cultivo de microorganismos en un reactor para fermentación con gas sintético, debido a la concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos en un suministro de gas de alimentación que comprende: agregar dióxido de carbono y opcionalmente alcohol; disminuir la temperatura de la temperatura de operación; mantener las concentraciones libres de ácido acético; y realizar los pasos anteriores dentro del tiempo especificado. En una modalidad de la presente invención, se puede utilizar alcohol como un sustrato. Aunque se han probado diversos sustratos de crecimiento alternativos, ninguno que se desempeñe tan bien como el alcohol y ninguno que sea tan fácilmente disponible como el alcohol. Cuando se restaura el suministro para gas de síntesis, el cultivó de microorganismos regresa fácilmente para utilizar el gas sintético. Adicionalmente, como una modalidad, se utiliza únicamente la trayectoria de acetato/alcohol, no proporciona la oportunidad de que otras bacterias competitivas se desarrollen, que puedan estar presentes en el caldo de cultivo o proceso de pipeteo. Mientras que un sustrato para crecimiento tal como glucosa podría estar disponible fácilmente para cualesquiera organismos presentes para su crecimiento .

La técnica anterior podría incluir ajustes al caldo de cultivo para mantener una concentración baja de ácido acético libre. Éstas podrían incluir aumentar el pH y disminuir el flujo líquidos para extraer por lavado el acetilo. Como una modalidad, la reducción de temperatura para reducir la actividad del cultivo y utilizar el producto etanol y dióxido de carbono para proporcionar la retro-energía al cultivo para mantener la viabilidad. Adicionalmente, el concepto de sustrato alternativo novedoso. Esto es una mejora sobre el proceso, debido a que habrá veces en que se interrumpa el suministro de gas, debido interrupciones en el suministro de la materia prima de alimentación gasificadora, el equipo de transporte, el equipo de secado, la limpieza de gas o cualquier otra unidad á lo largo de la tubería para suministro de gas. Otra aplicación de la presente invención comprende transportar inóculos desde un sitio a otro. En el transporte, el cultivo puede no tener un suministro de gas sintético, por lo tanto, se podría requerir un sustrato alternativo. Tener la capacidad de mantener la viabilidad durante 12 horas o más podría ser una mejora en la capacidad del proceso. Por lo tanto, teniendo una alternativa que sea económica y técnicamente viable dará por resultado en reducir al mínimo las interrupciones y/o disminuciones en la producción de alcohol, más las puestas en marcha y re-inicios de la planta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1, es un diagrama esquemático que ilustra una modalidad del flujo de proceso total contemplado durante las operaciones normales de la presente invención. Aunque en el diagrama se indica etanol, también se contemplan por la presente invención otros alcoholes. La figura 2, es un diagrama esquemático que ilustra las modalidades de la presente invención, que muestran tendencias con la adición de dióxido de carbono, consumo de alcohol, y recuperación de cultivos. La figura 3, es un diagrama esquemático que ilustra comparaciones de la presente invención que demuestran falta del consumo de alcohol y falta de recuperación de cultivos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A menos que se defina de otra manera, a todo lo largo de esta especificación se utilizan los siguientes términos, según se definen como sigue. El término "aproximadamente" que modifica cualquier cantidad se refiere a la variación en esa cantidad encontrada en las condiciones del mundo real para sostener un cultivo de microorganismo, por ejemplo, en el laboratorio, planta piloto, o instalaciones de producción. Por ejemplo, una cantidad de un ingrediente empleado en una mezcla cuando se modifica por "aproximadamente" incluye la variación y grado de cuidado empleado típicamente en la medición en una condición experimental en la planta de producción o laboratorio. Por ejemplo, la cantidad de un componente 1 de un producto cuando se modifica por "aproximadamente" incluye la variación entre los lotes en experimentos múltiples en la planta o laboratorio y la variación inherente en el método analítico. Si se modifica o no por "aproximadamente", las cantidades incluyen equivalentes a esas cantidades. Cualquier cantidad establecida en la presente y modificada por "aproximadamente" también se puede emplear en la presente invención como la cantidad no modificada por "aproximadamente" . A menos que se establezca de otra manera, el término "acetato" se utiliza para describir la mezcla . de ácido acético molecular o libre y sal de acetato presentes en el caldo de fermentación. La proporción de ácido acético molecular a acetato depende del pH del sistema, es decir, a una concentración constante de "acetato", entre menor sea el pH, mayor será la concentración de ácido acético molecular con relación a la sal de acetato. El término "acetógeno" o "acetogénico", se refiere a una bacteria que genera acetato como un producto de la respiración anaeróbica. Este proceso es diferente de la fermentación de acetato, aunque ambos se presentan en ausencia de oxigeno y producen acetato. Estos organismos también se denominan como bacterias acetogénicas , debido a que todos los acetógenos conocidos son bacterias. Los acetógenos se encuentran en una variedad de hábitat, en general aquellos que son anaeróbicos (falta de oxigeno) . Los acetógenos se pueden utilizar en una variedad de compuestos como fuentes de energía y carbono; la mejor forma estudiada del metabolismo acetogénico implica el uso de dióxido de carbono como una fuente de carbono e hidrógenos como una fuente de energía. Los términos "biorreactor" "reactor", o "biorreactor para fermentación", incluyen un dispositivo para fermentación que consiste de uno o más recipientes y/o torres o una disposición de tuberías, que incluye el reactor de depósito agitado continuo (CSTR, por sus siglas en inglés), reactor inmovilizado de células (ICR, por sus siglas en inglés), reactor de lecho percolador (TBR, por sus siglas en inglés) , columna de burbujas, termentador con impulso de gases, mezcladora estática, u otro dispositivo adecuado para el contacto de gas-líquido. De preferencia, para el método de esta invención, el biorreactor para fermentación comprende una reactor de crecimiento que alimenta el caldo de fermentación hacia un biorreactor para fermentación, en el cual se produce la mayoría del producto, el etanol. "Concentración celular", en esta especificación se basa en el peso en seco de las bacterias por litro de la muestra. La concentración celular se mide directamente o mediante calibración a una correlación con densidad óptica. El término "método continuo", en el sentido en el que' se utiliza en la presente, se refiere a un método de fermentación que incluye alimentación continua de nutrientes, alimentación de sustrato, producción celular en el biorreactor, eliminación (o purga) de células del biorreactor, y eliminación del producto. Esas alimentaciones continuas, eliminaciones o producción celular se pueden presentar en la misma o en diferentes corrientes. Un proceso continuo da por resultado en el logro de un estado estable dentro del biorreactor. Por "estado estable" se debe entender todas estas variables mensurables (es decir, velocidades de alimentación, concentraciones de sustrato y nutrientes mantenidas en el biorreactor, concentración celular en el biorreactor, y eliminación celular del biorreactor, eliminación de productos del biorreactor así como también variables condicionales tales como temperaturas y presión) son constantes a través del tiempo. "Productividad de etanol", es la productividad volumétrica de etanol, calculada como la proporción de la concentración de etanol en estado estable y el tiempo de retención liquido (LRT, por sus siglas en inglés) en sistemas continuos, o la proporción de la concentración de etanol y tiempo requerido para producir esta concentración en sistéínas por lote. La frase "alta productividad de etanol" describe una productividad volumétrica de etanol mayor que 10 g/L dia. "H.sub.2 en exceso", está disponible para la producción de etanol cuando la proporción de los moles de H. sub.2 en el gas de alimentación a la suma de dos veces los moles de CO convertido a tres veces los moles de CO.sub.2 convertido es mayor que 1.0. Si esta proporción es menor que I.0, el H.sub.2 en exceso no está disponible y el etanol sólo se puede producir a través de un mecanismo de control diferente . El término "fermentación" significa la fermentación de CO a alcoholes y acetato. Se sabe que un número de bacterias anaerobias son capaces de llevar a cabo la fermentación del CO a alcoholes, incluyendo butanol y etanol, y ácido acético, y son adecuadas para utilizarse en el proceso de la presente invención. Los ejemplos de estas bacterias que son adecuadas para utilizarse en la invención incluyen aquellas del género Clostridium, tal como las cepas de Clostridium Ijungdahlii, incluyendo aquellas descritas en la O 00/68407, la EP 117309, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,173,429, 5,593,886, y 6,368,819, la WO 98/00558 y la WO 02/08438, y Clostridium autoethanogenum (Aribini et al., Archives of Microbiology 161: páginas 345-351). Otras bacterias adecuadas incluyen aquellas del género Moorel'la, incluyendo Moorella sp HUC22-1, (Sakai et al., Biotechhology Letters 29: páginas 1607-1612), y aquellas del género Carboxydothermus (Svetlichny, V. A., Sokolova, T. G. et al. (1991), Systematic and Applied Microbiology 14:254-260): tas exposiciones de las mismas se incorporan completamente en la presente como referencia. Además, se pueden seleccionar otras bacterias anaerobias acetogénicas para utilizarse en el proceso de la invención por alguien con experiencia :en: la técnica. También se apreciará que se puede utilizar ' un cultivo mezclado de dos o más bacterias en el proceso de'; la presente invención. Un microorganismo adecuado ¦ para utilizarse en la presente invención es Clostridium autoethanogenum que está disponible comercialmente de DSM£ y que tiene las características de identificación del número de depósito DSMZ, DSMZ 10061. La fermentación se puede llevar a cabo en cualquier biorreactor adecuado, tal como un reaptor de depósito agitado continuo (CTSR) , una reactor de columna de burbuja (BCR, por sus siglas en inglés) o un reactor de lecho percolador (TBR) . También, en algunas modalidades preferidas de la invención, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento en el cual se cultivan los microorganismos, y un segundo reactor para fermentación, al cual el caldo de fermentación proveniente del reactor de crecimiento se alimenta y en cual se produce la mayoría del producto de fermentación (etanol y acetato) . El término "sustratos gaseosos", en el sentido en el que se utiliza en la presente, significa CO solo, CO y H.sub.2, CO.sub.2 y H.sub.2, o CO, CO.sub.2 y H.sub.2, mezclados opcionalmente con otros elementos o compuestos, incluyendo nitrógeno y metano en un estado gaseoso. . Estos sustratos gaseosos incluyen gases o corrientes, que típicamente se liberan o expulsan hacia la atmósfera ya sea directamente o a través de la combustión. En algunas modalidades de este método, el sustrato gaseoso comprende CO. En otras modalidades de este método, el sustrato gaseoso comprende CO.sub.2 y H.sub.2. Todavía en otras modalidades, el sustrato gaseoso comprende el CO y H.sub.2. En una modalidad particularmente preferida, el sustrato gaseoso comprende CO, CO.sub.2 y H.sub.2. Todavía otros sustratos de la invención pueden incluir aquellos componentes mencionados anteriormente y al menos un gas de nitrógeno, C0.sub.2, etano y metano. De esta forma, estos sustratos incluyen el qué se denomina convencionalmente como "gas sintético" o gas de síntesis proveniente de la gasificación de los productos de carbono (incluyendo metano) , así como también gases de escape provenientes de una variedad de métodos industriales. La frase "alta concentración de etanol", significa más. de aproximadamente 10 g/L, de preferencia mayor qué 15 g/L de etanol, en caldo de fermentación o un índice de producción de etanol a acetato de 5:1 o más. Los términos "sustrato limitante" o "nutriente limitante", definen una sustancia en el medio de nutrientes o sustrato gaseoso, el cual, durante el crecimiento del cultivo bacteriano en el biorreactor, se consume por el cultivo a un nivel tan grande que soporta el crecimiento bacteriano en estado estable o estable en el biorreactor. Todas las otras sustancias en el medio de nutrientes o sustrato de gas de esta forma están presentes en exceso, y son "no limitantes". La evidencia para la limitación es que un aumento en el índice de adición del sustrato limitante, es decir, en la velocidad de alimentación de nutrientes o velocidad de alimentación de gases, al cultivo provoca un aumento correspondiente en el índice de absorción de gas (mmol/mínuto de gas) debido al aumento en la densidad celular.

