BR9912014B1

BR9912014B1 - cÉlula microbiana recombinante, e, processos de produÇço de um primeiro metabàlito e de construÇço de uma cÉlula microbiana.

Info

Publication number: BR9912014B1
Application number: BRPI9912014-3A
Authority: BR
Inventors: Jens Nielsen; Torben Lauesgaard Nissen; Morten Kielland-Brandt
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-07-12
Publication date: 2010-03-23
Also published as: CA2379023A1; EP1097216A1; US7018829B1; ES2267274T3; ATE325196T1; BR9912014A; DE69931162D1; WO2000003020A1; DE69931162T2; NZ509728A; AU4897899A; AU773874B2; EP1097216B1; CA2379023C

Description

"CÉLULA MICROBIANA RECOMBINANTE, Ε, PROCESSOS DEPRODUÇÃO DE UM PRIMEIRO METABÓLITO E DE CONSTRUÇÃODE UMA CÉLULA MICROBIANA".

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A invenção está nas áreas de biotecnologia microbiana,engenharia metabólica e genética. Ela diz respeito a uma célulamicrobiana em que a expressão de várias atividades exprimíveis deenzima foram aumentadas ou diminuídas ou eliminadas de modo a alterara taxa de produção e/ou o rendimento de um metabólito tal como umproduto intermediário ou um produto de uma via metabólica.

Pelo menos uma, preferivelmente duas ou mais, deatividades exprimíveis de enzima, quando manifestadas, medeia umareação envolvida na assimilação de uma fonte de nutriente na célula. Aassimilação de uma fonte de nutriente pode envolver a captação da fontena célula e/ou conversão da fonte dentro da célula, preferivelmente aincorporação da fonte em um produto biossintético da célula, aincorporação sendo controlada pelo potencial metabólico e capacidadeda célula.

A invenção descrita aqui abaixo diz respeito a umamanipulação de um processo de assimilação de uma fonte de nutriente,preferivelmente amônia, e o efeito resultante desta na capacidade de umacélula microbiana em produzir um ou mais metabólitos primários esecundários tais como produtos intermediários e/ou produtos finais de umaou mais vias metabólicas presentes na célula microbiana.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Uma célula viva realiza uma rede complexa de mais do quemil reações diferentes simultaneamente, com cada seqüência de reaçõessendo estrita e sensivelmente controlada em várias vias de modo que asacumulações indesejáveis de deficiências de intermediários e/ou produtosfinais sejam normalmente impedidas de ocorrer. Como um resultado destecontrole estrito e sensível, as reações de maior complexidade mecânica eseletividade estereoquímica podem prosseguir tranqüilamente sob condiçõesfisiológicas normais tais como pressão ambiente, temperatura moderada e umpH próximo da neutralidade.

De modo a apreciar a complexibilidade e forma seletiva docontrole de redes metabólicas, é necessário primeiro considerar seqüências dereações específicas tais como vias metabólicas; a ligação entre cada via e aarquitetura celular; a importância biológica de cada via metabólica; e ossensível e eficiente mecanismos de controle regulando as taxas de reaçãointracelular. A totalidade de taxas de reação intracelular é também conhecidacomo fluxo metabólico.

A pessoa habilitada na técnica estará ciente de muitosmetabólitos primários e secundários microbianos e ela terá acesso a coleçõesrelevantes de referência na matéria tais como o autorizado Bergeys Manual.

A pessoa habilitada na técnica também terá a sua disposição a livrosdidáticos de bioquímica geral compreendendo o estado do discernimento datécnica dentro do mundo complexo do metabolismo celular e bioquímica.

A engenharia metabólica pode ser percebida como umareforma intencional de redes metabólicas gerando uma mudança e/ou umaredireção no metabolismo aeróbico e/ou anaeróbico de uma célulamicrobiana. O estado da técnica das técnicas de engenharia metabólica foramdescritas por entre outros Cameron e Chaplen (1997) em Curr. Opin.Biotechnol. vol. 8, páginas de 175 a 180, Hahn-Hagerdal et al. (1996) emAnn. New York Acad. Sci., vol. 782, páginas de 286 a 296, Stephanopoulos(1994) em Curr. Opin. Biotechnol., vol. 5, páginas de 196 a 200,Sthephanopoulos e Sinskey (1993) em Trends Biotechnol., vol. 11, páginasde 392 a 396, e Cameron e Tong (1993) em Appl. Biotechnol., vol. 38,páginas de 105 a 140.

Algumas células microbianas são potencialmentereconhecíveis por um único traço característico na forma de, por exemplo,um produto final metabólico predominantemente produzido sob uma dadasérie dé condições de crescimento. Consequentemente, uma levedura podebem ser inicialmente caracterizada por uma produção de etanol em quase amesma maneira como uma célula bacteriana de ácido láctico pode serpotencialmente identificável por uma produção de ácido láctico. No entanto,o ambiente complexo em que os metabólitos da célula microbiana sãoproduzidas evidentemente induz não apenas à formação de um único emborapredominante metabólito, mas sem dúvida a uma série complexa deintermediários metabólitos e produtos finais. Muitos aspectos dometabolismo microbiano e do regulamento destes estão ainda longe de seremcuidadosamente entendidos.

O metabolismo celular compreende catabolismo, isto é,aqueles processos relacionados com uma degradação de substânciasmacromoleculares complexas, e anabolismo, ou aqueles processosenvolvidos principalmente com a síntese de moléculas orgânicasfreqüentemente muito complexas. As vias tanto catabólicas quantoanabólicas podem ser percebidas ocorrerem em vários estágios decomplexidade - um sendo uma interconversão de polímeros e lipídeoscomplexos com intermediários monoméricos; uma outra interconversão deaçúcares monoméricos, aminoácidos e lipídeos com compostos orgânicosrelativamente simples; e ainda outro estágio sendo a degradação final, ousíntese, de compostos inorgânicos tais como CO2, H2O e NH3.

O metabolismo catabólico e anabólico pode ser ainda divididoem um metabolismo aeróbico e um anaeróbico, isto é, metabolismoocorrendo na presença ou ausência de oxigênio. Muitos microorganismos sãocapazes de se desenvolver tanto na presença quanto na ausência de oxigênio.Algumas células microbianas são estritamente aeróbicas e dependemabsolutamente de uma forma oxidativa de metabolismo conhecido comorespiração, isto é, a junção de geração de energia a uma oxidação denutrientes por oxigênio.

A conversão de glicose em piruvato em uma célula passa pelarespiração ativa, isto é, uma interrupção oxidativa e geração de energia apartir de fontes de nutrientes por meio de uma reação com o oxigênio, resultana formação de uma coenzima em uma forma reduzida conhecida comodinucleotídeo de nicotinamida adenina, ou NADH. O NADH é re-oxidadoatravés da cadeia de transporte de elétron mitocondrial em um processo quegera energia adicional e resulta em uma transferência final de elétrons para ooxigênio.

A coenzima dinucleotídeo de nicotinamida adenina em suaforma oxidada (NAD+) contém uma estrutura de anel nicotinamida que éfacilmente redutível e assim serve como um agente oxidante.Consequentemente, o dinucleotídeo de nicotinamida adenina pode consistirde uma forma reduzida, NADH, ou de uma forma oxidada, NAD+. Muitasenzimas desidrogenases, tais como desidrogenases de álcool, têm uma forteafinidade com a forma oxidada, NAD+. Após a oxidação de um substrato, aforma reduzida da coenzima, NADH, deixa a enzima e é reoxidada porsistemas aceptores de elétron disponíveis na célula. O NAD+ assim formadopode então se ligar a outra molécula da enzima e repetir o ciclo. O NAD+ e oNADH diferem da maioria dos substratos em que eles são continuamentereciclados.

Ao contrário do metabolismo oxidativo da cadeia respiratória,muitos microorganismos podem ou devem crescer em ambientes anaeróbicosdurante a derivação de sua energia metabólica a partir de processos que nãoenvolvam oxigênio. A maioria de tais organismos microbianosanaerobicamente se desenvolvendo derivam sua energia a partir defermentações caracterizadas por vias catabólicas de produção de energia taiscomo glicólise, em que uma conversão da glicose resulta na formação deprodutos tais como, por exemplo, etanol e CO2.

O metabolismo celular evidentemente requer e gera energia, eas vias metabólicas de produção de energia geram muitos intermediáriosusados em numerosas vias biossintéticas. As células principalmente obtêmenergia livre liberada durante o catabolismo na forma de ATP. A energiaquímica armazenada como ATP pode ser convertida em outras formas deenergia em um processo conhecido como energia de transdução.

A glicólise é uma via catabólica principal para a degradaçãode carboidratos nas células microbianas tanto aeróbica quantoanaerobicamente se desenvolvendo. A principal energia consumida daglicólise é a glicose e a via, compreendendo um total de 10 diferentesreações, leva à conversão de uma molécula de glicose em duas moléculas depiruvato, com a geração concomitante de ATP bem como a coenzima NADH.

A seqüência de reações entre a glicose e piruvato pode serconsiderada como duas fases distintas, uma compreendendo as primeirascinco reações e constituindo uma fase de entrada de energia, em que osfosfatos de açúcar são sintetizados à custa de uma conversão de ATP em umamolécula menor rica de energia na forma de ADP, e uma fasecompreendendo as últimas cinco reações e representando uma fase de saídade energia, em que uma transferência de um grupo de fosfato para ADP levaà regeneração da ATP. A conversão glicolítica de glicose em piruvatotambém envolve a redução simultânea de dois molares de NAD+ em suaNADH reduzida equivalente.

As células microbianas anaerobicamente se desenvolvendopodem reduzir o piruvato reduzido produzido por meio de glicólise em umavariedade de produtos finais metabólicos tais como, por exemplo, etanol,ácido láctico, ácido acético e dióxido de carbono. A produção de etanolatravés da fermentação anaeróbica de uma fonte de carbono pela leveduraSaccharomyces eerevisiae é um dos melhores processos biotecnológicosconhecidos e é responsável por uma produção mundial de aproximadamente30 bilhões de litros por ano. A produção de etanol é mais baixa do que umaprodução teórica máxima devido a uma formação de vários produtosadicionais afetando o rendimento do etanol, tais como, por exemplo,biomassa, acetato, piruvato, succinato e glicerol. Uma nova síntese dosprimeiros quatro componentes resulta em uma formação em rede de NADH,enquanto uma síntese de glicerol ocorre sob consumo de NADH simultâneo.

Quando o etanol é sintetizado sem uma formação em rede ou consumo deNADH, a formação de glicerol representa um importante papel fisiológicosob o crescimento anaeróbico. A formação de glicerol leva à uma re-oxidaçãode NADH para NAD+ e desse modo substitui o papel do oxigênio como umaceptor de elétron.

É conhecido que nos cultivos anaeróbicos de Saccharomyeeseerevisiae CBS8066, aproximadamente 10% da fonte de carbono é dirigidaem direção à formação de glicerol (Nissen et ai, 1997; Verduyn et ai, 1990).

Uma redireção desta quantidade de carbono com respeito a produção deetanol é claramente desejável e deve pressupor uma redução na formação emrede de NADH na síntese de biomassa e ácidos orgânicos.

Consequentemente, para a via glicolítica operaranaerobicamente, isto é, na ausência de oxigênio, o NADH deve ser re-oxidado para NAD+ por meio de uma transferência de elétrons em um aceptoradequado de elétron de modo que um fluxo metabólico constante possa sermantido. As células microbianas se desenvolvendo anaerobicamente têmdiferentes modos de transferir tais elétrons. Uma via simples usada porbactérias de ácido láctico consiste de simplesmente usar o NADH parareduzir o piruvato em lactato, através da desidrogenase de lactato da enzima.

O NADH é re-oxidado no processo:Piruvato + NADH <-> Lactato + NAD+

A fermentação de ácido láctico, isto é, a conversão de glicoseem ácido láctico, é importante na fabricação de queijo. Outra fermentaçãoimportante envolve uma conversão de piruvato em acetaldeído e CO2 e umaredução de acetaldeído em etanol pela desidrogenase de álcool:

Acetaldeído + NADH Etanol + NAD+

Quando realizada por células de levedura, esta fermentaçãogera o álcool em bebidas alcoólicas. As células de levedura usadas nocozimento também realizam esta forma de fermentação e o CO2 produzidopor descarboxilação do piruvato faz com que o pão cresça enquanto o etanolproduzido se evapora durante o cozimento.

Entre muitas outras fermentações úteis são aquelas levandoao, por exemplo, ácido acético na fabricação de vinagre e ácido propiônico nafabricação de queijo Suíço.

A formação de glicerol no metabolismo celular tem pelomenos dois papéis fisiologicamente importantes em Saccharomyceseerevisiae - é envolvida na re-oxidação do NADH e atua como um osmólitoeficiente que protege a célula contra a Iise sob condições de tensão.

A síntese da biomassa e de ácidos orgânicos, isto é, ácidosuccínico, ácido acético e ácido pirúvico, resulta em uma formação em redede NADH intracelular (Oura, 1977; van Dijken & Scheffers, 1986; Nissen etal., 1997). Isto tem de ser equilibrado por um mecanismo em que o NADHseja re-oxidado para NAD+ de modo a evitar a depleção da combinação deNADH. Sob condições anaeróbicas, a re-oxidação de NADH não é possívelpor meio da cadeia respiratória, que não está funcionando sob tais condições.

Em vez disso, o NADH é re-oxidado para NAD+ através da formação deglicerol, desde que a síntese de uma molécula de glicerol a partir da glicoseleve à re-oxidação de uma molécula de NADH.

O glicerol é também formado e acumulado dentro da céluladurante o desenvolvimento sob condições de tensão osmótica e atua comoum osmólito eficiente que protege a célula contra a Iise I (Ansell et ai., 1997;Larson et al., (1993)). A formação de glicerol ocorre através de uma reaçãode duas etapas a partir do fosfato de diidroxiacetona (DHAP) que é catalisadopor desidrogenase de 3-fosfato glicerol e fosfatase de 3-fosfato glicerol,respectivamente.

DHAP + NADH Glicerol-3-fosfato + NAD+

Glicerol-3-fosfato -» Glicerol + Fosfato

De modo a ser capaz de produzir qualquer produtometabólico, a célula microbiana necessita de uma energia consumida naforma tanto de energia quanto fontes de nutrientes facilmente assimiláveis. Ometabolismo de uma célula microbiana muitíssimo determina a capacidadeda célula de explorar as fontes de nutriente presentes em um ambienteexterno. Consequentemente, o metabolismo de uma célula microbiana édinâmica e a regulação sensível, direção e re-direção do metabolismo éindicativo das respostas da célula para mudar as condições ambientais.

Os nutrientes assimiláveis tais como várias fontes denitrogênio, carbono, enxofre e fósforo, existem em muitas formas diferentes.

Algumas destas formas podem ser facilmente assimiladas por uma célulamicrobiana enquanto outras não podem ser assimiladas. No caso donitrogênio, é essencial que uma célula microbiana seja capaz de assimilar estafonte de nutriente, quando o nitrogênio forma parte de entre outros i)aminoácidos nas proteínas, ii) nucleotídeos em DNA e RNA, iii) açúcares deamino em polissacarídeos complexos, e iv) compostos heterocíclicos emvárias coenzimas.

Como descrito acima, as vias catabólicas e anabólicas ocorremem estágios diferentes de complexidade e um dos estágios envolve adegradação final, ou síntese, de compostos inorgânicos tais como CO2, H2O eHN3. A maioria se não todas as células microbianas, são capazes de assimilaramônia e converter esta fonte de nitrogênio em compostos de nitrogênioorgânico - isto é, qualquer composto orgânico compreendendo uma ligaçãoC-N. A amônia é assim um metabólito central e atualmente serve como umsubstrato para não menos do que cinco enzimas diferentes que se convertemem vários compostos compreendendo nitrogênio orgânico. Com pHfisiológico, as espécies iônicas dominantes é umíon de amônio, mas todas dascinco reações envolvem o par de elétron não compartilhado de NH3, que éportanto geralmente considerada as espécies reativas.

Consequentemente, as células microbianas assimilam amôniaatravés de reações que levam a formação de glutamato, glutamina, asparaginaou fosfato de carbamoíla. Por causa do fosfato de carbamoíla ser usadoapenas na biossíntese de arginina, uréia e dos nucleotídeos de pirimidina, amaioria do nitrogênio terminando completamente nos aminoácidos e outronitrogênio compreendendo compostos orgânicos é assimilada através dosdois aminoácidos glutamato e glutamina. As enzimas responsáveis pelaassimilação da amônia em uma célula microbiana são brevementeintroduzidas aqui abaixo.

A desidrogenase de glutamato catalisa a aminação redutiva de2-oxoglutarato:

2-oxoglutarato + NH3 + NAD(P)H ^ Glutamato + NAD(P)

As células microbianas se desenvolvendo com amônia comosua única fonte de nitrogênio usam a reação acima como uma via principalpara a assimilação do nitrogênio.

A maioria das células microbianas contém uma formaespecífica de NADPH da enzima de desidrogenase glutamato, como indicadoacima, que atua principalmente na direção da formação de glutamato.Interessantemente, a levedura contém tanto uma forma específica NADHquanto uma forma específica NADPH da enzima, cada forma sendoapropriadamente regulada, com uma forma, NADPH, principalmenteenvolvida na assimilação do nitrogênio e a outra, NADH5 funcionandoprincipalmente no metabolismo catabólico.

A principal fonte de elétrons para a biossíntese redutivaNADPH, fosfato dinucleotídeo de nicotinamida adenina. O NADP+ e oNADPH são idênticos ao NAD+ e NADH5 respectivamente, exceto que aforma tem um fosfato adicional esterificado em C-2' na porção de adenilato.NAD+ e NADP+ são equivalentes em sua tendência termodinâmica paraaceitar elétrons e eles têm potênciais de redução padrão similares. Por razõesnão conhecidas, as enzimas articuladas com nicotinamida nucleotídeo queatuam no metabolismo catabólico geralmente usam o par de coenzimaNAD7NADH, ao passo que aquelas atuando em vias anabólicas tendem ausar NADP7NADPH.

A sintase de glutamato é uma funcionalidade da enzimarelacionada com a desidrogenase de glutamato e catalisa uma reaçãocomparável com aquela catalisada por desidrogenase de glutamato. Noentanto, a sintase de glutamato funciona principalmente na biossíntese deglutamato:

2-oxoglutarato + glutamina + NADPH 2 glutamato + NADP+

Quando formado pela ação da desidrogenase de glutamato, oglutamato pode aceitar uma segunda porção de amônia para formar glutaminaem uma reação catalisada pela sintetase de glutamina da enzima:Glutamato + NH3 + ATP -» Glutamina + ADP + Pi

A esta enzima é designada uma sintetase, em vez de umasintase, porque a reação junta a formação de ligação com a energia liberada apartir da hidrólise de ATP. No entanto, ambas as enzima são classificadascomo ligases, mas uma enzima da sintase não requer ATP.

A sintetase de glutamina de E. coli é um dodecâmero, cujas 12subunidades idênticas formam duas ordem hexagonais de revestimento. Aholoenzima tem um peso molecular de cerca de 600.000. Cada sítio catalíticoé formado em uma interface entre as subunidades de polipeptídeos dentro deum hexâmero e é feita completamente de resíduos a partir de duassubunidades adjacentes.

A glutamina ocupa um papel central no metabolismo denitrogênio de qualquer célula microbiana. O nitrogênio de amida é usado nabiossíntese de vários aminoácidos, incluindo glutamato, triptofano ehistidina, nucleotídeos de purina e pirimidina, e açúcares de amino. Comoprincipalmente revelado com base em estudos em E. coli, vários mecanismosde controle notáveis e muito extraordinários para a sintetase de glutaminamediaram as reações interagindo com um outro em muitas maneirascomplexas. A atividade da sintetase de glutamina é controlada por doismecanismos distintos mas mutuamente relacionados: Regulação alostéricapela inibição da realimentação acumulativa e modificação covalente daenzima mediada por uma cascata regulatória.

A inibição da realimentação acumulativa envolve a ação denão menos do que oito inibidores específicos de realimentação. Aqueles oitoinibidores são produtos finais metabólicos do metabolismo da glutamina(triptofano, histidina, glucosamina-6-fosfato, fosfato de carbamoíla, CTP eAMP), ou eles são indicadores em vários modos da condição geral dometabolismo de aminoácido (alanina, glicina). Muito extraordinariamente,cada subunidade de 50.000 daltons de sintetase de glutamina contém sítios deligação para cada um dos oito inibidores, bem como os sítios de ligação parasubstratos e produtos.

Cada um dos oito compostos somente dá apenas inibiçãoparcial, mas em combinação o grau de inibição é aumentado até que umamistura de todos os oito forneça um bloqueio virtualmente completo. Istogarante que um acumulo de um produto final de uma via não corte osuprimento de glutamina necessário para outra via. A sintetase de glutamina étambém regulada por meio de adenilação. Uma molécula de enzima comtodos os 12 sítios adenilados é completamente inativa, ao passo que aadenilação parcial produz uma inativação correspondentemente parcial.

A adenilação e a desadenilação da sintetase de glutaminaenvolve uma série complexa de cascatas regulatórias. Estas cascatasregulatórias fornecem um mecanismo responsivo garantindo que, quando osuprimento de nitrogênio ativado na forma de glutamina for suficientementeelevado, sua outra biossíntese é interrompida. Ao contrário, quando onitrogênio ativado na forma de glutamina for baixo, 2-oxoglutarato seacumula e, contanto que ATP seja também abundante, estimula a atividade desintetase de glutamina pelo mecanismo inverso.

Uma enzima comparável a sintetase de glutamina, sintetase deasparagina, é responsável por uma quantidade significativamente menor deassimilação de amônia. A sintetase de asparagina usa amônia ou glutamina nacatalisação da conversão de aspartato em asparagina. A enzima separa a ATPdiferentemente do modo que a ATP é separada pela sintetase de glutamina. Asintetase de asparagina também difere da sintetase de glutamina em que aglutamina é fortemente preferida como um substrato sobre a amônia.

A sintetase de fosfato de carbamoíla é outra enzima envolvidana assimilação de amônia nas células microbianas. A amônia ou glutaminapodem ambas servirem como o doador de nitrogênio.

NH3 + HCO3- + 2 ATP -» fosfato de carbamoíla + 2 ADP + PiGlutamina + HCO3- + 2 ATP + H2O

Fosfato de carbamoíla + 2 ADP + Pi + glutamato

A enzima bacteriana catalisa ambas as reações, embora aglutamina seja um substrato preferido. As células microbianas eucarióticascontêm duas formas da enzima. A forma I é localizada no mitocôndria e temuma preferência por amônia como substrato, enquanto a forma II estápresente no citossol e tem uma forte preferência por glutamina.Vários exemplos de microorganismos metabolicamenteplanejados são descritos na literatura de patente. A EP Om 733 712 Alapresenta um processo de produção de preferivelmente um aminoácido porcultivo de uma célula microbiana metabolicamente planejada,preferivelmente uma célula Escherichia coli, com uma expressãosupostamente aumentada ou produtividade de NADPH e isolamento doaminoácido.

A WO 96/41888 apresenta uma célula de levedura tendo umafermentação de açúcar de álcool modificada devido a uma expressão alteradade um gene codificando uma atividade de desidrogenase glicerol-3-fosfatodependente de NADH.

A EP 0 785 275 A2 apresenta uma levedura compreendendoexpressão constitutiva de um gene codificando uma atividade de enzimaenvolvida em um transporte de hexose.

A EP 0 645 094 Al apresenta o uso de uma leveduracompreendendo uma via glicolítica compreendendo um ciclo futil gerado pormeio de uma expressão constitutiva de genes codificando frutose-1,6-bifosfatase e carboxicinase fosfoenolpiruvato.

A US 5.545.556 apresenta uma cepa de levedura tendo umaprodução reduzida ou aumentada de glicerol mediada por mutações em váriosprodutos codificados por gene.

Nenhuma das acima apresenta uma célula microbiana em quea expressão de várias atividades de enzima exprimível envolvida naassimilação do nutriente seja aumentada ou diminuída ou eliminada de modoa alterar a taxa de produção e/ou o rendimento de um metabólito celular talcomo um produto intermediário ou um produto final de uma via metabólica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foi agora surpreendentemente descoberto que é possíveloperavelmente ligar o processo de assimilação de nutriente em uma célulamicrobiana tal como, por exemplo, uma célula de levedura com umaprodução aumentada de um metabólito semelhante, por exemplo, etanol. Ainvenção baseia-se na inesperada e surpreendente descoberta que é possíveloperavelmente ligar uma reação requerendo energia tal como a assimilaçãode uma fonte de nutrientes com uma energia produzindo a reação tal como aformação de um produto metabólico desejável semelhante, por exemplo,etanol.

Quando a fonte de nutriente for uma fonte de nitrogênio talcomo amônia ou uma fonte de nitrogênio convertível em amônia, é preferívelsubstancialmente reduzir ou eliminar a expressão em uma célula microbianade uma enzima, desidrogenase de glutamato, que, sob condições fisiológicasnormais, é a atividade de enzima predominante envolvida na assimilação daamônia, e simultaneamente com a redução ou eliminação, aumenta aexpressão de uma ou ambas de duas atividades de enzima adicionais, sintasede glutamato e sintetase de glutamina, ambas das quais são capazes deassimilar a amônia dentro do glutamato sob o consumo de ATP e re-oxidaçãode NADH. Consequentemente, a expressão excessiva de sintase de glutamatoe de sintetase de glutamina em uma célula microbiana, preferivelmente umacélula de levedura, sob condições anaeróbicas, gera uma redução dos níveisde ATP intracelular e potencialmente uma depleção da combinação de ATPdisponível na célula. Sob condições anaeróbicas, a célula é capaz decontrapor-se à redução na combinação de ATP mediante a produção de umaquantidade aumentada de um metabólito tal como por exemplo, etanolatravés de uma reação de produção de ATP.

A produção de etanol no mundo alcançou uma estimativa de31,3 bilhões de litros em 1996. Aproximadamente 80% foram produzidos porfermentação anaeróbica de várias fontes de açúcar por Saccharomyceseerevisiae. Consequentemente, o etanol é um dos produtos biotecnológicosmais importantes com respeito tanto ao valor quanto a quantidade. Doisterços da produção está localizado no Brasil e nos Estados Unidos com oobjetivo principal de usar o etanol como uma fonte renovável decombustível. A demanda e crescimento deste mercado é esperado dar origema um crescimento substancial na indústria de produção de etanol no futuro.

Portanto, existem fortes incentivos econômicos para ainda melhorar oprocesso de produção de etanol.

O preço da fonte de açúcar é um parâmetro do processo muitoimportante na determinação da economia global de produção de etanol. Porisso, é de grande interesse otimizar a produção de etanol de modo a garantiruma utilização eficiente da fonte de carbono. Junto da biomassa e dióxido decarbono, vários subprodutos são formados durante uma fermentaçãoanaeróbica de Saccharomyces eerevisiae (Oura, 1977). O glicerol é o maisdominante destes compostos, consumindo até 4% da fonte de carbono nasfermentações industriais. Consequentemente, é altamente desejável eliminara formação deste composto, quando não for necessário, e redirecionar o fluxometabólico em direção a produção de etanol. Se bem-sucedidamentealcançado, deve na teoria ser possível aumentar a produção de etanol por ummáximo de 4%, correspondendo a um aumento na produção mundial deetanol de 1,25 bilhão de litros por ano sem qualquer custo adicional.

Embora seja extremamente difícil alterar ou redirecionar ummetabolismo microbiano, tal como um metabolismo anaeróbico de levedura,pode não obstante ser desejável alterar um perfil "tradicional" de metabólitosprimários e/ou secundários de modo a alcançar uma composição diferente ou"mistura de produto", de modo a aumentar ou diminuir ou mesmo eliminar aprodução de alguns metabólitos presentes no perfil.

A surpreendente e inesperada descoberta descrita na presenteinvenção faz o possível para i) manipular o processo de assimilação de umafonte de nutriente tal como amônia dentro ou em uma célula microbiana e ii)correlacionar a manipulação do processo com uma provisão de um perfilalterado de metabólitos produzidos incluindo, por exemplo, etanol e glicerol.

A correlação de assimilação de uma fonte de nutriente com aprodução metabólita primária e secundária é alcançada mediante a ligação dea assimilação com uma produção alterada de um metabólito - um produtointermediário ou um produto final de uma via metabólica - através de umarede extremamente complexa e não completamente entendida de reaçõesmetabólicas guiando o fluxo de metabólitos em uma célula microbiana.

Consequentemente, em um primeiro aspecto da invenção éfornecido uma célula microbiana compreendendo

i) uma primeira atividade de enzima exprimível que, quandomanifestada em célula microbiana, está controlando a assimilação em célulade uma fonte de nutriente, expressão de primeira atividade da enzima emcélula microbiana sendo nova ou alterada quando comparada com aexpressão de primeira atividade de enzima em uma célula microbianacomparável tipo silvestre ou uma célula microbiana comparável isolada,e opcionalmente

ii) uma segunda atividade de enzima exprimível que, quandomanifestada em célula microbiana, está controlando a assimilação em célulade uma fonte de nutriente, expressão de segunda atividade da enzima emcélula microbiana sendo nova ou alterada quando comparada com aexpressão de segunda atividade de enzima em uma célula microbianacomparável tipo silvestre ou uma célula microbiana comparável isolada,segunda atividade de enzima exprimível sendo não idêntica a primeiraatividade de enzima exprimível,

e

iii) uma expressão reduzida ou nenhuma expressão de umaterceira atividade de enzima exprimível que, quando manifestada em célulamicrobiana, está controlando a assimilação em célula de uma fonte denutriente, terceira atividade de enzima exprimível sendo não idêntica aqualquer uma e ambas de primeira e segunda atividades de enzimaexprimíveis,

e ainda opcionalmente

iv) uma quarta atividade de enzima exprimível que, quandomanifestada em célula microbiana, está controlando um sistema redoxintracelular de célula, expressão de quarta atividade da enzima em célulamicrobiana sendo nova ou alterada quando comparada com a expressão dequarta atividade de enzima em uma célula microbiana comparável tiposilvestre ou uma célula microbiana comparável isolada, quarta atividade deenzima exprimível sendo não idêntica a cada uma e todas de primeira,segunda e terceira atividades de enzima exprimíveis.

