EA030282B1 - Способ ферментации - Google Patents

Abstract

Изобретение в целом относится к способам повышения эффективности роста микроорганизмов и производства продуктов, таких как спирты и кислоты, путем микробиологической ферментации субстратов, содержащих монооксид углерода. Более конкретно, изобретение относится к обеспечению альтернативного источника серы в жидкую питательную среду, благодаря которому сера становится доступной для одного или более микроорганизмов указанной ферментации.

Description

изобретение относится к обеспечению альтернативного источника серы в жидкую питательную среду, благодаря которому сера становится доступной для одного или более микроорганизмов указанной ферментации.

030282

Область техники

Настоящее изобретение в целом относится к способам повышения эффективности роста микроорганизмов и производства продуктов, таких как спирты и кислоты, путем микробиологической ферментации. Более конкретно, изобретение относится к способам получения спиртов, в частности этанола, с помощью микробиологической ферментации субстратов, содержащих монооксид углерода.

Уровень техники

Этанол по всему миру быстро становится основным жидким транспортным топливом, богатым водородом. Мировое потребление этанола в 2002 г. было оценено в 10,8 млрд галлонов. Прогнозируют резкий рост мирового рынка топливного этанола в будущем в связи с усилением интереса к этанолу в Европе, Японии, США и ряде развивающихся стран.

Например, в США этанол используют для производства Е10, представляющего собой 10% смесь этанола в бензине. В смеси Е10 этанольный компонент действует как окисляющий агент, повышающий эффективность сгорания и сокращает образование веществ, загрязняющих воздух. В Бразилии этанол удовлетворяет примерно 30% потребности в транспортном топливе как в качестве окисляющего агента, представляющего собой смесь в бензине, так и отдельно в виде чистого топлива. Кроме того, экологические проблемы в Европе, связанные с выделением газов, вызывающих парниковый эффект, стимулируют Европейский Союз (ЕС) установить для стран, входящих в ЕС, в качестве обязательной цели потребление экологичного транспортного топлива, такого как этанол, полученный из биомассы.

Большую часть топливного этанола получают с помощью традиционных ферментационных процессов на основе дрожжей, для которых в качестве основного источника углерода используют углеводы, полученные из сельскохозяйственных культур, например, сахарозу, извлеченную из сахарного тростника, или крахмал, извлеченный из зерновых культур. Однако на стоимость такого углеводного сырья влияет то, что оно является ценным в качестве пищи для человека или кормов для животных, в то время как выращивание сельскохозяйственных культур, из которых можно получить крахмал или сахарозу для производства этанола, не рационально с экономической точки зрения во всех географических регионах. Следовательно, представляет особый интерес разработка технологий, которые позволят преобразовывать ресурсы, имеющие более низкую стоимость и/или более богатые углеродом, в топливный этанол.

СО представляет собой главный бесплатный энергоемкий побочный продукт неполного сгорания органических материалов, таких как уголь, нефть или продукты, полученные из нефти. Например, сообщают, что сталелитейная промышленность Австралии производит и выбрасывает в атмосферу более 500000 т СО ежегодно.

Давно признано, что каталитические процессы могут быть использованы для преобразования газов, состоящих в основном из СО и/или СО и водорода (Н₂), в различное топливо и химические вещества. Тем не менее, для преобразования этих газов в топливо и химические вещества также можно применять микроорганизмы. Эти биологические процессы, несмотря на то что обычно они медленнее химических реакций, имеют ряд преимуществ перед каталитическими процессами, в том числе более высокую избирательность, повышенный выход, снижение затрат на энергоресурсы и большую устойчивость к отравлению.

Способность микроорганизмов расти на СО в качестве единственного для них источника углерода была впервые обнаружена в 1903 году. Позже было установлено, что этим свойством обладают организмы, использующие ацетил-коэнзимовый А (ацетил-КоА) биохимический путь автотрофного роста (также известный как метаболический путь Вуда-Льюнгдаля и путь дегидрогеназа монооксида углерода/ацетилСоА-синтаза (путь СОЭН/АС8)). Было показано, что большое количество анаэробных организмов, включая карбоксидотрофные, фотосинтезирующие, метаногенные и ацетогенные организмы, преобразуют СО в различные конечные продукты, а именно СО2, Н2, метан, н-бутанол, ацетат и этанол.

При использовании СО в качестве единственного источника углерода все такие организмы производят по крайней мере два из этих конечных продуктов.

Было продемонстрировано, что анаэробные бактерии, такие как бактерии из рода ОоЧпкшт. производят этанол из СО, СО₂ и Н₂ через биохимический путь ацетил-СоА. Например, различные штаммы С1о81пкшт ЦипдкаЫи, которые производят этанол из газов, описаны в АО 00/68407, ЕР 117309, патентах США №№ 5173429, 5593886 и 6368819, АО 98/00558 и АО 02/08438. Известно также, что бактерия С1о8йткшт аи1ое1каподепит φ производит этанол из газов (АпЫш е! а1., АгсЫуек о£ МюгоЪю1оду 161, рр 345-351 (1994)).

Однако выработка этанола микроорганизмами путем ферментации газов всегда связана с совместным получением ацетата и/или уксусной кислоты. Поскольку некоторая часть из имеющегося углерода превращается в ацетат/уксусную кислоту, а не в этанол, эффективность получения этанола с использованием таких процессов ферментации может быть меньше, чем желаемая. Кроме того, если побочный продукт ацетата/уксусной кислоты не может быть использован для других целей, при этом может возникнуть проблема утилизации отходов. Ацетат/уксусная кислота с помощью микроорганизмов превращается в метан и, следовательно, потенциально может внести дополнительный вклад в выброс парниковых газов.

В данной области техники была признана важность контроля параметров жидкой питательной сре- 1 030282

ды, используемой для культивирования бактерий или микроорганизмов, в биореакторе, используемом для ферментации. Документ N2 556615, дата подачи 18 июля 2007 г., включенный в настоящий документ в качестве ссылки, описывает в частности манипуляции с рН и окислительно-восстановительным потенциалом такой жидкой питательной среды. Например, в культуре анаэробных ацетогенных бактерий путем повышения рН культуры выше примерно 5,7 при поддержании окислительно-восстановительного потенциала культуры на низком уровне (-400 мВ или ниже), бактерии превращают ацетат, полученный в качестве побочного продукта ферментации, в этанол с гораздо более высокой скоростью, чем при более низких значениях рН. ΝΖ 556615 также признает, что различные уровни рН и окислительновосстановительного потенциала могут быть использованы для оптимизации условий в зависимости от первичной роли, выполняемой бактериями (то есть рост, получение этанола из ацетата и газообразного субстрата, содержащего СО, или получение этанола из содержащего газ субстрата).

Патент США 7078201 и публикация международной заявки \УО 02/08438 также описывают улучшение процессов ферментации для производства этанола путем изменения условий (например, рН и окислительно-восстановительный потенциал) жидкой питательной среды, в которой выполняется ферментация.

рН жидкой питательной среды можно регулировать путем добавления в среду одного или более агентов регулирования рН или буферов. Например, основания, такие как №АН. и кислоты, такие как серная кислота, можно использовать для увеличения или уменьшения значения рН по мере необходимости. Окислительно-восстановительный потенциал можно регулировать путем добавления одного или более восстановителей (например, метилвиологена) или окислителей.

Схожие процессы можно применять для производства других спиртов, таких как бутанол, что будет понятно специалистам в данной области техники.

Независимо от источника, используемого для питания реакции ферментации, могут возникнуть проблемы, если существуют перерывы в подаче такого питания. В частности, такие перерывы могут ухудшать эффективность микроорганизмов, используемых в реакции, а в некоторых случаях могут оказывать отрицательное воздействие и на сами микроорганизмы. Например, когда газ СО в потоке отработанного промышленного газа используют в реакциях ферментации для получения кислот/спиртов, могут быть моменты, когда такой поток не производится. В такие моменты микроорганизмы, используемые в реакции, могут перейти в пассивное состояние. Затем, когда поток снова станет доступным, может наблюдаться задержка, прежде чем микроорганизмы снова станут полностью продуктивными при выполнении требуемой реакции.

Источники серы, такие как цистеин и/или сульфид, также используют для достижения желаемого окислительно-восстановительного потенциала анаэробного ферментативного бульона перед инокуляцией. Тем не менее, такие восстановители являются медленными и имеют ограниченную восстановительную силу. Кроме того, когда эти серосодержащие соединения используют для снижения окислительновосстановительного потенциала ферментационной среды, они окисляют сами себя. Например, цистеин окисляется до димерного цистина. Считается, что восстановленная форма этих соединений является существенно более биодоступной в качестве источника серы для потребления микробной культурой, чем окисленная форма таких соединений. Таким образом, когда источник серы используют для снижения окислительно-восстановительного потенциала ферментативной реакции, фактическая концентрация серы, доступной для микробной культуры, будет уменьшаться. Соответственно, определение улучшенного или альтернативного восстановителя для применения с анаэробными системами ферментации, в которых в качестве сырья используют газы, содержащие монооксид углерода, представляется ключевым фактором для обеспечения высоких темпов производства спирта и низких эксплуатационных затрат процесса.

