CN104736715B - 一种发酵方法 - Google Patents

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Abstract

一般地，本发明涉及通过微生物发酵含一氧化碳的底物，而提高微生物生长和产品(例如醇和酸)生产的效率的方法。更具体地，本发明涉及向液体营养培养基提供替代硫源，使得硫可被一种或多发酵微生物利用。

Description

一种发酵方法
技术领域
本发明总体涉及通过微生物发酵提高微生物生长效率和产物例如醇类和酸类生产效率的方法。更具体地，本发明涉及通过对含有一氧化碳的底物进行微生物发酵产生醇，尤其是乙醇的方法。
背景技术
乙醇正迅速地成为全世界的主要富含氢的液体运输燃料。2002年全球范围内的乙醇消耗量估计为108亿加仑。由于欧洲、日本、美国和几个发展中国家对乙醇兴趣增加，燃料乙醇工业的全球市场也被预测会在未来急剧增长。
例如，在美国，乙醇用于生产E 10，一种乙醇在汽油中的10％的混合物。在E 10掺合物中，乙醇组分作为氧合剂起作用，提高燃烧效率并且降低空气污染物的产生。在巴西，乙醇作为混合在汽油中的氧合剂或其自身作为纯燃料，满足了约30％的运输燃料需求。同样，在欧洲，围绕温室气体(GHG)排放后果的环境问题已经成为欧盟(EU)为成员国设置消费可持续运输燃料(例如生物质衍生的乙醇)的强制目标的动力。
绝大部分燃料乙醇通过传统的基于酵母发酵的方法生产，所述方法使用源自作物的碳水化合物(例如从甘蔗提取的蔗糖或从谷类作物提取的淀粉)作为主要的碳源。然而，这些碳水化合物原料的成本受到它们作为人类食物或动物饲料的价值的影响，而栽培用于乙醇生产的产淀粉或产蔗糖作物并不是在所有的地理区域中都是经济上可持续的。因此，需要开发将更低成本的和/或更充足的碳源转化为燃料乙醇的技术。
CO是有机材料(例如煤或油和油衍生产品)不完全燃烧的主要免费的、富含能量的副产物。例如，有报道称澳大利亚的钢铁工业每年产生并向大气中排放超过500,000吨的CO。
长期以来，人们认为催化方法可用于将主要由CO和/或CO和氢(H2)构成的气体转化成多种燃料和化学制品。然而，微生物可也用于将这些气体转化为燃料和化学制品。这些生物学方法，尽管通常比化学反应慢，但与催化方法相比具有多个优势，包括更高特异性、更高产率、更低能量消耗和对中毒的更强抗性。
微生物将CO作为其唯一碳源生长的能力于1903年被首次发现。后来确定这是使用自养生长的乙酰辅酶A(乙酰CoA)生物化学途径(也被称作Woods-Ljungdahl途径和一氧化碳脱氢酶/乙酰CoA合酶(CODH/ACS)途径)的生物的特性。已表明包括一氧化碳营养生物、光合生物、产甲烷生物和产乙酸生物在内的大量厌氧生物可将CO代谢为多种终产物，即CO2、H2、甲烷、正丁醇、乙酸盐和乙醇。当使用CO作为唯一碳源时，所有这类生物都产生至少两种这些终产物。
已证明厌氧细菌(例如来自梭菌属(Clostridium)的那些)可通过乙酰CoA生物化学途径从CO、CO2和H2产生乙醇。例如，WO 00/68407、EP 117309、美国专利号5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO 98/00558和WO 02/08438中记载了从气体产生乙醇的多个扬氏梭菌(Clostridium ljunedahlii)菌株。还已知细菌自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum sp)可从气体生产乙醇(Aribini et al.,Archives of Microbiology161,pp 345-351(1994))。
然而，由微生物通过发酵气体生产乙醇通常伴随着同时产生乙酸盐和/或乙酸。由于一些可用的碳被转化为乙酸盐/乙酸而不是乙醇，使用这样的发酵方法产生乙醇的效率可能低于所期望的。并且，除非所述乙酸盐/乙酸副产物可被用于一些其他目的，否则还将引起废物处理的问题。乙酸盐/乙酸可被微生物转化为甲烷，因此可能会增加温室气体的排放。
本领域已经认识到控制用于发酵的生物反应器中用于培养细菌或微生物的液体营养培养基的参数的重要性。具体地，2007年7月18日提交的并以引用的方式纳入本文的NZ556615，描述了对所述液体营养培养基的pH和氧化还原电位的控制。例如，在厌氧产乙酸细菌的培养物中，通过将所述培养物的pH提高至高于约5.7，同时将培养物的氧化还原电位保持在低水平(-400mV或更低)，与在更低pH的条件下相比，细菌以高得多的速度将作为发酵副产物产生的乙酸盐转化为乙醇。NZ 556615还认为，不同的pH水平和氧化还原电位可用于优化条件，该条件取决于所述细菌正在进行的主要功能(即，生长、从乙酸盐和含有CO的气态底物产生乙醇、或从含有气体的底物产生乙醇)。
US 7078201和WO 02/08438也描述了通过改变其中进行发酵的液体营养培养基的条件(例如，pH和氧化还原电位)改进产乙醇的发酵方法。
液体营养培养基的pH可以通过向培养基中加入一种或多种pH调节剂或缓冲液调节。例如，碱如NaOH和酸如硫酸可被用于根据需要提高或降低pH。氧化还原电位可以通过加入一种或多种还原剂(例如，甲基紫精(methyl viologen))或氧化剂调节。
对于本领域技术人员显而易见的是，类似的方法可被用于生产其他醇如丁醇。
不考虑用于为所述发酵反应进料的来源，当供给中断时会出现问题。更具体地，所述中断可对用于反应的微生物的效率不利，并且在一些情况下，可对其有害。例如，当工业废气流中的CO气体被用于发酵反应以生产酸/醇时，可能存在不产生所述流的时候。此时，用于该反应的微生物可能进入休眠(hibernation)。当所述流再次可用时，可能在该微生物达到进行所需反应的最大生产活力前存在滞后。
硫源例如半胱氨酸和/或硫化物也可被用于在接种前获得所需的所述厌氧培养基的ORP。然而，这类还原剂较慢并具有有限的还原能力。另外，当这些含硫化合物被用于降低发酵培养基的ORP时，其自身被氧化。例如，半胱氨酸被氧化成二聚胱氨酸。考虑到这些化合物的还原形式比其氧化形式具有实质上更高的作为硫源被微生物培养物消耗的生物可用性。因此，当硫源被用于降低发酵反应的ORP时，可被微生物培养物利用的硫的实际浓度会降低。因此，鉴定一种改进的或者替代性的与使用含有一氧化碳气体作为原料的厌氧发酵系统一同使用的还原剂，是保证高醇产率和低过程操作成本的关键内容。
