BRPI0709679A2 - método para fermentar anaerobicamente glicerol para produzir um produto; e método de produção de 1,2-pdo - Google Patents
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Abstract
MéTODO PARA FERMENTAR ANAEROBICAMENTE GLICEROL PARA PRODUZIR UM PRODUTO; E MéTODO DE PRODUçãO DE 1,2-PDO. A invenção se refere ao desenvolvimento de condições de cultivo apropriadas para que uma bactéria cresça anaerobicamente (fermentativamente) em um substrato de glicerol. O método requer o cultivo de bactérias com uma via funcional de 1,2-propanodiol e uma via funcional da glicerol desidrogenase do tipo II-diidroxiacetona quinase em um meio de cultura contendo altas concentrações de glicerol, um pH neutro a levemente ácido, baixos níveis de potássio e fosfato e altos níveis de CO~ 2~, de modo que o glicerol seja, dessa forma, convertido em um produto desejável, como etanol, hidrogênio, formato, succinato ou 1,2-propanodiol.
Description
"MÉTODO PARA FERMENTAR ANAEROBICAMENTE GLICEROLPARA PRODUZIR UM PRODUTO; E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE 1,2-PDO".
PEDIDOS RELACIONADOS ANTERIORES
Este pedido reivindica a prioridade dos pedidosprovisórios anteriores U.S. 60/788.512, depositado em 31 demarço de 2006, e 60/867.581, depositado em 28 de novembro de2006, ambos aqui integralmente incorporados por referência.
DECLARAÇÃO DE PESQUISA COM PATROCÍNIO FEDERAL
Esta invenção foi patrocinada em parte com verbasgovernamentais e o Governo Americano pode ter certosdireitos na invenção.
REFERNCIA A APÊNDICE MICROFILMADONão aplicável
CAMPO DA TÉCNICAA invenção refere-SE ao desenvolvimento decondições de cultivo apropriadas para o crescimentofermentativo de bactérias (isto é, na ausência de receptoresde elétrons) em um substrato de glicerol. A invenção temusos particulares para o desenvolvimento de métodos e cepascapazes de converter glicerol em produtos de maior valor,como etanol, hidrogênio, formato, succinato e 1,2-propanodiol.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
Grandes quantidades de glicerol são produzidascomo um subproduto da produção de biodiesel, e se prevê quea produção de glicerol continue a aumentar por causa dotremendo crescimento global na produção de biodiesel. Oatual excesso de glicerol já resultou em uma redução de -10vezes no preço nos últimos dois anos.
Glicerol bruto, portanto, tornou uma fonte decarbono atraente para processos de fermentação, em parte porcausa de seu baixo custo. Não apenas o glicerol é abundante,mas seu estado mais reduzido, em comparação dom açúcarescelulósicos, promete um aumento significativo no rendimentode produto de substâncias químicas cuja produção a partir deaçúcares seja limitada pela disponibilidade de equivalentesredutores. Tirar vantagem do estado mais reduzido do carbonono glicerol requeriria o uso de fermentações anaeróbicas(isto é, de outra forma, o receptor de elétrons "tirará"elétrons, em vez de serem "depositados" no produto desejado,incluindo combustíveis ou compostos reduzidos). O potencialde uso do glicerol como uma fonte de carbono em processos defermentação poderia ser prejudicado, entretanto, pelaincapacidade de microorganismos industriais, como Escherichiacoli (o cavalo de batalha da moderna biotecnologia), defermentarem glicerol na ausência de receptores de elétronsexternos. A capacidade de fermentar glicerol se restringe amuito poucos organismos, a maioria deles incapazes deaplicação industrial devido à patogenicidade, exigência decondições anaeróbicas estritas, falta de conhecidofisiológico e ferramentas genéticas para sua modificação eelevadas exigências nutricionais.
O glicerol pode ser diretamente oxidado pelaenzima glicerol desidrogenase (GldA, codificada por gldA)GldA, que é caracterizada como uma glicerol desidrogenase dotipo II (glyDH-II), seja criptica ou não expressada em cepasdo tipo selvagem de E. coli. A ativação de GldA em E. colirequeria a inativação de glpK, glpR e glpD seguida por umprocedimento de mutagênese e seleção, que resultava em umacepa mutante que recuperava sua capacidade de metabolizarglicerol (Jin et al., 1983; Tanh et al., 1982a, b).Entretanto, mesmo nessa cepa mutante, GldA não confere a E.coli a capacidade de metabolizar fermentativamente glicerol(Jin et al., 1983; Tanh et al., 1982a, b).
O que se precisa na técnica é de um método debioconversão do excesso global de glicerol barato em outrassubstâncias químicas de matéria-prima. 0 método seriaespecialmente vantajoso caso se baseasse em fermentaçãoanaeróbica para tirar vantagem do estado mais reduzido docarbono no glicerol. Um processo anaeróbico tambémofereceria vantagens de custo, pois seus processos aeróbicoscorrespondentes requerem maiores investimentos de capital eexibem maiores custos operacionais.
EXPOSIÇÃO DA INVENÇÃO
Descobrimos que E. coli é, de fato, capaz defermentar glicerol na ausência de receptores de elétrons sobcertas condições. Nossos achados representam um novoparadigma para fermentação de glicerol em E. coli e outrasbactérias entéricas e permitem o desenvolvimento deplataformas microbianas para converter glicerol bruto debaixo valor substâncias químicas e combustíveis de maiorDescreve-se um método de fermentação de glicerolem que o pH, concentração de CO2, concentração de glicerol,concentração de potássio, concentração de fosfato econcentrações de hidroxiacetona (HA) são controlados parapermitir o metabolismo fermentativo de glicerol emprecursores químicos desejados.
Uma fermentação de glicerol aperfeiçoada pode serobtida quando o pH é quase neutro a levemente ácido. Em umamodalidade preferida, o pH é de 5,5-7,5, mais preferivelmenteo pH é de 6,0-6,5, em uma modalidade mais preferida, o pH éde cerca de 6,3.
As concentrações de CO2 estão inevitavelmenteligadas ao pH e diminuem quando o pH aumenta, porque o CO2 éconvertido em bicarbonato, HCO3-. Aumentando-se o CO2 para 20- 30%, os efeitos negativos de um pH aumentado acima de 7,0podem ser reduzidos. Observou-se uma melhor fermentação deglicerol com pH 6,3 e 10% de CO2, pH 7,5 e 20% de CO2.Maiores concentrações de CO2 também são benéficas.