Наряду с основными питательными веществами, такими как азот и фосфор, сера играет важную роль в ферментации анаэробного микроорганизма С. аи1ое1Ьаподепит. Сера необходима для микроорганизма и требуется для ряда соединений и ферментов, которые позволяют С. аи1ое1йаподепит выполнять ферментацию СО в уксусную кислоту, этанол и бутандиол, и для генерирования АТФ для роста биомассы. Сера представляет собой часть класса биологических соединений, называемых ферредоксинами, и является неотъемлемой частью многих ферментов Вуда-Льюнгдаля, которые фиксируют газообразный СО в ацетил-КоА. В целом, наиболее восстановленная форма серы ассимилируется в функциональные белки. Микроорганизм может поглощать Н₂§ непосредственно или в виде ионов сероводорода и ассимилировать его в требуемые белки. Многие из серосодержащих микробных ферментов также содержат ионы переходных металлов, такие как Ре2+, ΖΦ2+, Со2+ и Мп2+. Поскольку сульфиды этих металлов имеют продукты с очень низкой растворимостью при значениях рН около нейтральных, то свободная Н₂§ и или переходные металлы в свободном виде, как правило, редко наблюдаются в таких средах, потому что большая часть таких ионов металлов оказывается связанной в виде нерастворимых сульфидов металлов и, следовательно, является недоступной для микроорганизмов.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение системы и/или способа, которые, по меньшей мере, в некоторой степени смогут преодолеть вышеуказанные недостатки, или, по меньшей мере, обеспечение общества полезным выбором.

- 2 030282

Краткое описание изобретения

В одном широком аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ повышения эффективности роста бактериальной культуры, включающий этап, обеспечивающий культуру альтернативным источником серы.

Во втором широком аспекте обеспечен способ поддержания или увеличения темпов получения одного или более продуктов с помощью культуры микроорганизмов, включающий этап обеспечения культуры альтернативным источником серы.

В третьем широком аспекте обеспечен способ повышения эффективности ферментации бактериальной культуры, включающий этап обеспечения культуры альтернативным источником серы.

В четвертом аспекте обеспечен способ получения одного или более продуктов микробиологической ферментации, включающий:

ί) обеспечение газообразного субстрата, содержащего СО, в биореактор, содержащий культуру одного или более карбоксидотрофных микроорганизмов в жидкой питательной среде;

ίί) анаэробную ферментацию субстрата с получением одного или более продуктов, выбранных из группы, включающей спирты, кислоты и их смеси; и

ίίί) извлечение одного или более продукта.

В одном варианте реализации жидкая питательная среда содержит по меньшей мере один источник серы, выбранный из группы, включающей §О₂, Η₂δΟ₃, Να₂δ₂Ο₄, δ₈, Ыа₂8, ΝαΗδ. цистеин, ΝΗ₄ΗδΟ₃ или (ΝΗ₄)₂δΟ₃.

В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения предложен способ улучшения эффективности микробиологической ферментации субстрата, содержащего СО, при этом способ включает обеспечение альтернативного источника серы в питательную среду, благодаря которому сера доступна для одного или более микроорганизмов.

В определенных вариантах реализации вышеупомянутых аспектов альтернативный источник серы выбран из группы, включающей сернистую кислоту (Η₂δΟ₃), Ν;·ι₂δ₂Ο₄, δ₈, Ν;·ι₂δ, ΝαΗδ, §Ο₂, цистеин, ΝΗ₄ΗδΟ₃ ог (ΝΗ₄)₂δΟ₃. В определенных вариантах реализации изобретения альтернативный источник серы представляет собой сернистую кислоту.

В определенных вариантах реализации вышеупомянутых аспектов источник серы представляет собой побочный продукт промышленного процесса. Промышленный процесс может включать, но не ограничивается ими, сжигание угля или сжигание нефти на электростанциях.

В определенных вариантах реализации изобретения одно или более серосодержащих соединений может быть использовано культурой микроорганизмов.

В другом широком аспекте настоящее изобретение относится к способу получения одной или более кислот и/или спиртов путем микробиологической ферментации, включающий следующие этапы:

ί) обеспечение субстрата, содержащего монооксид углерода и возможно диоксид углерода и/или водород;

ίί) анаэробную ферментацию субстрата в биореакторе, содержащем культуру одного или более микроорганизмов, с получением одного или более продуктов, состоящих из кислот и/или спиртов; и

ίίί) сбор и извлечение одного или более полученных продуктов, при этом культуру обеспечивают сернистой кислотой в качестве источника серы.

В определенных вариантах реализации различных аспектов субстрат, содержащий СΟ, является газообразным. В определенных вариантах реализации изобретения газообразный субстрат содержит газ, полученный в промышленном процессе в качестве побочного продукта. В некоторых вариантах реализации изобретения промышленный процесс выбран из группы, состоящей из производства изделий из черных металлов, производства изделий из цветных металлов, процессов переработки нефти, газификации биомассы, газификации угля, производства электроэнергии, производства сажи, производства аммиака, производства метанола и производства кокса. В определенном варианте реализации газообразный субстрат содержит газ, полученный со сталелитейного завода.

В некоторых вариантах реализации субстрат, содержащий СΟ, как правило содержит основную долю ί.Ό, например, по меньшей мере от примерно 20 до примерно 100% СЮ по объему, от 40 до 95% СЮ по объему, от 40 до 60% СЮ по объему и от 45 до 55% СЮ по объему. В определенных вариантах реализации изобретения субстрат содержит примерно 25%, или примерно 30%, или примерно 35%, или примерно 40%, или примерно 45%, или примерно 50% СЮ, или примерно 55% СЮ, или примерно 60% СЮ по объему. Субстраты, имеющие более низкие концентрации СΟ, такую как 6%, также можно использовать, в частности, когда также присутствуют Η₂ и СΟ₂.

В определенных вариантах реализации изобретения спирт, полученный способом ферментации, представляет собой этанол. В результате реакции ферментации также можно получать ацетат.

В некоторых вариантах реализации различных аспектов источник серы выбран из группы, включающей §Ο₂, Η₂δΟ₃, Ν;·ι₂δ₂Ο.·|, δ₈, Ν;·ι₂δ, ΝαΗδ, цистеин, ΝΗ₄ΗδΟ₃ или (ΝΗ₄)₂δΟ₃ В некоторых вариантах реализации изобретения источник серы представляет собой сернистую кислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения источник серы представляет собой (ΝΗ₄)₂δΟ₃. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрацию (ΝΗ₄)₂δΟ₃ поддерживают на уровне между 1 и 2,5 ммоль.

- 3 030282

В некоторых вариантах реализации существует корреляция между количеством источника серы, которым обеспечивают культуру, и количеством Η₂δ, присутствующего в свободном пространстве ферментационной емкости/биореактора. В некоторых вариантах реализации контролируют Η₂δ в качестве индикатора концентрации серы в процессе ферментации.

В некоторых вариантах реализации концентрацию Η₂δ в свободном пространстве поддерживают в пределах от 1 до 100 ррт. В некоторых вариантах реализации увеличение количества источника серы, которым обеспечивают культуру, увеличивает концентрацию Η₂δ в свободном пространстве, и наоборот, уменьшение количества источника серы, которым обеспечивают культуру, снижает концентрацию Η₂δ в свободном пространстве.

В одном варианте реализации микроорганизм выбран из группы ацетогенных карбоксидотрофных организмов, включающей виды С1окйтФит айоеШаподешт, С1окйтФит уиидйаЫн, С1окйтФит гадкйа1ек С1окйтФит сагЬохШтуогапз, С1окйтФит йгакск С1окйгйшт ксаЮ1одепек, С1окйгйшт асейсит, С1окйтФит Готт1соасейсит, С1окйтФит тадпит, ЛсеЮЬасЮпит теоойи, Л1каИЬаси1ит Ьасскй, Мооге11а Шегтоасейса, Зроготта оуа1е, ВйуйЬайейит теШу1о1горЬюит, В1аийа ргойис1а, ЕиЬайейит йтокит, ТкегтоапаегоЬас1ег кшук

В определенных вариантах реализации изобретения микроорганизм выбран из группы ацетогенных карбоксидотрофных микроорганизмов, включающей виды С1окйтйшт айоеШаподепит, С1окйгйшт УипдйаЫи, С1окйгйшт гадкйа1е1, С1окйгйшт соккаШ и С1окйгйшт сатЬохуфуогапк. В одном варианте реализации ацетогенная бактерия представляет собой С1ок1пйшт айоеШаподепит.

В одном варианте реализации изобретения реакцию ферментации проводят с помощью штамма С1окйгйшт айоеШаподепит, депонированного в ресурсном центре биологического материала Германии (Оетшап Кекоигсе Сейте кот Вю1одюа1 Ма1епа1, ΌδΜΖ) с идентификационным депозитным номером 19630.

В одном варианте реализации изобретения реакцию ферментации проводят с помощью штамма С1окйтйшш айоеШаподепит, депонированного в ресурсном центре биологического материала Германии (Оеттап Кекоигсе Сейте Гог Вю1одюа1 Ма1епа1, ΌδΜΖ) с идентификационным депозитным номером 23693.

В определенных вариантах реализации изобретения источник серы представляет собой побочный продукт промышленного процесса. В некоторых вариантах реализации изобретения источник серы представляет собой побочный продукт процесса производства угля.

