KR20140146637A

KR20140146637A - 발효 방법

Info

Publication number: KR20140146637A
Application number: KR1020147030406A
Authority: KR
Inventors: 크리스토프 미할세; 프라나 해리안토
Original assignee: 란자테크 뉴질랜드 리미티드
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2014-12-26
Also published as: IN2014DN07980A; US20130260429A1; EP2831249A4; WO2013147621A1; EP2831249B1; CN104736715B; US8735115B2; ES2690380T3; EA201491785A1; PL2831249T3; EP2831249A1; KR102011540B1; CN104736715A; EA030282B1

Abstract

본 발명은 일반적으로 일산화탄소를 함유하는 기질의 미생물 발효에 의한 알코올 및 산과 같은 생성물의 미생물 성장 및 생성의 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 황이 발효의 하나 이상의 미생물에 이용 가능하도록, 액체 영양 배지에 대안적인 황원을 제공하는 것에 관한 것이다.

Description

발효 방법{A FERMENTATION METHOD}

본 발명은 일반적으로 미생물 발효에 의한 알코올 및 산과 같은 생성물의 미생물 성장 및 생성의 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 일산화탄소를 함유하는 기질의 미생물 발효에 의하여 알코올, 특히 에탄올의 제조하는 방법에 관한 것이다.

에탄올은 전세계에 걸쳐 주요한 수소 농후(hydrogen-rich) 액체 수송 연료가 빠르게 되고 있다. 2002년에 에탄올의 전세계 소비는 108억 갤론으로 추산되었다. 유럽, 일본, 미국 및 일부 개발 도상국가들에서 에탄올에 대한 관심의 증가로 인하여, 연료 에탄올 산업에 대한 세계 시장도 미래에 급격하게 증가할 것으로 예상된다.

예를 들면, 미국에서, 에탄올은 E10, 휘발유 중 에탄올의 10% 혼합물을 제조하는데 이용된다. E10 블렌드에서, 에탄올 성분은 산화제로서 작용하는데, 이는 연소 효율을 개선시키고 공기 오염물질의 생성을 감소시킨다. 브라질에서는, 에탄올은 휘발유 중에 블렌딩된 산화제로서, 또는 그 자체 순수 연료로서 모두 수송 연료 수요의 대략 30%를 충족시킨다. 또한, 유럽에서는, 온실 가스(GHG) 방출의 결과를 둘러싼 환경적 관심은 유럽 연합(EU)이 회원국들에게 바이오매스 유래 에탄올과 같은 지속 가능한 수송 연료의 소비에 대한 의무적인 목표를 설정하도록 유도해오고 있다.

연료 에탄올의 대부분은, 주요 탄소원으로서, 사탕수수로부터 추출된 수크로오스 또는 곡물 작물로부터 추출된 전분과 같은 작물 유래 탄수화물을 이용하는 전통적인 효모 기초 발효 공정을 통해 제조된다. 그러나, 이들 탄수화물 공급 원료의 비용은 인간 식품 또는 동물 사료로서 그 가치에 의하여 영향을 받기 하지만, 에탄올 제조를 위한 전분 또는 수크로오스-생산 작물의 경작은 모든 지형에 있어서 경제적으로 지속 가능하지 않다. 그러므로, 더 저렴하고/하거나 더 풍부한 탄소 자원을 연료 에탄올로 전환시키는 기술을 개발하는 것이 관심의 대상이 된다.

CO는 석탄 또는 오일 및 오일 유래 생성물과 같은 유기물의 불완전 연소의 주요한 자유 에너지 농후 부산물이다. 예를 들면, 호주 철강 산업은 매년 CO를 500,000 톤 넘게 생산하여 대기 중으로 방출하는 것으로 보고되고 있다.

촉매 공정은 주로 CO 및/또는 CO 및 수소(H₂)로 이루어진 가스를 다양한 연료 및 화학물질로 전환시키는데 이용될 수 있는 것으로 오랫동안 인식되어 오고 있다. 그러나, 미생물도 이러한 가스를 연료 및 화학물질로 전환시키는데 이용될 수 있다. 이러한 생물학적 공정은 일반적으로 화학적 반응보다 느리지만, 더 높은 특이성, 더 높은 수율, 더 낮은 에너지 비용 및 중독에 대한 더 높은 내성을 포함하여, 촉매 공정보다 더 나은 몇 가지 장점을 갖고 있다.

미생물이 CO를 자신의 유일한 탄소원으로서 이용하여 성장하는 성능은 1903년에 최초로 발견되었다. 이는 독립영양 성장의 아세틸 조효소 A(아세틸 CoA) 생화학적 경로(우즈-륭달(Woods-Ljungdahl) 경로 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸 CoA 합성효소(CODH/ACS) 경로라고도 알려져 있음)을 이용하는 미생물들의 특성이라는 것이 후에 알려졌다. 일산화탄소영양(carboxydotrophic) 미생물, 광합성 미생물, 메탄 생성 미생물 및 아세트산 생성 미생물을 포함한 혐기성 미생물의 대다수는 CO를 다양한 최종 산물, 즉 CO₂, H₂, 메탄, n-부탄올, 아세테이트 및 에탄올로 대사시키는 것으로 나타났다. 반면에 유일한 탄소원으로서 CO를 사용하면, 이러한 모든 미생물은 그러한 최종 생성물들 중 적어도 2종을 생성한다.

클로스트리듐 (Clostridium)속으로부터 유래된 것들과 같은 혐기성 세균은 아세틸 CoA 생화학적 경로를 통해 CO, CO₂ 및 H₂로부터 에탄올을 생성하는 것으로 입증되었다. 예를 들면, WO 00/68407호, EP 117309호, 미국 특허 번호 제5,173,429호, 제5,593,886호 및 제6,368,819호, WO 98/00558호 및 WO 02/08438호에는 가스로부터 에탄올을 생성하는 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii)의 다양한 균주가 기재되어 있다. 클로스트리듐 오토에타노게눔 종(Clostridium autoethanogenum sp) 세균도 가스로부터 에탄올을 생성하는 것으로 알려져 있다(Abrini 등, Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).

그러나, 가스의 발효를 통해 미생물에 의한 에탄올 생성은 항상 아세테이트 및/또는 아세트산의 공통 생성과 연관되어 있다. 이용 가능한 탄소 중 일부가 에탄올보다는 아세테이트/아세트산으로 전환되기 때문에, 그러한 발효 공정을 이용한 에탄올의 생산 효율은 바람직한 수준에 못 미칠 수 있다. 또한, 아세테이트/아세트산 부산물이 일부 다른 목적을 위해 이용될 수 없으면, 그것은 폐기물 처분 문제를 야기할 수 있다. 아세테이트/아세트산이 미생물에 의하여 메탄으로 전환되므로, 온실 가스 배출에 기여하는 가능성을 갖는다.

발효용으로 이용되는 생물반응기 내에서 세균 또는 미생물을 배양하는데 이용되는 액체 영양 배지의 매개변수들을 조절하는 중요성은 해당 기술 분야에 인식되어 왔다. 2007년 7월 18일에 제출되고 본원에 참고 인용된 뉴질랜드 특허 제556615호는 특히, 그러한 액체 영양 배지의 pH 및 산화환원 전위의 조작을 기재하고 있다. 예를 들면, 혐기성 아세트산 생성 세균의 배양에 있어서, 배양물의 산화환원 전위를 낮은 수준(-400 mW 이하)으로 유지하면서, 배양물의 pH를 약 5.7 이상으로 증가시킴으로써, 세균은 발효의 부산물로서 생성된 아세테이트를 더 낮은 pH 조건 하에서보다 훨씬 더 높은 속도로 에탄올로 전환시킨다. 뉴질랜드 특허 제556615호는 세균이 수행하는 주요 역할(즉, 성장, 아세테이트 및 가스성 CO 함유 기질로부터 에탄올 생성 또는 가스 함유 기질로부터 에탄올 생성)에 따라 조건을 최적화하는데 상이한 pH 수준 및 산화환원 전위들이 이용될 수 있다는 것을 또한 인식하고 있다.

미국 특허 제7,078,201호 및 WO 02/98438호는 또한 발효가 수행되는 액체 영양 배지의 조건(예컨대, pH 및 산화환원 전위)을 다양하게 함으로써 에탄올을 생성하는 발효 공정을 개선하는 것을 기재하고 있다.

액체 영양 배지의 pH는 하나 이상의 pH 조절 작용제 또는 완충제를 배지에 첨가함으로써 조절될 수 있다. 예를 들면, NaOH와 같은 염기 및 황산과 같은 산은 필요에 따라 pH를 증가시키거나 감소시키는데 이용될 수 있다. 산화환원 전위는 하나 이상의 환원제(예컨대, 메틸 바이올로젠) 또는 산화제를 첨가함으로써 조절될 수 있다.

당업자에게 명백하게 이해되는 바와 같이, 부탄올과 같은 다른 알코올을 제조하는데 유사한 공정들이 이용될 수 있다.

