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Gegenstand
der Erfindung ist eine mikrobielles Reaktionssystem, mit dem man
durch Einsatz eines Mikroorganismus mit einer inaktiven Glutamat
Dehydrogenase (EC 1.4.1.2; GDH) und weiterer beschriebener Maßnahmen
in die Lage versetzt wird, verstärkt α-Ketoglutarsäure
(2-Oxoglutarsäure, 2-Oxopentandisäure, AKG) fermentativ
aus einer C-Quelle, z. B. aus erneuerbaren Rohstoffen, wie Glucose,
Saccharose, Melasse, Öle, Fettsäuren etc. zu bilden.
Weiterhin wird ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von α-Ketoglutarsäure
mittels derartiger Mikroorganismen beschrieben. Ebenfalls sind Gegenstand
der vorliegenden Erfindung neue Mikroorganismen, Primersequenzen
und Plasmide zur Ausführung der Erfindung.
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α-Ketoglutarsäure
ist als Zwischenprodukt für die chemische Synthese und
als Nahrungsergänzungsmittel oder als Bestandteil parenteral
zu verabreichender Nahrungsmittelkompositionen von Bedeutung.
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α-Ketoglutarsäure
ist ein Zwischenprodukt des Citratzyklus. Beim aeroben Abbau über
den Citratzyklus erfolgt eine vollständige Oxidation der
Glucosederivate zu CO2. Aus dem in der Glycolyse
gebildeten Pyruvat wird durch oxidative Decarboxylierung, die von
dem Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHC) katalysiert wird, das Acetyl-Coenzym
A (Acetyl-COA) gebildet. Acetyl-CoA ist das gemeinsame Zwischenprodukt des
Katabolismus der Brennstoffmoleküle wie Aminosäuren,
Fettsäuren und Kohlenhydrate, das in den Citratzyklus eintritt.
Oxalacetat kondensiert mit der Acetyleinheit des Acetyl-CoA unter
der Bildung von Citrat. Anschließend wird ein Isomer des
Citrats oxidativ decarboxyliert und α-Ketoglutarat (AKG)
entsteht. Durch eine weitere Umwandlung mittels oxidativer Decarboxylierung,
die durch den α-Ketoglutarat-Dehydrogenasekomplex synonym
für 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex (ODHC) katalysiert
wird, liegt Succinyl-CoA vor. Die C4-Einheit
erfährt mehrere Umsetzungen bis erneut Oxalacetat für
ein neues Durchlaufen des Zykluses zur Verfügung steht.
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Tabelle
1 führt die Enzyme des Citratzyklus auf, die entstehenden
Zwischenprodukte sind in der
1 dargestellt. Tab. 1: Enzyme des Citratzykluses und
ihre Reaktionstypen
| Schritt | Enzym | Reaktionstyp |
| 1 | Citrat-Synthase | Kondensation |
| 2 | Aconitase | Dehydratisierung |
| 3 | Aconitase | Hydratisierung |
| 4 | Isocitrat-Dehydrogenase | Decarboxylierung
Oxidation |
| 5 | α-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplex
(ODHC) | Decarboxylierung
Oxidation |
| 6 | Succinyl-CoA-Synthetase | Substratkettenphosphorylierung |
| 7 | Succinat-Dehydrogenase | Oxidation |
| 8 | Fumarase | Hydratisierung |
| 9 | Malat-Dehydrogenase | Oxidation |
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Eine
weitere Aufgabe des Citratzyklusses, zusätzlich zu der
Energieerzeugung, ist das Bereitstellen verschiedener Vorstufen
für die Synthese von Zellbestandteilen. So leiten sich
viele Aminosäuren z. B. aus Oxalacetat oder AKG ab (siehe 2 – Vorstufen
für die Synthese verschiedener Aminosäuren ausgehend vom
Citratzyklus; s. a. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer,
L. (2003): Biochemie (5. Auflage), Spektrum Verlag, ISBN 3-8274-1303-6).
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Durch
Isomerisierung des Citrats im Citratzyklus wird die Vorstufe von α-Ketoglutarat,
das Isocitrat gebildet. Dieses wird von der Isocitrat-Dehydrogenase
(IDH) oxidativ decarboxyliert und α-Ketoglutarat liegt
vor.
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Die
Folgereaktion im Citratzyklus sorgt für einen Abbau des
gebildeten AKGs. Eine weitere oxidative Decarboxylierung, die vom
ODHC katalyisiert wird, wandelt AKG in Succinyl-CoA um.
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Das
Succinyl-CoA wird über die Zwischenprodukte Succinat, Fumarat,
Malat wieder zu Oxalacetat und der Citratzyklus kann erneut durchlaufen
werden.
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Für
die Synthese von Biomolekülen wie z. B. Aminosäuren
ist Stickstoff notwendig. Seine Assimilation kann in Form von NH4 + in Aminosäuren
erfolgen. Von Bedeutung sind hierbei die Aminosäuren Glutamat
und Glutamin. Viele Aminosäuren erhalten ihre α-Aminogruppe
durch Transaminierung der α-Aminogruppe des Glutamats oder
Glutamins. Die Glutamatdehydrogenase (GDH) katalysiert die Reaktion
zur Bildung von Glutamat aus AKG, das im Citratzyklus entsteht.
AKG bildet mit Ammonium eine Schiff-Base. Diese Base wird anschließend
protoniert wobei NADPH reduziert wird (3 – Bildung
von Glutamat aus α-Ketoglutarat mit dem Zwischenprodukt
einer Schiff-Base katalysiert durch das Enzym GDH).
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NADPH
dient bei der Biosynthese von Glutamat als Reduktionsmittel. Unter
der katalytischen Wirkung der Glutamin-Synthetase (GS) und den Verbrauch
von ATP wird ein weiteres Ammoniumion zur Amidierung des Glutamats
verwendet und auf diese Weise Glutamin synthetisiert.
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Aus
Glutamin kann in einer umgekehrten Reaktion, die durch Glutamat-Synthase
(Glutamin-2-Oxoglutarat-Aminotransferase, GOGAT) katalysiert wird,
erneut Glutamat entstehen. AKG wird durch die Glutamat-Synthase
reduktiv aminiert, wobei Glutamin als N-Donor fungiert.
