WO2009053489A1 - Fermentative herstellung von alpha-ketoglutarsäure - Google Patents

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WO2009053489A1
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microorganism
reaction system
gdh
microbial reaction
ketoglutaric acid
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PCT/EP2008/064522
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Stefan Verseck
Andreas Karau
Mitra Weber
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Evonik Degussa Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid

Definitions

  • the invention relates to a microbial reaction system which contains a microorganism with an inactive glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2; GDH) and is suitable while adhering to further measures, to a greater extent ⁇ -ketoglutaric acid (2-oxoglutaric acid, 2-oxopentanic acid, AKG) by fermentation from a C source, eg from renewable raw materials, such as glucose, sucrose, molasses, oils, fatty acids, etc. Further, a fermentative process for producing ⁇ -ketoglutaric acid by means of this reaction system will be described.
  • a C source eg from renewable raw materials, such as glucose, sucrose, molasses, oils, fatty acids, etc.
  • a fermentative process for producing ⁇ -ketoglutaric acid by means of this reaction system will be described.
  • novel microorganisms, primer sequences and plasmids for carrying out the invention.
  • ⁇ -Ketoglutaric acid is important as an intermediate for chemical synthesis and as a dietary supplement or as a component of parenterally administered food compositions.
  • ⁇ -Ketoglutaric acid is an intermediate of the citrate cycle. Aerobic degradation over the citrate cycle results in complete oxidation of the glucose derivatives to CO2. From the pyruvate formed in glycolysis, acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) is formed by oxidative decarboxylation catalyzed by the pyruvate dehydrogenase complex (PDHC). Acetyl-CoA is the common intermediate of the catabolism of fuel molecules such as amino acids, fatty acids and carbohydrates that enters the Krebs cycle. Oxaloacetate condenses with the acetyl unit of acetyl-CoA to form citrate.
  • acetyl-CoA oxidative decarboxylation catalyzed by the pyruvate dehydrogenase complex
  • an isomer of citrate is oxidatively decarboxylated and ⁇ -ketoglutarate (AKG) is formed.
  • Succinyl-CoA is present by further conversion by means of oxidative decarboxylation catalysed by the ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase complex synonymously for 2-oxoglutarate dehydrogenase complex (ODHC).
  • ODHC 2-oxoglutarate dehydrogenase complex
  • Table 1 lists the enzymes of the citric acid cycle, the resulting intermediates are shown in Fig. 1.
  • Tab. 1 Citrate cycle enzymes and their reaction types
  • Another objective of the citrate cycle in addition to energy production, is to provide various precursors for the synthesis of cell components.
  • many amino acids are derived, e.g. from oxaloacetate or AKG (see Fig. 2 - precursors for the synthesis of various amino acids starting from the citric acid cycle; sa Berg, JM, Tymoczko, JL, Stryer, L. (2003): Biochemistry (5th edition), Spektrum Verlag, ISBN 3 -8274- 1303-6).
  • the precursor of ⁇ -ketoglutarate By isomerization of the citrate in the citrate cycle, the precursor of ⁇ -ketoglutarate, the isocitrate, is formed. This is oxidatively decarboxylated by isocitrate dehydrogenase (IDH) and ⁇ -ketoglutarate is present.
  • IDH isocitrate dehydrogenase
  • NADPH is used in the biosynthesis of glutamate as
  • Glutamine can be re-glutamated in a reverse reaction catalyzed by glutamate synthase (glutamine-2-oxoglutarate aminotransferase, GOGAT). AKG is reductively aminated by glutamate synthase, with glutamine acting as an N-donor.
  • glutamate synthase glutamate-2-oxoglutarate aminotransferase
  • glutamate formation is predominantly due to the sequential effects of glutamine synthetase (GS) and glutamate synthase (GOGAT).
  • the formation of glutamate proceeds through this pathway when low concentrations of ammonium are present.
  • the cause is the high K m value of the GDH for NH 4 + of approx. 1 mm .
  • the GDH is not saturated.
  • the GS has a very high affinity to NH 4 + , therefore, with a limitation, the uptake of ammonia under ATP consumption can take place.
  • This synthetic process has the disadvantage that it is not selective enough and many by-products, e.g. Glycine and other organic acids are formed.
  • the procurement or disposal of the noble metal catalyst makes another possibly biotechnological process ecologically and economically attractive.
  • n-paraffin as the carbon source.
  • Metabolism of n-alkanes occurs via oxidation by hydroxylases and is described in detail in Watkins and Morgan (Biodegradation 1990, 1 (2-3), 79-92).
  • the disadvantage is the use of n-paraffin as Carbon source that the productivity of microorganisms varies with the used chain length of the n-alkanes, and that by-products such as glutamine are often formed.
  • the invention relates to a microbial reaction system for the fermentative production of ⁇ -ketoglutaric acid containing a genetically modified microorganism and a fermentation medium, wherein
  • GDH glutamate dehydrogenase
  • the fermentation medium contains an excess of usable nitrogen for the microorganism used, wherein the glutamine synthetase (GS) and the glutamate synthase activity are attenuated, or
  • the fermentation medium contains the customary constituents, renewable raw materials preferably being used as the C source, but not paraffins.
  • coryneform bacteria in particular the species Corynebacterium glutamicum.
  • inactivation of the GDH of the envisaged microorganism can be carried out according to measures known to the person skilled in the art. Importantly, inactivation results in at least reduced GDH activity in the target strain compared to the parent strain. As measures are advantageously those following in question, selected from the group consisting of:
  • mutagenesis classical in vivo mutagenesis methods using mutagenic substances such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or ultraviolet light may be used.
  • the GDH gene described in the prior art is amplified starting from isolated total DNA of a wild-type strain with the aid of the polymerase chain reaction, optionally cloned into suitable plasmid vectors.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the skilled artisan will find, inter alia, in the handbook of Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) and Newton and Graham: PCR ( Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994).
  • methods of in vitro mutagenesis can be used as described for example in the well-known manual by Sambrook et al.
  • the fermentation medium preferably contains an excess of nitrogen usable for the organism, in particular in the form of ammonium ions.
  • excess it is meant that the reaction medium has such a concentration of ammonium ions in the form of organism-utilizable nitrogen that the GS / GOGAT system is inhibited.
  • Inhibition of the GS / GOGAT system by ammonium ions can be detected by measuring the decreased formation of glutamate (by the GS / GOGAT system) in a GDH deletion mutant depending on various high NH 4 + concentrations. Inhibition occurs as soon as the glutamate formation decreases as the ammonium ion concentration increases further. This concentration forms the lower limit of the ammonium ions to be used.
  • concentrations of ammonium ions will vary from organism to organism and will be determined by one of ordinary skill in the art through routine experimentation.
  • An upper limit is the solubility of the ammonium salts and the economy or the practicality of the process as a whole.
  • the expert has to weigh from an economic point of view, whether a further addition of ammonium ions to the reaction medium still to a recoverable effect - that is, a further increase in AKG formation - leads.
  • the concentration of ammonium ions in the form of organism-utilizable nitrogen in the reaction medium is 5-70 g / L, preferably 10-50 g / L. As a rule, the concentration will be around 20 g / L.
  • the nitrogen source there may also be used organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate become.
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea
  • inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate become.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • GS / GOGAT enzymes of the organism it is indicated, in addition to the measures described above, to inhibit the GS / GOGAT enzymes of the organism.
  • one or more suitable inhibitor compounds are added to the fermentation medium (Inhibition of homocysteine sulfonamides of glutamate synthase purified from Saccharomyces cerevisiae DS Masters Jr and A Master J. Biol. Chem., Vol. 257, Issue 15, 8711-8715, 08, Glutamine Binding Subunit of Glutamate Synthase and Partial Reactions Catalyzed by Glutamine Amidotransferase Paul P. Trotta, Karen EB Platzer, Rudy H.
  • the inhibitor methionine sulfoximine may preferably be added to the reaction medium in order to influence the GS / GOGAT system.
  • the fermentation medium contains only so much biotin that there is a limited supply of the microorganism with biotin. It turns out that increased accumulation of AKG in the reaction medium can be achieved. It is believed that this is due to a weakening of the activity of the ODHC enzyme, which is caused by a lack of biotin.
  • Biotin concentration in the medium but the biotin concentration must not fall below a value at which the essential for the organism citric acid cycle is disturbed so that the cell is no longer viable.
  • An upper limit for the biotin concentration is formed by another Increasing the biotin concentration induced no further decrease in the formed AKG.
  • a lower limit of the biotin concentration results from the fact that a further lowering of the concentration again leads to a reduced AKG formation, since the growth conditions of the organism have a negative impact here.
  • the concentration of biotin in the reaction medium should preferably be between 0.1-0.0005 g / L, preferably 0.01-0.001 g / L. As a rule, a value of approx. 2-5 ⁇ g / L will be optimal.