발효 반응을 공급하는데 이용되는 원천에 관계 없이, 공급에 있어서 중단이 있는 경우 문제점이 일어날 수 있다. 더 상세하게는, 그러한 단절은 반응에서 이용되는 미생물의 효율에 손해를 줄 수 있으며, 일부 경우에는, 그 효율에 유해할 수 있다. 예를 들면, 산업 폐기물 가스 스트림 중의 CO 가스가 발효 반응에 사용되어 산/알코올을 생성하는 경우, 스트림이 생성되지 않는 시간이 있을 수 있다. 그러한 시간이 있는 동안, 그 반응에 이용된 미생물은 동면에 들어갈 수 있다. 상기 스트림이 다시 이용 가능한 경우, 미생물이 원하는 반응을 수행하는데 있어서 충분히 생성되기 전에 지체가 있을 수 있다.

시스테인 및/또는 황화물과 같은 황원(sulphur source)도 접종 전 혐기성 브로쓰(broth)의 바람직한 ORP를 달성하는데 이용된다. 그러나, 그러한 환원제는 느리며, 제한된 환원력을 갖는다. 또한, 이러한 황 함유 화합물이 발효 배지의 ORP를 감소시키는데 이용되는 경우, 그 화합물은 스스로 산화된다. 예를 들면, 시스테인은 이량체 시스틴으로 산화된다. 이러한 화합물의 환원 형태는 산화 형태보다 미생물 배양에 의한 소비를 위한 황원으로서 실질적으로 더 생체 이용가능한 것으로 고려된다. 그렇다면, 발효 반응의 ORP를 더 낮추는데 황원이 이용되는 경우, 미생물 배양에 이용 가능한 황의 실제 농도는 감소할 것이다. 따라서, 일산화탄소 함유 가스를 공급원료로서 이용하는 혐기성 배양 시스템과 함께 이용하기 위한 개선되거나 대안적인 환원제의 확인은 높은 알코올 생성 속도 및 낮은 공정 조작 비용을 확보하는데 있어서 핵심이 되는 성분이다.

질소 및 인과 같은 주요 영양분과 함께, 황은 혐기성 세균 클로스트리듐 오토에타노게눔(C. autoethanogenum)의 발효에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 황은 미생물에 필수적이며, 클로스트리듐 오토에타노게눔((C. autoethanogenum)으로 하여금 CO를 아세트산, 에탄올 및 부탄디올로 오코에타노게눔 발효시키고 바이오매스의 성장을 위한 ATP를 발생시키는 일련의 화합물 및 효소에 필요하다. 황은 페레독신이라고 하는 생물학적 화합물의 종의 일부이며, 가스성 CO를 아세틸-Co-A에 고정시키는 우즈-륭달 효소들 중 상당수의 필수부(integral part)이다. 일반적으로, 황의 대부분 환원 형태는 기능성 단백질로 동화된다. 미생물은 H₂S를 직접 또는 황화수소의 형태로 흡수할 수 있고 이를 원하는 단백질로 동화시킬 수 있다. 미생물 황 함유 효소의 상당수도 Fe²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ 및 Mn²⁺와 같은 전이 금속 이온을 함유한다. 이 금속들의 황화물은 대략 중성의 pH 수치에서 매우 낮은 용해도 생성물을 가짐에 따라, 자유 H₂S 및/또는 자유 전이 금속들은 통상적으로 그 서식지들에서 매우 드물게 존재하는데, 이는 대다수의 금속 이온들이 비가용성 금속 황화물에 결합될 것이므로, 미생물에 접근 가능하지 않기 때문이다.

본 발명의 목적은 적어도 일부 방식으로 상기 단점들을 극복하는 시스템 및/또는 공정을 제공하거나, 적어도 공중에 유용한 선택을 제공하는 것이다.

제1의 광범위 양태에 있어서, 본 발명은 세균 배양물의 성장 효율을 개선하는 방법으로서, 배양물에 대안적인 황원을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

제2의 광범위 양태에 있어서, 세균 배양물에 의해 생성된 하나 이상의 생성물의 생성 속도를 유지하거나 증가시키는 방법으로서, 상기 배양물에 대안적인 황원을 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

제3의 광범위 양태에 있어서, 세균 배양물의 발효 효율을 개선하는 방법으로서, 상기 배양물에 대안적인 황원을 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

제4의 광범위 양태에 있어서, 세균 발효에 의한 하나 이상의 생성물의 제조 방법으로서,

i. 액체 영양 배지 중의 하나 이상의 일산 화탄소영양(carboxydotrophic) 미생물의 배양물을 포함하는 생물반응기(bioreactor)에 CO를 포함하는 가스성 기질(gaseous substrate)을 제공하는 단계;

ii. 혐기적으로 기질을 발효하여 알코올, 산 및 이들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 생성물을 생성하는 단계; 및

iii. 하나 이상의 생성물을 회수하는 단계

를 포함하는 방법이 제공된다.

일 실시형태에 있어서, 액체 영양 배지는 SO₂, H₂SO₃, Na₂S₂O₄, S₈, Na₂S, NaHS, 시스테인, NH₄HSO₃또는 (NH₄)₂SO₃를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 황원을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, CO를 포함하는 기질의 미생물 발효의 효율을 개선하는 방법으로서, 황이 하나 이상의 미생물에 이용 가능하도록 대안적인 황원을 영양 배지에 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

상기 양태들의 특정한 실시형태들에 있어서, 대안적인 황원은 아황산(H₂SO₃), Na₂S₂O₄, S₈, Na₂S, NaHS, SO2, 시스테인, NH₄HSO₃또는 (NH₄)₂SO₃를 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태들에 있어서, 대안적인 황원은 아황산이다.

상기 양태들의 특정한 실시형태들에 있어서, 황원은 산업 공정의 폐기물이다. 산업 공정은 발전소에 의한 석탄 연소 또는 오일 연소를 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다.

특정한 실시형태들에 있어서, 하나 이상의 황 함유종은 세균 배양물에 의하여 이용될 수 있다.

다른 광범위 양태에 있어서, 본 발명은 미생물 발효에 의하여 하나 이상의 산 및/또는 알코올을 제조하는 방법에 있어서,

i. 일산화탄소 및 임의로 이산화탄소 및/또는 수소를 포함하는 기질을 제공하는 단계;

ii. 하나 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물반응기에서, 기질을 혐기적으로 발효하여 산 및/알코올로 이루어진 하나 이상의 생성물을 생성하는 단계; 및

iii. 하나 이상의 생성된 생성물을 포집하고 회수하는 단계

를 포함하는 제조 방법이 제공되며,

배양물은 황원으로서 아황산이 제공된다.

다양한 양태들의 특정한 실시형태들에 있어서, CO를 포함하는 기질은 가스성이다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 가스성 기질은 산업 공정의 부산물로서 얻어진 가스를 포함한다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 산업 공정은 철금속 생성물 제조, 비철금속 생성물 제조, 석유 정제 공정, 바이오매스의 가스화, 석탄의 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에 있어서, 상기 가스성 기질은 제강소로부터 얻어진 가스를 포함한다.

특정한 실시형태들에 있어서, CO 함유 기질은 적어도 약 20 부피% 내지 약 100 부피%의 CO, 40 부피% 내지 95 부피%의 CO, 40 부피% 내지 60 부피%의 CO 및 45 부피% 내지 55 부피%의 CO와 같이, 통상적으로 주요 비율의 CO를 함유할 것이다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 또는 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%의 CO, 또는 약 55 부피%의 CO, 또는 약 60 부피%의 CO를 포함한다. 6%와 같이 CO의 더 낮은 농도를 갖는 기질도 특히 H₂ 및 CO₂가 또한 존재하는 경우, 적합할 수 있다.

특정한 실시형태들에 있어서, 상기 발효 공정에 의하여 생성된 알코올은 에탄올이다. 상기 발효 공정은 아세테이트도 생성할 수 있다.

다양한 양태들의 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 황원은 SO₂, H₂SO₃, Na₂S₂O₄, S₈, Na₂S, NaHS, 시스테인, NH₄HSO₃ 또는 (NH₄)₂SO₃를 포함하는 군으로부터 선택된다.특정한 실시형태들에 있어서, 상기 황원은 아황산이다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 황원은 (NH₄)₂SO₃이다.특정한 실시형태들에 있어서, (NH₄)₂SO₃의 농도는 1 mmol 내지 2.5 mmol로 유지된다.

특정한 실시형태들에 있어서, 상기 배양물에 제공된 황원의 양과 발효 용기/생물반응기의 상부 공간(headspace)에 존재하는 H₂S의 양 사이에는 상관관계가 존재한다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 H₂S는 발효에서 황 농도의 지시자로서 모니터링된다.

특정한 실시형태들에 있어서, 상부 공간 내의 H₂S의 농도는 1 ppm 내지 100 ppm으로 유지된다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 배양물에 제공된 황원의 양을 증가시키면 상부 공간에서 H₂S 농도를 증가시키고, 이에 반하여, 상기 배양물에 제공된 황원의 양을 감소시키면 상부 공간에서 H₂S 농도를 감소시킨다.

일 실시형태에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 스카토로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리듐 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리듐 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리듐 매그넘(Clostridium magnum), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 알칼리바큘룸 박키이(Alkalibaculum bacchii), 모어렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 스포로무사 오베이트(Sporomusa ovate), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 써모아내로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi) 종을 포함하는 아세트산 생성 일산화탄소영양 유기체의 군으로부터 선택된다.

특정한 실시형태들에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 코스카티이(Clostridium coskatii) 및 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxydivorans) 종을 포함하는 아세트산 생성 일산화탄소영양 미생물의 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 상기 아세트산 생성 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔이다.