与主要营养素例如氮和磷一起，硫在厌氧微生物自产乙醇梭菌的发酵中具有重要作用。硫对微生物来说至关重要并且是一系列化合物和酶所必需的，所述化合物和酶使得自产乙醇梭菌能够将CO发酵成乙酸、乙醇和丁二醇并产生ATP用于生物质增长。硫是一类被称为铁氧化还原蛋白(ferredoxin)的生物化合物的一部分，并且是多种可将气态CO固定至乙酰-CoA的Wood-Ljundgahl酶的组成部分。通常，完全还原形式的硫被同化到功能性蛋白中。所述微生物可以直接摄取H2S或其硫氢根离子形式并将其同化至所需要的蛋白质中。许多所述微生物的含硫的酶也含有过渡金属离子如Fe2+、Zn2+、Co2+和Mn2+。由于这些金属的硫化物在中性pH值附近具有溶解度非常低的产物，因此游离H2S和/或游离过渡金属通常在这样的环境中非常少见，因为大部分所述金属离子被固定在不溶的金属硫化物中并因此不能被所述微生物获得。
本发明的目的是提供一种系统和/或方法，所述系统和/或方法至少在一定程度克服上述缺陷，或至少为公众提供可用的选择。
发明内容
在一大方面，本发明提供了一种提高细菌培养物生长效率的方法，所述方法包括向所述培养物提供替代性硫源的步骤。
在第二大方面，本发明提供了一种保持或提高由微生物培养物产生的一种或多种产物的生产速度的方法，所述方法包括向所述培养物提供替代性硫源的步骤。
在第三大方面，本发明提供了一种提高细菌培养物发酵效率的方法，所述方法包括向培养物提供替代性硫源的步骤。
第四方面，本发明提供了一种通过微生物发酵生产一种或多种产物的方法，所述方法包括：
i.向生物反应器提供含CO的气态底物，该生物反应器包含在液体营养培养基中的一种或多种一氧化碳营养微生物的培养物；
ii.厌氧发酵所述底物，以产生一种或多种选自醇、酸及其混合物的产物；和
iii.回收一种或多种产物。
在一个实施方案中，所述液体营养培养基包含至少一种选自SO2、H2SO3、Na2S2O4、S8、Na2S、NaHS、半胱氨酸、NH4HSO3或(NH4)2SO3的硫源。
依据本发明的一个实施方案，本发明提供了提高微生物发酵包含CO的底物的效率的方法，所述方法包括向营养培养基提供替代性硫源，使得硫可被一种或多种微生物利用。
在以上方面的具体实施方案中，所述替代性硫源选自亚硫酸(H2SO3)、Na2S2O4、S8、Na2S、NaHS、SO2、半胱氨酸、NH4HSO3或(NH4)2SO3。在具体的实施方案中，所述替代性硫源是亚硫酸。
在上述方面的具体实施方案中，所述硫源是工业过程的废弃产物。所述工业过程包括但不限于发电厂的煤炭燃烧或油燃烧。
在具体的实施方案中，所述一种或多种含硫物质可被微生物培养物利用。
在另一个大方面，本发明提供了一种通过微生物发酵生产一种或多种酸和/或醇的方法，所述方法包括以下步骤：
i.提供包含一氧化碳和任选的二氧化碳和/或氢气的底物；
ii.在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中厌氧发酵所述底物，以产生由酸和/或醇组成的一种或多种产物；和
iii.捕获并回收所产生的所述一种或多种产物；
其中，向所述培养物提供亚硫酸作为硫源。
在所述多个方面的具体实施方案中，所述包含CO的底物是气态的。在具体的实施方案中，所述气态底物包括作为工业过程副产物获得的气体。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造、非铁产品制造、石油精炼过程、生物质的气化、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在具体的实施方案中，所述气态底物包括从钢铁厂获得的气体。
在某些实施方案中，所述包含CO的底物通常含有较高比例的CO，如，以体积计至少约20％至约100％CO，以体积计40％至95％CO，以体积计40％至60％CO，以体积计45％至55％CO。在具体的实施方案中，以体积计，所述底物包含约25％，或约30％，或约35％，或约40％，或约45％，或约50％CO，或约55％CO，或约60％CO。具有更低CO浓度例如6％的底物也是合适的，特别是在还存在H2和CO2的情况下。
在具体的实施方案中，由所述发酵方法产生的醇是乙醇。所述发酵反应也可产生乙酸盐。
在所述多个方面的某些实施方案中，所述硫源选自SO2、H2SO3、Na2S2O4、S8、Na2S、NaHS、半胱氨酸、NH4HSO3或(NH4)2SO3。在某些实施方案中，所述硫源是亚硫酸。在某些实施方案中，所述硫源是(NH4)2SO3。在某些实施方案中，(NH4)2SO3的浓度保持在1mmol至2.5mmol。
在某些实施方案中，向培养物提供的硫源的量与发酵容器/生物反应器的顶空(headspace)中存在的H2S的量之间具有相关性。在某些实施方案中，H2S作为发酵过程中硫浓度的指示物被监测。
在某些实施方案中，顶空中H2S的浓度被保持在1ppm-100ppm。在某些实施方案中，提高向培养物提供的硫源的量会提高顶空中的H2S浓度，并且反过来，降低向培养物提供的硫源的量会降低顶空中的H2S浓度。
在一个实施方案中，所述微生物选自以下产乙酸一氧化碳营养生物，包括：菌种自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、甲酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovate)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、Blautia producta、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
在具体的实施方案中，所述微生物选自以下产乙酸一氧化碳自养微生物，包括：菌种自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、Clostridium coskatii和食一氧化碳梭菌。在一个实施方案中，所述产乙酸细菌是自产乙醇梭菌。
在一个实施方案中，所述发酵反应是由保藏于德国生物材料资源中心(DSMZ)鉴定保藏号为19630的自产乙醇梭菌菌株进行。
在一个实施方案中，所述发酵反应是由保藏于德国生物材料资源中心(DSMZ)的鉴定保藏号为23693的自产乙醇梭菌菌株进行。
在具体实施方案中，所述硫源是工业过程的废弃产物。在某些实施方案中，所述硫源是煤炭生产过程的废弃产物。
虽然以上广义地限定了本发明，但本发明不限于以上定义，并且包括以下描述提供了其实例的实施方案。
附图说明
现将更详细地并参考附图对本发明进行描述，其中：
图1示出了在利用H2SO3作为硫源的自产乙醇梭菌发酵过程中的H2摄取和H2S生产。
图2示出了利用(NH4)HSO3作为硫源的自产乙醇梭菌发酵过程中的H2摄取和H2S生产。
图3示出了双反应器系统中第一反应器中气体摄取和H2S浓度。
图4示出了双反应器系统中第二反应器中气体摄取和H2S浓度。
图5示出了多种替代性硫源的氧化数。
图6示出了第一反应器中(NH4)2SO3的添加量，及其他过程参数。
图7示出了第二反应器中(NH4)2SO3的添加量，及其他过程参数。
