DE69920568T2

DE69920568T2 - Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 4-Halo-3-hydroxybuttersäureester

Info

Publication number: DE69920568T2
Application number: DE69920568T
Authority: DE
Inventors: Hiroaki Tsukuba-shi Yamamoto
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1999-05-10
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-05-11
Also published as: EP0955375A2; JP2000189170A; EP0955375A3; EP0955375B1; DE69920568D1; US6855525B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester, wobei Acetoacetyl-CoA-Reduktase verwendet wird, die Poly-β-hydroxyfettsäure-Synthase umfasst.
Bekannte Verfahren zur Herstellung des optisch aktiven (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester beinhalten ein asymmetrisches Reduktionsverfahren, wobei 3-α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (Japanisches Patent, das mit der Veröffentlichungs-Nr.: Hei 1-277494 offen gelegt wurde) und Mikroorganismen wie Bäckerhefe (J. Am. Chem. Soc. 105, 5925-5926 (1983); Japanisches Patent, das mit der Veröffentlichungs-Nr. Sho 61-146191 offen gelegt wurde) oder Stemphylium, Alternaria, Corynespora oder Torulaspora ( US 5413921 ) verwendet wurden. Es wurde berichtet, dass das D-Enzym-1 und das D-Enzym-2 die Enzyme der Bäcker-Hefe sind, die 4-Haloacetessigsäureester reduzieren, wobei der (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester entsteht (J. Org. Chem. 56, 4778-4483 (1991)). Von diesen Enzymen zeigte es sich, dass das D-Enzym-2 basierend auf seinem Molekulargewicht, etc. die Fettsäure-Synthase ist (J. Am. Chem. Soc. 107, 2993 (1985)).
Bei der Synthese von optisch aktivem (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester durch Reduktion des 4-Haloacetessigsäureester unter Verwendung von Bäcker-Hefe ist jedoch die enzymatische Aktivität zu gering, um das gewünschte Produkt in einer hohen Konzentration zu produzieren. Darüber hinaus ist es schwierig (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester mit einer hohen optischen Reinheit stabil zu synthetisieren, da die Bäcker-Hefe ein Enzym besitzt, das 4-Haloacetessigsäureester reduziert, wobei (R)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester entsteht.
Zusätzlich wurde berichtet, dass die Fettsäure-Synthase, die in Bäcker-Hefe hauptsächlich an der Synthese von (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester beteiligt ist, schnell durch SH-Reagenzien wie Jodacetamid, Quecksilber und p-(Chlormercuri) benzoesäure gehemmt wird. So wird erwartet, dass das Enzym von dem Substrat 4-Haloacetessigsäureester und dem Produkt 4-Halo-3-hydroxybuttersäureester gehemmt wird. Aus dem Grund wird die Bäcker-Hefe zur Herstellung von (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester in großer Menge nicht bevorzugt.
Es ist auch vorstellbar, (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester mit einer hohen optischen Reinheit zu synthetisieren, indem man die Fettsäure-Synthase der Bäcker-Hefe in hohem Maße mit einer hohen spezifischen Aktivität in heterologen Mikroorganismen exprimiert, wobei gentechnische Verfahren verwendet werden. Die Fettsäure-Synthase der Bäcker-Hefe ist jedoch ein außerordentlich komplexes multikatalytisches Enzym, bei dem die α-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 208.000, bestehend aus 1.894 Aminosäureresten, und die β-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 229.000,. bestehend aus 2.051 Aminosäureresten (J. Biol. Chem. 263, 12315-12325 (1988)), einen α6β6-Komplex ausbilden (J. Biol. Chem. 253, 4464-4475 (1978)); das neben der β-Keto-Gruppe reduzierenden Aktivität (β-Ketoacyl-ACP reduzierende Aktivität) acht verschiedene Aktivitäten besitzt, beinhaltend die Acyl-Trägerprotein (ACP)-Aktivität, ACP-S-Acetyl-Transferase-Aktivität, ACP-S-Malonyl-Transferase-Aktivität, β-Ketoacyl-ACP-Synthase-Aktivität, β-Hydroxyacyl-ACP-Dehydrogenase-Aktivität, Enoyl-ACP-Reduktase-Aktivität und Palmitoyl-Transferase-Aktivität. Aus diesem Grund ist es nicht leicht diese Synthase in heterologen Mikroorganismen in hohem Maße zu exprimieren. In einem Versuch, FAS1 und FAS2 zum Beispiel in Minizellen von E. coli zu exprimieren, gelang es, wie berichtet wurde, nicht die Enzyme in vollständiger Länge nachzuweisen (Ann. Rev. Biochem. 52, 537-579 (1983)).
Die Domäne für die β-Ketoacyl-ACP reduzierende Aktivität, von der erwartet wird, dass sie die 4-Haloacetessigsäureester-Reduktase-Aktivität zeigt, befindet sich, wie basierend auf der Aminosäuresequenz gezeigt wurde, innerhalb der α-Untereinheit der Fettsäure-Synthase. Es wurde jedoch berichtet, dass die Untereinheit alleine die β-Ketoacyl-ACP reduzierende Aktivität nicht exprimierte, wenn die α-Untereinheit durch Einfrieren und Auftauen in einer hohen Salzkonzentration (Biochem. J. 109,312-314 (1968)) und nach Lysin-Modifikation mit Dimethylmaleinsäureanhydrid vollständig dissoziiert wurde (Eur. J. Biochem. 94, 189-197 (1979)). Es wurde auch berichtet, dass die Ethylacetacetat reduzierende Aktivität nicht durch Fettsäure-Synthase mit einer α6β6-Struktur exprimiert wurde, sondern nur mit einer α2β2-Struktur exprimiert wurde (MG 800.000) (Eur. J. Biochem. 172, 633-639 (1988)). Deshalb ist bisher nicht geklärt worden, welche Domäne der Fettsäure-Synthase für die 4-Haloacetessigsäure reduzierende Aktivität notwendig ist und wie es möglich ist, die Struktur (α2β2) effizient herzustellen, die die 4-Haloacetessigsäureester reduzierende Aktivität exprimiert.
Die Verwendung von Acetoacetyl-CoA-Reduktase zur Herstellung von Poly-β-D-hydroxybuttersäure ist in WO 93/02187 offenbart.
Somit war das technische Problem der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, um (S)-4-Halo-3-hydroxy-uttersäureester in großen Mengen und mit einer hohen optischen Reinheit herzustellen.
Die Lösung des technischen Problems wird durch das Bereitstellen der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen charakterisiert sind.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren bereitzustellen, um (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester effizient herzustellen, wobei ein Enzym verwendet wird, das das Poly-β-hydroxyfettsäure-Biosynthesesystem darstellt.