일 실시형태에 있어서, 상기 발효 반응은 독일 생물학적 물질 자원 센터(DSMZ)에 식별 기탁 번호 19630 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 균주에 의하여 수행된다.

일 실시형태에 있어서, 상기 발효 반응은 독일 생물학적 물질 자원 센터(DSMZ)에 식별 기탁 번호 23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 균주에 의하여 수행된다.

특정한 실시형태들에 있어서, 상기 황원은 산업 공정의 폐기물이다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 황원은 석탄 제조 공정의 폐기물이다.

본 발명이 상기에서 광범위하게 상기와 같이 정의된 바와 같다고 하더라도, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 하기 상세한 설명이 실시예를 제공하는 실시형태들도 포함한다.

본 발명은 이제 첨부한 도면들을 참조하여 더 상세히 설명될 것이다:
도 1은 황원으로서 H₂SO₃를 이용하는 클로스트리듐 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) 발효에 있어서 H₂ 흡수 및 H₂S 생성을 도시한다.
도 2는 황원으로서 (NH₄)HSO₃를 이용하는 클로스트리듐 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) 발효에 있어서 H₂ 흡수 및 H₂S 생성을 도시한다.
도 3은 2 개 반응기 시스템의 제1 반응기에서 가스 흡수 및 H₂S 농도를 도시한다,
도 4는 2 개 반응기 시스템의 제2 반응기에서 가스 흡수 및 H₂S 농도를 도시한다
표 1은 다양한 대안적인 황원들의 산화수들을 나타낸다.
표 2는 다른 공정 매개변수들에 연관된, 제1 반응기에서 (NH₄)₂SO₃ 첨가를 나타낸다.
표 3은 다른 공정 매개변수들에 연관된, 제2 반응기에서 (NH₄)₂SO₃ 첨가를 나타낸다.

황원

클로스트리듐 오토에타노게눔의 최적 pH는 대략 pH 5이다. pH 5에서, S^2-는 대개의 경우 양성자화되며, 주로 (용해된 가스인) H₂S로서 그리고 소량의 HS^-로 존재한다. 전자의 가스는 시스템 전체에 걸쳐 공급 가스들을 살포함으로써 생물반응기로부터 제거된다. 이러한 이유 때문에, 황을 설파이드 이온의 형태로 포획하는 높은 pH 값으로 H₂S 함유 수용액을 저장하고 황이 미생물에 의하여 이용될 수 있기 전에, 황을 시스템으로부터 상실하는 것을 회피하기 위하여 발효 용기에 소량의 용액만을 적하하는 것이 필요하다. 그러한 높은 pH 용액은 매우 부식성이 있으며, 비가용성 황화물을 형성하거나 비가용성 수산화물을 침전시킴으로써 대부분의 원소와 침전을 형성하는 경향도 있다. 그 용액의 부식성 및 침전성으로 인해 그 용액과 다른 매체 성분들을 엄격하게 분리할 것을 요구한다.

이 문제를 해결하기 위하여, 다수의 대안적인 황원들이 황원들을 이용할 수 있는 클로스트리듐 오토에타노게눔의 성능을 측정하도록 확인 및 시험되었다. 표 1은 다수의 황 화합물, 이들의 산화수 및 이들을 이용하는 클로스트리듐 오토에타노게눔의 성능을 보여준다.

아황산(H₂SO₃)은 대안적인 황원으로서 확인되었다. 아황산은 H₂S보다 훨씬 더 강산이고, pH 5에서 탈양성자화될 것이고, 비스설파이트 이온으로서 용액 중에 잔류할 것이다. 그러므로, 수용액은 수산화물 침전 또는 광범위한 부식의 추가적인 문제를 야기하는 일 없이, 상기 pH 범위에서 저장될 수 있다. 황을 생물반응기에 투여하는 것은 또한, 미생물이 세포 내의 SO₂를 동화 작용에 필요한 H₂S로 전환시킴에 따라 더 용이하다. 다른 공급 가스들의 살포를 통한 H₂S의 상실은 이러한 방식으로 최소화될 수 있다. 아황산, H₂SO₃ 또는 NH₄HSO₃또는 (NH₄)₂SO₃의 형태인 황은 생물반응기에 영양 배지가 제공되기 전에 배지에 혼합될 수 있다. 이는 이전의 시스템에서 H₂S의 연속적인 첨가에 요구되는 펌프 시스템 및 제어 루프에 대한 요구를 제거함으로써 발효의 효율을 증가시킨다.

추가적으로, 황원으로서 아황산, H₂SO₃ 또는 NH₄HSO₃또는 (NH₄)₂SO₃을 이용하는 것은 다른 배지 성분들로부터 그 용액을 분리할 필요성을 제거한다는 것을 확인하게 되었다. pH6에서, 용액은 중성에 가깝고 용액은 무색이고 투명하며, 가스를 배출하지 않는데, 이는 용액을 저장하는 것이 매우 용이하게 하는 것이다. 다른 장점은 NH₄ ⁺및 Na⁺ 비스설파이트(아황산의 수소 함유 염)는 용액에서 매우 용이하게 용해한다는 것이다.

아황산은 대부분의 미생물에 독성이 있는 것으로 알려져 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은 아황산의 브로쓰으로의 첨가 속도를 조절함으로써, 미생물 배양물은 배양물의 성장 및 생성에 손상을 주지 않으면서, 아황산을 황원으로서 이용할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명자들은 배양물에 황을 과부하(overloading) 시키는 것이 배양물에 유해하고 배양물의 사멸을 유발할 수 있다는 것을 확인하게 되었다. 이 문제를 극복하기 위하여, 상기 아황산은 배양물에 점진적으로 첨가된다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 아황산은 배양물에 액적과 같은 연속적인 방식으로 첨가된다. 고농도의 아황산의 독성으로 인하여, 배양물에 제공된 아황산의 양을 모니터링하고, 배양물에 이용 가능한 아황산의 양이 소정의 범위를 초과하여 상승하거나 소정의 범위 미만으로 하강하면 생물반응기로의 산의 흐름을 조정하는 것이 필요하다.

아황산 형태의 황원은 미생물 배양물에 의하여 신속히 흡수된다. 미생물 배양물에 의한 아황산의 전환으로 인하여 생물반응기의 상부 공간으로 방출되는 H₂S가 생성된다. 생물반응기에 제공되는 아황산의 유량은 생물반응기의 상부 공간에서 H₂S 농도를 모니터링함으로써 조절될 수 있다. 상부 공간 내의 높은 H₂S 수준은 액체 영양 배지 내에 아황산의 농도가 높다는 것을 나타내는 것이다. 고농도의 아황산의 독성을 감안하여, 액체 영양 배지 중의 아황산의 농도를 조절하는 것은 바람직하다. 본 발명의 특정한 실시형태들에 있어서, 상부 공간 내의 H₂S 농도를 500 ppm 미만, 또는 300 ppm 미만, 또는 200 ppm 미만, 또는 150 ppm 미만, 또는 100 ppm 미만 또는 80 ppm 미만, 또는 50 ppm 미만으로 유지하는 것은 바람직한 것으로 밝혀졌다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상부 공간 내의 H2S 농도는 대략 100 ppm로 유지된다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상부 공간 내의 H₂S 농도는 대략 10 ppm 내지 대략 100 ppm의 범위 내로 유지된다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상부 공간 내의 H₂S 농도는 60 ppm 내지 100 ppm의 범위 내로 유지된다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상부 공간 내의 H₂S 농도는 대략 70 ppm 내지 대략 90 ppm의 범위 내로 유지된다.

SO₂ 가스는 석탄 발전소의 폐기물이며, 산성비의 형태로 환경적 문제의 원인이 되어 왔다. 이제, 석탄 발전소는 발전소의 황 방출을 여과해야 되고, 상기 오염을 감소시키기 위한 조약이 체결되어 있다. SO₂를 이용할 수 있는 클로스트리듐 오토에타노게눔의 성능은 폐기물의 포집 및 이용을 가능하게 한다.

생물반응기

발효는 연속 교반 탱크 반응기(CSTR: continuous stirred tank reactor), 고정화 세포 반응기(immobilized cell reactor), 가스-리프트(gas-lift) 반응기, 기포 컬럼 반응기(BCR: bubble column reactor), 중공 섬유 생물반응기(HFMBR: hollow fibre membrane bioreactor)와 같은 막 반응기 또는 살수층 반응기(TBR: trickle bed ractor) 등과 같은 임의의 적당한 생물반응기에서 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 생물반응기는 미생물이 배양되는 제1 성장 반응기, 및 성장 반응기로부터 발효 브로쓰가 공급될 수 있고 대부분의 발효 생성물(예컨대, 에탄올 및 아세테이트)이 생성될 수 있는 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 본 발명의 생물반응기는 CO 및/또는 H₂ 함유 기질을 수용하도록 개조된다.

CO 및/또는 H ₂ 함유 기질

상기 CO 및/또는 H₂ 함유 기질은 임의의 간편한 방법을 이용하여 공정으로부터 포획되거나 추출된다. 상기 CO 및/또는 H₂ 함유 기질의 조성에 따라, 기질을 발효에 도입하기 전에 기질을 처리하여 먼지 입자와 같은 임의의 원하지 않는 불순물을 제거하는 것도 바람직할 수 있다. 예를 들면, 상기 기질은 알려진 방법을 이용하여 여과되거나 스크러빙될 수 있다.