具体实施方式
硫源
自产乙醇梭菌发酵的最佳pH是pH 5左右。在pH 5下，S2-被大量地质子化并主要作为H2S(一种可溶性气体)和少量HS-输出。通过将进料气鼓泡通过系统，导致H2S从生物反应器中被去除。因此，有必要将含H2S的水溶液保存在高pH值下以捕获硫离子形式的硫，并仅向发酵容器中滴入小体积该溶液，以避免所述硫在能够被微生物利用之前就从系统中流失。这样的高pH的溶液非常具有腐蚀性并倾向于与大部分元素通过形成不可溶的硫化物或者通过沉淀不可溶的氢氧化物而形成沉淀。该溶液的腐蚀和沉淀的性质需要将该溶液和其他培养基成分严格分离。
为了解决这些问题，已经鉴定并测试了多种替代硫源，以确定自产乙醇梭菌利用这些硫源的能力。图5示出了多种硫化合物、其氧化数和自产乙醇梭菌利用它们的能力。
亚硫酸(H2SO3)被认为是一种替代硫源。亚硫酸是比H2S更强的酸，并且在pH 5被大量去质子化并作为亚硫酸氢离子保留在溶液中。因此，水性溶液可被保存在该pH范围内，而不引起氢氧化物沉淀或强烈腐蚀的额外问题。并且向生物反应器中添加硫也更容易，这是由于微生物在细胞内将SO2转化成用于合成代谢(anabolism)所需的H2S。利用这种方法，在鼓泡其他进料气过程中的H2S损失可被降到最低。以亚硫酸H2SO3或NH4HSO3或(NH4)2SO3形式的硫可在向生物反应器提供营养培养基之前被混入培养基中。这通过消除对以前系统中持续添加H2S所需的泵系统和控制环路的需求来提高发酵的效率。
另外，现已确定，使用亚硫酸H2SO3或NH4HSO3或(NH4)2SO3作为硫源消除了将该溶液与其他培养基成分分开的需求。在pH 6下，该溶液接近中性，且该溶液是无色澄清且不释放气体，这使得储存该溶液非常容易。另一个优势在于，NH4 +和Na+的亚硫酸氢盐(含有氢的亚硫酸盐)能够非常容易地溶解于溶液中。
现已发现，亚硫酸对大多数微生物具有毒性。本发明人意外发现，通过控制向发酵液中加入亚硫酸的速率，微生物培养物可以利用亚硫酸作为硫源，而不会损害培养物的生长和生产。
本发明人已经确定，向培养物加入过多的亚硫酸是有害的并可引起培养物的死亡。为解决这一问题，应逐渐地向发酵中加入亚硫酸。在某些实施方案中，所述亚硫酸以液滴样连续方式加至发酵中。由于亚硫酸在高浓度下具有毒性，有必要监测向培养物提供的亚硫酸的量，并且如果该培养物可用的亚硫酸的量高于或低于预定范围时，就调节该酸到生物反应器的流。
亚硫酸形式的硫源被微生物培养物快速地摄取。由微生物培养物进行的亚硫酸的转化导致H2S的产生，H2S被释放至该生物反应器的顶空。向所述生物反应器提供亚硫酸的流速可通过监测生物反应器顶空中的H2S来控制。顶空中高水平的H2S指示了液体营养培养基中的高浓度的亚硫酸。考虑到高浓度亚硫酸的毒性，需要控制液体营养培养基中的亚硫酸浓度。在本发明某些实施方案中，已经发现需要将顶空中H2S的浓度保持在低于500ppm，或低于300ppm，或低于200ppm，或低于150ppm，或低于100ppm，或低于80ppm，或低于50ppm。在某些实施方案中，顶空中H2S的浓度保持在100ppm左右。在某些实施方案中，顶空中H2S的浓度保持在约10ppm至约100ppm的范围内。在某些实施方案中，顶空中H2S的浓度保持在60ppm至100ppm的范围内。在某些实施方案中，顶空中H2S的浓度保持在约70ppm至约90ppm的范围内。
SO2气体是煤电厂的废弃产物并且其是酸雨的形式的环境问题的成因。现在，煤电厂必须过滤其硫排放物，并且已经签订了降低所述污染的协议。自产乙醇梭菌利用SO2的能力使得能够捕获并利用废弃产物。
生物反应器
发酵可在任何适当的生物反应器中进行，例如连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定化细胞反应器、气提式反应器、鼓泡塔反应器(BCR)、膜反应器例如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)或滴流床反应器(TBR)。并且，在本发明的一些实施方案中，所述生物反应器可包括第一生长反应器(在其中培养微生物)和第二发酵反应器(将来自所述生长反应器的发酵液加入其中，并且在其中产生大部分发酵产物(例如乙醇和乙酸盐))。本发明的生物反应器被改造为适于接收含有CO和/或H2的底物。
含有CO和/或H2的底物
利用任何便捷方法从所述过程中捕获或提取所述含有CO和/或H2的底物。根据所述含有CO和/或H2的底物的组成，还可能需要在将所述底物引入至发酵之前对所述底物进行处理，以除去任何不需要的杂质例如尘粒。例如，可利用已知方法对所述底物进行过滤或洗涤。
所述包括CO的底物，优选气态底物，可作为蒸汽重整过程(stream reformingprocess)的任意步骤的副产物获得。这类步骤包括本文描述的蒸汽重整步骤、WGS步骤和PSA步骤。
通常，CO以气体状态被加入至发酵反应中。然而，本发明的方法并不局限于以此状态添加底物。例如，可以在液体中提供一氧化碳。例如，可用含有一氧化碳的气体将液体饱和，并将该液体加入至所述生物反应器。这可通过常规方法达到。举例来说，可将微气泡分散发生器(microbubble dispersion generator)(Hensirisak et al.Scale-up ofmicrobubble dispersion generator for aerobic fermantaion；Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101,Number 3/October,2002)用于此目的。当本文提到“气流”时，该术语也包括运输该流的气态组分的其他运输形式，例如上述的饱和液体方法。
气体组成
所述含有CO的底物可含有任意比例的CO，例如至少约20体积％-约100体积％CO、40体积％-95体积％CO、40体积％-60体积％CO及45体积％-55体积％CO。在具体的实施方案中，所述底物包含约25体积％，或约30体积％，或约35体积％，或约40体积％，或约45体积％，或约50体积％CO，或约55体积％CO，或约60体积％CO。具有较低CO浓度例如2％的底物也是适当的，尤其当H2和CO2也存在时。
H2的存在不会对发酵产生的碳氢化合物产物的形成有害。在具体实施方案中，氢气的存在导致醇生产的总体效率的提高。例如，在具体实施方案中，所述底物可包含约2:1、或1:1、或1:2比率的H2:CO。在其他实施方案中，所述含有CO的底物包含低于约30％的H2，或低于27％的H2，或低于20％的H2，或低于10％的H2，或更低浓度的H2，例如低于5％，或低于4％，或低于3％，或低于2％，或低于1％，或基本不含氢气。在其他实施方案中，所述含有CO的底物包含多于50％的H2，或多于60％的H2，或多于70％的H2，或多于80％的H2，或多于90％的H2。