El término "microorganismo", incluye bacterias, hongos, archaea, y protistas; plantas microscópicas (denominadas alga verde) ; y animales tales como plancton, los planarios y las amibas. Algunos también incluyen virus, aunque otras consideran éstos como no vivientes. Los microorganismos viven en todas las partes de la biosfera donde exista agua liquida, incluyendo suelo, fuentes termales, sobre el piso oceánico, alto en la atmósfera y profundo al interior de rocas dentro de la corteza terrestre. Los microorganismos son decisivos para reciclar nutrientes en los ecosistemas ya que actúan como descomponedores. Los microbios también se aprovechan por las personas en biotecnología, tanto en la alimentación tradicional como en la preparación de bebidas y en tecnologías modernas basadas en ingeniería genética. Se prevé que los microorganismos de cepas mezcladas, que pueden o no contener cepas de diversos microorganismos, se utilizarán en la presente invención. Además se prevé que la tecnología de ADN recombinante puede crear microorganismos utilizando cepas selectas de microorganismos existentes. En algunas modalidades de la presente invención, diversas cepas ilustrativas de C. ljungdahlii incluyen la cepa PETC (patente de los Estados Unidos No. 5,173,429); la cepa ERI2 (patente de los Estados Unidos No. 5,593,886) y las cepas C-01 y 0-52 (patente de los Estados Unidos No. 6,136,577). Estas cepas cada una ' están depositadas en la American Type Culture Collection, 10801 üniversity Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, con los Números de acceso 55383 (anteriormente ATCC No. 49587), 55380, 55988, y 55989 respectivamente. Cada una de las- cepas de C. ljungdahlii es una bacteria gram-positiva, anaeróbica, con un contenido de nucleótidos de guanina y citosina (G+C) de aproximadamente 22% molar. Estas bacterias utilizan una variedad de sustratos para crecer, aunque no metanol ni lactato. Estas cepas difieren en su tolerancia al CO, los índices de absorción de gas específicos y productividades específicas. En las cepas "silvestres" encontradas en la naturaleza, se observa muy poca producción de etanol. Las cepas de C. ljungdahlii funcionan idealmente a 37 °C, y típicamente producen un índice de producción de etanol acetilo (es decir, lo que se refiere tanto a ácido acético libre o molecular como a sales de acetato) de aproximadamente 1:20 (1 parte de etanol por 20 partes de acetilo) en el estado "silvestre". Las concentraciones de etanol típicamente son únicamente 1-2 g/L. Mientras que esta capacidad para producir etanol es de interés, debido a la baja productividad de etanol, las bacterias "silvestres", no se pueden utilizar para producir etanol económicamente sobre una base comercial. Con menor manipulación de nutrientes, las cepas de C. Ijungdahlii mencionadas anteriormente se han utilizado para producir etanol y acetilo con un índice de producción de 1:1 (partes iguales de etanol y acetilo), aunque la concentración de etanol es menor que 10 g/L, un nivel que da por resultado en baja productividad, menor de 10 g/L día. Además la estabilidad del cultivo es un problema, principalmente debido a la concentración relativamente alta (8-10 g/L) de acetilo (2.5-3 g/L de ácido acético molecular) en combinación con la presencia de etanol. Además, a medida que aumenta el índice de gases en un esfuerzo por producir más etanol, se inhibe el cultivo, en primer lugar por el ácido acético molecular y luego por el CO. Como resultado, el cultivo se torna inestable y fracasa en absorber el gas y forma un producto adicional. Además, un trabajo anterior por los inventores mostró dificultad en la producción mayor a una proporción de 2:1 de etanol a acetilo en una operación en estado estable. Véase, por ejemplo, Klasson et al., 1990 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the ll.sup.th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 24/25: 857; Phillips et al., 1993 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 14.sup.th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 39/40: 559, entre otros. Muchos documentos describen el uso de bacterias anaeróbicas, distintas de C. Ijungdahlii, en la fermentación de azúcares que no consumen CO, C0.sub.2 y H.sub.2 para producir solventes. En un intento de proporcionar altos rendimientos de etanol, se han alterado una variedad de parámetros entre los que se incluyen: tipos nutrientes, microorganismo, adición especifica de agentes reductores, variaciones de pH, y la adición de gases exógenos. Véase, por ejemplo, Rothstein et al, 1986 J. Bacterid., 165(1): 319-320; Lovitt et al, 1988 J. Bacterid., 170(6) :2809; Taherzadeh et al, 1996 Appl . Microbiol. Biotechnol . , 46:176. Por el término "cepas mezcladas", se debe entender un cultivo mezclado de dos o más de microorganismos. Estas "cepas mezcladas" del microorganismo enumeradas anteriormente se utilizan en los métodos de esta. El término "estado natural" describe cualquier compuesto, elemento, o trayectoria que no tenga electrones o portones adicionales que por lo general están presentes. Por el contrario, el término "estado de reducción" describe cualquier compuesto, elemento, o trayectoria que tenga un exceso de uno o más electrones. El "estado de reducción" se alcanza al agregar uno o más electrones al estado natural, es decir al disminuir el potencial redox del caldo de fermentación . "Medio de nutrientes", se utiliza en general para describir medios para crecimiento bacteriano convencionales que contengan vitaminas y minerales suficientes para permitir el crecimiento de una bacteria sujeto seleccionada. Los azúcares no se incluyen en estos medios. Los componentes de una variedad de medios de nutrientes adecuados para utilizarse en esta invención se conocen y reportan en las publicaciones anteriores, incluyendo aquellas de los inventores. Véanse, por ejemplo, las fórmulas para medios de nutrientes descritas en la solicitud de patente internacional No. WO 08/00558; la patente de los Estados Unidos No. 5,807,722; la Patente de los Estados Unidos No. 5,593,886, y la patente de los Estados Unidos No. 5,821,111, así como también en las publicaciones identificadas anteriormente. De acuerdo con la presente invención, un medio de nutrientes de laboratorio típico para la producción de acetato a partir de CO, CO.sub.2, y H.sub.2 contiene 0.9 mg/L de pantotenato de calcio. Sin embargo, un medio de nutrientes de laboratorio típico para la producción de etanol a partir de CO, CO.sub.2, y H.sub.2 contiene 0.02 mg/L de pantotenato de calcio. El término "gas reductor", significa cualquiera o ambos de CO o H.sub.2. Por la frase "una cantidad de gas reductor mayor que la requerida para el crecimiento de las bacterias", se debe entender que es la cantidad de gas reductor que exceda la cantidad que pueden utilizar las bacterias para crecimiento o metabolismo, dado los ingredientes del medio nutriente. Esta cantidad se puede alcanzar al aumentar la cantidad neta del gas reductor, ó al reducir los ingredientes de nutrientes clave, de tal forma que la cantidad en exceso de gas se alcance sin aumentar el gas, o al disminuir la velocidad de suministro de gas a las bacterias. Cuando las bacterias se exponen a más gas reductor que el requerido para el crecimiento, las bacterias responden aumentando la producción de etanol. "Bacterias sujeto" son bacterias anaeróbicas acetogénicas (o facultativas) , que son capaces de convertir el CO y agü$ o H.sub.2 y C0.sub.2 en productos de etanol y ácido acético. Las bacterias útiles de acuerdo con esta invención incluyen, sin limitación, Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum , C. acetobutylicum, C. thermoaceticum, Eubacterium limosum, C. Ijungdahlii PETC, C. ljungdahlii ERI2, C. Ijungdahlii C-01, C. Ijungdahlii 0-52, y Peptostreptococcus productus . Otras bacterias anaeróbicas acetogénicas se seleccionan para utilizarse en estos métodos por alguien con experiencia en la técnica. El término "gas sintético", significa gas para síntesis que es el nombre proporcionado a una mezcla de gases que contiene cantidades variables de monóxido de carbono e hidrógeno. Los ejemplos de los métodos de producción incluyen reformar por vapor el gas natural o hidrocarburos líquidos para producir el hidrógeno, la gasificación de carbón vegetal y en algunos tipos de instalaciones de gasificación de desechos a energías. El nombre proviene de su utilización como intermedios en la creación del gas natural sintético (SNG, por sus siglas en inglés) y para la producción de amoniaco o metanol . El gas sintético, también se utiliza como un intermediario para producir petróleo sintético para utilizarse como un combustible o lubrificante vía la síntesis Fischer-Tropsch y anteriormente el metanol Mobil para el proceso de la gasolina. El gas sintético consiste principalmente de hidrógeno, monóxido de carbono y con mucha frecuencia algo de dióxido de carbono, y tiene menos de la mitad de la densidad energética del gas natural. El gas sintético es combustible y con frecuencia se utiliza como una fuente de combustible o como un intermediario para la producción de otros químicos. La presente invención se relaciona con métodos para sostener un cultivo de microorganismos en un reactor para fermentación con gas sintético en concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos que comprende: agregar dióxido de carbono y opcionalmente alcohol; mantener la concentración de ácido acético libre a menos de 5 g/L de ácido acético libre; y realizar las pasos mencionados anteriormente en un periodo de 0-30 minutos, de 0-15 minutos, de 15-30 minutos. La presente invención contempla además un método para evitar la rápida pérdida de cultivo de microorganismos en un reactor para fermentación con gas sintético en concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos que comprende: agregar dióxido de carbono y opcionalmente alcohol; disminuir la temperatura de la temperatura de operación entre 0-25°C; mientras que se mantenga la temperatura entre 0-25 °C; mantener la concentración de ácido acético libre a menos de 5 g/L de ácido acético libre; y realizar las pasos mencionados anteriormente en un periodo de 0-30 minutos, de 0-15 minutos, de 15-30 minutos. La presente invención proporciona además un método para sostener un cultivo de microorganismos en un reactor para fermentación con gas sintético debido a una concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos en el suministro de gas de alimentación que comprende: agregar dióxido de carbono y opcionalmente alcohol; disminuir la temperatura de la temperatura de operación entre 0-25 °C mientras que se mantenga la temperatura entre 0-25 °C; mantener la concentración de ácido acético libre a menos de 5 g/L de ácido acético libre; y realizar los pasos mencionados anteriormente en un periodo de 0-30 minuta, de 0-15 minutos, de 15-30 minutos.

Como una modalidad, el sostenimiento del cultivo de microorganismos comprende un lapso de aproximadamente 0-30 horas. Como una modalidad, el pH que se puede mantener en la variación de aproximadamente 3.5-5.6. Se contempla ademas que se agrega una solución de bicarbonato para controlar el pH. La solución de bicarbonato puede comprender: bicarbonato de amonio, bicarbonato de sodio, y/o bicarbonato de potasio. Una modalidad de la presente invención proporciona un método en donde retirar opcionalmente el dióxido de carbono en el reactor. Además, como una modalidad, se proporciona opcionalmente agregar nutrientes al reactor. La presente invención proporciona opcionalmente agregar nutrientes al reactor. Modalidades adicionales de la presente invención proporcionan a un alcohol que comprende uno o más de los siguientes: etanol, butanol, etanol y butanol. Opcionalmente, la temperatura se puede disminuir de la temperatura de operación entre 0-25°C mientras que se mantenga la temperatura entre 0-25 °C; opcionalmente se puede agregar al reactor agua. Esta agua puede comprender, agua dulce, agua preparada, agua para reciclado, agua destilada, agua desionizada o sus combinaciones. La presente invención, contempla un método en donde el cultivo de microorganismos contiene al menos una bacteria acetogénica. El cultivo de microorganismos puede comprender una o más cepas seleccionadas de Clostridium, Moorella, y Carboxydothermus o sus modificaciones genéticas. Como una modalidad, el microorganismo puede comprender Clostridium ljungdahlii seleccionado de las cepas que consisten de PETC, ERI-2, 0-52 y C-01 o sus combinaciones . La presente invención también proporciona un método en donde el cultivo del microorganismo se regresa a condiciones de pre-suspensión que comprendan la adición de gas sintético. Opcionalmente como modalidades, la presente invención, se puede proporcionar para: retirar el permeado; purgar el reactor con gas inerte; o mantener baja la agitación para mantener los sólidos en suspensión. Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen más adelante en la siguiente descripción detallada . Las bacterias autotróficas acetogénicas que utilizan monóxido de carbono y/o hidrógeno y dióxido de carbono (gas de síntesis) para producir alcohol, requieren un suministro constante del gas para producir alcohol. Un producto intermedio en la producción de etanol es el ácido acético, que puede ser intercelular y extracelular . Sin un suministro suficiente de gas de síntesis, el alcohol limitado se produce a favor del ácido acético.

Durante las condiciones cuando se reduce o no hay disponible gas de síntesis para la producción del producto intermedio, el ácido acético, el cultivo puede convertir alcohol de nuevo a ácido acético en presencia de dióxido de carbono. El etanol ya está presente en el caldo de cultivo y está disponible fácilmente en caso de una cantidad limitada o ninguna cantidad para gas de síntesis. También se podría suministrar según sea necesario alcohol adicional. Se puede agregar dióxido de carbono al hacer burbujerar el gas de C02 en el cultivo o se puede formar en el caldo de cultivo mediante la adición de bicarbonato. El bicarbonato de sodio se puede utilizar en la fermentación para mantener el pH deseado y por lo tanto está disponible fácilmente. En el caldo de cultivo ácido, el tampón de bicarbonato reacciona para formar dióxido de carbono. El dióxido de carbono formado luego está disponible para las bacterias al desplazar el alcohol de nuevo a ácido acético. El desplazamiento de alcohol a ácido acético libre en presencia de dióxido de carbono es un proceso relativamente rápido. Los microorganismos tales como, Clostridium Ijungdahlii se limitan en la concentración de ácido acético libre que se puede resistir en el caldo de cultivo. Se deben ejecutar los pasos necesarios para controlar la concentración de ácido acético libre durante la reducción o pérdida del gas de síntesis. Uno de estos métodos de controles con la manipulación de la temperatura. Una temperatura aumentada, dentro de la variación mesofílica, aumenta los índices de actividad del cultivo. Mientras que una temperatura reducida en el caldo de fermentación reduce esos índices. Por lo tanto, la reducción de temperatura es útil para retardar la actividad del cultivo durante las condiciones de gas reducido o ningún gas, dando por resultado en una producción de ácido más lenta. Otro método para controlar el ácido acético libre es cambiar el pH del cultivo. El equilibrio de acetilo a ácido acético se controla en parte por pH. Aumentar el pH durante la interrupción del suministro de gas de síntesis permite la concentración total de acetilo, acetiló más ácido acético, que será mayor mientras que se mantenga una menor concentración de ácido libre. Un tercer método con el potencial para controlar la concentración de ácido libre es un flujo de líquido aumentado a través del sistema. A media que aumenta la concentración de ácido libre, aumentando el flujo de una corriente líquida en el sistema con un aumento en la purga del perneado se extraerá mediante lavado más ácido libre del cultivo mientras que se evita una inundación de células no deseadas. El líquido adicional en el sistema puede ser una corriente adicional de agua o un aumento en el flujo de la corriente para suministro de nutrientes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL PROCESO BAJO CONDICIONES NORMALES DE OPERACIÓN La presente invención, implica métodos para la fermentación anaeróbica de sustratos gaseosos que contienen al menos un gas reductor, en particular los componentes gaseosos de gases residuales y de síntesis industriales (por ejemplo, CO, CO.sub.2 y H.sub.2) a etanol. Estos métodos proporcionan productividades de etanol mayores que 10 g/L día al manipular las trayectorias biológicas de las bacterias sujeto. Un método de la invención provoca una abundancia de NAD ( P) H con respecto a NAD(P). La oxidación de NAD ( P) H a NAD(P) provoca ácido acético producido por el cultivo que se reducirá a etanol. Alternativamente, otros métodos para la producción de altas concentraciones de etanol en una fermentación anaeróbica de esta invención, implican reducir el potencial redox del caldo de fermentación, y con esto reducir el ácido acético a etanol. Los métodos de esta invención producen altas concentraciones de etanol (es decir, mayores que aproximadamente 10 g/L, y de preferencia mayores que aproximadamente 15 g/L) y bajas concentraciones de acetato (es decir, menores que aproximadamente 5 g/L de ácido acético libre en el biorreactor) . Estos métodos también mantienen y controlan las condiciones del método para la producción continua de etanol y ácido acético para ayudar al sistema a recuperarse rápidamente de los desajustes del método. Además, los métodos de esta invención, ayudan a evitar la aclimatación de los cultivos para disminuir la concentración de nutrientes, lo cual puede ser perjudicial para el desempeño del cultivo. La presente invención proporciona un método viable comercial para la producción de etanol .

Las trayectorias biológicas utilizadas en el método de esta invención bajo condiciones normales de operación Sin desear estar vinculados por la teoría, los inventores especulan que los métodos para aumentar la producción anaeróbica de etanol a partir de los métodos descritos en la presente se basan en las trayectorias biológicas que implican la conversión de NAD(P)H a NAD(P) en los ciclos de trayectoria básica de la trayectoria acetogénica para el crecimiento autotrófico. La invención implica manipular esas trayectorias para permitir la producción continua y mantenimiento de altas concentraciones de etanol con bajas concentraciones de acetato bajo condiciones de operación estables. Proporcionando con esto, los métodos comercialmente útiles para la producción de etanol a partir de gases industriales. La participación esencial de NAD ( P) H a NAD(P) en las trayectorias biológicas se describe como sigue: la producción de etanol a partir de componentes gaseosos, tales como, CO, C0.sub.2, y H.sub.2 se presenta en un método biológico de tres pasos. En el primer paso, los sustratos de CO y H.sub.2 se oxidan y, haciendo eso, liberan NAD ( P) H : NAD ( P) . fwdarw . NAD ( P) H C0+H.sub.2+H. sub.20. fwdarw. CO. sub.2+4H. sup.+ Los productos del paso 1, luego se convierten a ácido acético, un paso que requiere NAD ( P) H : NAD ( P) H . fwdarw . AD ( P) CO+CO . sub .2+6 H . sup. +. fwdarw . CH . sub .3C00H+H . sub .20. Por último, si está disponible NAD(P)H en exceso debido a la reacción del paso 1 se procede en una velocidad más rápida que la reacción del paso 2, el ácido acético se reduce a etanol: NAD ( P ) H . fwdarw . NAD ( P) CH . sub .3C00H+4 H . sup .+. fwdarw. C . sub.2H . sub .50H+H . sub .20. De esta forma, la disponibilidad del NAD ( P) H en exceso proveniente de la oxidación del sustrato conduce a la producción de etanol a partir de ácido acético. Existen dos ciclos de trayectoria básica conocidos en la trayectoria acetogénica: (1) el ciclo de acetilo-CoA y (2) el ciclo de THF, en el cual CO.sub.2 se reduce a un grupo metilo. La secuencia para la generación de etanol y ácido acético a partir de esto se ilustra en J. R. Phillips et al, 1994 Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/46:145. El ciclo acetilo-CoA tiene un ciclo interno, denominado en la presente como el ciclo de CO. A medida que el ciclo de CO reacciona normalmente en el sentido de las aguja del reloj, se reduce la ferredoxina. La ferredoxina también se puede reducir mediante H.sub.2 a medida que se oxida sobre la enzima hidrogenasa. Como resultado, el ciclo de acetilo-CoA también reacciona en la dirección de las agujas de reloj, y se oxida la ferredoxina. En el ciclo de CO interno y el ciclo de acetilo-CoA reaccionan a mismas velocidades, la ferredoxina está en un equilibrio de estado redox. Sin embargo, si estos dos ciclos no se presentan a la misma velocidad, es decir, el ciclo de CO reacciona a una velocidad más rápida que el ciclo de acetilo-CoA, se acumula la ferredoxina reducida. También con el H.sub.2, en exceso también se puede producir en exceso la ferredoxina reducida. Esta ferredoxina reducida en exceso provoca que el NAD(P) se regenere (reduzca) a NAD ( P) H, lo cual constituye un exceso que se debe mitigar a equilibrio y al hacer esto, se reduce el ácido acético a etanol. El ciclo de THF funciona para el crecimiento celular y es necesario para un cultivo continuo; por lo tanto, no se puede detener por completo. La reducción de la velocidad del ciclo de THF también sirve para provocar una mayor proporción de NAD ( P) H a NAD(P). NAD ( P) H se oxida en dos lugares. Al limitar esta oxidación, lo cual podría mantener el balance total de la proporción celular de NAD ( P) H a NAD(P), se utiliza el NAD ( P) H para reducir el ácido acético a etanol. Un segundo método básico para provocar que el ácido acético se reduzca etanol es disminuir directamente el potencial redox del caldo de fermentación. Un estado de reducción suficientemente menor que el estado natural del cultivo provoca que el NAD(P)H estará en abundancia y estimula la reducción de ácido acético a etanol.