  • ot-ketoglutarate for the increased production of ot-ketoglutarate, it may be advantageous in the organisms prepared in the manner described to have one or more of the enzymes of the particular biosynthetic pathway, glycolysis, anaplerotic, pentose phosphate cycle, keto acid export and optionally regulatory proteins overexpress to increase ⁇ -ketoglutarate formation in the claimed organisms.
  • the use of endogenous genes is generally preferred, as well as the attenuation measures described.
  • the present invention also provides a process for the production of AKG in which the reaction system according to the invention is used.
  • the preferred embodiments described for the reaction system apply according to the method.
  • the process according to the invention is preferably carried out by culturing in a suitable reaction vessel the modified bacteria in a fermentation broth as described above and accumulating the AKG in the broth.
  • the AKG can then be isolated from the broth by known methods or concentrated together with the broth and further processed with further constituents from the fermentation broth and / or the biomass (> 0 to 100%) produced during the fermentation.
  • the process can be carried out continuously or batchwise in the batch process (batch culturing) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) or in the perfusion process (WO9501214) for the production of ⁇ -ketoglutarate.
  • the culture medium to be used must satisfy the requirements of the respective organisms in a suitable manner under the abovementioned boundary conditions. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology, of the American Society for Bacteriology (Washington, DC, USA, 1981).
  • sugars and carbohydrates such as e.g. preferably glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose or oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol and organic acids, such as acetic acid.
  • oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol and organic acids, such as acetic acid.
  • phosphorus source can phosphoric acid,
  • the culture medium must further contain salts of metals, such as magnesium sulfate or iron sulfate, necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above-mentioned substances.
  • suitable precursors can be added to the culture medium.
  • the said starting materials can be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • basic compounds such as Sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner.
  • antifoams such as, for example, fatty acid polyglycol esters, can be used.
  • Maintaining the stability of plasmids can be added to the medium suitable selective substances, such as antibiotics.
  • suitable selective substances such as antibiotics.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as air, are introduced into the culture.
  • the temperature of the culture is usually from 20 0 C to 45 ° C and preferably at 25 ° C to 40 0 C.
  • the culture is continued until a maximum of ⁇ -ketoglutarate has formed, or the yield or productivity of a desired optimum Has achieved value. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • the ⁇ -ketoglutarate prepared in this way is subsequently collected and isolated as described and optionally purified.
  • a further subject of the present invention are the intermediates required for the preparation of the mutants to be used according to the invention. These are in detail primer sequences for the amplification of the GDH gene. In particular, these are the sequences having the Seq. ID No: 1 or 2.
  • plasmids are mentioned, with which the deleted gene construct can be transfected into the organism and integrated into the genome of the organism, whereby the desired double homologous recombination can take place.
  • Suitable for this purpose are those plasmids which are not replicated in the microorganism under consideration and have a sequence which is inactive for GDH and which, however, after cloning into the microorganism lead to a double homologous recombination and thus to the inactivation of the GDH in the microorganism.
  • Very particular preference is given to the plasmid according to Fig. 5 - plasmid map of pK18mobsacB_ ⁇ GDH (SEQ ID NO: 3).
  • the most preferred deletion region is one in the GDH gene located between two EcoO109I sites.
  • One such preferred inactivating GDH gene is described in Seq. ID NO: 4 listed.
  • the starting organism used may be any microorganism which is suitable for the person skilled in the art. Organisms which produce and precipitate ⁇ -ketoglutaric acid even before the elimination of the GDH activity are preferably used. Particularly preferred are those from the group consisting of the genera Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Rhodococcus, Saccharomyces, Pichia, Yarowia, Bacillus, Aspergillus. Especially preferred as a start organism here is the genus Corynebacterium, in particular the species known in the art, Corynebacterium glutamicum. Known wild-type strains of the species Corynebacterium glutamicum are, for example
  • the invention relates to a production strain for the fermentative production of ⁇ -ketoglutarate, preferably Corynebacterium glutamicum, which has a full or partial deletion in the allele of GDH.
  • a strain is selected from the group consisting of: ATCC13032_ ⁇ GDH, DSM20411_ ⁇ GDH.
  • the enrichment of the metabolite AKG for fermentative production can be done by influencing the biosynthetic pathways (see description of the invention).
  • Example 1 Construction of deletion mutants of C. glutamicum ATCC 13032 and DSM 20411
  • C. glutamicum ATCC 13032 has already been completely determined and is freely available on the Internet in corresponding databases (Kalinowski, J., Bathe, B., Bartels, D., Bischoff, N., Bott, M., Burkovski, A , shower, N., Eggeling, L., Eikmanns, BJ, Gaigalat, L., Goesmann, A., Hartmann, M., Huthmacher, K., Krämer, R., Linke, B., McHardy, A.
  • the determination of the GDH gene sequence which codes for glutamate dehydrogenase was carried out via the NCBI database.
  • the DNA sequence is stored under Genbank X59404, X72855, BA000036 and BX927154 and the protein sequence under PIR S32227.
  • the GDH gene from C. glutamicum ATCC 13032 was first amplified and transformed into the plasmid pKl ⁇ mobsacB (Schäfer, A., Tauch, A., Jäger, W., Kalinowski, J., Thierbach, G. Pühler, A.
  • GDH forw. Eco RI: CCATTTGAGGGCGCTCGAATTCGTGGCC Seq. ID No .1
  • GDH rev. Sali: GATGAAGCCAGTCGACCCAGCCACCAAGAT Seq. ID No. 2
  • the purified DNA with a length of 2037 bp was subjected to a restriction digestion with the enzymes EcoRI and Sali (SEQ ID NO: 4) and cloned into the vector pKl ⁇ mobsacB also cut with these enzymes (see FIG. 6 - plasmid map of pKl ⁇ mobsacB GDH).
  • the plasmid pK18mo J bsacB_ ⁇ GDH (SEQ ID NO: 3) was incubated with the enzyme EcoO109I. The resulting ends were then re-religated by T 4 DNA ligase. The resulting vector pK18mobsacB ⁇ GDH carries a truncated GDH gene, which after transcription and translation no longer leads to an active GDH enzyme (Figure 5).
  • the plasmid was transferred into C. glutamicum cells ATCC 13032 and DSM 20411 by electroporation. Since the vector could not be replicated in C. glutamicum, only colony formations of the cells in the medium with kanamycin were possible, which had integrated the vector into the chromosome by means of homologous recombination.
  • the integration of the vector provides for a double presence of the flanking regions of the gene to be deleted in the genome of these mutants. However, the newly introduced region lacks the deleted sequence within the gene.
  • a second homologous recombination allows the integrated vector to be cleaved back out of the genome together with one of the two identical sequence regions. Depending on which of the two DNA regions leaves the genome, the deletion is established in the genome (55%) or the native state is restored (45%). The colonies are grown in the medium without selection pressure to favor the loss of the vector and then plated on nutrient media containing 10% sucrose. The selection of the second homologous recombination event can be carried out since the modified sacB gene is located on the vector pK18mobsacB.
  • sucrose By the presence of sucrose occurs in cells containing the vector to produce the enzyme levansucrase. The conversion of sucrose to levan gives these cells a sucrose sensitivity. Cells that can grow on sucrose-containing but not on kanamycin-containing nutrient media have lost the vector.
  • the Corynebacterium cells were first dissolved in potassium phosphate buffer such that an OD 60 O of 45 was present in each 800 .mu.l cell suspension. Subsequently, the cell suspensions were disrupted by means of ball mill or ultrasound. NADPH serves as a cofactor of the enzyme GDH. For each glutamate molecule formed, one molecule of NADPH is oxidized. At 340 nm, the absorption maximum of NADPH, NADP + shows no absorption in this wavelength range.
  • the absorption decrease at ⁇ 340 nm was monitored photometrically due to the conversion of NADPH to NADP + .
  • the measurement was carried out over a period of 5 min at 30 0 C.
  • Table 2 Comparison of the specific GDH activities of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, DSM 20411 and their GDH deletion mutants.
  • the specific activity of the ATCC 13032 strain was 2.76 ⁇ mol-mg x -min ⁇
  • the specific activity DSM 20411 was slightly lower 1.99 ⁇ mol-mg ⁇ 1 -min ⁇ 1 ).
  • the two deletion mutants showed no discernible activity.
  • the values confirm the inactivation of glutamate dehydrogenase by the deletion of the GDH gene.