Em outro aspecto da invenção, a célula microbiana formaparte de uma composição ainda compreendendo um portador. Em ainda umoutro aspecto é fornecido uma nova seqüência de nucleotídeo codificandouma enzima de transidrogenase expremível capaz de controlar um sistemaredox intracelular de uma célula microbiana. É também fornecido umréplicon de DNA recombinante na forma de um vetor compreendendoseqüência de nucleotídeo codificando enzima de transidrogenase exprimível,e uma célula microbiana abrigando seqüência de nucleotídeo ou vetor. Ainvenção também pertence a uma seqüência de aminoácido codificada porseqüência de nucleotídeo.

Em um outro aspecto, a invenção é relacionada a uma célulamicrobiana ou uma composição para uso na produção de um primeiro ou umsegundo metabólito. É também fornecido uma célula microbiana ou umacomposição para uso em uma preparação de um produto bebível ou umcomestível. Em outro aspecto é fornecido uma célula microbiana ou umacomposição para uso em uma produção de um primeiro ou segundometabólico para uso em um produto bebível ou um comestível.

Em mais um outro aspecto é fornecido o uso de uma célulamicrobiana ou uma composição em uma produção de um primeiro ou umsegundo metabólito. A invenção também pertence ao uso de uma célulamicrobiana ou uma composição na produção de um primeiro ou segundometabólito para uso em um produto bebível ou um comestível.

Em ainda um outro aspecto é provido um processo deprodução de um primeiro metabólito, processo compreendendo as etapas de

i) cultivo de uma célula microbiana ou uma composiçãocompreendendo célula em um meio de desenvolvimento adequado e sob taiscondições que célula microbiana está produzindo primeiro metabólito,e opcionalmente

ii) isolamento de primeiro metabólito em uma formaadequada,

e ainda opcionalmente

iii) outra purificação de primeiro metabólito isolado.

Em mais um outro aspecto é fornecido um processo deconstrução de uma célula microbiana de acordo com a invenção, processocompreendendo as etapas de

i) operavelmente ligar uma seqüência de nucleotídeocodificando primeira atividade de enzima exprimível com um sinal deexpressão não naturalmente associada com seqüência de nucleotídeo, e/ou

ii) operavelmente ligar uma seqüência de nucleotídeocodificando segunda atividade de enzima exprimível com um sinal deexpressão não naturalmente associada com seqüência de nucleotídeo, e

iii) eliminar terceira atividade de enzima exprimível decélula microbiana, ou opcionalmente de forma operável ligar uma seqüênciade nucleotídeo codificando terceira atividade de enzima exprimível com umsinal de expressão não naturalmente associada com seqüência denucleotídeo, sinal de expressão gerando uma expressão reduzida deseqüência de nucleotídeo , eiv) introduzir seqüências de nucleotídeo operavelmenteligadas obtidas sob i) e iii), e opcionalmente a seqüência de nucleotídeoobtida sob ii), em célula microbiana, ou

v) introduzir seqüência de nucleotídeo operavelmente ligadasob i), e opcionalmente a seqüência de nucleotídeo obtida sob ii), em célulamicrobiana obtida sob iii) em que terceira atividade de enzima exprimível foieliminada.

As modalidades preferidas dos aspectos acima mencionadosda invenção são descritas aqui abaixo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esforços foram feitos para aumentar a formação de etanol nalevedura mediante a eliminação da síntese de glicerol através de deleções deGPDl e GPD2, codificando as duas isoenzimas existentes de desidrogenasede 3-fosfato de glicerol (Bjõrkqvist et al., 1997). A anulação dupla mutante éincapaz de se desenvolver sob condições anaeróbicas devido ao acumulo deNADH intracelular. O NADH é acumulado desde que nenhuma viaalternativa para re-oxidar o NADH sob estas condições de crescimentoexistentes em S. cerrevisiae. A eliminação da capacidade de gerar glicerolresulta em uma cepa com uma sensibilidade elevada a tensão osmótica. Atensão osmótica é causada pelo desenvolvimento de uma célula em um meiode crescimento industrial elevado em concentrações de várias fontes decarbono e sais. A Anulação de um dos genes não resulta nem em umaredução significativa na formação de glicerol nem em uma formação deetanol aumentada (Liden et al, 1997; Nissen et al., 1998a,b).

Consequentemente, a engenharia metabólica da síntese deglicerol não tem até agora mostrado ser bem-sucedida e nenhum aumentosignificativo na produção de etanol em uma cepa de S. cerevisiaemetabolicamente planejada foi notificado.

Foi agora surpreendentemente observado que é possívelimplementar uma estratégia compreendendo uma redução de um excesso deNADH formado pelo metabolismo catabólico simultaneamente com umconsumo aumentado de ATP na síntese da biomassa.

A amônia é freqüentemente usada como uma fonte denitrogênio nas fermentações industriais de S. cerevisiae. Seguinte aotransporte através da membrana no citoplasma, a amônia ou o íon de amônioé convertido em glutamato pela assimilação com 2-oxoglutarato. Nas célulastipo silvestre esta reação é catalisada por uma desidrogenase de glutamatodependente de NADPH codificada por GDHl (Moye et al., 1985):2-Oxoglutarato + NH4+ + NADPH Glutamato + NADP+

Duas outras desidrogenases de glutamato, codificadas porGDH2 e GDH3, estão também presentes em S. cerevisiae. Gdh2pnormalmente catalisa a reação oposta como aquela de Gdhlp sob a formaçãode NADH (Miller e Magasanik, 1990; Miller e Magasanik. 1991; Coschiganoet al., 1991; Courchesne e Magasanik, 1988). Esta reação ocorre quando asfontes de nitrogênio diferentes do amônio e glutamina são usadas. A reaçãopode também representar um papel nas reações de aminação durante a síntesede vários aminoácidos.

A atividade de Gdh2p é 70 vezes mais baixa do que aatividade de Gdhlp, quando o amônio for usado como fonte de nitrogênio(Nissen et al., 1997). Foi demonstrado, como descrito aqui abaixo e noExemplo 1, que a formação de glicerol pode ser reduzida mediante aanulação de GDHl e expressão excessiva de GDH2. Estas manipulaçõesresultam em uma cepa de levedura geneticamente modificada sintetizandoglutamato sob consumo de NADH diferente de NADPH (Nissen et al,1998a). No entanto, esta redução na formação de glicerol não resultou em umaumento global na produção de etanol. A função de Gdh3p dependente deNADPH é desconhecida. Nenhuma atividade de uma desidrogenase deglutamato dependente de NADPH pode ser medida nas células com umaanulação no GDHl quando o amônio for usado como fonte de nitrogênio,indício de um envolvimento desta enzima principalmente quando outrasfontes de nitrogênio forem usadas (Nissen et al, 1998a; Avendanõ et al,1997).

Interessantemente, existe outro sistema capaz de sintetizar oglutamato em S. cerevisiae. Este sistema consiste de duas reações unidas,catalisadas pela sintase de glutamato, codificadas por GLNl (Cogoni etal, 1995, Miller e Magasanik, 1983). As reações mediadas por enzimas sãobrevemente ilustradas abaixo.

Gltlp: 2-Oxoglutarato + Gltamina + NADH ->2 Glutamato + NAD+Dlnlp: Glutamato + NH4+ + ATP Glutamina + ADP + PiGltlp + Glnlp: 2-Oxoglutarato + NH4+ NADH + ATP -»

Glutamato + NAD+ + ADP + PiNas células tipo silvestres, a atividade de Gltlp é 80 vezesmais baixa do que a atividade de Gdhlp. Portanto, o sistema pode seresperado ter um efeito muito limitado na assimilação de amônio em umacélula de levedura.

Se GDHl for anulado de uma célula de levedura, a célula setorna incapaz de assimilar o amônio pelo meio da atividade de desidrogenasede glutamato dependente de NADPH. Isto leva a uma diminuição na taxamáxima de crescimento específico para metade do que observado para umacélula de levedura tipo silvestre (Nissen et al, 1998a). Isto é provavelmentedevido a uma limitação na síntese de glutamato, uma vez que outras enzimaspotencialmente envolvidas neste processo são manifestadas em níveis muitobaixos, como descrito aqui acima.

Uma mutante dupla em GHDl e GLTl é incapaz de sedesenvolver no amônio como fonte de nitrogênio, indicando que a sintase deglutamato potencialmente pode ter um papel como um sistema reserva nasíntese de glutamato (Miller e Magasanik5 1990). Assim5 foi hipotetizado quepor expressão excessiva do GLTl e GLNl em um mutante Agdhl, deve serpossível minorar e/ou eliminar o efeito limitativo da síntese de glutamato emμπ11χ e obter uma cepa de S. cerevisiae com um formação excedente reduzidade NADH e um consumo aumentado de ATP na síntese da biomassa.

Foi demonstrado que a anulação de GDHl, codificando adesidrogenase de glutamato I dependente de NADPH5 em uma cepa tiposilvestre de S. cerevisiae resultou em um aumento na formação de etanol euma diminuição na formação de glicerol (Nissen et al., 1998a,b).Infelizmente, a produtividade de etanol foi significativamente afastada pelaanulação, uma vez que a taxa máxima de crescimento específico do mutanteAgdhl foi de aproximadamente metade daquela da cepa tipo silvestre.

A presente invenção tem demonstrado pela primeira vez que aexpressão excessiva de GLN 1, codificando a sintetase de giutamina, e GLTl,codificando a sintase de glutamato, em um mutante Agdhl resulta em umaumento significativo na taxa máxima de crescimento específico, quandocomparado com o mutante Agdhl, bem como uma produçãosubstancialmente aumentada de etanol.

Consequentemente, uma nova via para a síntese de glutamatofoi apresentada para substituir o papel de uma desidrogenase de glutamatodependente de NADPH na assimilação de amônio e 2-oxoglutarato paraglutamato.

A taxa máxima de crescimento específico de uma cepa deacordo com a invenção, TNl 9, foi 90% da taxa máxima de crescimentoespecífico do tipo silvestre e isto claramente limita o aumento naprodutividade específica de etanol que foi obtida. Este problema pode maisprovavelmente ser resolvido mediante o aumento das atividades específicasde Glnlp e Gltlp ainda mais. Em uma modalidade da invenção, um aumentode cinco vezes na atividade específica de sintase de glutamato foi obtida pelainserção do promotor PGK no cromossoma IV à frente do gene estrutural daenzima. Este nível de atividade pode ser aumentado significativamentemediante, por exemplo, a inserção de mais cópias do gene no cromossomapor meio de, por exemplo, amplificação. É também possível submeter osistema de expressão em questão a uma genética detalhada e/ou análisebioquímica de modo a achar meios de aumentar a expressão.

Em um estudo mais recente, foi demonstrado que a expressãoexcessiva de GDH2, codificando a desidrogenase de glutamato dependentede NADH, em um mutante Agdhl levou a um aumento na taxa máxima decrescimento específico de 0,22 h"1 a 0,39 h"1 (Nissen et al., 1998a). Aatividade específica de Gdh2p nesta cepa foi de 0,625 unidades por mg deTCP, dez vezes mais elevada do que no tipo silvestre, o qual ilustra que aatividade de Gltlp deve ser aumentado ainda de modo a alcançar a mesmataxa máxima de crescimento específico como o tipo silvestre.

O aumento limitado no tempo de fermentação de TN19comparado com TNl poderia não ser um problema sério, assim como é ocusto do substrato que é um fator principal determinante da economia globalda produção de etanol. Isto significa que o aumento observado na produçãode etanol de TNl 9, combinado com a pequena redução relativa da taxamáxima de crescimento específico, representa um avanço e uma contribuiçãovaliosa em uma otimização de produção de etanol microbiana.

Além disso, os resultados obtidos neste estudo mostraram quemesmo embora seja muito difícil executar um processo de engenhariametabólica, a estratégia proposta de aumentar a produção de etanol por S.cerevisiae por engenharia metabólica de vias envolvidas na assimilação denutriente e síntese da biomassa é um grande sucesso.

Consequentemente, foi demonstrado que uma mera reduçãoda formação de glicerol através da engenharia metabólica de reações deconsumo de NADH e NADPH não necessariamente resulta em um fluxoaumentado em direção ao etanol, e formação reduzida de glicerol deveConsequentemente5 como de forma convincente aqui demonstrada pelaprovisão de resultados impressionantes representando um avanço naprodução de etanol microbiano, ser combinada com um consumo aumentadode ATP na formação de biomassa de modo a redirecionar o fluxo de carbonoa partir do glicerol em direção a uma produção aumentada de etanol.

A célula microbiana de acordo com a invenção compreendeuma composição alterada de atividades de enzima exprimíveis e/ou umaexpressão alterada destas. Em princípio, qualquer célula microbiana capaz dei) assimilar uma fonte de nutriente, ii) produzir um produto biossintético naforma de, por exemplo, um ou mais metabólitos primários e/ou secundários,formam parte da invenção. As atividades de enzima exprimíveis tais comouma primeira e/ou segunda atividade de enzima exprimível sãopreferivelmente de modo operável unidas a um sinal de expressão nãonaturalmente associada com atividades.

Em uma modalidade preferida é provido uma célulamicrobiana compreendendo

i) uma expressão aumentada de primeira atividade de enzimaexprimível controlando a assimilação em célula de uma fonte de nutriente,primeira atividade de enzima exprimível sendo operavelmente ligada a umsinal de expressão não naturalmente associada com primeira atividade deenzima,

e opcionalmente

ii) uma expressão aumentada de segunda enzima exprimívelcontrolando a assimilação em célula de uma fonte de nutriente, segundaatividade de enzima exprimível sendo operavelmente ligada a um sinal deexpressão não naturalmente associada com segunda atividade de enzima,e

iii) uma expressão reduzida ou nenhuma expressão de terceiraatividade de enzima exprimível que, quando manifestada em célulamicrobiana, está controlando a assimilação em célula de uma fonte denutriente, terceira atividade de enzima exprimível sendo opcionalmente demodo operável unida a um sinal de expressão não naturalmente associadacom terceira atividade de enzima,

e ainda opcionalmente

iv) uma quarta enzima exprimível controlando um sistemaredox intracelular de célula, quarta atividade da enzima exprimível sendooperavelmente ligada a um sinal de expressão não naturalmente associadacom quarta atividade de enzima.

Em outra modalidade preferida, a célula microbiana dainvenção compreende uma outra atividade de enzima exprimível, outraatividade de enzima exprimível, quando manifestada, medeia uma primeirareação produzindo energia resultando em uma produção de um primeirometabólito, primeira reação sendo operavelmente ligada a uma energiarequerendo a segunda reação resultando na assimilação de uma fonte denutriente. A célula microbiana é preferivelmente uma em que energia querequer a segunda reação resultando na assimilação de uma fonte de nutrienteé controlada pelo menos por primeira e/ou segunda atividade de enzimaexprimível.

Em mais outra modalidade é fornecido uma célula microbianacompreendendo uma outra atividade de enzima exprimível, outra atividadede enzima exprimível, quando manifestada, medeia uma primeira reaçãoproduzindo energia resultando em uma produção de um primeiro metabólito,outra atividade de enzima exprimível, quando manifestada em um nívelaumentado, resulta em um aumento na produção de primeiro metabólito,expressão aumentada de outra atividade de enzima exprimível e/ouprodução aumentada de primeiro metabólito é operavelmente ligada a umaexpressão aumentada de primeira e/ou segunda atividade de enzimaexprimi vel.

A expressão de outra atividade de enzima exprimívelpreferivelmente resulta na produção de um intermediário ou um produto finalde uma via metabólica tal como metabólitos semelhantes, por exemplo, ácidoláctico, ácido acético, ácido propiônico ou etanol, ou uma combinação destes.

A primeira reação produzindo energia pode consequentemente ser mediadapor uma enzima desidrogenase tal como por exemplo, uma desidrogenase deácido orgânico tal como uma desidrogenase de lactato, ou por desidrogenasede álcool mediando a formação de etanol a partir de acetaldeído.

Um metabólito principal é qualquer metabólito formandoparte de uma via metabólica principal compartilhada por váriosmicroorganismos comparáveis tais como microorganismos dentro da mesmaespécie ou subespécie. Vias metabólicas principais são entendidascompreenderem glicólise, ciclo de ácido cítrico, gliconeogênese, via defosfato de pentose, ciclo de uréia, e outras.

Um metabólito secundário é qualquer composto orgânicoformando parte de vias menores que são "ramificadas" das vias metabólicasprincipais mencionadas acima. Os metabólitos secundários podem ser bemproduzidas por alguns membros dentro de uma espécie e não por outras. Umaintrodução em metabólitos secundários é fornecida por Herbert (1981) em"The Biosynthesis of Secondary Metabolites" (Chapman e Hall, Londres,Inglaterra).

A célula microbiana em questão pode dessa maneira ser umeucariota microbiana ou uma procariota microbiana. Entre as eucariotasmicrobianas são as muitas células de levedura e fungicas, tais como ascélulas de levedura da espécie Saccharomyces, Schizosaceharomyees ePiehia, tais como por exemplo, Saccharomyees eerevisiae,Chizosaccharomyces pombe, Piehia pastoris e outros, bem como algas taiscomo por exemplo, Chlamydomonas reinhardi, mofo do limo tais como porexemplo, Dictyostelium discoideum e fungos filamentosos. Os fungosfilamentosos preferidos são espécies de Neurospora e Aspergillus tais comopor exemplo, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger,Aspergillus crytae e Penicillium chrysogenum. Particularmente preferidos sãotambém muitas células de levedura industrialmente relevantes, mofo do limoe fungos filamentosos fornecendo uma produção de produtos tais comoantibióticos, esteróides, pigmentos, enzimas, álcoois orgânicos e ácidos,aminoácidos, polissacarídeos e outros.

Entre as procariotas microbianas preferidas são as célulasbacterianas tais como as espécies Gram-positivas tais como por exemplo,Bacillus subtilis, Bacillus thuringenis, Bacillus lieheniformis, Bacillusamy loliquefaeiens, Bacillus eereus, Bacillus lentus e Baeilusstearothermophilus, espécies de Corynebaeterium e Propionibaeterium bemcomo as espécies Gram negativas tais como Eseheriehia eoli. Particularmentepreferidos são também as espécies bacterianas de ácido láctico tais como porexemplo, Laetococeus laetis, Lactoeoceus laetis subsp. laetis, Laetococeuslaetis subsp. eremoris, Laetococeus laetis subsp. diaeetilactis, espécieLeuconostoc, espécie Lactobacillus, espécie Pediococcus e espécies similaresindustrialmente relevantes semelhantes a por exemplo, Bifidobacterium.

A fonte de nutriente é qualquer fonte de nutriente capaz desustentar o desenvolvimento microbiano por, por exemplo, ser assimilado emum produto biossintético que pode ser utilizado por uma célula microbianaou ser convertido, isto é, metabolisado em um outro produto biossintético,utilização e/ou metabolismo envolvendo uma ou mais reações metabólicasproduzindo energia. Consequentemente, será entendido que qualquer fonte denutriente que seja assimilável e metabolisável por uma célula microbianaforma parte da invenção. A etapa de assimilação será entendida porcompreender igualmente a captação de fonte em célula bem como aconversão de fonte em um produto biossintético - um metabólitointermediário - dentro de célula. Em um escopo mais estrito da interpretaçãodo termo, assimilação será pretendido preferivelmente para compreender aassimilação que ocorre dentro da célula sem necessariamente ser limitada aesta etapa do processo de assimilação.

Em uma modalidade preferida da invenção é fornecido meiospara uma eficiência aumentada de uma captação de uma fonte de nutrientesem uma célula microbiana e/ou uma eficiência aumentada de assimilaçãodentro de célula. O termo eficiência será entendido por compreender, quetanto a captação quanto a conversão intracelular ocorre em uma taxa maisrápida, isto é, quantidades aumentadas de nutrientes são absorvidas e/oumetabolisadas por unidade de tempo, ou por unidade de tempo celular porunidade de massa celular, em célula de acordo com a invenção, quandocomparada com uma célula tipo silvestre comparável ou uma célula isoladacomparável. A pessoa habilitada na técnica estará ciente de que maneira umtransporte trans-membrana e uma quantidade interna de materialmetabolizado ou processado de uma fonte de nutriente assimilada pode sermonitorada.

A fonte de nutriente é preferivelmente uma fonte denitrogênio, uma fonte de carbono, uma fonte de enxofre, ou uma fonte defósforo, mais preferivelmente uma fonte de nitrogênio. As fontes denitrogênio assimiláveis preferidas compreendem amônia, íons de amônio,íons de nitrito, e íons de nitrato. A fonte de nitrogênio assimilável de acordocom a invenção é mais preferivelmente amônia e íons de amônio e o maispreferível amônia. Será entendido que a invenção pertence a todas as fontesde nutriente contendo nitrogênio capazes de serem convertidas em amôniapor oxidação incluindo a oxidação biológica ou pela redução incluindo aredução biológica. A pessoa habilitada estará ciente do fato que as oxidaçõesbiológicas e/ou reduções podem bem ocorrer na ausência de oxigênio comoum aceptor de elétron final.A célula microbiana de acordo com a invenção compreendeuma primeira atividade de enzima exprimível que, quando manifestada emcélula microbiana, está controlando a assimilação em célula de uma fonte denutrientes, preferivelmente uma fonte de nitrogênio tal como por exemplo,amônia, expressão de primeira atividade de enzima em célula microbianasendo ou nova ou alterada quando comparada com a expressão de primeiraatividade de enzima em uma célula microbiana tipo silvestre comparável ouuma célula microbiana isolada comparável.

Em uma modalidade preferida, a célula microbianacompreende uma primeira e uma segunda atividade de enzima exprimívelque, quando manifestada em célula microbiana, está controlando aassimilação em célula de uma fonte de nutriente, preferivelmente uma fontede nitrogênio tal como por exemplo, amônia, expressão de primeira esegunda atividades da enzima em célula microbiana é nova em célula oualterada quando comparada com a expressão de primeira e segundaatividades de enzima em uma célula microbiana comparável tipo silvestre ouuma célula microbiana comparável isolada, primeira e segunda atividades deenzima exprimíveis sendo não idênticas uma da outra.

Uma simplificação mediada da atividade de enzimaexprimível de assimilação de uma fonte de nutriente é entendida porcompreender a capacidade de microorganismo de realizar uma reaçãometabólica levando a assimilação na forma de captação e/ou conversãointracelular de fonte de nutriente. Uma conversão intracelular é entendidapor compreender a síntese de um produto biossintético pela fusão de fonte denutriente - na forma captável tal como uma forma diretamente assimilável ouem uma forma subseqüentemente processada - com um metabólito sendosintetizado por célula, fusão gerando um produto biossintéticometabolisável. É particularmente preferível que a atividade de enzimaexprimível de acordo com a invenção, quando manifestada, é mediada umareação biossintética.

Uma expressão alterada de primeira e/ou segunda atividadede enzima exprimível na célula microbiana de acordo com a invenção seráentendida por compreender qualquer expressão que difere com respeito à taxade formação do produto ou com respeito à quantidade de produto formadoquando comparada a uma célula microbiana comparável. Consequentemente5se uma célula microbiana tipo silvestre for submetida às manipulações deengenharia metabólica de acordo com a invenção, a pessoa habilitadacomparará a expressão de primeira e/ou segunda atividades de enzimaexprimíveis providas na célula metabolicamente planejada com a expressãodas mesmas atividades na célula microbiana tipo silvestre.

Geralmente, a pessoa habilitada na técnica preferivelmenteanalisará - e comparará um com outro - as células microbianas similares oupróximas a idêntica tais como células idênticas com e sem uma atividade deenzima exprimível de acordo com a invenção. Isto é prática padrão delaboratório e a pessoa habilitada na técnica conhecerá de que maneiraconduzir uma tal análise de modo que possa formar uma base para umacomparação direta de por exemplo, uma atividade de enzima manifestada ouuma coenzima expressa ou um sistema redox expresso dentro da significaçãodaqueles termos como determinado mais abaixo.

Preferivelmente, a pessoa habilitada na técnica necessitarácomparar as células microbianas com as células de pelo menos a mesmaespécie e mais preferivelmente comparar células com as células de pelomenos a mesma subespécie.

Consequentemente, se uma célula microbiana isolada tal comopor exemplo, uma cepa industrial ou uma cepa em uma coleção de cultura forsubmetida às manipulações de engenharia metabólica de acordo com ainvenção, a pessoa habilitada comparará a expressão de primeira e/ousegunda atividades de enzima exprimíveis provida na célula metabolicamenteplanejada com a expressão das mesmas atividades na cepa industrial ou nacélula microbiana da coleção de cultura.

O artífice habilitado conhecerá de que maneira as cepas decultura comparáveis tais como as cepas da mesma espécie ou subespécie sobcondições idênticas ou substancialmente similares de modo a fornecer umabase para executar a comparação entre as atividades relevantes da enzima. Apessoa habilitada na técnica também conhecerá de que modo realizará umensaio enzimático para uso em comparação e sendo indicativo da formaçãode um produto biossintético resultante da ação de primeira e/ou segundaatividades exprimíveis, quando manifestadas, e ele estará ciente do potencialde fusões transcritivas e/ou translacionais na expressão de monitoração deatividades de enzima exprimíveis sob condições comparáveis. A pessoahabilitada também será capaz de executar imunoensaios incluindoimunoprecipitações quantitativas. Uma análise da expressão do gene estádisponível em, por exemplo, Old e Primrose (1985): Principies of GeneManipulation - An introduction to genetic engineering (Terceira edição),Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra.

A expressão alterada de primeira e/ou segunda atividades deenzima exprimíveis na célula microbiana de acordo com a invençãopreferivelmente será entendida por compreender uma expressão aumentadaquando comparada com a expressão em uma célula microbiana comparável.

Consequentemente, qualquer uma de primeira ou segunda atividade deenzima exprimível, quando manifestada, é, independentemente uma da outra,aumentada por um fator de pelo menos 1,02, tal como um fator de pelomenos 1,4, por exemplo, 1,06, tal como 1,08, por exemplo, 1,10, tal comopelo menos 1,12, por exemplo, 1,14, tal como 1,16, por exemplo, 1,18, talcomo 1,2, por exemplo, 1,25, tal como 1,3, por exemplo, 1,4, tal como 1,5,por exemplo, 1,6, tal como 1,7, por exemplo, 1,8, tal como 1,9, por exemplo,2,0, tal como 2,25, por exemplo, 2,5, tal como 3, por exemplo, 3,5, tal comoum fato de pelo menos 4, por exemplo, 4,5, tal como 5, por exemplo, 6, talcomo 7, por exemplo, 8, tal como 9, por exemplo, 10, tal como 15, porexemplo, 20, tal como 25, por exemplo, 30, tal como 35, por exemplo, 40, talcomo 50, por exemplo, 60, tal como 80, por exemplo pelo menos, 100, talcomo 150, por exemplo, 200, tal como 250, por exemplo, 300, tal como 350,por exemplo, 400, tal como 500, por exemplo, 600, tal como 800, porexemplo, pelo menos 1000, tal como 1500, por exemplo, 2000, tal como2500, por exemplo, 3000, tal como 3500, por exemplo, 4000, tal como pelomenos 5000, por exemplo, 6000, tal como 8000, por exemplo, pelo menos10000, tal como 15000, por exemplo, 20000, tal como pelo menos 25000, porexemplo, 30000, tal como 35000, por exemplo, 40000, tal como um fator depelo menos 50000.

No entanto, uma expressão alterada não será limitada a umaexpressão aumentada. Uma expressão reduzida de atividades exprimíveisdevem também ser entendidas para serem compreendidas pelo termoexpressão alterada.

Uma reação biossintética mediada por primeira ou segundaatividade de enzima exprimível, quando manifestada, é preferivelmente umareação capaz de ser realizada pela ação de uma enzima de sintase metabólita,mais preferivelmente por uma enzima de sintase matabólita alostérica, eainda mais preferivelmente é reação realizada por uma atividade de enzimaexprimível que, quando manifestada, é apresentada por uma sintase deglutamato.

Em uma modalidade particularmente preferida da invenção,atividade de sintase de glutamato é aquela de GLTl de Saccharomyceseerevisiae tal como por exemplo, aquela de TN17 depositada sob DMSAccession Number 12275 ou uma atividade funcionalmente equivalente comesta. Uma atividade funcionalmente equivalente é qualquer atividade capazde realizar a mesma reação com a provisão de um resultado similar comoaquele resultando da reação sendo realizada pelo polipeptídeo codificadoGL Tl mencionado acima de Saccharomyces eerevisiae. Quando a atividadede enzima exprimível for uma atividade apresentada por uma sintase deglutamato, a célula microbiana é preferivelmente uma célula de levedura emais preferivelmente uma célula de Saeeharimyees eerevisae.

Uma outra reação biossintética mediada por primeira ousegunda atividade de enzima exprimível, quando manifestada, épreferivelmente uma reação capaz de ser realizada pela ação de uma enzimade sintetase metabólita, e mais preferivelmente é reação realizada por umaatividade de enzima exprimível que, quando manifestada, é apresentada poruma sintetase de glutamina.

Fica evidente que, como descrito mais acima, uma enzimaextremamente complexa e complicada sendo regulada tão estrita esensivelmente quanto a sintetase de glutamina não forma um candidato óbviopara redirecionar o fluxo metabólico de reações biossintéticas relacionadascom a assimilação de amônia em uma célula microbiana.

Em uma modalidade particularmente preferida da invenção,sita atividade sintetase de glutamina é aquela codificada por GLNl deSaccharomyees eerevisiae tal como por exemplo, aquela de TN15 depositadasob DSM Accession Number 12274 ou uma atividade funcionalmenteequivalente com esta. Uma atividade funcionalmente equivalente é qualqueratividade capaz de realizar a mesma reação com a provisão de um resultadosimilar como aquele resultando da reação sendo realizada pela atividadecodificada GLNl mencionado acima de Saccharomyees eerevisiae. Quando aatividade exprimível for uma atividade apresentada por uma sintase deglutamato, a célula microbiana é preferivelmente uma célula de levedura emais preferivelmente uma célula de Saecharimyees eerevisae.

Consequentemente, em uma modalidade particularmentepreferida é fornecida uma célula microbiana, preferivelmente uma célula delevedura, em que primeira atividade de enzima exprimível é uma atividadede sintase metabólita, mais preferivelmente uma atividade sintase metabólitaalostérica, e ainda mais preferivelmente uma atividade sintase de glutamato eem que segunda atividade de enzima exprimível é uma atividade sintetasemetabólita, preferivelmente uma atividade sintetase de glutamina.