Los métodos de la operación normal Las pasos básicos del método incluyen lo siguiente: haciendo referencia a la figura 1, se describe un método de fermentación continua con recuperación del producto. Un flujo continuo del sustrato gaseoso 1 que comprende al menos un gas reductor, por ejemplo, CO o H.sub.2, se suministra a una velocidad de alimentación de gas seleccionada y un flujo continuo del medio de nutrientes en fase líquida 2 a una velocidad de alimentación de nutrientes seleccionada se suministran a un biorreactor para fermentación 3 que contiene bacterias sujeto. En el biorreactor 3, el medio y el sustrato gaseoso se fermentan por las bacterias para producir etanol y ácido acético. Una vez que se alcanza una concentración celular estable bajo condiciones en estado estable, los componentes del sistema continuo se manipulan para reducir el potencial redox, o aumentar la proporción de NAD(P)H a NAD(P), en el caldo de fermentación, mientras que se mantenga la concentración de ácido acético libre 'en el biorreactor menor que 5 g/L. Los métodos de esta invención se diseñan para permitir y mantener la producción de etanól y acetato en el caldo de fermentación de tal forma que la productividad de etanol sea mayor que 10 g/L día y a una proporción de etanol a acetato entre 1:1 y 20:1. En una modalidad, esa proporción es mayor que 3:1. En otra modalidad, esa proporción es mayor que 5:1. Todavía en otra modalidad, esa proporción es mayor que 10:1. Todavía en otra modalidad esta proporción es mayor que 15:1. El método de esta invención es efectivo alternativamente para mejorar la producción continua estable (estado estable) de mayores concentraciones de etanol (15-35 g/L de etanol) y disminuir las concentraciones de acetato (0-5 g/L de acetato), es decir, el índice de producción de etanol a acetato de: 3:1 o más, de CO, CO.sub.2, y H.sub.2 con buena estabilidad del método . Periódicamente, durante el curso de los métodos de esta invención, las muestras del caldo se retiran para determinar la proporción mediante un método de análisis convencional. Por ejemplo, las células se separan de la muestra, por ejemplo, mediante centrifugación y la muestra libre de células luego se somete a un método de análisis, tal como el método preferido de cromatografía de gases. Sin embargo, otros métodos de análisis convencionales se seleccionan por alguien con experiencia en la técnica. Los pasos opcionales adicionales del método se agregan hasta alcanzar y/o mantener la proporción. Los pasos utilizados para manipular los componentes del sistema y mantener y/o alcanzar la productividad deseada de etanol o la proporción de etanol a acetato incluyen al menos uno, y convenientemente, combinaciones de los siguientes pasos: alterar el contenido del medio de nutrientes, la velocidad de alimentación de nutrientes, la velocidad de alimentación acuosa, la presión de operación, el pH de operación, el contenido del sustrato gaseoso, la velocidad de alimentación del gas, la velocidad de agitación del caldo de fermentación, evitando el paso de inhibición de producción, disminuyendo la densidad celular en el biorreactor, o evitando la inhibición de sustratos. Algunas manipulaciones preferidas, incluyen suministrar al biorreactor con una limitación de nutrientes de fase líquida (pantotenato o cobalto), un ligero exceso de CO y H.sub.2 en el gas de alimentación, reducir al mínimo la concentración de acetato, evitar la aclimatación del cultivo para disminuir las concentraciones de nutrientes en fase líquida, llevar el cultivo a una concentración celular adecuada a una velocidad relativamente rápida, aumentar el pH del cultivo a más de 4.5, purgar las células bacterianas del biorreactor a una concentración celular menor que la concentración en estado estable que utiliza todo el gas reductor o los sustratos de nutrientes en el biorreactor y aumentar la velocidad de alimentación acuosa cuando la porción de ácido acético libre del acetato presente en el caldo del biorreactor para fermentación excede 2 g/L, inhibiendo así cualquier aumento no deseado en la concentración de ácido acético libre. Todos estos pasos se describen en detalle más adelante. El gas de escape 4 que contiene gases distintos a CO, CO.sub.2 y H.sub.2 y CO, CO.sub.2 y H.sub.2 sin convertir provenientes del reactor se ventilan del reactor y se utilizan por su valor de combustible. Si se emplea H.sub.2 en exceso como un mecanismo de control, la presión parcial de H.sub.2 en el gas de salida y la proporción de presión parcial de H.sub.2 a presión parcial de CO.sub.2 en el. gas de salida se utilizan para identificar el control de la proporción de etanol a acetato por ese paso. El reciclado celular se utiliza (aunque no se requiere para aumentar la concentración de células dentro del biorreactor, y proporcionar asi más biocatalizador para la conversión de CO, C0.sub.2 y H.sub.2. Con el reciclado celular, el efluente liquido proveniente del reactor 5 se envia a un separador celular 6 donde la células 7 y el permeado (liquido libre de células) 8 se separan. Las células 7 se envían de regresó al biorreactor y el permeado 8 se envia para la recuperación del producto. La separación celular se lleva a cabo al utilizar una centrifuga continua, fibra hueca o un sistema de filtración de bobinado espiral, sistema de filtro de cerámica u otro separador de sólido/liquido. El etanol se puede recuperar del permeado (o alternativamente el efluente proveniente del reactor 5 si no se emplea la separación celular) mediante una variedad de técnicas entre las que se incluyen destilación y adsorción. El permeado 8 se separa en una columna de destilación para producir 95% de etanol evaporado 10, y agua para reciclado 11 de regreso al reactor 3. El agua para reciclado 11 contiene exceso de nutrientes no utilizados en la fermentación, aunque cualquier exceso de vitaminas provenientes de la fermentación o lisis celular se destruyen mediante destilación térmica. El 95% de etanol evaporado 10 se envia a un tamiz molecular 12 donde el etanol anhidro 13, el producto final deseado, se separa del etanol diluido 14 que se envía de regreso a la columna de destilación 9. La combinación continua de crecimiento, muerte y purga celular mantiene una concentración celular constante, de tal forma que se utiliza un método continuo para producir etanol (y pequeñas cantidades de ácido acético) puede operar durante muchos meses al ser alimentado CO, C0.sub.2 y H.sub.2 junto con nutrientes sin suplementacion de cultivo adicional, Los métodos de esta invención mantienen y controlan las condiciones para la producción continua de etanol y ácido acético y evitar o corregir rápidamente los desajustes del método. Los métodos de esta invención también pueden ayudar a evitar la aclimatación del cultivo para disminuir la concentración de nutrientes, lo cual puede ser perjudicial para el desempeño del cultivo. En la descripciones posterior y en los ejemplos, a menos que se indique de otra manera, la presión utilizada es atmósfera 1 y la temperatura utilizada es entre 36-41°C. Las temperaturas y presiones convenientes se pueden determinar por alguien con experiencia en la técnica, dependiendo del microorganismo seleccionado para utilizarse en el biorreactor. Una variedad de manipulaciones, descritas específicamente más adelante, agregadas a los pasos básicos de esta, permiten la producción mejorada de etanol. De preferencia, la limitación de nutrientes en fase liquida (pantotenato o cobalto) o el uso de H.sub.2 o CO en exceso, son los pasos del método de la invención, descritos con mayor detalle más adelante, utilizados para alcanzar y mantener la productividad deseada de etanol y permitir la producción de concentraciones estables y proporciones de etanol a acetato en el caldo de fermentación. Estas condiciones permiten la producción de concentraciones estables de etanol y acetato en el caldo de fermentación. En una modalidad preferida, la proporción de producción de etanol a acetato producidos en, el caldo de fermentación es mayor que 10:1 y la concentración de etanol es mayor que 15 g/L.

A. Limitación de pantotenato de calcio En una modalidad especifica de esta invención, el método para manipular las trayectorias biológicas para favorecer la producción de etanol y limitar la producción de ácido acético implica limitar la cantidad de pantotenato de calcio en el medio de nutrientes a una cantidad que sea menor que la requerida para mantener las bacterias en una concentración en estado estable, que podrían utilizar totalmente el pantotenato de calcio proporcionado. El pantotenato es un componente de acetilo-CoA y por lo tanto, al limitar el pantotenato de calcio en el medio de nutrientes, la velocidad de ciclo de acetilo-CoA se reduce con relación a la velocidad de ciclo de CO. Esto provoca una acumulación de ferredoxina reducida y la reducción de NAD(P) a NAD(P)H, y con esto aumenta la producción de etanol como el producto final. Se observa una limitación de pantotenato cuando los microgramos (.mu.g) de pantotenato de calcio se alimentan al reactor por gramo (g) de células (peso en seco) producido en el reactor está en la variación de 0.5 a 100. Una limitación de pantotenato más conveniente está en la variación de 2 a 75 .mu.g de pantotenato de calcio por gramo (g) de células en seco producidas en el reactor. Todavía una limitación preferida de pantotenato está en la variación de 0.5 a 50 .mu.g de pantotenato de calcio por gramo (g) de células producidas en el reactor. Otra modalidad de esta limitación es aproximadamente 1-25 .mu.g de pantotenato de calcio por gramo (g) de células producidas en el reactor. Otra modalidad de esta limitación es aproximadamente 10-30 .mu.g de pantotenato de calcio por gramo (g) de células producidas en el reactor. Esta cantidad de nutrientes mantiene la producción de etanol en preferencia a la producción de acetato . En otro aspecto de este método, se evita la aclimatación de las bacterias en el biorreactor para fermentación para disminuir la concentración de pantotenato de calcio limitante al regular o ajustar los parámetros de fermentación, de tal forma que se mantenga una concentración de pantotenato de calcio constante, mientras que al menos uno, y algunas veces más de uno, el parámetro de la velocidad de alimentación de gas, la velocidad de alimentación de liquido, la velocidad de agitación, o la presión parcial de H.sub.2 se ajusta. Se evitan cambios principales en los nutrientes, aunque se mantiene una concentración de alimentación de nutrientes relativamente constante. Si' se permite que el cultivo se aclimate para disminuir los nutrientes de limitación en fase liquida, deficientes proporciones de producción de 1.0 g de etanol/g de acetato o menos se presentan en un método irreversible. De esta forma, es necesaria la inactivación del reactor y la re-inoculación. De preferencia, la trayectoria biológica se controla a favor de la producción de etanol y se limita la producción de ácido acético al suministrar primero el exceso de H.sub.2 en el gas de alimentación al biorreactor, y luego limitar el pantotenato de calcio en el medio de nutrientes como se describió anteriormente. De hecho, al inicio, el pantotenato de calcio con nutriente en fase liquida, normalmente limitante se mantiene en exceso para evitar la aclimatación de bajas concentraciones de nutrientes, una condición que puede dar por resultado en un desempeño muy deficiente y la pérdida de la capacidad del cultivo para alcanzar altas productividades de etanol de más del 10 g/L día si no se emplea H.sub.2 en exceso .

B. Limitación de cobalto En otra modalidad de esta invención, el método para manipular las trayectorias biológicas para favorecer la producción de etanol y limitar la producción de ácido acético implica limitar la cantidad de cobalto en el medio de nutrientes a una cantidad que sea menor que la requerida para mantener las bacterias a una concentración en estado estable que podrían utilizar totalmente el cobalto proporcionado. La limitación de cobalto se observa cuando los microgramos (.mu.g) del cobalto alimentado al reactor por gramo (g) de células (peso en seco) producido en el biorreactor está en la variación de 5 hasta 100. De preferencia, una limitación de cobalto implica proporcionar entre aproximadamente 20,' hasta 50 .mu.g de cobalto al reactor por gramo de células producidas en el reactor. Esta cantidad de cobalto mantiene la producción de etanol en preferencia al acetato en el proceso. Limitar el cobalto en el caldo de fermentación también puede reducir la velocidad del ciclo de acetilo-CoA. Debido a que el cobalto se utiliza para transferir un grupo metilo del ciclo de THF al ciclo de acetilo-CoA, limitar la cantidad de cobalto en el caldo de fermentación también reduce la función del ciclo de THF al no permitir la transferencia. La limitación de cobalto reduce la velocidad del ciclo de THF, lo cual también provoca una mayor proporción de NAD(P)H a NAD(P), produciendo con esto etanol. El método se manipula además al evitar la aclimatación para disminuir la concentración de cobalto limitante. En gran parte de la misma manera se evita la aclimatación para disminuir la concentración de pantotenáto, se mantiene una concentración constante de cobalto mientras que se ajustan uno o más de los parámetros de fermentación (índice de gas, índice de líquida, velocidad de agitación, contenido de C0.sub.2, y presión parcial del gas de H.sub.2). Se evitan los principales cambios de nutrientes, aunque en su lugar se mantiene una concentración de alimentación de nutrientes relativamente constante. De preferencia, se controla la trayectoria biológica para favorecer la producción de etanol y limitar la producción de ácido acético al alimentar primero el H.süb.2 en exceso al reactor y luego limitar el cobalto en el medio de nutrientes como se describió anteriormente. Al inicio, el cobalto de nutrientes en fase liquida limitante se mantiene en exceso para evitar la aclimatación para disminuir la concentración de nutrientes, una condición que puede dar por resultado en un desempeño de cultivo muy deficiente y la pérdida de la capacidad del cultivo para preparar proporciones de producción mayores que 1:1.

C. Superabundancia de hidrógeno Todavía en otra modalidad, el método para manipular las trayectorias biológicas para favorecer la producción de etanol y limitar la producción de ácido acético implica alimentar H.sub.2 en exceso en el gas de alimentación o limitar el carbón gaseoso lo cual da por resultado en H.sub.2 en exceso, que luego se utiliza por la trayectoria biológica. De preferencia, el gas reductor de H.sub.2 está en exceso con relación al CO, y el H.sub.2 en exceso provoca que las bacterias produzcan una alta proporción de etanol a acetato en el caldo de fermentación. En la proporción de H.sub.2 (moles de gas alimentado) a la suma de dos veces el CO (en moles de gas) convertido y tres veces el C0.sub.2 (en moles de gas) convertido es mayor que 1, el fermentador es carbono limitado. El H.sub.2 parcial presente en el gas de salida de preferencia es mayor que 0.4 kg/cm2 (0.4 atm) . Por último, la proporción de presión parcial de H.sub.2 a presión parcial de CO.sub.2 debe ser mayor que 3.0 para asegurar que está disponible suficiente H.sub.2 para utilizar la totalidad del CO.sub.2. Si la presión parcial de CO.sub.2 es mayor qúe 0.1 kg/cm2 (0.1 atm) , es probable que se haya limitado de otra manera el crecimiento. Durante el inicio, se favorece el uso de H.sub.2 en exceso con respecto a la limitación de nutrientes principalmente debido a que es más fácil de controlar. Los beneficios de emplear H.sub.2 en exceso son que se evita la producción de ácido acético en exceso, lo cual puede conducir a proporciones de producción deficientes y una inhibición de ácido acético potencial, asi como también la aclimatación para disminuir las concentraciones de nutrientes.