所述底物也可含有一些CO2，例如，约1体积％至约80体积％CO2，或1体积％至约30体积％CO2。
流的混合
需要将包括CO和H2的重整底物流与一种或多种其他流混合以提高发酵反应的效率、醇生产和/或总碳捕获。不希望囿于理论，在本发明的一些实施方案中，一氧化碳营养细菌依据下式将CO转化为乙醇：
6CO+3H2O→C2H5OH+4CO2
然而，在H2存在时，总转化可为下式：
6CO+12H2→3C2H5OH+3H2O
因此，可将具有高CO含量的流与包含CO和H2的重整底物流混合，以提高CO:H2之比以优化发酵效率。例如，工业废物流如来自钢铁厂的尾气(off-gas)具有高CO含量，但包括少量H2或不含H2。这样，就需要将一种或多种包含CO和H2的流与包含CO的废物流混合，然后将所述混合底物流提供至发酵罐。发酵的总体效率、醇产率和/或总碳捕获取决于混合流中CO和H2的化学计量(stoichiometry)。然而，在具体实施方案中，所述混合流可大体上包含以下摩尔比的CO和H2：20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1或1:2。
另外，需要在发酵的不同阶段提供特定比例的CO和H2。例如，可在起始和/或微生物快速生长阶段提供具有相对高H2含量(例如1:2CO:H2)的底物流。然而，当生长阶段减慢，以至于培养物保持在大体上稳定的微生物密度时，可以提高CO的含量(如至少1:1或2:1或更高，其中H2浓度可以大于或等于0)。
流的混合还可具有其他优势，尤其是例如当包含CO的废物流天然不连续时。例如，可将包含CO的不连续废物流与包含CO和H2的基本连续的重整底物流混合并将其提供至所述发酵罐。在本发明的具体实施方案中，所述基本连续的混合流的组成和流速可根据所述不连续流进行变化，以保持向发酵罐提供具有基本连续的组成和流速的底物流。
发酵
由气态底物生产乙醇和其他醇的方法是已知的。示例性方法包括如在WO 2007/117157、WO 2008/115080、WO 2009/022925、WO 2009/064200、US 6340581、US 6136577、US5593886、US 5807722和US 5821111中记载的那些方法，这些申请中每一个都以引用的方式纳入本文。
微生物
在多个实施方案中，使用一种或多种一氧化碳营养细菌的培养物进行发酵。在多个实施方案中，所述一氧化碳营养细菌选自穆尔氏菌属(Moorella)、梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、真细菌属(Eubacterium)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、产醋杆菌属(Oxobacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)和脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)。已知多种厌氧细菌具有将CO发酵成醇(包括正丁醇和乙醇)和乙酸的能力，并适用于本发明的方法。适用于本发明的这类细菌的实例包括梭菌属的细菌，例如杨氏梭菌(包括WO 00/68407、EP 117309、美国专利号5173429、5593886和6368819、WO 98/00558和WO 02/08438所描述的那些)，食一氧化碳梭菌(Liou et al.,International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology 33:pp 2085-2091)；拉氏梭菌(WO/2008/028055)和自产乙醇梭菌(Abriniet al,Archives of Microbiology 161:pp 345-351)。其他适当的细菌包括穆尔氏菌属的细菌，包括穆尔氏菌属种HUC22-1(Moorella sp HUC22-1)(Sakai et al,BiotechnologyLetters 29:pp 1607-1612)，及一氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)的细菌(Svetlichny,V.A.,Sokolova,T.G.et al(1991),Systematic and Applied Microbiology14:254-260)。其他实例包括热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、普氏产醋酸杆菌(Oxobacter pfennigii)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)和库氏脱硫杆菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)(Simpa et.al.CriticalReviews in Biotechnology,2006 Vol.26.Pp41-65)。另外，如本领域技术人员会理解的那样，应理解其他产乙酸厌氧细菌可用于本发明。也应理解的是，本发明可用于两种或多种细菌的混合培养物。
在一个实施方案中，所述微生物是选自产乙酸一氧化碳营养生物，包括：菌种自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、甲酸乙酸梭菌、大梭菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、热醋穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、食甲基丁酸杆菌、Blautia producta、粘液真杆菌和凯伍热厌氧菌。