Em outra modalidade preferida é primeira e/ou segundaatividades de enzima exprimíveis, uma atividade de ligase ou uma atividadede desidrogenase de glutamato dependente de NADH ou uma atividade dedesidrogenase de glutamato dependente de NADPH.

A célula microbiana de acordo com a invenção pode - além deuma primeira e/ou segunda atividades de enzima exprimíveis - tambémcompreender uma terceira atividade de enzima exprimível, atividade, quandomanifestada em célula microbiana, preferivelmente uma célula de levedura,está controlando a assimilação em célula de uma fonte de nutriente,expressão de terceira atividade de enzima em célula microbiana,preferivelmente uma célula de levedura, sendo nova ou alterada quandocomparada com a expressão de terceira atividade de enzima em uma célulamicrobiana comparável tipo silvestre ou uma célula microbiana comparávelisolada, terceira atividade de enzima exprimível sendo não idêntica aqualquer uma e ambas de primeira e segunda atividades de enzimaexprimíveis.

É também fornecido uma modalidade da invenção em queterceira atividade de enzima exprimível foi anulada e não mais está presenteem célula. É particularmente preferido anular terceira atividade de enzimaquando a célula microbiana for uma célula de levedura, mas a atividade podetambém ser anulada a partir de qualquer outra célula microbiana eucarióticaou a partir de uma célula microbiana procariótica.

Referência é feita aos comentários e argumentos acimamencionados no que diz respeito a uma definição de termos tais comoassimilação, fonte de nutrientes, expressão alterada e célula microbianacomparável. As interpretações indicadas mais acima também se aplicam comrespeito a terceira atividade de enzima exprimível.

Consequentemente, em uma modalidade preferida de acordocom a invenção, a terceira atividade de enzima exprimível é preferivelmenteuma atividade de desidrogenase metabólita, e mais preferivelmente umaatividade de desidrogenase de glutamato que está presente em célulamicrobiana e preferivelmente em uma quantidade reduzida, maispreferivelmente em uma quantidade substancialmente reduzida, ou eliminadade célula por meio de, por exemplo, anulação de uma seqüência denucleotídeo codificando atividade ou por efetivamente reprimir a expressãode terceira atividade de enzima exprimível.

Consequentemente, uma expressão alterada em célulamicrobiana de acordo com a invenção de terceira atividade de enzimaexprimível, preferivelmente uma atividade de desidrogenase de glutamato eainda mais preferivelmente uma atividade de desidrogenanse de glutamatodependente de NADPH, será entendido por compreender uma expressãodiminuída quando comparada com a expressão de atividade em uma célulamicrobiana comparável. Consequentemente, a expressão de terceiraatividade de enzima exprimível, quando manifestada, é diminuída por pelomenos 1 por cento, tal como diminuída por pelo menos 2 porcento, porexemplo, 4 por cento, tal como 6 por cento, por exemplo, pelo menos 8 porcento, por exemplo, pelo menos 10 por cento, tal como 12 por cento, porexemplo, 14 por cento, tal como 16 por cento, tal como pelo menos 18 porcento, por exemplo, pelo menos 20 por cento, tal como 22 por cento, porexemplo, 24 por cento, tal como 26 por cento, tal como pelo menos 28 porcento, por exemplo, pelo menos 30 por cento, tal como 32 por cento, porexemplo, 34 por cento, tal como 36 por cento, por exemplo, 38 por cento, talcomo pelo menos 40 por cento, por exemplo, 42 por cento, tal como 44 porcento, por exemplo, 46 por cento, tal como 48 por cento, tal como pelomenos 50 por cento, por exemplo 52 por cento, tal como 54 por cento, porexemplo, 56 por cento, tal como 58 por cento, tal como pelo menos 60 porcento, por exemplo 62 por cento, tal como 64 por cento, por exemplo, 66 porcento, tal como 68 por cento, tal como pelo menos 70 por cento, por exemplo72 por cento, tal como 74 por cento, por exemplo, 76 por cento, tal como 78por cento, tal como pelo menos 80 por cento, por exemplo 82 por cento, talcomo 82 por cento, por exemplo, 84 por cento, tal como 86 por cento, talcomo pelo menos 88 por cento, por exemplo 90 por cento, tal como 92 porcento, por exemplo, 94 por cento, tal como 96 por cento, por exemplo, pelomenos 98 por cento, tal como 99 por cento, por exemplo 99,2 por cento, talcomo pelo menos 99,4 por cento, por exemplo, 99,6, tal como 99,8 por cento,por exemplo, 99,9 por cento, tal como 99,92 por cento, por exemplo, 99,94por cento, tal como 99,96 por cento, por exemplo 99,98 por cento, tal como99,99 por cento, por exemplo, diminuída a uma tal extensão que expressão éincontestável usando o estado padrão dos ensaios da técnica e/ou expressão éefetivamente reprimida e/ou substancialmente eliminada.

Entretanto, uma expressão alterada não será limitada a umaexpressão diminuída. Uma expressão aumentada de terceira atividade deenzima exprimível também será entendida para ser compreendida pelo termoexpressão alterada.

Em uma modalidade particularmente preferida da invençãoatividade de desidrogenase de glutamato é aquela de um polipeptídeocodificado por GDHl de Saccharomyces eerevisiae tal como por exemplo,TN1, ou uma atividade funcionalmente equivalente com esta. Uma atividadefuncionalmente equivalente é qualquer atividade capaz de realizar a mesmareação com a provisão de um resultado similar colmo aquela resultando dareação sendo realizada pelo polipeptídeo codificado por GDHl acimamencionado de Saccharomyees eerevisiae. Quando a atividade dedesidrogenase de glutamato for codificada por GDHl de Saccharomyceseerevisiae, a célula microbiana é preferivelmente uma célula de levedura emais preferivelmente uma célula de Saccharomyees eerevisiae.

As células microbianas que pertencem à invenção foramdepositadas com o DSM sob os Números de Acesso 12267, 12268, 12274,12275, 12276 e 12277 como cepas de Saccharomyees eerevisiae TN4, TN9,TNl5, TNl7, TNl9 e TN22, respectivamente.

Consequentemente, terceira atividade da enzima exprimível,preferivelmente na forma de uma atividade de desidrogenase de glutamato equando manifestada, é manifestada em um nível substancialmente reduzido,não manifestada absolutamente em célula devido a, por exemplo, umarepressão da expressão, ou a atividade foi eliminada completamente decélula. É particularmente preferido que uma seqüência de DNA codificandoterceira atividade da enzima exprimível, preferivelmente uma atividade dedesidrogenase de glutamato, e/ou sinais de expressão direcionando aexpressão desta, tenha sido parcial ou inteiramente anulada de um répliconcromossômico e/ou um réplicon extracromossômico abrigado por célulamicrobiana.

Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, éfornecido uma célula microbiana em que a expressão de primeira e/ousegunda atividades da enzima exprimíveis é aumentada, preferivelmente deforma substancial aumentada, visto que a expressão de terceira atividade daenzima exprimível é diminuída, preferivelmente de forma substancialdiminuída. Referência é feita aos níveis de tal expressão aumentada ediminuída como indicado mais acima.

Uma célula microbiana de acordo com a invenção, tal comouma célula microbiana, preferivelmente uma célula de levedura, em que aexpressão de primeira e/ou segundas atividades da enzima exprimíveis éaumentada, preferivelmente de forma substancial aumentada, visto que aexpressão de terceira atividade da enzima exprimível é diminuída,preferivelmente de forma substancial diminuída, pode em uma modalidadeproduzir um primeiro metabólito, tal como por exemplo, etanol, produção deprimeiro metabólito, preferivelmente etanol, é aumentada quando comparadaa uma expressão de metabólito em uma célula comparável tipo silvestre ouisolada, aumento é aumentado por um fator de pelo menos 1,005, porexemplo, 1,010, tal como 1,015, por exemplo, 1,020, tal como um fator depelo menos 1,025, por exemplo um fator de pelo menos 1,030, tal como1,035, por exemplo, 1,040, tal como 1,045, por exemplo, 1,050, tal como1,055, por exemplo, 1,060, tal como pelo menos 1,065, por exemplo, umfator de pelo menos 1,070, tal como 1,075, por exemplo, 1,080, tal como1,085, por exemplo um fator de pelo menos, 1,090, tal como 1,095, porexemplo, 1,100, tal como 1,105, por exemplo, 1,110, tal como 1,115, porexemplo, 1,120, tal como pelo menos 1,125, por exemplo um fator de pelomenos, 1,130, tal como 1,135, por exemplo, 1,140, por exemplo, 1,145, talcomo 1,150, por exemplo, 1,155, tal como pelo menos 1,160, por exemploum fator de pelo menos, 1,165, tal como um fator de pelo menos 1,170, porexemplo, um fator de pelo menos 1,175, tal como 1,180, por exemplo, 1,185,tal como 1,190, por exemplo, 1,195, tal como um fator de pelo menos 1,200,por exemplo, 1,21, tal como 1,22, por exemplo, 1,23, tal como 1,24, porexemplo, 1,25, tal como 1,26, por exemplo, 1,27, tal como 1,28, por exemplo,1,29, tal como um fator de pelo menos, 1,30, por exemplo, 1,35, tal como1,40, por exemplo, 1,45, tal como 1,50, por exemplo, 1,55, tal como 1,60, porexemplo, 1,65, tal como 1,70, por exemplo, 1,75, tal como 1,80, por exemplo,1,85, tal como 1,90, por exemplo, 1,95, tal como um fator de pelo menos, 2,0,por exemplo, 2,2, tal como 2,4, por exemplo, 2,6, tal como 2,8, por exemplo,3,0, tal como 3,2, por exemplo, 3,4, tal como 3,6, por exemplo, 3,8, tal comopelo menos 4,0, por exemplo, 4,2, tal como 4,4, por exemplo, 4,6, tal como4,8, por exemplo pelo menos, 5,0, tal como 5,2, por exemplo, 5,4, tal como5,6, por exemplo, 5,8, tal como pelo menos 6,0, por exemplo, 6,2, tal como6,4, por exemplo, 6,6, tal como 6,8, por exemplo pelo menos, 7,0, porexemplo, 7,2, tal como 7,4, por exemplo, 7,6, tal como 7,8, por exemplo, 8,0,tal como 8,2, por exemplo, 8,4, tal como 8,6, por exemplo, 8,8, tal como pelomenos 9,0, por exemplo, 9,2, tal como 9,4, por exemplo, 9,6, tal como 9,8,por exemplo, um fator de pelo menos 10,0.

A célula microbiana, mais preferivelmente levedura, tendouma produção aumentada de um primeiro metabólito tem, em outramodalidade preferida, uma produção diminuída de um segundo metabólito,preferivelmente glicerol. produção diminuída de segundo metabólito,preferivelmente glicerol, é diminuída por pelo menos 0,5 por cento, porexemplo, pelo menos 1 por cento, tal como pelo menos 2 porcento, porexemplo, 4 por cento, tal como 6 por cento, tal como pelo menos 8 por cento,por exemplo, pelo menos 10 por cento, tal como 12 por cento, por exemplo,14 por cento, tal como 16 por cento, tal como pelo menos 18 por cento, porexemplo, pelo menos 20 por cento, tal como 22 por cento, por exemplo, 24por cento, tal como 26 por cento, tal como pelo menos 28 por cento, porexemplo, pelo menos 30 por cento, tal como 32 por cento, por exemplo, 34por cento, tal como 36 por cento, por exemplo, 38 por cento, tal como pelomenos 40 por cento, por exemplo, 42 por cento, tal como 44 por cento, porexemplo, 46 por cento, tal como 48 por cento, tal como pelo menos 50 porcento, por exemplo 52 por cento, tal como 54 por cento, por exemplo, 56 porcento, tal como 58 por cento, tal como pelo menos 60 por cento, por exemplo62 por cento, tal como 64 por cento, por exemplo, 66 por cento, tal como 68por cento, tal como pelo menos 70 por cento, por exemplo 72 por cento, talcomo 74 por cento, por exemplo, 76 por cento, tal como 78 por cento, talcomo pelo menos 80 por cento, por exemplo 82 por cento, tal como 82 porcento, por exemplo, 84 por cento, tal como 86 por cento, tal como pelomenos 88 por cento, por exemplo 90 por cento, tal como 92 por cento, porexemplo, 94 por cento, tal como 96 por cento, por exemplo, pelo menos 98por cento, tal como 99 por cento, por exemplo 99,2 por cento, tal como pelomenos 99,4 por cento, por exemplo, 99,6 por cento, tal como 99,8 por cento,por exemplo, 99,9 por cento, tal como 99,92 por cento, por exemplo, 99,94por cento, tal como 99,96 por cento, por exemplo 99,98 por cento, tal como99,99 por cento, por exemplo, um nível de expressão sendo diminuída a umatal extensão que expressão de terceira atividade é incontestável usando oestado padrão dos ensaios da técnica e/ou expressão é efetivamentereprimida e/ou substancialmente eliminada.

Em uma outra modalidade preferida, a taxa máxima decrescimento específico da célula de acordo com a invenção ésubstancialmente inalterada quando comparada com uma célula microbianacomparável tipo silvestre ou a uma célula microbiana comparável isolada. Noentanto, uma célula microbiana caracterizada por uma diminuição na taxamáxima de crescimento específico é também preferida de acordo com ainvenção, tal como uma célula microbiana, preferivelmente uma célula delevedura, tendo uma taxa máxima de crescimento específico que é diminuídapor menos do que 1 por cento, tal como 1,5 por cento, por exemplo, 2,0 porcento, tal como por menos do que 2,5 por cento, por exemplo, 3,0 por cento,tal como 3,5 por cento, por exemplo, por menos do que 4,0 por cento, talcomo 4,5 por cento, por exemplo, 5,0 por cento, tal como por menos do que5,5 por cento, por exemplo, 6,0 por cento, tal como 6,5 por cento, porexemplo, por menos do que 7,0 por cento, tal como 7,5 por cento, porexemplo, 8,0 por cento, tal como por menos do que 8,5 por cento, porexemplo, 9,0 por cento, tal como 9,5 por cento, por exemplo, por menos doque 10,0 por cento, tal como 12 por cento, por exemplo, 14 por cento, talcomo por menos do que 16 por cento, por exemplo, 18 por cento, tal como 20por cento, por exemplo, por menos do que 25 por cento.

Em outra modalidade, a célula microbiana compreendendoprimeira e/ou segunda atividades de enzima exprimíveis e opcionalmenteterceira atividade de enzima exprimível, se atividade não foi eliminada decélula por remoção, anulação ou de outro modo, pode ainda opcionalmentecompreender uma quarta atividade de enzima exprimível. Consequentemente,é provido, em uma modalidade da invenção, uma célula microbiana deacordo com a invenção ainda compreendendo quarta atividade de enzimaexprimível visto que, em outra modalidade, quarta atividade exprimível nãoestá presente em célula microbiana.

A quarta atividade de enzima exprimível, quando manifestada,está controlando um sistema redox intracelular de célula, expressão dequarta atividade da enzima em célula microbiana sendo nova ou alteradaquando comparada com a expressão de quarta atividade de enzima em umacélula microbiana comparável tipo silvestre ou uma célula microbianacomparável isolada, quarta atividade de enzima exprimível sendo nãoidêntica a cada uma e todas de primeira, segunda e terceira atividades deenzima exprimíveis.

Em uma modalidade particularmente preferida da invenção,quarta atividade de enzima exprimível é codificada por uma seqüência denucleotídeo designada SEQ ID NO: 1 como ilustrado mais abaixo, seqüênciade nucleotídeo foi clonada em um plasmídeo de múltiplas cópias, Yep24-pPGK. Este plasmídeo foi construído a partir do Yep24 e contém o promotore terminador de PGK e foi fornecido por Mikael Anderlund (Walfridsson etal., 1997). O CTH foi ligado em YEp24 atrás do promotor constitutivo fortedo PGK resultante no plasmídeo Yep24-pPGK-CTH. Este plasmídeo foitransferido para dentro da cepa TN2 resultando na cepa TN4.

Os termos expressão alterada e célula microbiana comparávelcomo aqui introduzidos mais acima também se aplicam a quarta atividade deenzima exprimível. A expressão sistema redox intracelular será entendida porcompreender qualquer sistema redox compreendendo uma coenzima que estápresente nas formas oxidadas e reduzidas correspondentes. Os sistemas redoxintracelulares preferidos são coenzimas nas formas oxidadas/reduzidascorrespondentes tais como por exemplo, NAD7NADH e NADP7NADPH.

O termo manutenção de um sistema redox intracelular seráentendido por compreender a ação exercida por qualquer atividade de enzimaexprimível que, quando manifestada, está fornecendo uma entrada em um talsistema mediante, por exemplo, a ação em uma via levando à síntese de umou mais componentes de sistema ou mediante a ação em uma reciclagem oude fato qualquer reação cíclica envolvendo tais componentes, preferivelmenteuma reação envolvendo uma oxidação de uma coenzima e/ou uma redução deuma coenzima oxidada.

Por exercer qualquer uma das ações acima mencionadas,quarta atividade de enzima exprimível está controlando um sistema redox. Amanutenção descrita acima de sistema redox pode bem levar a uma taxaaumentada de síntese de qualquer um ou mais componentes de sistema,manutenção pode também levar a um aumento na combinação de qualquerum componente sendo compreendido em sistema redox, notavelmente umaumento na combinação da forma reduzida e/ou oxidada de uma coenzima.

Manutenção também será entendida por compreenderqualquer efeito que leve a uma diminuição na combinação de componentesde um sistema redox, notavelmente uma diminuição na combinação da formareduzida e/ou oxidada de uma coenzima.

A pessoa habilitada na técnica conhecerá de que maneira taxarum aumento ou diminuição de qualquer forma de uma coenzima ou dequalquer sistema redox, e ela saberá que deve comparar os níveis daquelamesma coenzima ou sistema redox em uma célula microbiana comparáveltipo silvestre ou uma célula microbiana isolada desenvolvida sob condiçõesidênticas ou substancialmente similares que permite uma comparação diretade níveis mediante a exploração do estado das técnicas monitorando o ofíciotais como aquelas descritas por Weuster e de-Graff (1996) em Adv. Biochem.Eng. Biotechnol., vol. 54, páginas de 75 a 108 e por Wiechert e de Graff(1996) em Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. vol. 54, páginas de 109 a 154. Apessoa habilitada na técnica preferivelmente analisará as células microbianassimilares ou quase idênticas com e sem quarta atividade de enzimaexprimivel.

Consequentemente, os termos aumento e diminuição dizemrespeito a um nível de expressão ou síntese ou a uma concentração de umacoenzima e/ou sistema redox. O termo nível é usado intervariavelmente natécnica com termos tais como taxa de síntese e concentração. A pessoahabilitada na técnica estará familiarizado com tais termos e anexará osignificado correto a seu uso em diferentes contextos.

Pela ação de aumentar e/ou diminuir a taxa de síntese e/ou acombinação de um componente do sistema redox, a quarta atividade deenzima exprimível está controlando sistema redox intracelular. O termoalteração neste contexto será entendido por compreender qualquer mudançaou desvio da presença e/ou quantidade de um sistema redox presente em ummicroorganismo comparável tipo silvestre ou uma célula microbianacomparável isolada.

Qualquer sistema redox pode geralmente ser percebidocontribuir com a provisão de um certo nível de redox em uma célula. Atotalidade de todos tais sistemas redox em uma célula determina o nível deredox de célula. O nível de redox de uma célula assim compreende apresença e/ou quantidade da totalidade de um poder de redução e um poderde oxidação presente em célula. Consequentemente, uma alteração de umsistema redox intracelular pode ser medida por monitoração do aumento oudiminuição de um sistema redox específico, isto é, um aumento oudiminuição em ambas as formas oxidadas bem como na forma reduzida deuma coenzima constituindo sistema redox, ou alternativamente, alteraçãopode ser monitorada por medir um nível total de redox celular.

Em uma modalidade preferida de acordo com a invenção,quarta atividade de enzima exprimível fornece os meios para transferir opotencial de redução ou oxidação de um sistema redox para o outro. Aalteração de um sistema redox intracelular pode assim resultar em umaumento ou diminuição na forma oxidada ou na forma reduzida de umacoenzima. Pode também resultar em cada uma daquelas formas sendoaumentadas enquanto a outra forma é diminuída. Qualquer tal alteração podeser medida ou por monitorar o aumento ou diminuição de qualquer umsistema redox específico, isto é, um aumento ou diminuição em cada umaforma oxidada e/ou forma reduzida de coenzima. Alternativamente,alteração pode ser monitorada por medir um nível total de redox intracelular.

A pessoa habilitada na técnica estará ciente de tais alteraçõeslevando a um nível de redox aumentado ou diminuído e, como aquiexemplificado e explicado ainda em detalhes abaixo, a pessoa habilitadaestará ciente das técnicas do ofício disponíveis para monitorar um nível deredox intracelular.

Em uma modalidade portanto, quando quarta atividade deenzima exprimível estiver presente em célula microbiana e aqui manifestada,resulta em um nível aumentado ou diminuído, preferivelmente um nívelaumentado, de pelo menos uma coenzima intracelular em sua forma oxidadaou reduzida, coenzima em sua forma oxidada/reduzida é preferivelmenteselecionada do grupo consistindo de FAD/FADH2, NAD+/NADH eNADP7NADPH.

Consequentemente, o nível de pelo menos uma coenzimaintracelular em sua forma oxidada ou reduzida é aumentada ou diminuída,preferivelmente aumentada, por um fator de 1,005, por exemplo, 1,010, talcomo 1,015, por exemplo, 1,020, tal como um fator de pelo menos 1,025, porexemplo um fator de pelo menos 1,030, tal como 1,035, por exemplo, 1,040,tal como 1,045, por exemplo, 1,050, tal como 1,055, por exemplo, 1,060, talcomo pelo menos 1,065, por exemplo, um fator de pelo menos 1,070, talcomo 1,075, por exemplo, 1,080, tal como 1,085, por exemplo um fator depelo menos, 1,090, tal como 1,095, por exemplo, 1,100, tal como 1,105, porexemplo, 1,110, tal como 1,115, por exemplo, 1,120, tal como pelo menos1,125, por exemplo um fator de pelo menos, 1,130, tal como 1,135, porexemplo, 1,140, por exemplo, 1,145, tal como 1,150, por exemplo, 1,155, talcomo pelo menos 1,160, por exemplo um fator de pelo menos, 1,165, talcomo um fator de pelo menos 1,170, por exemplo, um fator de pelo menos1,175, tal como 1,180, por exemplo, 1,185, tal como 1,190, por exemplo,1,195, tal como um fator de pelo menos 1,200, por exemplo, 1,21, tal como1,22, por exemplo, 1,23, tal como 1,24, por exemplo, 1,25, tal como 1,26, porexemplo, 1,27, tal como 1,28, por exemplo, 1,29, tal como um fator de pelomenos, 1,30, por exemplo, 1,35, tal como 1,40, por exemplo, 1,45, tal como1,50, por exemplo, 1,55, tal como 1,60, por exemplo, 1,65, tal como 1,70, porexemplo, 1,75, tal como 1,80, por exemplo, 1,85, tal como 1,90, por exemplo,1,95, tal como um fator de pelo menos, 2,0, por exemplo, 2,2, tal como 2,4,por exemplo, 2,6, tal como 2,8, por exemplo, 3,0, tal como 3,2, por exemplo,3,4, tal como 3,6, por exemplo, 3,8, tal como pelo menos 4,0, por exemplo,4,2, tal como 4,4, por exemplo, 4,6, tal como 4,8, por exemplo pelo menos,5,0, tal como 5,2, por exemplo, 5,4, tal como 5,6, por exemplo, 5,8, tal comopelo menos 6,0, por exemplo, 6,2, tal como 6,4, por exemplo, 6,6, tal como6,8, por exemplo pelo menos, 7,0, por exemplo, 7,2, tal como 7,4, porexemplo, 7,6, tal como 7,8, por exemplo, 8,0, tal como 8,2, por exemplo, 8,4,tal como 8,6, por exemplo, 8,8, tal como pelo menos 9,0, por exemplo, 9,2,tal como 9,4, por exemplo, 9,6, tal como 9,8, por exemplo, um fator de pelomenos 10,0.

Embora um aumento seja preferido, será entendido que otermo alteração não é por nenhum meio limitado a um aumento no nível depelo menos uma coenzima intracelular em sua forma oxidada ou reduzida,alteração também compreenderá qualquer diminuição no nível de pelo menosuma coenzima intracelular em sua forma oxidada ou reduzida.

Em uma modalidade da invenção em que a expressão dequarta atividade da enzima exprimível resulta em um aumento ou umadiminuição no nível isto é, concentração de um sistema redox intracelularcomo um todo, isto é, um aumento ou diminuição de ambas de duas formasoxidadas ou reduzidas correspondentes de uma coezima, alteração é umaumento ou diminuição, preferivelmente um aumento, por um fato de pelomenos 1,005, por exemplo, 1,010, tal como 1,015, por exemplo, 1,020, talcomo um fator de pelo menos 1,025, por exemplo um fator de pelo menos1,030, tal como 1,035, por exemplo, 1,040, tal como 1,045, por exemplo,1,050, tal como 1,055, por exemplo, 1,060, tal como pelo menos 1,065, porexemplo, um fator de pelo menos 1,070, tal como 1,075, por exemplo, 1,080,tal como 1,085, por exemplo um fator de pelo menos, 1,090, tal como 1,095,por exemplo, 1,100, tal como 1,105, por exemplo, 1,110, tal como 1,115, porexemplo, 1,120, tal como pelo menos 1,125, por exemplo um fator de pelomenos, 1,130, tal como 1,135, por exemplo, 1,140, por exemplo, 1,145, talcomo 1,150, por exemplo, 1,155, tal como pelo menos 1,160, por exemploum fator de pelo menos, 1,165, tal como um fator de pelo menos 1,170, porexemplo, um fator de pelo menos 1,175, tal como 1,180, por exemplo, 1,185,tal como 1,190, por exemplo, 1,195, tal como um fator de pelo menos 1,200,por exemplo, 1,21, tal como 1,22, por exemplo, 1,23, tal como 1,24, porexemplo, 1,25, tal como 1,26, por exemplo, 1,27, tal como 1,28, por exemplo,1,29, tal como um fator de pelo menos, 1,30, por exemplo, 1,35, tal como1,40, por exemplo, 1,45, tal como 1,50, por exemplo, 1,55, tal como 1,60, porexemplo, 1,65, tal como 1,70, por exemplo, 1,75, tal como 1,80, por exemplo,1,85, tal como 1,90, por exemplo, 1,95, tal como um fator de pelo menos, 2,0,por exemplo, 2,2, tal como 2,4, por exemplo, 2,6, tal como 2,8, por exemplo,3,0, tal como 3,2, por exemplo, 3,4, tal como 3,6, por exemplo, 3,8, tal comopelo menos 4,0, por exemplo, 4,2, tal como 4,4, por exemplo, 4,6, tal como4,8, por exemplo pelo menos, 5,0, tal como 5,2, por exemplo, 5,4, tal como5,6, por exemplo, 5,8, tal como pelo menos 6,0, por exemplo, 6,2, tal como6,4, por exemplo, 6,6, tal como 6,8, por exemplo pelo menos, 7,0, porexemplo, 7,2, tal como 7,4, por exemplo, 7,6, tal como 7,8, por exemplo, 8,0,tal como 8,2, por exemplo, 8,4, tal como 8,6, por exemplo, 8,8, tal como pelomenos 9,0, por exemplo, 9,2, tal como 9,4, por exemplo, 9,6, tal como 9,8,por exemplo, um fator de pelo menos 10,0.

A quarta atividade da enzima exprimível pode bem resultarem um aumento ou uma diminuição, preferivelmente um aumento, de maisdo que um sistema redox intracelular. Será entendido que em umamodalidade da invenção, quarta atividade da enzima exprimível, quandomanifestada, é resultante de um nível aumentado de pelo menos um sistemaredox intracelular.

Em um aspecto particularmente preferido da invenção, quartaatividade da enzima exprimível é uma atividade transidrogenase intracelular,preferivelmente uma atividade transidrogenase de nucleotídeo piridina, emais preferivelmente uma atividade transidrogenase de nucleotídeo piridinatal como aquela de CTH de Azotobacter vinelandii como abrigado porSaceharomyces eerevisiae TN4 depositado sob DMS Accession Number12267, ou uma atividade funcionalmente equivalente. O termo atividadeequivalente funcional é definido mais acima e também se aplica ao contextoem que o termo é aqui usado.

A atividade transidrogenase de nucleotídeo piridina éendogenosa ou heteróloga a célula microbiana em que é manifestada eatividade é apresentada por um polipeptídeo que é ligado a membrana em umorganismo hospedeiro natural ou localizado, isto é, presente no citoplasma deum organismo hospedeiro natural, organismo hospedeiro naturalpreferivelmente sendo selecionado do grupo de células de mamíferos, célulasde plantas, células eucarióticas e procarióticas incluindo células microbianase bacterianas tais como por exemplo, procariota microbiana Gram-positiva euma procariota microbiana Gram-negativa.

A expressão de atividade transidrogenase de nucleotídeopiridina em célula microbiana em uma modalidade preferida da invençãoresulta em uma conversão aumentada de NADPH e NAD para NADH eNADP. Em outra modalidade expressão de atividade transidrogenase denucleotídeo piridina resulta em um consumo aumentado de NADPH e umaformação aumentada de NADH. Em uma outra modalidade a expressão tem oefeito de aumentar o consumo de NADH e aumentar a formação de NADPH.

Em mais uma outra modalidade a expressão resulta em uma formaçãoaumentada de NADH e/ou NADP. No entanto, expressão pode tambémresultar em uma formação diminuída de NADPH e/ou uma relaçãoNADPH/NADP diminuída. A atividade transidrogenase de nucleotídeopiridina, é preferivelmente manifestada em célula microbiana sob condiçõesde desenvolvimento anaeróbico e preferivelmente resulta na relação deNADPH/NADP sendo mais baixa do que a relação NADH/NAD.

Em uma outra modalidade preferida, a atividadetransidrogenase, preferivelmente uma atividade que está ligada a membranaem um organismo hospedeiro natural, é inserida na membrana do plasma deuma célula microbiana, preferivelmente uma célula de levedura. A atividadetransidrogenase deve mediar uma reação de consumo de NADP e gerarNADPH. Em uma modalidade particularmente preferida, umatransidrogenase E. coli é manifestada em uma célula de levedura e leva à umnível aumentado de NADPH. A expressão da transidrogenase E. coli é ligadaa um gradiente de próton através da membrana do organismo hospedeironatural e uma ligação similar é provável de ser estabelecida quando a enzimatransidrogenase E. coli ligada a membrana for integrada na membrana doplasma de uma célula de levedura tal como por exemplo, Saccharomyceseerevisiae.