Dado o estado altamente reduzido do carbono noglicerol, a manutenção de um equilíbrio redox se torna muito"delicada", porque a incorporação de glicerol na massacelular resulta na geração líquida de equivalentesredutores. H2 serve de doador de elétrons em várias reações(por exemplo, fumarato redutase) e, portanto, compensa oequilíbrio redox. Se a concentração de H2 for diminuída,isso não acontece, e a fermentação de glicerol se processade maneira ótima. Aumentando-se o espaço superior, o H2 foilavagem do espaço superior com gás inerte ou C02 remove oexcesso de H2 e aumenta ainda mais a fermentação deglicerol. Borrifar ou borbulhar gás através da culturaremove a maior parte do H2 e proporciona as melhorescondições de fermentação de glicerol.
Uma melhor fermentação de glicerol pode ser obtidaquando as concentrações de matéria-prima de glicerol sãoaltas, por exemplo, maiores que 5 ou 10 g/L, ou mesmomaiores (25 g/L, 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L). Em uma modalidadepreferida, as concentrações de glicerol são maiores que 100 g/L.
Uma melhor fermentação de glicerol pode ser obtidacom baixas concentrações de potássio e de fosfato. Asconcentrações de potássio eram, de preferência, menores que10 mM, mais preferivelmente menores que 5 ou 2 mM e, o maispreferivelmente, menores que 0,6 mM. As. concentrações defosfato eram, de preferência, menores que 50 mM, maispreferivelmente menores que 25 ou 10 mM. Mais preferivelmente,são menores que 5 mM e, o mais preferivelmente, menores que1,3 mM. Baixos fosfato e potássio favorecem a operação dasvias de glicerol desidrogenase-diidroxiacetona quinase e1,2-PDO, esta última permitindo condições equilibradas deredox.
A suplementação da cultura com HA (pelo menos 10,20 ou 30 mM) melhorou ainda mais as condições da cultura. Asuplementação com triptona não foi requerido, quando acultura foi suplementada com HA.Em uma modalidade, a fermentação de glicerol foiotimizada por cultivo de E. coli com 10 g/L de glicerol a pH6,3 com 0,6 mM de potássio e 1,3 mM de fosfato a 37°C,enquanto se borrifava com CO2, Ar ou N2.
Em outras modalidades, a invenção pode ser usadapara aplicações especificas como a síntese de produtosfinais desejados, como succinato, etanol, formato ouhidrogênio e 1,2-PDO usando-se glicerol como a fonte decarbono.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
FIGURA. 1. Fermentação de glicerol por E. coliMG1655 em meio mínimo (MM) suplementado com 2 g/L detriptona. Crescimento celular (A), consumo de glicerol (■) eacumulação de etanol (·), succinato (□) e formato maisacetato (□).
FIGURA 2. Efeito da concentração de Na+, K+, PO43"e glicerol. Na+ (34 mM) , K+ (128 mM) e PO43- ( 98 mM) foramadicionados ao meio conforme indicado. A menos que indicadode outra forma, os experimentos foram conduzidos a pH 7,5,37 °C, 10 g/L de glicerol, 2 g/L de triptona e lavagem doespaço superior com argônio. Mostram-se a fermentação deglicerol (linha) e o crescimento celular (barras): a cor dabarra indica pH 6,3 (cinza) ou 7,5 (branca) .
FIGURA 3. Um novo paradigma para fermentação deglicerol em E. coli e outras bactérias entéricas que possuemuma glyDH do tipo II. A via proposta para a conversão deglicerol no intermediário glicolítico DHAP em E. coli éFIGURA 4. Co-produção de etanol (Iinha)-H2 (barrascheias) e etanol (linha)-ácido fórmico (barras abertas)durante a fermentação de glicerol. (I) MG1655: pH 6,3,Argônio; (II) AhycB: pH 7,5, Argônio. HycB é um componenterequerido do sistema FHL.
FIGURA 5. Produção de ácido succinico a partir deglicerol: (I) MG1655: pH 6,3, Argônio; (II) MG1655: pH 6,3,10%C02, (III) MGl 655: pH 7,5, 20% CO2; e (IV)AdhaKLM (pZSKLcf) : pH 7,5, 20% CO2. 0 plasmidio pZSKLcfexpressa Subunidades DhaKL da DHA quinase de C. freundii.
MELHOR MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
A invenção apresenta um novo método de fermentaçãode glicerol com bactérias para produzir compostos químicosúteis.
Um gene "críptico" é um que não seja expresso oucujas condições para a expressão do gene sejamdesconhecidas.
"Desproporcionar" é oxidar e reduzir.
Os termos "disrupção" e "cepas de disrupção",conforme aqui usados, referem-se a cepas celulares em que ogene nativo ou promotor tenha sofrido mutação, estejadeletado, interrompido ou regulado negativamente, de modo adiminuir a atividade da enzima codificada por ele. Um geneestá completamente (100%) reduzido por eliminação ou remoçãoda seqüência de DNA genômico inteira. O uso de uma mutaçãode deslocamento de quadro, códon de parada precoce, mutaçõespontuais de resíduos críticos ou deleções ou inserções eimpedindo completamente a transcrição e/ou tradução daproteína ativa.
"Dissimilação" é o processo metabólico pelo qualorganismos convertem substâncias em compostos excretados.
0 termo "exógeno" indica que a proteína ou ácidonucléico é uma molécula não nativa introduzida de fora doorganismo ou sistema, sem referência à espécie de origem.
Por exemplo, um peptídio exógeno pode ser aplicado à culturacelular; um RNA exógeno pode ser expressado por um DNArecombinante transfectado em uma célula; ou um gene nativopode estar sob o controle de seqüências reguladorasexógenas.
"Fermentação" significa o metabolismo ou dissimi-lação de uma fonte de carbono na ausência completa dereceptores de elétrons externos: nenhuma oxigênio, nenhumnitrato, e outros.
"Via funcional de 1,2-propanodiol" significa queas bactérias expressam funcionalmente os genes (e, portanto,as enzimas) necessários para preparar 1, 2-PDO por uma oumais vias diferentes. Por exemplo, genes funcionais de mgsA(metilglioxal sintetase: MGS), yeaE, yghZ e yafB (aldo-cetoredutase: AKR), gldA (glicerol desidrogenase, GldA) sãotodos requeridos. Uma distinção importante é que um dadoorganismo poderia ter os genes/enzimas de uma viaespecífica, mas a via ser críptica.
