CN108728499A - 一种多菌混合发酵制取乙醇方法 - Google Patents

一种多菌混合发酵制取乙醇方法 Download PDF

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张甜
黄晶
曹青
肖建勋
康宇
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江佳璐
徐菲
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
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Abstract

本发明公开了一种多菌混合发酵制取乙醇方法，包括以下步骤；保藏菌株的活化：将C.ljungdahlii、C.autoethanogenum、C.ragsdalei分别接种至装有培养基溶液的试管中；传代培养：将C.autoethanogenum，C.ljungdahlii与C.ragsdalei菌液分别按20％，10％，10％的接种量接种至含新鲜培养基试管中；扩大化培养获取种子：按各接种量(C.autoethanogenum 20％，C.ljungdahlii 10％，C.ragsdalei 10％)接种三种菌株于125ml容量培养瓶中；发酵罐混合发酵：将新鲜培养基加入发酵罐中，按10％的接种量接种至发酵罐中，连续通入工业废气。本发明利用共培养技术可以改造传统的发酵工艺，使发酵周期缩短且产品产量提高，共培养可以更有效降解有毒物质，源于微生物共培养时产生的协同作用，因此在降解毒物时更加高效。

Description

一种多菌混合发酵制取乙醇方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种多菌混合发酵制取乙醇方法。
背景技术
据报道，2017年全球二氧化碳排放总量约达410亿吨，化石燃料使用及工业活动产生的二氧化碳排放约占全球碳排放总量的90％。如何减少碳排放，缓解全球升温带来的影响，并将其再利用转化为可再生能源，创造经济价值是本项目的出发点。针对现有化学合成法催化转化工业废气中的CO2、CO、H2制取液体燃料过程中制备成本高、工艺复杂、设备磨损大、气体组分要求高和易产生环境污染等问题，本项目创造性地开发了以工业废气为原料，以微生物厌氧发酵技术为核心，制备具有巨大市场应用价值的液体燃料乙醇的简单工艺。本项目所开发的微生物厌氧发酵工业废气制取乙醇的技术，对工业废气中CO2、CO、H2等气体成分的利用率和转化率达90％以上，有效降低工业废气中的碳排放，并创造了经济价值。其次，以工业废气作为原料，来源广泛，几乎零成本，这种思路与工艺符合国家发展需要，切合国家发展建设需求，有较高的社会与经济价值。
目前已有的工业废气制乙醇主要有化学催化法和微生物纯培养发酵法。相比本发明的多菌混合利用工业废气发酵制取乙醇的技术，市场上现有工业废气制乙醇的化学催化法存在以下缺点：
1、反应条件常为高温高压，温度>100℃，通常要求315℃，压强通常>2MPa，甚至>15MPa。
2、需要使用催化剂，如Mo、Co等贵金属，250～500℃焙烧，增加额外成本和工艺步骤。
3、对废气比例要求严格，净化度要求高，增大了工艺难度。
4、所用设备需耐高温高压，且使用过程中易磨损，设备成本及维修费用高。
5、传统化学催化法产生的副产物较多，且分离困难。
6、产生废水废渣，易导致重金属污染，增大环境治理难度。
发明内容
为解决上述问题本发明提供的技术方案为：一种多菌混合发酵制取乙醇方法，包括以下步骤；
(1)保藏菌株的活化：将两种菌株C.ljungdahlii与C.ragsdalei分别接种至装有培养基溶液的试管中，在37℃恒温摇床中培养24h；
(2)传代培养：将C.ljungdahlii以及C.ragsdalei菌液按10％的接种量接种至含新鲜培养基试管中，所述的两种试管要求在37℃恒温摇床培养48h；连续多次传代培养至获取稳定性状菌株；
(3)扩大化培养获取种子：按各接种量(C.ljungdahlii 10％，C.ragsdalei 10％)接种两种菌株于125ml容量培养瓶中，混合后于37℃恒温摇床培养，获取足量菌液；
(4)发酵罐混合发酵：将新鲜培养基加入发酵罐中，按10％的接种量接种至发酵罐中，连续通入工业废气，37℃恒温搅拌培养；
(5)取样检测：每天2次对发酵液进行气相色谱检测，定量分析乙醇产量。
本发明提供的技术优点为：微生物发酵法克服了化学催化法存在的以上缺点，具有反应条件温和，无需高温高压，对设备腐蚀性小，副产物较少，微生物代谢途径易调控，微生物代谢产物属于环境友好型，减少环境污染等优点，但目前市场上现有微生物纯培养发酵制乙醇的技术仍存在一些如下缺点：