Em uma modalidade particularmente preferida, a quartaatividade da enzima expremível é aquela de CTH compreendida na cepaSaccharomyees eerevisiae TN4 depositada sob Accession Number DSM12267.

A célula microbiana de acordo com a invenção épreferivelmente uma adequada para armazenagem na forma de umapreparação congelada ou seca por congelamento tal como um liofilisato doqual a célula microbiana é parcial ou completamente reconstituível.

Em mais uma outra modalidade da invenção, a célulamicrobiana foi metabolicamente planejada como descrito acima e é capaz dereoxidação alternativa de NADH. reoxidação alternativa de NADH émediada pelo menos pela expressão combinada de primeira e segundaatividades da enzima exprimiveis acima mencionadas. Em uma modalidadepreferida, reoxidação alternativa de NADH é mediada pela expressãoexcessiva de primeira e segunda atividades da enzima exprimíveis em umacélula microbiana tendo uma expressão substancialmente diminuída deterceira atividade da enzima exprimível, ou uma célula microbiana em queexpressão foi reprimida ou eliminada ou anulada, quarta atividade da enzimaexprimível pode opcionalmente ser manifestada simultaneamente com umaexpressão excessiva de primeira e segunda atividades da enzima exprimíveise uma expressão substancialmente reduzida e preferivelmente eliminada deterceira atividade da enzima exprimível. Em uma modalidade preferida dainvenção, primeira, segunda, terceira e quarta atividades da enzimaexprimíveis são aquelas de uma sintase de glutamato, uma sintetase deglutamina, uma desidrogenase de glutamato e uma transidrogenase,respectivamente.

A reoxidação alternativa de NADH será entendido porcompreender a introdução de uma nova via principal para a reoxidação deNADH ou uma geração de uma via substancialmente alterada para areoxidação de NADH em uma célula microbiana. A alteração quanto a umavia para a oxidação alternativa de NADH será entendida no contexto da taxade reação mediando uma conversão de um metabólito em outro, reaçãotambém resultando na reoxidação de NADH. A taxa de reação de reoxidaçãoem uma célula microbiana capaz de reoxidação alternativa de NADH ésubstancialmente aumentada quando comparada com a taxa de reação emuma célula microbiana comparável. A definição do termo comparável quantoa células microbianas foi anteriormente introduzida mais acima.

A reoxidação alternativa de NADH é um exemplo de umacélula microbiana em que a expressão de uma transidrogenase, emcombinação com várias atividades de enzima exprimíveis adicionalmentepreferidas, são capazes de gerar um replanejamento intencional de uma redecomplexa de reações metabólicas. A célula microbiana replanejada éinventada pela substituição ou suplementação de uma primeira reaçãometabólica normalmente dominante com uma segunda reação que énormalmente insignificante em relação a taxa de reação e/ou formação doproduto quando comparada a primeira reação dominante. No entanto, porsignificativamente aumentar segunda reação enquanto ao mesmo temposignificativamente diminuir ou mesmo eliminar primeira reação, é possívelalcançar uma reoxidação alternativa de NADH. Em uma outra modalidade dainvenção, é também provido uma célula microbiana capaz de reoxidaçãoalternativa de NADPH ou redução alternativa de NADP.

Em um outro aspecto da invenção, é provido uma composiçãocompreendendo a célula microbiana e um portador, preferivelmente umportador fisiologicamente aceitável e mais preferivelmente um líquido combase em água tal como um caldo adequado para cultivo de célulamicrobiana. A composição em uma modalidade preferida é uma culturainiciadora da fermentação.

E também provido o aspecto de uma seqüência de nucleotídeocodificando uma atividade da enzima transidrogenase nova e industrialmenterelevante, seqüência compreendendo SEQ ID NO:l, como ilustrado maisabaixo, ou parte desta, incluindo derivados funcionalmente equivalentesdestes codificando uma atividade de enzima transidrogenase, preferivelmentemas não são limitados a eles, substituições de nucleotídeo conservativas e/ouanulações de nucleotídeo e/ou inserções de nucleotídeo. derivadosfuncionalmente equivalentes podem assim ser de pelo menos 99,9 por centoidênticas a SEQ ID NO:l, tais como pelo menos 99,8 por cento idênticas aSEQ ID NO:l, por exemplo, pelo menos 99,7 por cento idênticas, tais comopelo menos 99,6 por cento idênticas, por exemplo, pelo menos 99,5 por centoidênticas, tais como pelo menos 99,4 por cento idênticas, por exemplo, pelomenos 99,3 por cento idênticas, tais como pelo menos 99,2 por centoidênticas, por exemplo, pelo menos 99,1 por cento idênticas, tais como pelomenos 99 por cento idênticas a SEQ ID NO:l, por exemplo, pelo menos 98,5por cento idênticas A SEQ ID NO:l, tais como pelo menos 98,0 por centoidênticas, por exemplo 97,5 por cento idênticas, tais como pelo menos 97,0por cento idênticas a SEQ ID NO:l, por exemplo, pelo menos 96,5 por centoidênticas, tais como pelo menos 96,0 por cento idênticas, por exemplo, pelomenos 95,5 por cento idênticas, tais como pelo menos 95,0 por centoidênticas, por exemplo, pelo menos 94,5 por cento idênticas, tais como pelomenos 94,0 por cento idênticas, por exemplo, pelo menos 93,5 por centoidênticas, tais como pelo menos 93,0 por cento idênticas a SEQ ID NO:l, porexemplo, pelo menos 92,5 por cento idênticas, tais como pelo menos 92,0 porcento idênticas, por exemplo, pelo menos 91,5 por cento idênticas, tais comopelo menos 91,0 por cento idênticas, por exemplo, pelo menos 90,5 por centoidênticas, tais como pelo menos 90,0 por cento idênticas, por exemplo, pelomenos 85,0 por cento idênticas a SEQ ID NO:l. Em uma modalidade, SEQID Ν: 1 é uma seqüência que é sintetizada parcial ou completamente in vitro.

Em um outro aspecto dá invenção é provido um réplicon deDNA recombinante na forma de um vetor compreendendo a seqüência denucleotídeo designada SEQ ID NO:l incluindo derivados funcionalmenteequivalentes. A seqüência de nucleotídeo designada SEQ ID NO:l épreferivelmente de modo operável ligada a um sinal de expressãocompreendido em réplicon, sinal de expressão direcionando a expressão deseqüência de nucleotídeo. É também provido uma célula microbianaabrigando a seqüência de nucleotídeo designada SEQ ID NO:1 ou umréplicon recombinante na forma de um vetor abrigando seqüência denucleotídeo.

O réplicon de DNA recombinante é preferivelmente um capazde fazer uma réplica em uma célula de levedura e/ou em uma célulamicrobiana procariótica tal como uma célula bacteriana de ácido láctico. Osvetores de levedura preferidos compreendem um marcador selecionável e umou mais sítios em uma seqüência de nucleotídeo específica para umaendonuclease de restrição. Uma seqüência autonomamente replicante (ARS)medeia a reprodução exata de réplicon quando abrigado em uma célula delevedura. O vetor é preferivelmente baseado em um plasmídeo selecionadodo grupo consistindo de um plasmídeo epissomal de levedura (Yep), talcomo o plasmídeo 2 μηι, um plasmídeo de replicação de levedura (Yrp)5 umplasmídeo centromérico de levedura (Ycp) e um plasmídeo de integração delevedura (Yip). Um réplicon particularmente preferido é um abrigado pelacepa Saccharomyces eerevisiae TN4 depositada sob Acession Number DSM12267.

Os vetores capazes de serem mantidos em uma célulamicrobiana procariótica tal como um a célula bacteriana de ácido láctico sãobastante descritos na literatura e preferivelmente contêm um réplicondirecionando, por exemplo, replicação de círculo rolante ou θ-replicação, ummarcador selecionável tal como uma seleção e/ou mutação impedindo amutação sem sentido a não ser que suprimida por um supressorcompreendido por uma célula compreendendo vetor, e um ou mais sítioscliváveis por uma endonuclease de restrição.

Em um outro aspecto da invenção, é fornecido uma seqüênciade aminoácido codificado pela seqüência de nucleotídeo designada SEQ IDNO:l, ou qualquer derivado funcionalmente equivalente desta, seqüência deaminoácido compreendendo a seqüência SEQ ID NO:2 como ilustrada maisabaixo, ou uma parte desta, incluindo quaisquer derivados funcionalmenteequivalentes apresentando atividade transidrogenase, preferivelmente, masnão são limitados a eles, derivados funcionalmente equivalentescompreendendo substituições conservativas de aminoácido.

O derivado funcionalmente equivalente de seqüência deaminoácido designada SEQ ID NO: 2 pode assim ser pelo menos 99 porcento idêntico a SEQ ID NO: 2, tal como pelo menos 98 por cento idêntico aSEQ ID NO: 2, por exemplo, pelo menos 97 por cento idêntico, tal como pelomenos 96 por cento idêntico, por exemplo, pelo menos 95 por cento idêntico,tal como pelo menos 94 por cento idêntico, por exemplo, pelo menos 93 porcento idêntico, tal como pelo menos 92 por cento idêntico, por exemplo, pelomenos 91 por cento idêntico, tal como pelo menos 90 por cento idêntico aSEQ ID NO: 2, por exemplo, pelo menos 89 por cento idêntico a SEQ IDNO:2, tal como pelo menos 88 por cento idêntico, por exemplo, 87 por centoidêntico, tal como pelo menos 86 por cento idêntico a SEQ ID NO:2, porexemplo, pelo menos 85 por cento idêntico a SEQ ID NO:2. Em umamodalidade, SEQ ID NO: 2 é uma seqüência que é sintetizada parcial oucompletamente in vitro.

Em um outro aspecto da invenção é fornecido uma célulamicrobiana, preferivelmente uma célula de levedura ou uma célulabacteriana, ou uma composição compreendendo toda a célula, para uso emuma produção de um primeiro metabólito tal como um metabólito primárioou secundário, preferivelmente um metabólito primário e maispreferivelmente um álcool ou um ácido, tal como por exemplo, glicerol,ácido acético e ácido propiônico, o etanol sendo particularmente preferido.

Quando o primeiro metabólito for um metabólito secundário,metabólito secundário é preferivelmente selecionado do grupo de metabólitossecundários consistindo de uma β-lactama, uma policetida, um terpeno, umesteróide, uma quinona, uma cumarina, um flavonóide, um alcalóide, umapiperidina, uma piridina, e outros.

A produção do primeiro metabólito é preferivelmente deforma substancial aumentada quando comparado à produção de primeirometabólito em uma célula comparável tipo silvestre ou uma célulamicrobiana comparável isolada. Consequentemente, produção celularmicrobiana de primeiro metabólito é aumentada pelo menos por um fator de1,02, tal como um fator de pelo menos 1,04, por exemplo, 1,06, tal como1,08, por exemplo, 1,10, tal como pelo menos 1,12, por exemplo, 1,14, talcomo 1,16, por exemplo, 1,18, tal como 1,2, por exemplo, 1,25, tal como 1,3,por exemplo, 1,4, tal como 1,5, por exemplo, 1,6, tal como 1,7, por exemplo,1,8, tal como 1,9, por exemplo, 2,0, tal como 2,25, por exemplo, 2,5, talcomo 3, por exemplo, 3,5, tal como um fator de pelo menos 4, por exemplo,4,5, tal como 5, por exemplo, 6, tal como 7, por exemplo, 8, tal como 9, porexemplo, 10, tal como 15, por exemplo, 20, tal como 25, por exemplo, 30, talcomo 35, por exemplo, 40, tal como 50, por exemplo, 60, tal como 80, porexemplo pelo menos 100, tal como 150, por exemplo, 200, tal como 250, porexemplo, 300, tal como 350, por exemplo, 400, tal como 500, por exemplo,600, tal como 800, por exemplo, pelo menos 1000, tal como 1500, porexemplo, 2000, tal como 2500, por exemplo, 3000, tal como 3500, porexemplo, 4000, tal como pelo menos 5000, por exemplo, 6000, tal como8000, por exemplo, pelo menos 10000, tal como 15000, por exemplo, 20000,tal como pelo menos 25000, por exemplo, 30000, tal como 35000, porexemplo, 40000, tal como um fator de pelo menos 50000.

Pode além disso ser vantajoso produzir e/ou purificar pormeio de qualquer estado da técnica de processamento a jusante, primeirometabólito em um organismo tal como por exemplo, uma célula fungica, umacélula de levedura ou uma célula bacteriana. Qualquer de célulaseucarióticas ou procarióticas para uso em produção preferivelmente sequalifica para situação GRAS ("Generally Regarded As Safe") com o FederalDrug Administration of the United States of America.

Em outra modalidade, é fornecido uma célula microbiana,preferivelmente uma célula de levedura, para uso em produção de primeirometabólito, célula ainda produzindo um segundo metabólito, preferivelmenteglicerol, produção de segundo metabólito sendo substancialmente diminuídaquando comparado com a produção de segundo metabólito em uma célulacomparável tipo silvestre ou uma célula microbiana comparável isolada.

Consequentemente, produção de segundo metabólito édiminuída por pelo menos 2 por cento, tal como 4 por cento, por exemplo,pelo menos 6 por cento, tal como 8 por cento, por exemplo, pelo menos 10por cento, tal como 12 por cento, por exemplo, 14 por cento, tal como 16 porcento, por exemplo, 18 por cento, tal como pelo menos 20 por cento, porexemplo, 24 por cento, tal como pelo menos 30 por cento, por exemplo, 35por cento, tal como 40 por cento, por exemplo, 50 por cento, tal como 60 porcento, por exemplo, pelo menos 70 por cento, tal como 80 por cento, porexemplo, pelo menos 90 por cento, tal como diminuído por pelo menos 92por cento, por exemplo, 94 por cento, tal como 96 por cento, por exemplo, 98por cento, tal como diminuído por 99 por cento ou diminuído a uma talextensão que segundo metabólito é virtualmente improvável usando o estadodos ensaios da técnica para identificar e/ou quantificar segundo metabólito.

Quando a célula microbiana for uma célula procariótica talcomo por exemplo, uma célula bacteriana de ácido láctico para uso naprodução de um primeiro metabólito, primeiro metabólito é selecionado dogrupo consistindo de ácido láctico e um competente aroma tal como acetoína,acetaldeído, 2,3-butileno glicol ou diacetila.

Em uma modalidade, a célula microbiana ou a composição deacordo com a invenção é preferivelmente usada em uma produção de umprimeiro metabólito ou usada em um processo de gerar a reoxidação deNADH intracelular alternativa. Consequentemente, a célula microbiana estáfornecendo uma nova ou, em termos de eficiência e/ou taxa total de reação,uma via muito melhorada para a reoxidação de NADH alternativa para opropósito de fornecer, suplementar e/ou aumentar uma combinação de NADintracelular, provisão, suplementação e/ou aumento sendo usado em umprocesso de alterar, direcionar e/ou redirecionar o fluxo de metabólitosprimários e/ou secundários em célula.

Em outra modalidade é provido uma célula microbiana parauso em uma produção de um primeiro metabólito, célula abrigando umanova ou, em termos de eficiência e/ou taxa total de reação, uma via muitomelhorada para a redução alternativa de NAD para o propósito de prover,suplementar e/ou aumentar uma combinação de NADH intracelular,provisão, suplementação e/ou aumento sendo usada em um processo dealterar, direcionar e/ou redirecionar o fluxo de metabólitos primários e/ousecundários em célula.

Em mais outra modalidade da invenção, é provido uma célulamicrobiana para uso na produção de um primeiro metabólito, célulaabrigando uma nova ou, em termos de eficiência e/ou taxa total de reação,uma via muito melhorada para a reoxidação alternativa de NADPH para opropósito de prover, suplementar e/ou aumentar uma combinação de NADPintracelular, provisão, suplementação e/ou aumento sendo usada em umprocesso de alterar, direcionar e/ou redirecionar o fluxo de metabólitosprimários e/ou secundários em célula.

Em mais uma outra modalidade da invenção, é provido umacélula microbiana para uso na produção de um primeiro metabólito, célulaabrigando uma nova ou, em termos de eficiência e/ou taxa total de reação,uma via muito melhorada para a redução alternativa de NADP para opropósito de prover, suplementar e/ou aumentar uma combinação de NADPHintracelular, provisão, suplementação e/ou aumento sendo usada em umprocesso de alterar, direcionar e/ou redirecionar o fluxo de metabólitosprimários e/ou secundários em célula.

Em mais um outro aspecto da invenção é fornecido uma célulamicrobiana de acordo com a invenção para uso em uma preparação de umproduto bebível ou um comestível. É também fornecido uma célulamicrobiana para uso em uma produção de um primeiro metabólico para usoem um produto bebível ou um comestível, preferivelmente um produto tendoqualidades organolépticas desejáveis. Em uma modalidade, primeirometabólito tem e/ou fornece uma qualidade organoléptica desejável aproduto. Em uma modalidade particularmente preferida, primeiro metabólitoé o etanol.

A célula microbiana para uso em uma produção de umprimeiro metabólito de acordo com a invenção, em uma modalidade, aindaproduz um segundo metabólito, a produção de segundo metabólito sendosubstancialmente diminuído quando comparado com a produção de segundometabólito em uma célula comparável tipo silvestre ou uma célulamicrobiana comparável isolada, produção diminuída resultando em umaprovisão de uma qualidade organoléptica desejável a produto. Em uma outramodalidade produto é um alimento funcional.

Em ainda um outro aspecto da invenção é provido o uso deuma célula microbiana ou uma composição em uma produção de um primeirometabólito, processo sendo um metabólito primário ou um metabólitosecundário, um metabólito endogenoso em célula microbiana ou um produtogenético heterólogo a célula microbiana.

Em uma modalidade preferida é provido um uso de umacélula microbiana em que produção de primeiro metabólito ésubstancialmente aumentada quando comparado com a produção de primeirometabólito em uma célula comparável tipo silvestre ou uma célulamicrobiana comparável isolada, produção de primeiro metabólito éaumentada pelo menos por um fator de 1,01, tal como 1,02, por exemplo,1,03, tal como um fator de pelo menos 1,04, por exemplo, 1,05, tal como1,06, por exemplo, 1,07, tal como 1,08, por exemplo, 1,09, tal como 1,10, porexemplo, 1,11, tal como pelo menos 1,12, por exemplo, 1,14, tal como 1,16,por exemplo, 1,18, tal como 1,2, por exemplo, 1,25, tal como 1,3, porexemplo, 1,4, tal como 1,5, por exemplo, 1,6, tal como 1,7, por exemplo, 1,8,tal como 1,9, por exemplo, 2,0, tal como 2,25, por exemplo, 2,5, tal como 3,por exemplo, 3,5, tal como um fator de pelo menos 4, por exemplo, 4,5, talcomo 5, por exemplo, 6, tal como 7, por exemplo, 8, tal como 9, porexemplo, 10, tal como 15, por exemplo, 20, tal como 25, por exemplo, 30, talcomo 35, por exemplo, 40, tal como 50, por exemplo, 60, tal como 80, porexemplo, pelo menos 100, tal como 150, por exemplo, 200, tal como 250, porexemplo, 300, tal como 350, por exemplo, 400, tal como 500, por exemplo,600, tal como 800, por exemplo, pelo menos 1000, tal como 1500, porexemplo, 2000, tal como 2500, por exemplo, 3000, tal como 3500, porexemplo, 4000, tal como pelo menos 5000, por exemplo, 6000, tal como8000, por exemplo, pelo menos 10000, tal como 15000, por exemplo, 20000,tal como pelo menos 25000, por exemplo, 30000, tal como 35000, porexemplo, 40000, tal como um fator de pelo menos 50000.

É preferível que a célula microbiana seja uma célula delevedura ou uma célula microbiana procariótica e que primeiro metabólitoseja um álcool ou um ácido, preferivelmente etanol, ácido acético, ácidoláctico ou ácido propiônico.

Em um uso preferido é fornecido uma célula microbiana,preferivelmente uma célula de levedura, ainda produzindo um segundometabólito, produção de segundo metabólito sendo substancialmentediminuída quando comparada com a produção de segundo metabólito emuma célula comparável tipo silvestre ou uma célula microbiana comparávelisolada. Particularmente preferido é um uso em que segundo metabólito églicerol ou um componente de aroma indesejável naturalmente produzido poruma célula bacteriana de ácido láctico.

A produção de segundo metabólito, preferivelmente glicerolou um componente de aroma indesejável produzido por uma célulabacteriana de ácido láctico, é reduzida em um uso preferido de célulamicrobiana por pelo menos 2 por cento, tal como 4 por cento, por exemplo,pelo menos 6 por cento, tal como 8 por cento, por exemplo, pelo menos 10por cento; tal como 12 por cento, por exemplo, 14 por cento, tal como 16 porcento, por exemplo, 18 por cento, tal como pelo menos 20 por cento, porexemplo, 24 por cento, tal como pelo menos 30 por cento, por exemplo, 35por cento, tal como pelo menos 40 por cento, por exemplo, 50 por cento, talcomo 60 por cento, por exemplo, pelo menos 70 por cento, tal como 80 porcento, por exemplo, pelo menos 90 por cento, tal como diminuído por pelomenos 92 por cento, por exemplo, 94 por cento, tal como 96 por cento, porexemplo, 98 por cento, tal como diminuído por 99 por cento ou diminuído auma tal extensão que segundo metabólito é virtualmente improvável usandoo estado dos ensaios da técnica para identificar e/ou quantificar segundometabólito.

Um outro uso preferido de célula microbiana está napreparação de um produto bebível ou comestível em uma produção de umprimeiro metabólico para uso em produto bebível ou comestível, primeirometabólito tendo e/ou fornecendo uma qualidade organoléptica desejável aproduto. Preferivelmente o primeiro metabólito é o etanol ou, quando a célulamicrobiana for uma célula bacteriana de ácido láctico, um componente dearoma produzido por célula bacteriana de ácido láctico, preferivelmenteacetoína e/ou diacetiláctico.

Um uso muito preferido de célula microbiana em preparaçãode produto bebível ou comestível é aquele de uma célula microbiana deacordo com a invenção, preferivelmente uma célula de levedura ou umacélula bacteriana de ácido láctico, ainda produzindo um segundo metabólito,produção de segundo metabólito sendo substancialmente reduzido quandocomparado com a produção de segundo metabólito em uma célulacomparável tipo silvestre ou uma célula microbiana comparável isolada,produção diminuída resultando em uma provisão de uma qualidadeorganoléptica desejável a produto, diminuição é de pelo menos 2 por cento,tal como 4 por cento, por exemplo, pelo menos 6 por cento, tal como 8 porcento, por exemplo, pelo menos 10 por cento, tal como 12 por cento, porexemplo, 14 por cento, tal como 16 por cento, por exemplo, 18 por cento, talcomo pelo menos 20 por cento, por exemplo, 24 por cento, tal como pelomenos 30 por cento, por exemplo, 35 por cento, tal como pelo menos 40 porcento, por exemplo, 50 por cento, tal como 60 por cento, por exemplo, pelomenos 70 por cento, tal como 80 por cento, por exemplo, pelo menos 90 porcento, tal como diminuído por pelo menos 92 por cento, por exemplo, 94 porcento, tal como 96 por cento, por exemplo, 98 por cento, tal como diminuídopor 99 por cento ou diminuído a uma tal extensão que segundo metabólito évirtualmente improvável usando o estado dos ensaios da técnica paraidentificar e/ou quantificar segundo metabólito.

E também provido um uso de uma célula microbiana,preferivelmente uma célula de levedura ou uma célula bacteriana de ácidoláctico, em uma preparação de um alimento funcional.

Em mais um outro aspecto da invenção é provido um processode produção de um primeiro metabólito, processo compreendendo as etapasde

i) cultivo de uma célula microbiana em um meio dedesenvolvimento adequado e sob tais condições que célula microbiana estáproduzindo primeiro metabólito,e opcionalmente

ii) isolamento de primeiro metabólito em uma formaadequada,

e ainda opcionalmente

iii) purificação de primeiro metabólito isolado.

O processo compreende o cultivo de qualquer célulamicrobiana incluindo uma eucariota microbiana e uma procariota microbiana.

Entre as eucariotas microbianas, as células de levedura e células fungicas sãopreferidas, tais como as células de levedura semelhantes a, por exemplo,Saccharomyces eerevisiae, Shizosaeeharomyees pombe, Piehia pastoris eoutros, bem como algas tais como por exemplo, Chlamydomonas reinhardi,mofo do limo tais como por exemplo, Dictyostelium diseoideum e fungosfilamentosos. Os fungos filamentosos preferidos de acordo com o processosão espécies de Neurospora e Aspergillus tais como por exemplo,Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergilluscrytae e Penicillium ehrysogenum. Particularmente preferidos são muitascélulas de levedura industrialmente relevantes, mofo do limo e fungosfilamentosos fornecendo uma fonte de produção de produtos tais como, porexemplo, antibióticos, esteróides, pigmentos, enzimas, álcoois orgânicos eácidos, aminoácidos, polissacarídeos e outros.

O processo também pertence ao cultivo de procariotasmicrobianas tais como as espécies Gram-positivas tais como por exemplo,Bacillus subtilis, Bacillus thuringenis, Bacillus Ucheniformis, Bacillus lentuse Baeilus stearothermophilus e espécies Gram-negativas tais comoEscherichia coli. Particularmente preferidos são também as espéciesbacterianas de ácido láctico tais como por exemplo, Lactococcus laetis,Lactoeoceus laetis subsp. laetis, Laetococeus laetis subsp. eremoris,Lactoeoceus laetis subsp. diacetilaetis, espécie Leueonostoe, espécieLactobacillus, espécie Pediococcus e espécies similares industrialmenterelevantes semelhantes a por exemplo, Bifidobaeterium.

Modalidades deste aspecto da invenção compreendem umprocesso em que primeiro metabólito é um metabólito primário ou ummetabólito secundário. O metabólito pode ser produzido em uma célula capazde ainda produzir, por exemplo, um produto endogenoso ou um heterólogoselecionado do grupo consistindo de uma protease, uma amilase, umacelulase, uma β-glucanase, uma endoglucanase, uma fosfatase, uma xilánase,uma lipase, uma β-lactamase, uma β-galactosidase, uma β-glucoronidase, euma xilosidase. Quando a célula microbiana for uma bactéria de ácidoláctico, metabólito é preferivelmente diacetila, acetoína ou ácido láctico.

O processo de acordo com a invenção pertence em umamodalidade a uma produção aumentada de primeiro metabólito, tal comouma produção substancialmente aumentada, quando comparada à produçãode primeiro metabólito em uma célula comparável tipo silvestre ou umacélula microbiana comparável isolada. Consequentemente, é fornecido umprocesso pelo qual produção de primeiro metabólito é aumentado pelomenos por um fator de 1,01, tal como 1,02, por exemplo, 1,03, tal como umfator de pelo menos 1,04, por exemplo, 1,05, tal como 1,06, por exemplo,1,07, tal como 1,08, por exemplo, 1,09, tal como 1,10, por exemplo, 1,11, talcomo pelo menos 1,12, por exemplo, 1,14, tal como 1,16, por exemplo, 1,18,tal como 1,2, por exemplo, 1,25, tal como 1,3, por exemplo, 1,4, tal como1,5, por exemplo, 1,6, tal como 1,7, por exemplo, 1,8, tal como 1,9, porexemplo, 2,0, tal como 2,25, por exemplo, 2,5, tal como 3, por exemplo, 3,5,tal como um fator de pelo menos 4, por exemplo, 4,5, tal como 5, porexemplo, 6, tal como 7, por exemplo, 8, tal como 9, por exemplo, 10, talcomo 15, por exemplo, 20, tal como 25, por exemplo, 30, tal como 35, porexemplo, 40, tal como 50, por exemplo, 60, tal como 80, por exemplo, pelomenos 100, tal como 150, por exemplo, 200, tal como 250, por exemplo, 300,tal como 350, por exemplo, 400, tal como 500, por exemplo, 600, tal como800, por exemplo, pelo menos 1000, tal como 1500, por exemplo, 2000, talcomo 2500, por exemplo, 3000, tal como 3500, por exemplo, 4000, tal comopelo menos 5000, por exemplo, 6000, tal como 8000, por exemplo, pelomenos 10000, tal como 15000, por exemplo, 20000, tal como pelo menos25000, por exemplo, 30000, tal como 35000, por exemplo, 40000, tal comoum fator de pelo menos 50000.

Quando sendo isolado ou quando sendo isolado e purificado,metabólito é isolado ou isolado e purificado de acordo com qualquer estadodisponível das técnicas do ofício para isolar ou isolar e purificar ummetabólito.

Em uma modalidade preferida da invenção, o processopertence à produção em uma célula de levedura ou em uma célula bacterianade ácido láctico de um primeiro metabólito tal como um metabólito primárioou secundário, preferivelmente um metabólito primário e maispreferivelmente um álcool ou um ácido, tal como por exemplo, etanol,glicerol, ácido acético e ácido propiônico, com o etanol sendoparticularmente preferido. Em uma modalidade muito preferida, a célulamicrobiana de acordo com o processo é uma célula de levedura e o primeirometabólito é etanol. Quando primeiro metabólito for um metabólitosecundário, metabólito secundário é preferivelmente selecionado do grupode metabólitos secundários consistindo de uma P-lactama, uma policetida,um terpeno, um esteróide, uma quinona, uma cumarina, um flavonóide, umalcalóide, uma piperidina, uma piridina, e outros.

Em uma outra modalidade do processo de acordo com ainvenção, é fornecido uma célula microbiana, preferivelmente uma célula delevedura ou uma célula bacteriana de ácido láctico, célula ainda produz umsegundo metabólito, a produção de segundo metabólito sendosubstancialmente diminuída quando comparada com a produção de segundometabólito em uma célula comparável tipo silvestre ou uma célulamicrobiana comparável isolada. Em uma modalidade, diminuição deprodução de segundo metabólito é pelo menos 2 por cento, tal como 4 porcento, por exemplo, pelo menos 6 por cento, tal como 8 por cento, porexemplo, pelo menos 10 por cento, tal como 12 por cento, por exemplo, 14por cento, tal como 16 por cento, por exemplo, 18 por cento, tal como pelomenos 20 por cento, por exemplo, 24 por cento, tal como pelo menos 30 porcento, por exemplo, 35 por cento, tal como 40 por cento, por exemplo, 50 porcento, tal como 60 por cento, por exemplo, pelo menos 70 por cento, talcomo 80 por cento, por exemplo, pelo menos 90 por cento, tal comodiminuído por pelo menos 92 por cento, por exemplo, 94 por cento, tal como96 por cento, por exemplo, 98 por cento, tal como diminuído por 99 porcento ou diminuído a uma tal extensão que segundo metabólito évirtualmente improvável usando o estado dos ensaios da técnica paraidentificar e/ou quantificar segundo metabólito.

