CN101415830B - 甘油的厌氧发酵 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于细菌在甘油底物上厌氧(发酵地)生长的适当的培养条件的开发。所述方法需要在中性到弱酸性pH、低钾盐和磷酸盐水平和高CO2水平，含高甘油浓度的培养基中培养具有功能性1，2-丙二醇途径和功能性II型甘油脱氢酶-二羟基丙酮激酶途径的细菌，以使甘油由此被转化为合乎期望的产物，例如乙醇、氢气、甲酸盐、琥珀酸盐或1，2-丙二醇。
Description
相关在先申请
本发明要求2006年3月31日递交的在先美国临时申请60/788,512以及2006年11月28日递交的60/867,581的优先权，两者均通过引用被整体包括在本文中。
联邦资助研究声明
本发明可能部分受政府资金的资助，美国政府在本发明中可能具有某些权利。
缩微胶片引用
不适用。
技术领域
本发明涉及用于细菌在甘油底物上发酵(即缺少电子受体)生长的适当的培养条件的开发。所述方法在开发能够使甘油转化成为高价值产品，例如乙醇、氢、甲酸盐、琥珀酸盐或1，2-丙二醇的方法和菌株上具有特别的用途。
背景技术
在生物柴油的生产中产生大量作为副产物的甘油，并且据预测，甘油的产量由于全球生物柴油产量的急剧增加将持续增加。在过去的两年中甘油的过剩已导致价格下降～10倍。
因此，粗甘油由于其低成本已成为发酵工艺的吸引人的碳源。不仅由于甘油充足，与纤维糖(cellulosic sugar)相比，其高还原态有希望显著增加化学品的产物产率，而由糖生产所述化学品要受到还原当量的可用性的限制。利用甘油中碳的较高还原态的优势将会需要使用厌氧发酵(即，否则所述电子受体将“夺取”(take)所述电子而不是被“积累(deposit)”在所述期望产物中，所述期望产物包括燃料或还原化合物)。然而，甘油在发酵工艺中用作碳源的潜力可能被工业微生物，例如大肠杆菌(Escherichia coli，现代微生物学的主力)不能在缺少外源电子受体时发酵甘油阻碍。发酵甘油的能力限于非常少的生物，其绝大部分由于致病性、需要严格的厌氧条件、缺乏其生理知识和对其进行改进的基因手段，以及高度营养需求而不适于工业应用。
甘油可以被甘油脱氢酶(GldA，由gldA编码)直接氧化，产生二羟基丙酮(DHA)。然而，作为II型甘油脱氢酶的(glyDH-II)的GldA被认为是隐蔽的或不在野生型大肠杆菌(E.coli)菌株中表达的。激活大肠杆菌中的GldA需要使glpK、glpR和glpD去活化继之以产生恢复其代谢甘油能力的突变株的诱变和选择程序(Jin等，1983；Tanh等1982a，b)。然而，既使在这个突变株中，GldA并不为E.coli提供以发酵方式代谢甘油的能力。
在本领域中需要的是将全球过剩的廉价甘油生物转化为其他原料化学品的方法。如果所述方法基于厌氧发酵以利用甘油中碳的较高还原态，该方法可以是尤其有利的。厌氧工艺还将提供成本优势，由于其对应的需氧工艺需要更高的资本投资并显示更高的操作成本。
发明公开
我们已经发现在某些条件下大肠杆菌事实上能够在缺少电子受体时发酵甘油。我们的发现代表一种用于在大肠杆菌和其他肠细菌中发酵甘油的新范例，并且可以实现微生物平台的开发以将低价值的未加工的甘油转化为高价值的化学品和燃料。
甘油发酵的方法被描述，其中pH、CO2浓度、甘油浓度、钾浓度、磷酸盐浓度以及羟基丙酮的浓度被控制以使甘油发酵代谢成期望的化学前体。
当pH是近中性或弱酸性时，可以获得改善的甘油发酵。在优选的实施方案中，所述pH是5.5到7.5，更优选的是pH6.0-6.5，在最优选的实施方案中所述pH是大约6.3。
CO2浓度不可避免地与pH相关联并且当pH增加时变小，这是由于CO2被转化为碳酸氢根，HCO3 -。通过将CO2增加到20-30％可以减少将pH增加到7.0以上的负面影响。用pH6.3和10％CO2、pH7.5和20％CO2可见改善的甘油发酵。更大浓度的CO2也是有益的。
由于甘油中碳的高还原态，维持氧化还原平衡变得非常“精细”，这是因为将甘油并入细胞量导致还原当量的净产生。H2在几个反应中起电子给体的作用(例如延胡索还原酶)并因此使氧化还原反应偏移。如果减少H2浓度，这就不会发生而甘油发酵就能优化地进行。通过增加顶部空间，H2被稀释，改善了甘油发酵。用惰性气体或CO2冲洗顶部空间除去过量的H2并进一步增加甘油的发酵。将气体吹扫或鼓泡通过所述培养基以除去最多的H2提供了最佳的甘油发酵条件。
当甘油原料浓度高时可以获得改善的甘油发酵，例如所述甘油原料浓度比5或10g/L大，或甚至更大(25g/L、50g/L、75g/L、100g/L)。在优选的实施方案中，甘油浓度大于100g/L。
可以用低钾和低磷酸盐浓度来获得改善的甘油发酵。钾浓度优选地小于10mM、更优选地小于5或2mM、且最优选地小于0.6mM。磷酸盐浓度优选小于50mM，更优选地小于25或10mM。更优选的是小于5mM并且最优选地小于1.3mM。较低的磷酸盐和钾有利甘油脱氢酶-二羟基丙酮激酶的作用以及1，2-PDO途径，后者使得氧化还原平衡条件成为可能。
用HA补充培养基(至少10、20、或30mM)，进一步改善培养条件。当用HA补充时不需要胰蛋白胨补充物。
在一实施方案中，发酵甘油通过在37℃pH6.3具有0.6mM钾和1.3mM的磷酸盐、10g/L甘油培养E.coli，同时用CO2、Ar或N2吹扫而得以优化。