"Via funcional da glicerol desidrogenase do tipoII-diidroxiacetona quinase" significa que as bactérias têmpartir de glicerol na ausência de receptores de elétronsexternos por conversão de glicerol em DHA em DHAP. Porexemplo, as bactérias têm de ter GldA (gldA) e DHA quinaseativas (DHAK: dhaKLM).
"Via funcional da F0Fi ATP sintetase" significa queas bactérias têm todas as enzimas necessárias para acoplar asíntese de ATP com a bomba de prótons. Por exemplo, asbactérias têm de ter óperons atp funcionando, incluindo atpFe atpD.
"Via funcional da formato-hidrogênio liase (FHL)"significa que as bactérias têm todas as enzimas necessáriaspara desproporcionar formato em CO2 e hidrogênio. Porexemplo, formato desidrogenase ativa (por exemplo, FDH-F:fdhF) e hidrogenase 3 (óperons hyc).
"Via funcional de 1, 3-propanodiol" significa osgenes ou enzimas requeridos para preparar 1,3-PDO. Porexemplo, glicerol desidratase (GD) e/ou 1,3-PDO redutase(1,3-PDOR) estão inativas ou ausentes em uma céluladesprovida da via funcional de 1, 3-propanodiol.
"Glicerol" é descrito em NCBI™ PubChem n° 753 eCAS Reg n° 56-81-5, aqui incorporados por referência.
"Superexpressado" significa que o gene (ouproteína) está modificado para ter atividade aumentada emcomparação com o tipo selvagem. Isso pode ser feito poradição de mais cópias de um gene em uma célula, por mutaçãodo gene para deletar seqüências inibitórias, por remoção deinibidores ou por alteração da proteína .para aumentar aConforme aqui usado, "recombinante" refere-se a, éderivado de ou contém material manipulado geneticamente.
"Atividade reduzida" ou "inativar" é aqui definidocomo sendo uma redução de pelo menos 75% na atividade daproteína, em comparação com uma espécie de controleapropriada. De preferência, uma redução de atividade de pelomenos 80, 85, 90 ou 95% é atingida e, na modalidade maispreferida, a atividade é eliminada (100%). As proteínaspodem ser inativadas com inibidores, por mutação ou por supressão da expressão ou tradução e outros. "Mutante nulo"ou "mutação nula" significa que a atividade da proteína écompletamente inativada. Em um exemplo, o plasmídio decontrole é inserido sem o gene de interesse. Em outroexemplo, o gene de interesse é completamente removido por recombinação. Além disso, o gene de interesse pode serremovido por inativação, mutação ou truncamento, o queelimina a atividade.
Os termos "succinato" e "ácido succínico" e"formato" e "ácido fórmico" são aqui usados de maneira intercambiável. As presentes substâncias químicas podem serencontradas na base de dados da NATIONAL LIBRARY OFMEDICINE® PUBCHEM™ (pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) aquiincorporada por referência. Vias metabólicas bacterianaspodem ser encontradas em Principies of Biochemistry 2a ed., de Lehninger (1993), aqui incorporado por referência, assimcomo muitos outros textos de bioquímica.Tabela 1. Genes e Enzimas
<table>table see original document page 12</column></row><table>Tabela 1. Genes e Enzimas (continuação)
<table>table see original document page 13</column></row><table>
EXEMPLO 1: MATERIAIS E MÉTODOS
Em todo este pedido, mutantes de disrupção de genesão citados usando-se a seguinte nomenclatura: Agenel parauma disrupção simples do genel ou AgenelAgene2 para umadisrupção dupla.
E. coli K12 do tipo selvagem cepas MC4100 (ATCC35695), W3110 (ATCC 27325), E. coli B do tipo selvagem (ATCC11303) e as bactérias entéricas Enterobacter cloacae subsp.cloacae NCDC 279-56 (ATCC 13047), Buttiauxella agrestisrichardii (ATCC 33998) foram obtidas na AMERICAN TYPECULTURE COLLECTION . As cepas recombinantes mutantes únicasApta, AadhE, AcydA, AcyoB, AfrdA, AfixA, AglpA, AglpD,AmgsA, AyeaE, AyghZ, AyafB, AfucO, AatpF, AatpD, ApykF e AhycB foram obtidas no Projeto Genoma de E. coli(Universidade de Wisconsin-Madison, www.genome.wisc.edu) ouconstruídas usando-se o método descrito por Datsenko eWanner (2000). K12 cepa MG1655 (F- lambda- ilvG- rfb-50 rph-1) foi usada como o tipo selvagem para a criação de mutantes de disrupção de gene. As cepas AgldA, AdhaKLM e AfdhF foramconstruídas tanto em MG1655, quanto em W3110 (ATCC 27325).Disrupções de múltiplos genes foram conseguidas porcombinação de mutações únicas mediante uso de transdução defago PI. Cada mutação foi adicionada à cepa uma de cada vez, após a remoção do cassete de canamicina.
Os plasmídios pZSKLM (que expressa subunidadesDhaKLM de DHA quinase de E. coli) e pZSKLcf (que expressasubunidades DhaKL de DHA quinase de Citrobacter freundii)foram gentilmente fornecidos pelo Dr. B. Erni, Universidade de Berna, Suíça (Bachler et al., 2005). 0 plasmídiopZSKLM_gldA, que expressa as enzimas DHAK e GldA, foiconstruído da seguinte maneira. 0 quadro de leitura abertocompleto do gene gldA, juntamente com seu sítio de ligação aribossomo, foram amplificados por PCR. Os sítios PstI e MluI foram introduzidos mediante o primer em ambas asextremidades do produto de PCR para facilitar a clonagem 'dogene gldA a jusante do óperon dhaKLM no plasmídio pSZKLM.com PstI e MluI, ligados, transformados em DH5a e triadosquanto a colônias positivas. Uma construção bem sucedida doplasmidio foi verificada por PCR e mediante caracterizaçãodas atividades da enzima codificada. Os plasmidios foramtransformados nas cepas de E. coli e selecionados em LuriaBertani (LB) suplementado com antibióticos apropriados.