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Bei
niedriger Ammonium-Konzentration erfolgt die Bildung von Glutamat überwiegend
durch die aufeinander folgenden Wirkungen der Glutamin-Synthetase
(GS) und der Glutamat-Synthase (GOGAT).
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Die
Bildung von Glutamat verläuft über diesen Reaktionsweg,
wenn niedrige Ammoniumkonzentrationen vorliegen. Ursache ist der
hohe Km-Wert der GDH für NH4 + von ca. 1 mM.
Bei niedrigen Konzentrationen an Ammonium ist die GDH nicht abgesättigt.
Die GS besitzt eine sehr große Affinität zu NH4 +, daher kann bei einer
Limitierung die Aufnahme von Ammoniak unter ATP-Verbrauch stattfinden.
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Die
Aktivitäten der GDH und des GS/GOGAT-Systems, die abhängig
von der Ammonium-Konzentration sind, verhalten sich reziprok. Bei
hohen Ammonium-Konzentrationen besitzt die GDH eine hohe Aktivität, beim
GS/GOGAT-Systems ist sie jedoch vermindert. Im entgegen gesetzten
Fall, bei niedrigen Konzentrationen an NH4 +, dominiert die Aktivität des GS/GOGAT-Systems über
der GDH-Aktivität (4 – Bildung
und Umwandlung von α-Ketoglutarat; Kimura, E. (2002):
Metabolic Engineering of Glutamat Production, Advances in biochemical
engineering biotechnology Vol. 79, Microbial Production of L-Amino
Acids, Springer Verlag, ISBN 3-540-43383-x: 37–57; Berg,
J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L. (2003): Biochemie (5. Auflage),
Spektrum Verlag, ISBN 3-8274-1303-6).
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Das
bisher gängige Verfahren zur technischen Herstellung von α-Ketoglutarat
(AKG) basiert auf einer chemischen Transaminierung mit Glyoxalsäure
plus Natrium-Glutamat und einem Kupfer-Katalysator. Bei dieser Reaktion
entstehen α-Ketoglutarsäure und Glycin als Hauptprodukte
in Lösung, sowie eine Reihe von organischen Säuren
als Nebenprodukte.
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Dieser
synthetische Prozess hat den Nachteil, dass er nicht selektiv genug
erfolgt und viele Nebenprodukte, wie z. B. Glycin und andere organische
Säuren gebildet werden. Auch die Beschaffung bzw. Entsorgung
des Kupfer-Katalysators macht ein anderes ggf. biotechnologisches
Verfahren ökologisch und ökonomisch attraktiv.
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Im
Hinblick auf die fermentative Herstellung von α-Ketoglutarsäure
werden die höchsten Titer und Produktivitäten
mit Mikroorganismen (Bakterien und Hefen) erzielt, die n-Paraffin
als Kohlenstoffquelle nutzen. Der Metabolismus von n-Alkanen vollzieht
sich über die Oxidation durch Hydroxylasen und ist in Watkins
und Morgan (Biodegradation 1990, 1(2–3), 79–92)
detailliert beschrieben.
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Nachteilig
ist bei der Nutzung von n-Parffin als Kohlenstoffquelle, dass die
Produktivität der Mikroorganismen mit der eingesetzten
Kettenlänge der n-Alkane schwankt und dass häufig
Nebenprodukte wie Glutamin gebildet werden.
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Weitere
Bakterielle Naturisolate, die in der Lage sind 2-Oxoglutarat zu
bilden, wie Arthrobacter paraffineus, Corynebacterium hydrocarboclastus,
Micrococcus paraffinolyticus, Corynebacterium alkanolitecum oder
Brevibacterium ketoglutamicum sind in
DE
14 42 259 (Kyowa Hakko) als auch in
JP 49011080 (Takeda) beschrieben.
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Bei
den Hefen sind als natürliche α-Ketoglutarat-Bildner
Yarrowia lipolytica (
DD 267 999 )
und Candida lipolytica (
DE 23
58 312 ) zu nennen.
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Es
ist nur eine Arbeit aus dem Jahre 1955 von Asai et al. (Asai,
T.; Aida, K.; Sugisaki, Z.; Yakeishi, N., Journal of General and
Applied Microbiology 1955, 1 308-46) bekannt, welche die
Bildung von α-Ketoglutarsäure durch Bakterien
aus Glukose beschreibt. Dabei wurden folgende Naturisolate eingesetzt:
Pseudomonaden, Escherichia coli, Serratia marcescens, Bacillus megatherium,
Bacillus natto, Bacterium succinium und Gluconobacter cerinium.
Die hier erzielten Produktivitäten sind für ein
technisches Verfahren allerdings nicht ausreichend.
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Daher
besteht immer noch die Forderung ein fermentatives Verfahren zur
Herstellung von α-Ketoglutarsäure bereitzustellen,
welches insbesondere anstelle von Glutamat und Glyoxalsäure
von erneuerbaren Rohstoffen ausgeht. Dieses Verfahren sollte im
technischen Maßstab einsetzbar und daher den im Stand der Technik
beschriebenen vom ökonomischen wie ökologischen
Standpunkt aus gesehen überlegen sein. Insbesondere bestand
eine Aufgaben darin, die fermentative Bildung von α-Ketoglutarat
durch den Einsatz biotechnologischer Maßnahmen zu erhöhen.
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Eine
solche Aufgabe wird durch ein Verfahren bzw. den Einsatz eines erfindungsgemäßen
Reaktionssystems gemäß den vorliegenden Ansprüchen
gelöst.