在其他的实施方案中，本发明可以用于具体的应用，例如用甘油做碳源合成期望终产物，所述期望终产物例如琥珀酸盐、乙醇、甲酸盐或氢以及1，2-PDO。
附图的简要说明
图1：在由2g/L胰蛋白胨补充的基本培养基(MM)中由大肠杆菌MG1655发酵甘油。细胞生长(▲)甘油消耗(■)，以及乙醇(●)、琥珀酸盐(◆)和甲酸盐加乙酸盐(*)的积累。
图2：Na+，K+，PO4 3-以及甘油浓度的效果。将Na+(34mM)、K+(128mM)以及PO4 3-(98mM)按所示加至所述介质。除非另外注明，实验都是在pH7.5，37℃，10g/L甘油、2g/L胰蛋白胨下进行，并用氩气冲洗顶部空间。示出甘油发酵(线)和细胞生长(棒)：条形颜色表示pH6.3(灰色)或7.5(白色)。
图3：用于在具有II型glyDH的大肠杆菌和其他肠细菌中甘油发酵的新范例。所提出用于在大肠杆菌中将甘油转化为糖酵解中间产物DHAP的途径由GldA酶和DHAK构成。
图4：发酵甘油期间乙醇(线)-H2(实心棒)以及乙醇(线)-甲酸(空心棒)的共同生产。(I)MG1655：pH6.3，氩气；(II)ΔhycB：pH7.5，氩气。HycB是FHL系统的必需组分。
图5：由甘油生产琥珀酸：(I)MG1655：pH6.3，氩气；(II)MG1655：pH6.3，10％CO2，(III)MG1655：pH7.5，20％CO2；以及(IV)ΔdhaKLM(pZSKLcf)：pH7.5，20％CO2。质粒pZSKLcf表达C.freundii DHA激酶亚单位DhaKL。
本发明的最佳实施方式
本发明提供用细菌发酵甘油以生产有用的化合物的新方法。
“隐蔽”基因是一种不表达或基因表达条件未知的基因。
“歧化”是氧化和还原。
如本文所使用的，术语“阻断”和“阻断株”指其中天然基因或启动子被突变、删除、间断或下调以这样的方式减少由此编码的酶的活性的细胞株。通过敲除或移除整个基因DNA序列基因被完全地(100％)减去。使用移码突变、早期终止密码子、重要残基的点突变等等，通过完全阻止活性蛋白的转录和/或翻译，可以完全使基因产物去活化(100％)
“异化”是生物体将物质转化为分泌化合物的代谢过程。
术语“外源性的”表示所述蛋白和核酸是由生物体或系统之外引入的非天然分子，而不关心的物种来源。例如，可以将外源性多肽应用于细胞培养基；从转染到细胞中的重组DNA可以表达外源性RNA；或者天然基因可以处于外源调控序列的控制之下。
通过“发酵”表示完全不存在外部电子受体(无氧、无硝酸盐等等)时碳源的代谢或异化。
通过“功能性1，2-丙二醇途径”表示细菌通过一种或更多种不同路径功能性表达制造1，2-PDO所需要的基因(并由此表达酶)。举例来说，需要功能性mgsA(甲基乙二醛合成酶:MGS)、yeaE、yghZ以及yafB基因(醛酮还原酶：AKR)、gldA(甘油脱氢酶，GldA)中的每一个。一个重要的特征是给定生物体可能具有某种特定的途径的基因/酶但所述途径是隐蔽的。
通过“功能性II型甘油脱氢酶-二羟基丙酮激酶途径”表示所述细菌具有在缺少外部电子受体时通过将甘油转化为DHA到DHAP而由甘油制造DHA磷酸盐(DHAP)需要的酶。举例来说，所述细菌必须具有活性的GldA(gldA)和DHA激酶(DHAK：dhaKLM)。
通过“功能性F0F1ATP合成酶途径”表示细菌具有将ATP的合成与质子泵耦合所需要的所有的酶。例如，所述细菌必须具有起作用的atp操纵子，包括atpF和atpD。
通过“功能性甲酸盐-氢裂合酶(FHL)途径”表示所述细菌具有将甲酸盐歧化为CO2和氢所需的所有酶。举例来说，活性的甲酸脱氢酶(例如FDH-F：fdhF)以及氢化酶3(hyc操纵子)。
通过“功能性1，3-丙二醇途径”表示制造1，3-PDO所需的基因或酶。举例来说，在缺乏功能性1，3-丙二醇途径的细胞中甘油脱水酶(GD)和或1，3-PDO还原酶(1，3-PDOR)是去活化的或缺乏的。
“甘油”在NCBITM PubChem#753和CAS Reg#56-81-5中描述，通过引用包括在本文中。
通过“过度表达”表示基因(或蛋白)被修饰以具有比野生型增加的活性。这可以通过向所述细胞添加更多的基因拷贝、通过使所述基因突变以删除抑制序列、通过去掉抑制剂或通过改变所述蛋白来增加活性等等来达成。
如在本文中所使用的“重组体”涉及、来自于或包含基因工程改造的材料。
“降低的活性”或“去活化”在本文中被定义为与合适的对照物种相比，在蛋白活性上至少75％减低。优选地，获得至少80、85、90或95％的活性降低，在最优选的实施方案中，所述活性被消除(100％)。蛋白可以通过抑制剂、通过突变或通过抑制表达或翻译等等而去活化。通过“无效突变”或“无效突变化”表示所述蛋白活性被完全去活化。在一个实施例中，插入不具有感兴趣基因的对照质粒。在另一个实施例中，所述感兴趣的基因通过重组完全去除。此外，感兴趣的基因可以通过去活化、突变或截断以消除活性而去除。
术语“琥珀酸盐(succinate)”和“琥珀酸(succinic acid)”以及“甲酸盐(formate)”和“甲酸(formic acid)”在本文中被可互换地使用。本文中的化学品可以在NATIONAL LIBRARY oFMEDICINEPUBCHEMTM数据库(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中找到，所述数据库通过引用包括在本文中。细菌的代谢途径可以在Lehninger的Principles of Biochemistry2nd ed(生物化学原理，第二版，1993年)以及其他的生物化学教科书中找到，上述的Principles ofBiochemistry2nded通过引用包括在本文中。