这些一氧化碳营养产乙酸菌是由其以下能力所定义的：其能够在厌氧条件下利用并化学自养地生长于作为能量来源的气态一碳(C1)源，例如一氧化碳(CO)和含有一氧化碳(CO)和/或氢气(H2)的二氧化碳(CO2)，从而形成乙酰-CoA、乙酸酯及其他产物。它们具有相同的发酵方式——Wood-Ljungdahl或还原性乙酰-CoA途径，并由存在以下酶组而定义：一氧化碳脱氢酶(CODH)、氢化酶(Hydrogenase)、甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase)、甲酰四氢叶酸合成酶(Formyl-tetrahydrofolate synthetase)、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(Methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)、甲酰四氢叶酸环水解酶(Formyl-tetrahydrofolate cyclohydrolase)、亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylene-tetrahydrofolate reductase)及一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA合酶(CODH/ACS)，该组合对于此类细菌是特征性的并且是独特的(Drake,Küsel,Matthies,Wood,&Ljungdahl,2006)。糖发酵细菌将底物转化为生物质、次级代谢产物和丙酮酸盐，再由此形成(或者通过乙酰-CoA或者直接)产物，与所述糖发酵细菌的化学异养型生长不同，在产乙酸细菌中将底物直接转化为乙酰-CoA，再从所述乙酰-CoA形成产物、生物质和次级代谢产物。
在一个实施方案中，所述微生物选自一簇一氧化碳营养梭菌，其中包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和“拉氏梭菌”及相关分离株。这些包括但不限于菌株自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM 10061)(Abrini,Naveau,&Nyns,1994)、自产乙醇梭菌LBS 1560(DSM 19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌LBS 1561(DSM 23693)、杨氏梭菌PETCT(DSM 13528＝ATCC55383)(Tanner,Miller,&Yang,1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5593886)、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6368819)、杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6368819)或“拉氏梭菌P11T”(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055)，及相关分离株例如“C.coskatii”(美国专利2011/0229947)及其突变菌株如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-AcevedoO.Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridiumljungdahlii.PhD thesis,North Carolina State University,2010)。
尽管这些菌株被DNA-DNA重新组合(association)和DNA指纹实验确定为不同种(WO 2008/028055，美国专利2011/0229947)，其在梭菌的rRNA簇I中形成亚簇(Collins etal.,1994)，在16S rRNA基因水平上具有至少99％的同一性。
该簇的菌株由共有的特征定义，具有相似的基因型和表现性，并且它们都具有相同的能量储存和发酵代谢方式。该簇的菌株缺乏细胞色素，并通过Rnf复合体储存能量。
该簇的所有菌株具有约4.2MBp的基因组大小( et al.,2010)和约32％mol的GC组成(Abrini et al.,1994； et al.,2010；Tanner et al.,1993)(WO2008/028055；美国专利2011/0229947)，并且具有编码Wood-Ljungdahl途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸环水解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合体(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(aldehyde:ferredoxin oxidoreductase)( et al.,2010)的保守的必不可少的关键基因操纵子。现已发现，负责气体摄取的Wood-Ljungdahl途径基因摄取的组织和数量在所有种之间是相同的，尽管核酸和氨基酸序列上有差异( et al.,2011)。
所述菌株均具有相似的形态和大小(对数生长细胞为0.5-0.7×3-5μm)、均为嗜温的(最适生长温度为30-37℃)并且均是严格厌氧菌(Abrini et al.,1994；Tanner et al.,1993)(WO 2008/028055)。另外，它们都具有相同主要系统发生特征，例如相同pH范围(pH4-7.5，最佳初始pH 5.5-6)，用含有CO的气体以相似生长速率进行强烈的自养生长，及相似的代谢谱：以乙醇和乙酸作为主要发酵终产物，在某些条件下形成少量2,3-丁二醇和乳酸(Abrini et al.,1994； et al.,2011；Tanner et al.,1993)(WO 2008/028055)。在所有种中观察到吲哚的产生。然而，所述种在对多种糖类(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸盐和柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其他底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用方面有差异。发现所述种中的一些对某些维生素(例如硫胺素、生物素)是营养缺陷的，而其他种则不是。
因此，描述的所述特征不是一种微生物如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌特有的，而是一氧化碳自养的、合成乙醇的梭菌的共有特性。因此，可以预测，本发明可以利用以上菌株实施，尽管在表现上可以有所不同。
在某些实施方案中，所述微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌。在一个实施方案中，还可以选自Clostridium coskatii。在一个具体实施方案中，亲本微生物是自产乙醇梭菌DSM 23693。
适用于本发明的一个示例性微生物是自产乙醇梭菌。在一个实施方案中，所述自产乙醇梭菌是具有保藏在德国生物材料资源中心(DSMZ)的鉴定保藏号为23693的菌株的鉴定特征的自产乙醇梭菌。在其他实施方案中，所述自产乙醇梭菌是具有DSMZ保藏号DSMZ10061或DSMZ 19630的鉴定特征的自产乙醇梭菌。所述菌株对底物组成——尤其是H2和CO——的变化具有特别的耐受性，并因此特别适用于与蒸汽重整方法联合使用。