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Gegenstand
der Erfindung ist somit ein mikrobielles Reaktionssystem aufweisend
einen rekombinanten Mikroorganismus zur fermentativen Herstellung
von α-Ketoglutarsäure und ein Reaktionsmedium,
was sich dadurch auszeichnet, dass im Mikroorganismus eine Inaktivierung
der Glutamatdehydrogenase (GDH) vorliegt und das Reaktionsmedium
dergestalt angepasst ist, dass im Reaktionsmedium eine limitierte
Versorgung des Mikroorganismus mit Biotin erfolgt.. Mit den beschriebenen
Maßnahmen ist es überraschenderweise möglich
einen lebensfähigen Organismus in einem geeigneten Medium
dazu zu bringen, mehr als das 10fache an AKG verglichen mit dem
Ausgangsstamm zu synthetisieren. Die enorme Steigerung in der Raum/Zeitausbeute
an AKG einerseits und die Tatsache, dass ein derart modifizierter
Organismus unter den gegebenen und technisch besonders einfach zu
realisierenden Bedingungen ausreichend lebensfähig ist,
kann als goldener Griff gewertet werden, der die erfindungsgemäße
Kombination der angewandten Merkmale vor dem Hintergrund des Standes
der Technik klar als erfinderisch erscheinen lässt.
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Die
Inaktivierung der GDH des ins Auge gefassten Mikroorganismus kann
nach dem Fachmann bekannten Maßnahmen erfolgen. Wichtig
ist, dass eine Inaktivierung zumindest zu einer verminderten Aktivität der
GDH im Zielstamm verglichen mit dem Ausgangsstamm führt.
Als Maßnahmen kommen vorteilhafterweise solche ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus:
- – (Teil)
Deletion (s. u.)
- – Geringere Promotoraktivität
- – Anti-sens DNA oder RNA
in Frage. Entsprechende
Methoden zur Inaktivierung von Genen sind zusammengefasst im Handbook
of Corynebacterium glutamicum (ed. Eggeling, L., Bott, M.
(2005), CRC Press) beschrieben. Ganz besonders bevorzugt
ist die Maßnahme, bei der ein Teil oder das komplette Gen,
welches für die GDH des Organismus kodiert aus diesem entfernt
wird, bei der also die Inaktivierung der GDH durch Deletion erfolgt,
so dass keine oder lediglich eine inaktivierte GDH im Organismus
gebildet wird.
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Biotechnologische
Methoden zur Herstellung der entsprechenden Mutanten sind dem Fachmann
hinreichend geläufig (Pühler et al. Bio/Technology
9, 84–87 (1991), Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927
(1998)). Dabei kann es sich um in-vivo oder in-vitro Methoden
handeln.
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Für
die Mutagenese können klassische in vivo Mutageneseverfahren
unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin
oder ultraviolettes Licht verwendet werden.
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Weiterhin
können für die Mutagenese in-vitro Methoden wie
beispielsweise eine Behandlung mit Hydroxylamin (Miller,
J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual
and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) oder
mutagene Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für
Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993)
oder die Polymerasekettenreaktion (PCR), wie sie im Handbuch von
Newton und Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
1994) beschrieben ist, verwendet werden.
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Weitere
Anleitungen zur Erzeugung von Mutationen können dem Stand
der Technik und bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie
wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare
Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland,
1995), dem von Winnacker („Gene und Klone",
VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder
dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Bei
Verwendung von in-vitro Methoden wird das im Stand der Technik beschriebene
GDH Gen ausgehend von isolierter Gesamt-DNA eines Wildtypstammes
mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert, gegebenenfalls
in geeignete Plasmidvektoren kloniert. Anleitungen zur Amplifikation
von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide
Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und
bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, Deutschland, 1994). In gleicher Weise können
auch Methoden der in-vitro Mutagenese verwendet werden wie sie beispielsweise
in dem bekannten Handbuch von Sambrook et al. (Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989) beschrieben
sind.
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Entsprechende
Methoden sind auch kommerziell in Form sogenannter „kits"
wie beispielsweise der von Papworth et al. (Strategies 9(3),
3–4 (1996)) beschriebene „QuikChange
Site-Directed Mutagenesis Kit" der Firma Stratagene (La Jolla, USA)
verfügbar. Die GDH-Deletion kann durch das Verfahren des
Genaustausches („gene replacement"), wie es bei Schwarzer
und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991))
oder Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927
(1998)) beschrieben ist, in geeignete Stämme eingeführt
werden. Das entsprechende verkürzte GDH Allel wird hierbei
in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor wie
beispielsweise pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger
et al., Journal of Bacteriology 174: 5462–65 (1992))
oder pCR®Blunt (Firma Invitrogen,
Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology,
234: 534–541 (1993)) kloniert und dieser anschließend
durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten
Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer
Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses
und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses
im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation.
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Zur
Erreichung des gesetzten Zieles kann unter zur Hilfenahme des Vektors
pK18mobsacB – wie beschrieben – in verschiedenen
Corynebacterien eine Deletion des GDH-Gens im Chromosom der Bakterienzellen
eingeführt werden, die eine Aufhebung der Aktivität
der Glutamatdehydrogenase zur Folge hat. Die Geninaktivierung wurde
durch Sequenzierung und Ermittlung der spezifischen Enzymaktivitäten
der Glutamatdehydrogenase der verwendeten Stämme bestätigt.
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Das
Reaktionsmedium muss für die fermentative Herstellung von
AKG dergestalt aufgebaut sein, dass eine limitierte Versorgung des
Mikroorganismus mit Biotin vorliegt. Es zeigt sich, dass dadurch
in Kombination mit der oben beschriebenen Maßnahme eine
Anreicherung von AKG im Reaktionsmedium erreicht werden kann. Man
nimmt an, dass dies durch eine Schwächung der Aktivität
des ODHC-Enzyms, die durch einen Mangel an Biotin hervorgerufen
wird, bedingt ist.
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Der
Fachmann ist im Prinzip frei in der Wahl der Biotinkonzentration
im Medium, doch darf die Biotinkonzentration nicht unter einen bestimmten
Wert sinken, da dann der für den Organismus essentielle
Zitronensäurezyklus derart empfindlich gestört
wird, dass die Zelle nicht mehr lebensfähig wären.