Em uma modalidade preferida o segundo metabólito é glicerolquando célula for uma célula de levedura tendo uma produçãosubstancialmente aumentada de um primeiro metabólito, preferivelmenteetanol. Em uma outra modalidade preferida, quando a célula for uma célulabacteriana de ácido láctico, o segundo metabólito é um componente de aromaindesejável naturalmente produzido por uma célula bacteriana de ácidoláctico.

Em uma modalidade do processo de acordo com a invenção, acélula microbiana é uma célula bacteriana de ácido láctico e primeirometabólito é selecionado do grupo consistindo de ácido láctico e umcomponente de aroma desejável tal como, acetoína e diacetila. Em uma outramodalidade, a célula microbiana é uma célula bacteriana Gram-positiva,preferivelmente uma célula capaz de produzir uma enzima tal como, porexemplo, uma protease, uma amilase, uma celulase, uma p-glucanase, umaendoglucanase, uma fosfatase, uma xilanase, uma lipase, uma J3-lactamase,uma P-galactosidase ou uma xilosidase.

É também provido um processo para gerar uma reoxidaçãoalternativa de uma coenzima reduzida, processo, em uma modalidade,consistindo essencialmente de prover em uma célula microbiana uma novaou, em termos de eficiência e/ou taxa total de reação, uma via muitomelhorada para a reoxidação de NADH e/ou NADPH alternativa para uso naprovisão, suplementação e/ou aumento de uma combinação de NAD e/ouNADP intracelular, provisão, suplementação e/ou aumento sendo usada emum processo de alteração, direção e/ou redireção do fluxo de metabóütosprimários e/ou secundários em célula.

Também, é fornecido um processo para gerar uma reduçãoalternativa de uma coenzima oxidada, processo consistindo essencialmentede prover em uma célula microbiana uma nova ou, em termos de eficiênciae/ou taxa total de reação, uma via muito melhorada para a redução de NADe/ou NADP alternativa para o propósito de provisão, suplementação e/ouaumento de uma combinação de NADH e/ou NADPH intracelular, provisão,suplementação e/ou aumento sendo usada em um processo de alteração,direção e/ou redireção do fluxo de metabólitos primários e/ou secundários emcélula.

Em mais um outro aspecto da invenção, é fornecido umprocesso de construção de uma célula microbiana de acordo com a invenção,processo compreendendo as etapas de

iii) eliminar terceira atividade de enzima exprimível decélula microbiana, ou opcionalmente de forma operável ligar uma seqüênciade nucleotídeo codificando terceira atividade de enzima exprimível com umsinal de expressão não naturalmente associada com seqüência denucleotídeo, sinal de expressão gerando uma expressão reduzida deseqüência de nucleotídeo , e

iv) introduzir seqüências de nucleotídeo operavelmenteligadas obtidas sob i) e iii), e opcionalmente a seqüência de nucleotídeoobtida sob ii), em célula microbiana, ou

O sinal de expressão pode dirigir uma expressãosubstancialmente constitutiva, uma expressão constitutiva durante odesenvolvimento de célula em uma fase particular de crescimento, umaexpressão que se pode induzir em resposta à presença e/ou nível de umindutor ou a ausência e/ou nível de um repressor. O sinal de expressão épreferivelmente um sinal de expressão regulável tal como um sinal deiniciação da transcrição regulável e/ou sinal de iniciação translacionalregulável, tal como um sinal de expressão regulável em resposta a umaalteração em um valor, nível e/ou concentração de um fator tal como umparâmetro de crescimento fisiológico, preferivelmente um parâmetroselecionado do grupo consistindo de pH, temperatura, conteúdo de salincluindo osmolaridade, anaerobicidade, nível de oxigênio incluindoaerobicidade, nível de energia incluindo um potencial de membrana e umaforça motora de próton.

O sinal de expressão é preferivelmente um promotor sendoregulado na fase de crescimento, que se pode induzir e/ou reprimivel e/ou,em um organismo hospedeiro natural, direcionando a expressão de um genecodificando um produto genético envolvido na mediação de uma reação deuma via biossintética e/ou uma via matabólica principal, preferivelmente umavial selecionada do grupo de vias consistindo de glicólise, gluconeogênese,ciclo de ácido cítrico, e via de pentose fosfato.

O sinal de expressão pode ser ainda regulado por umaseqüência de ativação a montante (UAS), por um elemento intensificador oupor um elemento silenciador. A pessoa habilitada na técnica estará ciente dastécnicas de biologia molecular geral para uso na construção in vitro de umamolécula de DNA recombinante. Tais técnicas são descritas por exemplo, emSambrook et al (1989) e em Old e Primrose (ibid.). Tal artífice habilitadoainda estará ciente da literatura acadêmica incluindo livros didáticos geraisem biologia molecular e engenharia genética e será capaz de combinar váriossinais de expressão tais como regiões promotoras putativas ou reconhecidascom uma faixa de seqüências regulatórias de nucleotídeo conhecidas porexercer um efeito no nível de expressão do gene. A pessoa habilitada é capazde monitorar a expressão do gene mediante a construção de fusõestranscricionais e/ou translacionais adequadas de um sinal de expressão emum gene repórter geralmente disponível na técnica. Um sinal de expressãopode ser um sinal de expressão clonado ou um sinal de expressão sintetizadoin vitro. Os sinais de expressão nas células microbianas procarióticas sãoconhecidas por compreender as assim chamadas regiões 35 e 10 e exemplosnumerosos de tais regiões são disponíveis a partir de várias bases de dados.

Os sinais de expressão podem ser otimizados mediante oaumento da resistência do promotor, mediante o ajuste das seqüências deiniciação translacional, mediante a otimização da escolha dos códons por usaro assim chamado códons altamente expressos, mediante o ajuste da estruturasecundária do mRNA, mediante o aumento da eficiência da terminaçãotranscricional, mediante o aumento ou a diminuição de um número de cópiasde um vetor, ou mediante o aumento ou diminuição da estabilidade de vetor.

A célula microbiana é preferivelmente uma célula fungica,uma célula de levedura ou uma célula bacteriana. Saccharomyces eerevisiae,Shizosaceharomyees pombe e Piehia pastoris são células de levedurapreferidas e uma entre as células bacterianas são bactérias de ácido lácticopreferidas, particularmente espécies bacterianas de ácido láctico tais comopor exemplo, Lactoeoecus laetis, Lactoeoceus laetis subsp. laetis,Laetocoecus laetis subsp. eremoris, Lactoeoceus laetis subsp. diacetilactis,espécie Leuconostoc, espécie Lactobacillus, espécie Pediococcus e espéciessimilares industrialmente relevantes semelhantes a por exemplo,Bifidobacterium.

Também preferidas são as algas tais como por exemplo,Chlamydomonas reinhardi, mofo do limo tais como por exemplo,Dictyostelium discoideum e fungos filamentosos tais como Neurospora eAspergillus tais como por exemplo, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger, Aspergillus crytae e Penicillium chrysogenum.Particularmente preferidos são também muitas células de leveduraindustrialmente relevantes, mofo do limo e fungos filamentosos fornecendouma fonte de produção de produtos tais como, por exemplo, antibióticos,esteróides, pigmentos, enzimas, álcoois orgânicos e ácidos, aminoácidos,polissacarídeos e outros.

Entre as procariotas microbianas preferidas são as célulasbacterianas tais como as espécies Gram-positivas tais como por exemplo,Bacillus subtilis, Bacillus thuringenis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentuse Bacilus stearothermophilus, bem como as espécies Gram-negativas taiscomo Escherichia coli. Particularmente preferidos são também as espéciesbacterianas de ácido láctico tais como por exemplo, Lactococcus laetis,Laetocoeeus laetis subsp. laetis, Laetococeus laetis subsp. eremoris,Lactoeoceus laetis subsp. diaeetilaetis, espécie Leueonostoe, espécieLactobacillus, espécie Pedioeoeeus e espécies similares industrialmenterelevantes semelhantes a por exemplo, Bifidobaeterium.

Em uma modalidade do processo, a célula microbiana é umacélula de levedura e a primeira atividade da enzima exprimível é a atividadede sintase de glutamato, preferivelmente uma atividade de sintase deglutamato codificada por GLTl de Saccharomyees eerevisiae TNl7 comodepositada sob DMS Accession Number 12275, ou uma atividadefuncionalmente equivalente. A segunda atividade de enzima exprimível éuma atividade de sintetase de glutamina, preferivelmente uma atividade desintetase de glutamina codificada por GLTl de Saccharomyees eerevisiaeTN15 como depositado sob DSM Accession Number 12274, ou umaatividade funcionalmente equivalente. A terceira atividade da enzimaexprimível, quando presente em célula, é uma atividade de desidrogenase deglutamato e preferivelmente uma atividade codificada por GDHl deSaccharimyees eerevisae. É também fornecido um processo em que célula éSaeeharimyees eerevisae TN19 como depositado sob DSM AccessionNumber 12276. O processo pode compreender uma outra etapa decongelamento ou secagem por congelamento da célula microbiana napreparação de um liofilizato reconstituível.

Em uma modalidade atualmente preferida, a célula microbianaé uma bactéria de ácido láctico como aqui exemplificado, e quarta atividadeda enzima exprimível é, pelo menos em seu organismo hospedeiro nativo,uma transidrogenase citoplásmica, expressão de transidrogenasecitoplásmica resultando em uma formação de produto alterado e/ou novoe/ou produção metabólita de bactérias de ácido láctico.Um exemplo de produto novo e/ou formação metabólita édada mais abaixo. As bactérias de ácido láctico metabolisa o piruvato atravésde várias vias diferentes. O metabólito é convertido em lactato peladesidrogenase de lactato, em acetil-CoA e CO2 por desidrogenase depiruvato, em formiato por liase de formiato piruvato e em acetolactato e CO2por descarboxilase de acetolactato. A distribuição do fluxo de carbonoatravés destas vias é dependente das condições de desenvolvimento externo.

Este controle é exercido através das mudanças na relação de NADH/NAD+intracelular (C. Garrigues, P. Looubiere, N. D. Lindley e M. Cocaign-bousquet (1997). J. Bacteriology 179, 5282-5287; F. Lopez de Felipe, M.Kleerebezem, W. M. de Vos e J. Hugenholtz (1998). J. Baeteriology 180,3804-3808). Isto é ilustrado pelas observações a partir de estudos fisiológicosde bactérias de ácido láctico que estão listadas abaixo.

As bactérias de ácido láctico com uma formação aumentadado metabólito de diacetila secundário são pertinentes para várias aplicaçõesindustriais. Foi mostrado que a expressão excessiva de oxidase de NADH deStreptoeoeeus mutans em L. Iaetis resulta em um mudança de homoláctico(produção de ácido láctico) para a fermentação ácida misturada (produção deácido láctico, ácido acético, acetoína e diacetila) sob condições dedesenvolvimento aeróbico. Este efeito é atribuído a uma diminuição narelação NADH/NAD+ intracelular da cepa recombinante (F. Lopez de Felipe,M. Kleerebezem, W. M. de Vos e J. Hugenholtz (1998). J. Baeteriology 180,3804-3808). A expressão da transidrogenase citoplásmica em bactérias deácido láctico é esperada ter um efeito similar na relação NADH/NAD+ se areação ocorre na direção de NADH para NADPH.

Foi mostrado que a formação do produto por L. Iaetis mudaquando a fonte de carbono for mudada da glicose para lactose e que esteefeito é devido a um fluxo mais baixo através da glicólise, resultando em umarelação NADH/NAD+ inferior (C. Garrigues, P. Loubiere, N. D. Lindley e M.Cogaign-bousquet (1997). J. Bacteriology 179, 5282-5287). Assim, sobcondições de crescimento anaeróbico na glicose a maioria (93%) da fonte decarbono foi convertida em lactato, enquanto apenas 4% da fonte de carbonofoi convertida em lactato quando a lactose foi usada como fonte de carbono.

A parte remanescente foi convertida em formiato, acetato e etanol. Os autoresafirmam que a formação de lactato é reduzida devido a uma relaçãoNADH/NAD+ 3 vezes mais baixa durante o desenvolvimento na lactosequando comparada com a glicose, resultando na desativação dadesidrogenase de lactato. Em vez disso, o fluxo de carbono em direção aonodo piruvato é redirecionado voltado para a formação de acetato, etanol eformiato de modo a sintetisar o ATP e reoxidar o NADH. A expressão datransidrogenase citoplásmica em bactérias de ácido láctico é esperada ter umefeito similar na relação de NADH/NAD+ se a reação ocorre na direção deNADH para NADPH. Assim, é esperado que o cultivo de uma ceparecombinante contendo transidrogenase de bactérias de ácido láctico sobcondições de crescimento anaeróbico resultará na produção de vários novossubprodutos além do lactato.

Uma vez que a desidrogenase de lactato seja ativada por umarelação NADH/NAD+ é esperado que o fluxo em direção ao lactato possa seraumentado pela expressão da transidrogenase em bactérias de ácido lácticosob condições onde a reação de transidrogenase ocorra na direção de NADPHpara NADH.

A invenção será ainda exemplificada nos exemplos fornecidosabaixo dirigido para as modalidades preferidas da invenção. Será entendidoque a invenção não é de nenhuma maneira limitada a exemplos. Osexemplos incluem as figuras ilustrando a invenção e as legendas de figurassão listadas abaixo.

LEGENDAS DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a integração do plasmídeo pCHAl-GDH2na localização GDH2.

A Figura 2 mostra a integração do plasmídeo pPGK-GDH2 nalocalização GDH2.

A Figura 3 mostra as atividades específicas da enzima dasdesidrogenases de glutamato dependente de NADPH e dependente de NADHnos extratos de proteína das amostras de biomassa retiradas dos cultivoscontínuos de cepas TNl5 TN9 e TN12 com o aumento das quantidades deserina na alimentação. Linha pontilhada, atividade Gdhlp em TN1. Linhanormal, atividade Gdh2p em TNl. Linha normal, atividade Gdh2p emTN9. Linha normal, A atividade Gdh2p em TN12.

A Figura 4 mostra as taxas específicas de captação de amônioe serina nos cultivos contínuos de cepas TN1, TN9 e TN12 com o aumentodas quantidades de serina na alimentação. Linhas pontilhadas: captação deamônio. Linhas normais: captação de serina. ®: TNl, TN9, Á : TN12.

A Figura 5 mostra as taxas específicas de produção medidasde glicerol (linhas normais) e as taxas específicas de produção calculadas deglicerol (linhas pontilhadas) nos cultivos contínuos de cepas TNl5 TN9 eTN12 com o aumento das quantidades de serina na alimentação. •: TN1, ®:TN9, A : TNl2.

A Figura 6 mostra as taxas específicas de captação de glicose(linhas pontilhadas) e as taxas específicas de produção de etanol (linhasnormais) nos cultivos contínuos de cepas TN1, TN9 e TN12 com o aumentodas quantidades de serina na alimentação. •: TNl, TN9, A : TN12.

A Figura 7 apresenta o consumo de glicose (B), e a produçãode etanol (•), glicerol (A), acetato (0) e dióxido de carbono (X) versus otempo em um dos cultivos de batelada limitada a glicose anaeróbicos de cepaTNl com amônio como fonte de nitrogênio.

A Figura 8 apresenta o consumo de glicose (B), e a produçãode etanol (•), glicerol (A)5 acetato (0) e dióxido de carbono (O) versus otempo em um dos cultivos de batelada limitada a glicose anaeróbicos de cepaTNl com serina como fonte de nitrogênio.

A Figura 9 mostra os plasmídeos pPGK-GLNl e pPGK-GLTlconstruídos neste estudo e usados para integrar o promotor constitutivo fortede PGK no cromossoma à frente de GLNl e GLTl, respectivamente.

A Figura 10 apresenta o logarítimo natural das concentraçõesde biomassa de cepas TNl (O), TN9 (A), TN17 (■) e TN19 (u) versus otempo durante o crescimento exponencial nos cultivos anaeróbicos debatelada limitada por glicose. As equações mostram os declives e interseçõescom o segundo eixo das linhas de tendência através dos valores medidos. Osdeclives são iguais às taxas específicas de crescimento máximo das cepas.

A Figura 11 mostra o consumo de glicose (s) e a produção deetanol (J|), glicerol (u) e dióxido de carbono (X) em um dos cultivosanaeróbicos da batelada da cepa TN1.

A Figura 12 mostra o consumo de glicose (s) e a produção deetanol (J)5 glicerol (u) e dióxido de carbono (X) em um dos cultivosanaeróbicos da batelada da cepa TN9.

A Figura 13 mostra o consumo de glicose (s) e a produção deetanol (§|), glicerol (u) e dióxido de carbono (X) em um dos cultivosanaeróbicos da batelada da cepa TNl 9.

EXEMPLO 1

Expressão das atividades de desidrogenase de glutamato dependente de nadhe dependente de nadph na levedura.

Introdução

Este exemplo compreende um estudo de cepas deSaccharomyces cerevisiae com uma anulação em GDHl e um constitutivoconcomitante ou expressão excessiva indutível de GDH2. O efeito nas taxasde crescimento, atividades de enzima e formação de produto são notificadas.

Os cultivos de batelada e contínuos das novas cepas geneticamenteplanejadas foram realizadas em biorreatores de auto desempenho.

MATERIAIS E PROCESSOS

Microorganismos e sua manutenção. Todas as cepasSaccharomyces cerevisiae foram geradas a partir de Saceharomycescerevisiae T23D. A cepa foi gentilmente fornecida por Jack Pronk doDepartament of Microbiology and Enzymology, Kluyver Laboratory ofBiotechnology, Delft University of Technology, Países Baixos. As cepas delevedura foram mantidas em 4°C em placas de agar YPG, mensalmentepreparadas de um estoque liofilizado conservado em -80°C. Eseheriehia eoliDH5a (F FSOdlacZ DM15 D(laeZYA- argF) U169 deoR reeAl endAlhsdRl 7(rk" mk+) supE44\ thi-1 gyra96 relAl) (GIBCO BRL5 Gaithersburg5MD USA) foi usada para subclonagem.

Preparação de DNA. O DNA plasmídeo de E. eoli foipreparado com colunas Qiagen (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Alemanha)seguindo as instruções do fabricante. Para a purificação dos fragmentos deDNA usados para as experiências de clonagem, os fragmentos desejadosforam separados em géis de agarose a 0,8%, extirpado e recuperado daagarose usando o Kit de isolamento de DNA Qiagen (Qiagen GmbH,Düsseldorf, Alemanha). O DNA cromossômico da Saccharomyees cerevisiaefoi extraído como se segue. As células foram desenvolvidas em meio emfrascos de agitação e colhidas em OD = 1,5. 10 mg de células úmidas foramnovamente colocadas em suspensão em 0,5 ml de Tris-Cl (pH 8,0) eextinguidas com 0,5 ml de contas de vidro (tamanho de 250 a 500 mícrons)na presença de 0,5 ml de Tris-fenol saturado (pH 8,0). O DNA foi extraído dafase fenol com clorofórmio, precipitado com 98% de etanol e colocadonovamente em suspensão em tampão TE. O RNA no extrato foi removido portratamento com RNAaseA (adquirido da Promega) e finalmente o DNA foipurificado por precipitação com etanol/cloreto de lítio e novamente colocadoem suspensão em tampão TE. Os iniciadores de DNA foram adquiridos daDNA Technology (Aarhus, Dinamarca).

Anulação de GDHl. O plasmídeo pGDHldel foi gentilmentedoado pelo professor F. K. Zimmermann (Boles et al., 1993). Em pGDHldelum fragmento de 1,0 kb de GDHl foi substituído por um fragmento 1,1 kbcontendo a estrutura de leitura aberta de URA 3. A construção foi linearizadacom Clal/PvuII antes da transformação. A anulação correta de GDHl foiverificada pela análise PCR e pelas medições da atividade GDHl nos extratosde proteína de transformantes. Nenhuma atividade de desidrogenase deglutamato dependente de NADPH pode ser detectada nos transformantescorretos.

Expressão excessiva de GDH2. O promotor CHAl foiclonado por PCR usando polimerase pfu (New England Biolabs) e osiniciadores CHAlstart (5*-ATT CAT CGA TGA ATT CTA TCT TAT GGTCCC ATT CTT TAC TGC ACT GTT TAC A-3'), SEQ ID NO:3, consistindode sítios de enzima de restrição para ClaI e EcoRI em frente de nucleotídeosde -364 a --329 a montante de CHAl e CHAlstop (5'-GGC CAC TAG TGATAT CAA AGC ATT CTC TCG CTG GTT AAT TTT CCT GTC TCT TGTCTA TCA GCA CTT AAA AA-3'), SEQ ID NO:4, consistindo de sítios deenzima de restrição para SpeI, EcoRV e BsmI em frente de nucleotídeos de -1a -45 a montante de CHA1). O fragmento de DNA resultante foi isolado apósa eletroforese do gel em um gel de agarose a 0,8% e subclonado no sítioSmaI no vetor pUC19, resultando no plasmídeo pCHAl. O promotor CHAlfoi isolado por pCHAl pela digestão com BsmI e HineII (localizado no sítiode múltiplas clonagens de pUC19). O plasmídeo YEpMSP3, contendo aestrutura de leitura aberta de GDH2 (Boles et al., 1993), foi gentilmentedoado pelo professor F. K. Zimmermann. O plasmídeo foi digerido com MscIe BsmI e ligado com o fragmento HincII/Bsml CHAlp, resultando em umplasmídeo com inserção do promotor CHAl à frente do códon de partidaGDH2. Esta construção foi digerida com BamHI e um fragmento, consistindodo promotor CHAl e 2,27 kb da estrutura de leitura aberta de GDH2, foiisolado. O plasmideo pFA6A-kanMX3 contém o gene de resistênciageniticina, G418r, flanqueado por duas repetições diretas e dois sítios demúltiplas clonagens (Wach et al., 1994). Um fragmento de DNAEcoRI/MscIm consistindo de nucleotídeos -500 a -136 a montante de GDH2,foi isolado a partir de YEpMSp3 e inserido em pFA6A-kanMX3, digerido coEcoRI e EcoRV. A construção resultante foi linearizada por digestão comBamHI e ligada com o fragmento CHAlp-GDH2 2,64 kb, resultando noplasmideo pCHAlGDH2 (Figura 1). O pCHAlGDH2 foi linearizado comSpel/Aatll antes da transformação. Foi verificado por PCR que o promotorCHAl foi inserido em frente da estrutura de leitura aberta de GDH2 nocromossoma IV de transformantes corretos. Para este propósito, osiniciadores CHAlstart e GDH2verif (5'-GGT TTT CTA CAA TCT CCAAAA GAG-3'), SEQ ID NO:5, atravessaram a região de nucleotídeos de1294 a 1271 da estrutura de leitura aberta GDH2.

Os iniciadores Gdh2start (5'-GCG CGA GAT CTT CTAGAA TGC TTT TTG ATA ACA AAA AT-3'), SEQ ID NO:6, contendosítios de enzima de restrição para BglII e XbaI em frente de nucleotídeos de 1a 21 de GDH2, e Gdh2stop (5'-CGC GCA GAT CTC CGC GGA GAG CCTAAA CGA TTA ACA AA-3'), SEQ ID NO:7, contendo sítios de enzima derestrição para BglII e SacII em frente de nucleotídeos de 1221 a 1201 deGDH2, foram usados para clonar partes do gene estrutural de GDH2 por PCRcom polimerase pfu (New England Biolabs). Um fragmento de DNA dotamanho correto foi isolado de um gel de agarose a 0,8% após a eletroforese edigerido com BglII durante a noite. O fragmento foi ligado no sítio dedigestão BgiII único de plasmideo Yep24-pPGK atrás do promotor PGK eem frente do terminador PGK (Walfridsson et al., 1997), resultando noplasmideo Yep24-pPGK-GDH2. Um fragmento de DNA Smal/SacII 2,65 kb,consistindo do promotor PGK e a parte clonada de GDH2 foi isolada doYep24-pPGK-GLTl. O fragmento foi ligado no plasmídeo pFA6A-kanMX3(Wach et al., 1994), digerido com EcoRV e SacII5 resultando no plasmídeopPGK-GDH2 (Figura 2). O plasmídeo foi linearizado pela digestão comTthIIIl antes da transformação. A inserção correta do plasmídeo nalocalização GDH2 no cromossoma IV foi verificada por análise PCR doDNA cromossômico extraído de transformantes com resistência voltada parageniticina. Para este propósito os iniciadores PGKverif (5'-GTC ACA CAACAA GGT CCT A-3'), SEQ ID N0:8, atravessando a região de nucleotídeosde -420 a -400 a montante do códon de partida PGK, e Gdh2verif (descritoacima) foram usados.

Transformação de e. coli e s. cerevisiae. E. coli DH5a foitransformada por eletrotransformação usando o equipamento deeletroporação Bio-Rad (Biorad Laboratories, Richmond, USA). Ostransformantes foram selecionados em placas de caldo L contendo 100 mg/mlde ampicilina. Células de S. cerevisiae foram feitas capazes para a captaçãode plasmídeo por tratamento com acetato de lítio e polietilenoglicol (Schiestl& Gietz, 1989). 5 |ig de DNA foram usados para cada transformação. Ostransformantes foram chapeados diretamente no meio seletivo exceto para ostransformantes resistentes G418. Estes foram colocados em suspensão emYPD por 24 horas antes de incrustar no meio seletivo de modo a obter aexpressão do gene de resistência G418. A integração correta dos fragmentosde pHOdel e pSUC2 no cromossoma foi verificado por análise de PCRusando o DNA extraído dos transformantes.

Meio nos cultivos por batelada contínuo. As cepas de S.cerevisiae foram cultivadas em um meio mineral preparado de acordo comVerduyn et al. (1990). As vitaminas foram adicionadas por filtração estérilseguindo a esterilização quente do meio. As concentrações de glicose e(NH4)2SO4 inicialmente nos cultivos de batelada foram 25 g por 1 e 3,75 gpor 1, respectivamente. A concentração de glicose na alimentação doscultivos contínuos foi de 25 g por 1 enquanto a concentração de (NIM)2SO4foi variada de 3,75 g por 1 a O g por 1. A concentração de serina naalimentação foi variada de O g por 1 a 3,16 g por 1 de modo que a soma doamônio e concentrações de serina foi de 60 mM em todas as culturas.

O desenvolvimento da S. cerevisiae sob condiçõesanaeróbicas requer a adição suplementar do meio de ergosterol e ácidosgraxos insaturados, tipicamente na forma de Tween 80 (Andreasen & Stier,1953; Libudzisz et al., 1986). Ergosterol e Tween 80 foram dissolvidos em96% (v/v) de etanol e a solução foi autoclavada em 1210C por 5 min. Asconcentrações finais de ergosterol e Tween 80 no meio foram 4,2 mg por gDW e 175 mg por g DW5 respectivamente. Para impedir a espumação, 75 \úpor 1 de antiespuma (Sigma A-5551) foi adicionado ao meio. O reservatóriodo meio para o cultivo contínuo foi extensivamente pulverizado com N2contendo menos do que 5 ppm de O2 após a preparação e foi então selado.

Para evitar a formação de um vácuo quando se retira o meio do reservatório,foi conectado a um saco de gás impermeável enchido com N2 contendomenos do que 5 ppm de O2.

Levantamento experimental para os cultivos por bateladae contínuo. Cultivos por batelada e contínuo anaeróbicos foram realizadosem 3O0C e uma velocidade de agitação de 800 rpm em biorreatores fabricadosem casa. O volume de trabalho dos reatores de batelada e dos reatores decultivo contínuo foram de 4,5 litros e 1,0 litro, respectivamente. O pH foimantido constante em 5,00 por adição de 2 M KOH. Os biorreatores foramequipados com condensadores sem gás esfriados a 2°C. Os biorreatores foramcontinuamente pulverizados com N2 contendo menos do que 5 ppm de O2,obtidos pela passagem de N2 de uma qualidade técnica (AGA 3,8), contendomenos do que 100 ppm O2, através de uma coluna (250 x 30 mm) enchidacom camadas de cobre e aquecida a 400°C. A coluna foi regeneradadiariamente por pulverização com H2 (AGA 3,6). Um controlador de fluxo demassa (Bronkhorst Hitec F201C) foi usado para sustentar o fluxo de gás nosbiorreatores constante em 0,50 litro de nitrogênio por min. por litro deNorprene tubing (Cole-Parmer Instruments) foi usado por toda parte de modoa minimizar a difusão de oxigênio nos biorreatores. Os biorreatores foraminoculados em uma concentração inicial de biomassa de 1 mg por litro com odesenvolvimento de pré-culturas em frascos de agitação não obstruídos em30°C e 100 rpm por 24 horas. Os cultivos de batelada anaeróbicos de cepasTNl5 TN9, TN12 e TN22 foram cada uma realizada três vezes comresultados idênticos. O estado constante nos cultivos contínuos foi obtidoapós o crescimento por tempos de permanência de IOa 11. Isto foi verificadopor medir uma formação constante de CO2 e componentes do meio, porexemplo, etanol, glicerol e acetato, pela levedura através dos tempos depermanência de 2 a 3.

Determinação do peso seco. O peso seco foi determinadogravimetricamente usando filtros de nitrocelulose (tamanho de poro de 0,45 (im; Gelman Sciences). Os filtros foram pré-secados em um forno demicroondas (Moulinex FM B 935Q) por 10 min. Um volume conhecido delíquido de cultura foi filtrado e o filtro foi lavado com um volume igual deágua desmineralizada seguido por secagem em um forno de microondas por15 minutos. O desvio padrão relativo (RSD) das determinações foi menos doque 1,5% com base nas determinações triplas (n = 3).