Fettsäure-Synthase wird strukturell in vier Typen klassifiziert, IA, IB, IC und II (Shin Seikagaku Jikken Koza (New Biochemical Experiment) 4, Shisitu (Lipids) I, S. 34-37). Tiere, einschließlich Menschen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8695 (1995)), haben Typ IA-Synthase, die ein Homodimer (MG ungefähr 500.000) aus α-Untereinheiten (MG etwa 250.000) umfasst, und alle die vorstehend beschriebenen acht verschiedenen Aktivitäten der Fettsäure-Synthase besitzt. Hefen, einschließlich Bäcker-Hefe, und Pilze haben Typ IB-Synthase von einer α6β6-Struktur (MG etwa 2.400.000), die aus α-Untereinheiten (MG etwa 210.000) und β-Untereinheiten (MG etwa 200.000) besteht und die alle die Fettsäure-Synthase-Aktivitäten exprimieren. Bakterien wie Brevibacterium ammoniagenes (Eur. J. Biochem. 247, 268 (1977)) und Microbacterium smegmatis (Physiol. Rev. 56, 339 (1976)) haben eine Typ IC-Synthase von einer α6-Struktur, die aus α-Untereinheiten besteht (MG etwa 250.000) und die alle die Fettsäure-Synthase-Aktivitäten besitzen. Pflanzen wie Brassica napus (Biochem. Biophys. Acta, 1120, 151 (1992)) und Algen, Bakterien wie Escherichia coli, Actinomyceten und Viren haben Typ II-Synthase, bei der einzelne Reaktionen der Fettsäure-Synthase mit verschiedenen Enzymproteinen durchgeführt werden.
Dadurch, dass man auf die β-Ketoacyl-ACP-Reduktase aufmerksam wurde, die unter diesen verschiedenen Typen von Enzymen in die Typ II-Fettsäure-Synthase klassifiziert wurde, die sowohl in der Struktur als auch in den Funktionen einfacher ist, bezüglich des Molekulargewichts kleiner ist (MG der Untereinheit beträgt etwa 20.000 bis 40.000) im Vergleich zu Typ I-Enzymen (IA, IB und IC) und nicht durch SH-Reagenzien gehemmt wird, glaubte man, dass es möglich sein müsste (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester in einer großen Menge zu produzieren und einen mikrobiellen Stamm unter Verwendung von gentechnischen Verfahren zu erzeugen, der in der Lage ist, (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester in großer Menge zu produzieren, falls das Enzym die Aktivität besitzt, 4-Haloacetessigsäureester zu reduzieren.
Deshalb wurde versucht, die β-Ketoacyl-ACP-Reduktase, die die Typ II-Fettsäure-Synthase darstellt, zu isolieren, um deren reduzierende Aktivität bezüglich 4-Haloacetessigsäureester zu untersuchen.
Es wurde untersucht, ob Acetoacetyl-CoA-Reduktasen (im Allgemeinen als phbB oder phaB bezeichnet), eines der Enzyme, die das Poly-β-hydroxyfettsäure-(PHA)-Biosynthesesystem darstellen, in der Lage sind, 4-Chlor-acetessigsäureester asymmetrisch wie die β-Ketoacyl-ACP-Reduktase zu (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester zu reduzieren. Spezifisch wurde das Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gen aus Ralstonia eutropha isoliert, das resultierende Gen wurde zu seiner Expression in Escherichia coli eingebracht und die exprimierte Acetoacetyl-CoA-Reduktase wurde verwendet, um 4-Chloracetessigsäureester zu reduzieren. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass das Enzym eine hohe reduzierende Aktivität und Stereoselektivität besitzt, um (S)-4-Chlor-3-hydroxybuttersäureester herzustellen.
Es wurde auch gefunden, dass Acetoacetyl-CoA-Reduktase nahezu keine Reaktivität mit beiden optischen Isomeren des 4-Chlor-3-hydroxybuttersäureesters zeigt und praktisch ausschließlich als die Reduktase funktioniert, die für die Synthese von (S)-4-Chlor-3-hydroxybuttersäureester bevorzugt wird.
Darüber hinaus wurde versucht den Reduktions-Reaktionszyklus effizient zu beschleunigen, indem das Co-Enzym (NADPH oder NADH) regeneriert wird, das im Zusammenhang mit der asymmetrischen Reduktion von 4-Chloracetessigsäureester in diesem reduzierenden Reaktionssystem verbraucht wird. Dabei wurden ein Gen, das Glucose-Dehydrogenase codiert, die in der Lage ist, das Co-Enzym (NADPH oder NADH) zu regenerieren, und ein Gen, das Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert, in Escherichia coli eingebracht, wobei ein E. coli-Stamm erhalten wurde, der in der Lage war, diese Enzyme zu produzieren. Dann wurde Ethyl-4-haloacetacetat reduziert, wobei die so erhaltenen Transformanten verwendet wurden, um den Ertrag und die optische Reinheit des derart produzierten Ethyl-(S)-chlor-3-hydroxybutyrats zu messen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass das rekombinante Enzym, das von dem Escherichia coli-Stamm produziert wurde, eine hohe enzymatische Aktivität besitzt, die zur Herstellung von Ethyl-(S)-chlor-3-hydroxybutyrat mit einer hohen optischen Reinheit gut geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester, wobei 4-Haloacetessigsäureester oder Derivate davon mit Acetoacetyl-CoA-Reduktase, einem der Enzyme, die das Poly-βhydroxyfettsäure-Biosynthese-System darstellen, umgesetzt wird. Mehr spezifisch betrifft sie:

(1) ein Verfahren zur Herstellung von (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester, umfassend die asymmetrische Reduktion von 4-Haloacetessigsäureester oder von Derivaten davon mit Acetoacetyl-CoA-Reduktase (EC1.1.1.1.36), die das Poly-βhydroxyfettsäure-Biosynthese-System darstellt, um (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester zu erzeugen,
(2) ein Verfahren nach (1), wobei die Acetoacetyl-CoA-Reduktase aus Mikroorganismen stammt, die zur Gattung Ralstonia gehören,
(3) ein Verfahren nach (2), wobei die Acetoacetyl-CoA-Reduktase aus Ralstonia eutropha stammt,
(4) das Verfahren nach einem der Punkte (1) bis (3), wobei die Acetoacetyl-CoA-Reduktase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO.: 9; (b) einem Protein, umfassend eine modifizierte Aminosäuresequenz von SEQ ID NO.: 9, in der eine oder mehrere Aminosäurereste hinzugefügt, entfernt oder ersetzt sind, das in der Lage ist, 4-Haloacetessigsäureester oder Derivate davon asymmetrisch zu reduzieren, um (S)-4-Halo3-hydroxybuttersäureester zu erzeugen; und (c) einem Protein, das von DNA codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit DNA, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO.: 10 umfasst, hybridisierbar ist, und das in der Lage ist, 4-Haloacetessigsäureester oder Derivate davon asymmetrisch zu reduzieren, um (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester zu erzeugen,
(5) das Verfahren nach einem der Punkte (1) bis (4), wobei der 4-Haloacetessigsäureester 4-Chlor-acetessigsäureester ist,
(6) das Verfahren nach einem der Punkte (1) bis (4), wobei der 4-Haloacetessigsäureester Ethyl-4-chlor-acetacetat ist,
(7) das Verfahren nach einem der Punkte (1) bis (6), wobei das Verfahren einen Mikroorganismus, der in der Lage ist, Acetoacetyl-CoA-Reduktase (EC1.1.1.36) zu erzeugen, die das Poly-β-hydroxyfettsäure-Biosynthese-System darstellt und ein Enzym verwendet, das die Erzeugung von NAD(P)H aus NAD(P)⁺ katalysiert,
(8) das Verfahren nach Punkt (7), wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist, der mit heterologer oder homologer DNA transformiert ist, die die Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert, die das Poly-β-hydroxyfettsäure-Biosynthese-System darstellt, sowie mit heterologer oder homologer DNA, die ein Enzym codiert, das die Erzeugung von NAD(P)H aus NAD(P)⁺ katalysiert, und der beide Enzyme exprimieren kann, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform der Mikroorganismus der vorstehenden Methode von der Gattung Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus oder Hefe, vorzugsweise Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Hansenula, Pichia oder Candida, oder Pilzen, vorzugsweise Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium oder Trichoderma stammt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter wie folgt durchgeführt werden:
(9) das Verfahren nach Punkt (8), wobei der Mikroorganismus Escherichia coli ist, und
(10) das Verfahren nach einem der Punkte (7) bis (9), wobei das Enzym, das die Erzeugung von NAD(P)H aus NAD(P)⁺ katalysiert, Glucose-Dehydrogenase ist.