表1：基因和酶
| 基因 | (缩写)蛋白质名称(Acc.No.) |
| adhE | 乙醛-CoA脱氢酶(GenBank # NP_415757) |
| atpD | F0F1ATP合成酶亚单位β(GenBank # NP_418188) |
| atpF | F0F1ATP合成酶亚单位B(GenBank # NP_418192) |
| cydA | 细胞色素D末端氧化酶，亚单位I(GenBank # NP_415261) |
| cyoB | 细胞色素O泛醇氧化酶，亚单位I(GenBank # NP_414965) |
| dhaK | (DHAK)二羟基丙酮激酶，亚单位K(在GenBank # NP_415718的N-末端区) |
| dhaK | (DHAK)二羟基丙酮激酶，亚单位1来自Citrobacter freundii(GenBank # AAB48843) |
| dhaL | (DHAL)二羟基丙酮激酶亚单位L(在GenBank # NP_415717的C-末端区) |
| dhaM | (DHAM)二羟基丙酮激酶亚单位M(在NP_415716的融合的磷酸转移 |
| 基因 | (缩写)蛋白质名称(Acc.No.) |
| 酶亚单位) | |
| fdhF | 甲酸脱氢酶-H，FDH(在GenBank # NP_418503的含硒多肽亚单位) |
| fixA | (ETF)电子转移黄素蛋白(GenBank # NP_414583) |
| frdA | (Frd)延胡索酸还原酶(GenBank # NP_418578) |
| fucO | (FucO)L-1，2-丙二醇氧化还原酶(GenBank # NP_417279) |
| gldA | (GDHA)甘油脱氢酶(GenBank # NP_418380) |
| glpA | 厌氧sn-甘油-3-磷酸脱氢酶(GenBank # NP_416744) |
| glpD | 需氧sn-甘油-3-磷酸脱氢酶(GenBank # NP_417884) |
| hycB | 甲酸盐氢裂合酶(FHL)复合物的氢化酶3部分(在GenBank #NP_417204的Fe-S亚单位) |
| mgsA | 甲基乙二醛合成酶(GenBank # NP_415483) |
| pta | 磷酸乙酰基转移酶(GenBank # NP_416800) |
| trkA | 钾离子转运外围膜组分(GenBank # NP_417748) |
| yafB | 2，5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶B(GenBank # NP_414743) |
| yeaE | 醛/酮还原酶(GenBank # NP_754080) |
| yghZ | 醛/酮还原酶(GenBank # NP_417474) |
| dhaR | (dhaS或dhaR)HTH-型dhaKLM操纵子转录激活子 |
实施例1：材料和方法
本发明由始至终，采用下列专用名称，基因阻断突变被称为：针对基因1的单阻断为Δgene1或针对双阻断的Δgene1Δgene2。
野生型大肠杆菌(E.coli)K12菌株MC4100(ATCC35695)、W3110(ATCC27325)，野生型大肠杆菌(E.coli)B(ATCC11303)，以及肠细菌阴沟肠杆菌阴沟杆菌亚属(Enterobacter cloacae subsp.cloacae)NCDC279-56(ATCC13047)、乡间布丘氏菌(Buttiauxella agrestis)(ATCC33994)、普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica)(ATCC15928)以及理氏勒米诺氏菌(Leminorella richardii)(ATCC33998)由美国典型培养物保藏中心(AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION
)获得。单突变重组株Δpta、ΔadhE、ΔcydA、ΔcyoB、ΔfrdA、ΔfixA、ΔglpA、ΔglpD、ΔmgsA、ΔyeaE、ΔyghZ、ΔyafB、ΔfucO、ΔatpF、ΔatpD、ΔpykF和ΔhycB由大肠杆菌基因组计划(威斯康辛大学麦迪逊分校，www.genome.wisc.edu)获得或采用由Datsenko和Wanner(2000)描述的方法构建。K12株MG1655(F-lambda-ilvG-rfb-50rph-1)被用作产生基因阻断突变的野生型。在MG1655和W3110(ATCC27325)两者中构建菌株ΔgldA、ΔdhaKLM以及ΔfdhF。多基因阻断是通过使用P1噬菌体转导组合单突变体而实现的。在除去卡那霉素盒后，将每种突变加至菌种，一次加一种。