상기 CO 함유 기질, 바람직하게는 가스성 기질은 스팀 개질 공정의 임의의 단계의 부산물로서 얻어질 수 있다. 그러한 단계는 본원에 기재된 바와 같이, 스팀 개질 단계, WGS 단계 및 PSA 단계를 포함한다.

통상적으로 상기 CO는 가스 상태로 발효 반응기에 첨가될 것이다. 그러나, 본 발명의 방법은 그러한 상태로 기질을 첨가하는 것에 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 일산화탄소는 액체 중에 내포되어 제공될 수 있다. 예를 들면, 액체가 일산화탄소 함유 가스로 포화될 수 있고, 상기 액체가 생물반응기에 첨가될 수 있다. 이는 표준 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 일예로, 이 목적을 위해 마이크로버블 분산 발생기(Hensirisak 등. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002)가 이용될 수 있다. "가스 스트림" 이 본원에 지칭되는 경우, 상기 용어는 상기 기재된 포화 액체 방법과 같은 상기 스트림의 가스 성분들을 수송하는 다른 형태들도 포함한다.

가스 조성물

상기 CO 함유 기질은 적어도 약 20 부피% 내지 약 100 부피%의 CO, 40 부피% 내지 95 부피%의 CO, 40 부피% 내지 60 부피%의 CO 및 45 부피% 내지 55 부피% CO와 같이, CO의 임의의 비율을 함유할 수 있다. 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 또는 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%의 CO, 또는 약 55 부피%의 CO, 또는 약 60 부피%의 CO를 포함한다. 2%와 같은 CO의 더 낮은 농도를 갖는 기질은 또한, 특히 H₂ 및 CO₂가 또한 존재하는 경우에도, 적합할 수 있다.

H₂의 존재는 발효에 의한 탄화수소 생성물 형성에 손상을 주지 않아야 한다. 특정한 실시형태들에 있어서, 수소의 존재로 인하여 알코올 제조의 전체 효율이 개선된다. 예를 들면, 특정한 실시형태들에 있어서, 기질은 H₂:CO를 대략 2:1 또는 1:1 또는 1:2의 비율로 포함할 수 있다. 다른 실시형태들에 있어서, CO 함유 기질은 약 30% 미만의 H₂ 또는 27% 미만의 H₂, 또는 20% 미만의 H₂, 또는 10% 미만의 H₂, 또는 더 낮은 H₂ 농도, 예를 들면, 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만을 포함하거나 실질적으로 수소를 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태들에 있어서, CO 함유 기질은 50% 초과의 H₂, 또는 60% 초과의 H₂, 또는 70% 초과의 H₂, 또는 80% 초과의 H₂ 또는 90% 초과의 H₂를 포함한다.

기질은 예를 들면, 약 1 부피% 내지 약 80 부피%의 CO₂ 또는 1 부피% 또는 약 30 부피%와 같은 일부의 CO₂를 포함할 수도 있다.

스트림의 블렌딩

발효 반응의 효율, 알코올 제조 및/또는 전체 탄소 포획을 개선시키기 위해서는, CO 및 H₂를 포함하는 개질된 기질 스트림을 하나 이상의 추가적인 스트림과 블렌딩하는 것이 바람직할 수 있다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 일산화탄소영양 세균은 하기 식에 따라 CO를 에탄올로 전환시킨다:

6CO + 3H₂O → C₂H₅OH + 4CO₂

그러나, H₂의 존재 하에, 전체 전환은 하기 식과 같을 수 있다:

6CO + 12H₂ → 3C₂H₅OH + 3H₂O

따라서, 높은 CO 함유량의 스트림은 CO 및 H₂를 포함하는 개질된 기질 스트림과 블렌딩될 수 있어 CO:H₂ 비율을 증가시킴으로써 발효 효율을 최적화시키게 된다. 예를 들면, 제강소로부터의 오프-가스와 같은 산업 폐기물 스트림은 높은 CO 함유량을 가지지만, H₂를 최소한으로 포함하거나 전혀 포함하지 않는다. 이와 같이, 블렌딩된 기질 스트림을 발효기에 제공하기 전에, CO 및 H₂를 포함하는 하나 이상의 스트림을, CO를 포함하는 폐기물 스트림과 블렌딩하는 것이 바람직할 수 있다. 발효의 전체 효율, 알코올 제조 및/또는 전체 탄소 포획은 블렌딩된 스트림 중의 CO 및 H₂의 화학양론에 좌우될 것이다. 그러나, 특정한 실시형태들에 있어서, 블렌딩된 스트림은 CO 및 H₂를 다음과 같은 몰비로 실질적으로 포함할 수 있다: 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1 또는 1:2.

또한, 발효의 상이한 스테이지들에서 CO 및 H₂를 특정한 비율로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, (1:2 CO:H₂와 같은) 상대적으로 높은 H₂ 함유량을 갖는 기질 스트림은 개시(start up) 상 및/또는 급속한 미생물 성장 상(growth phase) 동안에 발효 스테이지에 제공될 수 있다. 그러나, 배양물이 실질적으로 정상 상태의 미생물 밀도로 유지되도록 성장 상이 지연되는 경우, 상기 CO 함유량은 증가될 수 있다(예컨대, 적어도 1:1 또는 2:1 이상으로, 여기서 H₂ 농도가 0 이상일 수 있다).

스트림들의 블렌딩은 또한, 특히 CO 함유 폐기물 스트림이 성질상 간헐적인 경우, 추가적인 장점들을 가질 수 있다. 예를 들면, CO를 함유하는 간헐적인 폐기물 스트림이 CO 및 H₂를 포함하는 실질적으로 연속적인 개질된 기질 스트림과 블렌딩되어 발효기에 제공될 수 있다. 본 발명의 특정한 실시형태들에 있어서, 상기 실질적으로 연속적인 블렌딩된 스트림의 조성 및 유량은 발효기에 실질적으로 연속적인 조성 및 유량의 기질 스트림의 제공을 유지하기 위하여 간헐적인 스트림에 따라 변할 수 있다.

발효

가스성 기질로부터 에탄올 및 다른 알코올의 제조 공정은 알려져 있다. 예시적인 공정으로는 예를 들면, 본원에 각각 참고 인용되어 있는 WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925, WO2009/064200, US 6,340,581, US 6,136,577, US 5,593,886, US 5,807,722 및 US 5,821,111에 기재된 것들을 포함한다.

미생물

다양한 실시형태들에 있어서, 발효는 일산화탄소영양 세균의 하나 이상의 균주의 배양물을 이용하여 수행된다. 다양한 실시형태들에 있어서, 상기 일산화탄소영양 세균은 모어렐라(Moorella), 클로스트리듐(Clostridium), 루미노코커스(Ruminococcus), 아세토박테리움(Acetobacterium), 유박테리움(Eubacterium), 부티리박테리움(Butyribacterium), 옥소박터(Oxobacter), 메타노사르시나(Methanosarcina) 및 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum)으로부터 선택된다. 다수의 혐기성 세균이 CO에서 n-부탄올 및 에탄올을 포함하는 알코올 및 아세트산으로의 발효를 수행할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 본 발명의 공정에 이용하기에 적합하다. 본 발명에서 이용에 적합한 그러한 세균의 예로는 WO 00/68407, EP 117309, 미국 특허 번호 제5,173,429호, 제5,593,886호, 및 제6,368,819호, WO 98/00558 및 WO 02/08438에 기재된 것들을 포함하는 클로스트리듐 륭달리, 클로스트리듐 카르복시디보란스(Liou 등, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091), 클로스트리듐 라그스달레이(WO/2008/028055) 및 클로스트리듐 오토에타노게눔(Abrini 등, Archives of Microbiology 161: pp 345-351)의 균주와 같은 클로스트리듐 속의 것들이 포함된다. 다른 적당한 세균으로는 모어렐라 종 HUC22-1를 포함하는 모어렐라 속(Sakai 등, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612)의 것들 및 카르복시도써무스(Carboxydothermus) 속(Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. 등(1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260)의 것들이 포함된다. 추가 예로는 모어렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 모어렐라 써모오토트로피카(Moorella thermoautotrophica), 루미노코커스 프로덕투스(Ruminococcus productus), 아세토박테리움 우디이, 유박테리움 리모숨, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 옥소박터 페닝기 (Oxobacter pfennigii), 메타노사르시나 바르케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans), 데술포토마쿨룸 쿠즈네트소비(Desulfotomaculum kuznetsovii)가 포함된다(Simpa 등, Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. Pp41-65). 또한, 다른 아세트산 생성 염기성 세균은 당업자가 이해하는 바와 같이 본 발명에 적용 가능할 수 있다는 것을 알아야 할 것이다. 또한, 본 발명은 2 이상의 세균의 혼합된 배양물에 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

일 실시형태에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카르복시디보란스, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스카토로게네스, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 매그넘, 아세토박테리움 우디이, 알칼리바큘룸 박키이, 모어렐라 써모아세티카, 스포로무사 오베이트, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 블라우티아 프로덕타, 유박테리움 리모숨, 써모아내로박터 키우비 종을 포함하는 아세트산 생성 일산화탄소영양 유기체의 군으로부터 선택된다.