Die Figuren zeigen:
1 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pSE420D. P(trc) repräsentiert den trc-Promotor, T(rrnB) den rrnB T1T2-Terminator, Amp das β-Laktamase-Gen für Ampicillin-Resistenz und ori den Replikationsursprung des Plasmids.
2 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pSG-AERl. P(trc) repräsentiert den trc-Promotor, AephbB das Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gen, das von Ralstonia eutropha abstammt, BsG1cDH das Glucose-Dehydrogenase-Gen, das von Bacillus subtilis abstammt, T(rrnB) den rrnB T1T2-Terminator, Amp das β-Laktamase-Gen für Ampicillin-Resistenz und ori den Replikationsursprung des Plasmids.
Das Verfahren zur Herstellung von (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester der vorliegenden Erfindung verwendet Acetoacetyl-CoA-Reduktase (EC 1.1.1.36), die das PHA-Biosynthese-System darstellt.
Poly-β-Hydroxyfettsäure (PHA) wird, wie bekannt ist, in mehr als 100 verschiedenen prokaryontischen Mikroorganismen angereichert, einschließlich der Gattungen Alcaligenes, Aphanothece, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas, Rhodospirillum und Actinomyces. Das PHA-Biosynthese-System umfasst 3-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA-Reduktase und PHA-Synthase. Unter diesen umfasst Acetoacetyl-CoA-Reduktase ein Tetramer aus Untereinheiten mit einem MG von 20.000 bis 40.000 und verwendet vorzugsweise Nikotinamid-Adenin-Dinucleotidphosphat (NADPH) als Co-Enzym für die Reduktionsreaktion. Sie kann auch ein ökonomischeres und hochgradig stabiles reduziertes Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (NRDH) als das Co-Enzym verwenden und ist somit industriell von Vorteil.
Jede beliebige Acetoacetyl-CoA-Reduktase kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ungeachtet ihres Ursprungs, sofern es sich um Acetoacetyl-CoA-Reduktase handelt, die an der PHA-Biosynthese beteiligt ist. Beispiele dafür beinhalten Acetoacetyl-CoA-Reduktase, die von Acinetobacter sp. RA3849 abstammt (J. Bacteriol. 177, 4501-4507 (1995)), Ralstonia eutropha (früher Alcaligenes eutrophus genannt, FEMS Microbiol. Lett. 52, 259-264 (1988)), Alcaligenes latus (J. Microbiol. Biotechnol. 6, 425-431 (1996)), Alcaligenes sp. SH-69 (DDBJ-Hinterlegungs-Nr. AF002014), Azospirillum brasilense (J. Gen. Microbiol. 136, 1191-1196 (1990), Mol. Gen. Genet. 231, 375-384(1992)), Azotobacter beijerinckii (Biochem. J. 134, 225-238 (1973)), Bacillus megaterium (Can. J. Microbiol. 41 (Erg.l), 77-79 (1995)), Chromatium vinosum D-Stamm (Eur. J. Biochem. 209, 135-150 (1992)), Ectothiorhodospira shaposhnikovii (Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 292-300 (1993)), Lupinus luteus (Plant Soil, 56 379-390 (1980)), Methylobacterium extorquens (FEMS Microbiol. Lett. 156, 275-279 (1997)), Methylobacterium rhodesianum MB 126 (Arch. Microbiol. 161, 277-280 (1994)), Paracoccus denitricans (FEMS Microbiol. Rev. 103, 257-264 (1992), FEMS Microbiol. Lett. 133, 85-90 (1995)), Pseudomonas sp. (DDBJ-Hinterlegungs-Nr. Z8056), Rhizobium lupini (Fiziol. Rast. (Moskau) 27, 544-550 (1980)), Rhizobium meliloti 41 oder Sinorhizobium meliloti (Microbiology, 141, 2553-2559 (1995)), Rhodococus rubber NCIMB 40126 (FEMS Microbiol. Rev., 103, 93-101 (1992)), Synechococcus sp. (Japanisches Patent, offen gelegt mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 8-187085), Synthrophomonas wolfei subsp. wolfei (Arch. Microbiol. 159, 16-20 (1993)), Thiocapsa pfennigii (Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 292-300 (1993)) und Zoogloea ramigera I-16-M (Arch. Microbiol. 114, 211-217 (1977), J. Biol. Chem. 262, 97-102 (1987)).