Eine Obergrenze an Biotin wird dadurch gebildet, dass eine weitere
Erhöhung der Biotinkonzentration keine weitere Abnahme
der gebildeten AKG induziert. Eine untere Grenze der Biotinkonzentration
ergibt sich – wie gesagt – durch die Tatsache,
dass eine weitere Absenkung der Konzentration wieder zu einer verminderten
AKG-Bildung führt, da die Wachstumsbedingungen des Organismus
hier negativ zu Buche schlagen. Innerhalb dieser Grenzen wird der
Fachmann die Konzentration an Biotin an wirtschaftlichen Erwägungen
ableiten. Die Konzentration des Biotins im Reaktionsmedium sollte
vorzugsweise zwischen 0,1–0,0005 g/L, bevorzugt bei 0,01–0,001
g/L liegen. In der Regel wird ein Wert von ca. 2–5 μg/L
optimal sein.
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Das
Reaktionsmedium sollte einen Überschuss an für
den Organismus verwertbaren Stickstoff, z. B. in Form von Ammoniumionen
enthalten. Unter Überschuss ist gemeint, dass das Reaktionsmedium
eine solche Konzentration an Ammoniumionen in Form von für
den Organismus verwertbaren Stickstoffs aufweist, so dass das GS/GOGAT-System
gehemmt wird. Eine Hemmung des GS/GOGAT-Systems durch Ammoniumionen
(Inhibitorische Konzentration) kann nachgewiesen werden durch die
Messung der verminderten Glutamat-Bildung (durch das GS/GOGAT-System)
in einer GDH Deletionsmutante in Abhängigkeit verschiedener NH4 + Konzentrationen.
Eine Hemmung liegt vor, sobald die Glutamat-Bildung bei weiter fortschreitender
Erhöhung der Ammoniumionenkonzentration eine verminderte
Bildung an Glutamat bedingt. Diese Konzentration bildet die Untergrenze
der einzusetzenden Ammoniumionen.
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Die
tatsächliche Konzentration an Ammoniumionen ist von Organismus
zu Organismus verschieden, kann jedoch vom Fachmann nach seinem
Können durch Routineexperimente bestimmt werden. Eine Obergrenze
bildet sicherlich die Löslichkeit der Ammoniumsalze sowie
die Wirtschaftlichkeit oder auch die Praktikabilität des
Verfahrens insgesamt. Hier hat der Fachmann unter ökonomischen
Gesichtspunkten abzuwägen, ob ein weiterer Zusatz an Ammoniumionen
zum Reaktionsmedium noch einen verwertbaren Effekt – sprich eine
weitere Erhöhung der AKG-Bildung – erzeugt.
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In
der Regel wird die Konzentration an Ammoniumionen in Form von für
den Organismus verwertbaren Stickstoffs im Reaktionsmedium bei 5–70
g/L, bevorzugt bei 10–50 g/L liegt. In der Regel wird sich
die Konzentration um 20 g/L liegen.
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Als
Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen
wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser,
Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie
Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat
und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
ist es angezeigt, zusätzlich zu den oben beschriebenen
Maßnahmen, die GS/GOGAT-Enzyme des Organismus zu inhibieren.
Dazu werden geeignete Inhibitor-Verbindungen dem Reaktionsmedium
zugefügt (Inhibition of homocysteine sulfonamide
of glutamate synthase purified from Saccharomyces cerevisiae DS
Masters Jr and A Meister J. Biol. Chem., Vol. 257, Issue 15, 8711–8715,
08, 1982; Glutamine-Einding Subunit of Glutamate Synthase
and Partial Reactions Catalyzed by this Glutamine Amidotransferase Paul
P. Trotta, Karen E. B. Platzer, Rudy H. Haschemeyer, Alton Meister
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America, Vol. 71, No. 11 (Nov., 1974), pp. 4607-4611).
Als solche kommen insbesondere die der folgenden Gruppe in Frage:
D-Glutamin, Ethionine Sulfon, L-Albizziin, Homocystein-Sulfonamide,
Methionin-Sulfone, Methionin-Sulfoximine und Methionin-Sulfoxide.
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Beispielsweise
kann zur Beeinflussung des GS/GOGAT-Systems der Inhibitor Methioninsulfoximin dem
Reaktionsmedium zugesetzt werden. Es zeigt sich, dass hierdurch
eine weitere Erhöhung der Produktivität der Organismen
bei der Herstellung von AKG eintritt.
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Zusätzlich
kann es für die verbesserte Produktion von α-Ketoglutarat
vorteilhaft sein, in den auf die beschriebene Weise hergestellten
Organismen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentosephosphat-Zyklus, des
Ketosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren,
um die α-Ketoglutarat Bildung in den beanspruchten Organismen zu
erhöhen. Die Verwendung endogener Gene wird ebenso wie
bei den beschriebenen Maßnahmen der Abschwächung
im Allgemeinen bevorzugt.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung
von AKG, bei dem ein wie eben beschriebenes erfindungsgemäßes
Reaktionssystem zum Einsatz kommt. Die für das Reaktionssystem
beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen gelten für
das Verfahren entsprechend.
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Ganz
besonders bevorzugt ist daher ein Verfahren, bei dem alle oben beschriebenen
Maßnahmen kumulativ vorliegen.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren geht man bevorzugt
dergestalt vor, dass man in einem geeigneten Reaktionsgefäß eine
wie beschriebene Fermentationsbrühe mit den veränderten
Bakterien anzieht und anschließend eine Anreicherung des
AKG in der Brühe zulässt. Das AKG kann anschließend
nach bekannten Methoden aus der Brühe isoliert werden oder
zusammen mit der Brühe konzentriert und dergestalt mit
Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse
(> 0 bis 100%) weiterverarbeitet
werden.
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Das
Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch – Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated
fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) oder im Perfusionsverfahren
(
WO 9501214 ) zum Zwecke
der Produktion von α-Ketoglutarat durchgeführt
werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden
ist im Lehrbuch von Chmiel (
Bioprozesstechnik 1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas
(Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))
beschrieben.
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Das
zu verwendende Kulturmedium muss unter den oben genannten Randbedingungen
in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Organismen
genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener
Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods
for General Bacteriology„ der American Society for Bacteriology
(Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
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Als
Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.
B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl,
Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett,
Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und
Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als
Mischung verwendet werden.