质粒pZSKLM(表达大肠杆菌DHA激酶亚单位DhaKLM)以及pZSKLcf(表达弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)DHA激酶亚单位DhaKL)是由瑞士伯尔尼大学的B.Erni博士惠赠的(Bachler等，2005)。表达酶DHAK和GldA的质粒pZSKLM_gldA按如下构建。PCR扩增gldA基因的完整开读框架以及其核糖体结合位点。所述PstI以及MluI位点通过引物引入到PCR产物的两端以促进质粒pSZKLM中dhaKLM操纵子下游的gldA基因的克隆。用PstI和MluI消化质粒和PCR产物两者，接合、转化到DH5α中并针对阳性克隆屏蔽。成功构建所述质粒是经PCR并通过所编码的酶活证实。质粒被转移到大肠杆菌菌株中并在由适当的抗生素补充的LuriaBertani(LB)上筛选。
采用标准的重组DNA方法克隆、分离质粒、噬菌体P1转导、电穿孔和聚合酶链式反应(PCR)(Sambrook等，1989)。所述菌株被保持在-80℃的32.5％的甘油储备液中。采用含有1.5％琼脂的LB介质制备平板。按下列浓度包括抗生素和引物：100μg/ml氨苄青霉素，30μg/ml的氯霉素，50μg/ml的卡那霉素以及12.5μg/ml四环素，0.001-0.1mM IPTG以及100ng/mL无水四环素。
除非另外注明，采用由Neidhardt等(1974)设计的基本培养基(MM)，用0.03-0.2％胰蛋白胨、5μM亚硒酸盐(selenyte)以及用1.32mM Na2HPO4代替K2HPO4。MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)本身仅包括于在试管中进行实验中(见以下)或其中未采用胰蛋白胨补充的实验中。当指出时，所述介质由一定浓度的下列化合物补充：磷酸二氢钠和磷酸氢钠以及磷酸二氢钾和磷酸氢钾、磷酸二氢铵和磷酸氢铵、氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、L-氨基酸、核苷酸和维生素。除非另外注明，所有化学品都由SIGMA
Co.(St Louis，MS)获得。
所有实验都是在厌氧条件下进行的，并且除非另外注明，于37℃下进行。试管中的实验是在密封的厌氧管(HUNGATETM管：美国新泽西州BELLCO
Inc)中进行的，所述厌氧管用介质完全填充或用氩气持续吹扫(初始pH7.2)。所述发酵系统以及其在厌氧条件下的操作连同接种物制备技术在别处已有描述(Dharmadi等，2006)。
在使用前，将所述储备培养物(贮藏为-80℃的甘油储备液)在LB平板上划线并在具有CO2产生装置的OXOIDTM厌氧罐(英国罕布什尔贝辛斯托克的
Ltd.)中在37℃下温育过夜。采用单个菌落接种完全充满介质(由10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物、以及5g/L甘油补充的MM)的17.5mL的HUNGATETM管。所述试管在37℃下温育直到达到～0.4的OD550。此活跃生长的预培养物的适当体积被离心，洗涤所述小团并用于接种各发酵罐中的350mL介质，在550nm处的目标起始光密度为0.05。
用具有六个500ml工作体积的容器，并独立控制温度、pH以及搅拌速度(200rpm)的SIXFORSTM多重发酵系统进行发酵。所述系统装备完全并用制造商的IRIS NT软件计算机控制。各容器安有用0℃冷却的甲醇-水供应操作的冷凝管以防止挥发。厌氧条件通过用超高纯氩(得克萨斯州休斯顿的MATHESON 
Inc.)以0.01LPM冲洗顶部空间维持。采用氧气阱(伊利诺伊州迪尔菲尔德的ALLTECH 
Inc.)来消除气流中的痕量氧气。为了保持无菌，分别采用0.2-μm和0.45-μm的HEPA滤器(加利福尼亚州Bellerica的
)安装入口和出口线路。
在550nm测量光密度并用作细胞浓度的估计(1O.D.＝0.34g DW/L)。离心后，上清液在-20℃储存以用于HPLC分析。为了定量甘油、乳酸盐、乙酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐以及乙醇的浓度，使用装配有HPX-87H有机酸柱(加利福尼亚州Hercules的
)的SHIMADZU PROMINENCE SIL20TM系统(马里兰州哥伦比亚的SHIMADZU SCIENTIFIC
Inc.)用离子排除HPLC分析样品。使用先前描述的方法(Dharmadi和Gonzalez，2005)确定最优化的峰分离操作条件(流动相30mM H2SO4、柱温42℃)。使用气相色谱在选定的样品中测量氢产生。还可以将氢计算为(乙醇+乙酸盐)和甲酸盐的摩尔量之差。如以下所述经NMR(核磁共振)实验确定1，2-PDO的浓度并使用四甲基硅烷(TMS)作为标准物。
发酵产物的身份通过1D1H(质子)NMR实验确认。60μl D2O和1μl的600mM NMR内标TSP(3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-D4，钠盐)被加至540μl样品中。所得的溶液然后被转移到5mm-NMR管中并在25℃于装配有PENTATM探头的500MHz INOVATM谱仪上进行1D质子NMR谱。使用以下参数：扫描宽度8,000Hz；捕获时间2.8秒；捕获256次；脉冲宽度6.3μs；脉冲重复延迟1.2s以及预饱和2秒。所得谱使用FELIXTM2001(马里兰州伯林顿的ACCELRYS
Inc.)软件分析。峰通过其化学位移和J-耦合值鉴定，其在其中样品用代谢标准物(2mM终浓度)示踪的独立实验中获得。