Falls die Nucleotidsequenz des Gens bekannt ist, das Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert, kann die codierende Region unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) isoliert werden. Das Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gen kann auch aus verschiedenen Organismen isoliert werden, indem die Ziel-DNA mit DNA, die Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert und zum Beispiel von Ralstonia eutropha abstammt (SEQ ID NO.: 10, die Aminosäuresequenz des Enzyms ist in SEQ ID NO.: 9 gezeigt), oder DNA, die von anderen Organismen hergestellt wurde, unter stringenten Bedingungen hybridisiert wird, wobei die Bereiche der vorstehenden Enzym codierenden DNA als Sonde verwendet werden. Darüber hinaus ist es auch möglich, das Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gen aus verschiedenen Organismen zu isolieren, indem die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Primern verwendet wird, die aufgrund einer Region mit einer hohen Homologie (wie die NADPH-Bindungsregion) des Gens, das Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert und der chromosomalen DNA oder cDNA eines Zielorganismus als Matrize entworfen wurden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur natürlich vorkommende Enzyme verwendet werden, sondern auch davon verschiedene Enzyme, die eine modifizierte Aminosäuresequenz des natürlichen Enzyms besitzen, sofern die verschiedenen Enzyme funktionell mit dem natürlich vorkommenden Enzym äquivalent sind. Solche Modifikationen der Aminosäuresequenz können durch das Verfahren, in dem BAL31-Exonuclease III verwendet wird, dem Kunkel-Verfahren, und mit Hilfe der PCR durchgeführt werden, die den Fachleuten gut bekannt sind (Labomanual Genetic Engineering, 3rd Ausg., S. 219-230, Maruzen). Da die Aminosäure-Substitution spontan auftreten kann, können nicht nur Enzyme in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die eine artifiziell modifizierte Aminosäure besitzen, sondern auch Enzyme mit einer spontan modifizierten Aminosäuresequenz.
In der vorliegenden Erfindung wird die "asymmetrische Reduktion von 4-Haloacetessigsäureester oder von dessen Derivaten, wobei Acetoacetyl-CoA-Reduktase verwendet wird", nicht notwendigerweise unter Verwendung des gereinigten Enzyms durchgeführt. Die Mikroorganismen und Pflanzen, die dieses Enzym enthalten, oder ihre behandelten Produkte können auch verwendet werden. Es wird insbesondere bevorzugt Organismen zu verwenden, die mit einem heterologen oder homologen Gen transformiert sind, das Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert, wobei gentechnische Verfahren verwendet wurden, um ein hohes Expressionsniveau des Enzyms oder hohe Mengen der behandelten Produkte des Organismus zu gewährleisten. Falls der Organismus, der Acetoacetyl-CoA-Reduktase enthält, auch das Enzym, das 4-Haloacetessigsäureester oder dessen Derivate reduziert besitzt, um (R)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester zu synthetisieren, wird ein solcher Organismus vorzugsweise mutiert, um diese (R)-Enantiomere erzeugenden Enzyme durch die natürliche oder artifizielle Mutation oder mit Hilfe rekombinanter DNA-Verfahren auszulöschen.
Die Wirts-Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie mit DNA transformiert werden können, die das Polypeptid codiert, das die Aktivität der Acetoacetyl-CoA-Reduktase besitzt, und sie diese Enzym-Aktivitäten exprimieren. Spezifische Beispiele dafür beinhalten Bakterien, für die das Wirts-Vektorsystem entwickelt wurde, wie die Gattung Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus und Lactobacillus, Hefen wie Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Hansenula, Pichia und Candida und Pilze wie die Gattung Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium und Trichoderma.
Transformanten können hergestellt werden, indem Verfahren verwendet werden, die herkömmlicherweise in dem Feld der Molekularbiologie, Biotechnologie und der Gentechnik verwendet werden (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories). Um das Gen für die erfindungsgemäße Acetoacetyl-CoA-Reduktase in Mikroorganismen und ähnlichen Wirten zu exprimieren, ist es als erstes notwendig das Gen in ein Plasmid oder einen Phagen-Vektor einzubringen, das/der in einem Mikroorganismus in stabiler Form vorliegen kann, um die genetische Information zu transkribieren und zu translatieren. Für diesen Zweck kann als die Einheit zur Kontrolle der Transkription und Translation stromaufwärts von der 5'-Seite des Gens ein Promotor und stromabwärts von der 3'-Seite des Gens ein Terminator beinhaltet sein. Jeder beliebige Promotor und Terminator können verwendet werden, insofern diese in Mikroorganismen funktionieren, die als der Wirt verwendet werden sollen. Vektoren, Promotoren und Terminatoren, die in verschiedenen Mikroorganismen funktionieren, sind in "Biseibutugaku Kisokoza (Fundamental Microbiology), 8, Idenshikogaku (Genetic Engineering); Kyoritsu" ausführlich beschrieben, insbesondere diejenigen, die in Hefe verwendet werden können, in Adv. Biochem. Eng. 43, 78-102 (1980) und Yeast 8, 423-488 (1992).
So können zum Beispiel in der Gattung Escherichia, insbesondere in Escherichia coli, pBR- und pUC-Serien als Plasmid-Vektor verwendet werden. Beispiele für die Promotoren beinhalten diejenigen, die von lac (β-Galactosidase), trp (Tryptophan Operon), tac (lac und trp fusioniert), Phage λ PL und PR abstammen. Die Terminatoren beinhalten den trpA-Terminator und den ribosomalen rrnB Terminator.
In der Gattung Bacillus können die Plasmid pUB110 pC194-Serien als Vektor verwendet werden. Diese Vektoren können in Chromosomen integriert werden. Als der Promotor und der Terminator können diejenigen für apr (alkalische Protease), npr (neutrale Protease) und amy (.-Amylase) verwendet werden.
In der Gattung Pseudomonas wurden Wirt-Vektor-Systeme in Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia etc. entwickelt. Es können Vektoren mit einem breiten Wirtsspektrum verwendet werden, wie pKT240 (umfassend das Gen, das für die autonome Replikation erforderlich ist und von RSF1010 abstammt oder ähnliche), entwickelt auf der Grundlage des Plasmids TOL, das bei der Degradation von Toluol-Verbindungen beteiligt ist. Ein Beispiel für den Promotor und Terminator, die verwendet werden können, sind diejenigen des Lipase-Gens (Japanisches Patent, das mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 5-284973 offengelegt wurde).
In der Gattung Brevibacterium, insbesondere in Brevibacterium lactofermentum, kann ein Plasmid-Vektor wie pAJ43 (Gene 39, 281 (1985)) verwendet werden. In diesem Vektor können die Promotoren und Terminatoren verwendet werden, die bei Escherichia coli benutzt werden.
Bei der Gattung Corynebacterium, insbesondere in Corynebacterium glutamicum, können Plasmid-Vektoren wie pCS11 (Japanisches Patent, das mit der Veröffentlichungs-Nr. Sho 57- 183799 offengelegt wurde) und pCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)) verwendet werden.
Bei der Gattung Streptococcus können pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)) und pGK1 (Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)) als Plasmid-Vektor verwendet werden.
Bei der Gattung Lactobacillus kann der Vektor pAMβ1 (J. Bacteriol. 137, 614 (1979)), der für die Gattung Streptococcus entwickelt wurde, und der Promotor, der in Escherichia coli verwendet wird, eingesetzt werden.