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Als
Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat
oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen
Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von
Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat,
die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich
können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt
werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete
Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert
werden.
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Zur
pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure
Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in
geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität
von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende
Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden.
Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder
Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C
bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an α-Ketoglutarat
gebildet hat, beziehungsweise die Ausbeute oder Produktivität
einen gewünschten optimalen Wert erreicht hat. Dieses Ziel
wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
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Das
auf diese Weise hergestellte α-Ketoglutarat wird wie beschrieben
anschließend gesammelt und isoliert und gegebenenfalls
gereinigt.
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Einen
weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden die für
die Herstellung der erfindungsgemäß einzusetzenden
Mutanten benötigten Zwischenprodukte. Dies sind im Einzelnen
Primersequenzen zur Amplifizierung des GDH-gens. Insbesondere sind
dies die Sequenzen aufweisend die Seq. ID No: 1 oder 2.
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Weiterhin
sind unter dieser Rubrik Plasmide zu nennen, mit denen das deletierte
Genkonstrukt in den Organismus transfiziert und ins Genom des Organismus
integriert werden kann, wodurch die gewünschte doppelte
homologe Rekombination stattfinden kann. Dafür eigenen
sich solche Plasmide, welche im betrachteten Mikroorganismus nicht
repliziert werden und eine für eine funktionsunfähige
GDH codierende Sequenz aufweisen und welche jedoch nach Klonierung
in den Mikroorganismus zu einer doppelten homologen Rekombination
und damit zur Inaktivierung der GDH im Mikroorganismus führen.
Ganz besonders bevorzugt ist das Plasmid laut 5 – Plasmidkarte
von pK18mobsacB ΔGDH (Seq. ID NO: 3). Die ganz bevorzugte
Deletionsregion ist eine solche im GDH-Gen, welche sich zwischen
zwei EcoO109I-Schnittstellen befindet. Ein solches bevorzugtes zur
Inaktivität führendes GDH-Gen ist in Seq. ID NO:
4 aufgeführt.
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Als
Ausgangsorganismus kann jeder dem Fachmann hierfür in Frage
kommende Organismus herangezogen werden. Vorzugsweise kommen Organismen
zum Zuge, welche schon eine erhöhte AKG Produktion von
Natur aus mitbringen. Besonders bevorzugt sind solche aus der Gruppe
bestehend aus den Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia
coli, Rhodococcus, Saccharomyces, Pichia, Yarowia, Bacillus, Aspergillus.
Besonders bevorzugt ist hier die Gattung Corynebacterium zu nennen,
insbesondere die in der Fachwelt bekannte Art Corynebacterium glutamicum.
Bekannte Wildtypstämme der Art Corynebacterium glutamicum
sind beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium
glutamicum DSM 20411
Corynebacterium glutamicum DSM 20412
Corynebacterium
glutamicum DSM 20598
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium melassecola ATCC
17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium
flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
und
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020.
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Angaben
zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe
von Bakterien findet man unter anderem bei Kämpfer und
Kroppenstedt (
Canadian Journal of Microbiology 42, 989–1005
(1996)) und in der
US-A-5,250,434 .
Seit einigen Jahren (
Liebt et al., International Journal
of Systematic Bacteriology 41(2), 255–260 (1991))
werden coryneforme Bakterien mit Artbezeichnung „Brevibacterium
flavum", „Brevibacterium lactofermentum" und „Brevibacterium
divaricatum" in die Art Corynebacterium glutamicum eingeordnet.
Coryneforme Bakterien mit Artbezeichnung „Corynebacterium
melassecola" gehören ebenfalls zur Art Corynebacterium
glutamicum.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Produktionsstamm zur fermentativen Gewinnung
von α-Ketoglutarat, bevorzugt Corynebacterium glutamicum,
welcher eine Voll- oder Teildeletion im Allel der GDH besitzt. Ganz besonders
bevorzugt ist ein Stamm ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus: ATCC13032_ΔGDH, DSM20411_ΔGDH.
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Die
Ergebnisse der Versuche zeigen, dass die Beeinflussung der α-Ketoglutarat-Konzentration
insbesondere bei den Deletionsmutanten durch oben genannte Faktoren
möglich ist. Es konnte eine 76fache Steigerung bezüglich
der Bildung von α-Ketoglutarat durch Erhöhung
der Ammoniumkonzentration, die Zugabe von 5 mM Methioninsulfoximin
und die Verringerung der Biotinkonzentration auf 5 μg/L
im Minimalmedium im Stamm Corynebacterium glutamicum DSM 20411_ΔGDH
im Vergleich zum Stamm ATCC 13032 ohne GDH-Deletion erreicht werden.
Dagegen sind bisher keine Publikationen oder Patente bekannt, die
die gezielte Entwicklung eines α-Ketoglutarat-Produzenten
mittels Abschwächung des Abflusses von AKG in Richtung Glutamat
durch Deletion der Glutamat Dehydrogenase, und gleichzeitiger Abschwächung
des Abflusses von AKG über den Citrat-Zyklus, als auch über
das GS/GOGAT-System (Glutamin Synthetase/Glutamin-2-Oxoglutarat-Aminotransferase
System; Stryer, Lubert; Biochemistry, 3rd edition) beschreiben.
Vor dem Hintergrund des Standes der Technik ist die vorliegende
Lehre daher erfinderisch.
-
Beispiele
-
Die
Anreicherung des Stoffwechselproduktes AKG zur fermentativen Gewinnung
kann durch Beeinflussung der Biosynthesewege erfolgen (siehe Beschreibung
der Erfindung).
-
Zur
Untersuchung der Auswirkung der Hemmung bzw. der Blockade der einzelnen
Stoffwechselwege mit dem Ziel der AKG-Anhäufung wird eine
GDH-Deletionsmutante von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 und
eine GDH-Deletionsmutante von Corynebacterium glutamicum DSM 20411,
bei dem es sich um einen Glutamatüberproduzenten handelt,
konstruiert.
-
Die
Beeinflussung einzelner oder mehrere Stoffwechselwege durch die
Umgebungsbedingung der Zellen, verursacht durch die Medienbestandteile
wurde getestet.