이러한 일산화탄소영양 아세트산 생성균(carboxydotrophic acetogen)은 아세틸-CoA, 아세테이트 및 다른 생성물을 형성하는 혐기성 조건 하에 에너지원으로서 일산화탄소(CO) 및 일산화탄소(CO) 및/또는 수소(H₂)를 지닌 이산화탄소(CO₂)와 같은 가스성 일-탄소(C1)원을 이용하여 화학독립영양적으로 성장하는 그의 성능에 의하여 정의된다. 그것은 동일한 발효 모드, 우즈-륭달 또는 환원성 아세틸-CoA 경로를 공유하며, 일산화탄소 탈수소효소(CODH), 수소화효소, 포름산 탈수소효소, 포르밀-테트라히드로폴레이트 합성효소(Formyl-tetrahydrofolate synthetase), 메틸렌-테트라히드로폴레이트 탈수소효소(Methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase), 포르밀-테트라히드로폴레이트 시클로히드롤레이즈(Formyl-tetrahydrofolate cyclohydrolase), 메틸렌-테트라히드로폴레이트 환원효소(Methylene-tetrahydrofolate reductase), 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸-CoA 합성효소(CODH/ACS)(이 조합은 그러한 유형의 세균에 특징적이고 독특한 것임)로 이루어진 효소 세트의 존재에 의하여 정의된다(Drake, Kuesel, Matthies, Wood, & Ljungdahl, 2006). 아세트산 생성균에서 그 기질을 바이오매스, 이차 대사산물, 및 생성물이 (아세틸-CoA를 통해 또는 직접적으로) 형성되는 피루베이트로 전환시키는 당-발효 세균의 화학종속영양 성장과는 달리, 그 기질은 생성물, 바이오매스 및 이차 대사산물이 형성되는 아세틸-CoA로 직접적으로 전달된다.

일 실시형태에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리 및 "클로스트리듐 라그스달레이" 종 및 관련된 단리균(isolate)을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리디아의 클러스터(cluster)로부터 선택된다. 그 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 JAI-1^T(DSM10061)(Abrini, Naveau, & Nyns, 1994) 클로스트리듐 오토에타노게눔 LBS1560(DSM19630) (WO/2009/064200), 클로스트리듐 륭달리 PETC^T(DSM13528 = ATCC 55383)(Tanner, Miller, & Yang, 1993), 클로스트리듐 륭달리 ERI-2(ATCC 55380)(미국 특허 번호 제5,593,886호), 클로스트리듐 륭달리 C-01(ATCC 55988)(미국 특허 번호 제6,368,819호), 클로스트리듐 륭달리 O-52(ATCC 55989)(미국 특허 번호 제6,368,819호), 또는 "클로스트리듐 라그스달레이 P11^T" (ATCC BAA-622)(WO 2008/028055) 균주 및 "클로스트리듐 코스카티이"(미국 특허 번호 제2011/0229947호)와 같은 관련된 단리균, 및 클로스트리듐 륭달리 OTA-1(Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010)와 같은 그 돌연변이 균주를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.

이들 균주는, DNA-DNA 재회합 및 DNA 지문 실험(WO 2008/028055, 미국 특허 번호 제2011/0229947호)에 의하여 측정된 바와 같이 전혀 다른 종이라고 하더라도, 16S rRNA 유전자 수준에서 적어도 99% 동일성을 갖는, 클로스트리디아 rRNA 클러스터 I(Collins 등, 1994) 내에 있는 하위 클러스터(subscluster)를 형성한다.

이러한 클러스터의 균주들은 공통의 특성들에 의하여 유사한 유전자형 및 표현형을 둘 다 갖는 것으로 정의되며, 이들은 모두 동일한 모드의 에너지 보존 및 발효 대사를 공유한다. 이러한 클러스터의 균주들은 시토크롬이 결여되어 있으며, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다.

이러한 클러스터의 모든 균주들은 4.2 MBp 정도의 게놈 크기(Koepke 등, 2010) 및 32 %몰 정도의 GC 조성(Abrini 등, 1994; Koepke 등, 2010; Tanner 등, 1993), 및 우즈-륭달 경로의 효소(일산화탄소 탈수소효소, 포르밀-테트라히드로폴레이트 합성효소, 메틸렌-테트라히드로폴레이트 탈수소효소, 포르밀-테트라히드로 시클로히드롤레이즈, 메틸렌-테트라히드로폴레이트 환원효소, 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸-CoA 합성효소), 수소화효소, 포르메이트 탈수소효소, Rnf 복합체(rnfCDGEAB), 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 알데히드:페레독신 산화환원효소를 인코딩하는 보존된 필수적인 핵심 유전자 오페론(Koepke 등, 2010, 2011)을 갖는다. 가스 흡수의 원인이 되는 우즈-륭달 경로 유전자의 조직화 및 개수는 핵 및 아미노산 서열에 있어서 차이가 있음에도 모든 종들에서 동일한 것으로 밝혀졌다(Koepke 등, 2011).

그 균주들은 모두 유사한 형상 및 크기(대수 성장 세균은 0.5 내지 0.5 내지 0.7 x 3 내지 5 μm)를 가지며, 중온성(30 내지 37℃의 최적 성장 온도)이고 엄밀하게는 혐기성 세균(Abrini 등, 1994; Tanner 등, 1993)(WO 2008/028055)이다. 또한, 그들은 모두 동일한 pH 범위(pH 4 내지 7.5로서, 5.5 내지 6의 최적의 초기 pH), 유사한 성장 속도에 의한 CO 함유 가스에 대해 강력한 독립영양 성장, 및 특정한 조건 하에 형성된 소량의 2,3-부탄디올 및 젖산을 지닌 주요 발효 최종 생성물로서 에탄올 및 아세트산과의 대사 프로파일과 같은 동일한 대다수의 계통발생적 특질들을 공유한다(Abrini 등, 1994; Koepke 등, 2011; Tanner 등, 1993)(WO 2008/028055). 인돌 생성은 모든 종에서 관찰된다. 그러나, 종들은 다양한 당(예컨대, 람노오스, 아라비노오스), 산(예컨대, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예컨대, 아르기닌, 히스티딘) 또는 다른 기질(예컨대, 베타인, 부탄올)의 기질 이용에서 구별된다. 일부 종들은 특정한 비타민(예컨대, 티아민, 비오틴)에 대한 영양요구체(autotroph)인 것으로 밝혀진 반면에, 다른 종들은 그렇지 않았다.

그러므로, 상기 기재된 특질들은 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 클로스트리듐 륭달리와 같은 하나의 유기체에 특이적이지 않지만, 일산화탄소영양의 에탄올-합성 클로스트리디아에 대하여 일반적인 특질이다. 따라서, 본 발명은 성능상 차이점이 있을 수 있음에도, 이들 균주에 걸쳐 작용할 것으로 예상할 수 있다.

특정한 실시형태들에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리 및 클로스트리듐 라그스달레이를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 상기 군은 클로스트리듐 코스카티이도 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 부모 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693이다.

본 발명에서 사용에 적합한 예시적인 하나의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔은 독일 생물학적 물질 자원 센터(DSMZ)에 식별 기탁 번호 23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 균주의 식별 특성을 갖는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 다른 실시형태들에 있어서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔은 기탁 번호 DSMZ 10061 또는 DSMZ 19630 하에서 DSMZ의 식별 특성을 갖는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 이들 균주는, 특히 H₂ 및 CO의 기질 조성에서의 변화에 특별한 내성을 가지며, 그 자체로 스팀 개질 공정과의 조합으로 사용하기에 매우 적합하다.

본 발명의 방법에 이용된 세균의 배양은 혐기성 세균을 이용하여 기질을 배양하고 발효하기 위한 해당 기술 분야에 알려진 임의의 수의 공정들을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 발효에 가스성 기질을 이용하는 하기 문헌들에 일반적으로 기재된 이들 공정이 이용될 수 있다:{(i) K. T. Klasson, 등(1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, 등(1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson, 등(1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, 등(1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L. Vega, 등(1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L. Vega, 등. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160; 이들 모두는 본원에 참고 인용된다}.

발효 조건

세균의 성장 및 CO-대-탄화수소 발효가 일어나기 위해서, CO 함유 기질 이외에도, 적당한 액체 영양 배지는 생물반응기에 공급될 필요가 있는 것으로 이해될 것이다. 영양 배지는 이용된 미생물의 성장을 허용하는데 충분한 비타민 및 미네랄을 함유할 것이다. CO를 단독 탄소원으로서 이용하는 발효를 통한 탄화수소 생성물의 제조에 적당한 혐기성 배지가 해당 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들면, 적당한 배지는 상기 언급된 미국 특허 번호 제5,173,429호 및 제5,593,886호 및 WO 02/08438, WO2007/115157 및 WO2008/115080에 기재되어 있다.

발효는 원하는 발효(예컨대 CO-대-에탄올)가 일어나기에 적절한 조건 하에서 바람직하게 수행되어야 한다. 고려되어야 할 반응 조건은 압력, 온도, 가스 유량, 액체 유량, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, (연속 교반 탱크 반응기를 이용하는 경우) 교반 속도, 접종 수준, 액체 상 중의 CO가 제한적이되지 않도록 보장하기 위한 최대 가스 기질 농도 및 생성물 억제를 회피하는 최대 생성물 농도를 포함한다. 적당한 조건은 WO02/08438, WO07/117157 및 WO08/115080에 기재되어 있다.

