WO2006061137A1 - Gdh-mutante mit verbesserter chemischer stabilität - Google Patents

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WO2006061137A1
WO2006061137A1 PCT/EP2005/012839 EP2005012839W WO2006061137A1 WO 2006061137 A1 WO2006061137 A1 WO 2006061137A1 EP 2005012839 W EP2005012839 W EP 2005012839W WO 2006061137 A1 WO2006061137 A1 WO 2006061137A1
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WO
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gdh
amino acid
enzyme
glucose dehydrogenase
gdbs
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PCT/EP2005/012839
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English (en)
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Inventor
Rupert Pfaller
Original Assignee
Wacker Chemie Ag
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the invention relates to a mutant of the enzyme glucose dehydrogenase (GDH) of the species Bacillus subtilis with high process stability in biotransformations, their preparation and use for the regeneration of NADH, or NADPH redox cofactors in enzymatisch catalyzed reduction reactions.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • Optically active hydroxy compounds are valuable synthesis building blocks, eg. As in the manufacture of pharmaceutical agents or agrochemicals. They therefore have an important economic importance. These compounds are often difficult to prepare by classical chemical methods. The required optical purities for pharmaceutical or agrochemical applications are difficult to achieve in this way. Therefore, biotechnological processes are increasingly being used to produce chiral compounds. In particular, enzymes that can reduce carbonyl compounds are increasingly used because of their high enantioselectivity.
  • Enzymes from the class of oxidoreductases, which are used for the preparation of chiral compounds by reducing prochiral carbonyl compounds, are by definition called the collective term carbonyl reductases (hereinafter "CR").
  • CR carbonyl reductases
  • the enzyme classes grouped under the collective term carbonyl reductases include, among others, aldehyde dehydrogenases (hereinafter "ADH"), aldo-ketoreductases (“AKR”). , Aldehyde reductases, glycerine hydrogenases and fatty acid synthase (referred to as "FAS").
  • aminotransferases or amino acid dehydrogenases are to be counted among the CRs.
  • This broad spectrum of reducing enzymes has in common that they are the electrons for the reduction of the carbonyl compound from redox cofactors in their reduced form, usually NADH or NADPH.
  • These redox cofactors are consumed stoichiometrically in the reaction, ie they must either be used stoichiometrically or be regenerated by oxidation of a cosubstrate.
  • the stoichiometric use of NADH or NADPH is uneconomical due to the high price of these compounds.
  • This disadvantage can be circumvented by the so-called cofactor regeneration. This requires a cheap reducing agent and a cofactor-reducing enzyme. Only the efficient and cheap regeneration of the redox cofactor enables the technical use of biocatalytic reduction processes.
  • a CR reduces the substrate stereoselectively to the desired product.
  • the regeneration of the spent NADH or NADPH cofactor is accomplished by a second enzyme.
  • any enzyme suitable for cofactor regeneration is suitable, which oxidizes a substrate in an enzymatic reaction and at the same time reduces NAD to NADH, or NADP to NADPH.
  • an enzyme that oxidizes the cheapest possible substrate Enzymes that can be used for cofactor regeneration, z. Formate dehydrogenase (FDH), glutamate dehydrogenase, glycerol dehydrogenase and glucose dehydrogenase (GDH).
  • FDH is only suitable for regenerating the NADH cofactor.
  • the disadvantage of FDH is the known low specific activity of the enzyme, which results in low space-time yields. It is also to be expected that formic acid (the cosubstrate) or its salts in large concentrations will have an enzyme-damaging effect on the CR. FDH mutants with specificity for NADPH have been described and their use on an industrial scale is of little use because of their low activity.
  • Glutamate dehydrogenase is useful for regenerating NADPH, oxidizing glutamic acid to ⁇ -ketoglutarate. Little is known about their use for cofactor regeneration. GDH oxidizes glucose to ⁇ -gluconolactone, which dehydrates further into gluconic acid in aqueous solution. Advantages of the GDH, especially the enzymes of the genus Bacillus, are a high specific activity of the enzyme as well as the possibility to regenerate both NADH and NADPH cofactors. Thus are high
  • GDH from Bacillus megaterium (summarized in a review article by Kataoka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003) 62: 437-445).
  • GDH from B. megaterium is used for biotransformations (EP 0967271).
  • the enzyme is a tetramer of four identical subunits. Its low thermal stability is known (Makino et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385). Some stabilization is achieved by high NaCl concentrations in the reaction buffer.
  • S-CHBE is technically produced in biotransformations from 4C1-ACE.
  • S-CHBE has high chemical reactivity and S-CHBE is responsible for the rapid irreversible inactivation of the enzymes involved in biotransformation, especially the cofactor regenerating GDH.
  • Another object of the invention is to provide a GDH with increased stability compared to the prior art solvents used in a biotransformation.
  • solvents are n-butyl acetate, which is used as a water-immiscible solvent in two-phase biotransformations, and methyl tertiary butyl ether (MTBE) as a solvent for product extraction from aqueous biotransformation batches.
  • MTBE methyl tertiary butyl ether
  • the object is achieved by a GDH having an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence of a GDH of Bacillus subtilis comprising a glutamic acid residue at position 96 with the difference that the glutamic acid residue at position 96 is exchanged for a nonpolar or hydrophobic amino acid or glycine.
  • amino acid sequence of a Bacillus subtilis GDH mutant according to the invention comprising an alanine residue at position 96 preferably corresponds to SEQ. ID. NO: 1.
  • an amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, tyrosine, and tryptophan is preferably present.
  • GDH GDH
  • amino acid selected from the group of glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine.
  • the GDHs according to the invention are distinguished, above all, by surprisingly high chemical stability against (S) -4-chloro-3-hydroxybutyric acid ethyl ester (S-CHBE).
  • S-CHBE chemical stability against (S) -4-chloro-3-hydroxybutyric acid ethyl ester
  • the GDH mutants have high stability to solvents such as n-butyl acetate and MTBE, which are commonly used in biotransformations.
  • the GDH mutants do not have the disadvantage of greatly reduced enzymatic activity compared to the wild-type enzyme, as observed with similar enzymes of the genus Bacillus megaterium.
  • the GDH mutants according to the invention are suitable for biotransformations with high product and product concentrations, for two-phase systems and for the reuse of the biocatalyst.
  • the invention therefore serves to improve the efficiency in biotransformations.
  • the invention further relates to a gene encoding a GDH according to the invention.
  • a preferred embodiment of such a gene is characterized by SEQ. ID. NO 2.
  • genes according to the invention are also all variants of the genes which are caused by the degenerate genetic code and code for a GDH according to the invention.
  • a gene according to the invention can be prepared from a GDH gene from B. subtilis.
  • the gene can be isolated from B. subtilis genomic DNA by methods known per se, such as PCR, and cloned into an expression vector.
  • the production of the enzyme according to the invention and its genetic variants in recombinant form is possible.
  • the gene from B. subtilis strain LK5 DSM 13487 (deposited under the Budapest Treaty at the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Braunschweig) can be used.
  • the GDH wild-type enzyme from the strain Bacillus subtilis LK5 is characterized by the protein sequence given in SEQ ID NO: 3 and the gene sequence coding for it (SEQ ID NO: 4).
  • the protein sequence of SEQ ID NO: 3 is 99% identical to that described in Lampel et al. , J. Bacteriol. (1986) 166: 238-243 revealed a protein sequence of the GDH from Bacillus subtilis, or 83% identical to the protein sequence of the GDH from Bacillus megaterium.
  • the particularly preferred GDH mutant according to the invention in which a glutamic acid at position 96 is replaced by alanine, is referred to as GDBS-E96A.
  • the gene sequence of this mutant is specified by the DNA sequence listed in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence derived therefrom (SEQ ID NO: 1).
  • the GDBS-E96A according to the invention is characterized by a high process stability in biotransformations such.
  • the GDH invention, z. B. the GDBS-E96A protein can be prepared by methods known per se in recombinant form.
  • a GDH gene according to the invention preferably the GDBS-E96A gene, is cloned into a suitable expression vector, transformed into a production host, transformed into transformed cells, wherein the GDH according to the invention is produced either constitutively or after induction of gene expression.
  • one or more CRs can be produced in recombinant form in addition to the GDH according to the invention in the same production host.
  • the invention thus also encompasses expression vectors which are suitable for the recombinant production of a GDH according to the invention, preferably the GDH-GDBS-E96A.
  • a GDH according to the invention preferably the GDH-GDBS-E96A.
  • one or more CRs can also be produced in a host organism using the expression vectors of the invention.
  • the GDH enzyme prepared in this way can then be used directly in the cells of the production host or, after the cells have been closed, as protein extract or after appropriate workup by z.
  • Bacterial and eukaryotic expression systems are suitable for enzyme production.
  • Host organisms for enzyme production are preferably selected from Escherichia coli, strains of the genus Bacillus, yeasts such as Pichia pastoris, Hansenula polymorpha or Saccharomyces cerevisiae and fungi such as Aspergillus or Neurospora, but they are not limited to the said host organisms.
  • Preferred expression systems include E. coli, Bacillus, Pichia pastoris, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha or Aspergillus.
  • Particularly preferred expression systems for the production of the GDH enzyme are E. coli, Pichia pastoris and S. cerevisiae.
  • the thus produced GDH protein according to the invention preferably GDBS-E96A, either in whole cells or as a cell extract or as a purified protein, can be used in biotransformations for the regeneration of NADH and NADPH cofactors. It is characterized in that after treatment with S-CHBE up to a concentration of 10% (v / v) (accordingly a concentration of 710 mM) in an aqueous medium at pH 7.0 and 3O 0 C it loses less than 30% of its activity compared to the untreated enzyme for 2.5 h.
  • the wild-type GDH (corresponding to the in SEQ ID NO: 3 protein sequence shown), however, after treatment with 3% (v / v) S-CHBE for 30 min at pH 7.0 and 30 0 C to 100% inactive.
  • This inventively high chemical stability is the basis for the use of the GDH mutant in biotransformations.
  • the GDH mutant according to the invention is characterized in that it according to a
  • the GDH mutant is characterized in that, after treatment with S-CHBE, it is up to a concentration of 10% (v / v) in an aqueous medium at pH 7.0 and 30 0 C for 2.5 h less than 10% of its activity compared to the untreated enzyme loses.
  • the GDH mutant according to the invention is distinguished by a high solvent stability with respect to n-butyl acetate and MTBE.
  • the GDH mutant is characterized by having 20% (v / v) of one of the two solvents n after treatment in aqueous solution in a two-phase mixture with constant mixing to prevent phase separation Butyl acetate or MTBE for 2 h at 30 0 C and pH 7.0, not more than 20% of its activity loses.
  • the GDH mutant does not lose more than 10% of its activity under these conditions.
  • the application of the GDH according to the invention is not limited to biotransformations. It is also used in other applications. Are known z. B. the use in biosensors, z. B. for glucose determination. However, the enzyme according to the invention can also be used for the production of gluconic acid, or. their salts are used by oxidation of glucose. In addition, the invention also includes the use of the GDH mutant according to the invention for the oxidation of other sugars, such as. B. 2-deoxyglucose or D-glucosamine.
  • Biotransformation compositions according to the invention comprise a GDH mutant according to the invention, a CR enzyme, a redox cofactor selected from NAD, NADH, NADP or NADPH, a reducing agent, preferably glucose or 2-deoxyglucose and a substrate to be reduced (educt) for the CR enzyme selected from the class of carbonyl compounds.
  • composition according to the invention is used in a process for the preparation of chiral alcohols or chiral amines, wherein the GDH according to the invention causes the cost-effective regeneration of NADH or NADPH cofactors which are consumed in the enantioselective reduction of the starting material by the CR.
  • the invention thus also relates to processes in which a GDH according to the invention is used for cofactor regeneration.
  • the amount of GDH used in relation to the CR enzyme is not fixed.