  • Citric acid 1 0000 g L-I soleucine 0, 150 g FeSO 4 .7H 2 O 0, 02 g MnSO 4 .5H 2 O 0, Ol g ZnSO 4 .7H 2 O 0.032 g CuSO 4 .5H 2 O 0, 0010 g calcium D-pantothenate 0, 001 g betaine base 0, 50 g myo-inos itol 0, 10 g nicotinic acid 0, 0005 g MOPS 10 g CaCO 3 15 g
  • Example 3 Comparison of the a-ketoglutarate formation of C. glutamicum ATCC 13032 and ATCC 13032_ ⁇ GDH or DSM 20411 and DSM 20411_AGOH in minimal medium
  • FIG. 7 Comparison of the AKG accumulation of the parent strains C. glutamicum ATCC 13032 and DSM 20411 and the deletion mutants ATTC 13032_ ⁇ GDH and DSM 20411_ ⁇ GDH in the minimal medium
  • the respective deletion mutants show a higher AKG content compared to their origin strains.
  • Corynebacterium glutamicum DSM 20411 ⁇ GDH showed more than 10 times the concentration of AKG compared to the other strains. After 30 h, the doubling of the 20 h value had occurred.
  • Example 4 Compared to the oc-ketoglate taration of C. gl u tami cum ATCC 13032 and ATCC 13032_ ⁇ GDH and DSM 20411 and DSM 20411_AGOH in minimal medi cations with a reduced biotope concentration
  • This medium contained biotin at a reduced concentration (5 ⁇ g / L) over the minimal medium described above.
  • the activity of the ODHC (oxoglutarate dehydrogenase complex) is thereby reduced and the outflow of AKG in the citrate cycle (see Fig. 2) is reduced (Fig. 8 - Comparison of the AKG accumulation of the parent strains C. glutamicum ATCC 13032 and DSM 20411 and the deletion mutants ATTC 13032_ ⁇ GDH and DSM 20411_ ⁇ GDH in the minimal medium with 5 ⁇ g / L biotin).
  • Example 5 Comparison of the ⁇ -ketoglutarate formation of C. glutamicum ATCC 13032 and ATCC 13032_ ⁇ GDH or DSM 20411 and DSM 20411_AGOH in minimal medium with addition of the inhibitor of the glutamine synthetase methioninesulfoximine (MSX)
  • Example 6 Comparing the oc-ketoglate taration of C. gl u tami cum ATCC 13032 and ATCC 13032_ ⁇ GDH or DSM 20411 and DSM 20411_AGOH in minimal medi um with the addition of IM ammonium as the sole source of sticks
  • This modified minimal medium contained 1 M (NH 4 ) 2 SO 4 as the sole nitrogen source.
  • An increased ammonium concentration in the medium reduces the activity of the GS / GOGAT system.
  • the activity of GDH which is reciprocal to GS / GOGAT activity, should therefore increase.
  • the deletion of the GDH the degradation of the AKG by this enzyme is prevented and also the conversion by the GS / GOGAT system is reduced (FIG. 10 - Comparison of the AKG accumulation of the starting strains C. glutamicum ATCC 13032 and DSM 20411 as well as the deletion mutants ATTC 13032_ ⁇ GDH and DSM 20411_ ⁇ GDH in the minimal medium with 1 M ammonium sulfate as sole nitrogen source).

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Abstract

Gegenstand der Erfindung sind rekombinante mikrobielle Organismen die durch eine Inaktivierung der Glutamat Dehydrogenase (EC 1.4.1.2; GDH) und weitere beschriebenen Maßnahmen in der Lage sind, verstärkt a-Ketoglutarsaure (2-Oxoglutarsaure, 2-Oxopentandisaure, AKG) fermentativ aus einer C-Quelle, z.B. aus erneuerbaren Rohstoffen, wie Glucose, Saccharose, Melasse, Ole, Fettsauren etc. zu bilden. Weiterhin wird ein f ermentatives Verfahren zur Herstellung von a-Ketoglutarsaure mittels derartiger Mikroorganismen beschrieben.

Description

Fermentative Herstellung von OC-Ketoglutarsäure
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Reaktionssystem, das einen Mikroorganismus mit einer inaktiven Glutamat Dehydrogenase (EC 1.4.1.2; GDH) enthalt und unter Einhaltung weiterer Maßnahmen geeignet ist, in erhöhtem Umfang α-Ketoglutarsaure (2- Oxoglutarsaure, 2-Oxopentandisaure, AKG) fermentativ aus einer C-Quelle, z.B. aus erneuerbaren Rohstoffen, wie Glucose, Saccharose, Melasse, Ole, Fettsauren etc. zu bilden. Weiterhin wird ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von α- Ketoglutarsaure mittels dieses Reaktionssystems beschrieben. Ebenfalls sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Mikroorganismen, Primersequenzen und Plasmide zur Ausfuhrung der Erfindung.
α-Ketoglutarsaure ist als Zwischenprodukt für die chemische Synthese und als Nahrungserganzungsmittel oder als Bestandteil parenteral zu verabreichender Nahrungsmittelkompositionen von Bedeutung.
α-Ketoglutarsaure ist ein Zwischenprodukt des Citratzyklus . Beim aeroben Abbau über den Citratzyklus erfolgt eine vollständige Oxidation der Glucosederivate zu CO2. Aus dem in der Glycolyse gebildeten Pyruvat wird durch oxidative Decarboxylierung, die von dem Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHC) katalysiert wird, das Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) gebildet. Acetyl-CoA ist das gemeinsame Zwischenprodukt des Katabolismus der Brennstoffmolekule wie Aminosäuren, Fettsauren und Kohlenhydrate, das in den Citratzyklus eintritt. Oxalacetat kondensiert mit der Acetyleinheit des Acetyl-CoA unter der Bildung von Citrat. Anschließend wird ein Isomer des Citrats oxidativ decarboxyliert und α-Ketoglutarat (AKG) entsteht. Durch eine weitere Umwandlung mittels oxidativer Decarboxylierung, die durch den α-Ketoglutarat-Dehydrogenasekomplex synonym für 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex (ODHC) katalysiert wird, liegt Succinyl-CoA vor. Die C4-Einheit erfahrt mehrere Umsetzungen bis erneut Oxalacetat für ein neues Durchlaufen des Zykluses zur Verfugung steht.
Tabelle 1 fuhrt die Enzyme des Citratzyklus auf, die entstehenden Zwischenprodukte sind in der Abb. 1 dargestellt. Tab. 1: Enzyme des Citratzykluses und ihre Reaktionstypen
Figure imgf000003_0001
Eine weitere Aufgabe des Citratzyklusses, zusätzlich zu der Energieerzeugung, ist das Bereitstellen verschiedener Vorstufen für die Synthese von Zellbestandteilen. So leiten sich viele Aminosäuren z.B. aus Oxalacetat oder AKG ab (siehe Abb. 2 - Vorstufen für die Synthese verschiedener Aminosäuren ausgehend vom Citratzyklus; s.a. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L. (2003) : Biochemie (5. Auflage), Spektrum Verlag, ISBN 3-8274- 1303-6) .
Durch Isomerisierung des Citrats im Citratzyklus wird die Vorstufe von α-Ketoglutarat, das Isocitrat gebildet. Dieses wird von der Isocitrat-Dehydrogenase (IDH) oxidativ decarboxyliert und α-Ketoglutarat liegt vor.
Die Folgereaktion im Citratzyklus sorgt für einen Abbau des gebildeten AKGs. Eine weitere oxidative Decarboxylierung, die vom ODHC katalyisiert wird, wandelt AKG in Succinyl-CoA um.
a - Ketoglutarat + NAD+ + CoA - ODHC ϊSuccinvl - CoA + CO, + NADH
Das Succinyl-CoA wird über die Zwischenprodukte Succinat, Fumarat, Malat wieder zu Oxalacetat und der Citratzyklus kann erneut durchlaufen werden. Für die Synthese von Biomolekülen wie z.B. Aminosäuren ist Stickstoff notwendig. Seine Assimilation kann in Form von NH4 + in Aminosäuren erfolgen. Von Bedeutung sind hierbei die Aminosäuren Glutamat und Glutamin. Viele Aminosäuren erhalten ihre α-Aminogruppe durch Transaminierung der α-Aminogruppe des Glutamats oder Glutamins. Die Glutamatdehydrogenase (GDH) katalysiert die Reaktion zur Bildung von Glutamat aus AKG, das im Citratzyklus entsteht. AKG bildet mit Ammonium eine Schiff- Base. Diese Base wird anschließend protoniert wobei NADPH reduziert wird (Abb. 3 - Bildung von Glutamat aus α-Ketoglutarat mit dem Zwischenprodukt einer Schiff-Base katalysiert durch das Enzym GDH) .
NADPH dient bei der Biosynthese von Glutamat als
Reduktionsmittel. Unter der katalytischen Wirkung der Glutamin- Synthetase (GS) und den Verbrauch von ATP wird ein weiteres Ammoniumion zur Amidierung des Glutamats verwendet und auf diese Weise Glutamin synthetisiert.