Несмотря на то, что изобретение в целом описано выше, оно не ограничивается этим и также включает варианты реализации изобретения, примеры которых приведены ниже.

Краткое описание графических материалов

Ниже изобретение будет описано более подробно со ссылками на прилагаемые фигуры, на которых: на фиг. 1 показано поглощение Η2 и выработка Η2δ в процессе ферментации с помощью

С.айоеФаиодеиит с использованием Η₂δΟ₃ в качестве источника серы;

на фиг. 2 показано поглощение Η2 и выработка Η2δ в процессе ферментации с помощью

С.айоеΐйаиодеиит с использованием (ΝΗ₄)ΗδΟ₃ в качестве источника серы;

на фиг. 3 показано поглощение газа и концентрация Η₂δ в первом реакторе системы из двух реакторов;

на фиг. 4 показано поглощение газа и концентрация Η₂δ во втором реакторе системы из двух реакторов.

В табл. 1 показаны степени окисления различных альтернативных источников серы.

В табл. 2 показано добавление (ΝΗ₄)₂δΟ₃ в первый реактор в связи с другими параметрами процесса.

В табл. 3 показано добавление (ΝΗ₄)₂δΟ₃ во второй реактор в связи с другими параметрами процесса.

Подробное описание изобретения

Источник серы.

Оптимальное значение ρΗ ферментации с помощью С.айоеШаподепит составляет примерно ρΗ 5. При ρΗ 5 δ^2- является преимущественно протонированным и существует в основном как Η2δ (что представляет собой растворенный газ) и небольшое количество Ηδ^-. Первый из упомянутых газов удаляется из биореактора барботированием исходных газов через систему. По этой причине необходимо сохранять водные растворы, содержащие Η2δ, при высоких значениях ρΗ для удержания серы в виде сульфид-иона и по каплям добавлять в емкость для ферментации только небольшие объемы раствора, чтобы избежать потери серы из системы перед тем, как она может быть использована микроорганизмами. Такие растворы с высокими значениями ρΗ очень коррозийны и кроме того имеют тенденцию к образованию осадков с большинством элементов либо путем образования нерастворимых сульфидов, либо путем осаждения нерастворимых гидроксидов. Коррозийный и осадительный характер раствора требует существования строгого разделения этого раствора и других компонентов среды.

Для решения этих задач были выявлены и проверены ряд альтернативных источников серы для определения способности С.айоеΐйаиодеиит использовать эти источники серы. В табл. 1 показан ряд со- 4 030282

единений серы, степени их окисления и способность С.аи1ое1Ьаподепит их использовать.

Сернистая кислота (Н₂80₃) была определена в качестве альтернативного источника серы. Сернистая кислота представляет собой гораздо более сильную кислоту, чем Н₂3, а при рН 5 эта кислота будет количественно депротонирована и будет оставаться в растворе в форме бисульфит-иона. Поэтому водные растворы можно хранить в диапазоне рН без дополнительных проблем, вызванных осаждением гидроксида или обширной коррозией. Кроме того, упрощается дозирование серы в биореактор, так как микроорганизмы преобразуют С0₂ внутри клетки в Н₂3, необходимый для анаболизма. Таким способом можно свести к минимуму потерю Н₂3 в результате барботирования других питающих газов. Серу в форме сернистой кислоты, Н₂80₃ или ПН₄Н80₃ или (ЫН₄)₂80₃ можно примешивать к среде до доставки питательной среды в биореактор. Это повышает эффективность ферментации, устраняя необходимость в насосной системе и контуре управления, необходимых для постоянного добавления Н₂3 в предыдущих системах.

Кроме того, было установлено, что применение сернистой кислоты, Н₂80₃ или ПН₄Н80₃ или (ΝΠ·ι)₂δ0₃ в качестве источника серы устраняет необходимость отделения раствора от других компонентов среды. При рН 6 раствор близок к нейтральному, растворы бесцветны и прозрачны и не выделяют газов, что существенно облегчает их хранение. Еще одним преимуществом является то, что бисульфиты ΝΠ₄ ⁺ и Να' (водородсодержащие соли сернистой кислоты) очень легко растворяются в растворе.

Было установлено, что сернистая кислота является токсичной для большинства микроорганизмов. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что в случае регулирования скорости добавления сернистой кислоты в ферментационный бульон культура микроорганизмов способна использовать сернистую кислоту в качестве источника серы без ущерба для роста и производства культуры.

Авторы настоящего изобретения определили, что чрезмерная перегрузка культуры сернистой кислотой является вредной и может вызывать гибель культуры. Чтобы преодолеть эту проблему, сернистую кислоту добавляют к ферментации постепенно. В некоторых вариантах реализации изобретения сернистую кислоту добавляют в процессе ферментации непрерывно по каплям. В связи с токсичностью сернистой кислоты в высокой концентрации необходимо контролировать количество сернистой кислоты, доставляемой к культуре, и регулировать поток кислоты в биореактор, если количество сернистой кислоты, доступной для культуры, поднимается выше или опускается ниже заданного диапазона.

Источник серы в виде сернистой кислоты быстро расходуется культурой микроорганизмов. Превращение сернистой кислоты культурой микроорганизмов приводит к получению Н₂3, который выделяется в свободное пространство биореактора. Скорость потока сернистой кислоты, доставляемой в биореактор, можно контролировать путем наблюдения за концентрацией Н₂3 в свободном пространстве биореактора. Высокие уровни Н₂3 в свободном пространстве свидетельствуют о высокой концентрации сернистой кислоты в жидкой питательной среде. Учитывая токсичность сернистой кислоты при высоких концентрациях, желательно контролировать концентрацию сернистой кислоты в жидкой питательной среде. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения было обнаружено, что желательно поддерживать концентрацию Н₂3 в свободном пространстве на уровне менее 500 ррт, или менее чем 300 ррт, или менее чем 200 ррт, или менее чем 150 ррт, или менее чем 100 ррт, или менее чем 80 ррт, или менее чем 50 ррт. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрацию Н₂3 в свободном пространстве поддерживают на уровне примерно 100 ррт. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрацию Н₂3 в свободном пространстве поддерживают в пределах от примерно 10 до примерно 100 ррт. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрацию Н₂3 в свободном пространстве поддерживают в пределах от 60 до 100 ррт. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрацию Н₂8 в свободном пространстве поддерживают в пределах от примерно 70 до примерно 90 ррт.

Г аз 30₂ представляет собой побочный продукт угольных электростанций, и он является причиной экологических проблем, а именно кислотных дождей. В настоящее время угольным электростанциям приходится фильтровать свои серные выбросы, появились соглашения об уменьшении упомянутого загрязнения. Способность С. аи1ое1Ьаподепит использовать 30₂ обеспечивает улавливание и использование отходов.

Биореактор

Ферментацию можно проводить в любом подходящем биореакторе, таком как проточный реактор с мешалкой (С8ТК), неподвижном реакторе для клеток, газлифтовом реакторе, в барботажной реакторной колоне (ВСК), мембранном реакторе, таком как мембранный биореактор с системой полых волокон (НРМВК) или реактор с орошаемым слоем (ТВК). Кроме того, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения биореактор может содержать первый реактор, реактор роста, в котором культивируют микроорганизмы, и второй реактор, ферментационный, в который можно подавать ферментационный бульон из реактора роста и в котором можно получать большинство продуктов ферментации (например, этанол и ацетат). Биореактор согласно настоящему изобретению выполнен с возможностью приема субстрата, содержащего С0 и/или Н₂.

Субстрат, содержащий СО и/или Н₂

Субстрат, содержащий С0 и/или Н₂, улавливают или извлекают из процесса с использованием любого подходящего способа. В зависимости от состава субстрата, содержащего С0 и/или Н₂, также может

- 5 030282

быть желательным удалить любые нежелательные примеси, такие как частицы пыли, перед его введением в процесс ферментации. Например, субстрат можно фильтровать или очищать с использованием известных способов.

Субстрат, содержащий СО, предпочтительно газообразный субстрат, можно получать в виде побочного продукта любой стадии процесса парового риформинга. Эти стадии включают стадию парового риформинга, стадию \Υίίδ и стадию ΡδΆ, описанные в настоящем документе.

Обычно СО добавляют к реакции ферментации в газообразном состоянии. Тем не менее, способы согласно настоящему изобретению не ограничиваются добавлением субстрата в этом состоянии. Например, монооксид углерода может быть обеспечен в виде жидкости. Например, жидкость может быть насыщена газом, содержащим монооксид углерода, и эту жидкость добавляют в биореактор. Это может быть достигнуто с использованием стандартной методологии. Например, для этой цели можно использовать генератор микропузырькой дисперсии (Непзшзак е1. а1., 8са1е-ир о£ ш1сгоЬиЬЫе Шзрегзюп депега1ог £ог аегоЫс ГеппепКШоп; ЛррНеб Вюсйеш1з1ту апб Вю1есйпо1оду Уо1ише 101, ХнтЬег 3/Ос1оЬег, 2002). При этом термин "газовый поток" при использовании в настоящем документе также охватывает другие формы транспортировки газообразные компоненты этого потока, такие как метод насыщенной жидкости, описанный выше.