  • the biotransformation is preferably carried out in a buffered, aqueous medium. However, it is also possible to carry out the biotransformation in a two-phase mixture consisting of a buffered, aqueous phase and a second, water-immiscible phase, preferably an organic solvent.
  • the invention also encompasses processes in which the GDH, because of its high chemical stability, either alone or together with the CR, can be recovered from the reaction mixture for reuse with the aim of increasing the economics of the process.
  • Recovery refers to processes where the reaction product is extracted in a manner known per se after the end of the reaction by extraction with a solvent which is not soluble in the aqueous phase and the enzyme is recovered with the aqueous phase for reuse.
  • the extraction can be continuous or discontinuous.
  • the process according to the invention also comprises all CR enzymes which can reduce a carbonyl compound as reactant of a biotransformation, wherein NADH or NADPH is consumed as reducing agent.
  • Preferred CRs are any enzymes that can reduce a carbonyl compound to an alcohol, especially a chiral alcohol.
  • CRs from the group of ADHs, AKRs, glycerol dehydrogenases, aldehyde reductases and fatty acid synthases.
  • ADH's from the genera Lactobacillus, Rhodococcus, Thermoanaerobacter (or Thermoanaerobium), as well as AKRs, glycerol dehydrogenases, aldehyde reductases and fatty acid synthases from yeasts or filamentous fungi.
  • the GDH according to the invention and the CR can be used in the process according to the invention either completely purified or partially purified or used in cells (whole cell process). This includes the possibilities that the GDH and the CR are contained separately or else together in the cells (co-expression).
  • the cells used can be native, permeabilized or lysed.
  • the amounts used of the CR and the GDH according to the invention in the process of the invention are not fixed, but it is well known to the art that the highest possible conversion of the substrate to the product is to be carried out with the lowest possible use of enzyme with a high space-time yield.
  • R 1 and R 2 are independently selected from the group consisting of C 1 -C 20 alkyl, C 3 -C 20 cycloalkyl, C 5 -C 20 aryl, C 1 -C 20 heteroaryl, C 2 -C 20 alkenyl, C 5 -C 20 aralkyl, C 5 -C 20 - Alkylaryl or Rl and R2 together can form a ring
  • R 1 and R 2 may be optionally independently substituted with one or more Z radicals, wherein
  • Z is selected from the group consisting of fluorine, chlorine, bromine, iodine, -CN, -NO2, -NO, -NR3OR3, -CHO, SO3H, -COOH or -R3 and
  • R3 is hydrogen or may have the meaning of Rl and
  • one or more methylene groups may be replaced by identical or different groups Y, where
  • Preferred C 5 -C 20 -aryl or C 1 -C 20 -heteroaryl radicals for R 1 and R 2 are in particular selected from the group comprising - phenyl, naphthyl, indolyl, benzofuranyl, thiophenyl, pyrrolyl, pyridinyl, imidazolyl, Oxazolyl, isoxazolyl, furanyl, or thiazolyl.
  • the compounds of the general formula (I) can in general also be used as salts.
  • Particularly preferred compounds of general formula (I) are selected from the class of ⁇ -ketoesters, ⁇ -ketoesters, ⁇ -ketoesters, ⁇ -diketones, ⁇ -diketones, ⁇ -diketones, ⁇ -diketones, ⁇ - Halo ketones, ⁇ -haloketones, ⁇ -dihalo ketones, ⁇ -alkoxy ketones, ⁇ -acyloxy ketones, ⁇ -alkoxy ketones, ⁇ -alkene ketones, alkene ketones, ⁇ -dialkoxy ketones, ⁇ -dialkoxy ketones, aryl ketones, heteroaryl ketones.
  • Particularly suitable compounds of the general formula (I) are methyl 3-oxo-butanoate, ethyl 3-oxo-butanoate, methyl 4-chloro-3-oxo-butanoate, ethyl 4-chloro-3-oxo-butanoate, methyl 3-oxo-pentanoate , 3-Oxo-pentanoic acid ethyl ester, 1-chloro-propan-2-one, 1, 1-dichloro-propan-2-one, 3-oxo-butan-2-one, 2, 6-dimethyl-hexane-3, 5 -dione, 2,7-dimethyl-hexane-3, 6-dione, 2,4-hexanedione, 2,4-pentanedione, tert-butyl 3-oxobutanoate, 2,5-hexanedione, 4-trimethylsilyl-3-butyne-2 -one, 4-triisopropyl
  • the compounds of the general formula (I) are used in the process according to the invention in an amount of from 1% to 50%, based on the total volume of each reaction batch, preferably from 3% to 30%, in particular from 5% to 20%.
  • the reaction mixture should generally have a pH of from 5 to 9, preferably from 6 to 8.
  • the aqueous phase (reaction medium) preferably contains a buffer, in particular a potassium phosphate / potassium hydrogen phosphate, tris (hydroxymethyl) aminomethane / HCl or
  • Triethanolamine / HCl buffer having a pH of 5 to 10, preferably a pH of 6 to 9.
  • the buffer concentration should be from 5 mM to 150 mM.
  • the aqueous phase may also contain magnesium ions, for example in the form of added MgCl 2 in a concentration of 0.2 .mu.m to 10 mM, preferably 0.5 mM to 2 mM, based on the amount of water used.
  • the aqueous phase may contain further salts, such as, for example, NaCl, preferably in a concentration of 50-200 mM, as well as other additives such as, for example, dimethyl sulfoxide, glycerol, glycol, ethylene glycol or known enzyme-stabilizing sugars, such as trehalose, sorbitol or Mannitol included.
  • further salts such as, for example, NaCl, preferably in a concentration of 50-200 mM
  • additives such as, for example, dimethyl sulfoxide, glycerol, glycol, ethylene glycol or known enzyme-stabilizing sugars, such as trehalose, sorbitol or Mannitol included.
  • coenzyme NADP As coenzyme NADP, NADPH, NAD, NADH or salts thereof can be used.
  • concentration of coenzyme in the aqueous phase is preferably from 0.01 mM to 0.25 mM, more preferably from 0.02 mM to 0.1 mM.
  • the temperature of the reaction mixture is preferably from 0 0 C to 7O 0 C, more preferably from 20 0 C to 50 0 C.
  • the pH of the batch will decrease continuously as a result of the oxidation of glucose to gluconic acid, which is corrected by counter-titration with a base.
  • the pH of the reaction mixture is kept constant by addition of a base selected from sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution, ammonia (so-called "pH-stat" method known to the person skilled in the art) or by addition of calcium carbonate from which gaseous carbon dioxide is liberated by the action of acid.
  • reaction time is between 30 minutes and 200 hours, preferably 6 h to 60 h.
  • the extraction of the product is carried out by methods known per se, preferably with a water-immiscible, organic solvent.
  • the extraction can be carried out batchwise or continuously.
  • temperature and pressure are adjusted so that optimum extraction of the product from the aqueous phase is ensured.
  • Suitable organic solvents are all water-immiscible solvents which can isolate the secondary alcohol formed from the aqueous phase.
  • Especially preferred solvents are MTBE, ethyl acetate and butyl acetate.
  • this is preferably worked up by distillation, wherein an enrichment of the reaction product is achieved and the partial to complete removal of by-products is effected by the extraction solvent and this can be used again for extraction.
  • the inventive method also includes the reuse of an aqueous, enzyme-containing reaction medium for the reaction of carbonyl compounds to chiral alcohols.
  • the resulting high space-time performances and the low enzyme consumption per mole of product as a result of repeated use of the enzyme solution enable the cost-effective conversion of carbonyl compounds into chiral alcohols using enzymes.
  • the GDH mutant GDBS-E96A according to the invention is characterized by an unexpectedly high chemical stability, which was not to be expected from the prior art.
  • those skilled in the art, including the chemically stable, GDH mutant GDBS-E96A according to the invention for cofactor regeneration show the advantages presented in the enzyme-catalyzed preparation of chiral alcohols, starting from prochiral carbonyl compounds.
  • the B. subtilis strain LK5 was used. Genomic DNA from Bacillus subtilis was isolated by methods known per se (Makino et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385). The GDH gene was purified by PCR with Pfu DNA polymerase (Stratagene) according to the manufacturer's instructions with genomic DNA from Bacillus subtilis LK5 and the primers gdbs-a (SEQ ID NO: 5) and gdbs-b (SEQ ID NO : 6) amplified. The primers were derived from the published sequence (Lampel et al., J. Bacteriol. (1986) 166: 238-243) and had the following sequences:
  • Oligo gdbs-b 5'-CACGCGGCCGCTTAACCGCGGCCTGCCTGG-S 'SEQ ID NO: 6
  • Primer gdbs-a contained an Eco RI site at the 5 'end
  • primer gdbs-b contained a Not I site at the 5' end.
  • a DNA fragment of 780 bp size was generated.
  • the 780 bp DNA fragment of the B. subtilis GDH produced by the PCR reaction was cut with Eco RI and Not I and cloned into the Eco RI and Not I cut and dephosphorylated vector pPIC3 (Invitrogen).
  • the result was the vector pGDBSpic (FIG. 1). Sequencing of the cloned GDH gene revealed the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the expression vector pGDBSpic is suitable for the expression of the GDH gene in the yeast Pichia pastoris.
  • Vector pGDHyexl for expression in Saccharomyces cerevisiae The GDH gene was excised from vector pGDBSpic with Eco RI and Not I and isolated. The resulting 780 bp fragment was cloned into the Not I and Eco RI cut and dephosphorylated S. cerevisiae expression vector pYEXL (Clonech). This gave rise to the expression vector pGDHyexl (FIG. 2). In pGDHyexl the GDH gene is under the control of the PGK promoter (phosphoglycerate kinase gene). The URA3 selection marker gene complements uracil auxotrophy in transformed S. cerevisiae strains. Vector pGDHyexl is suitable as an autonomously replicating vector for the expression of the GDH gene in S. cerevisiae.
  • Integrative vector pGDHnts for the expression of GDH in S. cerevisiae Vector pGDHyex1 was cut with Nde I and the linearized vector subsequently treated with Pfu DNA polymerase to fill in the overhanging, single-stranded DNA ends. This was followed by digestion with Hind III. In addition to a 2.4 kb, a 6.6 kb DNA fragment was generated which, in addition to the GDH expression cassette, also contained the URA3 selection marker gene. The 6.6 kb gene fragment was purified by preparative gel electrophoresis and cloned into Hpa I and Hind III cut and dephosphorylated vector pNTS.
  • Vector pNTS contained a 980 bp DNA fragment from the gene region of the S. cerevisiae repetitive ribosomal rDNA.
  • the NTS gene fragment was isolated by PCR with the Taq DNA polymerase (Qiagen) with the primers ntsA (SEQ ID NO: 7) and ntsB (SEQ ID NO: 8) from S. cerevisiae genomic DNA.
  • the primers were selected from the published sequence (gene database file SCNTSl.gb_pll.
  • Primer ntsB 5 '-GCGATCGATGGCGCGCCTATGCTAAATCCCATAAC-S ⁇ SEQ ID NO: 8
  • Primer ntsA contained a Barn HI site at the 5 'end, followed by an Asc I site.
  • Primer ntsB contained a CIa I site at the 5 'end, followed by an Asc I site.
  • the PCR fragment formed during the PCR reaction was cut with Barn HI and CIa I and cloned into the Barn HI and CIa I cut and dephosphorylated Bluescript vector (Stratagene), resulting in the vector pNTS (FIG. 3).
  • Plasmid DNA of the expression vector pGDBSpic was used to isolate the GDH gene with the primers gdbs-c (SEQ ID NO: 9) and gdbs-d (SEQ ID NO: 10) PCR reaction with Pfu DNA polymerase.
  • the primers had the following sequences:
  • Primer gdbs-c contained at the 5 'end an Eco RI site followed by a Bsa I site.
  • Primer gdbs-d contained a Hind III site at the 5 'end followed by a Bsa I site.