Glutamat + ATP + NH3 — ^→ Glutamin + ADP + P1
Aus Glutamin kann in einer umgekehrten Reaktion, die durch Glutamat-Synthase (Glutamin-2 -Oxoglutarat-Aminotransferase, GOGAT) katalysiert wird, erneut Glutamat entstehen. AKG wird durch die Glutamat-Synthase reduktiv aminiert, wobei Glutamin als N-Donor fungiert.
a - Ketoglutarat + Glutamin + NADPH + H+ G0GAT > 2 Glutamat + NADP +
Bei niedriger Ammonium-Konzentration erfolgt die Bildung von Glutamat überwiegend durch die aufeinander folgenden Wirkungen der Glutamin-Synthetase (GS) und der Glutamat-Synthase (GOGAT) .
NH4 + +a - Ketoglutarat + NADPH + ATP → Glutamat + NADP+ + ADP + P1
Die Bildung von Glutamat verläuft über diesen Reaktionsweg, wenn niedrige Ammoniumkonzentrationen vorliegen . Ursache ist der hohe Km-Wert der GDH für NH4 + von ca . 1 mM . Bei niedrigen Konzentrationen an Ammonium ist die GDH nicht abgesättigt. Die GS besitzt eine sehr große Affinität zu NH4 +, daher kann bei einer Limitierung die Aufnahme von Ammoniak unter ATP-Verbrauch stattfinden.
Die Aktivitäten der GDH und des GS/GOGAT-Systems, die abhängig von der Ammonium-Konzentration sind, verhalten sich reziprok. Bei hohen Ammonium-Konzentrationen besitzt die GDH eine hohe Aktivität, beim GS/GOGAT-Systems ist sie jedoch vermindert. Im entgegen gesetzten Fall, bei niedrigen Konzentrationen an NH4 +, dominiert die Aktivität des GS/GOGAT-Systems über der GDH- Aktivität (Abb. 4 - Bildung und Umwandlung von α-Ketoglutarat ; Kimura, E. (2002) : Metabolie Engineering of Glutamat Production, Advances in biochemical engineering biotechnology Vol. 79, Microbial Production of L-Amino Acids, Springer Verlag, ISBN 3- 540-43383-x: 37-57; Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L. (2003) : Biochemie (5. Auflage), Spektrum Verlag, ISBN 3-8274- 1303-6) .
Das bisher gängige Verfahren zur technischen Herstellung von Ot- Ketoglutarat (AKG) basiert auf einer chemischen Transaminierung mit Glyoxalsäure plus Natrium-Glutamat und einem Edelmetal- Katalysator. Bei dieser Reaktion entstehen α-Ketoglutarsäure und Glycin als Hauptprodukte in Lösung, sowie eine Reihe von organischen Säuren als Nebenprodukte.
Dieser synthetische Prozess hat den Nachteil, dass er nicht selektiv genug erfolgt und viele Nebenprodukte, wie z.B. Glycin und andere organische Säuren gebildet werden. Auch die Beschaffung bzw. Entsorgung des Edelmetal-Katalysators macht ein anderes ggf. biotechnologisches Verfahren ökologisch und ökonomisch attraktiv.
Im Hinblick auf die fermentative Herstellung von Ot- Ketoglutarsäure werden die höchsten Titer und Produktivitäten mit Mikroorganismen (Bakterien und Hefen) erzielt, die n- Paraffin als Kohlenstoffquelle nutzen. Der Metabolismus von n- Alkanen vollzieht sich über die Oxidation durch Hydroxylasen und ist in Watkins und Morgan (Biodegradation 1990, 1(2-3), 79-92) detailliert beschrieben. Nachteilig ist bei der Nutzung von n-Paraffin als Kohlenstoffquelle, dass die Produktivität der Mikroorganismen mit der eingesetzten Kettenlänge der n-Alkane schwankt, und dass häufig Nebenprodukte wie Glutamin gebildet werden.
Weitere bakterielle Naturisolate, die in der Lage sind, 2- Oxoglutarat zu bilden, wie Arthrobacter paraffineus, Corynebacterium hydrocarboclastus, Micrococcus paraffinolyticus, Corynebacterium alkanolitecum oder Brevibacterium ketoglutamicum sind in der DE-OS 1442259 (Kyowa Hakko) und in der JP49011080 (Takeda) beschrieben.
Bei den Hefen sind als natürliche α-Ketoglutarat-Bildner Yarrowia lipolytica (DD267999) und Candida lipolytica (DE2358312) zu nennen.
Es ist nur eine Arbeit aus dem Jahre 1955 von Asai et al . (Asai, T.; Aida, K.; Sugisaki, Z.; Yakeishi, N., Journal of General and Applied Microbiology 1955, 1 308-46) bekannt, welche die Bildung von α-Ketoglutarsäure durch Bakterien aus Glukose beschreibt. Dabei wurden folgende Naturisolate eingesetzt: Pseudomonaden, Escherichia coli, Serratia marcescens, Bacillus megatherium, Bacillus natto, Bacterium succinium und Gluconobacter cerinium. Die hier erzielten Produktivitäten sind für ein technisches Verfahren allerdings nicht ausreichend.
Daher besteht immer noch die Forderung, ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von α-Ketoglutarsäure bereitzustellen, welches insbesondere anstelle von Glutamat und Glyoxalsäure von erneuerbaren Rohstoffen ausgeht. Dieses Verfahren sollte im technischen Maßstab einsetzbar und daher den im Stand der Technik beschriebenen vom ökonomischen wie ökologischen Standpunkt aus gesehen überlegen sein. Insbesondere bestand eine Aufgaben darin, die fermentative Bildung von α-Ketoglutarat durch den Einsatz biotechnologischer Maßnahmen zu erhöhen.
Eine solche Aufgabe wird durch ein Verfahren bzw. den Einsatz eines erfindungsgemäßen Reaktionssystems gemäß den vorliegenden Ansprüchen gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist ein mikrobielles Reaktionssystem zur fermentativen Herstellung von a-Ketoglutarsäure, enthaltend einen genetisch veraenderten Mikroorganismus und ein Fermentationsmedium, wobei,
a) im Mikroorganismus die Glutamatdehydrogenase (GDH) inaktiviert vorliegt und
b) das Fermentationsmedium einen Uberschuss an für den eingesetzten Mikroorganismus verwertbarem Stickstoff enthalt, wobei die Glutamin-Synthetase (GS) und die Glutamat-Synthase-Aktivitat abgeschwächt werden, oder
c) die für eine limitierte Versorgung des eingesetzten Mikroorganismus notwendige Menge an Biotin enthalt, oder
d) die Maßnahmen aus b) und c) miteinander kombiniert vorliegen .
Ansonsten enthalt das Fermentationsmedium die üblichen Bestandteile, wobei als C-Quelle bevorzugt Rohstoffe aus erneuerbaren Quellen eingesetzt werden, jedoch keine Paraffine.
Mit den beschriebenen Maßnahmen ist es überraschenderweise möglich, die Lebensfähigkeit der eingesetzten Organismen zu erhalten und siedazu zu bringen, mehr als das lOfache an AKG verglichen mit dem Ausgangsstamm zu synthetisieren. Die enorme Steigerung in der Raum/Zeitausbeute an AKG einerseits und die Tatsache, dass ein derart modifizierter Organismus unter den gegebenen und technisch besonders einfach zu realisierenden Bedingungen ausreichend lebensfähig ist, waren nicht zu erwarten .
Bevorzugt eingesetzt werden coryneforme Bakterien, insbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum.
Die Inaktivierung der GDH des ins Auge gefassten Mikroorganismus kann nach dem Fachmann bekannten Maßnahmen erfolgen. Wichtig ist, dass eine Inaktivierung zumindest zu einer verminderten Aktivität der GDH im Zielstamm verglichen mit dem Ausgangsstamm fuhrt. Als Maßnahmen kommen vorteilhafterweise solche folgende in Frage, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(Teil) Deletion, Insertion, Mutation Austausch der Promotoren gegen einen schwächeren Promoter als ursprünglich vorhanden
Anti-sens DNA oder RNA
in Frage. Entsprechende Methoden zur Inaktivierung von Genen sind zusammengefasst im Handbook of Corynebacterium glutamicum
(ed. Eggeling, L., Bott, M. (2005), CRC Press) beschrieben. Ganz besonders bevorzugt ist die Maßnahme, bei der ein Teil oder das komplette Gen, welches für die GDH des Organismus kodiert aus diesem entfernt wird, bei der also die Inaktivierung der GDH durch Deletion erfolgt, so dass keine oder lediglich eine inaktivierte GDH im Organismus gebildet wird.
Biotechnologische Methoden zur Herstellung der entsprechenden Mutanten sind dem Fachmann hinreichend geläufig (Pühler et al . Bio/Technology 9, 84-87 (1991), Peters-Wendisch et al .
(Microbiology 144, 915 - 927 (1998)) . Dabei kann es sich um in- vivo oder in-vitro Methoden handeln.
Für die Mutagenese können klassische in vivo Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl- N ' -Nitro-N-Nitrosoguanidin oder ultraviolettes Licht verwendet werden .