Procedimentos padronizados de DNA recombinanteforam usados para a clonagem, isolamento do plasmidio,transdução do fago PI, eletroporação e reação em cadeia depolimerase (PCR) (Sambrook et al., 1989). As cepas forammantidas em estoques de glicerol a 32,5% a -80°C. As placasforam preparadas usando-se meio LB contendo 1,5% de agar.Antibióticos e indutores foram incluídos quando apropriadonas seguintes concentrações: 100 μg/mL de ampicilina, 30pg/mL de cloranfenicol, 50 yg/mL de canamicina e 12,5 pg/mLde tetraciclina, 0,001-0,1 mM de IPTG e 100 ng/mL deanidrotetraciclina.
Usou-se o meio mínimo (MM) projetado por Neidhardtet al. (1974) suplementado com 0,03-0,2% de triptona, 5 μΜde selenita e 1,32 mM de Na2HPO4 em vez de K2HPO4, a menosque especificado de outra forma. O próprio MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico) só foi incluído em experimentosconduzidos em tubos (veja abaixo) ou em experimentos em quenão se usou nenhuma suplementação com triptona. Quandoindicado, o meio foi suplementado com concentraçõesespecíficas dos seguintes compostos: fosfatos de sódio epotássio monobásico e dibásico, fosfatos de amôniocloreto de potássio, sulfato de potássio, L-aminoácidos,nucleotideos e vitaminas. Todas as substâncias químicasforam obtidas na SIGMA-ALDRICH® Co. (St Louis, MS), a menosque especificado de outra forma.
Todos os experimentos foram conduzidos sobcondições anaeróbicas e, a menos que indicado de outraforma, a 37°C. Experimentos em tubos foram conduzidos emtubos anaeróbicos lacrados (tubos HUNGATE™: BELLCO GLASS®Inc., NJ, USA) completamente cheios de meio ou continuamenteborrifados com argônio (pH inicial de 7,2) . Os sistemas defermentação e sua operação sob condições anaeróbicas,juntamente com técnicas de preparação de inóculo, foramdescritos em outro lugar (Dharmadi et al. , 2006).
Antes do uso, as culturas de estoque (armazenadascomo estoques de glicerol a -80°C) foram espalhadas sobre
placas LB e incubadas durante uma noite a 37°C em um jarro®anaeróbico OXOID™ com o kit de geração de gás CO2 (OXOIDLtd, Basingstoke, Hampshire, UK) . Usou-se uma única colôniapara. inocular tubos HUNGATE™ de 17,5 mL completamentecheios de meio (MM suplementado com 10 g/L de triptona, 5g/L de extrato de levedura e 5 g/L de glicerol) . Os tubosforam incubados a 37°C até se atingir uma OD550 de -0,4. Umvolume apropriado dessa pré-cultura de crescimento ativo foicentrifugado, e a pelota foi lavada e usada para inocular350 mL de meio em cada fermentador, com a densidade ópticade partida alvo de 0,05 a 550 nm.
As fermentações foram conduzidas em um sistema deSuíça) com seis recipientes de 500 mL de volume de trabalhoe controle independente de temperatura, pH e velocidade doagitador (200 rpm.). O sistema estava completamente equipadoe controlado por computador usando-se o software do fabricante IRIS NT. Cada recipiente foi equipado com umcondensador para evitar a evaporação, que foi operado com umsuprimento de metanol-água de resfriamento a 0°C. Ascondições anaeróbicas foram mantidas por lavagem do espaçosuperior com argônio de pureza ultra-alta (MATHESON TRI-GAS®, Inc., Houston, TX) a 0,01 LPM. Um coletor de oxigênio(ALLTECH ASSOCIATES®, Inc., Deerfield, IL) foi usado paraeliminar vestígios de oxigênio da corrente gasosa. Paramanter a esterilidade, filtros HEPA de 0,2 μπι e 0,45 μιη(MILLIPORE , Billerica, CA) foram usados para encaixe nas linhas de entrada e saída, respectivamente.
A densidade óptica foi medida a 550 nm e usadacomo uma estimativa da concentração celular (1 O.D. = 0,34 gde DW/L). Após a centrifugação, o sobrenadante foiarmazenado a -20°C para análise por HPLC. Para quantificaras concentrações de glicerol, lactato, acetato, formato,succinato e etanol, as amostras foram analisadas com HPLC deexclusão de íons usando-se um sistema SHIMADZU PROMINENCESIL 20™ (SHIMADZU SCIENTIFIC INSTRUMENTS® Inc., Columbia,MD) equipado com uma coluna de ácido orgânico HPX-87H (BIO- RAD , Hercules, CA). As condições operacionais para otimizara separação de pico (30 mM de H2SO4 em fase móvel,temperatura da coluna de 42°C) foram determinadas usando-se2005). A produção de hidrogênio foi medida em amostrasselecionadas usando-se cromatografia gasosa. O hidrogêniotambém podia ser calculado como a diferença entrequantidades molares de (etanol + acetato) e formato. Asconcentrações de 1,2-PDO foram determinadas medianteexperimentos de NMR (ressonância magnética nuclear),conforme descrito abaixo e usando-se tetrametilsilano (TMS)como padrão.
As identidades dos produtos de fermentação foramconfirmadas mediante um experimento de NMR ID IH (Próton).60 pL de D2O e 1 pL de padrão interno de NMR a 600 mM TSP(ácido 3-(trimetilsilil)propiônico-D4, sal sódico) foramadicionados a 540 pL da amostra. A solução resultante foi,então, transferida para um tubo de NMR de 5 mm, e aespectroscopia NMR ID próton foi realizada a 25°C em umespectrômetro VARIAN 500MHz INOVA™ equipado com uma sondaΡΕΝΤΑ™. Foram usados os seguintes parâmetros: 8.000 Hz delargura de varredura; 2,8 segundos de tempo de aquisição;256 aquisições; 6,3 ps de largura de pulso; 1,2 s de retardode repetição de pulso; e pré-saturação durante 2 segundos. 0espectro resultante foi analisados usando-se o softwareFELIX™ 2001 (ACCELRYS SOFTWARE® Inc., Burlington, MA). Ospicos foram identificados por seus deslocamentos químicos evalores de acoplamento J, que foram obtidos em experimentosseparados, em que as amostras receberam adições de padrõesmetabólicos (concentração final de 2 mM).