In der Gattung Saccharomyces, insbesondere in Saccharomyces cerevisiae können die Plasmide der YRp-Serie, YEp-Serie, YCp-Serie und YIp-Serie verwendet werden. Der Integrations-Vektor, der die homologe Rekombination mit der ribosomalen RNA verwendet, die in zahlreichen Kopien im Chromosom vorliegt ( EP 537456 ) ist außerordentlich nützlich, da er die Integration von multiplen Kopien eines Gens und deren stabile Erhaltung erlaubt. Die Promotoren und Terminatoren, die in dieser Hefe verwendet werden können, sind diejenigen für ADH (Alkohol-Dehydrogenase), GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase), PHO (saure Phosphatase), GAL (β-Galactosidase), PGK (Phosphoglyceratkinase) und ENO (Enolase).
In der Gattung Kluyveromyces, insbesondere in Kluyveromyces lactis, beinhalten Beispiele für Vektoren die Plasmide der 2 μm-Serie, die von Saccharomyces cerevisiae abstammen, der pKD1-Serie (J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)), Plasmide, die von pKG11 abstammen und für die Killer-Aktivität zuständig sind, der KARS-Serie, die das autonome Replikationsgen in der Gattung Kluyveromyces ist, und das Vektor-Plasmid, das in der Lage ist durch die homologe Rekombination mit ribosomaler RNA in das Chromosom zu integrieren ( EP 537456 ). Promotoren und Terminatoren, die von ADH, PGK etc. abstammen, können verwendet werden.
In der Gattung Schizosaccharomyces sind die Vektoren, die verwendet werden können, ARS (das autonome, mit der Replikation in Zusammenhang stehende Gen), das von Schizosaccharomyces pombe abstammt, und der Plasmid-Vektor, der den Selektionsmarker enthält, der die Autotrophie komplementiert, die von Saccharomyces cerevisiae abstammt (Mol. Cell Biol. 6, 80 (1986)). Der ADH-Promotor, der von Schizosaccharomyces pombe abstammt, kann verwendet werden (EMBO J. 6, 729 (1987)).
In der Gattung Zygosaccharomyces kann der Plasmid-Vektor verwendet werden, der auf pSB3 (Nucleic Acids Res.13, 4267 (1985)) basiert, das von Zygosaccharomyces rouxii abstammt. Beispiele für Promotoren sind der PH05-Promotor, der von Saccharomyces cerevisiae abstammt, der GAP-Zr (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase)-Promotor, der von Zygosaccharomyces rouxii abstammt (Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)).
In der Gattung Hansenula wurde der Wirt-Vektor in Hansenula polymorpha entwickelt. Die autonomen, mit der Replikation in Zusammenhang stehenden Gene HARS1 und HARS2, die von Hansenula polymorpha abstammen, können als Vektor verwendet werden. Da sie relativ instabil sind, ist die Integration von zahlreichen Kopien in das Chromosom wirkungsvoll (Yeast 7, 431-443 (1991)). Der AOX-Promotor (Alkohol-Oxidase), der durch Methanol induziert wird, und der FDH (Formiat-Dehydrogenase-Promotor) können verwendet werden.
Bei der Gattung Pichia wurde das Wirt-Vektor-System in Pichia pastoris entwickelt, wobei die Gene (PARS1 und PARS2) verwendet wurden, die an der autonomen Replikation von Pichia beteiligt sind (Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)). In diesem Vektor kann ein potenter Promotor wie AOX verwendet werden, der durch die Hochkonzentrationskultur und Methanol induzierbar ist (Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)).
In der Gattung Candida wurde das Wirt-Vektor-System in Candida maltosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida utilis, Candida boidinii etc. (Japanisches Patent, das mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 5-344895 offengelegt wurde) entwickelt. Das von Candida maltosa abstammende ARS wurde cloniert (Agri. Biol. Chem. 51, 1587 (1987)) und verwendet, um einen Vektor zu entwickeln. In Candida utilis wurde ein wirksamer Promotor für den Vektor entwickelt, der zu chromosomaler Integration in der Lage ist (Japanisches Patent, das mit der Veröffentlichungs-Nr. Hei 8-173170 offengelegt wurde).
In der Gattung Aspergillus wurden unter den Pilzen Aspergillus niger, Aspergillus oryzae etc. am umfassendsten untersucht. Die Plasmide, die von diesen Arten abstammen, und Vektoren, die zur chromosomalen Integration in der Lage sind, sind erhältlich. Promotoren für die extrazellulären Proteasen und Amylasen können verwendet werden (Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)).
In der Gattung Trichoderma wurde das Trichoderma reeseibasierte Wirt-Vektor-System entwickelt. In diesem Vektor kann der Promotor für das extrazelluläre Cellulase-Gen verwendet werden (Biotechnology 7, 596-603 (1989)).
Die Züchtung von Transformanten und Aufreinigung rekombinanter Proteine aus Transformanten kann durch die herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, die den Fachleuten bekannt sind.
Das Substrat für das erfindungsgemäße Enzym ist 4-Haloacetessigsäureester oder dessen Derivate, wie diejenigen mit einem Substituenten an der α-Position. Bevorzugte Substrate sind 4-Chloracetessigsäureester und Ethyl-4-chloracetacetat. Die Substrat-Konzentration, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, liegt gewöhnlich im Bereich von 0,1 – 50%, vorzugsweise von 1 – 20%. Die verwendete Enzymmenge des Reaktionsgemischs liegt gewöhnlich im Bereich von 0,01 – 500 U/ml, vorzugsweise von 0,1 – 50 U/ml. Das Co-Enzym (NADPH oder NADH), das von dem Enzym benötigt wird, wird, falls erforderlich, zu dem Reaktionssystem in einer Menge von 0,00001 – 5 Äquivalenten, vorzugsweise 0,0001 – 1 Äquivalent im Hinblick auf die Menge des Substrats zugegeben. Eine Pufferlösung (zum Beispiel ein Phosphat-Puffer) kann als ein Lösungsmittel in dem Reaktionssystem verwendet werden, um den pH-Wert zu erhalten. Ein wässeriges Zwei-Phasen-Reaktionssystem, das 10 – 90% organisches Lösungsmittel wie Oktan, Hexan, Toluol, Ethylacetat, n-Butylacetat und Chloroform enthält, kann ebenfalls verwendet werden. Die Reaktionstemperatur beträgt gewöhnlich 4 – 50° C, vorzugsweise 10 – 30° C. Der pH-Wert wird gewöhnlich auf 3 – 9, vorzugsweise 4 – 8 eingestellt. Das Reaktionsprodukt, (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester, kann mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert werden, das in der Lage ist, das Produkt gut aufzulösen, wie Ethylacetat und Oktan, und mit einem Verfahren wie Destillation aufgereinigt werden.