Составы газов

Субстрат, содержащий СО, может содержать любую долю СО, например, по меньшей мере от примерно 20 до примерно 100% СО по объему, от 40 до 95% СО по объему, от 40 до 60% СО по объему и от 45 до 55% СО по объему. В определенных вариантах реализации изобретения субстрат содержит примерно 25%, или примерно 30%, или примерно 35%, или примерно 40%, или примерно 45%, или примерно 50% СО, или примерно 55% СО, или примерно 60% СО по объему. Субстраты, имеющие более низкие концентрации СО, такую как 2%, также можно использовать, в частности, когда также присутствуют Н₂ и СО₂.

Присутствие Н₂ не должно причинять вред образованию углеводородных продуктов путем ферментации. В определенных вариантах реализации изобретения присутствие водорода приводит к улучшению общей эффективности производства спирта. Например, в определенных вариантах реализации изобретения субстрат может содержать Н₂:СО в соотношении приблизительно 2:1 или 1:1 или 1:2. В других вариантах реализации изобретения субстрат, содержащий СО, содержит менее чем примерно 30% Н₂, или менее чем 27% Н₂, или менее чем 20 % Н₂, или менее чем 10% Н₂, или более низкие концентрации Н₂, например, менее чем 5%, или менее чем 4%, или менее чем 3%, или менее чем 2%, или менее чем 1%, или по существу не содержит водорода. В других вариантах реализации изобретения субстрат, содержащий СО, содержит более 50% Н₂, или более чем 60% Н₂, или более чем 70% Н₂, или более чем 80% Н₂, или более чем 90% Н₂.

Субстрат может также содержать некоторое количество СО₂, например, такое как от примерно 1 до примерно 80% СО₂ по объему или от 1 до примерно 30% СО₂ по объему.

Смешивание потоков

Может быть желательным смешивать поток преобразованного субстрата, содержащий СО и Н₂, с одним или более последующими потоками с целью повышения эффективности, производства спирта и/или общего захвата углерода реакции ферментации. Не желая быть связанными теорией, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения карбоксидотрофные бактерии преобразуют СО в этанол в соответствии со следующей схемой:

6СО + ЗН₂О С₂Н₅ОН + 4СО₂

Однако в присутствии Н₂ в целом преобразование может быть следующим:

6СО + 12Н₂ ЗС₂Н₅ОН + ЗН₂О

Таким образом, потоки с высоким содержанием СО можно смешивать с потоками преобразованного субстрата, содержащими СО и Н₂, для увеличения соотношения СО:Н₂ для оптимизации эффективности ферментации. В качестве примера потоки промышленных отходов, такие как отходящий газ от сталелитейного завода, имеют высокое содержание СО, но содержат минимальное количество Н₂ или не содержат его совсем. По существу, желательно смешать один или более потоков, содержащих СО и Н₂, с потоками отходов, содержащими СО, до доставки смешанного потока субстрата в ферментер. Общая эффективность, продуктивность по спирту и/или общий захват углерода в процессе ферментации будет зависеть от стехиометрии СО и Н₂ в смешанном потоке. Тем не менее, в определенных вариантах реализации изобретения смешанный поток может по существу включать СО и Н₂ в следующих мольных соотношениях: 20:1, 10:1, 5:1, 3:1,2:1, 1:1 или 1:2.

Кроме того, может быть желательным обеспечение СО и Н₂ в определенных соотношениях на различных этапах процесса ферментации. Например, потоки субстрата с относительно высоким содержанием Н₂ (таким, как 1:2 СО:Н₂) можно доставлять на этап ферментации при запуске установки и/или на стадиях быстрого роста микроорганизмов. Однако когда фаза роста замедляется таким образом, что культуру поддерживают при по существу устойчивой плотности микроорганизмов, содержание СО можно увеличивать (например, по меньшей мере 1:1 или 2:1 или выше, где концентрация Н₂ может быть больше или равной нулю).

- 6 030282

Смешивание потоков может также иметь дополнительные преимущества, особенно в тех случаях, когда поток отходов, содержащий СО, имеет прерывистый характер. Например, прерывистый поток отходов, содержащий СО, можно смешивать с по существу непрерывным потоком преобразованного субстрата, содержащим СО и Н₂, и доставлять в ферментер. В определенных вариантах реализации настоящего изобретения состав и скорость потока, по существу, непрерывного смешанного потока можно изменять в соответствии с прерывистым потоком для того, чтобы поддерживать предоставление потока субстрата, по существу, постоянных состава и скорости потока в ферментер.

Ферментация

Известны процессы производства этанола и других спиртов из газообразных субстратов. Примерные процессы включают те, которые описаны, например, в следующих документах: АО 2007/117157, АО2008/115080, АО2009/022925, АО2009/064200, И8 6340581, И8 6136577, И8 5593886, И8 5807722 и И8 5821111, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки.

Микроорганизмы

В различных вариантах реализации изобретения ферментацию осуществляют с использованием культуры из одного или более штаммов карбоксидотрофных бактерий. В различных вариантах реализации изобретения карбоксидотрофные бактерии выбирают из Мооге11а, С1ок1пбшт, Киттососсик, Асе!оЪас!егшт, ЕиЪас!етшт, Ви1уг1Ъас!етшт, ОхоЬас1ег, МеШапокагапа, Ме!йапокатсша и Эеки1ГоЮтаси1ит. Известен ряд анаэробных бактерий, способных выполнять ферментацию СО в спирты, в том числе нбутанол и этанол, и в уксусную кислоту, и пригодных для применения в способе по настоящему изобретению. Примеры таких бактерий, которые являются подходящими для применения согласно настоящему изобретению, включают бактерии рода С1ок1пбшт, такие как штаммы С’1ок1пбшт ЦипдбаЫн, в том числе описанные в АО 00/68407, ЕР 117309, патентах США №№ 5173429, 5593886 и 6368819, АО 98/00558 и АО 02/08438, С1ок1пбшт сатЪохуфуотапк (Ьюи е! а1., 1п!етпа!юпа1 1оитпа1 оГ 8ук!етабс апб Еуо1и1юпату МютоЪю1оду 33: рр. 2085-2091), С1ок1пбшт тадкбаШ (АО/2008/028055) и ОокИабшт аи!ое1йаподепит (ЛЬгии е! а1., АгсЫуек оГ МютоЪю1оду 161: рр. 345-351). Другие подходящие бактерии включают бактерии рода Мооге11а, в том числе Мооге11а кр НИС22-1, (8ака1 е! а1., Вю!есЬпо1оду Ьейеге 29: рр. 1607-1612), и бактерии рода СаЛохубоШеттик (8уеШсЬпу, У.А., 8око1оуа, Т.С. е! а1. (1991), 8ук!етабс апб АррНеб МютоЪю1оду 14: 254-260). Другие примеры включают Мооге11а !йеттоасеНса, Мооге11а !йегтоаи!о!горЫса, Киттососсик ргобис!ик, Асе!оЪас!егшт \уообн„ ЕиЪас!етшт йтокит, Ви1уНЪас!еНит те!Ьу1о1торЫсит, ОхоЪас!ег рГептдн, МеШапокагапа Ъагкеп, Ме!йапокатста асе!Котапк, Эеки1Го1отаси1ит ки/пейоун (81тра е! а1. СННса1 Ре\ае\ук ш Вю!есЬпо1оду, 2006, уо1. 26. рр. 41-65). Кроме того, следует понимать, что другие ацетогенные анаэробные бактерии можно применять в настоящем изобретении, как должно быть понятно специалисту в данной области техники. Кроме того, должно быть понятно, что изобретение можно применять к смешанной культуре двух или более бактерий.

В одном варианте реализации изобретения микроорганизм выбран из группы ацетогенных карбоксидотрофных организмов, включающей виды С1ок1пбшт аи!ое!Ьаподепит, С1ок1пбшт ЦипдбаЫн, С1окНзбшт гадкбаШ, С1ок1пбшт сагЪох1бтогапк, ОоЧпбшт бгакек С1ок1Нбшт кса!о1одепек, С1ок1Нбшт асеНсит, С1ок1пбшт ГогтюоасеНсит, С1ок1Нбшт тадпит, Асе!оЪас!егшт теообн, А1каНЪаси1ит ЪассЬи, Мооге11а ШегтоасеНса, 8роготика оуа!е, Ви1уНЪас!еНит те1йу1о!торЫсит, В1аиНа ргобис!а, ЕиЪас!егшт Нтокит, ТйегтоапаетоЪас!ег Κίυνί.

Эти карбоксидотрофные ацетогены определены по их способности использовать и расти хемоавтотрофным способом на газообразных одноуглеродных (С1) источниках, таких как монооксид углерода (СО) и диоксид углерода (СО₂) с монооксидом углерода (СО) и/или водород (Н₂) в качестве источника энергии в анаэробных условиях, в которых происходит образование ацетила-КоА, ацетата и других продуктов. Они имеют один и тот же способ ферментации, метаболический путь Вуда-Льюнгдаля или восстановительный путь ацетила-КоА, и определены присутствием набора ферментов, состоящего из дегидрогеназы монооксида углерода (СОЭН), гидрогеназы, формиатдегидрогеназы, формил-тетрагидрофолатсинтетазы, метилен-тетрагидрофолат-дегидрогеназы, формил-тетрагидрофолат-циклогидролазы, метилен-тетрагидрофолат-редуктазы и дегидрогеназы монооксида углерода/синтазы ацетил-КоА (СОЭН/АС8), сочетание которых характерно и уникально для данного типа бактерий (Этаке, Кике1, Ма!!Ыек, Аооб, & Ь-ЩпдбаЫ, 2006). В отличие от хемогетеротрофного роста бактерий, ферментирующих сахар, которые преобразуют субстрат в биомассу, вторичные метаболиты и пируват, из которых образуются продукты (либо через ацетил-КоА или непосредственно), в ацетогенах субстрат направляется непосредственно в ацетил-КоА, из которого образуются продукты, биомасса и вторичные метаболиты.