D. Superabundancia de monóxido de carbono Otra forma de manipular los componentes del método implica proporcionar en abundancia el gas reductor, CO, en el sustrato gaseoso para utilizarse en la trayectoria, ló cual sirve para disminuir directamente el potencial redox en el caldo de fermentación. De esta forma, de acuerdo con esta modalidad, el biorreactor se suministra con sustrato gaseoso que comprende CO en la cantidad de CO presente en el biorreactor es mayor que la cantidad requerida para mantener las bacterias a una concentración en un estable, que podrían utilizar totalmente el CO proporcionado. La proporción en exceso de CO como un método para favorecer la producción de etanol con respecto a la producción de ácido acético cuándo la velocidad especifica de la absorción de CO (milimoles de CO por gramo de células (peso en seco) en el reactor por minuto o mmol/g célula-minutos) es mayor que 0.3. De mayor preferencia, esta paso implica una velocidad especifica de absorción de CO de más de 0.5. Esto significa que cada célula en el promedio está utilizando CO en su metabolismo a un índice de al menos 0.3 mmoles/g-minutos, o más idealmente a una velocidad de al menos 0.5 mmoles/g-minutos. De preferencia, el CO se proporciona a una velocidad a la cual la absorción de CO sea de 0.3 hasta 2 mmol CO/gram célula (peso en seco) de bacterias/minutos. En otra modalidad/ se proporciona el CO a una velocidad de 0.5 hasta 1.5 mmol CO/gramos célula (peso en seco) de bacterias/minuto. En otra modalidad, el CO se proporciona en una velocidad de aproximadamente 1 mmol CO/gramos célula (peso en seco) de bacterias /minuto. Esta velocidad de absorción de CO mantiene la producción de etanol en preferencia a la producción de acetato. Si se suministra CO de tal forma que el CO disuelto en el caldo de fermentación sea significativo por la presión de gas o una transferencia de masa extremadamente buena, el caldo de fermentación se torna más reducido. El suministro en exceso de CO tiene dos beneficios adicionales. El CO en exceso puede provocar que el ciclo de CO funcione a una velocidad más rápida, y si el ciclo de acetilo-CoA se limita de otra manera y no se puede mantener con el ciclo de CO, se reduce la acumulación de ferredoxina. El CO también puede disminuir el paso 2 (producción de ácido acético intermedio) en el método de tres pasos total a través de la inhibición del sustrato. Esta velocidad disminuida del paso 2 con relación al paso 1 provoca un exceso de NAD ( P) H, que conduce a una producción de etanol en favor del ácido acético. Aunque el exceso de CO puede dar por resultado en una producción aumentada de etanol al reducir directamente el potencial redox del caldo de fermentación, la presencia de CO en exceso también inhibe el crecimiento al inhibir la C0-deshidrogenasa y por lo tanto la absorción de H.sub.2. La presencia de CO en exceso desafortunadamente también da por resultado en una deficiente conversión de H.sub.2, lo cual puede no ser económicamente favorable. La consecuencia de la operación extendida bajo la inhibición del sustrato es una deficiente absorción H.sub.2. Esto con el tiempo provoca lisis celular y es necesario reiniciar el reactor. Cuando este método tiene un resultado no pretendido de la inhibición del sustrato con CO (la presencia de demasiado CO para las células disponibles) durante el crecimiento inicial del cultivo o después del mismo, se reduce la velocidad de alimentación del gas y/o velocidad de agitación hasta que se libera la inhibición del sustrato.

E. Pasos de manipulación adicionales Además del método principal para mejorar los pasos descritos anteriormente, en el método para producción de etanol se incluyen convenientemente diversos pasos del método. 1. Aumentar la transferencia de masa Una modalidad adicional implica asegurar que la transferencia de masa del CO o H.sub.2 proveniente de la alimentación de gases al caldo de fermentación liquido es más rápido que la capacidad de las bacterias para utilizar los gases disueltos. Por ejemplo, si un biorreactor que contiene C. ljungdahlii se alimenta con CO, C0.2 y H.sub.2 y se opera son limitación sobre los nutrientes (tal como pantotenató o cobalto) o la presencia de H.sub.2 en exceso, se limita el crecimiento de las células por la cantidad de gas transferido en la fase liquida y el sistema produce ácido acético como el producto. Si el cultivo se alimenta con una ligera cantidad de CO o H.sub.2 en exceso de lo que se requiera para el crecimiento del cultivo, se produce etanol . Sin embargo, si se transfiere demasiado gas en la fase liquida para el cultivo que se utilizará, se presenta una inhibición del sustrato, lo cual puede conducir a un desajuste del cultivo y muerte celular. De esta forma, existe una variación muy estrecha de operación con la transferencia de masa en exceso. Con referencia al ciclo de acetilo-CoA, para que se produzca ferredoxina reducida en exceso, el ciclo de CO o la reducción de ferredoxina a través de hidrogenasa se debe presentar más rápido que el ciclo de acetilo-CoA. Los métodos descritos en la presente, limitan la velocidad a la cual los organismos pueden utilizar los gases disueltos al restringir la velocidad a la cual los nutrientes esenciales, por ejemplo, pantotenato de calcio o cobalto, u otros sustratos, tales como gas de C0.sub.2, están disponibles para las bacterias», o al proporcionar el sustrato en exceso, H.sub.2 o CO al cultivo. Se puede calcular, una velocidad teórica de transferencia de masa, que es más rápida que la velocidad a la cual las bacterias puedan utilizar el sustrato, incluso sin otras limitaciones. Esa velocidad, cuando se alcanza, se limita por la velocidad de crecimiento natural del organismo. Por lo tanto, la modalidad más productiva es cuando la transferencia de masa (magnitud de flujo de gas o velocidad de agitación) es más rápida que la velocidad a la cual la mayor concentración posible de células pueden utilizar el sustrato sin ninguna limitación. Podría haber una variación de operación muy estrecha, ya que la inhibición del sustrato podría provocar rápidamente la muerte de células y una concentración de subproductos resultante que sea tóxica para el cultivo. 2. Suministro de CP y H.sub.2 en exceso En otra modalidad de un método de esta invención, se alcanza la estabilidad en la alta concentración de etanol/producción de ácido acético limitado en los métodos que limitan cobalto o pantotenato de calcio, o proporcionan una abundancia de H.sub.2 o CO. De acuerdo con este paso, a medida que el cultivo utiliza los sustratos gaseosos CO, H.sub.2 y C0.sub.2 como las fuentes de carbono y energía, se suministran en exceso ligero CO y H.sub.2. Un exceso ligero de CO y H.sub.2 se alcanza al alcanzar la operación estable y luego aumentar gradualmente la velocidad de alimentación de gas y/o la velocidad de agitación (incrementos del 10% o menores) hasta que las conversiones de CO y H.sub.2 recién comiencen a declinar. Éste es un medio para evitar la limitación de la transferencia de masa, que favorece la producción de ácido acético, y el suministro de ferredoxina reducida en exceso para reducir NAD(P) a NAD ( P) H y producir etanol. Si no se suministra en exceso ligero CO y H.sub.2, se presenta una limitación de transferencia de masa, y la trayectoria se balancea. Esto da por resultado en proporciones de producción deficientes de etanol a acetato (altas concentraciones de acetato) . Las altas concentraciones de acetato por último pueden dar por resultado en la inhibición del ácido acético, lo cual limita la capacidad de las bacterias para absorber el H.sub.2; y con el tiempo conducir a una deficiencia del cultivo. Los pasos para evitar la limitación de transferencia de masa incluyen un aumento en la velocidad de agitación o índice de gas para transferir más CO y H.sub.2 en la fase líquida, y de esta forma regresar a la presencia de un ligero exceso de CO y H.sub.2. Si se presenta la inhibición del producto como resultado de la limitación de la transferencia de masa, es necesario aumentar la velocidad de alimentación de líquido para aclarar la inhibición del ácido acético, al diluir a una concentración de acetato resultante menor. Debido a que aumentar la velocidad de alimentación del medio podría aumentar el .mu.g de pantotenató o cobalto/g-célula producidos, esto se debe realizar, sólo brevemente o el pantotenató o cobalto en exceso se debe eliminar al ajusfar la concentración del medio o aumentar la velocidad de alimentación de agua. 3. Acondicionamiento para la inhibición del producto de ácido acético Cuando en los métodos descritos anteriormente, se puede presentar la inhibición del producto de ácido acético si demasiado ácido acético molecular, es decir, >2 g/L, se acumula en el biorreactor para permitir el crecimiehto celular y la producción adicional de etanol. Otro pasó de manipulación se utiliza para evitar la falla del cultivo. Una modificación implica aumentar brevemente la velocidad de alimentación de liquido o acuosa para reducir la concentración en fase liquida o inhibir el ácido acético para a menos de 2 g/L. 4. Paso de agua para reciclado Todavía otro paso del método opcional para mantener un cultivo estable que produzca etanol como el único producto sin producción neta de ácido acético en los métodos de esta invención implica agregar agua para reciclado proveniente de la destilación de regreso al reactor para fermentación. Como se observó anteriormente, el agua para reciclado (que contiene hasta 5 g/L de acetato) tiene el beneficio de reciclar el acetato producido de regreso al reactor de tal forma que se produzca ácido acético neto. De esta forma se establece un equilibrio entre el etanol y el acetato en el reactor. Como resultado, la totalidad de CO, C0.sub.2 y H.sub.2 alimentado al reactor y convertido a productos da por resultado en la producción de etanol, excepto para el utilizado para el mantenimiento del cultivo.

. Reducir de la densidad celular Todavía otro paso de manipulación útil en el método es iniciar una purga periódica o continua de células bactrianas provenientes del biorreactor para reducir la concentración celular en el biorreactor. Esta manipulación sirve para reducir la concentración celular a menos que la concentración celular en estado estable que utiliza todo el gas reductor o los sustratos de nutrientes en el biorreactor. De esta forma, al alterar la densidad celular, se favorece la producción de etanol con respecto a la producción de acetato en el biorreactor. 6. CSTR de dos etapas Uno de los problemas asociados con la producción de etanol con la limitación de medios es la capacidad o tendencia del cultivo para adaptarse con el tiempo a las condiciones limitantes y no seguir produciendo etanol después de varios meses de operación. En lugar de esto el acetato se convierte con el tiempo al el producto dominante. Esta aclimatación para disminuir las concentraciones de nutrientes limitantes da por resultado en un cultivo que produce más ácido acético que etanol (proporción de producción de etánol a acetato de 1.0 o menos), y proporciona bajas concentraciones de etanol (algunas veces tan bajas como 1 g/L) . La adaptación de manera más probable se presenta cuando no se le proporciona al cultivo suficientes nutrientes durante el inicio, cuando la velocidad de crecimiento es más importante que la velocidad de producción de etanol. Adicionalmente, existe el peligro de que el cultivo se pueda aclimatar para disminuir las concentraciones de nutrientes limitantes durante la operación en estado estable en particular a medida que las concentraciones de nutrientes limitantes se ajustan descendentemente para limpiar el sistema de reacción del acetato. Para evitar esta adaptación cuando se utilizan los pasos limitantes de pantotenato o cobalto anteriores, en lugar de permitir que el cultivo crezca con los nutrientes disponibles, y el daño mencionado anteriormente, se puede emplear otra modificación del método. Un sistema CSTR de dos etapas donde se presenta principalmente un bueno crecimiento del cultivo en la primera etapa en un ligero exceso de nutrientes limitantes (quizá con la producción de ácido acético acompañante) , seguido por la etapa de producción donde el cultivo proveniente de la primera etapa ahora se limita por el nutriente limitante y se utiliza para producir altas concentraciones de etanol, es otra modificación del método. Esta modificación permite el mantenimiento de un cultivo estable, que no se aclimata para reducir las concentraciones de pantotenato o cobalto. Esta modificación implica la operación de un CSTR de dos etapas, en el cüal un reactor de crecimiento (etapa 1) para alimentar a un reactor de producción (etapa 2) donde se presenta el volumen de la producción de etanol. El reactor de crecimiento no se opera con los pasos de alimentación de nutrientes descritos anteriormente, de esta forma el cultivo no es tan susceptible de aclimatación a una condición limitada. De acuerdo con una modalidad del CSTR de dos etapas, la etapa de crecimiento que opera a un tiempo de retención de liquido (LRT) de aproximadamente 24 horas. La etapa de crecimiento CSTR 1 se alimenta con bastante pantotenato o cobalto en el medio 2 para proporcionar un cultivo sano (y también puede producir algo de ácido acético) . De esta forma, se produce en el reactor ácido acético en exceso, aunque con estabilidad aumentada. Esta concentración de pantotenato o cobalto está en exceso de lo que normalmente se podría alimentar a un CSTR individual utilizado para producir etanol. La alimentación de gas a este reactor es gas sin convertir 3 proveniente de la etapa de producción 4 y la alimentación de líquido es medio recién preparado 2. El CSTR de la etapa de crecimiento se opera sin reciclamiento de células. El fin de este reactor de etapa de crecimiento es proporcionar un cultivo sano para una producción posterior de etanol que no se aclimata a bajas concentraciones de pantotenato. El reactor de etapa de producción 4 se opera a un LRT nominal menor que 20 horas. Este CSTR con el reciclado de células se alimenta una alimentación de gas recién preparado 5, y puede tener bajas conversiones. Se alimenta alimentación de medio fresco 6 así como también alimentación de cultivo 7 proveniente de la etapa de crecimiento. Se alimenta mínimo pantotenato o cobalto a este reactor debido a que está disponible exceso de la etapa de crecimiento. El reciclamiento de células 8 se utiliza en este reactor para obtener la mayor producción de las células enviadas de regreso al reactor 9. La concentración de etanol de salida en el producto líquido 10 debe ser mayor que 20 g/L: Las características del sistema CSTR de dos pasos incluyen poco cambio para la aclimatación a bajas concentraciones de pantotenato o cobalto; un LRT total menor que o igual a 30 horas; una productividad mayor esperada de etanol y una mayor concentración de etanol que la de un CSTR individual del mismo tamaño. 7. Modificaciones de inicio Todavía otros pasos del método, que de preferencia se utilizan en la práctica de esta invención, implica la producción de células en el inicio del cultivo de fermentación. El inicio de una alimentación al biorreactor de CO, C0.sub.2 y H.sub.2 para producir etanol y ácido acético se lleva a cabo mediante inoculación por lotes a partir del cultivo madre o al emplear un inoculo continuo proveniente de un reactor existente como alimentación del cultivo. Como se observó anteriormente en el análisis de evitar la aclimatación de cultivos para disminuir las concentraciones de pantotenato o cobalto, el cultivo se debe llevar convenientemente a una alta concentración celular antes de limitar los nutrientes, pero suministrar H.sub.2 en exceso al cultivo. Este inicio rápido evita la aclimatación del cultivo y produce buenas proporciones de producción (altas concentraciones de etanol y bajas concentraciones de acetato) . Si no se emplea el inicio rápido, se pueden presentar proporciones de producción deficiente y el cultivo se puede aclimatar para disminuir las concentraciones de nutrientes en fase líquida y requerir la reinoculación del reactor . El reactor se inicia con una fase líquida en lote (el medio líquido no se alimenta inicialmente de forma continua al reactor), a bajas velocidades de agitación (quizás 400-600 rpm en un reactor New Brunswick Scientific Bioflo.RTM. de laboratorio) y al pH deseado. La fase líquida del reactor de esta forma consiste de un lote de medio de nutrientes que contiene vitaminas y sales, con una concentración nominal de nutriente limitante, ya sea pantotenato de calcio o cobalto (20 .mu. g/L de pantotenato o 75 ppb de cobalto) . Si se emplea un inoculo continuo proveniente de un reactor existente, probablemente no sea necesaria la operación en fase líquida por lotes. En este caso, el gas se alimenta continuamente al reactor durante el inicio a una velocidad lenta. Idealmente, la fase de gas al inicio podría ser CO. sub.2-libre, H . sub .2-abundante y el índice de gas y la velocidad de agitación se podrían mantener a bajos niveles para evitar la inhibición del sustrato con CO. Un protocolo de inicio general ilustrativo para producir y sostener las concentraciones de etanol comercialmente viables de CO, CO.sub.2 y H.sub.2 consiste de tres fases distintas: (a) inicio, donde la producción de células es decisiva; (b) inicio donde la velocidad de producción se torna decisiva; y (c) operación en estado estable. Esencialmente, el inicio se caracteriza por la inoculación de un liquido en lote, con un nutriente limitante nominal, seleccionado de cobalto (75 ppb) o pantotenato de calcio (20 .mu.g/L) a un pH deseado (típicamente 4.5-5.5). Para facilitar el inicio, la velocidad de alimentación de gases y la velocidad de agitación de preferencia se mantienen bajas, mientras que se alimenta en exceso los ratos H.sub.2. La causa de la producción de etanol durante el inicio es el H.sub.2 en exceso; más tarde se presenta la limitación de nutrientes. De esta forma, los nutrientes líquidos en exceso se presentan realmente durante el inicio para evitar una aclimatación no deseada del cultivo para disminuir los nutrientes. A medida que procede la fermentación durante un periodo de varias horas después de la inoculación, se produce CO.sub.2 y se consume H.sub.2. Los cambios en estas velocidades indican que la velocidad de agitación se debe aumentar nominalmente de forma lenta (quizás 200-300 rpm en un reactor de laboratorio, durante un periodo de 2-3 días) para evitar la limitación de transferencia de masa. Este ajuste de la producción de CO.sub.2 se presenta mucho más rápidamente en sistemas que emplean inoculación continua en oposición a la inoculación por lotes provenientes del cultivo madre. Sin embargo, si se aumenta demasiado rápido la velocidad de agitación, se presenta la inhibición del sustrato con CO. Este procedimiento de observar la conversión de H.sub.2 (o la producción de C0.sub.2) mientras que se aumenta la velocidad de agitación se presenta a una velocidad relativamente rápida hasta que se alcanza la velocidad de agitación blanco. Durante este tiempo de aumentar la velocidad de agitación y el cultivo de liquido por lotes, la producción celular en lugar de la formación del producto es de suma importancia. Una vez que se alcanza la velocidad de agitación blanco (800-1000 rpm en un reactor New Brunswick Scientific Bioflo. RTM. de laboratorio), el cultivo se deja estabilizar para confirmar la absorción de H.sub.2. El inicio cambia a un modo en el cual la velocidad de producción se torna importante. Es conveniente tener conversiones de CO que excedan el 80% y una alta presión parcial de H.sub.2 en el gas de salida (al menos 0.55 kg/cm2 (0.55 atm) ) para asegurar la producción de etanol mientras que se limite la concentración de acetato y el ácido acético molecular libre. La velocidad de alimentación del medio liquido luego se activa (para sistemas que tengan inoculación por lotes provenientes del cultivo madre) para iniciar la alimentación continua de líquidos y se aumenta el índice de gas en incrementos del 10% hacia la magnitud de flujo blanco. H.sub.2 permanece en exceso para evitar la producción de ácido acético en exceso. A medida que aumenta el índice de gas, se limitan los nutrientes en fase líquida (pantotenato de calcio o cobalto) , y el efecto de esta limitación és una pequeña caída en la conversión de H.sub.2, en la producción destinada . En la operación en estado constante, se alcanza la producción de 15-35 g/L de etanol y 0-5 g/L de acetato. En esta etapa, son necesarios pequeños ajustes para limitar los nutrientes, las velocidades de alimentación del líquido y las velocidades de alimentación de gases, y se seleccionan por un experto en la técnica recurriendo al conocimientos existente en la técnica así como también a las enseñanzas de esta invención. Si se agrega reciclamiento de células al método para la producción de etanol, se agrega en este momento junto con un ajuste en el índice de gas (aumento) y concentración (disminución) de nutrientes. Los métodos descritos anteriormente para la producción continua y mantenimiento de altas concentraciones de etanol con bajas concentraciones del subproducto de acetato bajo condiciones de operación estables mejoran el uso de las bacterias sujeto a una escala comercial para la producción de etanol. Los pasos señalados en los métodos anteriores superan las limitaciones de la utilización de las bacterias sujeto para la producción comercial de etanol a partir de CO, C0.sub.2 y H.sub.2. De preferencia, el método emplea un biorreactor continuo, aunque también se utilizan métodos para fermentación por lotes y por lote de alimentación, aunque probablemente no sean económicamente viables para la producción de etanol a gran escala. Los siguientes ejemplos servirán para ilustrar ciertas modalidades específicas de las invenciones descritas en la presente. Sin embargo, estos ejemplos no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención novedosa ya que existen muchas variaciones que se pueden realizar sobre la misma sin apartarse del espíritu de la invención expuesta, como reconocerán aquellos expertos en la técnica .