In der vorstehend beschriebenen Reaktion wird NADP⁺, das während der Reduktions-Reaktion aus NADPH erzeugt wird, in geeigneter Weise in NADPH umgewandelt (Acetoacetyl-CoA-Reduktase, die an der Biosynthese von PHA beteiligt ist, verwendet nicht nur NRDPH, sondern auch NADH). Die Regeneration des Co-Enzyms kann durchgeführt werden, wobei die reduzierende Fähigkeit des NAD(P)⁺ (wie der glycolytische Stoffwechselweg) von Mikroorganismen verwendet wird. Die NAD(P)⁺reduzierende Fähigkeit kann durch Ergänzen des Reaktionssystems mit Glucose oder Ethanol oder durch die Zugabe eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, NAD(P)H aus NAD(P)⁺ zu erzeugen, von behandelten Produkten davon oder dem Enzym mit einer solchen Aktivität erhöht werden. NAD(P)H kann zum Beispiel regeneriert werden, indem Mikroorganismen, die Glucose-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase, Glutamat-Dehydrogenase, Formiat-Dehydrogenase, Alkohol-Dehydrogenase, Aminosäure-Dehydrogenase und/oder Glycerin-Dehydrogenase enthalten, behandelte Produkte davon oder die gereinigten Enzyme verwendet werden. Darüber hinaus kann der Mikroorganismus, der in der Lage ist, Acetoacetyl-CoA-Reduktase zu produzieren, gentechnisch verändert sein, um dieses Enzym mit der NAD(P)H-regenerierenden Aktivität in hohem Maße zu exprimieren, und der resultierende Transformant oder das behandelte Produkt davon kann für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, Mikroorganismen, die in der Lage sind, sowohl Acetoacetyl-CoA-Reduktase als auch das NAD(P)H-regenerierende Enzym zu produzieren, oder die behandelten Produkte davon zu verwenden. Solche Mikroorganismen können weiter gentechnisch verändert sein, sodass sie diese Enzyme in hohem Maße exprimieren und die resultierenden Mikroorganismen oder deren behandelte Produkte können in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Es können in dem Verfahren zur Herstellung von (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester unter Verwendung des Mikroorganismus, der in der Lage ist, sowohl Acetoacetyl-CoA-Reduktase als auch das NAD(P)H regenerierende Enzym zu produzieren, oder der behandelten Produkte davon, 1/50 bis 1/20 Volumen, vorzugsweise 1/10 bis 1/5 Volumen, basierend auf dem Reaktionsgemisch, der Kultur, mikrobielle Zellen, die aus der Kultur gewonnen wurden, oder behandelte Produkte davon verwendet werden. NAD⁺ oder NADP⁺ kann, falls erforderlich, in einer Menge von 0,00001 bis 5 Äquivalenten, vorzugsweise 0,0001 bis 1 Äquivalent, im Hinblick auf die Menge des Substrats zu dem Reaktionsgemisch zugegeben werden.
Die Reaktion kann auch durchgeführt werden, indem ein Bioreaktor verwendet wird, in dem der Mikroorganismus, der die beiden Enzyme produziert, oder die behandelten Produkte daraus, an κ-Carrageen, Acrylamid, Polyurethan, Chitin oder ähnliche Träger immobilisiert sind. Die Reaktion unter Verwendung des Bioreaktors kann durchgeführt werden, indem fortlaufend 4-Haloacetessigsäureester als das Substrat, das Substrat zur Regeneration des Co-Enzyms (z. B. Glucose, wenn Glucose-Dehydrogenase als Enzym für die Regeneration des Co-Enzyms verwendet wird) und, falls erforderlich, ein Puffer zur Kontrolle des pH-Wertes und NAD+ oder NADP+ als das Co-Enzym zugeführt werden oder indem wiederholt das Reaktionsgemisch verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung des optisch aktiven (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureesters bereit, wobei Acetoacetyl-CoA-Reduktase verwendet wird, die das Poly-β-hydroxyfettsäure-Biosynthese-System darstellt.
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezugnahme auf die Beispiele genauer in Einzelheiten beschrieben, ist aber nicht so ausgelegt, dass sie auf diese Beispiele einzugrenzen ist.
BEISPIEL 1
Isolierung des Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gens aus Ralstonia eutropha
Ralstonia eutropha DSM 531 wurde in einem Bouillon-Medium (enthaltend 5,0 g Rinderextrakt, 15,0 g Pepton, 5,0 g NaCl und 5,0 g/1 K₂HPO₄) gezüchtet und die chromosomale DNA wurde aus den so erhaltenen mikrobiellen Zellen hergestellt, wobei eine Qiagen-Genomic-Spitze (Qiagen) verwendet wurde.
Für die PCR-Clonierung des Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gens (phbB) aus Ralstonia eutropha wurden die Primer AER-ATG1 (5'-AGTGGATCCAATGACTCAGCGCATTGCGTA-3', SEQ ID NO.: 11) und AERTAA1 (5'-AACRAGCTTCTCGAGTTAGCCCATATGCAGGCCGC-3', SEQ ID NO.: 12) auf der Grundlage der Sequenzen am 5'- und 3'-Ende des strukturellen Gens synthetisiert.
Unter Verwendung der chromosomalen DNA von Ralstonia eutropha als Matrize und der AER-ATGl und AER-TAA1-Primer wurden 30 Zyklen PCR (30 sec 95° C, 1 min 50° C und 2 min 75° C) durchgeführt, wobei die amplifizierten DNA-Fragmente erhalten wurden.
Die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit BamHI und HindIII gespalten. Der Plasmid-Vektor pSE420 (Invitrogen) wurde mit NcoI und BamHI gespalten, mit dem Klenow-Fragment behandelt und einer Selbst-Zyklisierungsreaktion unterzogen, wobei das Plasmid pSE420B erhalten wurde. Der Plasmid-Vektor pSE420B wurde mit BamHI und HindIII gespalten und das Spaltprodukt wurde mit den vorstehend PCR amplifizierten Fragmenten, die mit den gleichen zwei Restriktionsenzymen gespalten wurden, ligiert, wobei T4-DNA-Ligase verwendet wurde, um das Plasmid pSE-AER1 zu erhalten.
Die DNA-Insertion in dem Plasmid, das so erhalten wurde, wurde sequenziert und als das phbB-Gen identifiziert.
BEISPIEL 2
Expression des Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gens, das von Ralstonia eutropha abstammt
Der Escherichia coli HB101-Stamm wurde mit pSE-AER1 transformiert und die resultierende Transformante (E. coli HB101 (pSE-AER1)) wurde in LB-Medium (7 ml), das Ampicillin enthielt (50 mg/ml), über Nacht gezüchtet. IPTG wurde in einer Konzentration von 0,1 mM zu dem Medium zugegeben und die Kultur wurde 5 Stunden lang weiter inkubiert.