В одном варианте реализации изобретения микроорганизм выбирают из кластера карбоксидотрофных клостридий, включающего виды С. аи!ое!Ьаподепит, С. ЦипдбаЫй и "С. тадкбаШ" и относящиеся к ним изоляты. Они включают, но не ограничиваются ими, штаммы С. аи!ое!Ьаподепит 6А!-1^Т (Э8М10061) (АЪпш, Nаνеаи, & Иупк, 1994), С. аи!ое1йаподепит ЬВ8 1560 (Э8М19630) (АО/2009/064200), С. аи!ое!йаподепит ЬВ81561 (П8М23693), С. ЦипдбаЫи РЕТС^Т Щ8М13528 = АТСС 55383) (Таппег, МШет, & Уапд, 1993), С. ЦипдбаЫи ЕК1-2 (АТСС 55380) (патент США 5593886), С. ЦипдбаЫН С-01 (АТСС 55988) (патент США 6368819), С. ЦипдбаЫи 0-52 (АТСС 55989) (патент США 6368819) или "С. тадкбаШ Р11^Т "(АТСС ВАА-622) (АО 2008/028055) и относящиеся к ним изоляты, такие как "С. соккаШ" (патент США

- 7 030282

2011/0229947), и их мутантные штаммы, такие как С. ЦиидбаЫп ОТА-1 (Тиабо-Асеуебо О. Ртобисбои оГ ВюеШаио1 Ггот 8уи!кек1к Оак Икшд С1окйтбшт ЦипдбаЫи. ΡΙιΌ ШеШк, ЫопЬ СатоИиа 8!а!е ИтуегеНу, 2010).

Эти штаммы образуют субкластер в рамках кластера I рРНК клостридий (СоШик е! а1., 1994), имеющего по меньшей мере 99% идентичность на уровне гена рРНК 168, несмотря на то, что представляют собой различные виды, как определено экспериментами по реассоциации ДНК-ДНК и ДНКдактилоскопии (АО 2008/028055, патент США 2011/0229947).

Штаммы этого кластера определены общими характеристиками, имеют подобные генотип и фенотип, и все они имеют один и тот же способ сохранения энергии и ферментативного метаболизма. Штаммы этого кластера не имеют цитохромов и сохраняют энергию с помощью комплекса КиТ

Все штаммы этого кластера имеют размер генома около 4,2 МВР (Корке е! а1., 2010) и состав ОС около 32 мол.% (АЪбт е! а1., 1994; Корке е! а1., 2010; Таииег е! а1., 1993) (АО 2008/028055; патент США 2011/0229947), и консервативные существенные опероны ключевых генов, кодирующие ферменты пути Вуда-Льюнгдаля (дегидрогеназа монооксида углерода, формил-тетрагидрофолат синтетаза, метилентетрагидрофолат-дегидрогеназа, формил-тетрагидрофолат циклогидролаза, метилен-тетрагидрофолатредуктаза, и дегидрогеназа монооксида углерода/синтаза ацетил-КоА), гидрогеназа, формиатдегидрогеназа, комплекс КиТ (гпГСЭОЕАВ). пируват: ферредоксин оксидоредуктаза, альдегид:ферредоксин оксидоредуктаза (Корке е! а1., 2010, 2011). Структура и количество генов метаболического пути ВудаЛьюнгдаля, ответственных за поглощение газа, как было установлено, одинаковы во всех видах, несмотря на различия в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях (Корке е! а1., 2011).

Все штаммы имеют аналогичную морфологию и размер (логарифмически растущие клетки находятся между 0,5-0,7х3-5 мкм), мезофильны (оптимальная температура роста между 30-37°С) и строго анаэробны (АЪпт е! а1., 1994; Таииег е! а1., 1993) (АО 2008/028055). Более того, все они имеют те же основные филогенетические черты, такие же одинаковые диапазоны рН (рН 4-7,5 с оптимальным начальным рН 5,5-6), сильный автотрофный рост на газах, содержащих СО, с аналогичными темпами роста, и метаболический профиль с этанолом и уксусной кислотой в качестве основного конечного продукта ферментации, с небольшими количествами 2,3-бутандиола и молочной кислоты, образованных при определенных условиях (АЪпт е! а1., 1994; Корке е! а1., 2011; Таииег е! а1., 1993) (АО 2008/028055). Получение индола наблюдалось у всех видов. Тем не менее, виды дифференцируют по использованию субстрата из различных Сахаров (например, рамнозы, арабинозы), кислот (например, глюконата, цитрата), аминокислот (например, аргинина, гистидина) или других субстратов (например, бетаина, бутанола). Было обнаружено, что некоторые из видов являются ауксотрофами по отношению к некоторым витаминам (например, тиамину, биотину), в то время, как другие ими не являются.

По этой причине описанные черты не специфичны для одного организма, такого как С. аи!ое!каиодеиит или С. ЦиидбайШ, а скорее являются общими чертами для карбоксидотрофных, синтезирующих этанол клостридий. Таким образом, ожидается, что изобретение будет работать со всеми этими штаммами, хотя могут быть различия в производительности.

В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм выбран из группы, включающей С1окйтбшт аи!ое!Ьаиодеиит, С1окйтбшт ЦцидбаЫй и С1ок!пбшт гадкба1еЕ В одном варианте реализации изобретения группа также включает С1ок1пбшт соккаШ. В одном определенном варианте реализации изобретения родительский микроорганизм представляет собой С1ок1пбшт аи!оеШаиодеиит Ό8Μ23693.

Один типичный микроорганизм, пригодный для применения в настоящем изобретении, представляет собой С1ок!пбшт аи!оеШаиодеиит. В одном варианте реализации изобретения С1ок!г1б1ит аи!ое1каиодеиит представляет собой С1окйтбшт аи!ое!Ьаиодеиит, имеющий идентифицирующие характеристики штамма, депонированного в ресурсном центре биологического материала Германии (ΌδΜΖ) с идентификационным депозитным номером 23693. В других вариантах реализации изобретения С1ок1г1б1ит аи!ое!каиодеиит представляет собой С1ок!г1б1ит аи!оеШаиодеиит, имеющий идентифицирующие характеристики депозита ΌδΜΖ с депозитным номером ΌδΜΖ 10061 или ΌδΜΖ 19630. Эти штаммы имеют особую устойчивость к изменению состава субстрата, в частности Н₂ и СО, и как таковые особенно хорошо подходят для использования в сочетании с процессом парового риформинга.

Культивирование бактерий, используемых в способах по настоящему изобретению, можно проводить с применением любого количества способов, известных в данной области техники для культивирования и ферментации субстратов с помощью анаэробных бактерий. В качестве примера можно применять процессы с использованием газообразных субстратов для ферментации, которые в целом описаны в следующих статьях: (ί) К. Т. К1аккои, е! а1. (1991). Вютеас!отк Гог куиШекге дак Геттейабоик текоитсек. СоикетуаНои аиб Кесусйид, 5; 145-165; (ίί) К. Т. К1аккои, е! а1. (1991). Вютеас!от беыди Гог куиШекге дак Геттеи!а!юи8. Рие1. 70. 605-614; (ίίί) К. Т. К1аккои, е! а1. (1992). Вюсоиуеткюи оГ куиШекге дак ш!о йсцйб ог дакеоик Гие1к. Еи/уте аиб Μ^с^οЪ^а1 Тесйио1оду. 14; 602-608; (ίν) ί. Ь. Уеда, е! а1. (1989). 8!ибу оГ Оакеоик 8иЪк!га!е Реттеи!а!юи: СагЪои Μοηοx^бе Со^еткюи !о Асе!а!е. 2. Соибииоик Си1!ите. Вю!есй. Вюеид. 34. 6. 785-793; (ν) ί. Ь. Уеда, е! а1. (1989). 8!ибу оГ дакеоик киЪк!га!е Геттеи!а!юик: СагЪои тоиох1бе соиуегкюи !о асе!а!е. 1. Ва!сй си1!иге. Вю!есйио1оду аиб Вюеидшеегтд. 34. 6. 774-784; (νί) ί. Ь. Уеда, е! а1. (1990). Эеыди оГ Вюгеас!огк Гог Соа1 8уи1йек1к Оак Реттейайоик. Кекоигсек, Соикегеабои аиб Кесусйид. 3. 149- 8 030282

160; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Условия ферментации

Следует иметь в виду, что для процесса роста бактерий и осуществления ферментации СО в углеводород в дополнение к субстрату, содержащему СО, будет необходима подача в биореактор жидкой питательной среды. Питательная среда будет содержать витамины и минералы, достаточные для роста используемого микроорганизма. Анаэробные среды, пригодные для получения углеводородных продуктов путем ферментации с использованием СО в качестве единственного источника углерода, известны в данной области техники. Например, подходящие среды описаны в патентах США № 5173429 и 5593886 и АО 02/08438, АО 2007/115157 и АО 2008/115080, упомянутых выше.