所述样品进一步的表征是通过2D1H-1H COSY(相关光谱，COrrelation SpectroscopY)NMR实现的。具有watergate溶剂压制的双量子滤波COSY谱是通过wgdqfcosy脉冲序列获得的，所述的wgdqfcosy脉冲序列是脉冲序列BIOPACKTM套件(
Inc.)的部分。使用以下参数：扫描宽度6,000Hz；捕获时间0.5秒；t1维上600个复数点；32个瞬态；脉冲宽度5.5μs；弛豫延迟1秒。
通过在大肠杆菌中发酵50％U-13C-标记的甘油来评定甘油并入产蛋白的生物质。3天后(72小时)，收获所述试管并离心所述发酵肉汤。细胞小团用9g/L的NaCl溶液洗涤并再次离心。所得的细胞小团使用REACTI-THERMTM水解系统(伊利诺伊州Rockford的
)用6N持续煮沸的HCl在110℃水解24小时。采用CENTRIVAPTM系统(密苏里州堪萨斯的Corp.)使所述溶液在75℃真空下快速蒸发2小时以除去HCl。所述干燥样品在1ml D2O中复原(马萨诸塞州Cambridge的Cambridge Isotope Laboratories)，冰冻至-80℃，然后在4.5L FREEZONETM冻干系统(
Corp)中冻干24小时。然后将所述样品在600μl D2O中复原并过滤以除去细胞颗粒。将1μl TSP标准物加至所述样品，并将内含物转移到NMR管中。为了确定13C富集，所述样品采用在碳50上具有并发90°脉冲和不具有并发90°脉冲一维质子自旋回波分析。在碳上的90°脉冲重新调焦在13C碳原子上，由此压制由于质子-碳自旋耦合的13C卫星峰的产生。此现象对于12C原子不发生。对于这些实验，我们在500MHz Varian INNOVATM spectrometer使用了商业上可获得的脉冲序列pwxcal。采用以下参数：扫描宽度8,000Hz；捕获时间2.7秒；瞬态256个，在25℃pwx10和90°。根据化学位移和所述谱的精细结构鉴定单独的氨基酸。
为了进行酶分析，来自～0.7的OD550的厌氧培养物的细胞用离心收获(2分钟，10,000×g)，用9g/升NaCl洗涤，并以细胞小团在-20℃储存。细胞被重新悬浮于0.2ml各自的缓冲液中并通过涡旋与氯仿混合(Tao等，2001年)。通过测定在含有50mM Tris·HCl(pH7.6)、2mM MgCl2、500μM NAD+、10mM甘油以及10-100μl细胞粗提取物的混合物在25℃，340nm处吸光度的变化来检验甘油脱氢酶。对于所有制备物确立对HA的甘油脱氢酶活性、甲基乙二醛还原酶活性、醛-酮还原酶活性以及所述反应的线性(蛋白浓度和时间)。结果表示为微摩尔·分钟-1·毫克细胞蛋白-1，并且是对至少三个细胞制备物的平均。
细胞生长的比速率(μ)、甘油消耗以及产物合成通过将总细胞、甘油或产物浓度对细胞浓度的积分(ICC)作图，并将这些图拟合为多项式函数。
实施例2：甘油发酵和介质组成的影响
尽管人们认为大肠杆菌中甘油代谢限于呼吸条件下，我们发现此生物体可以在缺乏电子受体时代谢甘油。图1显示典型的野生型菌株MG1655在由2g/L胰蛋白胨补充的介质中的典型发酵曲线(其余细节在临时申请60/788,512和60/867,581以及Gonzalez等，2007年中提供)。在固定相培养物中剩下大约1-2g/L的甘油未发酵。使用不同的NMR技术鉴定了乙醇、1，2-丙二醇(1，2-PDO)以及琥珀酸、醋酸以及甲酸作为发酵产物。
下一步我们探索鉴定各种参数对于甘油发酵的影响效果。根据典型方法，进行钾、磷酸盐、钠、甘油、HA、pH和CO2对细胞生长滴定。
在先前的大肠杆菌中甘油代谢的研究中使用的典型介质含有高水平的磷酸盐、钾以及钠，其主要目的是将培养物的pH控制在从7-7.5。此介质最初由Tanaka等报道(1967)并随后在大肠杆菌中甘油的代谢研究中被大部分研究者使用。我们发现用这样水平的磷酸盐、钾和钠(即34mM NaH2PO4及64mM K2HPO4)补充我们的介质严重削弱甘油发酵(图2)——此影响在碱性pH下尤其有害。钾和磷酸盐是造成此消极作用的原因，但钠盐不是(图2)。在我们实验中分析甘油消耗模式显示在介质中留有显著量的甘油未被代谢(一般是10-30mM)，暗示存在限制厌氧发酵甘油的阈浓度。有趣的是，先前甘油代谢的研究也是在一般从20到30mM变化的甘油浓度下进行的。我们现在知道当采用含有高水平的磷酸盐和钾、2g/L的甘油的介质，并在pH7.5和37℃进行发酵时，甘油发酵和细胞生长被彻底削弱(图2)。
综上所述，我们的结果明确证实先前尝试用大肠杆菌厌氧发酵甘油的企图不成功是因为所述实验都是在消极影响甘油发酵的条件下进行的。这些条件包括使用中性到碱性的pH(7-7.5)、高浓度的钾和磷酸盐，相对低的甘油浓度、37℃以及密闭容器。后者是我们显示由于积累氢以及在氧化还原平衡上导致的结果而削弱甘油发酵的条件。
实施例3：甘油发酵的途径和机理
肠道细菌中甘油的厌氧发酵长久以来被认为是具有活性1，3-PDO途径的物种的特权。然而，我们已经证实，只要存在功能1，2-PDO途径和glyDH-II-DHAK途径，大肠杆菌可以以不依赖1，3-PDO方式，以发酵的方式代谢甘油。
基于我们的发现，所述发现在Dharmadi等(2006)、Gonzalez等2007以及临时申请60/867,581和60/788,512中更详细地描述(每一件都通过引用并入本文)，我们提出了用于在肠道细菌中甘油发酵的新范例，其中(i)所述的1，2-PDO途径提供消耗在合成细胞总量期间产生的还原当量，因此实现氧化还原平衡条件的手段以及(ii)通过氧化还原平衡途径合成乙醇，通过经底物水平的磷酰化产生ATP而实现能量要求(图3)。还发现所述甲酸氢裂合酶以及F0F1-ATP酶系统的活性可能是通过辅助维持胞内pH和CO2供应而促进甘油的发酵代谢。我们显示将甘油转化为糖酵解中间产物的途径主要由两种酶构成(图3)：甘油脱氢酶(glyDH)以及DHA激酶(DHAK)，前者是先前未知的生理角色。