  • the DNA fragment was cut with Bsa I and cloned into the Bsa I-cut and dephosphorylated vector pASK-IBA3 (so-called "Strep-tag" protein production system from IBA, Institute for Bioanalytics) to give the vector pecGDBS (FIG. 4) Sequencing of the cloned GDH gene gave the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the expression vector pecGDBS is suitable for expression of the GDH gene in E. coli. IO
  • GDmut1 SEQ ID NO: 11
  • GDmut2 SEQ ID NO: 12
  • GDmutl ⁇ '-AATGCCGGTCTTGCAAATCCTGTGCCATCTC-S 'SEQ ID NO: 11
  • GDmut2 5'-GAGATGGCACAGGATTTGCAAGACCGGCATT-S 'SEQ ID NO: 12
  • the mutagenesis was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • the resulting vector with the mutant GDH gene was designated pecGDBS-E96A ( Figure 5).
  • Successful introduction of the mutation was verified by DNA sequencing.
  • the DNA sequence of the GDH mutant GDBS-E96A is listed in SEQ ID NO: 2.
  • the protein sequence derived from SEQ ID NO: 2 is listed in SEQ ID NO: 1.
  • the expression vector pecGDBS-E96A is suitable for expression of the GDH gene in E. coli.
  • the mutated GDH- Gene was prepared as a 780 bp fragment, cut with Eco RI and Not I and cloned into the Eco RI and Not I cut and dephosphorylated vector pYEXL (see Example 1).
  • the correct DNA sequence of the mutant GDH gene was verified by sequencing.
  • the result was the expression vector pGDBS-E96Ayexl ( Figure 6) which is suitable for expression of the mutant GDH gene in S. cerevisiae.
  • the GDH gene was isolated with Eco RI and BgI II as a 780 bp gene fragment.
  • the integrative vector pGDHnts the wild-type GDH gene was excised by digestion with Eco RI and Bgl II, and the 9.7 kb vector fragment was isolated and dephosphorylated.
  • the 780 bp gene fragment of the GDH mutant was cloned into the vector fragment.
  • the result was the integrative expression vector pGDe96aNTS (FIG. 7), which is suitable for the expression of the GDH mutant in S. cerevisiae.
  • E. coli Top 10F (Invitrogen) was transformed with the pASK-IBA3 empty vector.
  • One clone in each case was selected and cultured in a shake flask culture according to the instructions of the manufacturer of the pASK-IBA3 vector (IBA Institute for Bioanalytics). From the E.
  • coli strains a preculture was produced in LBamp medium (10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl, 0.1 mg / ml ampicillin) (cultivation at 37 ° C.) and 120 rpm overnight). 2 ml each of preculture was used as the inoculum of a main culture of 100 ml LBamp medium (300 ml Erlenmeyer flask). The main cultures were grown at 3O 0 C and 180 rpm shaking was reached until a Zeil- density OD 600 of 0.5. Then the inductor became
  • Anhydrotetracyclin (IBA Institute of Bioanalytics, final concentration 2 ug / ml) was added and shaken for a further 3 h at 30 0 C and 180 rpm.
  • the mutant GDBS-E96A from B. subtilis thus has unexpectedly better enzymatic properties than the analogous mutant from Bacillus megaterium, which only about 30% of the activity of the wild-type enzyme possessed (Nagao et al., FEBS Lett. (1989) 253, 113-116).
  • One unit of GDH activity is defined as the formation of 1 ⁇ mol NADPH / min under assay conditions.
  • the protein concentration of the cell extracts was determined in a manner known per se using the so-called “BioRad protein assay” from BioRad.
  • the starting strain was S. cerevisiae strain CM3260 (uracil, histidine, tryptophan auxotrophy, described in Dancis et al., Cell (1994) 76: 393-402).
  • the transformed expression construct was pGDe96ants.
  • pGDe96ants contained the mutated GDH gene GDBS-E96A under the control of the PGK promoter.
  • Selection marker was the URA3 gene (uracil selection).
  • the vector was taken before the Transformation with Asc I cut to release the expression cassette.
  • the transformation of the yeast strain CM3260 was carried out according to the lithium acetate method familiar to the person skilled in the art (Gietz and Woods, Biotechniques (2001) 30: 816-831).
  • Transformants were isolated and tested for GDH activity by shake flask culture.
  • 50 ml of YPD-CSL medium (10 g / l yeast extract, 20 g / l peptone, 20 g / l glucose, 20 g / l corn spring water, "Com Steep Liquor"
  • YPD-CSL medium 10 g / l yeast extract, 20 g / l peptone, 20 g / l glucose, 20 g / l corn spring water, "Com Steep Liquor”
  • the cells were disrupted with the "French® Press" and the cell extracts were analyzed for GDH activity as described in the 3rd example for E. coli. From the comparison of approximately 50 transformants tested, the strain GD34 was considered to be the best GDH producer
  • the specific GDH activity in crude extracts was 1 U / mg protein and no GDH activity could be measured in the CM3260 control strain.
  • the GDH activity was compared in cell extracts from the culture in E. coli (see Example 3) after pretreatment with the enzyme-damaging product S-CHBE, which results from the biotransformation of 4C1-ACE.
  • the stability against the solvents n-butyl acetate and MTBE was investigated.
  • the GDH mutant was incubated with increasing amounts of S-CHBE (dose-dependent inactivation) and then the GDH activity was determined. How does in Tab. 2 ones shown, has been (0 C 3O, pH 7.0) under reaction conditions corresponding to a 2.5 h incubation with S-CHBE in concentrations up to 10% (v / v) (a 0.71 M Concentration) no significant inactivation of the enzyme was observed.
  • the recombinant S. cerevisiae strain FasB-his6 was used.
  • the strain FasB-his ⁇ is derived from the GDH-producing strain GD34. It is characterized by an increased FAS CR activity and is suitable for the production of S-CHBE and other chiral ß-hydroxy esters, as observed in the usual yeast strains CR activities that lead to R-CHBE, in naturally low activity available.
  • the expression enhancement of FAS activity was the According to the prior art, by overexpression of the so-called Fasl subunit of the yeast fatty acid synthase (described in Wenz et al., Nucleic Acids Res. (2001) 29: 4625-4632).
  • the cultivation of the yeast strain FasB-his ⁇ was carried out in shake flasks. 6 ⁇ 250 ml of YPD-CSL medium, in each case in 1 liter of Erlenmeyer flasks, were inoculated with the strain FasB-his6. The cultivation was carried out by incubation for four days on a Orbital here- ler (Infors) at 28 0 C and 120 rpm. Cells were either re-used or directly for the biotransformation frozen at -20 0 C.
  • a biotransformation approach was performed by centrifuging 1.5 1 of FasB-his6 cells from the shake flask culture and collecting in reaction buffer (0.1 M potassium phosphate, pH 7.0, 0.1 M NaCl, 2 M glucose) to give the final volume 200 ml.
  • reaction buffer 0.1 M potassium phosphate, pH 7.0, 0.1 M NaCl, 2 M glucose
  • the cell density OD600 was determined. Typically, the total OD600 in the batch was 30,000.
  • the cells were placed in a thermostatable reaction vessel, heated to 25 0 C and stirred with a magnetic stirrer. NADP was added at a concentration of 10 ⁇ M.
  • the reaction vessel was connected to a titrator (Titroline alpha, Schott) via a pH electrode and a sodium hydroxide (10 M stock solution) buret, so that the biotransformation could be carried out under pH-stat conditions at a constant pH of 7.5 ,
  • a titrator Tiroline alpha, Schott
  • a sodium hydroxide (10 M stock solution) buret
  • reaction buffer 0.1 M potassium phosphate, pH 6.5, 0.1 M NaCl, I mM magnesium sulfate, 2 M glucose
  • GDBS-E96A GDH and LB-ADH each in 15 U / ml
  • Dosage, 50 ⁇ M NADP and as substrate 12.9 g of methyl acetoacetate (ACME) in a dosage of 12.9% (w
  • the reaction vessel was connected to a titrator (bulkhead) via a pH electrode and a sodium hydroxide solution (10 M stock solution), so that the biotransformation could be carried out under pH-stat conditions at a constant pH of 6.5.
  • the reaction was stopped after 21 h.
  • the entire biotransformation batch was extracted three times with an equal volume of ethyl acetate, the ethyl acetate phases were combined and the solvent was removed in a rotary evaporator.
  • the (R) -3-hydroxybutyric acid methyl ester (R-HBMe) crude fraction thus obtained was analyzed by chiral gas chromatography. A quantitative conversion of the used ACMe was achieved.
  • the R-HBMe content of the crude fractions determined by gas chromatography was> 99%, the enantiomeric excess ee was 100%.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist Glucose Dehydrogenase mit einer Aminosäuresequenz die der Aminosäuresequenz einer GDH von Bacillus subtilis umfassend einen Glutaminsäurerest an Position 96 entspricht mit dem Unterschied, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine unpolare bzw. hydrophobe Aminosäure oder Glycin ausgetauscht ist.

Description

GDH-Mutante mit verbesserter chemischer Stabilität
Die Erfindung betrifft eine Mutante des Enzyms Glucose Dehydro- genäse (GDH) der Art Bacillus subtilis mit hoher Prozessstabilität bei Biotransformationen, ihre Herstellung und Verwendung zur Regenerierung von NADH, bzw. NADPH Redox-Cofaktoren bei en- zymatisch katalysierten Reduktionsreaktionen.
Optisch aktive Hydroxyverbindungen sind wertvolle Synthesebausteine, z. B. bei der Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe oder von Agrochemikalien. Sie haben daher eine wichtige wirtschaftliche Bedeutung. Diese Verbindungen sind durch klassische chemische Verfahren oft nur schwer herstellbar. Die erforderli- chen optischen Reinheiten für Anwendungen im pharmazeutischen oder agrochemischen Bereich sind auf diesem Wege nur schwer zu erreichen. Daher werden zur Herstellung chiraler Verbindungen im zunehmenden Maße biotechnologische Verfahren angewendet. Speziell Enzyme, die Carbonylverbindungen reduzieren können, finden wegen ihrer hohen Enantioselektivität vermehrt Verwendung.
Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen, die zur Herstellung chiraler Verbindungen durch Reduktion prochiraler Carbonylver- bindungen eingesetzt werden, werden definitionsgemäß mit dem Sammelbegriff Carbonylreduktasen (in der Folge „CR") bezeichnet. In der Mehrzahl der Fälle ist das Produkt einer CR- Reaktion ein Alkohol. Es ist aber auch möglich, dass das Produkt einer CR-Reaktion ein Amin ist. Zu den unter dem Sammel- begriff Carbonylreduktasen zusammengefassten Enzymklassen zählen unter anderen Alkohldehydrogenasen (in der Folge „ADH") , Aldo-Ketoreduktasen („AKR") , Aldehydreduktasen, Glycerinde- hydrogenasen und die Fettsäuresynthase (bezeichnet als „FAS") . Aber auch Aminotransferasen oder Aminosäuredehydrogenasen (z. B. Threonindehydrogenase) sind zu den CRs zu zählen. Diesem breiten Spektrum reduzierender Enzyme ist gemeinsam, dass sie die Elektronen für die Reduktion der Carbonylverbindung aus Redox-Cofaktoren in deren reduzierter Form, üblicherweise NADH oder NADPH, beziehen. Diese Redox-Cofaktoren werden bei der Reaktion stöchiometrisch verbraucht, d. h. sie müssen entweder stöchiometrisch eingesetzt werden oder aber durch Oxidation eines Cosubstrats regeneriert werden. Der stöchiometrische Ein- satz von NADH oder NADPH ist aufgrund des hohen Preises dieser Verbindungen unwirtschaftlich. Dieser Nachteil kann durch die sog. Cofaktor-Regenerierung umgangen werden. Voraussetzung dafür sind ein billiges Reduktionsmittel und ein Cofaktor- reduzierendes Enzym. Erst die effiziente und billige Regenerie- rung des Redox-Cofaktors ermöglicht den technischen Einsatz biokatalytischer Reduktionsverfahren.