1、微生物纯培养一段时间后，容易导致生物活性降低，生物量减少。
2、微生物生长过程中，由于新陈代谢容易导致一些毒素物质产生，纯培养过程中不易降解。
3、微生物发酵工业废气一般使用的是厌氧产乙酸菌，在密闭无氧条件下，受细菌生长过程影响，纯培养液中PH会发生变化，无法稳定细菌所需最适PH。
4、乙醇产量较低。
本发明中使用的微生物菌株Clostridium ljungdahlii(DSM 13582)，Clostridium autoethanogenum(DSM 10061)，Clostridium ragsdalei(DSM 15248)属于同型产乙酸菌，可以通过厌氧乙酰辅酶A(acetyl－CoA)途径，利用CO2、CO、H2等工业废气成分作为原料，合成乙醇和乙酸以及其他产物。
作为改进，所述培养基的内包括由以下组成；2(N-morpholino)ethanesulfonicacid(MES)20.0g、Yeast extract0.5g、Mineral solution25.0ml、Trace elementsolution10.0ml、Vitamin solution10.0ml以及Milli-Q930.0ml。
作为改进，所述的培养液为培养基的混合并且恒温振荡培养箱内摇床转速：200rpm，温度控制在37℃，PH＝5.9以及填充设有CO、CO2和H2的混合气环境内取得，所述试管内的培养基体积为9.3ml、培养瓶中培养基体积为93ml以及发酵罐中培养基体积为3L。
作为改进，所述步骤内还设有菌株C.autoethanogenum，所述的C.autoethanogenum按照步骤并且C.autoethanogenum，C.ljungdahlii以及C.ragsdalei制配接种量比例为2：1：1，按10％接种量接种于新鲜培养基中，通入气体(CO 50％，H2 5％，CO245％)，37℃恒温搅拌培养，发酵罐中发酵3天，发酵结束后收集发酵后产物。
利用共培养技术可以改造传统的发酵工艺，使发酵周期缩短且产品产量提高；共培养可以更有效降解有毒物质，源于微生物共培养时产生的协同作用，因此在降解毒物时更加高效；将细菌进行混合培养，细菌间代谢会增加，从而可减少或避免细菌在纯培养时出现的生物活性易降低，生物量减少的现象；共培养体系可以为彼此提供营养物质，并稳定体系的PH。
附图说明
图1是本发明一种多菌混合发酵制取乙醇方法的流程图；
图2是本发明一种多菌混合发酵制取乙醇方法的反映原理图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，
下述实施例均要求控制在以下基本环境：PH＝5.9、气体：CO、CO2和H2的混合气、温度：37℃、摇床转速：200rpm；
培养基的内包括由以下组成；2(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)20.0g、Yeast extract0.5g、Mineral solution25.0ml、Trace element solution10.0ml、Vitamin solution10.0ml以及Milli-Q930.0ml。
实施例一
结合附图一种多菌混合发酵制取乙醇方法，包括以下步骤；
(1)保藏菌株的活化：将两种菌株C.ljungdahlii与C.ragsdalei分别接种至装有培养基溶液的试管中，在37℃恒温摇床中培养24h；
(2)传代培养：将C.ljungdahlii以及C.ragsdalei菌液按10％的接种量接种至含新鲜培养基试管中，所述的两种试管要求在37℃恒温摇床培养48h；连续多次传代培养至获取稳定性状菌株；
(3)扩大化培养获取种子：按各接种量(C.ljungdahlii 10％，C.ragsdalei 10％)接种两种菌株于125ml容量培养瓶中，混合后于37℃恒温摇床培养，获取足量菌液；
(4)发酵罐混合发酵：将新鲜培养基加入发酵罐中，按10％的接种量接种至发酵罐中，连续通入工业废气，37℃恒温搅拌培养；
(5)取样检测：每天2次对发酵液进行气相色谱检测，定量分析乙醇产量。
所述的培养液为培养基的混合并且恒温振荡培养箱内摇床转速：200rpm，温度控制在37℃，PH＝5.9以及填充设有CO、CO2和H2的混合气环境内取得，所述试管内的培养基体积为9.3ml、培养瓶中培养基体积为93ml以及发酵罐中培养基体积为3L。