-
Anschließend
wurde die Akkumulation von AKG zwischen der Deletionsmutante des
C. glutamicum ATCC 13032 und dem Wildtyp ATCC 13032, sowie der Deletionsmutante
des Corynebacterium glutamicum DSM 20411 und des Ursprungsstammes
Corynebacterium glutamicum DSM 20411 verglichen.
-
Generelle Techniken
-
Für
DNA Manipulationen wurden Standardtechniken benutzt wie sie zum
Beispiel in Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning:
a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York, angegeben sind. DNA Amplifikationen
wurden mit der Taq-DNA Polymerase (Quiagen, Hilden, Germany) durchgeführt.
Wenn nicht anders angegeben wurde die Polymerasen entsprechend den
Angaben der Hersteller benutzt. Oligonukleotide für die
PCR Amplifikationen und die Einführung von Restriktionsschnittstellen
wurden von MWG-Biotech (Ebersberg, Germany) erhalten. Der Nachweis
konstruierter Stämme erfolgte durch Kolonie-PCR mit der
Tag Polymerase READYMIX (Quiagen, Hilden, Germany), sowie Plasmidpräparationen.
DNA Fragmente wurden mit dem MinElute Gel Extraction Kit (Quiagen,
Hilden, Germany) nach Angaben des Herstellers gereinigt und gewonnen.
Plasmid DNA wurde mittels des Qiaprep sein Miniprep Kits (Quiagen,
Hilden, Germany) isoliert. Alle konstruierten Plasmide wurden durch
Restriktionsanalyse mit nachfolgender Sequenzierung verifiziert.
-
Beispiel 1: Konstruktion der Deletionsmutanten
von C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411
-
Das
Genom des C. glutamicum ATCC 13032 wurde bereits vollständig
bestimmt und ist im Internet in entsprechenden Datenbanken frei
zugänglich (Kalinowski, J., Bathe, B., Bartels,
D., Bischoff, N., Bott, M., Burkovski, A., Dusch, N., Eggeling,
L., Eikmanns, B. J., Gaigalat, L., Goesmann, A., Hartmann, M., Huthmacher, K.,
Krämer, R., Linke, B., McHardy, A. C., Meyer, F., Möckel,
B., Pfefferle, W., Pühler, A., Rey, D. A., Ruckert, C.,
Rupp, O., Sahm, H., Wendisch, V. F., Wiegräbe, I., Tauch,
A. (2003): The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome
sequence and its impact an the production of L-B. flavumartate-derived
amino acids and vitamins, Journal of Biotechnology 104: 5–25).
-
Die
Ermittlung der GDH-Gensequenz, welche die Glutamatdehydrogenase
codiert, erfolgte über die NCBI-Datenbank. Die DNA-Sequenz
ist unter Genbank X59404, X72855, BA000036 und BX927154 und die Proteinsequenz
unter PIR S32227 abgelegt. Um die Deletionsmutanten zu erhalten,
wurde zunächst das GDH-Gen aus C. glutamicum ATCC 13032
amplifiziert und in das Plasmid pK18mobsacB (Schäfer,
A., Tauch, A., Jäger, W., Kalinowski, J., Thierbach, G.,
Pühler, A. (1994), Small mobilizable multipurpose cloning
vectors derived form the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19:
selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium
glutamicum, Gene 145: 69–73) kloniert. Ausgehend
von diesem Plasmid (pK18mobsacB_GDH) wurde dann die Deletion im
GDH-Gen eingeführt. Dieses Plasmid (pK18mobsacB_ΔGDH)
mit dem verkürzten Gen wurde in den Zielorganismus transformiert.
Anschließend wurden die Transformaten selektioniert und
auf das deletierte Enzym hin getestet.
-
Das
ca. 2 kb große DNA-Fragment mit der Sequenz der Glutamat
Dehydrogenase wurde mit folgenden Primern amplifiziert:
- GDH
forw. (EcoRI): CCATTTGAGGGCGCTCGAATTCGTGGCC Seq. ID No. 1
- GDH rev. (SalI): GATGAAGCCAGTCGACCCAGCCACCAAGAT Seq. ID No.
2
-
Die
aufgereinigte DNA mit einer Länge von 2037 bp wurden einem
Restriktionsverdau mit den Enzymen EcoRI und SalI unterzogen (Seq.
ID NO: 4) und in den ebenfalls mit diesen Enzymen geschnittenen
Vektor pK18mobsacB kloniert (siehe 6 – Plasmidkarte
von pK18mobsacB GDH).
-
Für
die abschließende Konstruktion des Plasmides pK18mobsacB_ΔGDH
(Seq. ID NO: 3) wurde das Plasmid pK18mobsacB_GDH mit dem Enzym
EcoO109I inkubiert. Die entstandenen Enden wurden anschließend
mittels T4-DNA-Ligase wieder religiert.
Der resultierende Vektor pK18mobsacB_ΔGDH trägt
ein verkürztes GDH-Gen, das nach einer Transkription und
Translation nicht mehr zu einem aktiven GDH-Enzym führt (5).
-
Das
Plasmid wurde in C. glutamicum-Zellen ATCC 13032 und DSM 20411 mittels
Elektroporation transferiert. Da der Vektor in C. glutamicum nicht
repliziert werden konnte, waren nur Koloniebildungen der Zellen
im Medium mit Kanamycin möglich, die mittels homologer
Rekombination den Vektor ins Chromosom integriert hatten.
-
Die
Integration des Vektors sorgt für ein zweifaches Vorliegen
der flankierenden Bereiche des zu deletierenden Gens im Genom dieser
Mutanten. Im neu eingeführten Bereich fehlt jedoch die
deletierte Sequenz innerhalb des Gens. Durch eine zweite homologe
Rekombination kann der integrierte Vektor zusammen mit einer der
beiden identischen Sequenzbereiche wieder aus dem Genom gespalten
werden. Abhängig davon welcher der beiden DNA-Bereiche
das Genom verlässt, wird die Deletion im Genom etabliert
(zu 55%) oder der native Zustand wieder hergestellt (zu 45%). Die
Kolonien werden um den Verlust des Vektors zu begünstigen
im Medium ohne Selektionsdruck angezogen und anschließend
auf Nährböden, die 10% Saccharose enthalten, ausplattiert.