A caracterização adicional das amostras foi(Espectroscopia de Correlação). Um espectro COSY corafiltragem quântica dupla, com supressão de solvente de portade água, foi obtido usando-se a seqüência de pulso
wgdqfcosy, que é parte do pacote BIOPACK™ de seqüências de®pulso (VARIAN , Inc.). Foram usados os seguintes parametros:6.000 Hz de largura de varredura; 0,5 segundos de tempo deaquisição; 600 pontos complexos em dimensão tl; 32transitórios; 5,5 ys de largura de pulso; e 1 segundo deretardo de relaxamento.
A incorporação de glicerol na biomassaproteinogênica foi avaliada por fermentação de glicerolmarcado com 50% de U-13C em E. coli. Após 3 dias (72 h) , ostubos foram colhidos, e o caldo de fermentação foicentrifugado. As pelotas de células foram lavadas uma vezcom solução de NaCl a 9 g/L e novamente centrifugadas. Aspelotas de células resultantes foram hidrolisadas com HCl a6N em ebulição constante a IlO0C durante 24 horas, usando-seo sistema de hidrólise REACTI-THERM™ (PIERCE®, Rockford,IL) . Para remover o HCl, a solução resultante foi submetidaa uma vaporização rápida a 75°C sob vácuo durante 2 horas,usando-se o sistema CENTRIVAP™ (LABCONCO® Corp., KansasCity, MO) . A amostra seca foi reconstituida em 1 mL de D2O(Cambridge Isotope Laboratories, Cambridge, MA) , congelada a-80°C e subseqüentemente liofilizada no sistema deliofilização 4.5L FREEZONE™ (LABCONCO® Corp) durante 24horas. A amostra foi, então, reconstituída em 600 yL de D2Oe filtrada para remover as partículas de células. Um DL detransferido para um tubo de NMR. Para determinar oenriquecimento com 13C, as amostras foram analisadas usando-se spin eco de ID próton com e seu pulsos concorrentes de90° no carbono50. O pulso de 90° no carbono refocalizou osátomos de carbono 13C, suprimindo, dessa forma, os satélitesde 13C que surgem devido ao acoplamento de spin próton-carbono. Esse fenômeno não ocorreu para os átomos de carbono12C. Para esses experimentos, usamos a seqüência de pulsoscomercialmente disponível pwxcal no espectrômetro 500 MHzVarian INNOVA™. Foram usados os seguintes parâmetros: 8.000Hz de largura de varredura; 2,7 segundos de tempo deaquisição; 256 transitórios; e pwxl 0 e 90° a 25°C. Osaminoácidos individuais foram identificados com base nosdeslocamentos químicos e na estrutura fina dos espectros.
Para realizar ensaios enzimáticos, células deculturas anaeróbicas de uma OD550 de -0,7 foram colhidas porcentrifugação (2 min, 10.000 χ g) , lavadas com 9 g/litro deNaCl e armazenadas como pelotas de células a -20 °C. Ascélulas foram ressuspendidas em 0,2 mL do respectivo tampãoe permeabilizadas por misturação de remoinho com clorofórmio(Tao et al., 2001). A glicerol desidrogenase foi ensaiadapor medição da alteração na absorbância a 340 nm e 25°C emuma mistura contendo 50 mM de Tris»HCl (pH 7,6), 2 mM deMgCl2, 500 μΜ de NAD+, 10 mM de glicerol e 10 - 100 pL deextrato celular bruto. A atividade da glicerol desidrogenasecom HA, a atividade da metilglioxal redutase, a atividade daaldo-ceto redutase e a linearidade das reações (concentraçãopreparações. Os resultados foram expressos como micromolesminuto-1 miligrama de proteína celular"1 e era médias parapelo menos três preparações celulares.
As taxas específicas de crescimento celular (μ) ,consumo de glicerol e síntese de produto foram estimadastraçando-se a concentração total de células, glicerol ouproduto versus a integral da concentração celular (ICC) eajuste desses gráficos a funções polinomiais.
EXEMPLO 2: FERMENTAÇÃO DE GLICEROL E EFEITO DACOMPOSIÇÃO DO MEIO
Embora se acredite que o metabolismo de glicerolem E. coli esteja restrito a condições respiratórias,descobrimos que esse organismo pode metabolizar glicerol naausência de receptores de elétrons. A Fig. 1 mostra umperfil de fermentação típico para a cepa do tipo selvagemMG1655 em um meio suplementado com 2 g/L de triptona(detalhes adicionais foram apresentados nos pedidosprovisórios 60/788.512 e 60/867.581 e em Gonzalez et al.,2007). Aproximadamente 1-2 g/L of glicerol foram deixadosnão fermentados no meio das culturas em fase estacionária.Etanol, 1,2-propanodiol (1,2-PDO) e ácidos succínico,acético e fórmico foram identificados como produtos defermentação usando-se diferentes técnicas de NMR.
Em seguida, buscamos identificar o efeito devários parâmetros sobre a fermentação de glicerol. Potássio,fosfato, sódio, glicerol,· HA, pH e CO2 foram·titulados parao crescimento celular de acordo com métodos típicos.Os meios típicos usados em estudos anteriores dometabolismo de glicerol em E. coli continham altos níveis defosfato, potássio e sódio, cuja principal finalidade eracontrolar o pH da cultura de 7-7,5. Esse meio foiinicialmente relatado por Tanaka et al. (1967) esubseqüentemente usado pela maioria dos investigadores emestudos do metabolismo de glicerol em E. coli. Descobrimosque a suplementação de nosso meio com esses níveis defosfato, potássio e sódio (isto é, 34 mM de NaH2PO4 e 64 mMde K2HPO4) prejudicava gravemente a fermentação de glicerol(Fig. 2) — um efeito que é particularmente prejudicial a pHalcalino. Potássio e fosfato, mas não o sódio, foramresponsáveis pelo efeito negativo (Fig. 2) . Δ análise dospadrões de consumo de glicerol em nossos experimentosmostrou que quantidades significativas de glicerolpermaneciam não metabolizadas no meio (tipicamente 10 - 30mM) , sugerindo a existência de uma concentração de limiarque limita a fermentação anaeróbica de glicerol. Interessan-temente, estudos anteriores do metabolismo de gliceroltambém foram conduzidos a concentrações de gliceroltipicamente variando de 20 a 30 mM. Sabemos agora que afermentação de glicerol e o crescimento celular foramcompletamente prejudicados quando se usou um meio contendoaltos níveis de fosfato e potássio, 2 g/L de glicerol econduzindo-se a fermentação a pH 7,-5 e 37°C (Fig. 2).