EJEMPLOS Se condujo un experimento inicial para investigar la utilización de etanol y dióxido de carbono como la fuente de energía para mantener la viabilidad de C. Ijungdahlii. En este experimento, se proporcionó el dióxido de carbono como un gas burbujeado a través del cultivo. La concentración de ácido libre se controló al disminuir la temperatura a 25°C y al aumentar el punto de ajuste del pH. El gas de síntesis luego se desactivó y reemplazó con un burbujeo lento de dióxido de carbono a aproximadamente 30 ml/min. La agitación se disminuyó a un nivel bajo que proporcionó sólo un mezclado suficiente para distribuir el calor y las adiciones, de liquido en el reactor. El pH se aumentó de 4.5 a 4.7. El reactor tuvo un ciclo de reciclamiento celular utilizando üna membrana de fibra hueca, lo cual permitió una purqa de permeado que se utilizará para evitar la pérdida de células durante el experimento. El flujo de permeado fue igual al flujo del medio en el sistema. El tiempo de retención de líquidos no cambió, permaneciendo a 30 horas. Después de 12 horas de falta de suministro de gas de síntesis, el etanol medido y las concentraciones de acetilo total habían cambiado como se esperaba. El nivel de etanol disminuyó de 24.0 a 12.8 g/L mientras que el nivel de acetilo total aumentó de 4.2 a 10 Ag/L. El punto de ajuste de la temperatura se regresó a 38 °C. A medida que se fue calentando el cultivo, se aumentó la agitación al mismo1 nivel utilizado antes del experimento; el dióxido de carbono se reemplazó con flujo de gas de síntesis al 50 por ciento de la magnitud de flujo utilizada antes del experimento. Se detuvo la purga del permeado. El cultivo se mantuvo en esta condición durante 14 horas. Durante ese tiempo, la absorción de monóxido de carbono permaneció estable y se mejoró constantemente la absorción de hidrógeno. Una. vez que la absorción de hidrógeno había mejorado suficientemente, la magnitud de flujo del gas se escalonó aumentando hasta alcanzar la magnitud de flujo pjre-experimental . Dentro de las 47.5 horas de la magnitud de flujo de gas de síntesis había regresado a los índices pre-experimentales . A medida que se fue aumentando el flujo de gas de alimentación, fue disminuyendo la concentración total de acetilo y aumentó la concentración de etanol. La concentración total de acetilo se disminuyó a los niveles pre-experimentales dentro de 32 horas. La concentración de etanol alcanzó casi los niveles pre-experimentales dentro de las 70.5 horas. En este experimento, se proporcionó dióxido de carbono mediante un flujo continuo de un 7.7% de solución de bicarbonato de sodio en el cultivo. La temperatura se redujo a 25°C. Se controló la concentración de ácido acético libre al disminuir la temperatura a 25°C, al aumentar el pH y al aumentar el flujo del líquido a través del cultivo. El gas de síntesis se detuvo y se reemplazó con un flujo continuo de 7.7% de bicarbonato de sodio. En presencia de un entorno ácido, el bicarbonato de sodio se degradó en un ión de sodio, agua y óxido de carbono proporcionando así el dióxido de carbono necesario para la conversión de etanol a ácido libre.

La agitación se disminuyó a un nivel bajo que proporcionó justo bastante mezclado para distribuir el calor y las adiciones del liquido en el reactor. El punto de ajuste del pH no se controló, aunque a medida que se agregó al cultivo el bicarbonato, el pH se aumentó lentamente a todo lo largo del experimento, lo cual ayudó a controlar la concentración de ácido libre. El reactor tuvo un ciclo de reciclamiento celular utilizando una membrana de fibra hueca, lo cual permitió una purga del permeado que se utilizará para evitar la pérdida de células durante el experimento. El flujo de permeado fue igual al flujo del medio más el flujo adicional de bicarbonato de sodio en el sistema. El flujo de bicarbonato extra redujo el tiempo de retención de liquido de 29 a 21 horas. Durante el experimento, la concentración de etanol disminuyó a medida que la concentración total de acetilo aumentó constantemente. Dentro de las 5.5 hora$ en que la concentración de etanol había disminuido de 21.0 a 14.1 g/L mientras que el nivel total de acetilo había aumentado de 4.4 a 9.1 g/L. El pH medido también había aumentado de 4.48 a 4.84. En un esfuerzo para controlar la concentración de ácido, la magnitud de flujo de la corriente de nutrientes se aumento de 1.33 mL/min a 2.81 mL/min., 5.6 horas después del inicio del experimento. La purga de permeado también se aumentó de 1.86 a 3.48 mL/min para evitar un lavado no deseado de células. Estos cambios disminuyeron el tiempo de retención de líquidos de 21 a 12 horas. Esto tuvo el efecto deseado de mantener baja la concentración de ácidos. Dos horas después de los cambios en los flujos de líquido, había aumentado la concentración total de acetilo a únicamente 9.4 g/L. Sin embargo, la concentración de etanol disminuyó a una velocidad más rápida de 14.1 hasta 10.7 g/L. Después de 8 horas sin suministro de gas de síntesis, la concentraciones medidas de etanol y acetilo total cambiaron como se esperaba. El nivel de etanol disminuyó de 21.0 hasta 10.7 g/L mientras que el total de acetilo aumento de 4.4 hasta 9.4 g/L. El punto de ajuste de la temperatura se aumentó nuevamente a 38 °C. A medida que el cultivo se fue calentando, se aumentó la agitación al mismo nivel utilizado antes del experimento; se detuvo la adición de bicarbonato de sodio, se inició el flujo de gas de síntesis al 50 por ciento la velocidad de flujo utilizada antes del experimento; y se detuvo la purga del permeado. El cultivo se mantuvo en esa condición durante únicamente 50 minutos. La magnitud de flujo del gas se escalonó aumentada hasta alcanzar la magnitud de flujo anterior. En un término de 29.2 horas la magnitud de flujo del gas de síntesis había regresado a los índices pre-experimentales . A medida que fue aumentando el flujo de gas de alimentación, la concentración total de acetilo, disminuyó y aumentó la concentración de etanol a concentraciones pre-experimentales en un periodo de 43.2 horas. De esta forma, el etanol que ya está en el termentador de esta forma se puede utilizar junto con dióxido de carbono para mantener la viabilidad del cultivo durante la interrupción del gas de síntesis.

Ejemplo 1 Estudios de la pérdida de gas con microorganismos utilizando conversión de etanol y C02 para energía El propósito de la experimentación con microorganismos fue determinar un método para sostener un cultivo en caso de una pérdida de gas de alimentación durante un periodo de tiempo prolongado (>30 minutos) . En este ejemplo, el enfoque fue sobre la adición de C02 para la conversión de etanol a ácido libre como una forma para que el cultivo ganara energía durante la pérdida del gas de síntesis . Se ha conocido durante bastante tiempo que ciertos microorganismos acetogénicos pueden convertir etanol de regreso a ácido acético utilizando C02, aunque no se han realizado pruebas para determinar si este proceso se puede utilizar para sostener el cultivo durante periodos de tiempo prolongados cuando no haya gas de síntesis disponible. Una modalidad de la presente invención proporciona una solución para superar una pérdida de gas de alimentación ya que el etanol y el C02 (en forma de bicarbonato de sodio) ya ' están para utilizarse debido a operaciones normales de biorreactores . Además de agregar el C02 para la conversión de etanol a ácido, la temperatura del cultivo se disminuyó durante algunos de los experimentos como una forma de disminuir la actividad del cultivo. Una actividad celular más lenta deberá reducir la cantidad de energía necesaria, la cantidad de C02 y etanol requeridos, y la cantidad de ácido producido . Para estos experimentos, el biorreactor se hizo funcionar directo a través del CSTR tanto con un reciclamiento de células como un bucle de bobina para enfriamiento de cultivos. Se utilizó una purga de permeados durante los experimentos para evitar la pérdida no deseada de células, aunque la corriente de purga se desvió para desperdiciar y no se recicló de regreso en el biorreactor. Durante las operaciones normales del biorreactor la temperatura del cultivo se mantuvo a 38 °C; la agitación fue de 400 rpm; el volumen de cultivo aproximado fue de aproximadamente 2.4 L; y el punto de ajuste de pH del cultivo fue de 4.5. Se utilizó para control de pH una solución de 7.7% de NaHC03. El gas de alimentación fue gas de síntesis que contuvo 15% de H2, 45% de N2, 30% de CO y 10% de CO= . La velocidad de alimentación del gas sintético fue de aproximadamente 475 mL/min. El medio se alimentó en el reactor a aproximadamente 1.30-1.35 mL/min, o aproximadamente 1870-1940 mL/dia. Los tiempos de retención de liquido y células se promediaron a 25-30 horas. El medio utilizado fue el medio lx EtOH utilizado regularmente para el cultivo dé C-01. Los componentes del medio y sus concentraciones se listan en la tabla 1 más adelante. Durante las operaciones normales, las bacterias CL utilizan los componentes del gas sintético CO, H2 y C02 como substratos por su fuente de carbono y energía, o electrones. Debido a esto, se debe tener cuidado de evitar la pérdida de ese sustrato para sostener el cultivo. Sin embargo, se debe interrumpir el suministro de gas de alimentación, las bacterias pueden sobrevivir al utilizar etanol y C02 para producir ácido acético como se observa en la siguiente ecuación ( 1 ) . 2 CH3-CH2-OH + 2 C02 = 3 CH3-COOH Ecuación (1) A través de esta reacción, ventajosamente las células pueden ganar electrones para la supervivencia de la oxidación del alcohol a la forma de ácido carboxílico. Si se interrumpe el gas de alimentación, el cultivo gana típicamente electrones, mientras que no gana carbono disminuyendo así el crecimiento de las células. Por lo tanto, se cree que este proceso proporciona un medio para la supervivencia del cultivo, aunque no optimiza la producción. El lavado de células, o la eliminación de cualesquiera células provenientes del sistema, se debe evitar, para mantener la densidad celular durante la pérdida del gas de alimentación. Este proceso conduce a una acumulación de ácido. Se deben tomar los pasos para asegurar que se mantengan los niveles de ácido acético libre a niveles de concentración menores para inhibir las concentraciones (<5 g/L) . Esté se puede llevar a cabo al aumentar el punto de ajuste de pH a una. variación de 5.1-5.3, al aumentar el flujo de líquido a través del sistema disminuyendo así el LRT a 15-20 horas, y al limitar la producción de ácido al limitar el C02 y/o el etanol disponibles o al disminuir el metabolismo del cultivo a través de la reducción de temperatura. La producción de ácido consume la concentración de etanol en el reactor. Debido a que el cultivo está exhibiendo una producción disminuida de etanol mientras que bajo estas condiciones, la concentración de etanol s debe supervisar para asegurar que no se consuma excesivamente.