최적 반응 조건은 이용된 특정한 미생물에 부분적으로 의존할 것이다. 그러나, 일반적으로, 발효는 주변 압력보다 더 높은 압력에서 수행되는 것이 바람직하다. 증가된 압력에서의 작동은 기체 상으로부터, 탄화수소 생성물의 제조를 위한 탄소원으로서 CO가 미생물에 의하여 흡수될 수 있는 액체 상으로의 CO 이동의 속도에서의 현저한 증가를 허용한다. 이는 결국 (입력 가스 유량으로 나눈 생물반응기 내의 액체 부피로서 정의된) 체류 시간이 생물반응기를 주변 압력보다 오히려 상승된 압력에서 유지할 경우 감소될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 주어진 CO-대-탄화수소 전환율은 부분적으로 기질 체류 시간의 함수이고, 원하는 체류 시간을 달성하는 것은 결국 생물반응기의 필요한 부피에 영향을 주기 때문에, 가압된 시스템을 이용하면 필요한 생물반응기의 부피를 현저히 감소시켜서, 결국에는 발효 장비의 자본 비용을 현저히 감소시킬 수 있다. 미국 특허 번호 제5,593,886호에서 주어진 실시예들에 따라, 반응기 부피는 반응기 작동 압력 증가에 따라 직선 비례하여 감소될 수 있다, 즉, 10 기압의 압력에서 작동되는 생물반응기는 1 기압의 압력에서 작동되는 것의 부피의 10분의 1만을 필요로 한다.

상승된 압력에서 가스-대-탄화수소 발효를 수행하는 이점이 또한 다른 곳에 기재되어 있다. 예를 들면, WO 02/08438에는 2.1 기압 및 5.3 기압의 압력 하에 수행된 가스-대-탄홧소 발효가 기재되어 있고, 이것은 각각 150g/l/일 및 369 g/l/일의 에탄올 생산성을 부여한다. 그러나, 대기압에서 유사한 배지 및 입력 가스 조성물을 이용하여 수행된 예시적인 발효는 1일 리터당 10 내지 20 배 미만의 에탄올을 생성하는 것으로 밝혀 졌다.

또한, CO-함유 가스성 기질의 도입 속도는 그 자체로 액체 상 중의 CO의 농도가 제한적이지 않도록 보장하는 것이 바람직하다. 이는 탄화수소 생성물이 배양물에 의하여 소비된다는 C0-제한된 조건의 결과가 존재할 수 있기 때문이다.

발효 생성물

본 발명의 방법은 다양한 탄화수소 생성물들 중 어느 하나를 생성하는데 이용될 수 있다. 이는 알코올, 산 및/또는 디올을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아세테이트, 부티레이트, 프로피오네이트, 카프로에이트, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 2,3-부탄디올, 이소프로판올, 프로필렌, 부타디엔, 이소-부틸렌 및 에틸렌을 생성하는 발효에 적용 가능할 수 있다. 이들 생성물 및 다른 생성물은 플라스틱, 약제 및 농약의 제조와 같은 다수의 다른 공정에 유효할 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 발효 생성물은 휘발유 범위 탄화수소(약 8 개 탄소), 디젤 탄화수소(약 12 개 탄소) 또는 제트 연료 탄화수소(약 12 개 탄소)를 제조하는데 이용된다.

또한, 본 발명은 발효에 의하여 생성된 탄화수소 생성물의 적어도 일부가 스팀 개질 공정에서 재사용되는 것을 제공한다. 이는 CH₄ 이외의 탄화수소가 촉매 위에서 스팀과 반응하여 H₂ 및 CO를 생성할 수 있기 때문에 수행될 수 있다. 특정한 실시형태에 있어서, 에탄올은 리사이클링되어 스팀 개질 공정에 대한 공급원료로서 사용된다. 추가 실시형태에 있어서, 상기 탄화수소 공급원료 및/또는 생성물은 스팀 개질 공정에 사용되기 전에 예비-개질기를 통과하게 된다. 예비-개질기를 통과하는 것은 수소 생성의 효율을 증가시키고 스팀 개질 퍼니스의 요구되는 용량을 감소시킬 수 있는 스팀 개질 공정의 스팀 개질 단계를 부분적으로 완성하게 된다.

본 발명의 방법은 호기성 발효에도 적용될 수 있고, 이소프로판올(이에 국한되지 않음)을 포함하는 다른 생성물의 혐기성 또는 호기성 발효에도 적용될 수 있다.

생성물 회수

발효 반응의 생성물은 알려진 방법을 이용하여 회수될 수 있다. 예시적인 방법으로는 WO07/117157, WO08/115080, US 6,340,581, US 6,136,577, US 5,593,886, US 5,807,722 및 US 5,821,111에 기재된 것들을 포함한다. 그러나, 간략하게 예를 들면, 에탄올은 분별증류 또는 증발 및 추출성 발효와 같은 방법에 의하여 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다.

발효 브로쓰로부터 에탄올을 증류하면 에탄올과 물의 공비 혼합물(즉, 95% 에탄올 및 5% 물)이 산출된다. 이어서, 무수 에탄올이 또한, 해당 기술 분야에 주지되어 있는 분자체 에탄올 탈수 기술의 이용을 통하여 얻어질 수 있다.

추출성 발효 절차는 에탄올을 희석 발효 브로쓰로부터 회수하기 위하여 발효 유기체에 낮은 독성 위험성을 제공하는 수-혼합성 용매의 사용을 수반한다. 예를 들면, 올레일 알코올이 이러한 유형의 추출 공정에 이용될 수 있는 용매이다. 올레일 알코올이 발효기에 연속적으로 도입되고, 그 결과 원심 분리기를 통해 연속적으로 추출되고 공급되는 그 용매가 상승하여 발효기의 상단에 층을 형성하게 된다. 이어서, 물과 세포가 그 올레일 알코올로부터 용이하게 분리되어 발효기에 복귀되고, 에탄올이 함유된 용매가 플래쉬 기화 유닛(flash vaporization unit)으로 공급된다. 대부분의 에탄올이 기화되고 응축되는 반면에, 올레일 알코올이 비휘발성이어서 발효에 재사용하기 위해 회수된다.

발효 반응에서 부산물로서 생성될 수 있는 아세테이트도 해당 기술 분야에 알려진 방법을 이용하여 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다.

예를 들면, 활성탄 필터를 수반하는 흡착 시스템이 이용될 수 있다. 이 경우, 미생물 세포가 우선 적당한 분리 유닛을 이용하여 발효 브로쓰로부터 제거되는 것이 바람직하다. 생성물 회수를 위한 세포 무함유 발효 브로쓰를 발생시키는 다수의 여과 기반 방법은 해당 기술 분야에 알려져 있다. 이후, 세포 무함유 에탄올- 및 아세테이트-함유 투과물이 활성탄을 함유하는 칼럼을 통과하게 되어 아세테이트를 흡착하게 된다. 염(아세테이트) 형태라기 보다는 산 형태(아세트산)의 아세테이트가 활성탄에 의하여 더 용이하게 흡착된다. 그러므로, 발효 브로쓰의 pH는 발효 브로쓰가 활성탄 칼럼을 통과하기 전에 약 3 미만으로 감소되어 아세테이트의 대부분을 아세트산 형태로 전환시키는 것이 바람직하다.

활성탄에 흡착된 아세트산은 해당 기술 분야에 알려진 방법을 이용한 용리에 의하여 회수될 수 있다. 예를 들면, 에탄올이 결합된 아세테이트를 용리하는데 사용될 수 있다. 특정한 실시형태들에 있어서, 발효 공정 자체에 의하여 생성된 에탄올이 상기 아세테이트를 용리하는데 사용될 수 있다. 에탄올의 비등점이 70.8℃이고, 아세트산의 비등점이 107℃이기 때문에, 에탄올과 아세테이트는 증류와 같은 휘발성 기반 방법을 이용하여 서로 용이하게 분리될 수 있다.

발효 브로쓰로부터 아세테이트를 회수하는 다른 방법도 해당 기술 분야에 알려져 있으며 이용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 제6,368,819호 및 제6,753,170호에는 발효 브로쓰로부터 아세트산을 추출하는데 이용될 수 있는 용매 및 공용매 시스템이 기술되어 있다. 에탄올의 추출성 발효를 위해 기재된 올레일 알코올 기반 시스템의 예에 관하여, 미국 특허 번호 제6,368,819호 및 제6,753,170호에 기재된 시스템은 아세트산 생성물을 추출하기 위하여 발효된 미생물의 존재 또는 부재 하에 발효 브로쓰와 혼합될 수 있는 수-비혼합성 용매/공용매를 설명하고 있다. 이어서, 상기 아세트산 생성물을 함유하는 용매/공용매는 증류에 의하여 브로쓰로부터 분리된다. 이어서, 제2 증류 단계가 상기 용매/공용매 시스템으로부터 아세트산을 정제하는데 이용될 수 있다.