Tomados juntos, nossos resultados demonstramclaramente que as tentativas anteriores de fermentarsucedidas, porque os experimentos foram todos conduzidos emcondições que afetavam negativamente a fermentação deglicerol. Essas condições incluem o uso de pH neutro aalcalino (7-7,5), altas concentrações de potássio e fosfato,concentrações de glicerol relativamente baixas, 37°C erecipientes fechados. A última é uma condição quedemonstramos que prejudica a fermentação de glicerol devidoà acumulação de hidrogênio e o efeito resultante sobre oequilíbrio redox.
EXEMPLO 3: VIAS E MECANISMOS DE FERMENTAÇÃO DE GLICEROL
A fermentação anaeróbica de glicerol em bactériasentéricas é considerada há muito tempo um privilégio deespécies que tenham uma via de 1,3-PDO ativa. Demonstramos,entretanto, que a E. coli pode metabolizar fermentativamenteglicerol de maneira independente do 1,3-PDO, contanto queuma via funcional de 1,2-PDO e vias de glyDH-II-DHAK estejampresentes.
Com base em nossos achados, descritos em maioresdetalhes em Dharmadi, et al. (2006), Gonzalez et al., 2007 enos pedidos provisórios 60/867.581 e 60/788.512 (todos aquiincorporados por referência), propomos um novo paradigmapara a fermentação de glicerol em bactérias entéricas, emque: (i) a via de 1,2-PDO proporciona um meio para consumirequivalentes redutores gerados durante a síntese da massacelular, permitindo, dessa forma, condições equilibradas deredox e (ii) a síntese de etanol, mediante uma viaequilibrada de redox, atende às exigências de energia,(Fig. 3) . Também se descobriu que a atividade dos sistemasde formato hidrogênio-liase e F0Fi-ATPase facilita ometabolismo fermentativo de glicerol, provavelmente ajudandoa manter o pH intracelular e o suprimento de CO2.
Demonstramos que a via que converte glicerol em intermediá-rios glicoliticos é composta por duas enzimas (Fig. 3) : umaglicerol desidrogenase (glyDH) e uma DHA quinase (DHAK), aprimeira com um papel fisiológico anteriormente desconhecido.
Tabela 2. Crescimento celular durante a fermentação deglicerol1'2
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Os experimentos foram conduzidos na presença de 0,2% detriptona e 10 g/L de glicerol.
NG: nenhum crescimento observado; ND: nenhuma detectada;DP: desvio padrão.
μΜ: taxa de crescimento especifico máxima (h"1) calculadadurante o crescimento exponencial.
Yx/S: rendimento de crescimento (mg de células/g deglicerol) calculado como o aumento na massa celular porglicerol consumido.
A síntese de 1,2-PDO foi identificada mediante NMR,conforme descritoNossos achados de que a cepa MG1655 pode fermentarglicerol é uma caracter!stica genérica da espécie E. coli,pois outras cepas (W3110, MC4100 e E. coli B) também foramcapazes de fermentar glicerol (Tabela 2). Como duas outrasglyDHs, a saber, glyDH-III e glyDH-IV, foram identificadasem membros das Enterobacteriaceae, investigamos seuenvolvimento na fermentação anaeróbica de glicerol. Apenas acepa Enterobacter cloacae NCDC 279-56, que, como a E. coli,possui uma glyDH-II (2), foi capaz de fermentar glicerol(Tabela 2). Nossos resultados preliminares com a leveduraSaccharomyces cerevisiae parecem indicar que vias similarespoderiam sustentar a fermentação de glicerol nesseorganismo.
As vias acima proporcionam o quadro de referênciapara explicar o efeito observado do pH e concentrações depotássio, fosfato e glicerol sobre a fermentação de glicerol(veja o EXEMPLO 2, pedido provisório 60/867.581 e Gonzalezet al., 2007). Por exemplo, altos níveis de fosfato promovema decomposição tanto de DHA, quando de HA (doisintermediários chave nas vias acima mencionadas) e afetamnegativamente a atividade de GldA e sua indução por HA. Alémdisso, a MG sintetase, uma enzima chave responsável pelasíntese de 1,2-PDO, é inibida por altos níveis de fosfato.
Altas concentrações de potássio aumentam a toxicidade de MG,um intermediário chave na síntese de 1,2-PDO. A baixaafinidade de GldA pelo glicerol [Km é de 3-40 mM] explicatanto as exigências de altas concentrações de glicer.ol paraseu metabolismo fermentativo, quanto nossa observação de que10-30 mM de glicerol permaneceram não metabolizados no meio.
O efeito do pH sobre a fermentação de gliceroltambém pode estar relacionado a seu impacto sobre as viasacima mencionadas (veja o EXEMPLO 2, pedido provisório60/867.581 e Gonzalez et al. , 2007). GldA exibe uma fortedependência do pH com maior atividade oxidativa a pHs muitoalcalinos e atividade redutora em condições neutras aalcalinas. Condições ácidas reduzem não apenas a atividadede glyDH, mas também as atividades redutoras de MG, que sãorequeridas para a síntese de 1,2-PDO. Condições alcalinas,por outro lado, aumentam a toxicidade de MG, um interme-diário chave na síntese de 1,2-PDO. Evidentemente, o pHintracelular precisa ser cuidadosamente controlado paraevitar baixas atividades de enzimas chave e a toxicidade deMG. Por exemplo, embora um pH extracelular de 6,3aparentemente previna a toxicidade de MG, as células aindarequereriam um sistema que evitasse que o pH caísse abaixodos níveis permissíveis para as atividades de glyDH eMGR/AKR. Com a conversão de ácido fórmico em CO2 e H2, sabe-se que o sistema FHL evita a acidificação citoplasmática, oque poderia explicar por que FHL é requerido para afermentação de glicerol em condições ácidas. Todavia, aatividade de FHL poderia gerar um excesso de hidrogênio que,caso acumulado, afetaria negativamente a fermentação deglicerol. Em condições alcalinas, o sistema F0Fi-ATPasepoderia ser requerido para evitar a alcalinização doEXEMPLO 4: MELHORA DA PRODUTIVIDADE E POSSIBILIDADE DAFERMENTAÇÃO DE GLICEROL EM MEIOS INDUSTRIAIS
Para demonstrar as implicações de nossos achadosna melhora da fermentação de glicerol, superexpressamos avia tronco descoberta (GldA-DHAK) na cepa do tipo selvagemMG1655 e observamos um aumento de mais de 2 vezes tanto nocrescimento celular, quanto na fermentação de glicerol. Aamplificação da via de GldA-DHAK foi conseguida portransformação de MG1655 com o plasmidio pZSdhaKLM_gldA. Aumentos adicionais na produtividade poderiam requerer umasuperexpressão sincronizada de enzimas glicoliticas (porexemplo, triose-fosfato isomerase) juntamente com a via deGldA-DHAK. Além disso, vários aperfeiçoamentos à base doprocesso, incluindo otimização adicional do meio de cultura, sistema de cultivo e modo de operação, estão sendoimplementados.