Puede ser necesario que se agregue etanol al sistema o simplemente como el periodo de tiempo sin que aumente el gas de alimentación. Durante estos experimentos, la concentración de etanol en el biorreactor se ha consumido a una concentración tan baja como 4 g/L sin efectos perjudiciales para el cultivo. Opcionalmente , la temperatura de cultivo desempeña una función vital en este proceso como una forma para controlar el Índice metabólico de las células. A medida que se disminuye la temperatura, disminuye el índice metabólico de las célula. Esto, a su vez, disminuye la producción de ácido y el uso de etanol y CO2. Disminuir la temperatura cuando el reactor está sin gas de alimentación extiende el periodo de tiempo en que puede sobrevivir el cultivo. Inversamente, si la temperatura se mantiene a 38 °C, la velocidad para la producción de ácido está a su nivel más alto y se debe tener cuidado de supervisar el nivel de áaido y el nivel de etanol que se requiera para mantener al cultivo sano. Los experimentos han disminuido la temperatura del cultivo a aproximadamente 25°C, manteniendo exitosamente la viabilidad celular durante aproximadamente 30 horas sin gas alimentado. Una modalidad de la presente invención proporciona un método de distribución de una cantidad controlada de C02 que comprende la adición de NaHCC>3. Cuando se introduce bicarbonato de sodio en un entorno ácido similar al caldo de fermentación, se produce C02 como se muestra más adelante en la ecuación 2. Se cree que este método de adición de C02 al sistema es ventajoso con respecto a rociar C02 en el cultivo debido a que el bicarbonato de sodio no sólo agrega C02 sino que también aumenta el pH del cultivo a aproximadamente 5,1, ayudando a compensar la producción del sistema de ácido al equilibrar los niveles de ácido libre.

NaHC03 + H+ = Na+ + H2C03 o Na+ + H20 + C02(g) Ecuación (2) La conversión de etanol a ácido inicia' para llevarse a cabo casi inmediatamente, o en un término de segundos, después de la pérdida del gas de alimentación. Es posible evitar una acumulación rápida y grande de ácido al inicio de la pérdida de gas de alimentación al depurar el C02 disuelto presente en el cultivo utilizando un alto flujo de N2 de aproximadamente 400-450 mL/min. El nitrógeno se debe rociar a través del cultivo durante aproximadamente 0.-15 minutos tan pronto como sea posible después de que el flujo de gas de alimentación se perdió, entre más rápido se haga esto más ventajoso será para la presente invención. El flujo de nitrógeno dentro los primeros 5 minutos es una modalidad de la presente invención. Una vez que el inventario de C02 disuelto se haya eliminado, utilizando una velocidad de alimentación controlada se puede iniciar la adición de NaHC03. La utilización de la adición de NaHC03 para proporcionar C02 puede aumentar el pH del cultivo. Si las células permanecen activas utilizando la totalidad de bicarbonato de sodio disponible, el pH se debe de aumentar a a aproximadamente 5.1 luego permanecer asi. Este es un efecto secundario deseado y no se debe evitar. El aumento lento y constante en el pH ayudará a contrarrestar el aumento en la producción de ácido al mantener el nivel de ácido libre en control. Sin embargo, si se compromete la actividad celular, el pH aumentará más allá de aproximadamente 5.3 proporcionando una indicación de que el cultivo se pueda desnaturalizar o de otra manera disminuir funcionalmente . Cuando está disponible el gas de alimentación, se debe de tener la adición de bicarbonato de sodio y se debe aumentar la transferencia de masa del gas de alimentación tan rápido como sea posible, aunque teniendo cuidado de no inundar las células. Durante un periodo de tiempo de aproximadamente 10-15 minutos, se debe aumentar la agitación de regreso al mismo ajuste utilizado antes de la pérdida de gas de alimentación y se aumenta la magnitud de flujo del gas de alimentación de regreso a aproximadamente 50% la velocidad de alimentación original. Debido a la disponibilidad de sustrato y el alto nivel de acetilo total, el cultivo se convertirá constantemente al ácido de regreso en etanól. Esto se reflejará en un aumento en el pH y se espera. Los cambios a la magnitud de flujo del gas de alimentación del termentador durante este tiempo se deben realizar con base en las conversiones del gas al igual que en cualquiera operaciones normales del reactor. Una vez que se ha restablecido el flujo de gas de alimentación, si todo salió bien, para conservar la viabilidad de la célula, la magnitud de flujo del gas de alimentación debe ser capaz de alcanzar un ajuste de operación normal durante aproximadamente 20-26 horas. Las concentraciones de etanol y ácido deben ser mayores hasta alcanzar los niveles normales de operación, a aproximadamente 26-72 horas. Se requiere una agitación mínima para mantener la distribución de la temperatura a todo lo largó del biorreactor y mantener el pH del cultivo. La agitación mínima se debe definir como bastante mezclado para mantener el líquido distribuido. Esto puede ser a aproximadamente 50 rpm, o 40-60 rpm, en comparación con altas velocidades, tales como 400 rpm, utilizadas durante las operaciones normales.

Esta agitación en efecto también mantiene las células suspendidas. Se cree que las células se deben suspender para proporcionar un contacto constante con el CO2 y el etanol para realizar las reacciones necesarias. Los microorganismos acetogénicos requieren CO o H2 y CO2 para ganar los electrones necesarios y el carbono para el crecimiento de las células. Durante los periodos de tiempo sin el gas de alimentación ni CO ni H2 están disponibles para el proceso del crecimiento celular. Sé cree que el crecimiento celular se suspende durante aquellos tiempos de pérdida de gas de alimentación. Se puede razonar que a un menor suministro de gas de alimentación se podría utilizar para la supervivencia del cultivo durante los momentos en los cuales se puede limitar el suministro del gas de alimentación. La cantidad disminuida de gas de alimentación suministrada proporciona la reversión del cultivo a un modo para producción de ácido. Cuando se disminuye la velocidad de alimentación del sustrato, el cultivo automáticamente detendrá la conversión de ácido a etanol, provocando una caída aumentada en la proporción de etanol a ácido. Una vez que se entendió totalmente este proceso de pérdida de gas, se puede prever que el mejor curso de acción es detener el suministro de gas de alimentación completamente durante los tiempos de las dificultades para la producción de gas de alimentación en lugar de suministrar una menor velocidad de sustrato. Se determina que se prefiere disminuir la velocidad de alimentación del sustrato, se debe tomar la acción para hacer frente al aumento en el ácido.

Estas acciones podrían implicar aumentar el flujo del líquido a través del sistema para eliminar el ácido, aumentando el pH del cultivo para mantener un nivel tolerable de ácido libre, y/o eliminar una gran porción de células del sistema para mantener una proporción sana de absorción de gas a célula para una producción mínima de ácido.

Tabla 1. Componente del medio y sus concentraciones en el medio lx EtOH Componente/ión Agregado como lx EtOH Conc. en ed. ( pm) NH4+ NH4CI/ (NH4) 2HPO4 838 Fe FeCl2 · 4H20 16.8 Ni NiCl2 · 6H20 0.198 Co C0CI2 · 6H20 0.991 Se Na2Se03 0.0913 Zn ZnS04 · 7H20 0.455 Mo Na2Mo04 · 2H20 0.238 Mn MnCl2 · 4H20 0.167 B H3BO3 1.05 Cu CuCl2 · 2H20 0.149 W Na2W0 · 2H20 1.12 K KC1 78.6 Mg MgCl2 · 6H20 59.8 Na NaCl 78.7* Componente/ión Agregado como lx EtOH Conc. en Med. (ppm) Ca CaCl2 · 2H20 54.5 , HC1 cisteína HC1 cisteína 250 P04-2 H3PO4/ (NH4 ) 2HPO4 816 Ácido pantoténico Ácido pantoténico 0.025 Biotina Biotina 0.020 Tiamina Tiamina 0.050 : La concentración de Na es de NaCl únicamente. Esta no incluye Na+ proveniente de los otros componentes tales como Na2W04 · 2H20. ** La concentración de Ca+2 no incluye el calcio proveniente del ácido pantoténico, la sal de calcio.

La tabla 2 detalla los parámetros de cultivo ' antes y después del experimento tales como pH, redox, etanol y ácido acético. En general, cuando el cultivo utiliza etanol y C02 para la supervivencia, el nivel de etanol disminuye a medida que aumenta la concentración de ácido y el pH del cultivo . La tabla 2 también lista el alto nivel medido de ácido libre durante esos experimentos así como también el número de horas después del final del experimento para recuperar la velocidad de alimentación del gas original. Se debe recordar que un componente clave en la supervivencia del cultivo durante la pérdida de gas de alimentación es el mantenimiento de una concentración de ácido libre <5.0 g/L.

A medida que se produce el ácido, se requiere un mayor pH del cultivo y una eliminación de ácido más rápida para evitar la inhibición del ácido. A medida que se produce el ácido, se requiere un mayor pH del cultivo o una velocidad de eliminación del ácido más rápida para evitar la inhibición del ácido. La tabla 3 detalla la adición de C02 al cultivo en mmol/minuto por gramo de células en el cultivo. Los cálculos se basan en la velocidad de alimentación de bicarbonato de sodio y el número total de células en el biorreactor. A los 25°C, fue suficiente una velocidad de alimentación de C02 de 0.014 mmol/min-g para sostener el cultivo durante 12 horas sin el gas de alimentación. Cuando el periodo de tiempo experimental se aumentó a 24 horas, se requirió una velocidad de alimentación de C02 promedio de 0.034 mmol/min-g para una supervivencia sana de cultivo. De manera interesante, 'Cuando se aumentó la temperatura del cultivo a 38 °C, el cultivo requirió una velocidad de alimentación mínima de C02 de 0.114 mmol/min-g para mantener un cultivo sano. A los 38 °C el metabolismo de las células fue mayor lo que requirió más energía para la supervivencia, de esta forma más conversión de etanol a ácido.

Ejemplo 2 Supervivencia del cultivo durante 17 y 24 horas sin gas de alimentación Condiciones experimentales: 16.9 horas sin gas de alimentación; la temperatura disminuyó a 25 °C; la adición del medio estuvo sin cambio para el experimento; 0.030 mmol/min de velocidad de alimentación de C02 por gramo de células; se utilizó purga de permeado para mantenimiento en la purga; el C02 no se depuró del caldo de cultivo al inicio del experimento. Antes del inicio del experimento, la densidad de células en cultivo fue de 3.7 g/L; el pH fue 4.44; redox fue -440 mV; la absorción de CO y H2 fue 5.0 y 1.2 mmol/min respectivamente; las conversiones de CO y H2 fueron 86 y 40% respectivamente; el etanol fue 23.5 g/L; y el ácido fue 3.9 g/L. A t = 9511.6 horas, la magnitud de flujo del gaá de alimentación se disminuyó de 474 mL/min a 53 mL/min. La agitación se disminuyó de 400 hasta 50 rpm, y el punto de ajuste de temperatura en el reactor se disminuyó de 38 a 25°C dentro de aproximadamente 12 minutos. Una vez que se realizó el enfriamiento, 38.5 g/L de bicarbonato de sodio como inició a 0.57 mL/min proporcionando un 0.030 mmol/min por gramo de células, velocidad de alimentación de C02; el flujo de gas alimentado se detuvo; se inició una purga de permeado a 1.95 mL/min, y el flujo de medio se mantuvo a 1.37 mL/min. Se agregó lentamente nitrógeno al espacio del cabezal del reactor para evitar la formación de vacio en el reactor. El cultivo se dejó en esta condición durante 16.9 horas. Durante el experimento, se tomaron muestras de liquido aproximadamente cada 2 horas para supervisar el pH del cultivo, la densidad celular, los productos y la morfología celular. El pH del cultivo aumentó constantemente a todo lo largo del experimento hasta alcanzar 5.07 hacia el término del experimento. La concentración de etanol disminuyó constantemente de 23.5 hasta 7.0 g/L aproximadamente al término del experimento. La concentración total de acetilo aumentó constantemente de 3.9 hasta 8.2 g/L. Aproximadamente 12 horas en el experimento, la morfología del cultivo mostró que sólo el 5-10% de las células fueron cuerpos granulados o huecos. La longitud de la célula fue el promedio con leve a ninguna distorsión o doblado. A t 9528.5 horas, el punto de ajuste de temperatura en el reactor se aumentó de nuevo a aproximadamente 38 °C; se restableció el gas de alimentación a aproximadamente 53 mL/min; se detuvieron el medio B y la purga del permeado; y se detuvo el flujo de N2 en el espacio de cabezal del reactor. Cuando la temperatura alcanzó aproximadamente 28.0°C, se aumentó la magnitud de flujo del gas de alimentación a 143 mL/min. A aproximadamente 30.0°C se aumentó el flujo de gas de alimentación nuevamente a 236 mL/min, o al 50% o la magnitud de flujo del gas original. A aproximadamente 32.0°C, se aumentó la agitación a 200 rpm. A aproximadamente 34 °C se aumentó la agitación a aproximadamente 400 rpm. Las conversiones iniciales aproximadamente 40 minutos después del aumento en el gas, agitación y temperatura fueron buenas a 47% de H2 y 88% de CO. Aproximadamente 15 minutos más tarde las conversiones todavía fueron buenas a 47% de H2 y 87% de CO. Los aumentos en la magnitud de flujo de gas se iniciaron inmediatamente. Tomó aproximadamente 18.3 horas hasta alcanzar el flujo de gas máximo utilizado antes de iniciar el experimento. A medida que se aumentó la magnitud de flujo de gas, el pH seguía disminuyendo hasta alcanzar aproximadamente 4.60 dentro de aproximadamente 18.3 horas. El etanol aumentó de regreso a 20.0 g/L, 40.6 horas después de finalizar el experimento, y el ácido disminuyó nuevamente a 3.4 g/L después de 24.9 horas .

Ejemplo 3 Condiciones experimentales: aproximadamente 24 horas sin gas de alimentación; la temperatura disminuyó a aproximadamente 25 °C; durante el experimento no hubo cambio en la adición del medio; velocidad de alimentación de C02 0.035 mmol/min por gramo de células; se utilizó purga del permeado para mantenimiento en las células; el C02 NO se depuró del caldo de cultivo al inicio del experimento. Antes de iniciar el experimento, la densidad celular del cultivo fue de aproximadamente 3.2 g/L; el pH fue de aproximadamente 4.50; el redox fue de aproximadamente -425 mV; la absorción de CO y H2 fue 4.7 y 1.5 mmol/min respectivamente; el etanol fue aproximadamente 17.7 g/L; y el ácido fue aproximadamente 2.93 g/L. A t = 1888 horas, la magnitud de flujo del gas de alimentación se disminuyó de aproximadamente 474 mL/min a 53 mL/min. La agitación se disminuyó de aproximadamente 400 a aproximadamente 50 rpm, y el punto de ajuste de temperatura en el reactor se disminuyó de aproximadamente 38 hasta aproximadamente 25 °C en aproximadamente 14 minutos. Una vez que se llevó a cabo el enfriamiento, se inició la adición de bicarbonato de sodio utilizando un flujo de aproximadámefite 38.5 g/L de NaHC03 de 0.58 mL/min proporcionando una velocidad de alimentación de C02 de 0.035 mmol/min por gramo de células; se detuvo el flujo de gas de alimentación; se inició la purga del permeado a 1.81 mL/min, y el flujo de medio se mantuvo a 1.30 mL/min. Se agregó lentamente nitrógeno al espacio de cabezal del reactor para evitar la formación de vacio en el reactor. El cultivo se dejó én esa condición durante aproximadamente 24 horas. Aproximadamente 15.5 horas en el experimento, la condición de reacción proporcionó: densidad celular de aproximadamente 2.4 g/L; pH de aproximadamente 4.96; EtOH de aproximadamente 6.06 g/L; y el ácido fue aproximadamente 7.87 g/L. La morfología celular mostró que aproximadamente el 5-10% de las célula fueron granularas o casi granuladas. Debido a la baja concentración de etanol se quedó en el reactor, a t = 1904 horas, se agregaron 115 mL de alcohol granulado Gem Clear a 9 L del medio A para una concentración de etanol de aproximadamente 10 g/L. La velocidad de alimentación del medio permaneció igual proporcionando una velocidad de alimentación de etanol de 0.037 mmol/min por gramo de células. Al finalizar las 24 horas, la condición del cultivo proporcionó: densidad celular de aproximadamente 2.9 g/L; pH de aproximadamente 5.04; EtOH de aproximadamente 4.10 g/L; y el ácido fue de aproximadamente 8.68 g/L. La morfología celular mostró que aproximadamente el 10-15% de las células se habían tornado granuladas o casi granuladas. A t = 1912 horas, el punto de ajuste de temperatura en el reactor se aumentó de nuevo a aproximadamente 38 °C; se restableció el gas de alimentación a aproximadamente 53 ml/min; se detuvieron el medio B y la purga del permeado; y se detuvo el flujo de N2 en el espacio de cabezal del reactor. El medio se cambió a un medio lx EtOH normal sin etanol agregado. El gas de alimentación y la agitación se aumentaron a intervalos regulares a medida que la temperatura aumentó por pasos. Cuando la temperatura alcanzó aproximadamente 28.0°C, se aumentó la magnitud de flujo del gas de alimentación a aproximadamente 179 mL/min. Aproximadamente 30.0°C se aumentó el flujo de gas de alimentación nuevamente a aproximadamente 248 ml/min, o aproximadamente 50% o la magnitud de flujo de gas original. Aproximadamente 32.0°C, se aumentó la agitación a aproximadamente 200 rpm. Aproximadamente 34 °C la agitación se aumentó a aproximadamente 400 rpm.