Análise de compostos do meio. As amostras livres de célulasforam retiradas diretamente do biorreator através de um tubo capilarconectado a um filtro de 0,45 }4,m. As amostras foram subseqüentementearmazenadas em -40°C. Glicose, etanol, glicerol, ácido acético, ácidopirúvico, ácido succínico e 2-oxoglutarato foram determinados por HPLCusando uma coluna de exclusão de íon HPX-87H Aminex (RSD < 0,6%, n =3). A coluna foi eluída em 60°C com 5 mM de H2SO4 em uma taxa de fluxode 0,6 ml por min. O ácido pirúvico, ácido acético e o 2-oxoglutarato foramdeterminados com um medidor Waters 486 UV em 210 nm ao passo que osoutros compostos foram determinados com um detector de índice refrativoWaters 410. Os dois detectores foram conectados em série com o detector deUV primeiro. A concentração de CO2 no gás extraído foi determinado usandoum analisador de gás acústico Brüel & Kjaer 1308 (RSD = 0,02%)Christensen et al., 1995). O amônio foi determinado usando um testecomercialmente disponível (Boehringer Mannheim Cat. No. 1 112 732). Aserina foi determinada como descrito por Barkholt e Jensen, 1989. Em umaexperiência separada, o gás extraído do biorreator foi borbulhado através denitrogênio líquido e a concentração de etanol na mistura congelada de água,etanol e acetaldeído foi determinada por HPLC após a evaporação do N2. Pormeio deste, a perda de etanol através do condensador de refluxo do biorreatorfoi determinada ser entre 4% e 9% do etanol formado pela biorreaçãodependendo da taxa de diluição (Schulze, 1995). No equilíbrio do carbono osfluxos de etanol medidos foram corrigidos por esta perda através daevaporação.

Medição das atividades da enzima. O líquido de cultura foiretirado do biorreator em um béquer gelado, centrifugado e lavado duas vezescom 10 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,5, 2°C) contendo 2 mMde EDTA. Subseqüentemente as células foram colocadas novamente emsuspensão em 4,2 ml de tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5, 2°C)contendo 2 mM de MgCl2 seguido por congelamento imediato em nitrogêniolíquido e armazenagem em -40°C. Antes da análise 0,22 ml de DTT 20 mMfoi adicionado nas amostras logo após eles serem distribuídos em tubos deeppendorf contendo 0,75 ml de contas de vidro (tamanho de 0,25 a 0,50). Ascélulas foram rompidas em um moinho de contas por 12,5 min. (O0C). Ostubos de teste foram centrifugados (20000 rpm, 20 min., O0C), logo após ossobrenadantes foram reunidos em um tubo de teste. Durante as análisesseguintes o extrato foi mantido em gelo. Os testes da enzima foramexecutados em 3 O0C usando um espectrofotômetro Shimadzu UV-260 em30°C. As taxas de reação, corrigidas para taxas endogenosas, foramproporcionais à quantidade de extrato adicionado. Todas as atividades daenzima foram expressas como micromoles de substrato convertido porminuto por mg de proteína celular total como determinado pelo processoLowry. A desidrogenase de glutamato (NAD+ e NADP+) (EC 1.4.1.5 e EC1.4.1.4, respectivamente) foi testada como descrito por Bruinenberg et al.(1983a). A sintase de glutamato (GOGAT) (EC 1.4.1.14) foi testada comodescrito por Holmes et ai. (1989).

RESULTADOS

Construção de cepas com uma anulação em GDHl e umaexpressão excessiva de GDH2. O objetivo dos estudos foi analisar se adesidrogenase de glutamato dependente de NADH, codificada por GDH2,pode substituir a isoenzima dependente de NADPH, codificada por GDHl,na assimilação de amônio e 2-oxoglutarato em glutamato na S. cerevisiae.

Isto deve levar a uma redução na formação de excedentes de NADH nasíntese de biomassa e assim, em uma cepa de S. cerevisiae com umaformação reduzida de glicerol e possivelmente uma formação aumentada deetanol. Para se obter isto, as cepas foram construídas com uma anulação naGDHl e uma expressão excessiva de GDH2. A GDHl foi anulada comodescrito mais no princípio (Boles et al., 1993) na cepa haplóide TN2 derivadade S. cerevisiae CBS8066 (Nissen et al, 1998). A cepa resultante foicensurada TN9. De modo a obter uma cepa com uma expressão excessivaconstitutiva estável de GDH2, o promotor de PGK, codificando a cinase defosfoglicerato, foi inserido em frente do códon de partida de GDH2 nocromossoma IV. O PGK codifica um dos mRNA mais abundante e espéciesde proteína na célula, estimando por 1% a 5% do mRNA celular total eproteína durante o crescimento nas fontes de carbono fermentativo (Dobsonet al., 1982). A inserção do promotor foi obtido por recombinação homólogade um fragmento Spel/xxx 4,8 kbp de pPGKGDH2 na localização GDH2 nacepa TN9 (ver materiais e processos). A cepa resultante foi censurada TN22.O promotor de CHAl, codificando a desidratase L-serina catabólica, foiapresentado ser indutível por quantidades baixas de serina (Bornaes et al.,1993). Para estudar o efeito de níveis variando de atividade Gdh2p em umaformação da cepa com nenhuma atividade de Gdh lp, o promotor CHAl foiinserido no cromossoma IV à frente da estrutura de leitura aberta de GDH2na cepa TN9. O promotor indutível de serina foi selecionado para evitar o usode promotores indutíveis que eram dependentes da adição de uma segundafonte de carbono além da glicose, uma vez que isto deve complicar acomparação entre os cultivos com concentrações aumentando desta segundafonte de carbono. Além disso, o promotor CHAl foi notificado ser induzidoaté 130 vezes pela adição de 5 mM de serina, que deve ter muito poucainfluência na fisiologia da célula. A inserção do promotor CHAl foi obtidopor recombinação homóloga de um fragmento Spel/Aatll 4,3 kbp depCHAlGDH2 na localização GDH2 na cepa TN9 (ver materiais e processos).A cepa resultante foi censurada TN12.

Cultivos contínuos. Os estudos fisiológicos das cepasgeneticamente planejadas foram realizados em cultivos contínuosanaeróbicos. A cepa TN12 com o promotor CHAl indutível inserido nocromossoma em frente de GDH2 foi cultivada até que condições constantesforam alcançadas no meio de desenvolvimento contendo glicose como afonte de carbono principal e quantidades aumentando de serina de 0 mM a 30mM. A quantidade de sulfato de amônio na alimentação foi regulada para daruma concentração final de 60 mM de amônio e serina. Isto foi feito paraestudar o grau de indução de GDH2 que pode ser alcançado com o novopromotor e o efeito desta indução na formação do produto. Cultivos similaresde cepas TNl e TN9 foram executados. Por meio deste, os efeitos dasquantidades aumentando de serina na alimentação, a anulação de GDHl, e ainserção do novo promotor em frente de GDH2 na formação do produto podeser discriminado cada um do outro.

As atividades específicas de Gdhlp5 Gdh2p e Gltlp forammedidas in vitro nos extratos celulares de cada cultivo de condição constante.

A atividade de Gdhlp em TNl diminuiu quase linear de 0,657 para 0,475unidades por mg de proteína celular total (U por mg de TCP) quando oconteúdo de serina na alimentação foi aumentado de 0 mM para 30 mM(linha pontilhada na Figura 3). Isto bem ajustado com a diminuição damedida na captação de amônio de 18,8 a 8,2 mmoles por c-mol de biomassapor hora, respectivamente. Estudos mais antigos de S. cerevisiae têmmostrado que uma diminuição na captação de amônio resulta em umaredução simultânea na atividade Gdhlp nos extratos livres de célula (Schureet ai, 1995a). Nenhuma atividade da desidrogenase de glutamato dependentede NADPH pode ser detectada nos extratos livres de célula de qualquer umdos cultivos contínuos de TN9 e TN12. A atividade Gdh2p nos extratos livresde célula de cepas TNl aumentadas de 0,007 U por mg de TCP quando oamônio foi usado como a única fonte de nitrogênio para 0,022 U por mg deTCP quando 30 mM de serina estava presente na alimentação (Figura 3). Aanulação de GDHl em TN9 resultou em um aumento marcado na atividadeespecífica de Gdh2p. Quando o amônio foi usado como a única fonte denitrogênio a atividade foi determinada em 0,268 U por mg de TCP, umaumento de um fator 40 quando comparado com a atividade em TNl. Foimostrado que o nível intracelular de glutamina resulta em repressão forte daexpressão GDH2 no nível transcricional (Miller e Magasanik, 1991). Quandoo GDHl foi anulado, a síntese de glutamato de 2-oxoglutarato e amônio éfortemente afetada que provavelmente leva a uma diminuição significativa naconcentração intracelular do componente. Uma vez que o glutamato é um dossubstratos na síntese da glutamina isto resultará em uma outra diminuição nonível intracelular do aminoácido. Assim, o forte aumento na Gdh2p em TN9provavelmente foi devido a uma elevação da repressão da glutamina deGDH2. A adição de quantidades aumentando de serina na alimentaçãoresultou em uma redução significativa na atividade Gdh2p. Uma vez que asconcentrações de glicose residual em todos os cultivos de TN9 foramconstantes em 20 c-mmoles por litro, isto não foi devido a repressão daglicose de GDH2 (Coschigano et al., 1991). A concentração residual deamônio diminuiu de 48 mM quando o composto foi usado como a única fontede nitrogênio para 28 mM quando 30 mM de serina foi adicionada no meio.

Em um estudo mais antigo no cultivo contínuo de uma S. cerevisiae tiposilvestre, foi demonstrado que a atividade Gdh2p diminuiu por um fator 4quando a concentração de amônio residual foi reduzida por esta quantidade(Schure et al, 1995b). Uma vez que a concentração de glutamina intracelulardiminuiu simultaneamente, este efeito não foi devido a repressão destecomponente. Em vez disso, um aumento observado na concentraçãointracelular de 2-oxoglutarato pode esclarecer a redução na atividade Gdh2puma vez que este componente geralmente é pensado ser o produto da reaçãocatalisada pela enzima quando as células são cultivadas nas fontes denitrogênio diferentes do amônio. Nenhum aumento na atividade específica deGdh2p foi observado no cultivo de TN12 com amônio como a única fonte denitrogênio. Isto claramente demonstrou que o aumento da atividade de Gdh2pobservado estas condições de desenvolvimento em TN9, foi devido adesregulação do promotor GDH2. A indução esperada do promotor CHAlpor serina não foi observada nos cultivos de TN12 quando quantidadesaumentando do componente foram adicionadas ao alimento. A presença deserina 5 mM no meio aumentou a atividade Gdh2p por um fator de 6enquanto a indução máxima foi observada pela adição de serina 30 mM.Aqui, a atividade da enzima foi 13 vezes mais elevada do que quando oamônio foi usado como fonte de nitrogênio. Nenhuma mutação na regiãoclonada do promotor CHAl foi observada quando o fragmento PCR obtidofoi sequenciado. Como mencionado acima, estudos mais antigos têmmostrado que o promotor é induzido 130 vezes no nível transcricional pelapresença de serina 5 mM no meio de crescimento. Assim, a ausência destaindução em TN12 deve ser devido a regulação pós-transcricional da enzima.

Nenhuma diferença significativa na atividade específica da desidrogenase deglutamato pode ser detectada quando os cultivos em condições constantescom quantidades aumentando de serina na alimentação da mesma cepa foramcomparados ou quando os cultivos em condições constantes de TNl, TN9 eTN12 foram comparados. O nível da atividade específica variou de 0,008 a0,013 Upormg de TCP.

A captação de glicose, amônio e serina e a produção de etanol,glicerol, biomassa, dióxido de carbono, succinato, piruvato e acetato pelastrês cepas foi medida em cada estado constante. Destas medições, osrendimentos do produto (em c-moles do produto produzido por c-moles deglicose e serina consumidas) foram calculados (Tabelas de 1 a 3).

TABELA 1

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Tabela 1. Rendimentos do produto nos cultivos contínuos da cepa TNl comquantidades aumentando de serina na alimentação. Unidade: c-moles doproduto por c-moles de glicose e serina consumidas.

TABELA 2

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Tabela 2. Rendimentos do produto nos cultivos contínuos da cepa TN9 comquantidades aumentando de serina na alimentação. Unidade: c-moles doproduto por c-moles de glicose e serina consumidas.TABELA 3

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Tabela 3. Rendimentos do produto nos cultivos contínuos da cepa TN12 comquantidades aumentando de serina na alimentação e no cultivo contínuo dacepa TN22 com amônio como a única fonte de nitrogênio. Unidade nocultivo de TNl2: c-moles do produto por c-moles de glicose e serinaconsumidas. Unidade no cultivo de TN22: c-moles do produto por c-moles deglicose consumida.

O equilíbrio de carbono dos produtos produzidos nos 12cultivos em estado constante mostraram que 95% a 98% do carbonoconsumido foi convertido em um dos produtos listados. O grau de redução doresíduo de 2% a 5% do carbono consumido variou entre 0 e 1, indicando quea produção do dióxido de carbono foi medida para baixo.

O amônio e serina foram consumidos simultaneamente pelastrês cepas (Figura 3). Assim, a presença de ambas as fontes de nitrogênio nomeio de crescimento não resultou na repressão do sistema específico decaptação dos dois componentes. As quantidades aumentando de serinaadicionadas ao alimento, resultou em um aumento na captação específica docomposto. Um modelo com base na cinética tipo Michaelis Mentenelementar, descrevendo a dependência da captação da concentração de serinaextracelular, não se ajustou às medições (resultados não mostrados). Assimoutros componentes, por exemplo, glicose, provavelmente tinha um efeitoregulatório na captação específica do composto. A necessidade para acaptação do nitrogênio na forma de amônio diminuiu quando quantidadesaumentando de serina foram consumidas pelas células. Isto resultou em umaredução na captação específica do amônio nas culturas (Figura 4). A captaçãoespecífica total de nitrogênio foi calculada a partir das medições da captaçãode amônia e serina para ser constante em 17 a 18 mmoles de nitrogênio por c-mol de biomassa por hora em todos os 12 cultivos contínuos em estadoconstante. Isto indicou uma composição constante da bio massa com respeitoao conteúdo de proteína, RNA5 DNA e carboidratos.

A adição de serina ao meio resultou em uma diminuição naprodução específica de glicerol (Figura 5). A adição de serina reduz anecessidade de células para outra síntese do aminoácido. A síntese de um molde serina a partir de glicose e amônio envolve a redução de dois moles deNAD+ em NADH e uma etapa de desaminação onde um mol de glutamato éconvertido em 2-oxoglutarato. Como descrito mais no princípio, o glutamatopode ser regenerado a partir de 2-oxoglutarato por duas isoenzimas dedesidrogenase de glutamato, codificadas por GDHl e GDH2, sob o consumode NADPH ou NADH, respectivamente. Além disso, o glutamato pode sersintetizado a partir de 2-oxoglutarato e glutamina pela sintase de glutamato,codificada por GLTl, sob o consumo de NADH (Cogoni et ai, 1995). Nacepa TN1, todas as três enzimas estão presentes enquanto apenas Gdh2p eGltlp estão ativas nas cepas TN9 e TN12. Assim, a adição de serina resultaem uma redução de formação de NADH excedente de cada 1 ou 2 moles pormol de serina em TNl e 1 mol por mol de serina em TN9 e TN12. Outrasíntese de serina em S. cerevisiae CBS8066 foi calculada em 157 c-mmolespor c-mol de biomassa com base nas medições do conteúdo de serina e nosaminoácidos sintetizados a partir de serina na combinação de proteína(Schulze, 1995). Por assumir isto para ser similar em TN1, TN9 e TN12, asíntese específica de serina durante o desenvolvimento no amônio como aúnica fonte de nitrogênio foi de 19,9 c-mmoles por c-mol de biomassa porhora. Nos cultivos com 15 mM e 30 mM de serina na alimentação, a captaçãoespecífica de serina excedeu este valor (Figura 4). Assim, nestes cultivos, aserina foi também catabolizada pelas células. Como mencionado acima, adesidratase de L-serina, codificada por CHAl, catalisa a desaminação deserina em piruvato e amônio. Nenhum aumento na secreção de piruvato,acetato ou metabólitos no ciclo tricarboxílico foi medido quando quantidadesaumentando de serina foram adicionadas no alimento. Portanto, o piruvatoque resistiu da reação de desaminação foi convertido em acetaldeído e aindaem etanol sob consumo de um mol de NADH por mol de serina. Estes doisefeitos da adição de serina ao meio na redução de formação de NADHexcedente, resultaram na diminuição observada na produção específica deglicerol. Isto foi quantificado pela extração da redução na formação deNADH excedente, devido a adição de serina a partir do valor da produçãoespecífica de glicerol medida nos cultivos contínuos com amônio como aúnica fonte de nitrogênio (linhas pontilhadas na Figura 5). Em todos oscálculos um valor para a redução na formação de NADH excedente de 1 molpor mol de serina foi usado. A redução na formação específica de glicerol decepas TN9 e TN12 quando cultivadas em meio com quantidades aumentandode serina na alimentação, pode ser calculada para os dois efeitos da adição deserina na formação de NADH excedente, uma vez que os valores calculadosforam exatos para igualar com os valores medidos. Para a cepa TNl, aprodução específica de glicerol calculada foi igual aos valores medidos noscultivos com 15 mM e 30 mM de serina no alimento. No cultivo com 5 mMde serina na alimentação, um valor correto para a formação específica deglicerol pode somente ser calculado por assumir uma redução na formação deNADH excedente de 2 moles por mol de serina. Por meio desta, umaprodução específica de glicerol de 61,2 c-mmoles por c-mol de biomassa porhora foi obtida quando comparada com 68,6 c-mmoles por c-mol debiomassa por hora, quando um valor para a redução na formação de NADHexcedente de 1 mol por mol de serina foi usado. Isto indica que Gdhlpcatalisa a regeneração de glutamato a partir de 2-oxoglutarato quando acaptação de serina for baixa, enquanto Gdh2p catalisa a reação com níveisaumentando do aminoácido. Estudos mais antigos sustentam esta observação,uma vez que foi mostrado que Gdhlp catalisa a formação de glutamatodurante o desenvolvimento no amônio como a única fonte de nitrogênio,enquanto Gdh2p catalisa a interconversão de glutamato e 2-oxoglutaratodurante o desenvolvimento em outras fontes de nitrogênio (Courchesne eMagasanik, 1988; Miller e Magasanik, 1990). Os cálculos claramentedemonstraram o efeito significativo da adição de serina na fisiologia dacélula, mas também que a formação de NADH excedente na síntese debiomassa tem um alto controle na formação de glicerol. Além disso, Elesdemonstraram que a diminuição na produção específica de glicerol foiindependente da atividade específica de Gdh2p.

A produção específica de etanol foi também efetuada pelaadição de serina no alimento (Figura 6). Nos cultivos de TNl, a formaçãoespecífica de etanol alcançou um máximo quando 5 mM e 15 mM de serinafoi adicionada na alimentação, e então diminuiu levemente quando oconteúdo de serina foi aumentado para 30 mM. Nos cultivos de TN9, aprodução específica de etanol aumentou quase linearmente de 540 para 626c-moles por c-mol de biomassa por hora, enquanto foi constante nos cultivosde TN12. A adição de serina tem pelo menos quatro influências potenciais naformação de etanol em S. cerevisiae. O consumo celular de ATP é para umadada extensão efetuada pelo aumento na captação ativa de serina, peladiminuição na captação ativa de amônio, e pela redução na formação deglicerol, uma vez que a síntese de glicerol envolve o consumo de um ATPpor molécula. Uma vez que o ATP é formado através da síntese de etanoldurante o desenvolvimento anaeróbico, estes efeitos mudarão a formaçãoespecífica de etanol. Além disso, como descrito acima, a serina foicatabolizada em etanol em alguns dos cultivos. Os efeitos da adição de serinana síntese de etanol foram quantificados por assumir o consumo de ATP nossistemas de captação ativa de serina e de amônio de um ATP por molécula.

As mudanças calculadas na formação de etanol devido aos quatro efeitosforam então usadas para calcular os valores para a formação específica deetanol com quantidades aumentando de serina na alimentação, a partir dovalor medido quando o amônio foi usado como a única fonte de nitrogênio.

Um aumento na produção específica de etanol de 540 para 544 c-mmoles porc-mol de biomassa por hora e de 531 para 536 c-moles por c-mol debiomassa por hora, foi calculado para as cepas TN9 e TNl 2, respectivamente.

Para a TNl a produção específica de etanol calculada diminuiu de 441 para435 c-mmoles por c-mol de biomassa por horas. Assim, os efeitos diretoslistados da adição de serina no consumo de ATP e síntese de etanol nãopodem esclarecer as mudanças na produção específica de etanol. Em vezdisso, as mudanças podem ser devido a uma chave no metabolismo levando aum consumo de ATP aumentado na síntese de biomassa. Foi apresentado emum estudo mais antigo que apenas a sintase de glutamato catalisa a formaçãode glutamato quando a GDHl for anulada (Miller e Magasanik, 1990).

Assim, uma cepa com uma anulação dupla em GDHl e GLTl cultivavafracamente no amônio como a única fonte de nitrogênio. No estudo um meiode crescimento contendo níveis elevados de glicose foi usado e emconseqüência, a atividade Gdh2p no mutante duplo foi reprimida. Porexpressão excessiva de GDH2 no mutante, uma atividade específica doproduto genético de 0,195 unidades por mg de TCP foi obtida que levou a umaumento na taxa de crescimento no amônio a níveis do tipo silvestre. Nocultivo contínuo da cepa TN9, acarretando a anulação em GDHl, comamônio como a única fonte de nitrogênio, a atividade específica de Gh2p foide 0,268 unidades por meg de TCP devido a ausência de repressão deglicose. Isto fortemente indicou que o glutamato foi sintetizado tanto porsintase de glutamato quanto pela desidrogenase de glutamato dependente deNADH sob estas condições de desenvolvimento. Quando o conteúdo deserina no meio foi aumentado, a atividade específica Gdh2p diminuiu. Umavez que a taxa específica de desenvolvimento foi mantida constante em 0,127h"1, é razoável supor que também a taxa celular da síntese de glutamato foiconstante com o aumento das quantidades de serina na alimentação. Assim, oaumento das quantidades do componente provavelmente foi sintetizadoatravés da reação catalisada por sintase de glutamato. Aqui, o 2-oxoglutaratoe a glutamina são convertidas em duas moléculas de glutamato sob oconsumo de NADH. A glutamina é então regenerada a partir do glutamatosob consumo de amônio e ATP, catalisada por sintetase de glutamina. Nareação em rede catalisada pelas duas enzimas, 2-oxoglutarato e amônio sãoconvertidos em glutamato sob consumo de NADH e ATP que resulta em umaumento no consumo de ATP na síntese da biomassa, comparado com asíntese de glutamato catalisada por Gdh2p. Além de tudo, o aumento naformação específica de etanol na cepa TN9 com o aumento de quantidades deserina na alimentação, pode ser devido a este aumento no consumo de ATPna síntese de glutamato. No cultivo de TN12 com o amônio como a únicafonte de nitrogênio, a sintase de glutamato catalisou a síntese de glutamato,visto que a atividade específica de Gdh2p foi medida em 0,005 unidades pormg de TCP. Como descrito mais no princípio, a atividade específica dadesidrogenase de glutamato dependente de NADH aumentou com o aumentodas quantidades de serina na alimentação, mas o nível não excedeu a 0,065unidades por mg de TCP que provavelmente foi baixa para substituir asintase de glutamato na formação de glutamato. Portanto, o consumo de ATPna síntese da biomassa permaneceu constante nas culturas, que resultou emuma formação específica de etanol constante. A desidrogenase de glutamatodependente de NADPH catalisou a formação de glutamato nos cultivos deTN1. Assim, um aumento no consumo de ATP na assimilação de amônio nãopode esclarecer o pequeno aumento na formação específica de etanolobservada nos cultivos com 5 mM e 15 mM de serina na alimentação. Emvez disso, o aumento observado de aproximadamente 6% comparado com ocultivo com amônio como a única fonte de nitrogênio, pode ser devido àsoma de pequenas mudanças no metabolismo, resultando em um consumoaumentado de ATP na síntese da biomassa. No cultivo de TN9 com amôniocomo a única fonte de nitrogênio, um aumento na produção específica deetanol e uma diminuição na produção específica de glicerol de 22% e 20%,respectivamente, foi observado comparado com o cultivo de TN1. Resultadossimilares foram obtidos no cultivo de TN12. Assim, a anulação de GDHl,resultando na formação de glutamato celular por Gltlp5 levou a uma cepa S,cerevisiae com características melhoradas para a produção de etanol.

Para ainda analisar o efeito da expressão excessiva de GDH2em um mutante Agdhl sem a influência da adição de serina, um cultivocontínuo limitado a glicose da cepa TN22 foi realizado com o amônio como aúnica fonte de nitrogênio em uma taxa de diluição de 0,11 h"1. Comomencionado acima, a TN22 tem o promotor constitutivo forte de PGKinserido à frente da GDH2 no cromossoma IV. Uma atividade específica de0,381 unidades por mg de TCP da desidrogenase de glutamato dependente deNADH foi medida nos extratos livres de célula a partir do cultivo em estadoconstante de TN22, enquanto as atividades de Gdhpl e Gltlp foram ausente e0,012 unidade por mg de TCP, respectivamente. O equilíbrio de carbono e oequilíbrio sobre o grau de redução dos substratos e produtos medidos nocultivo, igualmente fecharam dentro de 3,8%. Assim, foi concluído que todosos produtos segregados pela célula foram corretamente quantificados. Aatividade elevada de Gdh2p foi refletida nas taxas específicas de produçãomedidas de etanol e glicerol. As duas taxas foram medidas a 411 c-mmolespor c-mol de biomassa por hora e 24 c-mmoles por c-mol de biomassa porhora, respectivamente. O valor baixo para a produção específica de etanol foisimilar ao valor medido no cultivo contínuo de TNl com amônio como aúnica fonte de nitrogênio. Por isso, o nível de consumo de ATP naassimilação de amônio no glutamato provavelmente foi idêntico nas duascepas. Isto indicou que na TN22, a desidrogenase de glutamato dependentede NADH tinha completamente substituído o papel da sintase de glutamatona síntese de glutamato que foi observado nas cepas TN9 e TYN12. Aprodução específica de glicerol muito baixa na TN22 comparada com a cepaTN9 e TN12 foi surpreendente. A captação específica de amônio no cultivofoi de 19,2 mmoles por c-mol de biomassa por hora que foi 12% maiselevado do que na TN9. Também o rendimento da biomassa aumentou de123 c-mmoles por c-mol de glicose na TN9 para 138 c-mmoles por c-mol deglicose na TN22. Isto indicou que a atividade elevada de Gdh2p resultou emum fluxo mais elevado de 2-oxoglutarato e amônio no glutamato na TN22 doque na TN9, que levou a um aumento na reoxidação de NADH através dareação catalisada pela enzima, e assim, uma diminuição na formação deglicerol. Além disso, indicou que a redução nos rendimentos da biomassaobservada nos cultivos contínuos de TN9 e TN12 comparada com as TNl eTN22 (Tabelas de 1 a 3), foi devido a uma limitação na assimilação doamônio. Nenhuma mudança na formação dos ácidos orgânicos foi observadacomparada com TN9 e TNl 2.

Cultivos por batelada. A fisiologia anaeróbica das cepas deS. cerevisiae foi também estudada nos cultivos por batelada com a glicosecomo a fonte de carbono principal e amônio ou serina como a fonte denitrogênio. Isto foi feito para quantificar o efeito das mudanças genéricas nataxa específica de desenvolvimento máximo, |nmax, e nos rendimentos doproduto.

Os rendimentos do produto obtidos,nos cultivos por bateladaanaeróbicas das quatro cepas são listados na Tabela 4.TABELA 4

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Tabela 4. Rendimentos do produto nos cultivos por batelada limitados aglicose anaeróbicos de cepas TNlj TN9, TNl2 e TN22 com amônio ou serinacomo fonte de nitrogênio. A unidade no cultivo como amônio como a fontede nitrogênio: c-moles do produto por c-mol de glicose consumida. Unidadeno cultivo com serina como fonte de nitrogênio: c-moles do produto por c-moles de glicose e serina consumidas.

A produção de glicerol diminuiu significativamente quando acepa TNl foi cultivada com serina como fonte de nitrogênio quandocomparada com o cultivo na amônio. Como para os cultivos contínuos, istofoi devido a uma redução na formação excedente de NADH na síntese dabiomassa sob estas condições de crescimento. Um aumento dramático naformação de acetato foi observado e também a produção de etanol aumentou.A captação celular total de serina foi de 309 c-mmoles por c-mol debiomassa. Por assumir a necessidade constante para outra síntese de serina de157 c-mmoles por c-mol de biomassa usada nos cálculos no princípio, podeser calculado que 152 c-mmoles de serina por c-mol de biomassa foicatabolizado em etanol e acetato. O etanol específico e a formação de acetatoaumentou com 92 c-mmoles por c-mol de biomassa e 210 c-mmoles por c-mol de biomassa, respectivamente, quando a serina foi usada como fonte denitrogênio no lugar do amônio. Assim, a degradação de serina para acetatonão pode ser responsável pelo aumento no rendimento do componentesomente. A formação de acetato pela desidrogenase de aldeído dependente deNAD(P)+, codificado por ALD2, foi proposta para ter um papel fisiológico naredução de NADP+ para NADPH5 que é consumido na síntese da biomassa(Bruinenberg et al., 1983b; Miralles e Serano, 1995). A serina é um precursorna síntese de cisteína e fosfolipídeos, que são vias de síntese que requeremgrandes quantidades de NADPH. A presença de concentrações elevadas deserina intracelular pode potencialmente aumentar o fluxo através destas viase ser responsável pelo aumento na formação de NADPH através da síntese deacetato. A taxa específica de desenvolvimento máximo de TNl diminuiusignificativamente de 0,41 h"1 para 0,31 h"1 quando a fonte de nitrogênio foitransferida de amônio para serina. Quando a serina foi usada como fonte denitrogênio, o nitrogênio tem de estar disponível para a síntese da biomassaatravés da degradação do aminoácido para piruvato e amônio. Este processo émenos eficiente do que a captação direta de amônio seguido pela assimilaçãoem glutamato catalisado pela desidrogenase de glutamato e sintase deglutamato e portanto, a redução na taxa específica de desenvolvimentoprovavelmente foi devido a esta diferença na assimilação do nitrogênio. Aprodução de etanol, glicerol, acetato e dióxido de carbono como funções dotempo é apresentado nas Figuras 7 e 8 para os cultivos de TNl com amônio eserina como fontes de nitrogênio, respectivamente. No cultivo em amônio oteor de dióxido de carbono no gás exaurido diminuiu rapidamente para zerodentro de 40 minutos após a depleção de glicose no meio, também aformação de outros produtos terminados. Assim, o metabolismo parouquando a fonte de carbono disponível foi consumida. Nos cultivos com serinacomo fonte de nitrogênio a queda do teor de dióxido de carbono no gásexaurido durou 400 minutos após a depleção da glicose. As mediçõesfortemente indicaram que isto foi devido a degradação de serina parapiruvato e ainda no acetato, por meio do qual o dióxido de carbono foiformado, visto que a concentração de acetato continuou a aumentar após adepleção da glicose, enquanto as concentrações dos outros produtospermaneceram constante (Figura 8). Devido a problemas de capacidade,apenas o consumo total de serina no cultivo foi medido por quantificar oconteúdo de serina nas amostras do começo e do final. Portanto, não pode sercalculado se a formação de acetato após a depleção da glicose foi devido adegradação da serina. A diminuição vagarosa na formação de dióxido decarbono após a depleção da glicose, não foi observada nos cultivos de TN9 eTN12 quando a serina foi usada como fonte de nitrogênio. Isto pode indicarque o acetato foi produzido no cultivo de TNl para formar NADPH, quesucessivamente foi consumido na assimilação de amônio, originando-se apartir da degradação de serina, pela desidrogenase de glutamato dependentede NADPH.