발효 반응의 생성물(예를 들면, 에탄올 및 아세테이트)은 발효 생물반응기로부터 브로쓰의 일부를 연속적으로 제거하고, (간편하게는 여과에 의하여) 브로쓰로부터 미생물 세포를 분리하며, 브로쓰로부터 하나 이상의 생성물을 동시적으로 또는 순차적으로 회수함으로써 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다. 상기 기재된 방법들을 이용하여, 에탄올의 경우, 에탄올은 증류에 의하여 간편하게 회수될 수 있고, 아세테이트는 활성탄 상에 흡착에 의하여 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 바람직하게는 발효 생물반응기로 복귀된다. 에탄올 및 아세테이트가 제거된 이후에 잔류하는 세포 무함유 투과물도 바람직하게는 발효 생물반응기로 복귀된다. (비타민 B와 같은) 추가적인 영양분이 상기 세포 무함유 투과물 첨가될 수 있어 상기 투과물이 생물반응기로 복귀되기 전에 영양 배지를 보충하게 된다. 또한, 브로쓰의 pH가 상기 기재된 바와 같이 조절되어 아세트산의 활성탄으로의 흡착을 향상시킨 후, 그 pH는 생물반응기로 복귀되기 전에 발효 생물반응기 내의 브로쓰의 pH와 유사한 pH로 재조절되어야 한다.

생물반응기로부터 회수된 바이오매스는 혐기성 소화를 수행할 수 있어 바이오매스 생성물, 바람직하게는 메탄을 생성하게 된다. 이 바이오매스 생성물은 스팀 개질 공정을 위한 공급원료로서 사용될 수 있거나 본원에 정의된 반응들 중 하나 이상을 수행하는 보충 열을 생성하는데 이용될 수 있다.

실시예

개시를 위한 물질 및 방법

배지:

혈청 병에서의 발효

배지 50 mL를 함유하는 234 mL 혐기성 혈청 병에 클로스트리듐 오토에타노게눔 동결 건조된 스톡 1 mL를 주사함으로써 배양을 수행하였다. 혈청 병의 상부 공간을 30 psi RMG로 플러싱하였다. 이를 37℃의 유지 온도에서 진탕 배양기 상에 저장하였다. 배양 2 일 후 또는 배양물의 광학 밀도가 0.2에 도달할 때, 그것을 8 개의 병들로 계대 배양하였다.

생물반응기에서의 발효 - 실시예 1 및 2.

5 L 증류수 중에 모든 성분들을, 비타민 B 용액 및 시스테인을 제외하고, 혼합함으로써 배지를 제조하였다. 10 리터 CSTR 반응기를 준비하고, 배지 용액 4.5 L를 내부로 넣었다. 이후, 반응기를 121℃에서 30 분 동안 오토클레이브에서 살균하였다. 오토클레이브에서의 처리 후, 반응기를 냉각시키고, 37℃에서 유지하며, N₂ 가스의 일정한 흐름 및 200 rpm의 교반에 의해 혐기성으로 만들었다. 일단 냉각된 후에, 비타민 B 및 시스테인 용액을, 0.2 ㎛ 여과 주사기를 이용하여 첨가하였다. 이어서, 이 용액의 pH를, 5 M NH₄OH 용액을 이용하여, 5.3으로 조절하여 유지하였다.

배양 전 2 시간 동안, 상기 N₂ 가스를 100 ml/분 RMG로 전환시키고, 상기 배지를 0.2 M Cr²⁺ 용액을 이용하여 -250 mV로 더 환원시켰다. 이를 클로스트리듐 오토에타노게눔 혈청 병 배양물 400 mL로 접종하였다. 발효는 가스 및 교반 초과시간(overtime)을 완만히 증가시키면서 배치(batch)로서 시작하였다. 접종 후 2 일 동안, 상기 배양물은 여전히 완만하게 푸싱(pushing)하면서 연속적으로 바꾸었고, 최종적으로 550 ml/분 RMG 및 400 rpm 교반에서 안정하게 유지하였다.

생물반응기에서의 발효 - 실시예 3

2 개의 2-리터 반응기에 (상기 표들에서 특정된 바와 같이) 모든 금속, 인산, B-비타민을 함유하는 배지 1.5 L를 충전하였다. 이후, 상기 배지를 하기 조성을 갖는 산업용 가스를 이용하여 탈기하였다; 대략 50% CO, 20% CO₂, 28% N₂ 및 2% H₂. 0.12 M (NH₄)₂SO₃(pH 6.0)를 0.2 mL/h의 유량으로 첨가하여 접종 전에 상기 배지에 황을 전달하였다. 대략 2 g/L의 바이오매스를 갖는 연속적으로 작동하는 종균 발효기(seed fermenter)로부터의 200 mL 배양물로 접종하기 전에 0.2 M Cr²⁺을 이용하여 ORP(Ag/AgCl 전극)을 -200 mV로 더 조절하였다. 상기 pH는 상기 배양물로의 가스의 최적 전달을 제어하는 것을 통해 조절하였고, 5 M NH₄OH를 통한 (5.0에서) 자동적인 pH 조절에 의하여 추가적으로 백업(back up)하였다. 최초 24 시간 동안, 상기 배양물은 배치 발효물이고, 이후 2 내지 3의 희석 속도를 달성하는 속도로 배지(2mM NaCl, 2mM KCl, 0.5mM MgCl₂, 1mM CaCl₂, 비타민 B, 5mM 인산, 금속 믹스)를 전달하고 동시에 적절한 속도로 (NH₄)₂SO₃ 및 소포제를 전달함으로써 연속 모드로 전환하였다.

황원으로서 0.12M (NH₄)₂SO₃ (진한 HCl에 의해 pH가 6.0으로 조절됨) - 상부 공간 내의 H₂S가 100 ppm이 되도록 유량이 조절됨.

소포제(폴리(프로필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프로필렌 글리콜)(CAS 9003-11-6)(10 ㎕/h)

상기 1.5 L 반응기에서의 실험을 2-발효기 시스템으로서 수행하였다. 양쪽 반응기는 세포 리사이클링을 특징으로 하였다. 이 세포 사이클링에 기공 크기 0.1 ㎛의 중공사막 카트리지를 이용한다. 반응기를 2-발효기 시스템에 연결하는 경우, 세포 리사이클링으로 인한 투과물 및 폐기물을 하류 발효기로 직접 이송한다. 따라서, 투과물과 폐기물 간의 비율이 다이얼로 조정된(dialled-in) 유량을 기초로 한 평가로 남게 된다.

실시예 1: 황원으로서 H ₂ SO ₃

배경:

단일 반응기 시스템에서의 안정하게 연속적으로 가동하는 종균 발효기 상에서 이 실험을 수행하였다. 상기 종균 발효기의 주 목적은 다른 생물반응기 발효를 위하여 개시 접종을 제공하는 것이었다. 이와 같이, 이 발효기는 안정하게 유지하고, 낮은 가스 공급 및 교반으로 불충분하게 공급되었다. 종균 발효기는 (오염의 위험성을 줄이기 위하여) 정지되어 재시동되기 전에 대략 1 내지 2 달 동안 정상적으로 가동한다. 2 달의 연속적인 안정한 가동 시간 후에, 상기 배양물에 대하여 실험들을 수행하였다. 종균 발효기의 프로파일은 고성능 발효 시스템의 것과는 상이하다.

이 실험에 대한 목표는 클로스트리듐 오토에타노게눔 및 기타 일산화탄소영양 아세트산 생성 미생물들에 대한 대안적인 황원을 찾는 것이었다. 클로스트리듐 오토에타노게눔은 (용액을 발효기로 직접 적하하거나 용액을 H₃PO₄로 충전된 폐쇄 용기로 적하하고 방출된 H₂S를 발효기에 공급함으로써) Na₂S로부터 황원을 이용할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 또한, 클로스트리듐 오토에타노게눔은 시스테인을 소비하고 H₂S를 방출할 수 있으며, 과거에는 S₈이 유효하다고도 증명되었다. 이 실험은 H₂SO₃에 집중되었는데, 그것이 현재 황원(Na₂S 또는 시스테인)과 비교하여 장점들을 갖고 있기 때문이다. H₂SO₃는 대부분의 미생물들에 독성이 있어서, 황원으로서뿐만 아니라 소독제로서 작용할 수 있다. 또한, SO₂ 가스는 석탄 발전소의 폐기물이고, 산성비의 형태로 환경적 문제를 유발시켰다. 이후, 석탄 발전소는 발전소의 황 방출을 여과해야 되고, 국제 조약이 상기 오염을 감소시키기 위해 만들어졌다.

방법:

수 중의 약 0.6M SO₂용액을, 주사기 펌프를 이용하여 10 L 발효기에 펌핑하였다. 수행 지시자(indicator)는 상부 공간 내의 H₂S 및 H₂와 CO 흡수이다. 실시 황원은 H₂S를 생성하고, 안정한 H₂와 CO 흡수를 제공하여야 한다. H₂ 흡수는 미생물의 건강 상태의 초기 지시자이다.

결과:

1 ml/시 펌프 속도에 의한 대략 0.6 M 농도는 상부 공간에서 H₂S를 과량 제공하였다(대략 600 ppm). 생성된 H₂S를 감소시키기 위하여, 용액을 10 배로 희석하였고, 펌프 속도를 조절하여 원하는 수치를 달성하였다.

도 1은 생물반응기에서의 수소 흡수 및 H₂S 생성을 도시한다.