Como una modalidad, las conversiones iniciales a aproximadamente 35 minutos después del aumento en el gas, agitación y temperatura fueron a 60% de H2 y 84% de CO. Como una modalidad, aproximadamente 15 minutos más tarde Xas conversiones proporcionadas: 62% de H2 y 91% de CO. Se introdujeron inmediatamente aumentos en la velocidad de flujo del gas. En este caso, llevó aproximadamente 19.5 horas hasta alcanzar el máximo flujo de gas utilizado antes de iniciar el experimento.

Ejemplo 4 Condiciones experimentales: 23.5 horas sin gas de alimentación; temperatura disminuida a 25°C; se redujo la adición del medio a la mitad del flujo normal; se duplicó en el medio la concentración de cisteina ; velocidad de alimentación de C02 0.039 mmol/min por gramo de células; se utilizó purga del permeado para mantenimiento en las células de C02 NO se depuró del caldo de cultivo al inicio del experimento. En una modalidad, el experimento de pérdida de gas a las 24 horas, mostró que el cultivo puede sobrevivir muy bien durante aproximadamente 24 horas sin gas de alimentación, mientras que se proporcione la adición de CO2 0.035 mmol/min por gramo de células. Los flujos de medió y bicarbonato de sodio en el reactor durante el experimento requirieron de aproximadamente 2.6 L del permeado que será retirado para evitar la pérdida de células debido al lavado. Esto es ligeramente mayor que el 2.4 L del volumen de cultivo. A escala de laboratorio, se tolera bien esa proporción de flujo de liquido requerido a volumen de cultivos. Sin embargo, a escala industrial, se debe supervisar la cantidad de agua residual y, si es necesario, se debe disminuir. En este experimento, todos los parámetros se . mantuvieron iguales como los experimentos anteriores excepto que se redujo la velocidad de flujo del medio a la mitad para reducir la cantidad de purga del permeado que se requiere. Ha habido algunas indicaciones en experimentos del pasado que sugieren que una reducción en la velocidad de alimentación de cisteina pueda interferir con el experimento, por lo tanto durante este experimento, la concentración de cisteina en el medio se duplicó para conservar la velocidad de alimentación de cisteina. Antes de iniciar el experimento, la densidad celular del cultivo fue de aproximadamente 2.5 g/L; el pH fue de aproximadamente 4.50; el redox fue de aproximadamente -440 mV; la absorción de CO y H2 fue de aproximadamente 4.8 y aproximadamente 1.2 mmol/min respectivamente; el etano'l fue de aproximadamente 21.3 g/L; y el ácido fue de aproximadamente 2.96 g/L. A t = 2008.5 horas, se disminuyó la magnitud de flujo del gas de alimentación de 474 mL/min a 53 mL/min. La agitación se disminuyó de aproximadamente 400 hasta aproximadamente 50 rpm, y el punto de ajuste de temperatura en el reactor se disminuyó de 38 a 25°C en un término de 13 minutos. Una vez que se realizó el enf iamiento, se inició la adición de bicarbonato de sodio utilizando una solución de 38.5g/L de NaHC03 a 0.57 ml/min; se detuvo el flujo de gas de alimentación; se inició la purga del permeado a 1.20 ml/min, y se redujo el flujo del medio a 0.68 ml/min. Se agregó lentamente el nitrógeno al espacio de cabezal del reactor para evitar la formación de un vacio en el reactor. La concentración de cisteína se aumentó a 5 g/L en el medio A. El C02 se proporcionó a 0.039 mmol/min por gramo de células. El cultivo se mantuvo en esa condición durante 24 horas. Durante el experimento, se tomaron muestras de liquido a aproximadamente cada 2 horas para supervisar el pH del cultivo, la densidad celular, los productos y la morfología celular. Como se esperaba, el pH aumentó constantemente a todo lo largo del experimento hasta alcanzar 5.14 al término del experimento. La concentración de étáhol disminuyó constantemente de 21.3 hasta 6.03 g/L al término del experimento. La concentración total de acetilo aumentó constantemente de 2.96 a 10.38 g/L. Después de aproximadamente 24 horas, la morfología del cultivo mostró gue aproximadamente el 10-20% de las células fueron granuladas o casi granuladas. ? t = 2032 horas, el punto de ajuste de temperatura en el reactor se aumentó nuevamente a aproximadamente 38 °C; se restableció el gas de alimentación a aproximadamente 53 ml/min; se detuvieron la adición de bicarbonato de sodio y la purga del permeado; y se detuvo el flujo de N2 en el espacio de cabezal del reactor. La magnitud de flujo del medio se aumentó de nuevo a 1.37 ml/min. A media gue el cultivo se calentó, el flujo de gas de alimentación se aumentó de nuevo a 248 ml/min y la agitación se aumentó a aproximadamente 400 rpm por pasos. Las conversiones iniciales a aproximadamente 30 minutos después del aumento en gas, agitación y temperatura fueron a 50% de H2 y 87% de CO. Se iniciaron inmediatamente los aumentos en la magnitud de flujo del gas. Llevó aproximadamente 24 horas para alcanzar el máximo flujo de gas utilizado antes de iniciar el experimento.

Ejemplo 5 Reducción al mínimo de la velocidad de alimentación de C02 mientras estuvo a 25°C, 12 horas de supervivencia del cultivo Condiciones experimentales: 12 horas sin gas de alimentación; temperatura disminuida a 25 °C; durante el experimento no hubo cambio en la adición del medio; velocidad de alimentación del C02 0.014 mmol/min por gramo de células; se utilizó purga del permeado para mantenimiento en las células; el CO2 NO se depuró del caldo de cultivo al inicio del experimento. Este experimento evalúa la velocidad de adición mínima de C02 necesaria para sostener el cultivo durante 12 horas a 25°. Como una modalidad, la solución de NaHC03 utilizada como medio B se aumentó en concentración mientras que se mantuvieron igual todos los otros parámetros experimentales. En este experimento, se disminuyó la concentración de NaHC03 a aproximadamente 19.3 g/L proporcionando una velocidad de alimentación de C02 de aproximadamente 0.014 mmol/min de C02 por gramo de células en el reactor. Esta es una baja velocidad de alimentación con la supervivencia del cultivo. Antes de iniciar el experimento, la densidad celular del cultivo fue de aproximadamente 4.0g/L; el pH fue de aproximadamente 4.43; el redox fue de aproximadamente -430 mV; la absorción de CO y H2 fue de aproximadamente 4.9 y aproximadamente 1.3 mmol/min respectivamente; las conversiones de CO y H2 fueron de aproximadamente 86 y aproximadamente 44% respectivamente; el etanol fue de aproximadamente 18.9g/L; y el ácido fue de aproximadamente 3.8 g/L. A 2015, t = 9580.7 horas, se disminuyó el flujo de gas de alimentación de aproximadamente 474 mL/min hasta aproximadamente 53 mL/min. La agitación se disminuyó de aproximadamente 400 a aproximadamente 50 rpm, y el punto de ajuste de temperatura en el reactor se disminuyó de aproximadamente 38 hasta aproximadamente 25 °C en un periodo de aproximadamente 12 minutos. Una vez que se llevó a cabo el enfriamiento, se inició el flujo de bicarbonato de sodio a 0.56 mL/min; se detuvo el flujo de gas de alimentación; se inició la purga del permeado a 1.96 mL/min, y se mantuvo el flujo del medio a 1.36 mL/min. Se agregó lentamente nitrógeno al espacio de cabezal del reactor para evitar la formación de vacio en el reactor. El cultivo se mantuvo en esa condición durante aproximadamente 12 horas. Durante el experimento, se tomaron muestras de liquido a aproximadamente cada 2 horas para supervisar el pH del cultivo, la densidad celular, los productos y la morfología celular. A todo lo largo del experimento, el pH aumentó constantemente a todo lo largo del experimento hasta alcanzar aproximadamente 4.72 al término del experimentó. La concentración de etanol disminuyó constantemente ente aproximadamente 18.9 a aproximadamente 10.7 g/L al término del experimento. La concentración total de acetilo aumentó constantemente entre aproximadamente 3.8 a aproximadamente 6.0 g/L. La densidad celular disminuyó entre aproximadamente 4.0 a aproximadamente 2.8 g/L. Después de aproximadamente 12 horas, la morfología del cultivo proporcionó aproximadamente el 95+% de células que fueron el promedio para alargar ligeramente con sólo distorsión o doblado mínimos y sólo una célula granulada o cuerpo hueco ocasional. A t 9592.7 horas, el punto de ajuste de temperatura en el reactor se aumentó de nuevo a aproximadamente 38 °C; se restauró el gas de alimentación a aproximadamente 53 mL/min; se detuvieron el medio B y purga del permeado; y se detuvo el flujo de N2 en el espacio de cabezal del reactor. Mientras que el cultivo estuvo tibio durante los siguientes 15 minutos, se aumentaron por pasos la magnitud de flujo del gas de alimentación y la agitación. Cuando la temperatura alcanzó aproximadamente 28 °C, se aumentó la magnitud de flujo del gas de alimentación a aproximadamente 178 mL/min. El pH del cultivo fue disminuyendo lentamente indicando la actividad del cultivo. Aproximadamente 30.0°C, se aumentó el flujo de gas de alimentación nuevamente a 236 mL/min, o al 50% o a la magnitud de flujo del gas original. Aproximadamente 32.0°C, la agitación se aumentó a aproximadamente 200 rpm. Aproximadamente 34 °C, la agitación se aumentó a aproximadamente 400 rpm. Las conversiones iniciales 50 minutos después del aumento en el gas, agitación y temperatura proporcionaron aproximadamente 53% de H2 y aproximadamente 89% de CO. Se iniciaron inmediatamente los aumentos en la magnitud de flujo del gas. Tomó 14.6 horas hasta alcanzar el máximo flujo de gas utilizado antes de iniciar el experimento. A medida que se aumentó la magnitud de flujo del gas, aumentó la concentración de etanol nuevamente a aproximadamente 23.7 g/L 49.4 horas, y disminuyó el ácido de regreso a aproximadamente 3.5 g/L 9.3 horas después del término del experimento.

Ejemplo 6 Reducción al mínimo de la velocidad de alimentación de CO2 mientras que estuvo a 38°C, 6 horas de supervivencia del cultivo Condiciones experimentales: 6 horas sin gas de alimentación; la temperatura permaneció a 38 "endurante el experimento no hubo cambio en la adición del medio; velocidad de alimentación de C02 0.114 mmol/min por gramo de células; se utilizó purga del permeado para mantenimientó en las células; se utilizó N2 para depurar el C02 del caldo de cultivo al inicio del experimento. Antes de iniciar el experimento, la densidad celular del cultivo fue de aproximadamente 2.76 g/L; el pH fue de aproximadamente 4.60; el redox fue de aproximadamente -440 mV; la absorción de CO y H2 fueron de aproximadamente 4.5 y aproximadamente 1.2 mmol/min respectivamente; el etanol fue aproximadamente 19.0 g/L; y el ácido fue de aproximadamente 2.43 g/L. A t = 3080.5 horas, se disminuyó la magnitud de flujo del gas de alimentación entre aproximadamente 475 mL/min a aproximadamente 53 mL/min luego se apagó. Se inició un alto flujo de N2 a través del rociador de gas de alimentación mientras gue la agitación todavía estuvo aproximadamente 400 rpm durante aproximadamente 3 minutos para depurar el C02 proveniente del cultivo. Mientras se estaba depurando el C02, se apagó el control de pH para evitar cualguier adición de bicarbonato de sodio. Después de aproximadamente 3 minutos, se detuvo el flujo de N2 y la entrada de N2 se cambió al espacio de cabezal en lugar del rociador. La agitación se disminuyó de entre aproximadamente 400 a aproximadamente 50 rpm. La adición de C02 se inició a aproximadamente 0.82 mL/min utilizando aproximadamente 77 g/L NaHC03 para proporcionar aproximadamente C02 0.114 m ol/tnin por gramo de células en el reactor. La magnitud de flujo del medio se dejó a aproximadamente 1.34 mL/min, y se inició un flujo de la purga del permeado de 2.25 mL/min. El experimento se detuvo después de 6 horas a t = 3086.5 horas debido a un alto contenido de ácido. Se detuvieron la adición de bicarbonato de sodio, la purga del permeado y la adición de N2 al espacio de cabezal. Se restableció el flujo de gas de alimentación a 53 mL/min. El gas de alimentación y la agitación se aumentaron a aproximadamente los mismos intervalos como se utilizaron para aumentar el gas de agitación cunado el cultivo se estuvo calentando a aproximadamente 38 °C en los experimentos anteriores. Dos minutos después, el experimento se detuvo, se aumentó el flujo de gas de alimentación a aproximadamente 170 mL/min. Aproximadamente cuatro minutos después de que se detuvo el experimento, se aumentó el flujo de gas de alimentación a aproximadamente 248 mL/min (50% de la magnitud de flujo del gas original) . Aproximadamente seis minutos después, el experimento se detuvo, se aumentó la agitación a 200 rpm. Aproximadamente ocho minutos después, el experimento se detuvo, la agitación se aumentó a aproximadamente 400 rpm» Después de aproximadamente 6 horas con la adición de C02 y la baja agitación, el pH fue de aproximadamente 5.08. Un análisis de liquido mostró que los productos fueron de aproximadamente 10.4 g/L de etanol y aproximadamente 8.21 g/L de ácido. La morfología del cultivo mostró aproximadamente el 3% de las células que fueron granuladas con un adicional de 22% que fueron casi granuladas. Las conversiones iniciales a aproximadamente 30 minutos después de que se detuvo el experimento fueron de aproximadamente 47% de H2 y aproximadamente 87% de CO; Los aumentos en la magnitud de flujo del gas se iniciaron inmediatamente. El magnitud de flujo del gas de alimentadión original se alcanzó a t = 3108 horas, o aproximadamente 21.5 horas después de que terminó el experimento.