Die Selektion des zweiten homologen Rekombinationsereignisses kann
durchgeführt werden, da sich auf dem Vektor pK18mobsacB
das modifizierte sacB-Gen befindet. Durch die Anwesenheit von Saccharose
kommt es in Zellen, die den Vektor beinhalten, zur Bildung des Enzym
Levansucrase. Die Umsetzung von Saccharose zu Levan verleiht diesen
Zellen eine Saccharose-Sensitivität. Zellen, die auf Saccharose
haltigen, aber nicht auf Kanamycin haltigen Nährböden
wachsen können, haben den Vektor verloren.
-
Beispiel 2: Nachweis der Inaktivierung
der Glutamatdehydrogenase in C. glutamicum ATCC 13032_ΔGDH
und DSM 20411_ΔGDH
-
Der
Nachweis der Inaktivierung der Glutamat Dehydrogenase durch die
Gendeletion wurde durch Aktivitätstests durchgeführt.
Ein intaktes Gen ist für ein vollständig aktives
Enzym notwendig. Durch die Deletion der ca. 500 bp liegt eine starke
Veränderung der Sequenz vor, die sich auf die dreidimensionale
Struktur des daraus exprimierten Enzymes auswirkt. Die gebildete
Struktur kann aufgrund der fehlenden AS nicht mit der ursprünglichen
Form übereinstimmen. Aufgrund dieser Veränderungen
wird die Enzymaktivität beeinflusst.
-
Für
den vergleichenden Enzymtest wurden zunächst die Corynebacterium-Zellen
in Kaliumphosphat-Puffer so gelöst, dass in jeweils 800 μL
Zellsuspension eine OD600 von 45 vorlag.
Anschließend wurden die Zellsuspensionen mittels Kugelmühle
oder Ultraschall aufgeschlossen. NADPH dient als Co-Faktor des Enzymes
GDH. Für jedes gebildete Glutamat-Molekül wird
eine Molekül NADPH oxidiert. Bei 340 nm liegt das Absorptionsmaximum
von NADPH, NADP+ zeigt in diesem Wellenlängenbereich
keine Absorption.
-
Zur
Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität der GDH bzw. ΔGDH
wurde die Absorptionsabnahme bei λ = 340 nm aufgrund der
Umsetzung von NADPH zu NADP+ photometrisch
verfolgt. Die Messung erfolgte über einen Zeitraum von
5 min bei 30°C.
-
Die
Ergebnisse des Enzymtests sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tab. 2: Vergleich der Spezifische GDH-Aktivitäten
von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, DSM 20411 und deren GDH
Deletionsmutanten.
| Stamm | spezifische
Aktivität in μmol·mg–1·min–1 |
| ATCC
13032 | 2,76 |
| ATCC
13032_ΔGDH | - |
| DSM
20411 | 1,99 |
| DSM
20411_ΔGDH | - |
-
Die
spezifische Aktivität des Stammes ATCC 13032 lag bei 2,76 μmol·mg–1·min–1,
die spezifische Aktivität DSM 20411 war etwas geringer
(1,99 μmol·mg–1·min–1).
-
Die
beiden Deletionsmutanten zeigten keine erkennbaren Aktivitäten.
Die Werte bestätigen die Inaktivierung der Glutamat Dehydrogenase
durch die Deletion des GDH-Gens.
-
Beispiel 3: Untersuchung der Verhaltens
von ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH in Standard-Corynebacterium
Standardmedium
-
Für
einen Vergleich des Wachstumsverhaltens der beiden Stämme
in einer Flüssigkultur über einen längeren
Zeitraum, sowie der Gewinnung erster Werte über die Beeinflussung
der AKG Bildung durch die Deletion wurden die Stämme ATCC
13032 und ATCC 13032_ΔGDH in Corynebacterium-Standardmedium
kultiviert. Standardmedium
| Saccharose | 100
g |
| (NH4)2SO4 | 10
g |
| MgSO4·7 H2O | 1
g |
| KH2PO4 | 2
g |
| CSL | 15
g |
| Zitronensäure | 1,0000
g |
| L-Isoleucin | 0,150
g |
| FeSO4·H2O | 0,02
g |
| MnSO4·5 H2O | 0,01
g |
| ZnSO4·7 H2O | 0,032
g |
| CuSO4·5 H2O | 0,0010
g |
| Calcium-D-Pantothenat | 0,001
g |
| Betain
Base | 0,50
g |
| myo-Inositol | 0,10
g |
| Nicotinsäure | 0,0005
g |
| MOPS | 10
g |
| CaCO3 | 15
g |
| D-(+)-Biotin | 0,00050
g |
| Thiamin-HCl | 0,0010
g |
| Wasser | ad
1 L |
-
Hierfür
wurden vier 500 mL Kolben jeweils mit 50 mL Produktionsmedium befüllt.
Zu je zwei der Kolben wurde 5 mM Glutaminsäure hinzugegeben.
Je zwei unterschiedliche Kolben wurden mit einem der beiden Stämme
inokuliert.