시간당 2 ml의 펌프 속도에서, 상기 배양물은 H₂S를 거의 생성하지 않았고, 상기 H₂ 흡수는 불안정하였고 감소하고 있었다.

시간당 3 ml의 펌프 속도에서, 상부 공간 내의 H₂S의 양은 대략 60 내지 70 ppm H₂S였다. 펌프 속도가 시간 당 3.5 ml로 증가된 경우, H₂S의 양은 대략 20 ppm H₂S에서 거의 0까지 변동하였다. 상기 H₂ 흡수는 매우 안정하였다. 펌프 속도를 시간당 4 ml로 증가시키는 것은 결국 과량의 H₂S를 생성하였다.

실시예 2: 황원으로서 (NH ₄ )HSO ₃

배경:

이 실험은 상기 H₂SO₃ 실험의 연속적인 것이었다. H₂SO₃는 매우 강한 산성이고 수 중에 SO₂의 형태로 존재하며, 그 흐름에서 pH는 건강 및 안전 문제를 유발할 수 있는 독성 SO₂ 가스를 방출한다. IV 백(bag) 내에 그 용액을 저장하는 별도 실험(Na₂S를 발효기로 공급하는 정상적인 방법)은 상기 백이 손상을 입지 않았어도, SO₂ 가스의 축적으로 인하여 팽창되었다는 것을 보여주었다.

더 안전한 용액을 제공하기 위하여, 수 중의 SO₂(H₂SO₃)는 안전하고 거의 냄새가 없는 (NH₄)HSO₃을 생성하는 진한 NH₄OH를 이용하여 6으로 조절된 pH를 갖는다. 이후, 이 용액은 종균 발효기에 대하여 시험하였다.

방법:

수 중의 대략 0.6M SO₂ 용액을 28% NH₄OH와 반응시켜 pH를 최대 6까지 올리고 10배 희석한다. 이후, 상기 용액을, 주사기 펌프를 이용하여 상기 발효기에 공급한다.

결과:

도 2는 생물반응기에서의 수소 흡수 및 H₂S 수준을 도시한 것이다. 도 2에 도시된 바와 같이; 미희석 용액이 시간 당 4 ml이면 H₂S가 과량이 되었다. 미희석 용액이 시간 당 4 ml의 유량이면 H₂S이 대략 80 ppm이 되었다.

1/10 희석된 용액이 시간 당 2 ml의 유량이면 H₂S는 최소량이 되었지만, H₂ 흡수는 감소하였다. 1/10 희석된 용액이 시간 당 3 ml의 유량이면 H₂S는 낮은 수준이 되고 H₂ 흡수는 안정되었다.

실시예 3: 황원으로서 (NH ₄ ) ₂ SO ₃

방법:

(NH₄)₂SO₃를 2-발효기 시스템에서 황원으로서 이용하였다. 0.12 M (NH₄)₂SO₃ 용액을 제조하고, 진한 HCl로 pH를 6.0으로 조절하였다. 이 용액을 0.5 M Na₂S 용액과 유사한 유량으로 이용할 수 있다. 투여량을 조절하여 상부 공간 내의 H₂S를 100 ppm 미만으로 유지한다. 상부 공간 내의 더 높은 H₂S 농도는 배양물에 잠재적으로 유해할 수 있는 브로쓰 중의 SO₂ 수준을 나타내는 것이다. 표 2 및 3은 더 높은 농도의 바이오매스 및 더 높은 희석 속도 및 가스 속도에서 H₂S를 목표 수준에 유지하는데 필요한 (NH₄)₂SO₃의 농도가 어떻게 증가하는가를 보여준다. 접종시에, 너무 많은 (NH₄)₂SO₃를 첨가하지 않도록, 각별히 주의해야 한다. 지시자로서 H₂S는 접종 이후에만 이용 가능하다. H₂S는 접종 이전에는 상부 공간 내에 존재하지 않을 것이다. 이 실험으로부터, (NH₄)₂SO₃에 대한 최적 농도는 바이오매스, 가스 흐름 및 희석 속도에 따라, 연속적인 고성능 배양에 대하여 1 내지 3.5 mmol인 것으로 나타났다. 접종시에, 농도는 0.3 mmol 미만이어야 한다.

결과:

(NH₄)₂SO₃를 대안적인 황원으로서 이용하기 위해 pH6의 용액에 첨가하였다. 상기 (NH₄)₂SO₃를 0.5 M Na₂S 용액과 동일한 유량으로 상기 발효에 첨가하였다. 실험을 진행하는 동안에, 상기 반응기의 상부 공간 내의 H₂S의 양이 100 ppm 미만의 농도로 유지되도록, 용액 중의 (NH₄)₂SO₃의 농도를 유지하는 것은 바람직한 것으로 나타났다. 도 3 및 4에 도시된 바와 같이, 상기 발효를 (NH₄)₂SO₃를 대략 40 일 동안 이용하는 안정한 방식으로 유지하여, 대안적인 황원으로서 (NH₄)₂SO₃의 유효성을 입증하였다.

발효 브로쓰 중의 바람직한 (NH₄)₂SO₃ 농도를 1 내지 3.5 mmol로 유지하고, 상부 공간에서의 H₂S 농도를 100 ppm 미만으로 유지하면서, 미생물에 대한 상기 황원으로서 (NH₄)₂SO₃를 이용하는 안정한 연속적인 배양을 입증하였다.

본 발명은 당업자가 과도한 실험을 하지 않고도 본 발명을 실행할 수 있도록 하기 위하여, 특정한 바람직한 실시형태들을 참조하여 본 명세서에 기술되어 있다. 그러나, 당업자는 다수의 성분들 및 매개변수들이 본 발명의 영역으로부터 벗어나는 일 없이 일정한 정도로 변경 또는 변형될 수 있거나, 알려진 균등물로 치환될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 그러한 변형 및 균등물은 개별적으로 설명된 것처럼 본 명세서에 포함되어 있다는 것을 알아야 한다. 본 발명은 본 명세서에서 언급되거나 지시된 단계, 특징, 조성물 및 화합물 모두를 개별적 또는 집합적으로 포함하고, 상기 단계들 또는 특징들 중 임의의 2 이상으로 된 임의의 조합 또는 모든 조합도 포함한다.

전술한 설명에서 알려진 균등물을 갖는 정수가 언급되는 경우, 이러한 정수는 본원에서 개별적으로 설명된 것처럼 포함된다.

더구나, 명칭, 배경 등은 본 문서에 대한 당업자의 이해를 향상시키도록 제공되며, 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 전술한 내용 및 존재하는 경우 후술하는 내용에서 인용된 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체 개시내용은 본 명세서에 참조 인용된다.

본 명세서에서 임의의 선행 기술을 참조하는 것은 그 선행 기술이 전세계의 어느 나라에서 노력한 분야에서 공통적인 일반 지식의 부분을 형성한다는 인정 또는 임의의 형태의 제시가 아니고 그러한 인정으로서 또는 제시로서 간주되어서는 안된다.

본 명세서 및 후술하는 임의의 청구항 전체를 통하여, 문맥이 달리 요구되지 않는 한, "포함한다", "포함하는" 등의 단어는 배제의 의미에 반대되는 포괄적인 의미, 즉, "포함하지만, 여기에 국한되지 않은"의 의미로 해석되어야 한다.

Claims

미생물 발효에 의해 하나 이상의 생성물을 제조하는 방법으로서,
a) 황원(sulphur source)을 포함하는 액체 영양 배지 중의 하나 이상의 일산화탄소영양(carboxydotrophic) 미생물의 배양물을 포함하는 생물반응기(bioreactor)에 CO를 포함하는 가스성 기질(gaseous substrate)을 제공하는 단계;
b) 그 기질을 혐기적으로 발효하여 알코올, 산 및 이들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 생성물을 생성하는 단계; 및
c) 하나 이상의 생성물을 회수하는 단계
를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 액체 영양 배지는 SO₂, H₂SO₃, Na₂S₂O₄, S₈, Na₂S, NaHS, 시스테인, NH₄HSO₃또는 (NH₄)₂SO₃를 포함하는 군으로부터 선택된 황원을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 황원이 아황산인 방법.
제3항에 있어서, 액체 영양 배지 중의 아황산의 농도는 1 내지 3.5 mmol로 유지되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 황원의 일부는 생물반응기의 상부 공간(headspace)에서 H₂S로 전환되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 액체 영양 배지 중의 황원의 농도는 상부 공간에서 측정된 H₂S의 양에 따라 조절되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상부 공간 내의 H₂S의 농도는 1 ppm 내지 100 ppm로 유지되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 일산화탄소영양 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리듐 코스카티이(Clostridium coskatii) 및 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans)를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 일산화탄소영양 미생물이 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)인 방법.
제8항에 있어서, 일산화탄소영양 미생물이 독일 생물학적 물질 자원 센터(DSMZ)에 식별 기탁 번호 19630 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 균주인 방법.
제8항에 있어서, 일산화탄소영양 미생물이 독일 생물학적 물질 자원 센터(DSMZ)에 식별 기탁 번호 23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 균주인 방법.
제1항에 있어서, 황원이 산업 공정의 폐기물인 방법.
제1항에 있어서, 황원이 석탄 제조 공정의 폐기물인 방법.