Verschiedene Möglichkeiten zur Cofaktor-Regenerierung sind bekannt: Beim Einsatz einer CR aus der Klasse der ADH' s ist die Cofaktor-Regenerierung durch Oxidation eines billigen Alkohols (Cosubstrat) , z. B. Isopropanol, möglich. Es werden also die stereoselektive Reduktion des Substrats und die Cofaktor- Regenerierung von einem Enzym besorgt. Dabei besitzen ADH' s im allgemeinen den Nachteil, dass ihr pH-Optimum der Reduktion und Oxidation stark unterschiedlich sind, so dass die Gesamtreaktion nur mit verminderter Geschwindigkeit abläuft, was die Raum- Zeit-Ausbeuten beeinträchtigt. So wurde z. B. für die ADH aus Rhodococcus erythropolis ein pH-Optimum für die Reduktion von 5,5, für die Oxidation dagegen von 9,5 gefunden (Zelinski et al., J. Biotechnol. (1994) 33: 283-292) . Zusätzliche Nachteile sind, dass nicht alle ADH' s mit Isopropanol reagieren und außerdem bei den gewünschten hohen Raum-Zeit-Ausbeuten große Mengen Isopropanol eingesetzt werden müssen, bzw. große Mengen an Aceton anfallen, dem Reaktionsprodukt der Isopropanoloxidation. Bekanntermaßen sind beide Verbindungen in hohen Konzentrationen enzymschädigend. Schließlich kann die Einstellung eines Reaktionsgleichgewichts dazu führen, dass quantitative Reaktionsumsätze nicht erreicht werden, was zu reduzierten Ausbeuten und wegen ähnlicher physikalisch-chemischer Eigenschaften von Edukt (das Substrat der CR-Reaktion) und Produkt oftmals zu Schwierigkeiten bei der Produktisolierung führt. Bei Nicht-ADH CRs erfolgt aufgrund eines fehlenden Cosubstrats die Cofaktor-Regenerierung grundsätzlich auf andere Weise. Bekannt ist die gleichzeitige Verwendung der CR mit einem zweiten Enzym. Dabei reduziert eine CR das Substrat stereoselektiv zum gewünschten Produkt. Die Regenerierung des verbrauchten NADH, bzw. NADPH Cofaktors wird durch ein zweites Enzym bewerkstelligt. Prinzipiell ist jedes Enzym zur Cofaktor-Regenerierung geeignet, das in einer enzymatischen Reaktion ein Substrat oxi- diert und gleichzeitig NAD zu NADH, bzw. NADP zu NADPH redu- ziert. Man wird jedoch ein Enzym verwenden, das ein möglichst billiges Substrat oxidiert. Enzyme, die zur Cofaktor- Regenerierung eingesetzt werden können, sind z. B. Formiatde- hydrogenase (FDH) , Glutamatdehydrogenase, Glycerindehydrogenase und Glucose Dehydrogenase (GDH) .
Bei Ganzzeilbiotransformationen kann die Cofaktor-Regenerierung auch durch den zellulären Stoffwechsel erfolgen. Ein bekanntes Beispiel dafür sind Biotransformationen der Bäckerhefe Saccha- romyces cerevisiae. Jedoch ist nicht jeder Mikroorganismus da- für geeignet. Nachteilig sind bei diesen Biotransformationen die generell niedrigen Raum-Zeit-Ausbeuten, sowie die Erfordernis eines intakten zellulären Stoffwechsels.
Unter den bekannten Cofaktor-regenerierenden Enzymen eignet sich die FDH nur zur Regenerierung des NADH Cofaktors. Nachteil der FDH ist die bekannt geringe spezifische Aktivität des Enzyms, was geringe Raum-Zeit-Ausbeuten bedingt. Außerdem ist damit zu rechnen, dass Ameisensäure (das Cosubstrat) oder deren Salze in großen Konzentrationen enzymschädigend auf die CR wir- ken. FDH-Mutanten mit Spezifität für NADPH wurden beschrieben, der Einsatz im technischen Maßstab ist aufgrund ihrer niedrigen Aktivität nur von geringem Nutzen.
Glutamatdehydrogenase eignet sich zur Regenerierung von NADPH, wobei Glutaminsäure zu α-Ketoglutarat oxidiert wird. Über ihre Verwendung zur Cofaktor-Regenerierung ist wenig bekannt. GDH oxidiert Glucose zu δ-Gluconolacton, das in wässriger Lösung weiter zur Gluconsäure dehydratisiert. Vorteile der GDH, speziell der Enzyme aus der Gattung Bacillus, sind eine hohe spezifische Aktivität des Enzyms sowie die Möglichkeit, sowohl NADH wie NADPH Cofaktoren zu regenerieren. Somit sind hohe
Raum-Zeit-Ausbeuten und ein breiter Einsatz des Enzyms in Verbindung mit praktisch allen CRs gewährleistet. Außerdem ist Glucose als Cosubstrat ein billiges Reduktionsmittel. Nachteil der bekannten GDH' s ist die schlechte chemische Stabilität des Enzyms, was den Einsatz großer Mengen Enzym erfordert.
Bei der am weitest verbreiteten GDH für die Cofaktorregenerie- rung handelt es sich um eine GDH aus Bacillus megaterium (zu- sammengefasst in einem Übersichtsartikel von Kataoka et al. , Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003) 62: 437-445) . GDH aus B. megaterium wird für Biotransformationen eingesetzt (EP 0967271) . Bei dem Enzym handelt es sich um ein Tetramer aus vier identischen Untereinheiten. Bekannt ist seine niedrige thermische Stabilität (Makino et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385) . Eine gewisse Stabilisierung wird erreicht durch hohe NaCl-Konzentrationen im Reaktionspuffer. Die Gensequenz der Bacillus megaterium GDH und Mutanten dieser GDH, die eine höhere Temperaturstabilität besitzen sind in Makino et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385 offenbart. Diese Mut- anten sind in ihren kinetischen Eigenschaften dem Wildtypenzym jedoch deutlich unterlegen (Nagao et al. , FEBS Lett. (1989) 253, 113-116) .
Um mit GDH aus B. megaterium zur Cofaktor-Regenerierung bei Biotransformationen hohe Raum-Zeit-Ausbeuten zu erreichen, werden üblicherweise aufwändige Verfahrensschritte wie Zweiphasensysteme eingesetzt. Oft kann dann kein quantitativer Umsatz des Eduktes mehr erzielt werden. Zusätzlich bereitet dann oft die Abtrennung von nicht umgesetztem Edukt Schwierigkeiten bei der Produktisolierung. Auch ist ein Wiedereinsatz der GDH nicht bekannt, der die Wirtschaftlichkeit der Biotransformationen verbessern würde. Ein durch Biotransformation hergestelltes Produkt von großer wirtschaftlicher Bedeutung ist (S) -4-Chlor-3-Hydroxybutter- säureethylester (S-CHBE) , das großtechnisch als Synthesebaustein zur Herstellung der sogenannten Statine verwendet wird. Statine sind eine Klasse pharmakologischer Wirkstoffe, die als Cholesterinsenker in Medikamenten eingesetzt werden. Sie sind von enormer medizinischer Bedeutung bei der Vorbeugung und Behandlung der zum Herzinfarkt führenden Arteriosklerose. S-CHBE wird technisch in Biotransformationen aus 4C1-ACE hergestellt. Als chlorierter sekundärer Alkohol besitzt S-CHBE eine hohe chemische Reaktivität und S-CHBE ist für die schnelle irreversible Inaktivierung der an der Biotransformation beteiligten Enzyme, speziell der Cofaktor-regenerierenden GDH, verantwortlich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine GDH zur Verfügung zu stellen, die nicht die Nachteile des Standes der Technik aufweist und insbesondere eine erhöhte chemische Stabilität gegen alpha-halogenierte Carbonylverbindungen oder alpha- halogenierte Alkohole aufweist.
Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist S-CHBE.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine GDH mit einer im Vergleich zum Stand der Technik erhöhten Stabilität gegenüber Lösungsmitteln, die bei einer Biotransformation zum Einsatz kommen, zur Verfügung zu stellen. Beispiele für solche Lösungsmittel sind n-Butylacetat, welches als nicht wassermischbares Lösungsmittel bei Zweiphasen-Biotransformationen Verwen- düng findet, sowie Methyl-Tertiärbutylether (MTBE) als Lösungsmittel zur Produktextraktion aus wässrigen Biotransformationsansätzen.
Die Aufgabe wird gelöst durch eine GDH mit einer Aminosäurese- quenz, die der Aminosäuresequenz einer GDH von Bacillus subti- lis umfassend einen Glutaminsäurerest an Position 96 entspricht mit dem Unterschied, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine unpolare bzw. hydrophobe Aminosäure oder Glycin ausgetauscht ist.
Die Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Bacillus subtilis GDH-Mutante umfassend einen Alaninrest an Position 96 entspricht vorzugsweise SEQ. ID. NO: 1.
Bevorzugt befindet sich bei der erfindungsgemäßen GDH an Position 96 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Glycin, AIa- nin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, und Tryptophan.
Besonders bevorzugte befindet sich bei der erfindungsgemäßen GDH an Position 96 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin.
Insbesondere bevorzugt befindet sich bei der erfindungsgemäßen GDH an Position 96 die hydrophobe Aminosäure Alanin.
Die erfindungsgemäßen GDHs, im folgenden auch GDH-Mutanten genannt, zeichnen sich vor allem durch eine überraschend hohe chemische Stabilität gegen (S) -4-Chlor-3-Hydroxybuttersäu- reethylester (S-CHBE) aus. Darüber hinaus besitzen die GDH- Mutanten eine hohe Stabilität gegenüber Lösungsmitteln wie n- Butylacetat und MTBE, die häufig bei Biotransformationen verwendet werden. Schließlich weisen die GDH-Mutanten nicht den Nachteil einer stark erniedrigten enzymatischen Aktivität im Vergleich zum Wildtypenzym auf, wie bei ähnlichen Enzymen aus der Gattung Bacillus megaterium beobachtet.
Die erfindungsgemäßen GDH-Mutanten eignen sich aufgrund ihrer hohen Prozessstabilität für Biotransformationen mit hoher E- dukt- und Produktkonzentration, für Zweiphasensysteme und zur Wiederverwendung des Biokatalysators. Die Erfindung dient daher zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit bei Biotransformationen. Die Erfindung betrifft ferner ein Gen codierend für eine erfindungsgemäße GDH. Ein bevorzugte Ausführungsform eines solchen Gens ist charakterisiert durch SEQ. ID. NO 2.
Erfindungsgemäße Gene sind ferner auch alle durch den degenerierten genetischen Code bedingten Varianten der Gene codierend für eine erfindungsgemäße GDH.
Ein erfindungsgemäßes Gen lässt sich herstellen aus einem GDH- Gen aus B. subtilis . Das Gen kann aus genomischer DNS von B. subtilis mit an sich bekannten Methoden wie PCR isoliert und in einen Expressionsvektor kloniert werden. Dadurch ist die Produktion des erfindungsgemäßen Enzyms und seiner genetischen Varianten in rekombinanter Form möglich. Beispielsweise kann das Gen aus dem B. subtilis Stamm LK5 DSM 13487 (hinterlegt nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) verwendet werden.
Das GDH-Wildtypenzym aus dem Stamm Bacillus subtilis LK5 ist charakterisiert durch die in SEQ ID NO: 3 angegebene Proteinsequenz und die dafür kodierende Gensequenz (SEQ ID NO: 4) . Die Proteinsequenz aus SEQ ID NO: 3 ist zu 99 % identisch mit der in Lampel et al. , J. Bacteriol. (1986) 166: 238-243 offenbarten Proteinsequenz der GDH aus Bacillus subtilis, bzw. zu 83 % i- dentisch mit der Proteinsequenz der GDH aus Bacillus megateri- um.