A aplicação da fermentação de glicerol em níveisindustriais requereria o uso de glicerol derivado durante aprodução de biodiesel. Observamos um crescimento celular euma fermentação de glicerol similares quando MG1655 foicultivado em glicerol puro e duas amostras de glicerolobtidas em uma instalação de biodiesel operada pelaCompanhia Química FutureFuel: após 48 horas de cultivo, ascélulas fermentaram 4 (puro), 3,9 (refinado) e 3,8 (bruto)g/L de glicerol e atingiram uma densidade óptica de 1,2(puro), 0,96 (refinado) e 0,98 (bruto).
A substituição da suplementação com triptona poroutro fator chave para o sucesso comercial. Entretanto, jádemonstramos que a suplementação do meio com liquor deinfusão de milho (um suplemento barato usado em fermentaçãoindustrial) sustenta a fermentação de glicerol em níveissimilares aos observados com a suplementação com triptona(Dharmadi et al., 2006).
Também obtivemos mutantes de MG1655 capazes decrescer em meio mínimo sem nenhuma suplementação (uma OD550de 0,36 e 8,1 g/L de glicerol fermentado) . Esses mutantesforam gerados mediante múltiplas rodadas de seleção paracepas capazes de fermentar glicerol em meios contendoquantidades decrescentes de HA ou triptona (pedidoprovisório 60/867.581).
EXEMPLO 5: PRODUTOS DO GLICEROL
Também fizemos demonstrações exemplificativas daformação de produtos usando glicerol como a fonte de carbonoe os meios acima descritos. Por exemplo, demonstramos aprodução de etanol na FIG. 4. Nossos resultados indicaramque pequenas modificações genéricas e ambientais tornam E.coli um bom biocatalisador para a conversão de glicerol emetanol e H2-CO2 (pH 6,3) ou etanol e formato (pH 7,5 edisrupção do sistema FHL) . A produção de etanol mediantefermentação de açúcar, em contraste, não ofereceria apossibilidade de co-produção de H2 e formato, representando,assim, um processo menos eficiente. Aperfeiçoamentosadicionais dos rendimentos de etanol-H2 e etanol-formatoresultarão da eliminação das vias de succinato e acetatoprovisório 60/867.581). O aperfeiçoamento nas produtividadese o uso de meio industrial são conforme acima descritos no
EXEMPLO 4.
Outro exemplo é o ácido succinico, cuja produção apartir de açúcares é limitada pela disponibilidade deequivalentes redutores. Felizmente, sua síntese a partir deglicerol é possível mediante uma via equilibrada de redox.Entretanto, uma produção muito baixa de succinato a partirde glicerol foi observada em nossos experimentos com MG1655,uma conseqüência do glicerol sendo diferenciada pela via deGldA-DHAK dependente de PEP (isto é, baixa disponibilidadede PEP) . Pela substituição de DHAK dependente de PEP de E.coli por DHAK dependente de ATP de C. freundii, juntamentecom o uso de pH e concentração de CO2 apropriados,conseguimos um aumento de quase 10 vezes no rendimento desuccinato (FIG. 4), usando os meios acima descritos.Aperfeiçoamentos adicionais no rendimento de succinatoresultarão da eliminação das vias de etanol e acetato(mutações adhE e pta: Gonzalez et al. , 2007 e pedidoprovisório 60/867.581). 0 aperfeiçoamento na produtividade eo uso de meio industrial são conforme acima descritos noEXEMPLO 4, com a exceção de que a DHAK dependente de ATP deC. freundii será superexpressada, em vez da DHAK nativa.Para tornar a via de ácido succinico mais favorávelenergeticamente, eliminamos a fosfoenolpiruvato carboxilasede E. coli (PEPC, codificada pelo gene ppc) e asuperexpressão de fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK)outros microorganismos, conforme descrito na base de dadosde enzimas BRENDA (Schomburg et al., 2004). Uma maiorprodução de energia pela via de succinato (diferentemente daPEPC, PEPCK gera ATP) deve resultar tanto em maioresprodutividades, quanto maior rendimento.
Outro produto cuja síntese se beneficiaria doestado altamente reduzido do carbono em glicerol é o 1,2-PDO. A amplificação da via de GldA-DHAK não apenas resultouem uma produtividade aumentada, mas também levou a umaumento de quase 20 vezes na síntese de 1,2-PDO: enquantoMGl655 produziu apenas 0,026 mM de 1,2-PDO, a ceparecombinante MG1655 (pZSdhaKLM_gldA) acumulou 0,51 mM desseproduto. Esses resultados provavelmente são devidos aoenvolvimento de GldA na síntese de 1,2-PDO (Gonzalez et al., 2007).
Estamos agora desenvolvendo várias estratégiaspara produzir altos níveis de 1,2-PDO a partir de glicerol,que são descritas a seguir:
(1) Substituição da DHAK dependente de PEP nativa(dhaKLM) de E. coli pela DHAK dependente de ATP (subunidadesdhaKL) de C. freundii e sua superexpressão juntamente comglicerol desidrogenase nativa (gldA).
(2) Superexpressão das enzimas metilglioxalsintetase, glicerol desidrogenase e metilglioxal redutase,todas envolvidas na conversão de DHAP em 1,2-PDO (Gonzalezet al., 2007 e pedido provisório 60/867.581).