用于本发明方法的细菌的培养可使用任意数量的本领域已知的使用厌氧细菌培养和发酵底物的方法进行。举例来说，可利用那些通常记载于以下使用气态底物用于发酵的文章中的方法：(i)K.T.Klasson,et al.(1991).Bioreactors for synthesis gasfermentations resources.Conservation and Recycling,5；145-165；(ii)K.T.Klasson,et al.(1991).Bioreactor design for synthesis gas fermentations.Fuel.70.605-614；(iii)K.T.Klasson,et al.(1992).Bioconversion of synthesis gas into liquidor gaseous fuels.Enzyme and Microbial Technology.14；602-608；(iv)J.L.Vega,etal.(1989).Study of Gaseous Substrate Fermentation:Carbon Monoxide Conversionto Acetate.2.Continuous Culture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793；(v)J.L.Vega,etal.(1989).Study of gaseous substrate fermentations:Carbon monoxide conversionto acetate.1.Batch culture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784；(vi)J.L.Vega,et al.(1990).Design of Bioreactors for Coal Synthesis GasFermentations.Resources,Conservation and Recycling.3.149-160；以上文献均以引用的方式纳入本文。
发酵条件
应理解，为进行细菌生长和CO至碳氢化合物的发酵，除了所述含有CO的底物之外，还需要向生物反应器中进料适当的液体营养培养基。营养培养基含有足以使所用微生物生长的维生素和矿物质。适用于以CO作为唯一碳源通过发酵产生碳氢化合物产物的厌氧培养基是本领域已知的。例如，合适的培养基记载于上文引用的美国专利号5173429和5593886，以及WO 02/08438、WO 2007/115157和WO 2008/115080。
为进行所需的发酵(例如，CO到乙醇)，理想地，发酵应在适当条件下进行。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜反应器)、接种水平、保证液相中CO不会成为限制的最大气体底物浓度及避免产物抑制的最大产物浓度。适当的条件记载于WO 02/08438、WO 07/117157和WO08/115080中。
最佳反应条件部分取决于使用的具体微生物。然而，通常优选在高于环境压力的压力下进行发酵。在增大压力下操作可以显著提高CO从气相到液相的传递速率，在液相中CO可作为碳源被微生物摄取用于产生碳氢合化物产物。这反过来说明，当生物反应器被保持在增大的压力下而不是环境压力下时，可以缩短保留时间(定义为生物反应器中液体体积除以输入气体流速)。并且，由于给定的CO到碳氢化合物的转化率部分上是底物保留时间的函数，且达到理想的保留时间反过来觉定所需的生物反应器的体积，因此利用加压系统可以极大地降低所需的生物反应器的体积，并因此降低发酵设备的成本。根据美国专利号5593886给出的实例，反应器体积的减少可与反应器操作压力的增加呈线性比例，即在10个大气压下操作的生物反应器仅需要在1个大气压下操作的反应器体积的1/10。
其他文献也记载了在增加的压力下进行气体到碳氢化合物的发酵的益处。例如，WO 02/08438描述了在2.1atm和5.3atm的压力下进行的气体到乙醇的发酵，分别得到150g/l/天和369g/l/天的乙醇产率。然而，发现在大气压力下利用类似培养基和输入气体组成进行的示例性发酵每天每升产生1/10-1/20的乙醇。
同样需要的是，引入所述含有CO的气态底物的速度应保证液相中的CO浓度不成为限制。这是由于CO受限的条件的后果可能是所述碳氢化合物产物被培养物消耗。
发酵产物
本发明的方法可被用于生产多种碳氢化合物产物中的任意产物。这包括醇、酸和或二醇。更具体的，本发明可应用于发酵生产乙酸盐、丁酸盐、丙酸盐、己酸盐、乙醇、丙醇、丁醇、2,3-二丁醇、异丙醇、丙烯、丁二烯、异丁烯和乙烯。这些及其他产物对于许多其他过程例如塑料、药物制剂和农业化学品的生产是有价值的。在一个具体实施方案中，所述发酵产物用于生产汽油范围内的碳氢化合物(约8碳)、柴油碳氢化合物(约12碳)或航空燃料碳氢化合物(约12碳)。
本发明还提供将通过所述发酵产生的至少一部分碳氢化合物产物再次用于所述蒸汽重整过程。这是可行的，由于除CH4以外的碳氢化合物可以在催化剂上与流反应以产生H2和CO。在具体实施方案中，将乙醇循环用作蒸汽重整过程的原料。在另一实施方案中，所述碳氢化合物原料和/或产品被通过预重整装置，然后将其用于所述蒸汽重整过程。通过预重整装置部分完成了所述蒸汽重整过程的蒸汽重整步骤，这可提高氢气产生的效率并降低所需的蒸汽重整炉容量。
本发明的方法也可应用于需氧发酵、和厌氧或需氧发酵其他产品，包括但不限于异丙醇。
产物回收
所述发酵反应的产物可利用已知方法回收。示例性的方法包括WO 07/117157、WO08/115080、US 6340581、US 6136577、US 5593886、US 5807722和US 5821111中描述的方法。然而，简言之，例如，乙醇可通过例如分级分馏或蒸发和萃取发酵的方法从发酵中回收。
从发酵液中蒸馏乙醇得到乙醇和水的共沸混合物(即，95％乙醇和5％水)。随后可通过本领域公知的分子筛乙醇脱水技术获得无水乙醇。
萃取发酵方法涉及使用对发酵生物具有低毒性危险的可与水混溶的溶剂，以从稀发酵液中回收乙醇。例如，油醇是一种可用于这类萃取方法的溶剂。油醇被持续地引入至发酵罐中，此时该溶剂上升并在发酵罐顶部形成一层，该层被连续萃取并离心。随后水和细胞被容易地从油醇中分离并返回至发酵罐，而含有乙醇的溶剂被进料到闪蒸装置。大部分乙醇被蒸发并浓缩，而油醇是不易挥发的并被回收在发酵中再利用。
乙酸盐——作为所述发酵反应的副产物产生——也可利用本领域已知方法从发酵液中回收。