Ферментацию желательно проводить в соответствующих условиях для осуществления желаемой ферментации (например, СО в этанол). Условия реакции, которые следует учитывать, включают давление, температуру, скорость потока газа, скорость потока жидкости, рН среды, окислительновосстановительный потенциал среды, скорость перемешивания (при использовании проточного реактора с мешалкой), уровень инокулята, максимальные концентрации газового субстрата, чтобы гарантировать, что СО в жидкой фазе не станет ограничивающим, и максимальные концентрации продукта, чтобы избежать ингибирования продукта. Подходящие условия описаны в АО 02/08438, АО 07/117157 и АО 08/115080.

Оптимальные условия реакции будут частично зависеть от конкретного используемого микроорганизма. Однако в общем предпочтительно, чтобы ферментация была выполнена при давлении более высоком, чем давление окружающей среды. Работа при повышенных давлениях позволяет значительно увеличить скорость передачи СО из газовой фазы в жидкую фазу, где он может быть поглощен микроорганизмами в качестве источника углерода для получения углеводородных продуктов. Это в свою очередь означает, что время пребывания (определяется как объем жидкости в биореакторе, разделенный на скорость входного потока газа) можно уменьшить в случае, когда биореакторы поддерживают при повышенном давлении, а не атмосферном давлении. Кроме того, поскольку данная скорость преобразования СО в углеводород частично представляет собой функцию от времени пребывания субстрата, и в свою очередь достижение желаемого времени пребывания диктует необходимый объем биореактора, использование систем под давлением может значительно снизить объем требуемого биореактора, и, следовательно, снизить капитальные затраты на оборудование для ферментации. В соответствии с примерами, приведенными в патенте США 5593886, объем реактора может быть уменьшен в линейной пропорции к увеличению рабочего давления реактора, т.е. биореакторы с рабочим давлением 10 атм должны составлять только одну десятую объема тех, которые работают при давлении 1 атм.

Преимущества проведения ферментации газа в углеводород при повышенном давлении также были описаны в других источниках. Например, в АО 02/08438 описана ферментация газа в этанол, выполняемая при давлениях 2,1 и 5,3 атм, дающая продуктивность по этанолу 150 и 369 г/л/день соответственно. Тем не менее, пример ферментации, выполненной с использованием аналогичной среды и составом газа, вводимого при атмосферном давлении, показал получение от 10 до 20 раз меньшего количества этанола на литр в день.

Желательно также, чтобы скорость введения газообразного субстрата, содержащего СО, гарантировала, что концентрация СО в жидкой фазе не станет ограничивающей. Это обусловлено тем, что следствием ограниченных по СО условий может быть расходование культурой углеводородного продукта.

Продукты ферментации

Способы согласно изобретению можно применять для получения любого из различных углеводородных продуктов. Они включают спирты, кислоты и/или диолы. Более конкретно, изобретение можно применять к ферментации с получением ацетата, бутирата, пропионата, капроата, этанола, пропанола, бутанола, 2,3-бутандиола, изопропанола, пропилена, бутадиена, изо-бутилена и этилена. Эти и другие продукты могут иметь значение для целого ряда других процессов, таких как производство пластмасс, фармацевтических препаратов и агрохимикатов. В определенном варианте реализации изобретения продукт ферментации применяют для производства углеводородов бензинового ряда (примерно 8 атомов углерода), дизельных углеводородов (примерно 12 атомов углерода) или углеводородов реактивного топлива (примерно 12 атомов углерода).

Изобретение также предусматривает, что по меньшей мере часть углеводородного продукта, полученного в результате ферментации, повторно используют в процессе парового риформинга. Это можно осуществить, поскольку углеводороды, отличные от СН₄, способны вступать в реакцию с паром над катализатором с образованием Н₂ и СО. В определенном варианте реализации изобретения этанол повторно используют для применения в качестве сырья для процесса парового риформинга. В еще одном варианте реализации изобретения углеводородное сырье и/или продукт пропускают через установку предварительного риформинга перед использованием в процессе парового риформинга. Прохождение через установку предварительного риформинга частично завершает этап парового риформинга процесса парового риформинга, что может повысить эффективность производства водорода и уменьшить требуемую емкость печи парового риформинга.

Способы согласно настоящему изобретению также можно применять к аэробной ферментации, а

- 9 030282

также к анаэробной или аэробной ферментации других продуктов, в том числе, но не ограничиваясь, изопропанола.

Извлечение продукта

Продукты реакции ферментации можно извлекать с использованием известных методов. Примерные способы включают те, которые описаны в ΥΘ 07/117157, ΥΘ 08/115080, υδ 6340581, υδ 6136577, И8 5593886, υδ 5807722 и υδ 5821111. Тем не менее, коротко и в качестве примера, этанол можно извлекать из ферментационного бульона способами, например, такими как фракционная перегонка или испарение, и экстрактивная ферментация.

Перегонка этанола из ферментационного бульона дает азеотропную смесь этанола и воды (т.е. 95% этанола и 5% воды). Далее можно получить безводный этанол, который также хорошо известен в данной области техники, при применении технологии дегидратации этанола молекулярными ситами.

Процедуры экстрактивной ферментации рожения предусматривают использование смешивающегося с водой растворителя, который имеет низкую для микроорганизмов ферментации токсичность, для извлечения этанола из разбавленного ферментативного бульона. Например, олеиловый спирт представляет собой растворитель, который может быть использован в процессе экстракции этого типа. Олеиловый спирт непрерывно вводят в ферментер, после чего этот растворитель поднимается с образованием слоя в верхней части ферментера, который непрерывно экстрагируют и подают через центрифугу. Вода и клетки затем легко отделяют от олеилового спирта и возвращают в ферментер, в то время как растворитель, насыщенный этанолом, подают в блок мгновенного испарения. Большую часть этанола испаряют и конденсируют, в то время как олеиловый спирт является нелетучим и его извлекают для повторного использования в процессе ферментации.

Ацетат, который можно получать как побочный продукт в реакции ферментации, также можно извлекать из ферментационного бульона с использованием способов, известных в данной области техники.

Например, можно использовать систему адсорбции на основе фильтра с активированным углем. В этом случае предпочтительно сначала удалить клетки микроорганизмов из ферментационного бульона с использованием подходящего блока разделения. Многочисленные способы генерирования безклеточного ферментационного бульона на основе фильтрации для извлечения продукта известны в данной области техники. Затем безклеточный фильтрат, содержащий этанол и ацетат, пропускают через колонку, содержащую активированный уголь, чтобы адсорбировать ацетат. Ацетат в форме кислоты (уксусная кислота), в отличии от солевой формы (ацетата), легче адсорбируется на активированном угле. Поэтому предпочтительно снижать рН ферментационного бульона до менее чем примерно 3, прежде чем он проходит через колонку активированного угля, для преобразования большей части ацетата в форму уксусной кислоты.

Уксусную кислоту, адсорбированную на активированном угле, можно извлекать элюированием с помощью способов, известных в данной области техники. Например, этанол можно применять для элюирования связанного ацетата. В некоторых вариантах реализации изобретения сам этанол, производимый в процессе ферментации, можно применять для элюирования ацетата. Поскольку температура кипения этанола составляет 78,8°С, а температура кипения уксусной кислоты составляет 107°С, этанол и ацетат можно легко отделять друг от друга с использованием способа, основанного на летучести, например, способом дистилляции.

Другие методы для извлечения ацетата из ферментационного бульона также известны в данной области техники и могут быть использованы. Например, патенты США № 6368819 и 6753170 описывают систему растворителя и сорастворителя, которая может быть использована для экстракции уксусной кислоты из ферментационных бульонов. Как и в примере системы на основе олеилового спирта, описанной для экстрактивной ферментации этанола, системы, описанные в патенте США № 6368819 и 6753170, описывают несмешивающийся с водой растворитель/сорастворитель, который может быть смешан с ферментационным бульоном в присутствии либо в отсутствие ферментированных микроорганизмов в целях экстрагирования продукта уксусной кислоты. Растворитель/сорастворитель, содержащий продукт уксусной кислоты, затем отделяют от бульона путем дистилляции. Затем можно применять второй этап дистилляции для очистки уксусной кислоты от системы растворителя/сорастворителя.

Продукты ферментационной реакции (например, этанол и ацетат) можно извлекать из ферментационного бульона путем непрерывного удаления части бульона из ферментационного биореактора, с отделением клеток микроорганизмов из бульона (обычно фильтрацией) и извлечением из бульона одного или более продуктов одновременно или последовательно. В случае этанола его легко можно извлекать путем перегонки, а ацетат можно извлекать путем адсорбции на активированном угле с использованием способов, описанных выше. Предпочтительно отделенные клетки микроорганизмов возвращают в ферментационный биореактор. Безклеточный фильтрат, остающийся после удаления этанола и ацетата, предпочтительно также возвращают в ферментационный биореактор. Дополнительные питательные вещества (такие как витамины группы В) можно добавлять к безклеточному фильтрату для восполнения питательной среды прежде, чем возвращать в биореактор. Кроме того, если рН бульона регулировали так, как описано выше, для улучшения адсорбции уксусной кислоты на активированном угле рН необходимо повторно довести до рН, подобного рН бульона в ферментационном биореакторе, перед возвратом в

- 10 030282

биореактор.