Die so erhaltenen bakteriellen Zellen wurden gesammelt, mit einem Minibeatbeater 8 (BIOSPEC Inc.) aufgebrochen und zentrifugiert, wobei der Überstand als der zellfreie Extrakt erhalten wurde.
BEISPIEL 3
Reduzieren der Aktivität von Acetoacetyl-CoA-Reduktase, die von Ralstonia eutropha abstammt
Die reduzierende Aktivität des zellfreien Extraktes, der in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde getestet, wobei Ethyl-4-chloracetacetat und Acetoacetyl-CoA als Substrat verwendet wurden. Ein Reaktionsgemisch, das 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,5), 0,2 mM NADPH und 20 mM Substrat (0,2 mM, wenn Acetoacetyl-CoA als das Substrat verwendet wurde) enthielt und das Enzym wurden bei 25 ° C umgesetzt. Eine Einheit des Enzyms wurde als die Menge des Enzyms definiert, die die Abnahme von 1 μMol NADPH in 1 Minute katalysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Der zellfreie Extrakt, der Acetoacetyl-CoA-Reduktase exprimiert, zeigte die NADPH-abhängige Ethyl-4-chloracetacetat reduzierende Aktivität und seine spezifische Aktivität betrug 2,50 U/mg Protein. Im Gegensatz dazu zeigte der HB101-Stamm, der Plasmid pSE-AER1 nicht enthielt, nahezu keine Ethyl-4-chloracetacetat reduzierende Aktivität.
Die reduzierende Aktivität mit Acetoacetyl-CoA betrug nicht mehr als etwa 39% von derjenigen mit Ethyl-4-chloracetacetat.
BEISPIEL 4
Oxidierende Aktivität von Acetoacetyl-CoA-Reduktase, die von Ralstonia eutropha abstammt
Die oxidierende Aktivität des zellfreien Extrakts, der in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde getestet, wobei Ethyl-(S)- oder (R)-4-Chlor-3-hydroxybutyrat als Substrat verwendet wurde. Die Oxidationsreaktion wurde durchgeführt, indem ein Reaktionsgemisch, das 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0), 2,5 mM NADP+, 20 mM Substrat und das Enzym enthielt, bei 25° C inkubiert wurde. Eine Einheit des Enzyms wurde definiert als die Menge des Enzyms, die die Zunahme um 1 μMol NADPH pro Minute katalysierte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Der Zellextrakt zeigte nahezu keine oxidierende Aktivität für jedes der beiden Substrate.
BEISPIEL 5
Stereoselektivität von Acetoacetyl-CoA-Reduktase aus Ralstonia eutropha
Ein Reaktionsgemisch (1 ml), das 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,5), 1 mM NADP+, 2% (122 mM) Ethyl-4-chloracetacetat, Acetoacetyl-CoA-Reduktase (1 U), die in Beispiel 2 hergestellt wurde, 243 mM Glucose und Glucose-Dehydrogenase (2,8 U) (Wako Pure Chemical) enthielt, wurde über Nacht bei 25° C inkubiert. Ein Aliquot der Reaktionslösung wurde zweifach mit 0,1 N HCl verdünnt und Ethyl-4-chlor-3-hydroxybutyrat, die in der Verdünnung enthalten war, wurde mit Hilfe von Gas-Chromatographie bestimmt. Die Gas-Chromatographie wurde mit einem Thermon 3000 Chromosolv W (2 m, Shinwakako) unter den Bedingungen der Säulentemperatur von 150° C und der Nachweistemperatur von 250° C durchgeführt, wobei ein Flammen-Ionisations-Detektor (FID) verwendet wurde.
Als ein Ergebnis wurde Ethyl-4-chlor-3-hydroxybutyrat mit der optischen Reinheit von 99% ee (S) oder mehr mit einem Ertrag von 67% synthetisiert.
BEISPIEL 6
Konstruktion des Co-Expressions-Plasmids pSE420D
Das Plasmid pSE420B, das in Beispiel 1 konstruiert wurde, wurde mit MunI und SpeI gespalten und mit dem Anelierungsprodukt der synthetischen DNA SE420D-S (SEQ ID NO. 13: AATTCTCGAGTAATCTAGAGGAATTCTRAAA) und der synthetischen DNA SE420D-A (SEQ ID NO. 14: CTAGTTTTAGAATTCCTCTAGATTACTCGAG) ligiert, wobei T4-DNA-Ligase verwendet wurde, um das Plasmid pSE420D zu erhalten. Die Restriktionskarte von pSE420D ist in 1 gezeigt.
BEISPIEL 7
Clonierung des Glucose-Dehydrogenase-Gens, das von Bacillus subtilis abstammt
Um das reduzierte Nikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat zu regenerieren, wurde das Glucose-Dehydrogenase-Gen cloniert, das von Bacillus subtilis stammt (J. Bacteriol. 166, 238-243 (1986)).
Für die PCR-Clonierung von ausschließlich dem offenen Leserahmen-Anteil des Glucose-Dehydrogenase-Gens, basierend auf der Nucleotidsequenz, die in der Literatur beschrieben ist, wurden die Primer BSG-ATG1 (SEQ ID NO. 15: GAGGAATTCATACATGTATCCAGATTTAAAAGGAA) und BSG-TAA2 (SEQ ID NO. 16: GGTAAGCTTTCATTAACCGCGGCCTGCCTG) auf der Grundlage der Sequenzen der 5'- und 3'-Enden des Strukturgens synthetisiert.
Der Bacillus subtilis BGSC 1A1-Stamm wurde in LB Medium (enthaltend l0g Bacto-Trypton, 5g Bacto-Hefeextrakt und 10g/1 NaCl) gezüchtet und die chromosomale DNA wurde aus den so erhaltenen mikrobiellen Zellen hergestellt, wobei ein Qiagen Genomic-Tip (Qiagen) verwendet wurde.
Unter Verwendung der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde, als die Matrize und der BSG-ATG1- und BSG-TAA2-Primer wurden 30 Zyklen PCR durchgeführt (30 sec 95° C, 1 min 50° C, 3 min und 15 sec 75° C), wobei die amplifizierten DNA-Fragmente erhalten wurden.
Die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit EcoRI und HindIII gespalten und das Spaltprodukt wurde mit dem Plasmid-Vektor pSE420D ligiert, der in Beispiel 6 erzeugt wurde und der mit den gleichen beiden Restriktionsenzymen gespalten worden war, wobei T4-DNA-Ligase verwendet wurde, um das Plasmid pSE-BSG1 zu erhalten.
Die Analyse der Nucleotidsequenz der DNA-Insertion resultierte in der perfekten Übereinstimmung mit derjenigen, die in der Datenbank eingetragen ist (DDBJ Registriernr. M12276).