In der vorliegenden Anmeldung beziehen sich alle Homologiewerte auf Ergebnisse, die mit dem Computerprogramm "Wisconsin Package Version 10.3, Accelrys Inc." erhalten wurden. Die Homologiebestimmung erfolgte durch Vergleich der Proteinsequenzen mit dem Unterprogramm "gap" . Hierbei werden die voreingestellten Parameter "gap creation penalty 8" und "gap extension penalty 2" verwendet. Aus der Kristallstruktur einer B. megaterium GDH (Yamamoto et al., J. Biochem. (2001) 129: 303-312) ist bekannt, dass das en- zymatisch aktive GDH-Tetramer durch hydrophobe Wechselwirkung zwischen den einzelnen Untereinheiten stabilisiert wird. Eine Verstärkung der hydrophoben Wechselwirkung, z. B. durch eine NaCl-Konzentration von 1-2 M oder durch Zusatz von Glycerin, ermöglicht in begrenztem Umfang die Erhöhung der thermischen Stabilität. Über einen Einfluss auf eine chemische Inaktivie- rung des Enzyms durch Verbindungen wie S-CHBE lassen sich aus dieser Beobachtung keine Vorhersagen treffen.
In Makino et al. , J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385 werden Genmutationen offenbart, die zu einer Erhöhung der Temperaturstabilität der GDH aus B. megaterium führen. Eine dieser Muta- tionen ersetzte die negativ geladene Aminosäure Glutaminsäure an Position 96 durch eine ungeladene Aminosäure, wie z. B. Alanin oder Glycin. Die erhöhte Temperaturstabilität in dieser Mutante wird dadurch erklärt, dass die negative Ladung der Glutaminsäure zu einer elektrostatischen Abstoßung der einzelnen Untereinheiten des GDH-Enzyms führt, was vor allem bei höheren Temperaturen und pH-Werten zu einer Dissoziation und Inaktivie- rung des Enzyms führt. Die Einführung einer ungeladenen Aminosäure reduziert die elektrostatische Abstoßung und erhöht die thermische Stabilität des Enzyms. Aus diesen Beobachtungen las- sen sich keine Aussagen über die Veränderung der chemischen Stabilität ableiten. Der Fachmann erwartet eher keinen Zusammenhang zwischen thermischer und chemischer Stabilität, da die Enzyminaktivierung durch eine Verbindung wie S-CHBE nicht durch Beeinflussung ionischer oder hydrophober Wechselwirkungen er- folgt, sondern durch chemische Modifikation reaktiver Aminosäurereste im GDH-Protein.
Daher ist der Befund, dass die Einführung einer erfindungsgemäß definierten Mutation in dem GDH Enzym aus B. subtilis die che- mische Stabilität dieses Enzyms drastisch erhöht, ohne dass gleichzeitig eine Stabilisierung durch NaCl-Konzentrationen von 1-2 M erforderlich ist, überraschend. Die erfindungsgemäße Mutation, die bei der GDH aus Bacillus subtilis zu einer erhöhten chemischen Stabilität führt, bewirkt bei Mutationen der GDH aus Bacillus megaterium nur eine Erhöhung der Temperaturstabilität.
Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße GDH-Mutante, bei der eine Glutaminsäure an Position 96 ersetzt ist durch Alanin, wird bezeichnet als GDBS-E96A. Die Gensequenz dieser Mutante ist spezifiziert durch die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte DNS- Sequenz bzw. die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) .
Unerwarteterweise bewirken die erfindungsgemäßen Mutationen in GDBS-E96A eine drastische Erhöhung der chemischen Stabilität gegenüber enzymschädigenden Verbindungen wie S-CHBE.
Die erfindungsgemäße GDBS-E96A zeichnet sich dementsprechend durch eine hohe Prozessstabilität bei Biotransformationen aus wie z. B. der enzymatischen Synthese von S-CHBE aus 4C1-ACE.
Die erfindungsgemäße GDH, z. B. das GDBS-E96A Protein kann durch an sich bekannte Methoden in rekombinanter Form hergestellt werden. Dazu wird ein erfindungsgemäßes GDH Gen, vorzugsweise das GDBS-E96A Gen, in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert, dieser in einen Produktionswirt transformiert, transformierte Zellen kultiviert, wobei die erfindungsgemäße GDH entweder konstitutiv oder nach Induktion der Genexpression produziert wird. Darüber hinaus kann in dem gleichen Produktionswirt neben der erfindungsgemäßen GDH eine oder auch mehrere CRs in rekombinanter Form hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst somit auch Expressionsvektoren, die zur rekombinanten Produktion einer erfindungsgemäßen GDH, vorzugsweise der GDH GDBS-E96A geeignet sind. Wo gewünscht lassen sich mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren auch eine oder mehrere CRs in einem Wirtsorganismus produzieren.
Das auf diese Weise hergestellte GDH Enzym kann dann direkt in den Zellen des Produktionswirts weiterverwendet werden oder a- ber nach AufSchluss der Zellen als Proteinextrakt bzw. nach entsprechender Aufarbeitung durch z. B. Säulenchromatographie als gereinigtes Protein.
Für die Enzymproduktion sind bakterielle und eukaryontische Ex- pressionssysteme geeignet. Wirtsorganismen für die Enzymproduktion sind vorzugsweise ausgewählt aus Escherichia coli, Stämmen der Gattung Bacillus, Hefen wie Pichia pastoris, Hansenula po- lymorpha oder Saccharomyces cerevisiae sowie Pilzen wie Aspergillus oder Neurospora, sie sind aber nicht auf die genannten Wirtsorganismen beschränkt.
Zu den bevorzugten Expressionssystemen zählen E. coli, Bacil- lus, Pichia pastoris, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha oder Aspergillus .
Besonders bevorzugte Expressionssysteme für die Produktion des GDH Enzyms sind E. coli, Pichia pastoris und S. cerevisiae.
Das so produzierte erfindungsgemäße GDH Protein, vorzugsweise GDBS-E96A, entweder in ganzen Zellen oder als Zellextrakt bzw. als gereinigtes Protein vorliegend, kann in Biotransformationen zur Regenerierung von NADH- und NADPH Cofaktoren verwendet werden. Es zeichnet sich dadurch aus, dass es nach einer Behandlung mit S-CHBE bis zu einer Konzentration von 10 % (v/v) (ent- sprechend einer Konzentration von 710 mM) in einem wässrigen Medium bei pH 7,0 und 3O0C für 2,5 h weniger als 30 % seiner Aktivität im Vergleich zum unbehandelten Enzym verliert. Die Wildtyp GDH (entsprechend der in SEQ ID NO: 3 aufgeführten Proteinsequenz) ist dagegen bereits nach einer Behandlung mit 3 % (v/v) S-CHBE für 30 min bei pH 7,0 und 300C zu 100 % inaktiv. Diese erfindungsgemäß hohe chemische Stabilität ist Grundlage für die Verwendung der GDH Mutante in Biotransformationen.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung zeichnet sich die erfindungsgemäße GDH-Mutante dadurch aus, dass es nach einer
Behandlung mit S-CHBE bis zu einer Konzentration von 10 % (v/v) in einem wässrigen Medium bei pH 7,0 und 300C für 2,5 h weniger als 20 % seiner Aktivität im Vergleich zum unbehandelten Enzym verliert.
In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung zeich- net sich die GDH-Mutante dadurch aus, dass es nach einer Behandlung mit S-CHBE bis zu einer Konzentration von 10 % (v/v) in einem wässrigen Medium bei pH 7,0 und 300C für 2,5 h weniger als 10 % seiner Aktivität im Vergleich zum unbehandelten Enzym verliert.
Ferner zeichnet sich die erfindungsgemäße GDH-Mutante durch eine hohe Lösungsmittelstabilität gegenüber n-Butylacetat und MTBE aus. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist die GDH-Mutante charakterisiert dadurch, dass sie nach einer Be- handlung in wässriger Lösung in einem Zweiphasengemisch unter ständigem Mischen, um eine Phasentrennung zu verhindern, mit 20 % (v/v) eines der beiden Lösungsmittel n-Butylacetat oder MTBE für 2 h bei 300C und pH 7,0, nicht mehr als 20 % seiner Aktivität verliert.
In einer besonders bevorzugten Ausführung verliert die GDH- Mutante unter diesen Bedingungen nicht mehr als 10 % seiner Aktivität .
Die Anwendung der erfindungsgemäßen GDH ist j edoch nicht nur auf Biotransformationen beschränkt . Es findet auch in anderen Anwendungen Verwendung . Bekannt sind z . B . die Verwendung in Biosensoren, z . B . zur Glucosebestimmung . Das erfindungsgemäße Enzym kann aber auch zur Herstellung von Gluconsäure , bzw . de- ren Salze , durch Oxidation von Glucose , verwendet werden . Darüber hinaus umfasst die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen GDH-Mutante zur Oxidation anderer Zucker, wie z . B . 2-Deoxyglucose oder D-Glucosamin .
Erfindungsgemäße Biotransformationszusammensetzungen umfassen eine erfindungsgemäße GDH-Mutante, ein CR-Enzym, einen Redox- Cofaktor ausgewählt aus NAD, NADH, NADP oder NADPH, ein Reduktionsmittel , vorzugsweise Glucose oder 2-Deoxyglucose sowie ein zu reduzierendes Substrat (Edukt) für das CR-Enzym, ausgewählt aus der Klasse der Carbonylverbindungen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird genutzt in einem Ver- fahren zur Herstellung von chiralen Alkoholen oder chiralen A- minen, wobei die erfindungsgemäße GDH die kostengünstige Regenerierung von NADH bzw. NADPH-Cofaktoren bewirkt, die bei der enantioselektiven Reduktion des Edukts durch die CR verbraucht werden.
Die Erfindung bezieht sich also auch auf Verfahren, bei denen eine erfindungsgemäße GDH zur Cofaktor-Regenerierung verwendet wird. Die Einsatzmenge der GDH im Verhältnis zum CR-Enzym ist dabei nicht festgelegt. Die Biotransformation wird dabei vor- zugsweise in einem gepufferten, wässrigen Medium ausgeführt. Es ist aber auch möglich, die Biotransformation in einem zweipha- sigen Gemisch durchzuführen, bestehend aus einer gepufferten, wässrigen Phase und einer zweiten, nicht mit Wasser mischbaren Phase, vorzugsweise einem organischen Lösungsmittel.
Insbesondere umfasst die Erfindung auch Verfahren, bei denen die GDH aufgrund ihrer hohen chemischen Stabilität, entweder alleine oder zusammen mit der CR, aus dem Reaktionsansatz zurückgewonnen werden kann für eine Wiederverwendung mit dem Ziel, die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu erhöhen. Die
Wiedergewinnung bezieht sich dabei auf Verfahren, wo das Reaktionsprodukt in an sich bekannter Weise nach Reaktionsende durch Extraktion mit einem in der wässrigen Phase nicht löslichen Lösungsmittel extrahiert wird und das Enzym mit der wäss- rigen Phase für den Wiedereinsatz zurückgewonnen wird. Dabei kann die Extraktion kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst außerdem alle CR-Enzyme, die als Edukt einer Biotransformation eine Carbonylverbindung reduzieren können, wobei als Reduktionsmittel NADH oder NADPH verbraucht wird. Bevorzugte CRs sind alle Enzyme, die eine Carbonylverbindung zu einem Alkohol, insbesondere einen chiralen Alkohol, reduzieren können.
Besonders bevorzugt sind CRs aus der Gruppe der ADHs, der AKRs, der Glycerindehydrogenasen, der Aldehydreduktasen und der Fett- säuresynthasen.
Insbesondere bevorzugt sind ADH' s aus den Gattungen Lactobacil- lus, Rhodococcus, Thermoanaerobacter (bzw. Thermoanaerobium) , sowie AKRs, Glycerindehydrogenasen, Aldehydreduktasen und Fett- säuresynthasen aus Hefen oder filamentösen Pilzen.