Биомасса, извлеченная из биореактора, может подвергнуться анаэробному разложению с получением продукта биомассы, предпочтительно метана. Этот продукт биомассы можно применять в качестве исходного сырья для процесса парового риформинга или применять для получения дополнительного тепла для управления одной или более реакциями, определенными в данном документе.

Примеры

Материалы и способы для запуска.

Среды: __

Компонент среды биореактора	Концентрация на 1,0 л среды
МёС12.6Н2О	0,1 г
СаС12.2Н2О	0,15 г
КС1	0,15 г
ИаС1	0,12 г
85% НЗРО4	0,38 мл
Смесь металлов 1 (Ре Ο,ΙΜ, Νί 0,005М, Ζη 0,005М)	1 мл
Смесь металлов 2 (0.01 М В, Мп, Со, 5е, Мо)	0,2 мл
Раствор вольфрама 0,01 М	0,2 мл
Резазурин (2 г/л)	0,5 мл
Раствор витамина В (Ь803)	10 мл
Цистеин	2,5 §

- 11 030282

Компонент среды сывороточного сосуда	Концентрация на 1,0 л среды
М§С12.6Н2О	0,5 г
СаС12.2Н2О	0,37 г
КС1	0,15 г
ИаС1	0,12 г
85% НЗРО4	0,5 мл
СНзСООМ-Ц	1 г
Смесь металлов 1 (Ре Ο,ΙΜ, Νΐ 0,005М, Ζη 0,005М)	1 мл
Смесь металлов 2 (0,01 М В, Мп, Со, 5е, Мо)	0,2 мл
Раствор вольфрама 0,01 М	0,2 мл
Резазурин (2 г/л)	0,75 мл
Раствор витамина В (Ь803)	10 мл
Цистеин	0,5 г
Экстракт дрожжей	1 г

Раствор витамина В (ЬЗОЗ)	на л исходного раствора
Тиамин НС1	50 мг
Рибофлавин	50 мг
Никотиновая кислота	50 мг
Пантотеновая кислота	50 мг
Пиридоксин НС1	10 мг
Биотин	20 мг
Фолиевая кислота	20 мг
4-аминобензойная кислота	50 мг
Цианокобаламин	50 мг
Липоевая кислота	50 мг
Вода дистиллированная	до 1 л

- 12 030282

Смесь металлов 1	на л раствора
РеС12.4Н2О	19,35 г
№С12.6Н2О	1,19 г
Ζηα2	0,69 г
Смесь металлов 2	на л раствора
СоС12. 6Н2О	2,38 г
нво4	0,62 г
МпС12.4Н2О	1,98 г
ЫаМоО4.2Н2О	2,42 г
Ν&2δεΟ3	1,73 г
ИаАУО4.2Н2О	3.29

Ферментация в сывороточном сосуде

Инкубацию проводили путем инъекции 1 мл высушенного сублимацией исходного С1о§1пбшт аи1ое1йапо§епит в сывороточный анаэробный сосуд объемом 234 мл, содержащий 50 мл среды. Свободное пространство сывороточного сосуда продували КМС под давлением 30 р§г Его размещали на встряхивателе-инкубаторе при поддержании температуры 37°С. После двух дней инкубации, или когда оптическая плотность культуры достигала 0,2, его пересеяли в 8 сывороточных сосудов.

Ферментация в биореакторе - примеры 1 и 2

Среду получали путем смешивания всех ингредиентов в 5 л дистиллированной воды, за исключением раствора витамина В и цистеина. Внутрь подготовленного 10-литрового проточного реактора с мешалкой поместили 4,5 л раствора среды. Затем реактор стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 121°С. После обработки в автоклаве реактору давали остыть, выдерживали при температуре 37°С и делали анаэробным с помощью постоянного потока газа Ν₂ и перемешивании 200 об/мин. После остывания растворы витамина В и цистеина добавляли с помощью 0,2 мкм фильтрующих шприцов. рН раствора доводили и поддерживали при 5,3 с использованием 5 М раствора ΝΗ₄ΟΗ.

За два часа до инокуляции газ Ν₂ был переключен на КМС 100 мл/мин и среду в дальнейшем восстановили до -250 мВ, используя раствор 0,2 М Сг²⁺. Инокулировали с помощью 400 мл С1о§1пбшт аи1ое1йаподепит культуры сывороточного сосуда. Ферментацию начинали как периодический процесс, с аккуратным увеличением количества газа и продлением времени встряхивания. Через два дня после инокуляции культура становилась непрерывной, все еще при легком встряхивании, и, наконец, ее оставляли стабильной при 550 мл/мин КМС и перемешивании со скоростью 400 об/мин.

Ферментация в биореакторе - пример 3

Два 2-литровых реактора заполняли 1,5 л среды, содержащей все металлы, фосфорную кислоту, витамин В (как указано в таблицах выше). Среду затем дегазировали с помощью промышленного газа, имеющего следующий состав; приблизительно 50% СО, 20% СО2, 28% Ν₂ и 2% Н₂. Перед инокуляцией добавляли 0,12 М (ΝΗ₄)₂8Ο₃ (рН 6,0) со скоростью 0,2 мл/ч для доставки серы в среду. Далее окислительно-восстановительный потенциал ОВП (Л§/Л§С1 электрод) доводили до -200 мВ с помощью 0,2 М Сг²+ перед инокуляцией 200 мл культуры из непрерывно работающего инокулятора с биомассой примерно 2 г/л. рН, ОВП, поглощение газа и Н₂8 в свободном пространстве внимательно отслеживали в течение следующих часов для обеспечения успешного запуска. рН контролировали с помощью контроля оптимального снабжения культуры газом и дополнительно резервировали автоматическим контролем рН (в 5,0) при помощи 5М Ν^ΟΉ Первые 24 ч культура представляла собой периодический фермент и затем ее переводили в режим непрерывного, путем доставки среды (2 мМ №С1, 2 мМ КС1, 0,5 мМ М§С1₂, 1 мМ СаС12, витамины В, 5 мМ фосфорная кислота, смесь металлов) при скорости, необходимой для достижения степени разбавления между 2 и 3, и в то же время доставляли (Ν^)₂8Ο₃ и антивспениватель при соответствующих скоростях.

0,12М (ΝΚ|)₂8Ο₃ (рН до 6,0 с помощью концентрированной НС1) в качестве источника серы, скорость потока регулировали таким образом, что Н₂8 в свободном пространстве < 100 ррт.

Антивспениватель (поли(пропиленгликоль)-блок-поли(этиленгликоль)-блок-поли(пропиленгли- 13 030282

коль) (СА§ 9003-11-6) (10 мкл/ч).

Эксперимент в 1,5 л реакторе был проведен как в системе из 2 ферментеров. Оба реактора имели возможность вторичной использования клеток. Для вторичного использования клеток использовали картриджи из половолоконной мембраны с размером пор, составляющим 0,1 мкм. Когда реакторы соединены с системой из 2-х ферментеров, фильтрат, полученный при вторичном использовании клеток и отходов, передают непосредственно в ферментер ниже по потоку. Таким образом, отношение между фильтратом и отходом остается оценкой, основанной на набранных темпах потока.

Пример 1. Н₂§0₃ в качестве источника серы

Предпосылки.

Этот эксперимент проводили на стабильном, непрерывно работающем инокуляторе в однореакторной системе. Основная задача инокулятора состоит в предоставлении пускового инокулята для ферментации других биореакторов. Как таковой этот ферментер остается стабильным и не полностью насыщенным с низкими газоснабжением и встряхиванием. Инокулятор обычно запущен в течение примерно двух месяцев перед остановкой и перезапуском (для уменьшения риска загрязнения). Эксперименты проводили на культуре после двух месяцев непрерывного стабильного времени работы. Профили инокулятора отличаются от систем ферментации высокой производительности.

Целью для этих экспериментов было нахождение альтернативного источника серы для С.аи1ое1йаподетит и других карбоксидотрофных ацетогенных микроорганизмов. Было обнаружено, что С. аи1ое1йаподепит способна использовать источник серы из Ыа₂§ (либо раствор каплями прямо в ферментер, либо раствор каплями в закрытый контейнер, заполненный Н₃РО₄, и подача Н₂§, выделенного в ферментер). С. аи1ое1йаподепит также способна потреблять цистеин и выделять Н₂§ и в прошлом также была доказана эффективность §₈. Эти эксперименты сосредоточены на Н₂§0₃, поскольку по сравнению с известным источником серы (Ыа₂§ или цистеином) он имеет преимущества. Н₂§0₃ является токсичным для большинства микроорганизмов, таким образом, он может действовать в качестве дезинфицирующего средства, а также источника серы. Кроме того, газ §02 представляет собой побочный продукт угольных электростанций, вызывавший экологические проблемы в виде кислотных дождей. В настоящее время угольные электростанции должны фильтровать свои выбросы серы, появились международные договоры для уменьшения указанного загрязнения.

Способ

~0,6 М §0₂ в водном растворе было закачано в 10-литровый ферментер с помощью шприцевого насоса. Показателями эффективности были Н₂§ в свободном пространстве и поглощение Н₂ и СО. Действующий источник серы должен производить Н₂§ и давать стабильное поглощение Н₂ и СО. Поглощение Н₂ является ранним индикатором состояния здоровья микроорганизмов.