Die Nucleotidsequenz des so erhaltenen Glucose-Dehydrogenase-Gens ist in SEQ ID NO.: 17 gezeigt und die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch das Gen codiert wird, in SEQ ID Nr.: 18.
BEISPIEL 8
Erzeugung des Plasmids pSG-AER1, das das Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gen, das von Ralstonia eutropha stammt, und das Glucose-Dehydrogenase-Gen, das von Bacillus subtilis stammt, co-exprimiert.
Das Plasmid pSE-AER1, das in Beispiel 1 erzeugt wurde, wurde mit BamHI und XhoI gespalten, um das DNA-Fragment zu erhalten, das das Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gen enthält, das von Ralstonia eutropha abstammt.
Das Plasmid pSE-BSGl, das das Glucose-Dehydrogenase-Gen enthält, das von Bacillus subtilis stammt, und in Beispiel 7 erzeugt wurde, wurde mit NcoI und XhoI gespalten, an das vorstehende DNA-Fragment ligiert, das das Acetoacetyl-CoA- Reduktase-Gen enthält, das von Ralstonia eutropha abstammt, wobei T4-DNA-Ligase verwendet wurde, um das Plasmid pSG-AER1 zu erhalten, das in der Lage ist, Glucose-Dehydrogenase und Acetoacetyl-CoA-Reduktase zu co-exprimieren. Die Restriktionskarte des Plasmids pSG-AER1 ist in 2 gezeigt.
BEISPIEL 9
Co-Expression von Glucose-Dehydrogenase, die von Bacillus subtilis stammt, und Acetoacetyl-CoA-Reduktase, die von Ralstonia eutropha stammt
Der Escherichia coli HB101-Stamm wurde mit dem Plasmid pSG-AER1 transformiert, um Glucose-Dehydrogenase, die von Bacillus subtilis stammt, mit Acetoacetyl-CoA-Reduktase, die von Ralstonia eutropha stammt, zu co-exprimieren.
Rekombinante Escherichia coli, die mit dem Plasmid transformiert worden waren, wurden in das 2XYT-Medium (enthaltend 20 g Bacto-Trypton, 10 g Bacto-Hefeextrakt und 10 g/1 NaCl) überimpft und über Nacht bei 30C° gezüchtet. Nach Zugabe von 0,1 mM IPTG in das Medium wurde das Züchten weitere 4 Stunden lang durchgeführt.
Die so erhaltene Escherichia coli-Transformante wurde gesammelt und dem Enzym-Aktivitäts-Test und der reduzierenden Umsetzung von Ethyl-4-chloracetacetat unterzogen.
BEISPIEL 10
Enzymatische Aktivität von Escherichia coli-Zellen, die mit pSG-AER1 transformiert worden waren
Escherichia coli-Zellen (entsprechend einer 2 ml-Kultur), die mit pSG-AER1 transformiert worden waren, das in Beispiel 8 hergestellt worden war, wurden in 0,25 ml einer Zellaufschließenden Lösung (enthaltend 100 mM Kalium-Phosphat-Puffer (pH 6, 5), 0, 02% 2-Mercaptoethanol und 0, 5 M Natriumchlorid) suspendiert. Die resultierende Lösung wurde in einem geschlossenen Ultraschallgerät UCD-200TM (Cosmobio) 3 Minuten lang behandelt, um die Zellen aufzuschließen. Die Ultraschall behandelte Zellsuspension wurde zentrifugiert und der Überstand wurde als die rohe Enzymlösung gewonnen, die dem Enzym-Aktivitäts-Test unterzogen wurde.
Die Ethyl-4-chloracetacetat reduzierende Aktivität wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 getestet. Glucose-Dehydrogenase-Aktivität wurde in einer Reaktionslösung, die 100 mM Kalium-Phosphat-Puffer (pH 6,5), 2,5 mM NAD⁺, 100 mM D-Glucose und das Enzym enthielt, bei 25° C getestet.
Eine Einheit jedes Enzyms wurde definiert als die Menge des Enzyms, die die Bildung von 1 μmol NADH pro Minute unter den vorstehend beschriebenen Reaktionsbedingungen katalysiert.
Die Enzym-Aktivität und SECHB-Produktivität der rohen Enzym-Lösung, die aus rekombinanten E. coli erhalten wurde, die pSG-AER1 enthielten, sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester, umfassend die asymmetrische Reduktion von 4-Halo-acetessigsäureester oder Derivaten davon mit Acetoacetyl-CoA-Reduktase (EC1.1.1.36), welche das Poly-β-hydroxyfettsäure-Biosynthese-System darstellt, um (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Acetoacetyl-CoA-Reduktase aus Mikroorganismen stammt, die zur Gattung Ralstonia gehören.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Acetoacetyl-CoA-Reduktase aus Ralstonia eutropha stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Acetoacetyl-CoA-Reduktase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 9; (b) einem Protein, umfassend eine modifizierte Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 9, in welcher eine oder mehrere Aminosäurereste hinzugefügt, entfernt oder ersetzt sind, und welches in der Lage ist, 4-Halo-acetessigsäureester oder Derivate davon asymmetrisch zu reduzieren, um (S)-4-Halo-3-hydroxybuttersäureester zu erzeugen; und (c) einem Protein, das von DNA codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit DNA, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 10 umfasst, hybridisierbar ist, und das in der Lage ist, 4-Halo-acetessigsäureester oder Derivate davon asymmetrisch zu reduzieren, um (S)-4-halo-3-Hydroxybuttersäureester zu erzeugen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der 4-Halo-acetessigsäureester 4-Chlor-acetessigsäureester oder Ethyl-4-chlor-acetoacetat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren einen Mikroorganismus verwendet, welcher in der Lage ist, Acetoacetyl-CoA-Reduktase (EC1.1.1.36) zu erzeugen, welche das Poly-β-hydroxyfettsäure-Biosynthese-System darstellt, und ein Enzym, welches die Erzeugung von NAD(P)H aus NAD(P)⁺ katalysiert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist, der mit heterologer oder homologer DNA transformiert ist, die die Acetoacetyl-CoA-Reduktase codiert, die das Poly-β-hydroxyfettsäure-Biosynthese-System bildet, sowie mit heterologer oder homologer DNA, welche ein Enzym codiert, das die Erzeugung von NAD(P)H aus NAD(P)⁺ katalysiert, und welcher beide Enzyme exprimieren kann.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Mikroorganismus aus den Gattungen Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus oder Hefe, vorzugsweise Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Hansenula, Pichia oder Candida, oder Pilzen, vorzugsweise Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium oder Trichoderma, stammt. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Enzym, welches die Erzeugung von NAD(P)H aus NAD(P)⁺ katalysiert, Glucose-Dehydrogenase ist.