Weiterhin können für die Mutagenese in-vitro Methoden wie beispielsweise eine Behandlung mit Hydroxylamin (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, 1992) oder mutagene Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) oder die Polymerasekettenreaktion (PCR) , wie sie im Handbuch von Newton und Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994) beschrieben ist, verwendet werden.
Weitere Anleitungen zur Erzeugung von Mutationen können dem
Stand der Technik und bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Bei Verwendung von in-vitro Methoden wird das im Stand der Technik beschriebene GDH Gen ausgehend von isolierter Gesamt-DNA eines Wildtypstammes mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert , gegebenenfalls in geeignete Plasmidvektoren kloniert. Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) . In gleicher Weise können auch Methoden der in-vitro Mutagenese verwendet werden wie sie beispielsweise in dem bekannten Handbuch von Sambrook et al . (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, USA, 1989) beschrieben sind. Entsprechende Methoden sind auch kommerziell in Form sogenannter „kits" wie beispielsweise der von Papworth et al. (Strategies 9(3), 3-4 (1996)) beschriebene „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit" der Firma Stratagene (La Jolla, USA) verfügbar. Die GDH-Deletion kann durch das Verfahren des Genaustausches
(„gene replacement") , wie es bei Schwarzer und Pühler
(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) oder Peters-Wendisch et al .
(Microbiology 144, 915 - 927 (1998)) beschrieben ist, in geeignete Stämme eingeführt werden. Das entsprechende verkürzte GDH Allel wird hierbei in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor wie beispielsweise pKlδmobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al . , Journal of Bacteriology 174: 5462-65
(1992)) oder pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al . , Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross- over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation.
Zur Erreichung des gesetzten Zieles kann unter zur Hilfenahme des Vektors pK18mobsacB - wie beschrieben - in verschiedenen Corynebacterien eine Deletion des GDH-Gens im Chromosom der Bakterienzellen eingeführt werden, die eine Aufhebung der Aktivität der Glutamatdehydrogenase zur Folge hat. Die Geninaktivierung wurde durch Sequenzierung und Ermittlung der spezifischen Enzymaktivitaten der Glutamatdehydrogenase der verwendeten Stamme bestätigt.
Das Fermentationsmedium enthalt bevorzugt einen Uberschuss an für den Organismus verwertbarem Stickstoff, insbesondere in Form von Ammoniumionen. Unter Uberschuss ist gemeint, dass das Reaktionsmedium eine solche Konzentration an Ammoniumionen in Form von für den Organismus verwertbaren Stickstoffs aufweist, so dass das GS/GOGAT-System gehemmt wird. Eine Hemmung des GS /GOGAT-Systems durch Ammoniumionen (Inhibitorische Konzentration) kann nachgewiesen werden durch die Messung der verminderten Glutamat-Bildung (durch das GS/GOGAT-System) in einer GDH Deletionsmutante in Abhängigkeit von verschiedenen hohen NH4 + Konzentrationen. Eine Hemmung liegt vor, sobald die Glutamat-Bildung bei weiter fortschreitender Erhöhung der Ammoniumionenkonzentration absinkt. Diese Konzentration bildet die Untergrenze der einzusetzenden Ammoniumionen.
Diese Konzentrationen an Ammoniumionen sind von Organismus zu Organismus verschieden und werden vom Fachmann innerhalb seines Könnens durch Routineexperimente bestimmt. Eine Obergrenze bildet die Loslichkeit der Ammoniumsalze sowie die Wirtschaftlichkeit oder auch die Praktikabilitat des Verfahrens insgesamt. Hier hat der Fachmann unter ökonomischen Gesichtspunkten abzuwägen, ob ein weiterer Zusatz an Ammoniumionen zum Reaktionsmedium noch zu einem verwertbaren Effekt - sprich eine weitere Erhöhung der AKG-Bildung - fuhrt.
In der Regel liegt die Konzentration an Ammoniumionen in Form von für den Organismus verwertbaren Stickstoffs im Reaktionsmedium bei 5 - 70 g/L, bevorzugt bei 10 - 50 g/L. In der Regel wird die Konzentration bei ca. 20 g/L liegen.
Als Stickstoffquelle können auch organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es angezeigt, zusätzlich zu den oben beschriebenen Maßnahmen, die GS/GOGAT-Enzyme des Organismus zu inhibieren. Dazu werden eine oder mehrere geeignete Inhibitor-Verbindungen dem Fermentationsmedium zugesetzt (Inhibition of homocysteine Sulfonamide of glutamate synthase purified from Saccharomyces cerevisiae DS Masters Jr and A Meister J. Biol. Chem., Vol. 257, Issue 15, 8711-8715, 08, 1982; Glutamine-Binding Subunit of Glutamate Synthase and Partial Reactions Catalyzed by this Glutamine Amidotransferase Paul P. Trotta, Karen E. B. Platzer, Rudy H. Haschemeyer, Alton Meister Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 71, No. 11 (Nov., 1974), pp . 4607-4611) . Als solche kommen insbesondere die der folgenden Gruppe in Frage: D-Glutamin, Ethionine Sulfon, L-Albizziin, Homocystein-Sulfonamide, Methionin-Sulfone, Methionin-Sulfoximine und Methionin- Sulfoxide. Es zeigt sich, dass hierdurch eine weitere Erhöhung der Produktivität der Organismen bei der Herstellung von AKG eintritt .
Bevorzugt kann zur Beeinflussung des GS /GOGAT-Systems der Inhibitor Methioninsulfoximin dem Reaktionsmedium zugesetzt werden .
Das Fermentationsmedium enthält in einer bevorzugten Ausführungsform nur so viel Biotin, dass eine limitierte Versorgung des Mikroorganismus mit Biotin vorliegt. Es zeigt sich, dass dadurch eine erhöhte Anreicherung von AKG im Reaktionsmedium erreicht werden kann. Man nimmt an, dass dies durch eine Schwächung der Aktivität des ODHC-Enzyms, die durch einen Mangel an Biotin hervorgerufen wird, bedingt ist.
Der Fachmann ist im Prinzip frei in der Wahl der
Biotinkonzentration im Medium, doch darf die Biotinkonzentration nicht unter einen Wert sinken, bei dem der für den Organismus essentielle Zitronensäurezyklus so gestört wird, dass die Zelle nicht mehr lebensfähig sind. Eine Obergrenze für die Biotinkonzentration wird dadurch gebildet, dass eine weitere Erhöhung der Biotinkonzentration keine weitere Abnahme der gebildeten AKG induziert. Eine untere Grenze der Biotinkonzentration ergibt sich durch die Tatsache, dass eine weitere Absenkung der Konzentration wieder zu einer verminderten AKG-Bildung führt, da die Wachstumsbedingungen des Organismus hier negativ zu Buche schlagen. Innerhalb dieser Grenzen wird der Fachmann die Konzentration an Biotin an wirtschaftlichen Erwägungen orientieren. Die Konzentration des Biotins im Reaktionsmedium sollte vorzugsweise zwischen 0,1-0,0005 g/L, bevorzugt bei 0,01 - 0,001 g/L liegen. In der Regel wird ein Wert von ca. 2-5 μg/L optimal sein.
Zusätzlich kann es für die gesteigerte Produktion von Ot- Ketoglutarat vorteilhaft sein, in den auf die beschriebene Weise hergestellten Organismen eines oder mehrere der Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentosephosphat-Zyklus, des Ketosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren, um die α-Ketoglutarat Bildung in den beanspruchten Organismen zu erhöhen. Die Verwendung endogener Gene wird ebenso wie bei den beschriebenen Maßnahmen der Abschwächung im Allgemeinen bevorzugt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von AKG, bei dem das erfindungsgemäße Reaktionssystem zum Einsatz kommt. Die für das Reaktionssystem beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen gelten für das Verfahren entsprechend.
Ganz besonders bevorzugt ist daher ein Verfahren, bei dem alle oben beschriebenen Maßnahmen kumulativ vorliegen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geht man bevorzugt dergestalt vor, dass man in einem geeigneten Reaktionsgefäß die modifizierten Bakterien in einer wie oben beschriebene Fermentationsbrühe kultiviert und das AKG in der Brühe akkumuliert. Das AKG kann anschließend nach bekannten Methoden aus der Brühe isoliert werden oder zusammen mit der Brühe konzentriert und mit weiteren Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der während der Fermentation erzeugten Biomasse (> 0 bis 100%) weiterverarbeitet werden. Das Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) oder im Perfusionsverfahren (WO9501214) zum Zwecke der Produktion von α-Ketoglutarat durchgeführt werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben .
Das zu verwendende Kulturmedium muss unter den oben genannten Randbedingungen in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Organismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology,, der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. bevorzugt Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Starke und Cellulose oder Ole und Fette, wie zum Beispiel Sojaol, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsauren, wie zum Beispiel Palmitinsaure, Stearinsaure und Linolsaure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Sauren, wie zum Beispiel Essigsaure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsaure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusatzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise wahrend der Kultivierung zugefuttert werden. Zur pH - Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 200C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 400C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an α-Ketoglutarat gebildet hat, beziehungsweise die Ausbeute oder Produktivität einen gewünschten optimalen Wert erreicht hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Das auf diese Weise hergestellte α-Ketoglutarat wird wie beschrieben anschließend gesammelt und isoliert und gegebenenfalls gereinigt.
Einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden die für die Herstellung der erfindungsgemäß einzusetzenden Mutanten benötigten Zwischenprodukte. Dies sind im Einzelnen Primersequenzen zur Amplifizierung des GDH-gens . Insbesondere sind dies die Sequenzen auweisend die Seq. ID No: 1 oder 2.
Weiterhin sind unter dieser Rubrik Plasmide zu nennen, mit denen das deletierte Genkonstrukt in den Organismus transfiziert und ins Genom des Organismus integriert werden kann, wodurch die gewünschte doppelte homologe Rekombination stattfinden kann. Dafür eigenen sich solche Plasmide, welche im betrachteten Mikroorganismus nicht repliziert werden und eine für eine funktionsunfähige GDH codierende Sequenz aufweisen und welche jedoch nach Klonierung in den Mikroorganismus zu einer doppelten homologen Rekombination und damit zur Inaktivierung der GDH im Mikroorganismus führen. Ganz besonders bevorzugt ist das Plasmid laut Abb. 5 - Plasmidkarte von pK18mobsacB_ΔGDH (Seq. ID NO: 3) . Die ganz bevorzugte Deletionsregion ist eine solche im GDH-Gen, welche sich zwischen zwei EcoO109I-Schnittstellen befindet. Ein solches bevorzugtes zur Inaktivität führendes GDH-Gen ist in Seq. ID NO: 4 aufgeführt.
Als Ausgangsorganismus kann jeder dem Fachmann hierfür in Frage kommende Mikroorganismus herangezogen werden. Vorzugsweise kommen Organismen zum Zuge, welche schon vor der Ausschaltung der GDH-Aktivität α-Ketoglutarsäure produzieren und ausscheiden. Besonders bevorzugt sind solche aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Rhodococcus, Saccharomyces, Pichia, Yarowia, Bacillus, Aspergillus. Besonders als Startorganismus bevorzugt ist hier die Gattung Corynebacterium zu nennen, insbesondere die in der Fachwelt bekannte Art Corynebacterium glutamicum. Bekannte Wildtypstämme der Art Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Corynebacterium glutamicum DSM 20411 Corynebacterium glutamicum DSM 20412 Corynebacterium glutamicum DSM 20598 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC 14020.
Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)) und in der US-A-5, 250, 434. Seit einigen Jahren (Liebl et al . , International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255-260 (1991)) werden coryneforme Bakterien mit Artbezeichnung „Brevibacterium flavum", „Brevibacterium lactofermentum" und,, Brevibacterium divaricatum" in die Art Corynebacterium glutamicum eingeordnet. Coryneforme Bakterien mit Artbezeichnung „Corynebacterium melassecola" gehören ebenfalls zur Art Corynebacterium glutamicum. Gegenstand der Erfindung ist ein Produktionsstamm zur fermentativen Gewinnung von α-Ketoglutarat, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, welcher eine Voll- oder Teildeletion im Allel der GDH besitzt. Ganz besonders bevorzugt ist ein Stamm ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: ATCC13032_ΔGDH, DSM20411_ΔGDH.
Die Ergebnisse der Versuche zeigen, dass die Beeinflussung der α-Ketoglutarat-Konzentration insbesondere bei den Deletionsmutanten durch oben genannte Faktoren möglich ist. Es konnte eine 76fache Steigerung bezüglich der Bildung von α-Ketoglutarat durch Erhöhung der Ammoniumkonzentration, die Zugabe von 5 mM Methioninsulfoximin und die Verringerung der Biotinkonzentration auf 5 μg/L im Minimalmedium im Stamm Corynebacterium glutamicum DSM 20411 ΔGDH im Vergleich zum Stamm ATCC 13032 ohne GDH-Deletion erreicht werden. Dagegen sind bisher keine Publikationen oder Patente bekannt, die die gezielte Entwicklung eines α-Ketoglutarat-Produzenten mittels Abschwächung des Abflusses von AKG in Richtung Glutamat durch Deletion der Glutamat Dehydrogenase, und gleichzeitiger Abschwächung des Abflusses von AKG über den Citrat-Zyklus, als auch über das GS/GOGAT-System (Glutamin Synthetase/Glutamin-2- Oxoglutarat-Aminotransferase System; Stryer, Lubert; Biochemistry, 3rd edition) beschreiben. Vor dem Hintergrund des Standes der Technik ist die vorliegende Lehre daher erfinderisch.
Beispiele
Die Anreicherung des Stoffwechselproduktes AKG zur fermentativen Gewinnung kann durch Beeinflussung der Biosynthesewege erfolgen (siehe Beschreibung der Erfindung) .
Zur Untersuchung der Auswirkung der Hemmung bzw. der Blockade der einzelnen Stoffwechselwege mit dem Ziel der AKG-Anhäufung wird eine GDH-Deletionsmutante von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 und eine GDH-Deletionsmutante von Corynebacterium glutamicum DSM 20411, bei dem es sich um einen Glutamatüberproduzenten handelt, konstruiert.
Die Beeinflussung einzelner oder mehrere Stoffwechselwege durch die Umgebungsbedingung der Zellen, verursacht durch die Medienbestandteile wurde getestet.
Anschließend wurde die Akkumulation von AKG zwischen der Deletionsmutante des C. glutamicum ATCC 13032 und dem Wildtyp ATCC 13032, sowie der Deletionsmutante des Corynebacterium glutamicum DSM 20411 und des Ursprungsstammes Corynebacterium glutamicum DSM 20411 verglichen.
Generelle Techniken
Für DNA Manipulationen wurden Standardtechniken benutzt wie sie zum Beispiel in Sambrook, J. et al . (1989), Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, angegeben sind. DNA Amplifikationen wurden mit der Taq-DNA Polymerase (Quiagen, Hilden, Germany) durchgeführt. Wenn nicht anders angegeben wurde die Polymerasen entsprechend den Angaben der Hersteller benutzt. Oligonukleotide für die PCR Amplifikationen und die Einführung von Restriktionsschnittstellen wurden von MWG-Biotech
(Ebersberg, Germany) erhalten. Der Nachweis konstruierter Stämme erfolgte durch Kolonie-PCR mit der Taq Polymerase READYMIX
(Quiagen, Hilden, Germany), sowie Plasmidpräparationen . DNA Fragmente wurden mit dem MinElute Gel Extraction Kit (Quiagen, Hilden, Germany) nach Angaben des Herstellers gereinigt und gewonnen. Plasmid DNA wurde mittels des Qiaprep spin Miniprep Kits (Quiagen, Hilden, Germany) isoliert. Alle konstruierten Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse mit nachfolgender Sequenzierung
Beispiel 1: Konstruktion der Deletionsmutanten von C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411
Das Genom des C. glutamicum ATCC 13032 wurde bereits vollständig bestimmt und ist im Internet in entsprechenden Datenbanken frei zugänglich (Kalinowski, J., Bathe, B., Bartels, D., Bischoff, N., Bott, M., Burkovski, A., Dusch, N., Eggeling, L., Eikmanns, B. J., Gaigalat, L., Goesmann, A., Hartmann, M., Huthmacher, K., Krämer, R., Linke, B., McHardy, A. C, Meyer, F., Möckel, B., Pfefferle, W., Pühler, A., Rey, D. A., Rückert, C, Rupp, 0., Sahm, H., Wendisch, V. F., Wiegräbe, I., Tauch, A. (2003) : The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-B. flavumartate-derived amino acids and vitamins, Journal of Biotechnology 104: 5-25) .
Die Ermittlung der GDH-Gensequenz, welche die Glutamatdehydrogenase codiert, erfolgte über die NCBI-Datenbank. Die DNA-Sequenz ist unter Genbank X59404, X72855, BA000036 und BX927154 und die Proteinsequenz unter PIR S32227 abgelegt. Um die Deletionsmutanten zu erhalten, wurde zunächst das GDH-Gen aus C. glutamicum ATCC 13032 amplifiziert und in das Plasmid pKlδmobsacB (Schäfer, A., Tauch, A., Jäger, W., Kalinowski, J., Thierbach, G., Pühler, A. (1994), Small mobilizable multi- purpose cloning vectors derived form the Escherichia coli Plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene 145: 69-73) kloniert. Ausgehend von diesem Plasmid (pKlδmobsacB GDH) wurde dann die Deletion im GDH-Gen eingeführt. Dieses Plasmid (pKlδmobsacB ΔGDH) mit dem verkürzten Gen wurde in den Zielorganismus transformiert. Anschließend wurden die Transformaten selektioniert und auf das deletierte Enzym hin getestet .