Die erfindungsgemäße GDH und die CR können im erfindungsgemäßen Verfahren entweder vollständig gereinigt oder teilweise gereinigt eingesetzt werden oder in Zellen enthalten (Ganzzellverfahren) verwendet werden. Dies schließt die Möglichkeiten ein, dass die GDH und die CR getrennt oder aber auch zusammen in den Zellen (Co-Expression) enthalten sind. Die eingesetzten Zellen können dabei nativ, permeabilisiert oder lysiert vorliegen. Die Einsatzmengen der CR und der erfindungsgemäßen GDH in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind dabei nicht festgelegt, dem Fachmann ist aber geläufig, dass mit einem möglichst geringen Enzymeinsatz bei hoher Raum-Zeit-Ausbeute ein möglichst quanti- tativer Umsatz des Substrates zum Produkt erfolgen soll.
Als Substrate der Biotransformationen, bei denen die erfindungsgemäße GDH die Regenerierung von NADH bzw. NADPH bewerkstelligt, können allgemein Carbonylverbindungen verwendet wer- den, bevorzugt solche mit 3 bis 40 C-Atomen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden prochirale Carbonylverbindungen der allgemeinen Formel (I)
R1-C(O)-R2 (I)
eingesetzt, wobei Rl und R2 unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe enthaltend Cl-C20-Alkyl, C3-C20-Cycloalkyl, C5-C20-Aryl, Cl-C20-Heteroaryl, C2-C20-Alkenyl, C5-C20-Aralkyl, C5-C20- Alkylaryl oder Rl und R2 zusammen einen Ring bilden können
und Rl und R2 gegebenenfalls unabhängig voneinander mit einem oder mehreren Resten Z substituiert sein können, wobei
Z ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Fluor, Chlor, Brom, Iod, -CN, -NO2, -NO, -NR3OR3, -CHO, SO3H, -COOH oder -R3 und
R3 für Wasserstoff steht oder die Bedeutung von Rl haben kann und
in Rl und R2 gegebenenfalls unabhängig voneinander eine oder mehrere Methylengruppen durch gleiche oder verschiedene Gruppen Y ersetzt sein können, wobei
Y ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend -CR3=CR3-, -C≡C-, - C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)OC(O)-, -0-, -0-0-, -CR3=N-, - C(0)-NR3-, N=N-, -NR3-NR3-, -NR3-O-, -NR3-, -P (0) (0R3) 0-, - OP(O) (R3)0-, -P(R3)-, P(O) (R3)-, -S-, -S-S-, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)NR3-, -S(O) (0R3)0-, -Si(R3)2-, Si(R3)2O-, -Si (R3) (0R3) -, -OSi(R3)2O-, -OSi (R3) 2-oder -Si (R3) 20Si (R3) 2- .
Bevorzugte C5-C20-Aryl oder Cl-C20-Heteroaryl-Reste für Rl und R2 werden insbesondere ausgewählt aus der Gruppe enthaltend - Phenyl, -Naphthyl, -Indolyl, -Benzofuranyl, -Thiophenyl, - Pyrrolyl, -Pyridinyl, -Imidazolyl, -Oxazolyl, -Isoxazolyl, - Furanyl, oder -Thiazolyl.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können im allgemeinen auch als Salze eingesetzt werden.
Besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden ausgewählt aus der Klasse der α-Ketoester, ß-Ketoester, γ-Ketoester, α-Diketone, ß-Diketone, γ-Diketone, δ-Diketone, α- Halogenketone, ß-Halogenketone, αα-Dihalogenketone, α- Alkoxyketone, α-Acyloxyketone, ß-Alkoxyketone, α-Alkinketone, Alkenketone, αα-Dialkoxyketone, ßß-Dialkoxyketone, Arylketone, Heteroarylketone.
Insbesondere eignen sich als Verbindungen der allgemeinen Formel (I) 3-Oxo-butansäuremethylester, 3-0xo-butansäure- ethylester, 4-Chlor-3-oxo-butansäuremethylester, 4-Chlor-3-oxo- butansäureethylester, 3-0xo-pentansäuremethylester, 3-0xo- pentansäureethylester, l-Chlor-propan-2-on, 1, 1-Dichlor-propan- 2-on, 3-Oxo-butan-2-on, 2, 6-Dimethyl-hexan-3, 5-dion, 2,7- Dimethyl-hexan-3, 6-dion, 2, 4-Hexandion, 2, 4-Pentandion, 3-Oxo- butansäuretertbutylester, 2, 5-Hexandion, 4-Trimethylsilyl-3- butin-2-on, 4-Triisopropylsilyl-3-butin-2-on, l-Chlor-4- trimethylsilyl-3-butin-2-on, l-Chlor-4-triisopropylsilyl-3- butin-2-on oder l-Chlor-butin-2-on, l-Chlorbutan-3-on, Butanon, Pentan-2-on, Hexan-2-on, Heptan-2-on, Octan-2-on, 3-Penten-2- on, 4, 4-Dimethoxybutan-2-on, l-Acetoxypropan-2-on, Cyclopent-2- en-l-on, 3-Oxotetradecansäuremethylester, 3- Oxododecansäuremethylester, 1, l-Dimethoxy-4-methyl-3-pentanon, 2-Oxo-propionsäureethylester, 1, 4-Dichlorbutanon, Acetophenon, 3-Methylbutanon, l-Benzyloxy-propan-2-on oder 2- Methylcyclopentanon.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Menge von 1 % bis 50 % bezogen auf das Gesamtvolumen eines jeden Reaktionsansatzes eingesetzt, bevorzugt von 3 % bis 30 %, insbesondere von 5 % bis 20 %.
Die Reaktionsmischung sollte generell einen pH-Wert von 5 bis 9 haben, bevorzugt von 6 bis 8.
Die wässrige Phase (Reaktionsmedium) enthält bevorzugt einen Puffer, insbesondere einen Kaliumphosphat/ Kaliumhydro- genphosphat-, Tris (hydroxymethyl) aminomethan/ HCl- oder
Triethanolamin/ HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise ein pH-Wert von 6 bis 9. Die Pufferkonzentration sollte von 5 mM bis 150 mM betragen. Zusätzlich kann die wässrige Phase auch Magnesiumionen enthalten, beispielsweise in Form von zugesetztem MgCl2 in einer Konzentration von 0.2 πiM bis 10 mM, bevorzugt 0.5 mM bis 2 mM be- zogen auf die eingesetzte Wassermenge. Daneben kann die wässrige Phase weitere Salze, wie beispielsweise NaCl, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 - 200 mM, sowie weitere Zusätze wie beispielsweise Dimethylsulfoxid, Glycerin, Glycol, Ethy- lenglycol oder bekannt Enzym-stabilisierende Zucker, wie Treha- lose, Sorbitol oder Mannitol enthalten.
Als Coenzym können NADP, NADPH, NAD, NADH oder deren Salze eingesetzt werden. Die Konzentration an Coenzym in der wässrigen Phase beträgt bevorzugt von 0.01 mM bis 0.25 mM, besonders be- vorzugt von 0.02 mM bis 0.1 mM.
Die Temperatur des Reaktionsgemisches beträgt bevorzugt von O0C bis 7O0C, besonders bevorzugt von 200C bis 500C.
Im Laufe der Reaktion kann weiteres Reduktionsmittel, vorzugsweise in Form von Glucose, oder Edukt insbesondere in Form von Carbonylverbindungen der allgemeinen Formel (I), zugegeben werden. Die Zugabe kann dabei jeweils kontinuierlich (als sog. „Feed") oder aber auch in Portionen (sog. „batchweise") erfol- gen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der pH des Ansatzes infolge der Oxidation von Glucose zu Gluconsäure kontinuierlich abnehmen, was durch Gegentitrieren mit einer Base korrigiert wird . Der pH des Reaktionsgemisches wird konstant gehalten durch Zugabe einer Base , ausgewählt aus Natronlauge , Kalilauge , Ammoniak (sog . , dem Fachmann geläufiges , „pH-stat" Verfahren) oder aber durch Zugabe von Calciumcarbonat, aus dem durch Säureeinwirkung gasförmiges Kohlendioxid freigesetzt wird .
Je nach Art und Menge der eingesetzten Alkohol-Dehydrogenase und der eingesetzten Verbindung der allgemeinen Formel (I) beträgt die Reaktionszeit zwischen 30 min und 200 h, bevorzugt 6 h bi s 60h .
Die Extraktion des Produktes erfolgt nach an sich bekannten Methoden, vorzugsweise mit einem mit Wasser nicht mischbaren, or- ganischen Lösungsmittel. Die Extraktion kann dabei diskontinuierlich (batchweise) oder kontinuierlich erfolgen. Wie dem Fachmann bekannt, werden dabei Temperatur und Druck so eingestellt, dass eine optimale Extraktion des Produktes aus der wässrigen Phase gewährleistet ist.
Als organische Lösemittel sind alle mit Wasser nicht mischbaren Lösemittel geeignet, die den gebildeten sekundären Alkohol aus der wässrigen Phase isolieren können.
Bevorzugt werden organische Lösemittel, ausgewählt aus der Gruppe der Ester und/oder Ether, verwendet.
Besonders bevorzugt werden Ethylacetat, Methylacetat, Propyla- cetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Tertbutylacetat, Diethy- lether, Diisopropylether, Dibutylether und MTBE oder deren Mischungen verwendet.
Insbesondere bevorzugte Lösungsmittel sind MTBE, Ethylacetat und Butylacetat.
Nach der Abtrennung der organischen Extraktionsphase wird diese vorzugsweise destillativ aufgearbeitet, wobei eine Anreicherung des Reaktionsproduktes erreicht und die teilweise bis vollständige Abtrennung von Nebenprodukten vom Extraktionslösemittel bewirkt wird und dieses erneut zur Extraktion eingesetzt werden kann.
Durch Aufreinigung der organischen Extraktionslösung enthaltend das Rohprodukt, beispielsweise mittels Feindestillation, erhält man das gewünschte Endprodukt. Das Endprodukt zeichnet sich typischerweise durch Ausbeuten >90 % und einem Enantiomerenüber- schuss ee >90 %, bevorzugt durch Ausbeuten >95 % und ee >97 % aus. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch den Wiedereinsatz eines wässrigen, enzymhaltigen Reaktionsmediums zur Umsetzung von Carbonylverbindungen zu chiralen Alkoholen. Die sich erge- benden hohen Raum-Zeit-Leistungen und der durch wiederholten Einsatz der Enzymlösung geringe Enzymverbrauch pro Mol Produkt ermöglichen die kostengünstige Umsetzung von Carbonylverbindungen zu chiralen Alkoholen unter Verwendung von Enzymen.
Die erfindungsgemäße GDH-Mutante GDBS-E96A zeichnet sich durch eine unerwartet hohe chemische Stabilität aus, die durch den Stand der Technik nicht zu erwarten war. Für den Fachmann überraschend ergeben sich unter Einbeziehung der erfindungsgemäßen, chemisch stabilen, GDH-Mutante GDBS-E96A zur Cofaktor- Regenerierung die dargestellten Vorteile bei der enzymkatalysierten Herstellung chiraler Alkohole, ausgehend von prochira- len Carbonylverbindungen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele beschrieben:
1 . Beispiel :
Isolierung und Klonierung des GDH-Gens aus genomischer B. sub- tilis DNS.