Tabla 2. Parámetros del cultivo en experimentos para pérdida de gas a aproximadamente y aproximadamente 38°C donde se restauró el cultivo utilizando agitación y menos 50% del GFR original Tabla 3. Velocidad de alimentación calculada de C02 por gramo de células en el reactor (mmol/minuto g) para la adición de bicarbonato, los experimentos de pérdida de gas de alimentación c/velocidades conocidas de adición de C02 Tabla 4. Velocidad de alimentación de C02, velocidad de absorción de EtOH y velocidad de producción de ácido durante los experimentos para pérdida de gas de alimentación Ejemplo 7 Ejemplo comparativo: un método ilustrativo de la presente invención Un gas de síntesis o residual que contiene CO y/o dióxido de carbono/hidrógeno gaseoso se introduce continuamente en un biorreactor con depósito agitado que contiene una cepa de C. ljungdahlii, junto con un medio líquido convencional que contiene vitaminas, metales traza y sales .

Durante el inicio del método, utilizando un inoculo de cultivo del 10% o menos, el reactor se opera con una fase liquida por lotes, donde el medio liquido no se alimenta continuamente al reactor. La fase liquida en el reactor de esta forma consiste de un lote de medio de nutrientes con una concentración nominal de nutrientes limitantes, ya sea pantotenato de calcio o cobalto. Alternativamente, también se puede emplear un medio rico que contenga extracto de levadura, tripticasa o otros nutrientes complejos. Idealmente, la fase gaseosa al inicio es CO2 libre y contiene H.sub.2 en exceso. La velocidad del gas y la velocidad de agitación se mantienen a bajos niveles (menores que 500 rpm en un biorreactor para fermentación New Brunswick Scientific Bioflo.RTM.) para proporcionar CO y H.sub.2 en exceso ligero, aunque al mismo tiempo, evitando la inhibición del sustrato de CO. En un biorreactor para fermentación New Brunswick Scientific Bioflo.RTM. para laboratorio de un litro, como un ejemplo, donde la composición de gas de alimentación es del 63% de H.sub.2, 32% de CO y 5% de CH.sub.4, la velocidad de agitación para iniciar es 400 rpm y la velocidad del gas es 20 mL/min. La causa de la producción de etanol durante inicio es el H.sub.2 en exceso; la limitación en los nutrientes se presenta más tarde. De esta forma, los nutrientes liquido en exceso (pantotenato, cobalto) realmente están presentes durante el inicio para evitar una aclimatación no deseada del cultivo para disminuir nutrientes . A medida que procede la fermentación durante un periodo de varias horas después de la inoculación, se produce C02 proveniente de la conversión de CO, y se consume H.sub.2 junto con el CO.sub.2, lo cual es una señal para aumentar nominalmente la velocidad de agitación para evitar la limitación de transferencia de masa de gas. En el New Brunswick Scientific Bioflo.RTM. El CSTR, el gas de salida es del 25% de CO, 67% de H.sub.2, 2% de CO.sub.2, y 6% de CH.sub.4. Si se aumenta la velocidad de agitación demasiado rápido, se presenta la inhibición del sustrato de CO, como resulta evidente por una disminución en la concentración de metano después de un aumento en la agitación. De esta forma, la velocidad de agitación típicamente se podría aumentar con 200 rpm en 24 horas. Este procedimiento de supervisión de la producción de CO.sub.2 (o conversión de H.sub.2) mientras que se aumenta nominalmente la velocidad de agitación se presenta una velocidad relativamente rápida hasta que se alcanza una velocidad de agitación blanco. Una velocidad de agitación blanco típica en el biorreactor para fermentación New Brunswick Scientific Bioflo.RTM., es de 900 rpm. Durante este tiempo de aumento de la velocidad de agitación en el cultivo liquido por lotes, la producción celular en lugar de la formación del producto es de suma importancia. De esta forma, se alcanzó las concentraciones celulares de aproximadamente 1.5 g/L mientras que las concentraciones de producto típicas son 10 g/L de etanol y 2 g/L de acetato del cultivo por lote. Una vez que se alcanzó la velocidad de agitación blanco, el sistema se dejó crecer para una absorción máxima de H.sub.2. Es conveniente tener concentraciones de salida de H.sub.2 muy altas (típicamente >60%) para asegurar la producción de etanol mientras que se limite la producción de ácido acético. La alimentación del medio líquido luego se activa (para los sistemas que tengan inoculación por , lotes del cultivo madre) para iniciar la alimentación continua de líquidos y se aumenta la velocidad de alimentación del gas hacia la magnitud de flujo blanco. En el biorreactor para fermentación New Brunswick Scientific Bioflo.RTM de laboratorio, la velocidad de alimentación de líquidos es típicamente de 0.5 mL/min, mientras que la velocidad de flujo de gas se aumenta al 10 hasta 15% cada 24 horas hacia una velocidad blanco de 125 mL/min. Es importante proporcionar H.sub.2 en exceso en el gas de alimentación para evitar la producción en exceso de ácido acético. A medida que se aumenta la velocidad de flujo del gas, aumenta la producción de células hasta que el reactor con el tiempo se limita en los nutrientes en f&se liquida (pantotenato de calcio o cobalto) como resulta evidente por una pequeña caída en la conversión de H.sub,2, en la productividad blanco. En el CSTR New Brunswick Scientific Bioflo.RTM., esto se reconoce por una caída del 10% en la conversión de H.sub.2 a una productividad blanco de 20 g/L día. El método de producción y el sistema reactor luego se mantienen en un estado constante produciendo 15 a 35 Cj/L de etanol y 0 a 5 g/L de acetato como productos, cort sólo pequeños ajustes adicionales en los nutrientes limitantes, velocidades de líquido y velocidad de gas. Las condiciones en estado constante típicas en el biorreactor para fermentación New Brunswick Scientific Bioflo.RTM. sin reciclamiento de célula, son un tiempo de retención de gas (magnitud de flujo de gas/volumen líquido del reactor) ; de 20 minutos, un tiempo de retención de líquidos (magnitud, de flujo de líquido/volumen del líquido del reactor) de 30' horas y una velocidad de agitación de 900 rpm, proporcionando conversiones de CO del 92% y conversiones de H.sub.2 del: 60% con limitación de pantotenato. En una modalidad de este método en el cual se agrega reciclamiento de células al sistema reactor, se agrega en este momento junto con un ajuste en la velocidad del gas (aumento) y concentración de nutrientes (disminución) . Con el reciclamiento de célula en el CSTR New Brunswick Scientific Bioflo.RTM., el tiempo de retención de gas típicamente es de 8 minutos, el tiempo de retención de líquidos es de 12 horas, el tiempo de retención de células es 40 horas y la velocidad de agitación es 900 rpm. Estas condiciones típicamente proporcionaron una conversión de CO del 92% y una conversión de H.sub.2 del 50% con limitación de pantotenato .

Ejemplo 8 Ejemplo comparativo: Recuperación del desajuste del método severo Un CSTR con reciclamiento de células que contiene C. ljungdahlii, la cepa C-01 que será el gas alimentado continuamente y los nutrientes líquidos y la producción de 15-35 g/L de etanol y 0-5 g/L de acetato a un estado constante se desajustó debido a cambios imprevistos en las condiciones del método, por ejemplo, problemas mecánicos en el reactor. El desajuste al sistema reactor puede ser ya sea menor, tal como un breve aumento en la velocidad del gas que provoca una inhibición del sustrato a corto plazo, o mayor, tal como un aumento a largo plazo en la velocidad del gas, que con el tiempo conduce a una producción aumentada de ácido acético y una inhibición del producto de ácido acético molecular más severa. Los desajustes a corto plazo se corrigen fácilmente simplemente al volver a ajustar el parámetro de desajuste (por ejemplo, disminuir la velocidad del gas a su nivel original) y supervisar el progreso del reactor para asegurar que el desajuste no ha conducido a un problema a largo plazo. Sin embargo, la inhibición del producto de ácido acético es un problema más grave. Si se produce ácido acético molecular en exceso por el cultivo como resultado de la inhibición del sustrato a largo plazo, la adición de nutrientes en exceso, la acumulación de CO.sub.2 o problemas mecánicos de muchos tipos, primero se debe corregir el problema que conduce al ácido acético en exceso. El ácido acético en exceso, que conduce rápidamente a la inhibición del producto, luego se aclara del sistema al aumentar la velocidad del liquido para lavar el ácido acético (y desafortunadamente el etanol) del sistema. Una vez que el nivel de acetato es menor de 3-5 g/L, se restaura la velocidad de liquido y el reactor se coloca nuevamente bajo ya sea alimentación de H.sub.2 en exceso, o limitación de la vitaminas o cobalto (con o sin reciclamiento de células) . Poner el reactor de regreso implica reducir la velocidad del gas para evitar la inhibición del sustrato y/o velocidad de agitación antes del layado celular y se lleva a cabo la lisis. Luego se aumenta la velocidad de agitación; o la velocidad del gas. En un ejemplo especifico, un CSTR con reciclamiehto celular que contiene C. ljungdahlii, la cepa C-01 que estuvo produciendo etanol y ácido acético a partir del CO, CO.sub.2 y H.sub.2, comenzó a producir ácido acético en respuesta á un problema mecánico. El reactor de 2100 mi se alimentó con gas que contuvo 62% de H.sub.2, 31% de CO y 7% de C . sub .2?·. sub .6 a un tiempo de retención de gas de 15 minutos, y estuvo funcionando con una velocidad de agitación de 600 rpm y un pH de 4.86. El tiempo de retención de líquidos fue de 23 horas y el tiempo de retención de célula fue de 68 horas. La solución de vitamina B (una mezcla acuosa 50.5 mg/L de pantotenato de calcio, 20.6 m g/L de d-biotina y 50.6 m g/L de tiamina HC1) estuvo presente en el medio de nutrientes líquidos que contuvo sales y vitaminas en una concentración de 0.4 mi de solución de vitamina por litro de medio (véase la tabla 2) . La concentración de etanol cayó a 7 g/L, mientras que la concentración de acetato aumentó a 7 g/L, las condiciones que ni son estables para la operación del reactor económicas para la producción de etanol. La concentración celular fue 2.4 g/L, la conversión de CO fue del 85% y la conversión de H.sub.2 fue del 25%. La estrategia utilizada en la recuperación del reactor consistió en reducir primero dramáticamente la velocidad de alimentación del gas al reactor, seguida por la recuperación gradual del reactor en presencia de H.sub.2 en exceso. La velocidad del liquido al reactor no se redujo para aclarar la inhibición del producto en este ejemplo debido a que la concentración de acetato no fue excesivamente alta. En lugar de esto, se dejó que la concentración de acetato disminuyera más gradualmente a niveles sin inhibición con la reducción en la magnitud de flujo del gas . y la posterior operación en presencia de H.sub.2 en excesq. El procedimiento especifico para recuperar el reactor se analizará más adelante. El reciclamiento celular se detuvo y la velocidad del gas se redujo dramáticamente al 70% a un tiempo de retención de gas de 62 minutos, mientras que se ajustó sólo ligeramente el tiempo de retención del liquido de 23 a 30 horas (t=0) . La concentración de vitaminas en el medio no cambió. Con este cambio en la velocidad de ga's, la conversión de CO aumentó al 98% y la conversión de H.sub.2 aumentó al 80%. De manera más importante, el sistema tuvo H.sub.2 en exceso presente, como resulta evidente por la disminución en CO.sub.2 en el gas de salida de 19 hasta 5%.

Con la aparición de H.sub.2 en exceso, la concentración de acetato cayó mientras que aumentó la concentración de etanol. A t=66 horas (66 horas, después de desactivar el reciclamiento celular), por ejemplo, la concentración de acetato había caído a 4 g/L y la concentración de etanol había aumentado ligeramente a 7.5 g/L. La presencia de H.sub.2 en exceso (y la concentración disminuida de acetato) permitió aumentos posteriores en la velocidad, primero lentamente y luego: a Una velocidad más rápida. Por t = 215 hora, la retención de gas fue de 29 minutos, la concentración de etanol fue 12 g/L y la concentración de acetato fue 3 g/L. La productividad ; de etanol fue de 8 g/L día. CO.sub.2 estuvo presente en el gas de salida al 6%, la conversión de CO fue del 98% y la conversión de H.sub.2 fue del 80%. Por t=315 hora, la concentración de etanol fue 16 g/L y la concentración de acetato fue 4 g/L, nuevamente con buenas conversiones dé gas, y un tiempo de retención de gas de 20 minutos. < La productividad de etanol fue de 11 g/L día. Por t = 465 hora, la concentración de etanol había alcanzado 20 g/L, con 3.5-4 g/L de acetato también presente. La productividad de etanol fue 16 g/L día. El tiempo de retención de gas había i disminuido a 16 minutos, con conversiones de CO y H.sub.2 de 95 y 73%, respectivamente. Estas condiciones se mantuvieron por casi 200 horas de operación continua, demostrando que el sistema reactor había recuperado su capacidad para producir etanol y había retenido esencialmente las condicionas de operación anteriores. Todos los documentos publicados se incorporan como referencia en la presente. Se incluyen muchas modificacióries y variaciones de la presente invención en la especificación identificada anteriormente y se espera que sean evidentes para alguien con experiencia en la técnica. Estas modificaciones y alteraciones a las composiciones y métodos de la presente invención se cree que estarán abarcadas. e el alcance de las reivindicaciones anexas .

Claims (19)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un método para sostener un cultivo de microorganismos en un reactor para fermentación con gas sintético en concentración disminuida o ausencia de diyersos sustratos caracterizado porque comprende: agregar dióxido de carbono y opcionalmente alcohol; mantener la concentración de ácido acético libre a menos de 5 g/L de ácido acético libre; y realizar las pasos mencionados anteriormente ' en un término de 0-30 minutos.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el procedimiento del cultivo de microorganismos comprende una duración de aproximadamente 0-30 horas. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el pH se mantiene en la variación de aproximadamente
3. 3.5-5.6.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se agrega una solución de bicarbonato para controlar el pH.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por eliminar opcionalmente el dióxido de carbono en el reactor.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por agregar opcionalmente nutrientes al reactor.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el alcohol comprende etanol, butanol, o etanol y butanol.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por disminuir opcionalmente la temperatura de la temperatura de operación a entre 0-25°C mientas qué se mantenga la temperatura entre 0-25°C.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque por agregar opcionalmente agua al reactor .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por agregar opcionalmente agua al reactor que comprende: agua dulce, agua preparada, agua para reciclado, agua destilada, agua desionizada o sus combinaciones .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cultivo de microorganismos contiene al menos una de las bacterias acetogénicas .
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los cultivos de microorganismos comprenden una o más cepas seleccionadas de Clostridium, Moorella, y Carboxydothermus o sus modificaciones genéticas.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Clostridium ljungdahlii se selecciona de las cepas que consisten de PETC, ERI-2, 0-52 y C-01 o sus combinaciones.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cultivo de microorganismos 1 se regresa a condiciones de pre-suspensión que comprenden la adición de gas sintético.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por eliminar opcionalmente el permeado .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por purgar opcionalmente el reactor con gas inerte. ;
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1. caracterizado por mantener opcionalmente baja agitación para mantener los sólidos en suspensión.
18. 18. Un método para evitar la pérdida rápida del cultivo de microorganismos en un reactor para fermentación con gas sintético en una concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos caracterizado porque comprende: disminuir la temperatura de la temperatura de operación a entre 0-25 °C mientras que mantenga la temperatura entre 0-25°C; mantener la concentración de ácido acético libre a menos de 5 g/L de ácido acético libre; y realizar los pasos mencionados anteriormente en un término de 0-30 minutos.
19. 19. Un método para sostener un cultivo de microorganismos en un reactor para fermentación con gas sintético debido a una concentración disminuida o ausencia de diversos sustratos en el suministro de gas de alimentación caracterizado porque: disminuir la temperatura de la temperatura de operación a entre 0-25°C mientras que se mantenga la temperatura entre 0-25°C; mantener la concentración de ácido acético libre a menos de 5 g/L de ácido acético libre; y realizar los pasos mencionados anteriormente en un término de 0-30 minutos.