所述步骤内还设有菌株C.autoethanogenum，所述的C.autoethanogenum按照步骤并且C.autoethanogenum，C.ljungdahlii以及C.ragsdalei制配接种量比例为2：1：1，按10％接种量接种于新鲜培养基中，通入气体(CO 50％，H2 5％，CO2 45％)，37℃恒温搅拌培养，发酵罐中发酵3天，发酵结束后收集发酵后产物。
实施例二
C.ljungdahlii与C.ragsdalei混合培养：培养环境与实施例一相同并且菌株只有C.ljungdahlii与C.ragsdalei。
将C.autoethanogenum与C.ljungdahlii混合菌液(C.autoethanogenum与C.ljungdahlii接种比例为2:1)按10％接种量接种于新鲜培养基中，通入气体(CO 50％，H25％，CO2 45％)，37℃恒温搅拌培养，发酵罐中发酵3天，发酵结束后收集发酵后产物，测得乙醇最高产量为10.7g/L。
实施例三
C.autoethanogenum与C.ragsdalei混合培养：培养环境与实施例一相同并且菌株只有C.autoethanogenum与C.ragsdalei。
将C.autoethanogenum与C.ragsdalei混合菌液(C.autoethanogenum与C.ragsdalei接种比例为2:1)按10％接种量接种于新鲜培养基中，通入气体(CO 50％，H25％，CO2 45％)，37℃恒温搅拌培养，发酵罐中发酵3天，发酵结束后收集发酵后产物，测得乙醇最高产量为2.0g/L。
实施例四
C.ljungdahlii与C.ragsdalei混合培养：培养环境与实施例一相同并且菌株C.ljungdahlii与C.ragsdalei。
将C.ljungdahlii与C.ragsdalei混合菌液(C.ljungdahlii与C.ragsdalei接种比例为1:1)按10％接种量接种于新鲜培养基中，通入气体(CO 50％，H2 5％，CO2 45％)，37℃恒温搅拌培养，发酵罐中发酵3天，发酵结束后收集发酵后产物，测得乙醇最高产量为13.2g/L。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种多菌混合发酵制取乙醇方法，其特征在于：包括以下步骤；
(1)保藏菌株的活化：将两种菌株C.ljungdahlii与C.ragsdalei分别接种至装有培养基溶液的试管中，在37℃恒温摇床中培养24h；
(2)传代培养：将C.ljungdahlii以及C.ragsdalei菌液按10％的接种量接种至含新鲜培养基试管中，所述的两种试管要求在37℃恒温摇床培养48h；连续多次传代培养至获取稳定性状菌株；
(3)扩大化培养获取种子：按各接种量(C.ljungdahlii 10％，C.ragsdalei 10％)接种两种菌株于125ml容量培养瓶中，混合后于37℃恒温摇床培养，获取足量菌液；
(4)发酵罐混合发酵：将新鲜培养基加入发酵罐中，按10％的接种量接种至发酵罐中，连续通入工业废气，37℃恒温搅拌培养；
(5)取样检测：每天2次对发酵液进行气相色谱检测，定量分析乙醇产量。
2.根据权利要求1所述的一种多菌混合发酵制取乙醇方法，其特征在于：培养基的内包括由以下组成；2(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)20.0g、Yeast extract0.5g、Mineral solution25.0ml、Trace element solution10.0ml、Vitamin solution10.0ml以及Milli-Q930.0ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种多菌混合发酵制取乙醇方法，其特征在于：所述的培养液为培养基的混合并且恒温振荡培养箱内摇床转速：200rpm，温度控制在37℃，PH＝5.9以及填充设有CO、CO2和H2的混合气环境内取得，所述试管内的培养基体积为9.3ml、培养瓶中培养基体积为93ml以及发酵罐中培养基体积为3L。
4.根据权利要求1或2所述的一种多菌混合发酵制取乙醇方法，其特征在于：所述步骤内还设有菌株C.autoethanogenum，所述的C.autoethanogenum按照步骤并且与C.autoethanogenum，C.ljungdahlii以及C.ragsdalei制配接种量比例为2：1：1，按10％接种量接种于新鲜培养基中，通入气体(CO 50％，H2 5％，CO2 45％)，37℃恒温搅拌培养，发酵罐中发酵3天，发酵结束后收集发酵后产物。
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