As amostras de biomassa foram retiradas dos cultivos debatelada quando as células tinham alcançado a fase de crescimentoexponencial e as atividades específicas de Gdhlp, Gdh2p e Gltlp forammedidas na combinação de proteínas extraídas destas amostras (Tabela 5).

TABELA 5

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Tabela 5. As atividades específicas da enzima das desidrogenases deglutamato dependente de NADPH e dependente de NADH e sintase deglutamato nos extratos de proteína de amostras de biomassa retiradas na fasede crescimento exponencial das cepas TN1, TN9, TNl2 e TN22 nos cultivosde batelada limitados por glicose com amônio ou serina como a fonte denitrogênio.

A atividade específica da desidrogenase de glutamatodependente de NADPH diminuiu de 1,522 para 1,197 unidades por mg deTCP, enquanto aquela da isoenzima dependente de NADH aumentou de0,020 a 0,221 unidade por mg de TCP quando a serina foi usada como fontede nitrogênio no lugar do amônio. Também um pequeno aumento naatividade específica de sintase de glutamato foi observado. Isto pode indicarque uma pequena mudança ocorreu na especificidade do co-fator daassimilação de amônio no glutamato com respeito ao consumo tanto deNADPH quanto NADH. Uma vez que a redução na produção de glicerol foicalculada como pelo efeito na formação de NADH excedente do consumo deserina, a parte principal do amônio intracelular provavelmente ainda foiassimilada sob consumo de NADPH por Gdhlp.

A anulação de GDHl em TN9 resultou em uma diminuição nataxa específica de crescimento para 0,22 h" quando o amônio foi usado comofonte de nitrogênio. As atividades específicas de Gdh2p e Gltlp na fase decrescimento exponencial foram 0,055 e 0,045 unidades por mg de TCP,respectivamente, enquanto nenhuma atividade de Gdhlp pode ser detectada.Assim, a redução na taxa específica de crescimento da cepa provavelmentefoi devido a uma redução na taxa de síntese de glutamato a partir do amônioe 2-oxoglutarato, uma vez que a atividade específica total das duas enzimasfoi mais do que dez vezes mais baixa que a de Gdhlp na TN1. A atividadebaixa de Gdh2p comparada com a atividade da enzima nos cultivos contínuosfoi devido a repressão transcricional por glicose (Coschigano et al., 1991).

Como observado nos cultivos contínuos, a assimilação de amônio por umacombinação de sintase de glutamato e a desidrogenase de glutamatodependente de NADH resultou em um aumento na produção de etanol e umadiminuição na produção de glicerol devido ao consumo de NADH e ATP nasíntese de glutamato quando comparado com o consumo de apenas NADPHna cepa TNl. Quando a serina foi usada como fonte de nitrogênio, as mesmasmudanças qualitativas nos rendimentos de etanol, glicerol e acetato foramobservadas como nos cultivos de TN1. O aumento na produção de acetato de0,004 c-moles por c-mol de glicose para 0,018 c-moles por c-mol de glicose eserina foi mais baixo do que observado na TN1, indicando que parte doNADPH consumido por Gdhlp em TNl foi sintetizado através da oxidaçãode acetaldeído em acetato pela desidrogenase de aldeído dependente deNAD(P)+ citoplásmica. A diminuição na produção de biomassa da TN9 foimais baixa quando a serina foi usada como fonte de nitrogênio no lugar doamônio. Isto não foi observado nos cultivos de TNl e TN12 e não foiesclarecido por qualquer uma das mudanças medidas nos rendimentos doproduto ou atividades da enzima.

As atividades de Gdh2p e Gltlp na fase de crescimentoexponencial de TN12 foram 0,006 e 0,050 unidades por mg de TCP,respectivamente, quando o amônio foi usado como fonte de nitrogênio.Assim, a atividade total das enzimas na assimilação de amônio foi ainda maisbaixa do que observada em TN9 e resultou em uma outra redução na taxaespecífica de desenvolvimento máximo para 0,15 h"1, quase uma diminuiçãopara um terço de Plnax em TNl. Uma vez que a atividade de Gdh2p foifechada em zero na TN12 sob estas condições de desenvolvimento, a síntesede glutamato foi catalisada pela sintase de glutamato somente. Isto levou aum pequeno aumento na produção de etanol. Quando oposto às observaçõesdos cultivos de TNl e TN9 em amônio como fonte de nitrogênio, umaumento dramático na produção de acetato e uma redução correspondente naprodução de biomassa foi observada em TN12. A queda na quantidade debiomassa sintetizada por mol de glicose, sugeriu que uma mudançasignificativa no anabolismo da célula tinha ocorrido. Um papel importante deglutamato no metabolismo é a doação de amônio na síntese de muitosaminoácidos através da desaminação de 2-oxoglutarato catalisado pelas duasdesidrogenases de glutamato. Como descrito, as atividades específicas destesforam muito baixas em TN12, que pode limitar o fluxo através das vias dasíntese para estes aminoácidos e assim, o fluxo total em direção a síntese dabiomassa. O aumento na formação de acetato pode ser devido a um aumentono consumo de NADPH na síntese da biomassa. Quando a serina foi usadacomo fonte de nitrogênio, a atividade específica de Gdh2p aumentou para0,329 unidades por mg de TCP. Isto representou uma indução da enzima porum fator de mais do que 50, enquanto a atividade Gdh2p apenas aumentoudez vezes na TNl quando a serina foi adicionada. Portanto, a indução dopromotor CHAl por serina foi funcional na TN12. A atividade de Gltlpdiminuiu ligeiramente para 0,040 unidades por mg de TCP. A atividadeaumentada da desidrogenase de glutamato dependente de NADH resultou emum aumento marcante na taxa específica de desenvolvimento máximo dacepa. Isto claramente ilustrou que a taxa de desenvolvimento da cepa foilimitada pelo fluxo em direção ao glutamato quando o amônio foi usadocomo fonte de nitrogênio. Além disso, demonstrou que a Gdh2p foi capaz desubstituir tanto a Gdhlp quanto a Gltlp na síntese de glutamato a partir doamônio e 2-oxoglutarato. A atividade de Gdh2p elevada também resultou emuma produção de biomassa comparável aos valores obtidos nos cultivos deTNl e TN9. Isto sustentou a teoria de que a produção baixa de biomassa emamônio foi devido a uma limitação na síntese da biomassa pela reação dedeslaminação de glutamato para 2-oxoglutarato.

De modo a analisar o efeito da expressão excessiva de GDH2em TN9 sem a influência de adição de serina, os cultivos por bateladaanaeróbicos da cepa TN22 foram realizados com glicose como a fonte decarbono e amônio como a fonte de nitrogênio. Quando o promotor de GDH2original foi substituído pelo promotor de PGK constitutivo forte na TN22,uma atividade Gdh2p na fase de crescimento exponencial de 0,625 foi obtido.Isto resultou em um aumento dramático na taxa específica dedesenvolvimento máximo de 0,22 h"1 para 0,39 h'1 que foi muito próximo a μmax na cepa TN1. Novamente isto ilustrou que a desidrogenase dependente deNADH pode completamente substituir a isoenzima dependente de NADPH semanifestada em um nível suficiente. A produção da biomassa na TN22aumentou em 11% comparada com a TN9 e foi ainda mais elevada do que naTN1. Isto resultou em uma produção mais elevada de glicerol, uma vez que aquantidade formada de NADH excedente aumentou por c-mol de glicose quefoi consumido. O aumento na produção de etanol que foi observado na TN9foi ausente no cultivo da TN22, o qual ilustrou que a síntese de glutamato apartir do amônio e 2-oxoglutarato, ocorreu sem o consumo de ATP em TN22.

Comentários de conclusão. O trabalho mais acima descritofoi realizado para analisar se a atividade da desidrogenase de glutamatodependente de NADPH codificada por GDHl pode vantajosamente sersubstituído pela isoenzima dependente de NADH codificada por GDH2 emum processo envolvendo a assimilação de amônio e 2-oxoglutarato emglutamato. Um outro objetivo foi analisar o efeito de tal assimilação deamônio metabolicamente planejada na formação do produto em cultivosanaeróbicos.

O cultivo por batelada anaeróbico da cepa TN22 claramentedemonstrou que a expressão elevada de GDH2 em um mutante Agdhlresultou em uma cepa em que o papel fisiológico de Gdhlp em uma cepa tiposilvestre foi tomado por Gdh2p. Além disso, foi mostrado que esta mudançano metabolismo resultou em uma redução da formação de glicerol. Assim, aformação de NADH excedente na síntese da biomassa exerce um efeitoprincipal na síntese de glicerol. Mais provavelmente, uma outra redução naformação de produtos metabólicos indesejáveis pode ser obtida pormetabolicamente planejar outras reações catalisadas por isoenzimas comespecificidades diferentes do co-fator. A produção reduzida do glicerol nãoresultou em um aumento do fluxo metabólico em direção ao etanol.

Consequentemente, nas cepas metabolicamente planejadas, a formação deetanol não é limitada pelo fluxo de metabólitos com respeito a outrosprodutos de fermentação.

Uma tentativa foi feita para estudar o efeito da expressãoexcessiva de GDH2 na fisiologia anaeróbica com mais detalhe pelaintrodução do promotor indutível de CHAl à frente da GDH2 no cromossomaIV. A indução dom promotor por serina foi claramente evidente, masquantidades muito elevadas do aminoácido tinham de ser adicionadas aomeio de modo a se obter uma expressão elevada de GDH2. Adição de até 30mM de serina ao meio em um cultivo contínuo afetou o metabolismo dascélulas e complicou a análise das experiências. Nos cultivos de batelada deTN12, a indução da expressão de GDH2 por serina resultou em um aumentosignificativo na taxa específica de desenvolvimento daquela cepa. Esteresultado renovou a conclusão mais acima alcançada de que a atividade de1( Gdh2p pode realmente substituir aquela da Gdhlp em um metabolismocelular.

Um aumento significativo na formação de etanol e umadiminuição na formação de glicerol foram observados, quando a GDHl foianulada na cepa TN9. Isto pode ser devido a uma síntese de glutamatoatravés de duas reações unidas mediadas pela sintase de glutamato codificadapor GLTl e sintetase de glutamina codificada por GLNl. A síntese deglutamato através destas duas reações unidas resulta no consumo tanto deNADH quanto de ATP, e consumo pode esclarecer as mudanças observadasna formação do produto. Infelizmente, a taxa específica de desenvolvimentomáximo da cepa TN9 foi também reduzida pela anulação em questão e assim,nenhum aumento global na produtividade do etanol foi obtido. A taxa dedesenvolvimento mais baixa foi provavelmente devido a uma limitação nataxa da síntese de glutamato. Isto é concebível uma vez que a atividade deGltlp foi muito mais baixa do que a atividade de Gdhlp que catalisou aformação de glutamato na cepa TNl.

As experiências descritas acima têm demonstrado que odefeito de desenvolvimento observado pode ser minorado por uma expressãoexcessiva de GDH2. Consequentemente, uma questão chave é: produzir umaexpressão excessiva de Gltlp e Glnlp resulta em uma cepa com umaprodutividade aumentada de etanol bem como uma taxa de desenvolvimentomais elevada, quando comparada com uma cepa tipo silvestre?

EXEMPLO 2

Assimilação de amônio metabolicamente planejada e produção de etanol emlevedura

Introdução

Neste exemplo, uma nova estratégia é apresentada para aotimização da produção de etanol em Saccharomyces eerevisiae através daengenharia metabólica. É baseada nos papéis fisiológicos de glicerol e etanolna oxidação de NADH excedente e na formação de ATP, respectivamente,sob condições de desenvolvimento anaeróbico. São apresentados osresultados experimentais dos cultivos por batelada anaeróbicos de cepasdesenvolvidas na base da estratégia.

MATERIAIS E PROCESSOS

Microorganismos e sua manutenção. Todas as cepasSaccharomyees eerevisiae foram geradas a partir de Saccharomyeeseerevisiae T23D. A cepa foi gentilmente fornecida por Jack Pronk doDepartament of Microbiology and Enzymology, Kluyver Laboratory ofBiotechnology, Delft University of Technology, Países Baixos. As cepas delevedura foram mantidas em 4°C em placas de agar YPG, mensalmentepreparadas de um estoque liofilizado conservado em -80°C. Eseheriehia eoliDH5cc (F- YSOdlaeZ DM15 O(laeZYA- argF) U169 deoR reeAl endAlhsdRl 7(rk" mk+) supE44\ thi-1 gyra96 relAl) (GIBCO BRL, Gaithersburg,MD USA) foi usada para subclonagem.

Preparação de DNA. O DNA plasmídeo de E. eoli foipreparado com colunas Qiagen (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Alemanha)seguindo as instruções do fabricante. Para a purificação dos fragmentos deDNA usados para as experiências de clonagem, os fragmentos desejadosforam separados em géis de agarose a 0,8%, extirpado e recuperado daagarose usando o Kit de isolamento de DNA Qiagen (Qiagen GmbH,Düsseldorf, Alemanha). O DNA cromossômico da Saccharomyces eerevisiaefoi extraído como se segue. As células foram cultivadas em meio em frascosde agitação e colhidas em OD = 1,5. 10 mg de células úmidas foramnovamente colocadas em suspensão em 0,5 ml de Tris-Cl (pH 8,0) eextinguidas com 0,5 ml de contas de vidro (tamanho de 250 a 500 mícrons)na presença de 0,5 ml de Tris-fenol saturado (pH 8,0). O DNA foi extraído dafase fenol com clorofórmio, precipitado com 98% de etanol e colocadonovamente em suspensão em tampão TE. O RNA no extrato foi removido portratamento com RNAaseA (adquirido da Promega) e finalmente o DNA foipurificado por precipitação com etanol/cloreto de lítio e novamente colocadoem suspensão em tampão TE. Os iniciadores de DNA foram adquiridos daDNA Technology (Aarhus, Dinamarca).

Expressão excessiva de GLTL Os iniciadores Gltlstart (53-GCG CGG GAT CCT CTA GAA TGC CAG TGT TGA AAT CAG AC-3'),SEQ ID NO:9, contendo sítios de enzima de restrição para BamHI e XbaI emfrente de nucleotídeos de 1 a 21 de GLTl, e Gltlstop (5'-CGC GCG GATCCC CGC GGG CTG GAC CAT CCC AAG GTT CC-3'), SEQ ID NO: 10,contendo sítios de enzima de restrição para BamHI e SacII em frente denucleotídeos de 1149 a 1169 de GLTl), foram usados para clonar partes dogene estrutural de GLTl por PCR com a polimerase pfu (New EnglandBiolabs). Um fragmento de DNA do tamanho correto foi isolado de um gelde agarose a 0,8% após a eletroforese e digerido com BamHI durante a noite.

O fragmento foi ligado no sítio de digestão BgIII único de plasmídeo Yep24-pPGK atrás do promotor PGK e em frente do terminador PGK (Walfridssonet al., 1997), resultando no plasmídeo Yep24-pPGK-GLTl. Um fragmento deDNA Smal/SacII 2,5 kb, consistindo do promotor PGK e a parte clonada deGLTl foi isolado do Yep24-pPGK-GLTl. O fragmento foi ligado noplasmídeo pFA6A-kanMX3 (Wach et al., 1994), digerido com EcoRV eSacII5 resultando no plasmídeo pPGK-GLTl (Figura 9). O plasmídeo foilinearizado pela digestão com EcoRV antes da transformação. A inserçãocorreta do plasmídeo na localização GLTl no cromossoma IV foi verificadapor análise PCR do DNA cromossômico extraído de transformantes comresistência voltada para geniticina. Para este propósito os iniciadoresPGKverif, atravessando a região 420 a 400 bp a montante do códon departida PGK, e GLTlverif5 atravessando a região de nucleotídeos 1243 a1260 de GLTl, foram construídos. A alça exterior do gene de resistência ageniticina por recombinação homóloga das duas repetições diretasflanqueando o gene, foi obtida por cultivo de transformantes corretos por até100 gerações no meio YPD não seletivo seguido por revestimento deaproximadamente 50000 colônias em placas de YPD. As colônias foramentão revestidas de réplicas em placas de YPD contendo 150 mg por litro degeniticina e os transformantes sem resistência com respeito a geneticinaforam isolados. A freqüência da alça exterior foi aproximadamente 1 por25000 colônias. Foi verificado por análise de PCR do DNA cromossômico apartir de transformantes de alça exterior que o promotor de PGK foi aindaintroduzido em frente da GLT1.

Expressão excessiva de GLNl. Os iniciadores Glnlstart (5'-GCG CGG GAT CCT CTA GAA TGC CTG AAG CAA GCA TCG AA-3'),SEQ ID NOill5 contendo sítios de enzima de restrição para BamHI e XbaIem frente de nucleotídeos de 1 a 21 de GLNl, e Glnlstop (5'-CGC GCGGAT CCC CGC GGT TAT GAA GAT TCT CCT TCA AA-3'), SEQ IDNO: 12, contendo sítios de enzima de restrição para BamHI e SacII em frentede nucleotídeos de 1093 a 1113 de GLN 1), foram usados para clonar GLNlpor PCR com a polimerase pfu (New England Biolabs). O fragmento de DNAobtido foi usado para construir o plasmídeo pPGK-GLNl, contendo GLNlatrás do promotor PGK inserido em pFA6A-kanMX3 (Figura 9), comodescrito acima para o plasmídeo pPGK-GLTl. O pPGK-GLNl foilinearizado pela digestão com KpnI antes da transformação. A inserçãocorreta do plasmídeo na localização GLNl no cromossoma XVI foiverificada por análise PCR do DNA cromossômico extraído detransformantes com resistência voltada para geniticina. Para este propósito osiniciadores PGKverif5 atravessando a região 420 a 400 bp a montante docódon de partida PGK, e GLNlverif5 atravessando a região de nucleotídeos52 a 70 de GLTl, foram construídos.

Transformação de E. coli e S. cerevisiae. E. coli DH5a foitransformada por eletrotransformação usando o equipamento deeletroporação Bio-Rad (Biorad Laboratories, Richmond5 USA). Ostransformantes foram selecionados em placas de caldo L contendo 100 mg/mlde ampicilina. Células de S. cerevisiae foram feitas capazes para a captaçãode plasmídeo por tratamento com acetato de lítio e polietilenoglicol (Schiestl& Gietz5 1989). 3 μg de DNA foram usados para cada transformação. Ostransformantes foram colocados em suspensão em YPD por 24 horas antes derevestir no YPD5 contendo 150 mg de geniticina por Iitro5 de modo a obter aexpressão do gene de resistência G418.

Meio nos cultivos por batelada. As cepas de S. cerevisiaeforam cultivadas em um meio mineral preparado de acordo com Verduyn etal. (1990). As vitaminas foram adicionadas por filtração estéril seguindo aesterilização quente do meio. As concentrações de glicose e (NH4)2SO4inicialmente nos cultivos de batelada foram 25 g por 1 e 3,75 g por 1,respectivamente. O desenvolvimento da S. cerevisiae sob condiçõesanaeróbicas requer a adição suplementar do meio de ergosterol e ácidosgraxos insaturados, tipicamente na forma de Tween 80 (Andreasen & Stier51953; Libudzisz et al., 1986). Ergosterol e Tween 80 foram dissolvidos em96% (v/v) de etanol e a solução foi autoclavada em 1210C por 5 min. Asconcentrações finais de ergosterol e Tween 80 no meio foram 4,2 mg por gDW e 175 mg por g DW, respectivamente. Para impedir a espumação, 75 μΐpor 1 de antiespuma (Sigma A-5551) foi adicionado ao meio.

Levantamento experimental para os cultivos por batelada.

Os cultivos por batelada anaeróbicos foram realizados em 3O0C e umavelocidade de agitação de 600 rpm em biorreatores fabricados em casa. Ovolume de trabalho dos reatores de batelada foi de 4,5 litros. O pH foimantido constante em 5,00 por adição de 2 M KOH. Os biorreatores foramcontinuamente pulverizados com N2 contendo menos do que 5 ppm de O2,obtidos pela passagem de N2 de uma qualidade técnica (AGA 3,8), contendomenos do que 100 ppm de O2, através de uma coluna (250 χ 30 mm) enchidacom camadas de cobre e aquecida a 400°C. A coluna foi regeneradadiariamente por pulverização com H2 (AGA 3,6). Um controlador de fluxo demassa (Bronkhorst Hitec F201C) foi usado para sustentar o fluxo de gás nosbiorreatores constante em 0,50 litro de nitrogênio por min"1 por litro"1 deNorprene tubing (Cole-Parmer Instruments), foi usado por toda parte demodo a minimizar a difusão de oxigênio nos biorreatores. Os biorreatoresforam inoculados em uma concentração inicial de biomassa de 1 mg por litro"1 com o desenvolvimento de pré-culturas em frascos de agitação nãoobstruídos em 30°C e 100 rpm por 24 horas. A evaporação do etanol dosbiorreatores foi minimizada por condensadores de gás extraído esfriados para2°C. Os cultivos de batelada anaeróbicos de cepas TNl, TN9, TNl5 e TNl7foram cada uma realizada três vezes com resultados idênticos.

Determinação do peso seco. O peso seco foi determinadogravimetricamente usando filtros de nitrocelulose (tamanho de poro de 0,45 μm; Gelman Sciences). Os filtros foram pré-secados em um forno demicroondas (Moulinex FM B 935Q) por 10 min. Um volume conhecido delíquido de cultura foi filtrado e o filtro foi lavado com um volume igual deágua desmineralizada seguido por secagem em um forno de microondas por15 minutos. O desvio padrão relativo (RSD) das determinações foi menos doque 1,5% com base nas determinações triplas (n = 3).Análise de compostos do meio. As amostras livres de célulasforam retiradas diretamente do biorreator através de um tubo capilarconectado a um filtro de 0,45 μιη. As amostras foram subseqüentementearmazenadas em -40°C. Glicose, etanol, glicerol, ácido acético, ácidopirúvico, ácido succínico e 2-oxoglutarato foram determinados por HPLCusando uma coluna de exclusão de íon HPX-87H Aminex (RSD < 0,6%, η =3). A coluna foi eluída em 60°C com 5 mM de H2SO4 em uma taxa de fluxode 0,6 ml por min'1. O ácido pirúvico, ácido acético e o 2-oxoglutarato foramdeterminados com um medidor Waters 486 UV em 210 nm ao passo que osoutros compostos foram determinados com um detector de índice refrativoWaters 410. Os dois detectores foram conectados em série com o detector deUV primeiro. A concentração de CO2 no gás extraído foi determinado usandoum analisador de gás acústico Brüel & Kjaer 1308 (RSD = 0,02%)Christensen et al., 1995). Em uma experiência separada, o gás extraído dobiorreator foi borbulhado através de nitrogênio líquido e a concentração deetanol na mistura congelada de água, etanol e acetaldeído foi determinada porHPLC após a evaporação do N2. Por meio deste, a perda de etanol através docondensador de refluxo do biorreator foi determinada ser entre 4% e 9% doetanol formado pela biorreação dependendo da taxa de diluição (Schulze,1995). No equilíbrio do carbono os fluxos de etanol medidos foramcorrigidos por esta perda através da evaporação.

Medição das atividades da enzima. O líquido de cultura foiretirado do biorreator em um béquer gelado, centrifugado e lavado duas vezescom 10 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,5, 2°C) contendo 2 mMde EDTA. Subseqüentemente as células foram colocadas novamente emsuspensão em 4,2 ml de tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5, 2°C)contendo 2 mM de MgCl2 seguido por congelamento imediato em nitrogêniolíquido e armazenagem em -40°C. Antes da análise 0,22 ml de DTT 20 mMfoi adicionado nas amostras logo após eles serem distribuídos em tubos deeppendorf contendo 0,75 ml de contas de vidro (tamanho de 0,25 a 0,50). Ascélulas foram rompidas em um moinho de contas por 12,5 min. (O0C). Ostubos de teste foram centrifugados (20000 rpm, 20 min., O0C), logo após ossobrenadantes foram reunidos em um tubo de teste. Durante as análisesseguintes o extrato foi mantido em gelo. Os testes da enzima foramexecutados em 30°C usando um espectrofotômetro Shimadzu UV-260 em3 O0C. As taxas de reação, corrigidas para taxas endogenosas, foramproporcionais à quantidade de extrato adicionado. Todas as atividades daenzima foram expressas como micromoles de substrato convertido porminuto por mg de proteína celular total como determinado pelo processoLowry. A desidrogenase de glutamato (NAD+ e NADP+) (EC 1.4.1.5 e EC1.4.1.4, respectivamente) foi testada como descrito por Bruinenberg et al.(1983a). A sintetase de glutamina (EC 6.3.1.2) e a sintase de glutamato(GOGAT) (EC 1.4.1.14) foram testadas como descrito por Holmes et al (1989).

RESULTADOS

Análise de controle metabólico. A fisiologia anaeróbica noscultivos contínuos de S. cerevisiae CBS8066 foi previamente analisado pormeio de análise de fluxo metabólico e teorética, embora a análisepraticamente aplicável mostrou que o fluxo através da reação catalisada peladesidrogenase de glutamato dependente de NADPH (reação 25 em ummodelo proposto) foi c-mmoles por g de biomassa por hora em uma taxa dediluição de 0,3 h"1, embora o fluxo em rede de 2-oxoglutarato para glutamatofoi apenas de 2,0 c-mmoles por g de biomassa por hora.

Consequentemente, se as Gltlp e GlnlO catalisaram a mesmareação no lugar de Gdhlp, um mol de NADH e um mol de ATP devem seresperados de serem consumidos por mol de glutamato sintetizado, no lugardo consumo de um mol de NADPH. O resultado de uma tal engenhariametabólica deve consequentemente ser uma redução em uma formação deNADH.

Uma diminuição na formação de glicerol de 9,8 para 5,0 c-mmoles por g de biomassa por hora, um redução de 49%, foi prognosticada.Além disso, o consumo de ATP foi hipotetizado para resultar em um aumentode 6% de formação de etanol, de 54,9 a 58,2 c-mmoles por g de biomassa porhora.

Construção de novas cepas. Mais no princípio, a cepa S.cerevisiae haplóide TNl foi construída a partir de um progênie diplóide dacepa de modelo industrial S. cerevisiae CBS8066 (Nissen et al., 1998b). Istofoi feito pela anulação de HO, codificando uma endonuclease envolvida namudança tipo acasalamento, e isolamento de haplóides estáveis seguindo aesporulação de mutantes de anulação. Além disso, a GDHl foi anulada comodescrito mais no princípio, resultando na cepa TN9 (Nissen et al., 1998a).Neste estudo o objetivo foi construir novas cepas de TN9 com uma expressãoexcessiva constitutiva estável de GLNl, codificando a sintetase de glutamina,e GLTl, codificando a sintase de glutamato. Isto foi alcançado mediante ainserção do promotor constitutivo forte de PGK em frente dos dois genes noscromossomas XVI e IV, respectivamente. O PGK codifica uma das mRNAmais abundantes e espécies de proteína na célula, estimando por 1% a 5% domRNA celular total e proteína durante o crescimento nas fontes de carbonofermentativo (Dobson et al., 1982). Mediante a integração do promotor nocromossoma, os problemas com a perda de plasmídeo resultando em umfenótipo instável, pode ser evitado. A TN9 foi transformada com cada um dosplasmídeos linearizados pPGK-GLNl e pPGK-GLTl, resultando em cepasTNl5 e TNl7, respectivamente. Foi verificado por análise de PCR que opromotor constitutivo forte de PGK foi inserido no cromossoma em frentedos genes estruturais, codificando a sintetase de glutamina e sintase deglutamato, respectivamente. A TN17 foi cultivada em meio YPD não seletivode 100 gerações de modo a remover a resistência contra a geniticina porrecombinação homóloga das repetições diretas, flanqueando o gene deresistência no cromossoma. Isto resultou no isolamento da cepa TNl 8 quetinha perdido a resistência a geniticina, mas mantinha o promotor forte àfrente da GLT1. A TNl8 foi transformada com pPGK-GLNl como descritoacima, resultando na cepa TN19 com o promotor de PGK inserido em frentetanto da GLNl quanto da GLTl no cromossoma. A Tabela 6 lista os fenótiposde todas as cepas que foram cultivadas em reatores de batelada neste estudo.

TABELA 6

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Tabela 6. Fenótipos das cepas cultivadas nas fermentações de bateladaanaeróbicas neste estudo.

Cultivos por batelada limitados a glicose. A fisiologiaanaeróbica das cepas de S. cerevisiae geneticamente planejadas foi estudadanos cultivos por batelada com a glicose como a fonte de carbono principal efonte de nitrogênio de amônio. Isto foi feito para quantificar o efeito dasmudanças genéricas nas atividades específicas da enzima de Gdhlp, Gdh2p,Gltlp e Gln lp, a taxa específica de desenvolvimento máximo, Hmax, e nosrendimentos do produto.

As atividades específicas da enzima foram medidas nosextratos de proteína a partir das amostras de biomassa retiradas dosbiorreatores quando as células estavam na fase de crescimento exponencial(Tabela 7).TABELA 7

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Tabela 7. Os rendimentos do produto de cepas TNl5 TN9, TN15, TN17 eTN19 nos cultivos por batelada limitados a glicose anaeróbicos que foramrealizados neste estudo. Unidade: c-moles do produto por c-mol de glicose.