Verwendet wurde der B. subtilis Stamm LK5. Genomische DNS aus Bacillus subtilis wurde nach an sich bekannten Methoden isoliert (Makino et al . , J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385) . Das GDH Gen wurde durch PCR mit der Pfu DNS-Polymerase (Strata- gene) nach den Angaben des Herstellers mit genomischer DNS aus Bacillus subtilis LK5 und den Primern gdbs-a (SEQ ID NO: 5) und gdbs-b (SEQ ID NO: 6) amplifiziert. Die Primer wurden aus der publizierten Sequenz (Lampel et al. , J. Bacteriol . (1986) 166: 238-243) abgeleitet und hatten folgende Sequenzen:
Oligo gdbs-a:
5'-GCAGAATTCATGTATCCGGATTTAAAAGG-S' SEQ ID NO: 5
Oligo gdbs-b: 5'-CACGCGGCCGCTTAACCGCGGCCTGCCTGG-S' SEQ ID NO: 6
Primer gdbs-a enthielt am 5' -Ende eine Eco RI Schnittstelle, Primer gdbs-b enthielt am 5' -Ende eine Not I Schnittstelle. Bei der PCR-Reaktion von genomischer Bacillus subtilis DNS mit den Primern gdbs-a und gdbs-b entstand ein DNS-Fragment von 780 bp Größe.
Vektor pGDBSpic für die Expression in Pichia pastoris:
Das durch die PCR-Reaktion hergestellte 780 bp DNS-Fragment der B. subtilis GDH wurde mit Eco RI und Not I geschnitten und in den mit Eco RI und Not I geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pPIC3 (Invitrogen) kloniert. Es entstand der Vektor pGDBSpic (Fig. 1) . Sequenzierung des klonierten GDH Gens ergab die in SEQ ID NO: 4 aufgeführte DNS-Sequenz. Der Expressions- vektor pGDBSpic ist zur Expression des GDH Gens in der Hefe Pichia pastoris geeignet.
Vektor pGDHyexl für die Expression in Saccharomyces cerevisiae: Das GDH-Gen wurde aus dem Vektor pGDBSpic mit Eco RI und Not I herausgeschnitten und isoliert. Das dabei erhaltene 780 bp Fragment wurde in den mit Not I und Eco RI geschnittenen und dephosphorylierten S. cerevisiae Expressionsvektor pYEXL (Clon- tech) kloniert. Dadurch entstand der Expressionsvektor pGDHyexl (Fig. 2) . In pGDHyexl steht das GDH Gen unter Kontrolle des PGK-Promoters (Phosphoglyceratkinase Gen) . Das URA3 Selektions- markergen komplementiert eine Uracil Auxotrophie in transformierten S. cerevisiae Stämmen. Vektor pGDHyexl ist als autonom replizierender Vektor für die Expression des GDH-Gens in S. cerevisiae geeignet.
Integrativer Vektor pGDHnts für die Expression der GDH in S. cerevisiae: Vektor pGDHyexl wurde mit Nde I geschnitten und der lineari- sierte Vektor anschließend mit Pfu DNS-Polymerase behandelt, um die überhängenden, einzelsträngigen DNS-Enden aufzufüllen. Es folgte ein Verdau mit Hind III. Dabei entstanden neben einem 2,4 kb auch ein 6,6 kb DNS-Fragment, das neben der GDH- Expressionskassette auch das URA3 Selektionsmarkergen enthielt. Das 6,6 kb Genfragment wurde durch präparative Gelelektrophorese gereinigt und in mit Hpa I und Hind III geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pNTS kloniert.
Vektor pNTS (Fig. 3) enthielt ein 980 bp großes DNS-Fragment aus dem Genbereich der repetitiven ribosomalen rDNA aus S. cerevisiae. Das NTS-Genfragment wurde durch PCR mit der Taq DNS- Polymerase (Qiagen) mit den Primern ntsA (SEQ ID NO: 7) und ntsB (SEQ ID NO: 8) aus genomischer DNS aus S. cerevisiae iso- liert. Die Primer waren aus der publizierten Sequenz (Gendatenbankdatei SCNTSl.gb_pll. Primer ntsA: ab bp 11. Primer ntsB: ab bp 990, in revers-komplementärer Orientierung) ausgewählt worden und hatten folgende Sequenzen:
Primer ntsA:
5'-GCGGGATCCGGCGCGCCATCCGGGTAAAAACATG-3 λ SEQ ID NO: 7
Primer ntsB: 5' -GCGATCGATGGCGCGCCTATGCTAAATCCCATAAC-S λ SEQ ID NO: 8
Primer ntsA enthielt am 5'-Ende eine Barn HI Schnittstelle, gefolgt von einer Asc I Schnittstelle. Primer ntsB enthielt am 5' -Ende eine CIa I Schnittstelle, gefolgt von einer Asc I Schnittstelle.
Das bei der PCR-Reaktion gebildete PCR-Fragment wurde mit Barn HI und CIa I geschnitten und in den mit Barn HI und CIa I geschnittenen und dephosphorylierten Bluescript Vektor (Stratage- ne) kloniert, wodurch der Vektor pNTS (Fig. 3) entstand.
Vektor pecGDBS für die Expression in Escherichia coli: Plasmid-DNS des Expressionsvektors pGDBSpic wurde dazu verwendet, um das GDH-Gen mit den Primern gdbs-c (SEQ ID NO: 9) und gdbs-d (SEQ ID NO: 10) in einer PCR-Reaktion mit der Pfu DNS- Polymerase herzustellen. Die Primer hatten folgende Sequenzen:
Oligo gdbs-c:
5' -GAATTCGGTCTCAAATGTATCCGGATTTAAAAGG-S Λ SEQ ID NO: 9
Oligo gdbs-d:
5'-GTAAAGCTTGGTCTCTGCGCTTTAACCGCGGCCTGCCTGGA-S λ SEQ ID NO: 10
Primer gdbs-c enthielt am 5' -Ende eine Eco RI Schnittstelle ge- folgt von einer Bsa I Schnittstelle. Primer gdbs-d enthielt am 5' -Ende eine Hind III Schnittstelle gefolgt von einer Bsa I Schnittstelle.
Bei der PCR-Reaktion von pGDBSpic Plasmid-DNS mit den Primern gdbs-c und gdbs-d entstand ein DNS-Fragment von 780 bp Größe.
Das DNS-Fragment wurde mit Bsa I geschnitten und in den mit Bsa I geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pASK-IBA3 (sog. „Strep-tag" Protein Produktionssystem der Firma IBA, Institut für Bioanalytik) kloniert. Es entstand der Vektor pecGDBS (Fig. 4) . Sequenzierung des klonierten GDH Gens ergab die in SEQ ID NO: 4 aufgeführte DNS-Sequenz. Der Expressionsvektor pecGDBS ist zur Expression des GDH Gens in E. coli geeignet. IO
2 . Beispiel :
Herstellung der Mutante GDBS-E96A
Zur gezielten Mutagenese (sog. „site-directed" Mutagenese) des GDH-Gens, kloniert in den Expressionsvektor pecGDBS, wurde der „Quick Change" Mutagenese Kit der Fa. Stratagene verwendet. Als Primer für die Mutagenese wurden GDmutl (SEQ ID NO: 11) und GDmut2 (SEQ ID NO: 12) verwendet. Die Primer hatten folgende Sequenzen:
GDmutl: δ'-AATGCCGGTCTTGCAAATCCTGTGCCATCTC-S' SEQ ID NO: 11
GDmut2 : 5'-GAGATGGCACAGGATTTGCAAGACCGGCATT-S' SEQ ID NO: 12
Die Mutagenese wurde entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Der resultierende Vektor mit dem mutierten GDH- Gen wurde als pecGDBS-E96A (Fig. 5) bezeichnet. Die erfolgrei- che Einführung der Mutation wurde durch DNS-Sequenzierung überprüft. Die DNS-Sequenz der GDH-Mutante GDBS-E96A ist in SEQ ID NO: 2 aufgeführt. Die aus SEQ ID NO: 2 abgeleitete Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 1 aufgeführt. Der Expressionsvektor pecGDBS-E96A ist zur Expression des GDH Gens in E. coli geeig- net.
Autonom replizierender Vektor pGDBS-E96Ayexl zur Expression der
GDH-Mutante in S. cerevisiae:
Durch PCR-Reaktion mit den Primern gdbs-a (SEQ ID NO: 5) und gdbs-b (SEQ ID NO: 6, siehe 1. Beispiel), pecGDBS-E96A Plasmid- DNS und Pfu DNS-Polymerase wurde das mutierte GDH-Gen als 780 bp Fragment hergestellt, mit Eco RI und Not I geschnitten und in den mit Eco RI und Not I geschnittenen und dephosphorylier- ten Vektor pYEXL kloniert (siehe 1. Beispiel) . Die korrekte DNS-Sequenz des mutierten GDH-Gens wurde durch Sequenzierung überprüft. Es entstand der Expressionsvektor pGDBS-E96Ayexl (Fig. 6), der zur Expression des mutierten GDH-Gens in S. cerevisiae geeignet ist. Integrativer Vektor pGDBS-e96aNTS zur Expression der GDH- Mutante in S. cerevisiae:
Aus dem Vektor pGDBS-E96Ayexl wurde das GDH-Gen mit Eco RI und BgI II als 780 bp großes Genfragment isoliert. Aus dem integra- tiven Vektor pGDHnts wurde das Wildtyp GDH-Gen durch Verdau mit Eco RI und BgI II herausgeschnittenen, das 9,7 kb große Vektorfragment isoliert und dephosphoryliert . Das 780 bp große Genfragment der GDH-Mutante wurde in das Vektorfragment klo- niert. Es entstand der integrative Expressionsvektor pGDe96aNTS (Fig. 7) , der für die Expression der GDH-Mutante in S. cerevisiae geeignet ist.
3. Beispiel: Expression von GDH-Genen in E. coli
Verwendet wurden die Expressionsvektoren pecGDBS und pecGDBS- E96A. Plasmid-DNS wurde nach an sich bekannten Methoden in den E. coli Stamm Top 10F^ (Invitrogen) transformiert. Als Kontrol- Ie diente E. coli Top 10F \ mit dem pASK-IBA3 Leervektor transformiert. Jeweils ein Klon wurde ausgewählt und in einer Schüt- telkolbenanzucht nach den Angaben des Herstellers des pASK-IBA3 Vektors (IBA Institut für Bioanalytik) kultiviert. Von den E. coli-Stämmen wurde in LBamp-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefe- extrakt, 5 g/l NaCl, 0,1 mg/ml Ampicillin) eine Vorkultur hergestellt (Anzucht bei 370C und 120 rpm über Nacht) . Je 2 ml Vorkultur wurden als Inokulum einer Hauptkultur von 100 ml LBamp Medium (300 ml Erlenmeyerkolben) verwendet. Die Hauptkulturen wurden bei 3O0C und 180 rpm geschüttelt, bis eine ZeIl- dichte OD600 von 0,5 erreicht wurde. Dann wurde der Induktor
Anhydrotetracyclin (IBA Institut für Bioanalytik, Endkonzentration 2 μg/ml) zugegeben und weitere 3 h bei 300C und 180 rpm geschüttelt .
Zur Analyse der GDH-Produktion wurden jeweils 1 ml der E. coli Zellen in an sich bekannter Weise mit einem sog. „French®PressλΛ Hochdruckhomogenisator (SLM-AMINCO) aufgeschlossen und ein Zellextrakt durch Zentrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) isoliert. Aliquots der Zellextrakte wurden zur photometrischen Bestimmung der GDH-Aktivität verwendet. Während im Kontrollstamm keine GDH-Aktivität gemessen werden konnte, betrug die spezifische GDH-Aktivität in Zellextrakten 34,8 U/mg Protein für das Wildtypenzym und 30,8 U/mg für die Mutante GDBS-E96A (entspricht 88,5 % der spezifischen Aktivität der Wildtyp-GDH) . Beide GDH-Enzyme haben somit vergleichbare enzy- matische Eigenschaften. Die Mutante GDBS-E96A aus B. subtilis hat damit unerwartet bessere enzymatische Eigenschaften als die analoge Mutante aus Bacillus megaterium, die nur noch ca. 30 % der Aktivität des Wildtypenzyms besaß ( (Nagao et al. , FEBS Lett. (1989) 253, 113-116) .