(3) Aumento, da disponibilidade de NADPH paraconversão de NADH em NADPH mediante superexpressão detransidrogenases ou manipulação da especificidade de co-fator de enzimas nas vias metabólicas centrais, incluindoglicerol desidrogenase, glicerol-3-Ρ desidrogenase,gliceraldeidos desidrogenase, piruvato desidrogenase eoutras. Alternativamente, a variação dessas enzimas que, emsua forma nativa, usam NADP como co-fator pode ser clonadade outros organismos e expressada em E. coli.
(4) Manipulação de uma glicerol desidratase (GD,que, na natureza, desidrata glicerol por conversão em 3-hidroxipropionaldeido) para a conversão de glicerol em HA emuma etapa. HA é, então, convertida em 1,2-PDO por GldA ououtras enzimas em E. coli, conforme já demonstramos emexperimentos em que HA inicialmente presente no meio decultura foi estequiometricamente convertida em 1,2-PDO(pedido provisório 60/867.581). Essa via evitará metilglioxalcomo intermediário (um produto muito tóxico) e representauma via mais eficiente em termos de energia para a conversãode glicerol em 1,2-PDO, pois nenhum ATP é consumido,resultando em um aumento significativo nos rendimentos. A GDmanipulada é obtida por mutagênese de GD de C. butyricum(dhaBl), que, diferentemente de outras GDs, não requer a co-enzima Βχ2 para sua atividade. Também estamos conduzindo umabusca de uma GD microbiana nativa que possa converterglicerol em HA. Uma vez encontrada, essa atividade seráclonada e expressada em E. coli.
(5) Estratégias química (glicerol em HA) eglicerol em HA foi eficientemente conseguida com um processoque usa um catalisador sólido, temperatura moderada (~200°C)e pressão atmosférica (Crabtree et al., 2006). Os únicosprodutos são HA e água. Demonstramos a conversão eficiente de HA em 1,2-PDO por células de E. coli em um meio contendoglicerol (Gonzalez et al., 2007 e pedido provisório60/867.581). A quantidade de glicerol consumida é mínima, ea conversão estequiométrica de HA em 1,2-PDO é conseguida emuma fermentação muito curta.
Os resultados acima descritos e mostrados nasFiguras 4 e 5 demonstram claramente a possibilidade de sedesenvolver uma plataforma para a produção de combustíveis esubstâncias químicas reduzidas a partir de glicerol.Produtos adicionais cuja produção mediante fermentação de glicerol seria vantajosa incluem propanolamidas, ácidopropiônico, butanol e outros (Gonzalez et al., 2007) . Essesprocessos permitiriam a implementação de verdadeiras bio-refinarias e revolucionaria a indústria de biocombustíveis,melhorando grandemente seus aspectos econômicos.
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Claims (19)
1. Método para fermentar anaerobicamenteglicerol para produzir um produto, caracterizado pelo fatode compreender:o cultivo de uma célula bacteriana em um meio sobcondições anaeróbicas de modo que o glicerol seja convertidoem um produto,em que a dita célula bacteriana é desprovida deuma via funcional de 1, 3-propanodiol, mas tem uma viafuncional de 1,2-propanodiol, uma via funcional da gliceroldesidrogenase do tipo II-diidroxiacetona quinase e uma viafuncional de F0Fi-ATPase,em que o dito meio compreende pelo menos 10 g/L deglicerol como a fonte de carbono, menos de 10 mM depotássio, menos de 50 mM de fosfato, CO2 maior que ou iguala 10% e um pH entre 5,0 e 7,5.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o meio é suplementado comhidroxiacetona (HA), mas não com triptona.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o meio é suplementado com 30mM de HA.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a célula bacteriana tambémtem uma via funcional de FHL, quando o pH do meio é menorque ou igual a 6,5.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o CO2 é de pelo menos 20%quando o pH é de cerca de 7.5.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o meio tem menos de ou iguala 2 mM de potássio e menos de ou igual a 10 mM de fosfato.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o meio tem menos de ou iguala 1 mM de potássio e menos de ou igual a 5 mM de fosfato.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito produto é selecionadodo grupo que consiste em etanol, ácido succinico, ácidofórmico, hidrogênio, 1,2-PDO, propanolamidas, ácidopropiônico e butanol.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o meio tem menos de ou iguala 1 mM de potássio e menos de ou igual a 2 mM de fosfato.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o pH é de cerca de 6,3, e omeio é borrifado com um gás inerte, e o dito produto éetanol e hidrogênio.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que uma via nativa de gliceroldesidrogenase-diidroxiacetona quinase está superexpressada,uma pta e uma frdA estão inativadas, o glicerol é glicerolbruto, e o meio também compreende liquor de infusão demilho, mas não triptona.
12. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que a célula bacteriana édesprovida de uma enzima FHL funcional, o pH é de cerca de-7, e o meio é borrifado com um gás inerte, e o dito produtoé etanol e formato.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que uma via nativa de gliceroldesidrogenase-diidroxiacetona quinase está superexpressada,uma pta e uma frdA são inativadas, o glicerol é glicerolbruto, e o meio também compreende liquor de infusão demilho, mas não triptona.
14. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que a dita célula bacteriana édesprovida de subunidades de diidroxiacetona quinase nativa eexpressa uma diidroxiacetona quinase de C. freundii, e o ditoproduto é succinato.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o meio compreende 10-20% deCO2, e o pH é de 6-7,5.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que uma glicerol desidrogenasenativa e diidroxiacetona quinase de C. freundii estãosuperexpressadas, uma fosfoenolpiruvato carboxilase estáinativada, uma fosfoenolpiruvato carboxiquinase de E. coliou A. succinogenes está superexpressada, uma pta e uma adhEsão inativadas, o glicerol é glicerol bruto, e o meio tambémcompreende liquor de infusão de milho.
17. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que uma glicerol desidrogenasenativa e uma diidroxiacetona quinase estão superexpressadas,e o dito produto é 1,2-PDO.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a diidroxiacetona quinasenativa é substituída por diidroxiacetona quinase de C.freundii, e as enzimas metilglioxal sintetase, gliceroldesidrogenase e metilglioxal redutases estão todassuperexpressadas.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que uma glicerol desidratasemanipulada ou de ocorrência natural capaz de converterglicerol em hidroxiacetona está superexpressada.
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