Table2.发酵甘油期间细胞的生长1，2
| 菌株 | GldA蛋白 | 生长速率μM±SD3 | 生长产率YX/S±SD4 | 1，2-PDO5(mM) |
| W3110 | glyDH-II | 0.031±0.002 | 32.2±3.1 | 是 |
| MG1655 | glyDH-II | 0.040±0.003 | 32.9±2.9 | 是 |
| MC4100 | glyDH-II | 0.029±0.004 | 54.9±8.8 | 是 |
| 大肠杆菌(E.coli)B | glyDH-II | 0.036±0.002 | 34.1±2.7 | 是 |
| 阴沟肠杆菌(E.cloacae) | glyDH-II | 0.022±0.002 | 30.9±2.8 | 是 |
| 理氏勒米诺氏菌(L.richardii) | glyDH-III | ND | ND | ND |
| 乡村杆菌(B.agrestis) | glyDH-IV | ND | ND | ND |
| 普利茅斯沙雷氏菌(S.plymuthica) | 无 | ND | ND | ND |
1实验在0.2％的胰蛋白胨和10g/L甘油的存在下进行。
2NG：未观察到生长；ND：未检测到；SD：标准偏差。
3μM：在指数生长期间计算的最大比生长速率(h-1)。
4YX/S：按消耗单位甘油的细胞总量增加计算的生长产率(mg细胞/g甘油)。
5按所描述的通过NMR鉴定1，2-PDO的合成
我们所发现的菌株MG1655可以发酵甘油的现象是大肠杆菌物种的通性，因为其他的测试菌株(W3110，MC4100和E.coli B)也可以发酵甘油(表2)。由于两种其他glyDHs，即glyDH-III和glyDH-IV，已经在肠杆菌族(Enterobacteriaceae)的成员中得以确认，我们对其在厌氧发酵甘油中的参与进行了研究。只有菌株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)NCDC279-56，类似大肠杆菌拥有glyDH-II(2)，可以发酵甘油(表2)。我们对酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的初步结果似乎表明相似的途径可以支持在此生物体中发酵甘油。
以上的途径提供了可以解释所观察到的pH和钾、磷酸盐和甘油浓度对于甘油发酵的影响(见实施例2、临时申请60/867,581以及Gonzalez等，2007)的框架。举例来说，高水平的磷酸盐促进DHA和HA两者(两种在前述途径中的关键中间体)的分解并消极影响GldA的活性及其由HA的可诱导性。此外，MG合成酶，一种负责1，2-PDO合成的关键酶在高磷酸盐浓度下被抑制。高浓度的钾增加了MG(一种在1，2-PDO合成中的关键中间体)的毒性。GldA对于甘油的低亲和性[Km为3-40mM]解释了为了发酵代谢要求高浓度的甘油以及我们观察到的在介质中留有10-30mM的甘油未被发酵。
pH对于甘油发酵的影响也可以与其对于前述途径(见实施例2、临时申请60/867,581以及Gonzalez等，2007)的影响有关。GldA呈现强的pH依赖性，在强碱性pH氧化活性较高以及在中性到碱性条件下的还原活性。酸性条件不仅降低了glyDH的活性，还降低了合成1，2-PDO所需的MG还原活性。另一方面，碱性条件增加了MG(一种在1，2-PDO合成中的关键中间体)的毒性。显然，所述细胞内pH需要谨慎控制以避免关键酶的低活性和MG的毒性。举例来说，尽管细胞外6.3的pH明显防止了MG的毒性，细胞仍然需要一个系统来防止pH降到允许glyDH和MGR/AKR活性的水平以下。已知所述的FHL系统通过将甲酸转化为CO2和H2，可以防止细胞质酸性化，这可以解释为何在酸性条件下对于甘油发酵需要FHL。然而，FHL活性可以产生过量的氢，如果其积累将会消极影响甘油发酵。在碱性条件下，可能需要所述F0F1-ATP酶以防止细胞质碱性化，由此避免MG毒性。
实施例4：在工业介质中改进甘油发酵的生产效率和可行性
为了证实应用我们的发现对于改进甘油发酵的推论，我们将发现的主体途径(GldA-DHAK)在野生型菌株MG1655中过度表达并观察到在细胞生长和甘油发酵两者中多于2倍的增加。GldA-DHAK途径的放大是通过用质粒pZSdhaKLM_gldA转化MG1655而实现的。进一步的生产效率的提升可能需要糖酵解酶(例如磷酸丙糖异构酶)与所述GldA-DHAK途径的协同过度表达。此外，其他基于工艺的改进包括进一步优化培养介质、培养系统以及执行的操作模式。
甘油发酵在工业水平上的应用将需要使用在生物柴油生产期间得到的甘油。当MG1655在纯甘油和由FutureFuel化学公司所经营的生物柴油厂获得的两个甘油样品上培养时，我们观察到相似的细胞生长和甘油发酵：48小时培养后，所述细胞发酵4(纯)，3.9(提纯)和3.8(粗)g/L的甘油并达到1.2(纯)，0.96(提纯)，and0.98(粗)的光密度。