例如，可使用包括活性炭过滤器在内的吸附系统。在这种情况下，优选先用适当的分离装置将微生物细胞从发酵液中除去。本领域中已知多种产生用于产物回收的无细胞发酵液的基于过滤的方法。然后，使含乙醇(和乙酸盐)的无细胞过滤液通过含有活性炭的柱以吸附所述乙酸盐。酸形式的乙酸盐(乙酸)而不是盐形式的乙酸盐(乙酸盐)更易于被活性炭所吸附。因此，优选在使所述发酵液通过所述活性炭柱之前将所述发酵液的pH降低至小于约3，以使大部分乙酸盐转化为乙酸形式。
被吸附到活性炭上的乙酸可通过使用本领域已知方法的洗脱进行回收。例如，可使用乙醇洗脱结合的乙酸盐。在某些实施方案中，可使用由发酵过程本身产生的乙醇洗脱乙酸盐。由于乙醇的沸点是78.8℃，乙酸的沸点是107℃，因此使用基于挥发性的方法(例如蒸馏)可容易地将乙醇和乙酸盐相互分离。
其他用于从发酵液中回收乙酸盐的方法也为本领域所知，并可被使用。例如，美国专利号6,368,819和6,753,170描述了可用于从发酵液中萃取乙酸的溶剂和共溶剂系统。如所述用于对乙醇进行萃取发酵的基于油醇的系统的实例一样，美国专利号6,368,819和6,753,170描述的系统记载了一种不与水混溶的溶剂/共溶剂，其可在存在或不存在所述发酵微生物的情况下与发酵液混合，以萃取乙酸产物。随后通过蒸馏从发酵液中分离含有乙酸产品的溶剂/共溶剂。随后可进行第二蒸馏步骤以从所述溶剂/共溶剂系统中纯化乙酸。
所述发酵反应的产物(例如乙醇和乙酸盐)，可通过以下方法从发酵液中回收：从发酵生物反应器中连续移除部分发酵液、(通过过滤可方便地)从发酵液中分离微生物细胞，并同时或随后从发酵液中回收一种或多种产物。对于乙醇，其可方便地通过分馏回收，且乙酸盐可使用以上描述的方法通过活性炭吸附回收。被分离的微生物细胞优选地被返回至发酵生物反应器。去除了乙醇和乙酸盐之后剩下的无细胞的过滤液也优选地被返回至发酵生物反应器。其他营养物(例如B族维生素)可加入至无细胞的过滤液中，以在其被返回至生物反应器前补充营养培养基。并且，如果如上文所述调节发酵液的pH以提高乙酸对活性炭的吸附，则应先将其pH重新调节至与发酵反应器中发酵液相似的pH，再返回至生物反应器。
可对从所述生物反应器回收的生物质进行厌氧消化以产生生物质产物，优选甲烷。该生物质产物可被用作蒸汽重整过程的原料或用于产生补充的热量以驱动本文定义的反应中一个或多个。
实施例
起始的材料和方法
培养基：
金属混合物1 每L储液
FeCl2·4H2O 19.35g
NiCl2·6H2O 1.19g
ZnCl2 0.69g
金属混合物2 每L储液
CoCl2·6H2O 2.38g
HBO4 0.62g
MnCl2·4H2O 1.98g
NaMoO4·2H2O 2.42g
Na2SeO3 1.73g
Na2WO4·2H2O 3.29
在血清瓶中发酵
通过在含有50mL培养基的234mL厌氧血清瓶中注射1mL的自产乙醇梭菌冻干储液(freeze dried stock)进行培养。用30psi RMG吹扫(flush)血清瓶的顶空。将其保存于温度保持在37℃的振荡培养箱上。培养两天后或当培养物的光密度达到0.2时，将培养物传代培养(sub culture)于8个血清瓶中。
在生物反应器中发酵——实施例1和2
将除B族维生素溶液和半胱氨酸以外的所有成分在5L蒸馏水中混合，以制备培养基。准备10L CSTR反应器并向其中加入4.5L所述培养基溶液。随后将上述反应器在高压灭菌器中于121℃下灭菌30min。高压灭菌后，将反应器冷却，保持在37℃并用连续的N2气体流使其厌氧化并以200rpm搅拌。冷却后，用0.2μm过滤注射器加入B族维生素和半胱氨酸溶液。随后用5M NH4OH溶液将所述溶液的pH调节并保持在5.3。
接种前2小时，将N2气体换成100ml/min RMG，并将所述培养基进一步用0.2M Cr2+溶液还原至-250mV。向其中接种400mL自产乙醇梭菌血清瓶培养物。开始发酵，作为一个气体和搅拌随时间逐渐增加的批次。接种后两天，将培养转变为连续的、仍旧缓慢增加并最终稳定在550ml/min RGM和400rpm搅拌。
在生物反应器中发酵——实施例3
向两个2L反应器中加入1.5L含有全部金属、磷酸、B族维生素(如以上表中所示)的培养基。随后将该培养基用具有以下组成的工业气体脱气：约50％CO、20％CO2、28％N2和2％H2。接种前，以0.2mL/h的速度向培养基中加入0.12M(NH4)2SO3(pH 6)以提供硫。用0.2M Cr2+将ORP(Ag/AgCl电极)进一步调节至-200mV，随后接种来自连续运行的种子发酵罐的200mL的生物量为约2g/L的培养物。在接下来的几个小时，密切监测pH、ORP、气体摄取和顶空中的H2S，以确保成功开始。通过实现向培养物的最佳气体输送来控制pH及通过用5M NH4OH的自动pH控制(在5.0)来额外支持pH。在初始24h，培养物进行分批发酵，并随后通过以下方式转换成连续模式：以达到稀释率为2-3的速度递送培养基(2mM NaCl、2mM KCl、0.5mM MgCl2、1mM CaCl2、B族维生素、5mM磷酸、金属混合物)，并同时以适当速度递送(NH4)2SO3和消泡剂。
0.12M(NH4)2SO3(用浓盐酸将pH调节至6)作为硫源——调节流速以使顶空中H2S<100ppm
消泡剂(聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇))(CAS9003-11-6)(10μL/h)
在所述1.5L反应器中的实验是以2-发酵罐系统进行。两个反应器的特征均为细胞再循环(cell recycling)。将孔径0.1μm的中空的纤维膜滤柱(cartridge)用于进行细胞再循环。当反应器被连接到2-发酵罐系统时，由细胞再循环产生的渗出物和废弃物被直接转移到下游发酵罐中。因此，渗出物与废弃物的比例保持在一个基于进料(dialled in)流速的估计值。
实施例1：H2SO3作为硫源
背景：
本实验是在单反应器系统中稳定的连续运行的种子发酵罐上进行。所述种子发酵罐的主要目的是为其他生物反应器发酵提供起始接种物。因此，该发酵罐被保持稳定并以低水平气体供给和搅拌进行不充足供应。通常，种子发酵罐运行约1-2个月，随后停止并重新启动(以降低污染的风险)。本实验在连续稳定运行两个月的培养物上进行。种子发酵罐的特性(profile)与高性能发酵系统不同。
这些实验的目的是，找到用于自产乙醇梭菌及其它产乙酸一氧化碳营养微生物的替代硫源。现已发现，自产乙醇梭菌能够利用来自Na2S的硫源(通过将该溶液直接滴加至发酵罐或将该溶液滴加至装有H3PO4的封闭容器并提供释放至该发酵罐中的H2S)。自产乙醇梭菌也能够消耗半胱氨酸并释放H2S，并且过去已证明S8同样有效。这些实验关注H2SO3是由于与目前的硫源(Na2S或半胱氨酸)相比，H2SO3具有优势。H2SO3对大多数微生物有毒性，因此可以作为消毒剂和硫源。另外SO2气体是煤电厂的废弃产物并且已经导致酸雨形式的环境问题。从那以后，煤电厂需要过滤其硫排放物，并且已经签订了降低所述污染的国际条约。