Das ca. 2 kb große DNA-Fragment mit der Sequenz der Glutamat Dehydrogenase wurde mit folgenden Primern amplifiziert: GDH forw. (EcoRI) : CCATTTGAGGGCGCTCGAATTCGTGGCC Seq. ID No .1 GDH rev. (Sali) : GATGAAGCCAGTCGACCCAGCCACCAAGAT Seq. ID No. 2
Die aufgereinigte DNA mit einer Länge von 2037 bp wurden einem Restriktionsverdau mit den Enzymen EcoRI und Sali unterzogen (Seq. ID NO: 4) und in den ebenfalls mit diesen Enzymen geschnittenen Vektor pKlδmobsacB kloniert (siehe Abb. 6 - Plasmidkarte von pKlδmobsacB GDH) .
Für die abschließende Konstruktion des Plasmides pK18moJbsacB_ΔGDH (Seq. ID NO: 3) wurde das Plasmid pK18/nojbsacB_GDH mit dem Enzym EcoO109I inkubiert. Die entstandenen Enden wurden anschließend mittels T4-DNA-Ligase wieder religiert. Der resultierende Vektor pK18mobsacB ΔGDH trägt ein verkürztes GDH-Gen, das nach einer Transkription und Translation nicht mehr zu einem aktiven GDH-Enzym führt (Abb. 5) .
Das Plasmid wurde in C. glutamicum-Zellen ATCC 13032 und DSM 20411 mittels Elektroporation transferiert. Da der Vektor in C. glutamicum nicht repliziert werden konnte, waren nur Koloniebildungen der Zellen im Medium mit Kanamycin möglich, die mittels homologer Rekombination den Vektor ins Chromosom integriert hatten.
Die Integration des Vektors sorgt für ein zweifaches Vorliegen der flankierenden Bereiche des zu deletierenden Gens im Genom dieser Mutanten. Im neu eingeführten Bereich fehlt jedoch die deletierte Sequenz innerhalb des Gens. Durch eine zweite homologe Rekombination kann der integrierte Vektor zusammen mit einer der beiden identischen Sequenzbereiche wieder aus dem Genom gespalten werden. Abhängig davon welcher der beiden DNA- Bereiche das Genom verlässt, wird die Deletion im Genom etabliert (zu 55%) oder der native Zustand wieder hergestellt (zu 45%) . Die Kolonien werden um den Verlust des Vektors zu begünstigen im Medium ohne Selektionsdruck angezogen und anschließend auf Nährböden, die 10 % Saccharose enthalten, ausplattiert. Die Selektion des zweiten homologen Rekombinationsereignisses kann durchgeführt werden, da sich auf dem Vektor pK18mobsacB das modifizierte sacB-Gen befindet. Durch die Anwesenheit von Saccharose kommt es in Zellen, die den Vektor beinhalten, zur Bildung des Enzym Levansucrase . Die Umsetzung von Saccharose zu Levan verleiht diesen Zellen eine Saccharose-Sensitivität . Zellen, die auf Saccharose haltigen, aber nicht auf Kanamycin haltigen Nährböden wachsen können, haben den Vektor verloren.
Beispiel 2 : Nachweis der Inaktiv ierung der Glutamatdehydrogenase in C. gl utamicum ATCC 13032_AGOH und DSM 20411_AGOH
Der Nachweis der Inaktivierung der Glutamat Dehydrogenase durch die Gendeletion wurde durch Aktivitätstests durchgeführt. Ein intaktes Gen ist für ein vollständig aktives Enzym notwendig. Durch die Deletion der ca. 500 bp liegt eine starke Veränderung der Sequenz vor, die sich auf die dreidimensionale Struktur des daraus exprimierten Enzymes auswirkt. Die gebildete Struktur kann aufgrund der fehlenden AS nicht mit der ursprünglichen Form übereinstimmen. Aufgrund dieser Veränderungen wird die Enzymaktivität beeinflusst.
Für den vergleichenden Enzymtest wurden zunächst die Corynebacterium-Zellen in Kaliumphosphat-Puffer so gelöst, dass in jeweils 800 μL Zellsuspension eine OD60O von 45 vorlag. Anschließend wurden die Zellsuspensionen mittels Kugelmühle oder Ultraschall aufgeschlossen. NADPH dient als Co-Faktor des Enzymes GDH. Für jedes gebildete Glutamat-Molekül wird eine Molekül NADPH oxidiert. Bei 340 nm liegt das Absorptionsmaximum von NADPH, NADP+ zeigt in diesem Wellenlängenbereich keine Absorption .
Zur Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität der GDH bzw. ΔGDH wurde die Absorptionsabnahme bei λ = 340 nm aufgrund der Umsetzung von NADPH zu NADP+ photometrisch verfolgt. Die Messung erfolgte über einen Zeitraum von 5 min bei 300C.
Die Ergebnisse des Enzymtests sind in Tabelle 2 zusammengefasst . Tab. 2: Vergleich der Spezifische GDH-Aktivitäten von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, DSM 20411 und deren GDH Deletionsmutanten .
Figure imgf000021_0001
Die spezifische Aktivität des Stammes ATCC 13032 lag bei 2,76 μmol-mg x-min γ , die spe zziiffiisscclhe Aktivität DSM 20411 war etwas geringer 1, 99 μmol-mg~1-min~1) .
Die beiden Deletionsmutanten zeigten keine erkennbaren Aktivitäten. Die Werte bestätigen die Inaktivierung der Glutamat Dehydrogenase durch die Deletion des GDH-Gens .
Beispiel 3 : Un tersuchung der Verhal tens von ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH in Standard-Corynebacteri um Standardmedi um
Für einen Vergleich des Wachstumsverhaltens der beiden Stämme in einer Flüssigkultur über einen längeren Zeitraum, sowie der Gewinnung erster Werte über die Beeinflussung der AKG Bildung durch die Deletion wurden die Stämme ATCC 13032 und ATCC 13032 ΔGDH in Corynebacteri um-Standardmedium kultiviert. Standardmedium
Saccharose 100 g (NH4 ) 2SO4 10 g MgSO4 * 7 H2O 1 g KH2PO4 2 g CSL 15 g
Zitronensäure 1, 0000 g L- I soleucin 0, 150 g FeSO4 * 7 H2O 0, 02 g MnSO4 * 5 H2O 0, Ol g ZnSO4 * 7 H2O 0,032 g CuSO4 * 5 H2 O 0, 0010 g Calcium- D- Pant o thenat 0, 001 g Betain Base 0, 50 g myo- Inos itol 0, 10 g Nicotinsäure 0, 0005 g MOPS 10 g CaCO3 15 g
D- (+) -Biotin 0,00050 g Thiamin-HCl 0, 0010 g Wasser ad 1 L
Hierfür wurden vier 500 mL Kolben jeweils mit 50 mL Produktionsmedium befüllt. Zu je zwei der Kolben wurde 5 mM Glutaminsäure hinzugegeben. Je zwei unterschiedliche Kolben wurden mit einem der beiden Stämme inokuliert.
Es erfolgten Probennahmen bei 0 h, 7 h, 24 h und 30 h Endprobe) die auf die Bildung α-Ketoglutarat (AKG) hin untersucht wurden. Tab. 3: Quantitative Bestimmung von AKG in den Proben des Standardmediums: + : mit 5 mM Glutaminsäure-Zusatz, - : ohne Zusatz von Glutaminsäure.
Probe AKG in g/L
ATCC 13032 O h - << 0,03
ATCC 13032 0 h + << 0,03
ATCC 13032 7 h - < 0, 03
ATCC 13032 7 h + << 0,03
ATCC 13032 24 h - 0,2
ATCC 13032 24 h + 0,2
ATCC 13032 30 h - 0,4
ATCC 13032 30 h + 0,4
ATCC 13032_ ΔGDH 0 h - << 0,03
ATCC 13032 ΔGDH 0 h + << 0, 03
ATCC 13032_ ΔGDH 7 h - < 0,03
ATCC 13032 ΔGDH 7 h + << 0, 03
ATCC 13032_ ΔGDH 24 h - 0,2
ATCC 13032_ ΔGDH 24 h + 0,2
ATCC 13032 ΔGDH 30 h - 0,5
ATCC 13032 ΔGDH 30 h + 0,4
Aus den ermittelten Werten (siehe Tabelle 3) ist zu erkennen, dass die gefundene Menge an AKG äußerst gering waren. Die Proben selbst unterschieden sich unabhängig von dem Zusetzen der Glutaminsäure kaum in ihrer AKG-Konzentration . Die Deletionsmutante zeigte ebenfalls im Vergleich zum Ursprungsstamm keine AKG-Anreicherung. Die bloße Deletion des GDH-Gens führte demnach nicht zu einer Akkumulation des AKGs.