Como observado mais no princípio, a atividade dasdesidrogenases de glutamato dependentes de NADPH na cepa TNl foi de 50a 100 vezes mais elevada do que as enzimas remanescentes envolvidas naassimilação do amônio. Isto demonstrou a importância desta enzima nascélulas tipo silvestres durante o desenvolvimento com amônio como a fontede nitrogênio. Nenhuma atividade de Gdhlp pode ser detectada nos extratosdas quatro cepas onde a GDHl foi anulada. Assim, a GDH3p não tevenenhum papel fisiológico nesta formação da cepa quando o amônio foi usadocomo fonte de nitrogênio. A atividade da desidrogenase de glutamatodependente de NADH, codificada por GDH2, foi de aproximadamente 2,5vezes mais elevada na cepa TN9 do que observado no tipo silvestre haplóide.

Como descrito mais no princípio, este aumento provavelmente foi devido aum aumento na concentração intracelular de glutamina uma vez que estemetabólito reprime a expressão de GDH2 no nível transcricional (Nissen etal., 1998a). Esta diminuição pode ser devido a uma limitação na taxa dasíntese de glutamato nas células com uma anulação na GDHL Um aumentoquase similar na atividade Gdh2p foi observado na cepa TN15, indicando quea expressão excessiva do gene estrutural para a sintetase de glutamina apenasresultou em um aumento limitado na concentração intracelular de glutamina.

Nas cepas TN17 e TNl 9, a atividade Gdh2p foi reduzida para um nívelpróximo a aquele observado na TN1. Assim, um aumento na concentração deglutamina intracelular para o tipo silvestre provavelmente foi alcançado pelaexpressão excessiva da sintase de glutamato, resultando em um aumento nataxa da síntese do glutamato. A inserção do promotor constitutivo forte dePGK em frente da GLNl no cromossoma de TN15 e TN19 resultou em umaumento na atividade específica da sintetase de glutamina deaproximadamente 0,010 unidades por mg de proteína celular total (TCP) nascepas TNl e TN9 para 0,068 e 0,062 unidades por mg de TCP,respectivamente. A inserção do promotor à frente da GLTl resultou em umaumento de cinco vezes na atividade da sintase de glutamato nas cepas TN17e TNl9 comparado com as outras três cepas. Assim, foi concluído que o novopromotor foi inserido correto no cromossoma e que isto resultou no aumentoesperado nas atividades específicas da sintetase de glutamina e sintase deglutamato.

Na figura 10, a produção de biomassa nas fases decrescimento exponencial de TN1, TN9, TN17 e TN19 como funções dotempo são descritas. A anulação de GDHl resultou em uma redução na taxaespecífica de desenvolvimento máximo, μ^, de 0,41 h"1 na cepa TNl para0,21 h"1 na cepa TN9 (Figura 10). Como mencionado mais no princípio, istoprovavelmente foi devido a uma redução na taxa da síntese de glutamato,uma vez que as atividades totais das enzimas que potencialmente podemsubstituir o papel fisiológico de Gdhlp, Gdh2p e Gltlp, foi 15 vezes maisbaixa do que a atividade específica de Gdhlp em TN1. A expressão excessivade GLNl em TN9, resultando na cepa TNl5, deu apenas um pequenoaumento na taxa específica de desenvolvimento máximo, para 0,24 h"1(resultados não mostrados). Este efeito muito limitado do aumento naatividade Glnlp foi provavelmente devido a um fluxo ligeiramente maiselevado em direção a síntese de glutamina. Como descrito mais no princípio,a glutamina é um dos substratos na reação, catalisada pela sintase deglutamato, em que o glutamato é formado quando a GDHl é anulada. Aexpressão excessiva de GLNl na TN15 provavelmente remove uma limitaçãono suprimento de glutamina na reação catalisada por Gltp5 que resulta noaumento observado na μ^. A expressão excessiva de GLTl tinha um efeitosignificativo na taxa específica de desenvolvimento máxima da TNl7. Umaumento para 0,31 h"1 foi observado. Isto claramente demonstrou que aredução na taxa de desenvolvimento da TN9 foi causada por uma taxa baixada síntese de glutamato, e que esta limitação pode ser parcialmente removidapela construção de uma cepa com uma atividade específica elevada da sintasede glutamato. A expressão excessiva tanto da GLTl quanto da GLNl foiobtida na TN19. Isto levou a um outro aumento na taxa específica dedesenvolvimento máximo para 0,37 h"1. Assim, o aumento na atividadeespecífica da sintetase de glutamina tinha um efeito mais pronunciado na taxaespecífica de desenvolvimento em uma cepa, onde a atividade específica dasintase de glutamato foi elevada comparada com uma cepa com um nível tiposilvestre de atividade. Isto indicou que a expressão excessiva somente daGLTl provavelmente resultou em depleção na combinação intracelular deglutamina, que limitou o efeito do aumento na atividade específica de Gltlpna TNl7. Esta limitação foi aparentemente removida pela expressãoexcessiva do gene estrutural codificando a sintetase da glutamina.

O consumo de glicose e a produção de etanol, acetato,piruvato, succinato, biomassa e dióxido de carbono foram medidos nasamostras filtradas retiradas dos cultivos por batelada de TNl, TN9, TNl5,TNl7 e TNl9. Nenhuma variação entre as cinco cepas na formação dosácidos orgânicos foram detectados e assim, apenas a produção total destesmetabólitos é listada na Tabela 8.TABELA 8

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Tabela 8. As atividades específicas das desidrogenases de glutamatodependente de NADPH e dependente de NADH e sintetase de glutamina esintase de glutamato nos extratos de proteína de amostras de biomassaretiradas nas fases de crescimento exponenciais das cepas TNl, TN9, TN15,TNl7 e TNl9 nos cultivos de batelada limitados por glicose anaeróbicos.

As Figuras 11, 12 e 13 mostram o consumo de glicose e aprodução de etanol, glicerol e dióxido de carbono como funções de temponos cultivos de cepas TNl5 TN9 e TNl9, respectivamente. Toda formação decultivos de etanol, glicerol e dióxido de carbono parou imediatamente após adepleção da glicose no meio. Nenhum consumo dos produtos foi detectado jáque os biorreatores foram pulverizados com nitrogênio, que demonstrou queas condições de desenvolvimento anaeróbicos foram obtidas nos cultivos. Aredução em μ^ de TN9 resultou em um aumento na duração da fermentaçãoanaeróbica da fonte de carbono de 3,5 horas comparado com a TNl. Esteprolongamento do tempo de fermentação foi significativamente reduzido nacepa TNl9. Aqui, a fermentação durou 40 minutos mais longo do que oobservado nos cultivos de TN1. Um aumento relativo na produção de etanolde 8% foi medido nos cultivos de TN9 comparado com TN1, enquanto adiminuição relativa na produção de glicerol foi medida em 38% (tabela 8).

Como descrito mais no princípio, isto foi devido a formação de glutamatopelas reações de consumo de NADH e ATP, catalisado por sintase deglutamato e sintetase de glutamina na TN9 comparado com a formação deglutamato pela reação de consumo de NADPH catalisado por desidrogenasede glutamato I em TN1. O aumento no consumo de ATP na síntese dabiomassa resultou em uma redução da produção da biomassa em TN9, por6%. A expressão excessiva somente da GLNl não tinha nenhuma influênciasignificativa na formação do produto da cepa TNl 5 comparada com a TN9.

O aumento de cinco vezes na atividade específica da sintase de glutamato quefoi obtido pela expressão excessiva de GLTl na cepa TN17 resultou em umpequeno aumento na produção de etanol e um pequeno aumento similar naformação da biomassa. Isto indicou que o fluxo total através das reaçõescatalisadas por Gltlp e Glnlp provavelmente foi ligeiramente mais elevadona TN17 comparado com a TN9 que resultou em um aumento no custo deATP da síntese da biomassa. Nenhuma diminuição na formação de glicerolfoi detectada. Assim, a diferença na formação de etanol de TNl7 e TN9 podeser um artefato causado por pequenos erros na medição de etanol. O desviopadrão nos rendimentos de etanol obtidos nos cultivos anaeróbicos da mesmacepa foi de 3,5 a 4,1%. A expressão excessiva tanto da GLNl quanto daGLTl na cepa TNl9 não resultou em quaisquer mudanças na formação doproduto comparado com a TNl7.

EXEMPLO 3

Expressão de uma atividade da transidrogenase em Lactococcus laetis Eeseheriehia eoli

Introdução

eth, codificando a transidrogenase citoplásmica deAzotobacter vünelandii, foi clonado por PCR usando iniciadores BglII-cth(5 '-tacgaagatctGCTGTATATAACTACGATGTGGTGG-3'), (SEQ IDNO: 13) e CTH-XhoI (5 '-tagcactcgagttaAAAAAGCCGATTGAGACC-3')(SEQ ID NO: 14) e polimerase pfu. O fragmento de DNA resultante foidigerido com a enzima de restrição BflII e XhoI e inserido no sítio demúltiplas clonagens do vetor de transporte de E. eoli/L. laetis pTRKH2-pl70atrás de um derivado constitutivo forte do promotor ρ 170 (S. M. Madsen, J.Arnau, A. Vrang, M. Givskov e H. Israelsen (1999). Molecular Mierobiology32, 75-87). O plasmídeo resultante foi significado pTRKH2-pl 70-cth. Aregião promotora do vetor e o cth foram sequenciados, por meio da qual foiverificado que o gene foi inserido corretamente no vetor de transporte.

E. coli DH5a e L. Iactis subs. cremosis foram ambastransformadas com pTRKH2-pl 70-cth e os transformantes foramselecionados em placas contendo meio complexo (LB e GM13,respectivamente), suplementados com eritromicina. Os transformantespTRKH2-p 170-cth independentes tanto de E. coli quanto de L. Iactis foramdesenvolvidos em frascos de agitação em meio LB e meio GM13,respectivamente, suplementados com eritromicina. Na fase atrasada dedesenvolvimento exponencial, as amostras de célula foram retiradas dosfrascos de agitação e as combinações de proteína das células foram extraídas.

As combinações de proteína extraídas foram testadas poratividade da transidrogenase citoplásmica. Os resultados são listados abaixo.

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Dos dados foi concluído que a transidrogenase citoplásmicafoi bem-sucedidamente expressa tanto na E. coli quanto na L. Iactis.REFERÊNCIAS E LITERATURA CITADAS

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<101> Nielsen3Jens

Nissen3 Torben L

<120> Célula microbiana metabolicamente planej ada com uma produção

metabólita alterada<130> 29944/JL<140><141>

<150> PA 1998 00967<151> 1998-07-10<160> 14

<170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 1395<212> DNA

<213 > Azotobacter vinelandii<220>

<221> CDS<222> (1)...(1395)

<223> s em pos 15 é c ou g; Xaa é Asn ou Lys;

r em pos 363 é a ou g; r em pos 711 é a ou g;m em pos 912 é a ou c;Xaa é Asn ou Lyz<400> 1

atg gct gta tat aasMet Ala Val Tyr Xaa

tac gat gtg gtg gtaTyr Asd Val Val Val10

ate ggc aca ggc cct gct 4 8Ile Gly Thr Gly Pro Ala15

1 5

ggc gaa ggg gea gcg atg aat gcc gtgGly Glu Gly Ala Ala Met Asn Ala Val

aag gcc ggg cgc aag gta gcg 96Lys Ala Gly Arg Lys Val Ala30

20

25

gtc gtg gat gat cgc cccVal Val Asp Asp Arg Pro35

cag gtc ggcGln Val Gly40

ggc aac tgc acc cac ctc gga 14 4Gly Asn Cys Thr His Leu Gly45

acc att ccc tcc aag gcg ctg cgc cac tcg gtg cgg cag ate atg cag 192Thr Ile Pro Ser Lys Ala Leu Arg His Ser Val Arg Gln-Ile Met Gln50 55 60

tac aac aac aat ccg ctg ttc cgc cag ate ggc gag ccg cgc tgg ttt 240

Tyr Asn Asn Asn Pro Leu Phe Arg Gln Ile Gly Glu Pro Arg Trp Phe65 70 75 80

tec ttc gcc gat gtc ctg aag age gcc gag cag gtc ate gcc aag cagSer Phe Ala Asp Val Leu Lys Ser Ala Glu Gln Val Ile Ala Lys Gln85 90 95

288

gtt tcc tcg cgg acc ggc tac tat gcg cgc aac cgt ate gat acc ttc 336Val Ser Ser Arg Thr Gly Tyr Tyr Ala Arg Asn Arg Ile Asp Thr Phe100 105 110

ttc ggg acc gcg age ttc tgc gac gar cac acc ate gag gtc gtc cac 384Phe Gly Thr Ala Ser Phe Cys Asp Glu His Thr Ile Glu Val Val His115 120 125

etc aac ggt atg gtg gaa acg ctg gtg gcc aag cag ttc gtc ate gcc 432Leu Asn Gly Met Val Glu Thr Leu Val Ala Lys Gln Phe Val Ile Ala130 135 140

acc ggg tcg cgt ccc tac cgc ccg gcc gat gtc gat ttc acc cat ccgThr Gly Ser Arg Pro Tyr Arg Pro Ala Asp Val Asp Phe Thr His Pro145 150 155 160

cgc ate tac gac age gac acc ate etc age ctc ggc cac acg ccg cgc

Arg Ile Tyr Asp Ser Asp Thr Ile Leu Ser Leu Gly His Thr Pro Arg165 170 175

cgg ttg acc ate tac gga gcg ggg gtg ate ggc tgc gaa tat gcc tcc

Arg Leu Ile Ile Tyr Gly Ala Gly Val Ile Gly Cys Glu Tyr Ala Ser180 185 190

528

576

ate ttc agt ggg ctg ggc gtg ctg gtc gac ctc ate gac aac cgc gacIle Phe Ser Gly Leu Gly Val Leu Val Asp Leu Ile Asp Asn Arg Asp195 200 205

624

eaa ctg ctc agt ttc ctcGln Leu Leu Ser Phe Leu210

cac ctg cgc aac aac aacHis Leu Arg Asn Asn Asn225 230

cgt gtc gaa ggc ctg gacArg Val Glu Gly Leu Asp

gac gac gaa ate tcc gacAsp Asp Glu Ile Ser Asp215 220

gtg ctg ate cgc cac aacVal Leu Ile Arg His Asn235

aac ggg gtg ate ctg cacAsn Gly Val Ile Leu His

tcg ctc age tac 672Ser Leu Ser Tyr

gar gaa tac gag 720Glu Glu Tyr Glu240

ctc aag tcc ggc 768Leu Lys Ser Gly245 250 255

aag aag ate aag gcc gac gcc ttc ctg tgg age aac ggc cgt acc ggc 816

Lys Lys Ile Lys Ala Asp Ala Phe Leu Trp Ser Asn Gly Arg Thr Gly260 265 270

aat acc gac aag ctg ggc ctg gag aac ate ggt etc aag gcc aat ggt 864

Asn Thr Asp Lys Leu Gly Leu Glu Asn Ile Gly Leu Lys Ala Asn Gly

275 280 285

cgc gga cag ate cag gtc gac gag cac tac cgt acc gaa gtc age aam 912

Arg Gly Gln Ile Gln Val Asp Giu His Tyr Arg Thr Glu Val Ser Xaa

290 295 300

att tat gcc gct ggt gac gtg ate ggc tgg ccg age ctg gcc age gcc 960

Ile Tyr Ala Ala Gly Asp Val Ile Gly Trp Pro Ser Leu Ala Sèr Ala305 310 315 320

gcc tac gac cag ggt cgt teç gcc gcg ggc agr ate acc gag aac gat 1008

Ala Tyr Asp Gln Gly Arg Ser Ala Ala Gly Ser Ile Thr Glu Asn Asp325 330 335

age tgg cgt ttc gtc gac gac gcg ccg acc ggc ate tac acc att ccg 1056

Ser Trp Arg Phe Val Asp Asp Val Pro Thr Gly Ile Tyr Thr Ile Pro340 345 350gag ate agt tcg gtc ggc aag acc gag cgc gaa ctg acc cag gcg aag 1104Glu Ile Ser Ser Val Gly Lys Thr Glu Arg Glu Leu Thr Gln Ala Lys355 360 365

gtt ccc tac gag gtc ggc aag gcc ttc ttc aag ggc atg acc cgg gea 1152Val Pro Tyr Glu Val Gly Lys Ala Phe Phe Lys Gly Met Ala Arg Ala370 375 380

cag ate gcc gtc gag aag gcc ggc atg ctg aag ate etc ttt cac cgc 1200Gln Ile Ala Val Glu Lys Ala Gly Met Leu Lys Ile Leu Phe His Arg385 390 395 400

gag acg ctg gaa ate ctc ggc gtg cac tgc ttc ggc tat cag gct tcg 1248Glu Thr Leu Glu Ile Leu Gly Val His Cys Phe Gly Tyr Gln Ala Ser405 410 415

gaa ate gtc cat ate ggc cag gcg ate atg aac cag aag ggc gag gcg 1296Glu Ile Val His Ile Gly Gln Ala Ile Met Asn Gln Lys Gly Glu Ala420 425 430

aat acc ctc aag tat ttc ate aac acc acc ttc aac tac ccg acc atg 134 4Asn Thr Leu Lys Tyr Phe Ile Asn Thr Thr Phe Asn Tyr Pro Thr Met

435 440 445

gcc gag gcc tac cgg gtg gcg gcc tac gac ggt ctc aat cgg ctt ttt 1392Ala Glu Ala Tyr Arg Val Ala Ala Tyr Asp Gly Leu Asn Arg Leu Phe450 455 460

tSa 1395

465<210> 2

<211> 464

<212> PRT

<213> Azotobacter vinelandii

<400> 2

Met Ala Val Tyr Xaa Tyr Asp Val Val Val Ile Gly Thr Gly Pro Ala1 5 ίο 15

Gly Glu Gly Ala Ala Met Asn Ala Val Lys Ala Gly Arg Lys Val Ala20 25 30

Val Val Asp Asp Arg Pro Gln Val Gly Gly Asn Cys Thr His Leu Gly35 40 45

Thr Xle Pro Ser Lys Ala Leu Arg His Ser Val Arg Gln Ile Met Gln50 55 60

Tyr Asn Asn Asn Pro Leu Phe Arg Gln Ile Gly Glu Pro Arg Trp Phe65 70 75 80

Ser Phe Ala Asp Val Leu Lys Ser Ala Glu Gln Val Ile Ala Lys Gln85 90 95

Val Ser Ser Arg Thr Gly Tyr Tyr Ala Arg Asn Arg Ile Asp Thr Phe100 105 HO

Phe Gly Thr Ala Ser Phe Cys Asp Glu His Thr Ile Glu Val Val His115 120 125

Leu Asn Gly Met Val Glu Thr Leu Val Ala Lys Gln Phe Val Ile Ala130 135 140

Thr Gly Ser Arg Pro Tyr Arg Pro Ala Asp Val Asp Phe Thr His Pro145 150 155 160

Arg Ile Tyr Asp Ser Asp Thr Ile Leu Ser Leu Gly His Thr Pro Arg165 170 175

Arg Leu Ile Ile Tyr Gly Ala Gly Val Ile Gly Cys Glu Tyr Ala Ser180 185 190

Ile Phe Ser Gly Leu Gly Val Leu Val Asp Leu Ile Asp Asn Arg Asp

195

200

205

Gln Leu Leu Ser Phe Leu Asp Asp Glu Ile Ser Asp Ser Leu Ser Tyr210 215 220

His Leu Arg Asn Asn Asn Val Leu Ile Arg His Asn Glu Glu Tyr Glu225 230 235 240

Arg Val Glu Gly Leu Asp Asn Gly Val Ile Leu His Leu Lys Ser Gly

245

250

255

Lys Lys Ue Lys Ala Asp Ala Phe Leu Trp Ser Asn Gly Arg Thr Gly260 265 270

Asn Thr Asp Lys Leu Gly Leu Glu Asn Ile Gly Leu Lys Ala Asn Gly275 280

285

Arg Gly Gln Ile Gln Val Asp Glu His Tyr Arg Thr Glu Val Ser Xaa290 295 3oo

Ile Tyr Ala Ala Gly Asp Val Ile Gly Trp Pro Ser Leu Ala Ser Ala305 310 315 320

Ala Tyr Asp Gln Gly Arg Ser Ala Ala Gly Ser Ile Thr Glu Asn Asp

32S 330 335

Ser Trp Arg Phe Val Asp Asp Val Pro Thr Gly Ile Tyr Thr Ue Pro340 345 350

Glu Ile Ser Ser Val Gly Lys Thr Glu Arg Glu Leu-Thr Gln Ala Lys355 360 365

Val Pro Tyr Glu Val Gly Lys Ala Phe Phe Lys Gly Met Ala Arg Ala370 375 380

Gln Ile Ala Val Glu Lys Ala Gly Met Leu Lys Ue Leu Phe His Arg385 390

395

400

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Glu Ile Val His Ile Gly Gln Ala Ile Met Asn Gln Lys Gly Glu Ala420 425 430

Asn Thr Leu Lys Tyr Phe Ile Asn Thr Thr Phe Asn Tyr Pro Thr Met435 440 445

Ala Glu Ala Tyr Arg Val Ala Ala Tyr Asp Gly Leu Asn Arg Leu Phe450 455 460

<210> 3<211> 52<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador<400> 3

attcatcgat gaattctatc ttatggtccc attctttact gcactgttta ca 52

<210> 4<211> 71<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador<400> 4

ggccactagt gatatcaaag cattctctcg ctggttaatt ttcctgtctc ttgtctatca 60gcacttaaaa a 71

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador

<400> 5

ggttttctac aatctccaaa agag 24

<210> 6<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador

<400> 6

gagagagatc ttctagaatg ctttttgata acaaaaat 38

<210> 7

<2l1> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador

<400> 7

cgcgcagatc tccgcggaga gcctaaacga ttaacaaa 38

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador

<400> 8

gtcacacaac aaggtccta 19

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador<400> 9

gcgcgggatc ctctagaatg ccagtgttga aatcagac<210> 10<211> 38<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador

<400> 10

cgcgcggatc cccgcgggct ggaccatccc aaggttcc

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador

<400> 11

gcgcgggatc ctctagaatg gctgaagcaa gcatcgaa

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador<400> 12

cgcgcggatc cccgcggtta tgaagattct ctttcaaa

<210> 13<211> 36<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador

<400> 13

tacgaagatc tgctgtatat aactacgatg tggtgg

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador

<400> 14

tagcactcga gttaaaaaag ccgattgaga cc

Claims

1. Célula microbiana recombinante, caracterizada pelo fato decompreender:i) uma atividade de enzima exprimível aumentada controlandoo metabolismo anabólico de amônia na dita célula como uma fonte denutriente, dita atividade de enzima aumentada sendo uma atividadedependente de NADH que catalisa uma reação selecionada do grupo queconsiste de:(a) 2-Oxoglutarato + NH/ + NADH Glutamato + NAD+(b) 2-Oxoglutarato + Glutamina + NADH -» 2 Glutamato + NAD+e(c) Glutamato + NH/ + ATP -> Glutamina + ADP + Piou uma combinação de (b) e (c),em que a atividade de enzima aumentada é aquela de umaenzima codificada por uma seqüência codificadora de ácido nucleico ligada aum sinal de expressão não naturalmente associado com a dita seqüência quecodifica ácido nucleico, e é aumentada quando comparada à expressão daatividade de enzima quando dita seqüência que codifica ácido nucléico estáassociada ao seu sinal de expressão natural,eii) uma atividade de enzima exprimível reduzida ou eliminadacontrolando o metabolismo anabólico de amônia na dita célula como umafonte de nutriente, dita atividade de enzima reduzida ou eliminada sendo umaatividade glutamato desidrogenase dependente de NADPH naturalmentepresente e sendo reduzida quando comparada ao nível natural de atividade ousendo eliminada.

2. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a dita célula compreende: uma atividade deenzima exprimível aumentada que catalisa a reação (b) e uma segundaatividade de enzima exprimível aumentada que catalisa a reação (c).

3. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1caracterizada pelo fato de que a dita célula compreende uma atividade deenzima exprimível adicional, dita atividade de enzima exprimível adicionalcontrolando um sistema redox intracelular da dita célula, dita atividade deenzima exprimível adicional sendo operacionalmente ligada a um sinal deexpressão não naturalmente associada com dita atividade de enzimaadicional.

4. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a dita atividade de enzima exprimível adicionalresulta em um nível aumentado de pelo menos uma coenzima intracelular emsua forma oxidada ou reduzida.

5. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a dita coenzima em sua formaoxidada/reduzida é FAD/FADH2, NAD/NADH ou NADP/NADPH.

6. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a dita atividade de enzima exprimível adicionalé uma atividade de transidrogenase intracelular.

7. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que de que a dita atividade de transidrogenase éheteróloga à dita célula.

8. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a dita atividade de transidrogenase éapresentada por um polipeptídeo que é localizado no citoplasma de umorganismo hospedeiro natural.

9. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a dita célula não compreende nenhumaatividade de transidrogenase endógena.

10. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a dita atividade de transidrogenase intracelularé uma atividade de transidrogenase de nucleotídeo de piridina codificada porCTH de Azotobacter vinelandii quando abrigada por Saccharomyceseerevisiae TN4 depositada sob Número de Acesso DSM 12267, ou umaatividade funcionalmente equivalente.

11. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que compreende uma atividade de enzimaexprimível aumentada que catalisa a reação (b), que é provida por umaglutamato sintase.

12. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que a dita glutamato sintase é uma glutamatosintase de Saccharomyees eerevisiae.

13. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que a dita glutamato sintase é aquela codificada porGLTl de Saccharomyees eerevisiae como depositada sob Número de AcessoDSM 12275.

14. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que compreende uma atividade de enzimaexprimível aumentada que catalisa a reação (c), que é provida por umaglutamina sintetase.

15. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 14,caracterizada pelo fato de que a dita glutamina sintetase é uma glutaminasintetase de Saccharomyees eerevisiae.

16. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de que a dita glutamina sintetase é GLNl deSaccharomyces eerevisiae como depositada sob Número de Acesso DSM 12274.

17. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que compreende uma atividade de enzimaexprimível aumentada que catalisa a reação (a), em que a dita atividade deenzima aumentada é uma atividade de glutamato desidrogenase deSaccharomyces eerevisiae.

18. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que a dita atividade de glutamato desidrogenase éaquela codificada por GDH2 de Saceharomyces eerevisiae.

19. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que a dita atividade de glutamato desidrogenase éaquela de Saccharomyees eerevisiae TN22 depositada sob Número de AcessoDSM 12277, ou uma atividade funcionalmente equivalente.

20. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que uma seqüência de nucleotídeo codificando umaenzima que medeia a dita atividade glutamato desidrogenase dependente deNADPH reduzida ou eliminada e/ou uma expressão de sinal que direciona aexpressão da dita atividade foi parcial ou completamente anulada de umreplicon cromossômico e/ou um replicon extracromossômico abrigado peladita célula microbiana, produzindo assim a dita expressão reduzida oueliminada.

21. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que é uma célula de levedura geneticamentemodificada.

22. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 21,caracterizada pelo fato de que é uma levedura Saccharomyees,Schizosaccharomyces ou Piehia geneticamente modificada.

23. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a dita célula é Saccharomyees eerevisiae TM-19 como depositada sob Número de Acesso DSM 12276.

24. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a dita célula é Saccharomyees eerevisiae TN22como depositada sob Número de Acesso DSM 12277, ou uma atividadefuncionalmente equivalente.

25. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ser na forma de uma preparação congelada ou secapor congelamento.

26. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato da célula ser parcial ou completamente reconstituível.

27. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato da célula ser em uma composição que aindacompreende um portador.

28. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o portador é um portador fisiologicamenteaceitável.

29. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 27 ou-28, caracterizada pelo fato da dita composição ser uma cultura iniciadora dafermentação.

30. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a produção do primeiro metabólito ésubstancialmente aumentada quando comparada com a produção dometabólito em uma célula comparável tipo selvagem.

31. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que a produção do dito primeiro metabólito éaumentada por um fator de pelo menos 1,08.

32. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que o dito primeiro metabólito é etanol.

33. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que ainda produz um segundo metabólito, aprodução do dito metabólito sendo substancialmente diminuída quandocomparada com a produção do segundo metabólito em uma célulacomparável tipo selvagem ou uma célula microbiana comparável isolada.

34. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que o dito segundo metabólito é glicerol.

35. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ser para uso em uma preparação de um produtobebível ou um comestível.

36. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ser para uso em uma produção de produto bebívelou um comestível que produz uma quantidade aumentada do primeirometabólito que fornece uma qualidade organoléptica desejável ao ditoproduto.

37. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato da dita célula ainda produzir um segundo metabólito,a produção do dito segundo metabólito sendo substancialmente diminuídaquando comparada com a produção do segundo metabólito em uma célulacomparável tipo selvagem, a dita produção diminuída resultando em umaprovisão de uma qualidade organoléptica desejável.

38. Processo de produção de um primeiro metabólito,caracterizado pelo fato do dito processo compreender as etapas dei) cultivo da célula microbiana como definida na reivindicaçãoem um meio de crescimento adequado e sob tais condições que a ditacélula microbiana produz o dito primeiro metabólito,e opcionalmenteii) isolamento do dito primeiro metabólito em uma formaadequada,e ainda opcionalmenteiii) purificação do dito primeiro metabólito isolado.

39. Processo de construção de uma célula microbiana comodefinida na reivindicação 30, caracterizado pelo fato do dito processocompreender as etapas de operavelmente ligar uma seqüência de nucleotídeocodificando uma enzima mediando a dita atividade de enzima exprimivelaumentada com um sinal de expressão não naturalmente associada com a ditaseqüência de nucleotídeo, e reduzir ou eliminar a dita atividade de enzimaexprimivel reduzida ou eliminada da dita célula microbiana.

40. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a dita atividade de enzima exprimivel reduzida ou eliminadaé reduzida ou eliminada por operavelmente ligar uma seqüência denucleotídeo codificando uma enzima que medeia a dita atividade de enzimaexprimivel com um sinal de expressão não naturalmente associada com aseqüência de nucleotídeo, o dito sinal de expressão gerando uma expressãoreduzida da dita seqüência de nucleotídeo.