Результаты

Концентрация примерно в 0,6 М со скоростью закачки в 1 мл/ч дала чрезмерное количество Н₂§ в свободном пространстве (примерно 600 ррт). Чтобы уменьшить получение Н₂§, раствор разбавляли в 10 раз и скорость насоса доводили до достижения желаемого значения.

На фиг. 1 показаны поглощение водорода и выработка Н2§ в биореакторе.

При скорости прокачки, составляющей 2 мл/ч, культура почти не произвела Н₂§, и поглощение Н₂ было нестабильным и уменьшалось.

При скорости прокачки, составляющей 3 мл/ч, количество Н₂§ в свободном пространстве составляло примерно 60-70 ррт Н₂§. Когда скорость прокачки была увеличена до 3,5 мл/ч, количество Н₂§ колебалось от примерно 20 ррт Н₂§ почти до нуля. Поглощение Н₂ было очень стабильным. Увеличение скорости прокачки до 4 мл/ч привело к избыточному количеству Н₂§.

Пример 2. (ПН₄)Н§0₃ в качестве источника серы

Предпосылки.

Этот эксперимент был продолжением эксперимента с Н₂§0₃. Н₂§0₃ - очень кислотное вещество и в виде §0₂ в воде со своим текущим рН выделяет токсичный газ §0₂, который может вызвать проблемы со здоровьем и безопасностью. Отдельный эксперимент по хранению этого раствора в пакетах для внутривенного вливания (обычный способ подачи Ыа₂§ в ферментер) показал, что даже при том, что пакет не был поврежден, он был вспучен вследствие накопления газа §0₂.

Чтобы обеспечить более безопасный раствор, рН раствора §0₂ в воде (Н₂§0₃) доводили до 6 с использованием концентрированного ПН₄0Н, таким образом получали (ЯН₄)Н§0₃, который безопасен и практически не имеет запаха. Затем этот раствор был протестирован на инокуляторе.

Способ

Приблизительно 0,6 М §0₂ в водном растворе подвергали взаимодействию с 28% ПН₄0Н, чтобы довести рН до значения 6, и разбавляли в 10 раз. Затем раствор подавали в ферментер с помощью шприцевого насоса.

Результаты

На фиг. 2 показано поглощение Н₂ и уровни Н₂§ в биореакторе. Как показано на фиг. 2; скорость 4 мл/ч неразбавленного раствора обеспечила избыточное количество Н₂§. Скорость 4 мл/ч разбавленного раствора обеспечила примерно 80 ррт Н2§.

- 14 030282

Скорость 2 мл/ч 1/10 разбавленного раствора обеспечила минимальное количество Н₂§, однако поглощение Н₂ снизилось. Скорость 3 мл/ч 1/10 разбавленного раствора привела к снижению уровня Н₂§ и стабильному поглощению Н₂.

Пример 3. (ΝΗ₄)₂δΘ₃ в качестве источника серы.

Способ

(ΝΗ₄)₂δΘ₃ был использован в качестве источника серы в системе из двух ферментеров. 0,12 М (ΝΗ₄)₂δΘ₃ раствор получали и рН доводили до 6,0 с помощью концентрированной НС1. Этот раствор можно использовать при таких же скоростях, как и раствор 0,5 М Να₂δ. Дозирование регулировали поддержанием Н₂§ в свободном пространстве ниже 100 ррт. Более высокие концентрации Н₂§ в свободном пространстве свидетельствуют об уровнях §О₂ в ферментационном бульоне, которые потенциально могут повредить культуре. Табл. 2 и 3 показывают, как при более высоких концентрациях биомассы и более высоком значении коэффициента разведения и скоростей газа возрастает концентрация (ЫН₄)₂§О₃, необходимая для поддержания Н₂§ на заданном уровне. На момент инокуляции необходимо быть особенно осторожным, чтобы не добавить слишком большое количество (ИН₄)₂§О₃. Н₂§ в качестве индикатора доступен только после инокуляции. Н₂§ не будет присутствовать в свободном пространстве перед инокуляцией. С помощью этого эксперимента было показано, что оптимальная концентрация для (ИН₄)₂§О₃ составляла от 1 до 3,5 ммоль для непрерывной высокопроизводительной культуры, в зависимости от биомассы, потока газа и степени разбавления. В момент инокуляции концентрация должна иметь значение не менее 0,3 ммоль.

Результаты

(ИН₄)₂§О₃ добавляли к раствору при рН 6 для применения в качестве альтернативного источника серы. ЩН₄)₂§О₃ добавляли к ферментации с той же скоростью, как раствор 0,5 М Να₂8. В ходе эксперимента было показано, что желательно поддерживать концентрацию (ИН₄)₂§О₃ в растворе, так что количество Н₂§ в свободном пространстве реактора поддерживали при концентрации менее 100 ррт. Как показано на фиг. 3 и 4, ферментацию поддерживали в стабильном режиме используя (ИН₄)₂§О₃ в течение примерно 40 дней, демонстрируя эффективность (ИН₄)₂§О₃ в качестве альтернативного источника серы.

Стабильная непрерывная ферментация с использованием (ИН₄)₂§О₃ в качестве источника серы для микроорганизмов была продемонстрирована при поддержании концентрации (ЯН₄)₂§О₃ в ферментационном бульоне от 1 до 3,5 ммол и поддержании концентрации Н₂§ в свободном пространстве менее 100 ррт.

Изобретение описано в настоящем документе со ссылкой на конкретные предпочтительные варианты для того, чтобы дать читателю практиковать изобретение без излишнего экспериментирования. Тем не менее, специалисты с обычной квалификацией в данной области техники легко поймут, что многие из компонентов и параметров могут быть изменены или модифицированы в определенной степени или замещены известными эквивалентами без отступления от объема настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что такие модификации и эквиваленты включены в настоящий документ, как если бы были изложены по отдельности. Изобретение также включает все этапы, признаки, композиции и соединения, упомянутые или указанные в настоящем описании, индивидуально или вместе, и любая и все комбинации любых двух или более из указанных этапов или признаков.

Там, где была сделана ссылка в вышеприведенном описании к целым числам, имеющим известные эквиваленты, эти целые числа включены в настоящий документ, как если бы были изложены по отдельности.

Кроме того, наименования, заголовок или подобное предназначены для расширения понимания читателя настоящего документа и их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Полное раскрытие всех заявок, патентов и публикаций, цитируемых выше и ниже, если таковые имеются, включено в настоящий документ посредством ссылок.

Ссылка на любой предшествующий уровень техники в данном описании не является и не должна рассматриваться как подтверждение или любая другая форма предположения, что эта часть уровня техники является частью обычного уровня знания в данной области техники в любой стране мира.

Во всем данном описании и любых последующих пунктах формулы изобретения, если контекст не требует иного, слова "включает", "содержит" и т.п., должны быть истолкованы во включительном смысле, в противоположность к исключающему смыслу, то есть, в смысле "в том числе, но не ограничиваясь этим".

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ ферментации газообразного субстрата с использованием карбоксидотрофных микроорганизмов, включающий:

   а) подачу газообразного субстрата, содержащего СО, в биореактор, содержащий культуру одного или более карбоксидотрофных микроорганизмов в жидкой питательной среде, содержащей источник серы, выбранный из группы, содержащей §О₂, Н₂§О₃, №₂8₂О₄, δ₈, Ν;·ι₂δ. №-1Н8. цистеин, NΗ₄Η§О₃ или

   (МИАСС;

   - 15 030282

   b) анаэробную ферментацию субстрата с получением одного или более продуктов, выбранных из группы, включающей спирты, кислоты и их смеси;

   c) превращение источника серы в Н₂8, который выделяется в свободное пространство биореактора; ά) регулирование концентрации источника серы в жидкой питательной среде в зависимости от количества Н₂8, измеренного в свободном пространстве; и

   е) извлечение одного или более продуктов,

   где концентрацию Н₂8 в свободном пространстве поддерживают в пределах от 1 до 100 м.д.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что источник серы представляет собой сернистую кислоту.
3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что концентрацию сернистой кислоты в жидкой питательной среде поддерживают от 1 до 3,5 ммоль.
4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что один или более карбоксидотрофных микроорганизмов выбраны из группы, включающей С1озйтбшт аи1ое1йапо§епит, С1оз1пбшт ЦипдбаЫн, С1озйгбшт га§зба1ец С1озйгбшт созкаШ и С1оз1пбшт сагЬохуфуогапз.
5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что карбоксидотрофный микроорганизм представляет собой С1озйтбшт аиЮеДНапоцепит.
6. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что карбоксидотрофный микроорганизм представляет собой штамм С1озйтбшт аиЮеДНапоцепит, депонированный в ресурсном центре биологического материала Германии (Ώ8ΜΖ) с идентификационным депозитным номером 19630.
7. 7. Способ по п.4, отличающийся тем, что карбоксидотрофный микроорганизм представляет собой штамм С1озйтбшт аи1ое1йапо§епит, депонированный в ресурсном центре биологического материала Германии (Ώ8ΜΖ) с идентификационным депозитным номером 23693.
8. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что источник серы представляет собой побочный продукт промышленного процесса.
9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что источник серы представляет собой побочный продукт процесса производства угля.

   - 16 030282