方法：
用注射泵向10L发酵罐中泵入约0.6M SO2的水溶液。其性能指标(performanceindicator)是顶空中的H2S以及H2和CO的摄取。有效的硫源应产生H2S并导致稳定的H2及CO摄取。H2摄取是所述微生物健康状态的早期指标。
结果：
使用1ml/hr泵速的约0.6M的浓度导致顶空中过量的H2S(约600ppm)。为减少产生的H2S，所述溶液被稀释10倍并调节泵速至达到理想值。
图1示出了该生物反应器中的氢气摄取和H2S产生。
在泵速为2ml/hr时，培养物几乎不产生H2S且H2摄取不稳定并降低。
在泵速为3ml/hr时，顶空中H2S的量约为60-70ppm的H2S。当泵速提高至3.5ml/hr时，H2S的量在约20ppm至约0之间波动。H2摄取非常稳定。将泵速提高至4ml/hr时形成过量的H2S。
实施例2：(NH4)HSO3作为硫源
背景：
本实验是所述H2SO3实验的延续。H2SO3酸性很强且在水中以SO2形式存在，这种在水中的形式在其目前的pH下释放可引起健康和安全问题的有毒的SO2气体。在IV袋中储存该溶液(向发酵罐提供Na2S的常用方法)的独立实验表明，尽管该袋没有被损坏，但是由于SO2气体的累积而膨胀。
为提供更安全的溶液，将溶于水中的SO2(H2SO3)用浓NH4OH将pH调节至6，这形成安全且几乎无味的(NH4)HSO3。随后将该溶液在种子发酵罐上测试。
方法：
将约0.6M SO2的水溶液与28％NH4OH反应从而将pH升高至6并稀释10倍。随后用注射泵将该溶液供应至发酵罐。
结果：
图2示出了生物反应器中的H2摄取和H2S水平。如图2所示：用4ml/hr未稀释的溶液得到过量的H2S。4ml/hr稀释溶液的速度得到约80ppm的H2S。
2ml/hr的1/10稀释溶液的速度得到最低量的H2S，然而H2摄取降低。3ml/hr的1/10稀释溶液的速度得到低水平H2S和稳定的H2摄取。
实施例3：(NH4)2SO3作为硫源
方法：
在双发酵罐系统中把(NH4)2SO3用作硫源。制备0.12M(NH4)2SO3溶液并用浓盐酸将pH调节至6.0。该溶液可按与0.5M Na2S溶液相似的速率使用。调节其剂量以保持顶空中H2S低于100ppm。顶空中更高浓度的H2S指示了发酵液中的SO2水平可能对培养物有害。图6和7示出了在更高生物量浓度和更高稀释率和气体速率下，用于将H2S保持在目标水平时所需的(NH4)2SO3浓度是如何增加的。接种时需要特别当心不要添加太多(NH4)2SO3。作为指示剂的H2S仅在接种后可得。接种前顶空中不会出现H2S。从本实验看出，对于连续高效培养，根据生物量、气流和稀释率，(NH4)2SO3的最佳浓度介于1-3.5mmol之间。接种时浓度应低于0.3mmol。
结果：
在pH 6时向溶液加入(NH4)2SO3，用作替代硫源。向发酵液中加入(NH4)2SO3的速率与0.5M Na2S溶液相同。在本实验过程中发现，需要将溶液中(NH4)2SO3保持在一定浓度，使反应器顶空中H2S的含量能够维持在低于100ppm的浓度。如图3和图4所示，利用(NH4)2SO3以稳定方式将所述发酵维持约40天，证明了(NH4)2SO3作为替代硫源的有效性。
证明了可以用(NH4)2SO3作为微生物的替代硫源进行的稳定的连续发酵，同时将发酵液中所需(NH4)2SO3浓度保持在1-3.5mmol，且顶空中H2S的浓度保持在低于100ppm。
为了使读者实施本发明而不需要进行过多的实验，本文参考某些优选实施方案描述本发明。然而，本领域普通技术人员可以容易理解，许多组分和参数可被改变或变更至一定范围，或用已知等效物替换，而不会超出本发明的范围。应该理解，这样的变更和等效物如同单独列出一样被纳入本文。本发明还包括本说明书提及的或指示的所有步骤、特征、组合物及化合物，单独地或整体地，及任何两个或以上的所述步骤或特征的任意和所有组合。
当上述描述中提到具有已知等效物的整体时，那些整体如同各自提出一样纳入本文。
另外，为帮助读者理解本文，本文提供了题目、标题等，这些不应被理解为限制本发明的范围。以上和以下引用的所有申请、专利和公开文本的完整公开内容，如果存在的话，以引用的方式纳入本文。
本说明书中对任何现有技术的参考不是，也不应被认为是承认或任何形式的暗示该现有技术在世界上的任何国家在所致力的领域形成了公共常识的一部分。
除非上下文另有说明，在本说明书和以下任何权利要求中，词语“包括”、“包含”等，应被理解为包含性的而不是排除性的含义，即，具有“包括，但不限于”。

Claims (9)

1.一种通过微生物发酵生产一种或多种产品的方法，所述方法包括：
a)向生物反应器提供包含CO的气态底物，所述生物反应器包含在含硫源的液体营养培养基中的一种或多种一氧化碳营养微生物的培养物，其中所述液体营养培养基包含选自SO2、H2SO3、Na2S2O4、S8、Na2S、NaHS、半胱氨酸、NH4HSO3或(NH4)2SO3的硫源；
b)厌氧发酵所述底物以产生一种或多种选自醇、酸及其混合物的产物；
c)所述硫源的一部分在所述生物反应器的顶空中被转化成H2S；
d)所述液体营养培养基中的硫源的浓度是依据所述顶空中测定的H2S的量进行调整；和
e)回收一种或多种产物；
其中所述顶空中H2S的浓度保持在1ppm-100ppm。
2.权利要求1的方法，其中所述硫源是亚硫酸。
3.权利要求2的方法，其中所述液体营养培养基中亚硫酸的浓度保持在1-3.5mmol。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种一氧化碳营养微生物选自自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、Clostridium coskatii和食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxydivorans)。
5.权利要求4的方法，其中所述一氧化碳营养微生物是自产乙醇梭菌。
6.权利要求4的方法，其中所述一氧化碳营养微生物是保藏于德国生物材料资源中心(DSMZ)的鉴定保藏号为19630的自产乙醇梭菌菌株。
7.权利要求4的方法，其中所述一氧化碳营养微生物是保藏于德国生物材料资源中心(DSMZ)鉴定保藏号为23693的自产乙醇梭菌菌株。
8.权利要求1的方法，其中所述硫源是工业过程的废弃产物。
9.权利要求1的方法，其中所述硫源是煤炭生产过程的废弃产物。
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