将具有成本有效的工业补充物胰蛋白胨补充的代替是商业成功的另一个重要因素。然而，我们已经证实用玉米浆(corn steep liquor)(一种在工业发酵中使用的廉价补充物)补充介质与观察到的用胰蛋白胨补充(Dharmadi等，2006)在相似水平支持甘油发酵。
我们还获得了能够在无补充的基本培养基中生长的MG1655突变体(OD5500.36以及发酵甘油8.1g/L)。这些突变体是通过在含有减少量的HA或胰蛋白胨的介质中多轮筛选可以发酵甘油的菌株而产生的(临时申请60/867,581)。
实施例5：来自甘油的产物
我们还做了使用甘油作为碳源以及以上所描述的介质形成产物的例证性证实。举例来说我们在图4展示了乙醇的生产。我们的结果表明微小的基因和环境调整使得大肠杆菌成为将甘油转化为乙醇以及H2-CO2(pH6.3)或乙醇和甲酸盐(pH7.5并阻断所述FHL系统)的优良生物催化剂。与此不同，经糖发酵生产乙醇不会提供H2或甲酸盐的共产生，因此代表更不经济的过程。乙醇-H2以及乙醇-甲酸盐产率的进一步改进可以由消除琥珀酸和乙酸途径(frdA和pta突变，Gonzalez等，2007以及临时申请60/867,581)造成。改进生产率并使用工业介质上面在上面的实施例4中描述。
另一个实施例是琥珀酸，其由糖的产生受限于被还原当量的可用性。幸运的是，通过氧化还原-平衡途径，其从甘油的合成是可行的。然而，在我们用MG1655的实验中观察到非常低的琥珀酸产量，这是甘油通过PEP依赖的GldA-DHAK途径而异化(即低PEP可用性)的结果。通过用弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)的ATP依赖的DHAK取代大肠杆菌PEP依赖的DHAK，并且使用适当的pH和CO2浓度，采用以上描述的介质，我们实现了琥珀酸产率近10倍的增加(图4)。琥珀酸产率的进一步改进可以由消除乙醇和乙酸途径(adhE和pta突变：Gonzalez等，2007以及临时申请60/867,581)造成。改进生产率并使用工业介质如同在上面的实施例4中被描述的那样，除了弗氏柠檬酸杆菌的ATP依赖的DHAK而不是天然的DHAK将被过度表达。为了使琥珀酸途径在能量上更有利，我们正在消除大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，由基因ppc编码)以及过度表达来自大肠杆菌(pckA)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)(pckA)或如在酶数据库BRENDA(Schomburg等，2004)所描述的其他的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的过度表达。通过琥珀酸途径(不像产生ATP的PEPC和PEPCK)的高能量产生将导致更高的生产效率和产率。
其合成受益于甘油中碳的高度还原态的另一产物是1，2-PDO。GldA-DHAK途径的放大不仅导致增加的生产效率还导致1，2-PDO合成近20倍的增加：MG1655仅产生0.026mM的1，2-PDO，而重组的菌株MG1655(pZSdhaKLM_gldA)积累0.51mM的该产物。这些结果可能是由于GldA参与了1，2-PDO的合成(Gonzalez等，2007)。
我们现在正探索几种用于由甘油产生高水平的1，2-PDO的策略，如下所述：
(1)用弗氏柠檬酸杆菌的ATP依赖的DHAK(dhaKL亚单位)代替大肠杆菌的天然的PEP依赖的DHAK(dhaKLM)以及其与天然的甘油脱氢酶(gldA)一起过度表达。
(2)过度表达甲基乙二醛合成酶、甘油脱氢酶和甲基乙二醛还原酶，所有都涉及将DHAP转化为1，2-PDO(Gonzalez等，2007以及临时申请60/867,581)。
(3)增加NADPH的可用性以通过经过度表达转氢酶的或改造在核心代谢途径中酶的辅助因子的特异性改善NADH到NADPH的转化，驱使DHAP转化为1，2-PDO，所述核心代谢途径中的酶包括甘油脱氢酶、甘油-3-P脱氢酶、甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶等。可替换地，这些处于天然形式的使用NADP作为辅助因子的酶的改变可以由其他生物体克隆并在大肠杆菌中表达。
(4)改造甘油脱氢酶(GD，其本性为通过将其转化为3-羟基丙醛而使甘油脱氢)以使甘油一步转化为HA。然后HA由GldA或大肠杆菌中的其他酶转化为1，2-PDO，正如我们在实验中已经证实的那样，在所述实验中，最初存在于培养介质中的HA被等化学计量地转化为1，2-PDO(临时申请60/867,581)。此途径可以避免甲基乙二醛作为中间体(非常有毒的产物)并代表更能量有效的将甘油转化为1，2-PDO的途径，因为不需要消耗ATP，这导致产率显著增加。所述改造的GD是由诱变丁酸梭菌(C.butyricum)GD(dhaBI)而获得的，其不像其他的GD，其活性不需要辅酶B12。我们还进行了可以将甘油转化为HA的天然微生物GD的搜索。一旦发现，此活性就将被克隆并在大肠杆菌中表达。
(5)将化学的(甘油到HA)和生物的(HA到1，2-PDO)组合策略。已经用使用固体催化剂、适宜温度(～200℃)和常压的工艺下有效实现甘油到HA的脱水(Crabtree等，2006)。仅有的产物是HA和水。我们已经证实在含有甘油的介质中通过大肠杆菌细胞将HA有效转化为1，2-PDO(Gonzalez等，2007以及临时申请60/867,581)。甘油的消耗量是最小的并且在非常短的发酵中实现HA到1，2-PDO的等化学计量转化。