-
Es
erfolgten Probennahmen bei 0 h, 7 h, 24 h und 30 h Endprobe), die
auf die Bildung α-Ketoglutarat (AKG) hin untersucht wurden. Tab. 3: Quantitative Bestimmung von AKG
in den Proben des Standardmediums: +: mit 5 mM Glutaminsäure-Zusatz, –:
ohne Zusatz von Glutaminsäure.
| Probe | AKG
in g/L |
| ATCC
13032 0 h – | << 0,03 |
| ATCC
13032 0 h + | << 0,03 |
| ATCC
13032 7 h – | < 0,03 |
| ATCC
13032 7 h + | << 0,03 |
| ATCC
13032 24 h – | 0,2 |
| ATCC
13032 24 h + | 0,2 |
| ATCC
13032 30 h – | 0,4 |
| ATCC
13032 30 h + | 0,4 |
| ATCC
13032_ΔGDH 0 h – | << 0,03 |
| ATCC
13032_ΔGDH 0 h + | << 0,03 |
| ATCC
13032_ΔGDH 7 h – | < 0,03 |
| ATCC
13032_ΔGDH 7 h + | << 0,03 |
| ATCC
13032_ΔGDH 24 h – | 0,2 |
| ATCC
13032_ΔGDH 24 h + | 0,2 |
| ATCC
13032_ΔGDH 30 h – | 0,5 |
| ATCC
13032_ΔGDH 30 h + | 0,4 |
-
Aus
den ermittelten Werten (siehe Tabelle 3) ist zu erkennen, dass die
gefundene Menge an AKG äußerst gering waren. Die
Proben selbst unterschieden sich unabhängig von dem Zusetzen
der Glutaminsäure kaum in ihrer AKG-Konzentration. Die
Deletionsmutante zeigte ebenfalls im Vergleich zum Ursprungsstamm keine
AKG-Anreicherung. Die bloße Deletion des GDH-Gens führte
demnach nicht zu einer Akkumulation des AKGs.
-
Beispiel 3: Vergleich der α-Ketoglutarat-Bildung
von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM
20411 und DSM 20411_ΔGDH in Minimalmedium
-
-
Minimalmedium
-
-
| FeSO4·7 H2O |
28,5
g |
| MnSO4·H2O |
16,5
g |
| ZnSO4·7 H2O |
6,4
g |
| CuSO4·5 H2O |
0,764
g |
| CoCl2·6 H2O |
0,129
g |
| NiCl2·6 H2O |
0,044
g |
| H3BO3 |
0,048
g |
| Wasser |
ad
1 L |
-
Lösen
der Spurenelemente durch Ansäuerung mit H2SO4 auf pH 1.
- – 100
mM CaCl2-Lösung
- – 1 M MgSO4-Lösung
- – 50% D-(+)-Glucose-Lösung
- – Grundbestandteile des CgC-Mediums
| MOPS | 42
g |
| (NH4)2SO4 | 20
g |
| Harnstoff | 5
g |
| KH2PO4 | 0,5
g |
| K2H2O4 | 0,25
g |
| Wasser | ad
1 L |
-
Die
Grundbestandteile wurden in ca. 300 mL Wasser gelöst, der
pH-Wert auf 7,0 mit NaOH eingestellt und die Medien autoklaviert.
Anschließend wurden die fehlenden Bestandteile so ergänzt,
dass ein Endvolumen von 1 L vorlag.
| CaCl2-Lösung | 10
mL |
| MgSO4-Lösung | 10
mL |
| D-(+)-Glucose-Lösung | 50
mL |
| Spurenelemente-Lösung | 1
mL |
| Biotin | 200
mg |
-
Im
Vergleich zum Standardmedium war bereits durch den Einsatz des Minimalmediums
eine unterschiedliche Akkumulation von AKG zu erkennen (siehe 7 – Vergleich
der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC
13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und
DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium). Die jeweiligen Deletionsmutanten
verzeichnen einen höheren AKG-Gehalt im Vergleich zu ihren
Ursprungstämmen. Corynebacterium glutamicum DSM 20411_ΔGDH
wies im Vergleich zu den anderen Stämmen eine mehr als
10 mal so hohe Konzentration an AKG auf. Nach 30 h hatte in etwa
eine Verdoppelung des 20 h Wertes stattgefunden.
-
Beispiel 4: Vergleich der α-Ketoglutarat-Bildung
von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM
20411 und DSM 20411_ΔGDH in Minimalmedium mit reduzierter
Biotion-Konzentration
-
Dieses
Medium enthielt Biotin in einer verminderten Konzentration (5 μg/L)
gegenüber dem oben beschriebenen Minimalmedium. Die Aktivität
des ODHC (Oxoglutarat – Dehydrogenase-Komplexes) wird dadurch
reduziert und der Abfluss von AKG im Citrat-Zyklus (siehe 2)
vermindert (8 – Vergleich der AKG-Akkumulation
der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411
sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH
im Minimalmedium mit 5 μg/L Biotin).
-
Beispiel 5: Vergleich der α-Ketoglutarat-Bildung
von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM
20411 und DSM 20411_ΔGDH in Minimalmedium mit Zusatz des
Hemmers der Glutaminsynthetase Methioninesulfoximin (MSX)
-
Diesem
Minimalmedium wurde sowohl 5 mM des Inhibitors der Glutaminsynthetase
MSX (Methioninesulfoximin) zugesetzt, als auch die auf Biotin-Konzentration
auf 5 μg/L vermindert. Die Kombination hatte das Ziel die
Aktivität des ODHC zu vermindern und das GS/GOGAT-System
zu deaktivieren. Inhibitoren wie Methioninsulfoximin (MSX) können
in bestimmten Systemen als Glutamat-Antagonisten wirken und z. B.
die Glutamin-Synthetase inhibieren. Die Inhibition der Glutaminsynthetase
durch MSX ist irreversibel (9 – Vergleich
der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC
13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH
und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium mit 5 μg/L
Biotin und 5 mM MSX.).
-
Beispiel 6: Vergleich der α-Ketoglutarat-Bildung
von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM
20411 und DSM 20411_ΔGDH in Minimalmedium mit Zusatz von
1 M Ammoniumsulfat als einzige Stickstoffquelle
-
Dieses
abgewandelte Minimalmedium enthielt 1 M (NH4)2SO4 als einzige
Stickstoffquelle. Eine erhöhte Ammonium-Konzentration im
Medium vermindert die Aktivität des GS/GOGAT-Systems. Die
Aktivität der GDH, die sich reziprok zur GS/GOGAT-Aktivität
verhält, sollte daher ansteigen. Als Folge der Deletion
der GDH wird der Abbau des AKG durch dieses Enzym verhindert und
auch die Umwandlung durch das GS/GOGAT-System vermindert (10 – Vergleich
der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC
13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH
und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium mit 1 M Ammoniumsulfat
als einzige Stickstoffquelle).
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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