Beispiel 3: Vergleich der a-Ketoglutarat-Bildung von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM 20411 und DSM 20411_AGOH in Minimalmedium
Minimalmedium
■ Spurenelemente-Lösung
FeSO4 * 7 H2O 28, 5 g
MnSO4 * H2O 16,5 g
ZnSO4 * 7 H2O 6, 4 g
CuSO4 * 5 H2O 0, 764 g
CoCl2 * 6 H2O O, 129 g
NiCl2 * 6 H2O O, 044 g
H3BO3 0, 048 g
Wasser ad 1 L
Lösen der Spurenelemente durch Ansäuerung mit H2SO4 auf pH 1.
■ 100 mM CaCl2-Lösung
■ I M MgSO4-Lösung
■ 50% D- (+) -Glucose-Lösung
■ Grundbestandteile des CgC-Mediums
MOPS 42 g
(NH4) 2SO4 20 g
Harnstoff 5 g
KH2PO4 0, 5 g
K2HPO4 0,25 g
Wasser ad 1 L Die Grundbestandteile wurden in ca. 300 mL Wasser gelöst, der pH-Wert auf 7,0 mit NaOH eingestellt und die Medien autoklaviert . Anschließend wurden die fehlenden Bestandteile so ergänzt, dass ein Endvolumen von 1 L vorlag.
CaCl2~Lösung 10 mL
MgSO4-Lösung 10 mL
D- ( + ) -Glucose-Lösung 50 mL
Spurenelemente-Lösung 1 mL
Biotin 200 mg
Im Vergleich zum Standardmedium war bereits durch den Einsatz des Minimalmediums eine unterschiedliche Akkumulation von AKG zu erkennen (siehe Abb. 7 - Vergleich der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium) . Die jeweiligen Deletionsmutanten verzeichnen einen höheren AKG-Gehalt im Vergleich zu ihren Ursprungstämmen. Corynebacterium glutamicum DSM 20411 ΔGDH wies im Vergleich zu den anderen Stämmen eine mehr als 10 mal so hohe Konzentration an AKG auf. Nach 30 h hatte in etwa eine Verdoppelung des 20 h Wertes stattgefunden.
Beispiel 4 : Verglei ch der oc-Ketogl u tara t-Bildung von C . gl u tami cum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM 20411 und DSM 20411_AGOH in Minimalmedi um mi t reduzierter Bi oti on - Konzen tra tion
Dieses Medium enthielt Biotin in einer verminderten Konzentration (5 μg/L) gegenüber dem oben beschriebenen Minimalmedium. Die Aktivität des ODHC (Oxoglutarat - Dehydrogenase-Komplexes) wird dadurch reduziert und der Abfluss von AKG im Citrat-Zyklus (siehe Abb. 2) vermindert (Abb. 8 - Vergleich der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium mit 5 μg/L Biotin) .
Beispiel 5: Vergleich der α-Ketoglutarat-Bildung von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM 20411 und DSM 20411_AGOH in Minimalmedium mit Zusatz des Hemmers der Glutaminsynthetase Methioninesulfoximin (MSX)
Diesem Minimalmedium wurde sowohl 5 mM des Inhibitors der Glutaminsynthetase MSX (Methioninesulfoximin) zugesetzt, als auch die auf Biotin-Konzentration auf 5 μg/L vermindert. Die Kombination hatte das Ziel die Aktivität des ODHC zu vermindern und das GS/GOGAT-System zu deaktivieren. Inhibitoren wie Methioninsulfoximin (MSX) können in bestimmten Systemen als Glutamat-Antagonisten wirken und z.B. die Glutamin-Synthetase inhibieren. Die Inhibition der Glutaminsynthetase durch MSX ist irreversibel (Abb. 9 - Vergleich der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium mit 5 μg/L Biotin und 5 mM MSX.) . Beispiel 6 : Verglei ch der oc-Ketogl u tara t-Bildung von C . gl u tami cum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM 20411 und DSM 20411_AGOH in Minimalmedi um mi t Zusa tz von IM Ammoni umsul fa t als einzige Sticks toffquelle
Dieses abgewandelte Minimalmedium enthielt 1 M (NH4) 2SO4 als einzige Stickstoffquelle . Eine erhöhte Ammonium-Konzentration im Medium vermindert die Aktivität des GS/GOGAT-Systems . Die Aktivität der GDH, die sich reziprok zur GS/GOGAT-Aktivität verhält, sollte daher ansteigen. Als Folge der Deletion der GDH wird der Abbau des AKG durch dieses Enzym verhindert und auch die Umwandlung durch das GS/GOGAT-System vermindert (Abb. 10 - Vergleich der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium mit 1 M Ammoniumsulfat als einzige Stickstoffquelle) .

Claims

Patentansprüche :
1. Reaktionssystem zur fermentativen Herstellung von a-
Ketoglutarsaure, enthaltend einen genetisch veränderten Mikroorganismus und ein Fermentationsmedium, wobei
a) im Mikroorganismus die Glutamatdehydrogenase (GDH) inaktiviert vorliegt und
b) das Fermentationsmedium ein Uberschuss an für den eingesetzten Mikroorganismus verwertbarem Stickstoff oder
c) die für eine limitierende Versorgung des eingesetzten Mikroorganismus notwendige Menge an Biotin enthalt, oder
d) die Maßnahmen aus b) und c) miteinander kombiniert werden .
2. Mikrobielles Reaktionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inaktivierung der GDH durch Deletion, Insertion oder Mutation oder schwächere Promotoren erfolgt.
3. Mikrobielles Reaktionssystem nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des für den Mikroorganismus in Form von Ammoniumionen verwertbaren Stickstoffs im Medium bei 5 - 70 g/L liegt.
4. Mikrobielles Reaktionssystem nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium einen oder mehrere auf das GS/GOGAT-System inhibitorisch wirkende Verbindungen enthalt .
5. Mikrobielles Reaktionssystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium, einen oder mehrere Inhibitoren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus D-Glutamin, Ethionine Sulfon, L-Albizziin, Homocystein-Sulfonamide, Methionin-Sulfone, Methionin-Sulfoximine und Methionin- Sulfoxide enthält.
6. Mikrobielles Reaktionssystem nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Biotins im Fermentationsmedium bei 0,1 - 0,0005 g/L liegt.
7. Mikrobielles Reaktionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es als Mikroorganismus, ausgewählt aus den Gattungen
Corynebakterium, Escherichia oder Bacillus enthält.
8. Mikrobielles Reaktionssystem gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Mikroorganismus der Spezies Corynebacterium glutamicum enthält.
9. Mikrobielles Reaktionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es als Kohlenstoffquelle Zucker oder zuckerhaltige Mischungen enthält.
10. Mikrobielles Reaktionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem eingesetzten Mikroorganismus eines oder mehrere der geeignete Enzyme des Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentosephosphat-Zyklus, des Ketosäure- Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine überexprimiert werden.
11. Verfahren zur fermentativen Herstellung von α- Ketoglutarsäure unter Einsatz eines Reaktionssystems nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10.
12. Verfahren zur fermentativen Herstellung von α- Ketoglutarsäure, das folgende Schritte enthält: a) Kultivieren eines Mikroorganismus, in dem die Glutamatdehydrogenase inaktiviert ist, in einem Fermentationsmedium, das
al) einen Uberschuss an für den eingesetzten
Mikroorganismus verwertbaren Stickstoff, oder
a2) die für eine limitierende Versorgung des eingesetzten Mikroorganismus notwendige Menge an Biotin enthalt, oder
a3) in dem man die Maßnahmen aus a) und b) miteinander kombiniert werden,
b) Akkumulieren der gebildeten α-Ketoglutarsaure im Fermentationsmedium oder in den Zellen des Mikroorgansimus,
c) Isolieren der α-Ketoglutarsaure, gegebenenfalls mit weiteren Bestandteilen aus der Fermentationsbruhe und/oder der Biomasse.
13. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, bei dem man coryneforme Bakterien oder Bakterien der Gattung Brevibacterium einsetzt.
14. Primersequenz gemäß Seq. ID No: 1 bzw. Seq. ID No: 2.
15. Plasmid, welches im transformierten Mikroorganismus nicht repliziert wird und eine für eine funktionsunfähige GDH codierende Sequenz aufweist und nach Klonierung in den Mikroorganismus und damit zur Inaktivierung der Glutamatdehydrogenase im Mikroorganismus fuhrt.
16. Mikroorganismus, in dem die Glutamatdehydrogenase inaktivitiert vorliegt, wobei es sich bevorzugt um einen coryneformen Organismus handelt.
17. Mikroorganismus gemäß Anspruch 16, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus ATCC13032 ΔGDH und DSM20411 ΔGDH.
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