在上面描述的并在图4和5中显示的结果明确证实开发用于由甘油生产燃料和还原化学品平台的可行性。其生产经甘油发酵将会是有利的其余产物包括丙醇酰胺(propanolamide)、丙酸、丁醇等(Gonzalez等，2007)。这些工艺将真正的生物炼制得以实施并通过大幅改进其经济效果而使生物燃料工业革命化。
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Claims (18)
1.一种厌氧发酵甘油以生产产物的方法，包括：
将细菌细胞在厌氧条件下在介质中培养以使甘油被转化为产物，
其中所述细菌细胞：
i)缺乏甘油脱水酶或1,3-PDO还原酶或二者，并且无法制造1,3-丙二醇，
ii)具有甲基乙二醛合成酶、醛酮还原酶以及甘油脱氢酶并且能够制造1,2-丙二醇，
iii)具有II型甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶并且能够由所述甘油制造二羟基丙酮磷酸盐，
iv)具有甲酸脱氢酶和氢化酶并且能够将甲酸盐歧化为CO2和氢，以及
v)具有F0F1-ATP合成酶并且能够将ATP的合成与质子泵耦合；
其中所述介质包括至少10g/L的甘油作为碳源，小于10mM的钾，小于50mM的磷酸盐、大于或等于10%的CO2以及在5.0和7.5之间的pH；
其中所述细菌的菌株选自由MG1655、W3110、MC4100、E.coli B以及E.cloacae组成的组；并且
其中所述产物选自由乙醇、琥珀酸、甲酸、氢以及1,2-PDO所组成的组。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述介质由羟基丙酮补充，但不用胰蛋白胨补充。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述介质用30mM的羟基丙酮补充。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述介质pH小于或等于6.5。
5.如权利要求1所述的方法，其中当所述pH是7.5时CO2是至少20%。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述介质具有小于或等于2mM的钾以及小于或等于10mM的磷酸盐。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述介质具有小于或等于1mM的钾以及小于或等于5mM的磷酸盐。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述介质具有小于或等于1mM的钾以及小于或等于2mM的磷酸盐。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述pH是6.3并且所述介质用惰性气体吹扫，并且所述产物是乙醇以及氢。
10.如权利要求9所述的方法，其中天然的甘油脱氢酶-二羟基丙酮激酶途径被过度表达。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述介质还包括玉米浆。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述天然甘油脱氢酶-二羟基丙酮激酶途径被过度表达。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述介质还包括玉米浆。
14.如权利要求8所述的方法，其中所述细菌细胞缺乏天然二羟基丙酮激酶亚单位，并且表达来自弗氏柠檬酸杆菌的二羟基丙酮激酶，并且所述产物是琥珀酸盐。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述介质包括10-20%的CO2而pH是6-7.5。
16.如权利要求15所述的方法，其中天然甘油脱氢酶和弗氏柠檬酸杆菌二羟基丙酮激酶被过度表达。
17.如权利要求8所述的方法，其中天然甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶被过度表达，而所述产物是1,2-PDO。
18.一种产生1,2-PDO的方法，包括：将细菌细胞在厌氧条件下在介质中培养以使甘油被转化为1,2-PDO，其中所述细菌细胞：
i)缺乏甘油脱水酶或1,3-PDO还原酶或二者，并且无法制造1,3-丙二醇，
ii)具有甲基乙二醛合成酶、醛酮还原酶以及甘油脱氢酶并且能够制造1,2-丙二醇，
iii)具有II型甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶并且能够由所述甘油制造二羟基丙酮磷酸盐，
iv)具有甲酸脱氢酶和氢化酶并且能够将甲酸盐歧化为CO2和氢，以及
v)具有F0F1-ATP合成酶并且能够将ATP的合成与质子泵耦合，其中所述介质包括至少10g/L的甘油作为碳源，小于10mM的钾，小于50mM的磷酸盐、大于或等于10%的CO2以及在5和7.5之间的pH，其中所述细菌的菌株选自由MG1655、W3110、MC4100、E.coli B以及E.cloacae组成的组。
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