Spektralphotometrische Bestimmung der GDH-Aktivität: Der Messansatz von 1 ml Volumen zur photometrischen Bestimmung von GDH-Aktivität war zusammengesetzt aus Messpuffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,0, 0,1 M NaCl), 10 mg/ml Glucose, 2 mM NADP und GDH-haltigem Zellextrakt. Messtemperatur war 250C. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe der Glucose (aus einer 40- fach konzentrierten Stammlösung) und die Extinktionszunahme infolge der Bildung von NADPH bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen (Extinktionskoeffizient von NADPH: ε = 0,63 x 104 1 x Mol"1 x cm"1) . Ein Unit GDH-Aktivität ist definiert als die Bildung von 1 μmol NADPH/min unter Testbedingungen.
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration der Zellextrakte in an sich bekannter Weise mit dem sog. „BioRad Proteinassay" der Fa. BioRad bestimmt.
4. Beispiel:
Expression von GDH-Genen in der Hefe S. cerevisiae
Ausgangsstamm war der S. cerevisiae Stamm CM3260 (Uracil-, Histidin-, Tryptophanauxotrophie, beschrieben in Dancis et al . , Cell (1994) 76: 393-402) . Das transformierte Expressionskon- strukt war pGDe96ants. pGDe96ants enthielt das mutierte GDH-Gen GDBS-E96A unter Kontrolle des PGK-Promotors . Selektionsmarker war das URA3 Gen (Uracil Selektion) . Der Vektor wurde vor der Transformation mit Asc I geschnitten, um die Expressionskassette freizusetzen. Die Transformation des Hefestammes CM3260 erfolgte nach der dem Fachmann geläufigen Lithiumacetat-Methode (Gietz and Woods, Biotechniques (2001) 30: 816-831) .
Transformanten wurden isoliert und durch Schüttelkolbenanzucht auf GDH-Aktivität getestet. Dazu wurde jeweils 50 ml YPD-CSL Medium (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 20 g/l Glucose, 20 g/l Mais Quellwasser, „Com Steep Liquor") mit einer Transfor- mante beimpft und vier Tage bei 28°C und 140 rpm (Infors
Schüttler) inkubiert. Die Zellen wurden, wie im 3. Beispiel für E. coli beschrieben, mit der „French®Press" aufgeschlossen und die Zellextrakte auf GDH-Aktivität untersucht. Aus dem Vergleich von ca. 50 getesteten Transformanten ging der Stamm GD34 als bester GDH-Produzent hervor. Die spezifische GDH-Aktivität in Rohextrakten (bestimmt wie im 3. Beispiel beschrieben) betrug 1 U/mg Protein. Im CM3260 Kontrollstamm konnte keine GDH- Aktivität gemessen werden.
5. Beispiel:
Chemische Stabilität der GDH-Mutante GDBS-E96A
Verglichen wurde die GDH-Aktivität in Zellextrakten aus der Anzucht in E. coli (Siehe 3. Beispiel) nach Vorbehandlung mit dem enzymschädigenden Produkt S-CHBE, das bei der Biotransformation von 4C1-ACE entsteht. Außerdem wurde die Stabilität gegen die Lösungsmittel n-Butylacetat und MTBE untersucht.
In einem ersten Test wurden gleiche Enzymaktivitäten von WiId- typ GDH und Mutante GDBS-E96A in Messpuffer (siehe 3. Beispiel) bei 300C und pH 7,0 mit S-CHBE in einer Konzentration von 3 % (v/v) behandelt und die GDH-Aktivität nach verschiedenen Inkubationszeiten bestimmt. Tab. 1 zeigt, dass das Wildtypenzym nach 30 min vollständig inaktiv war. Die Mutante GDBS-E96A war dagegen nach einer Inkubation von 120 min bei 3O0C zu noch mehr als 90 % aktiv. Tabelle 1: Kinetik der Inaktivierung von Wildtyp GDH und GDH- Mutante GDBS-E96A durch Vorinkubation (3O0C, pH 7,0) mit 3 % (v/v) S-CHBE
Zeit GDH-Wildtyp GDBS-E96A
(min) (% Restaktivität) (% Restaktivität)
0 100 100
30 0 91
60 0 96,7
90 0 92,2
120 0 98,9
In einem zweiten Test wurde die GDH-Mutante mit steigenden Mengen S-CHBE inkubiert (dosisabhängige Inaktivierung) und anschließend die GDH-Aktivität bestimmt. Wie in Tab. 2 darge- stellt, wurde unter Reaktionsbedingungen (3O0C, pH 7,0) nach einer 2,5 h Inkubation mit S-CHBE in Konzentrationen bis 10 % (v/v) (entspricht einer 0,71 M Konzentration) keine signifikante Inaktivierung des Enzyms beobachtet.
Tabelle 2: Dosisabhängige Inaktivierung der GDH-Mutante GDBS- E96A durch Vorinkubation (2,5 h 300C, pH 7,0) mit steigenden Mengen S-CHBE
% S-CHBE GDBS-E96A
(v/v) (% Restaktivität)
0 100
3 100,6
4,5 91,8
6 96,2
7,5 96,2
9 99,4
10 94,3
In einem dritten Test wurden gleiche Enzymaktivitäten von Wildtyp GDH und Mutante GDBS-E96A in Messpuffer (siehe 3. Beispiel) bei 300C und pH 7, 0 mit steigenden Mengen n-Butylacetat oder MTBE inkubiert (dosisabhängige Inaktivierung) und anschließend die GDH-Aktivität bestimmt. Wie in Tab. 3 dargestellt, wurde unter Reaktionsbedingungen (300C, pH 7,0) nach einer 2,5 h Inkubation mit n-Butylactet oder MTBE in Konzentrationen bis 20 % (v/v) keine signifikante Inaktivierung (n-Butylacetat) , bzw. eine Inaktivierung < 20 % (MTBE) der GDH-Mutante GDBS-E96A beobachtet, während die Wildtyp-GDH 50 % (n-Butylacetat) , bzw. bis zu 90 % (MTBE) inaktiviert wurde.
Tabelle 3: Dosisabhängige Inaktivierung der Wildtyp-GDH und der GDH-Mutante GDBS-E96A durch Vorinkubation (2 h 300C, pH 7,0) mit steigenden Mengen n-Butylacetat oder MTBE
% n-ButylWT-GDH GDBS-E96A % MTBE WT-GDH GDBS-E96A acetat (% Rest(% Rest(v/v) (% Rest(% Rest¬
(v/v) aktiviaktiviaktiviaktivität) tät) tät) tät)
0 100 100 0 100 100
5 55 99 5 31 84
10 57 105 10 14 80
20 56 99 20 11 86
Diese Ergebnisse bedeuten eine signifikante und nach dem Stand der Technik nicht zu erwartende Verbesserung der chemischen Stabilität der GDH-Mutante GDBS-E96A gegenüber dem Wildtypenzym.
6. Beispiel:
Ganzzeilbiotransformation mit GDH-produzierenden Hefezellen
Für Biotransformationen wurde der rekombinante S. cerevisiae Stamm FasB-his6 verwendet. Der Stamm FasB-hisδ ist abgeleitet vom GDH-produzierenden Stamm GD34. Er zeichnet sich durch eine erhöhte FAS CR-Aktivität aus und eignet sich für die Herstellung von S-CHBE und anderen chiralen ß-Hydroxyestern, da die in üblichen Hefestämmen zu beobachtenden CR-Aktivitäten, die zu R- CHBE führen, in natürlicherweise geringer Aktivität vorhanden sind. Die Expressionssteigerung der FAS-Aktivität wurde, dem Stand der Technik entsprechend, erreicht durch Überexpression der sog. Fasl-Untereinheit der Hefe Fettsäuresynthase (beschrieben in Wenz et al. , Nucleic Acids Res. (2001) 29: 4625- 4632) .
Die Anzucht des Hefestammes FasB-hisδ erfolgte in Schüttelkolben. 6 x 250 ml YPD-CSL-Medium, jeweils in 1 1 Erlenmeyerkol- ben, wurden mit dem Stamm FasB-his6 beimpft. Die Anzucht erfolgte durch Inkubation für vier Tage auf einem Orbitalschütt- ler (Infors) bei 280C und 120 rpm. Zellen wurden entweder direkt für die Biotransformation weiterverwendet oder bei -200C eingefroren.
Ein Biotransformationsansatz wurde durchgeführt, indem 1,5 1 FasB-his6 Zellen aus der Schüttelkolbenanzucht zentrifugiert und in Reaktionspuffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,0, 0,1 M NaCl, 2 M Glucose) aufgenommen wurden, so dass das Endvolumen 200 ml betrug. Die Zelldichte OD600 wurde bestimmt. Üblicherweise betrug die Gesamt-OD600 im Ansatz 30.000. Die Zellen wur- den in einem thermostatisierbaren Reaktionsgefäß vorgelegt, auf 250C temperiert und mit einem Magnetrührer gerührt. NADP wurde in einer Konzentration von 10 μM zugegeben. Das Reaktionsgefäß war über eine pH-Elektrode und eine Natronlauge (10 M Stammlösung) fördernde Bürette mit einem Titrator (Titroline alpha, Schott) verbunden, so dass die Biotransformation unter pH-stat- Bedingungen bei einem konstanten pH von 7,5 durchgeführt werden konnte. Das Substrat 4C1-ACE, in n-Butylacetat gelöst, wurde kontinuierlich zudosiert.
In zwei Versuchsreihen wurden entweder 12 g (Ansatz A) oder 18 g (Ansatz B) des Substrates 4C1-ACE mit n-Butylacetat gemischt, so dass das Endvolumen 40 ml betrug. Die Substratlösung wurde dann jeweils über eine Zeitdauer von 16 - 2O h kontinuierlich zudosiert. Die Endkonzentration des zudosierten Sub- strates im Ansatz A betrug 5 % (w/v) , im Ansatz B 7,5 % (w/v) .
Die Reaktion wurde nach 24 h gestoppt. Zur Aufarbeitung wurde der gesamte Biotransformationsansatz dreimal mit einem gleichen Volumen Essigester extrahiert, die Essigesterphasen vereinigt und in einem Rotationsverdampfer das Lösungsmittel entfernt. Die so gewonnene S-CHBE Rohfraktion wurde in an sich bekannter Weise durch chirale Gaschromatographie analysiert. In beiden Ansätzen wurde ein quantitativer Umsatz des eingesetzten 4Cl- ACE erzielt. Der durch Gaschromatographie bestimmte S-CHBE Gehalt der Rohfraktionen bzw. Enantiomerenüberschuss ee ist in Tab. 4 aufgeführt.
Tabelle 4
Produktion von S-CHBE durch Ganz zeilbiotransformation mit GDH- überexprimierenden Hefezellen
Ansatz 4C1-ACE Reaktions- S-CHBE ee S-CHBE Dosierung dauer (h) (%) (%)
A 5 % (v/v) 24 96 , 5 93 B 7 , 5 % (v/v) 24 95 90
7. Beispiel:
Biotransformation mit Zellextrakten
Die Anzucht des E. coli Stammes pecGDBS-E96A in Schüttelkolben und Extraktion des GDH Enzyms erfolgte wie im 3. Beispiel be- schrieben. Die ADH aus Lactobacillus brevis (LB-ADH) war kommerziell verfügbar (Jülich Fine Chemicals GmbH) .
Ein Biotransformationsansatz von 100 ml Endvolumen enthielt neben Reaktionspuffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 6,5, 0,1 M NaCl, I mM Magnesiumsulfat, 2 M Glucose) GDBS-E96A GDH und LB-ADH, jeweils in 15 U/ml Dosierung, 50 uM NADP und als Substrat 12,9 g Acetessigsäuremethylester (ACMe) in einer Dosierung von 12,9 % (w/v) . Der Ansatz wurde in einem thermostatisierbaren Reaktionsgefäß vorgelegt, auf 300C temperiert und mit einem Magnetrührer gerührt. Das Reaktionsgefäß war über eine pH- Elektrode und eine Natronlauge (10 M Stammlösung) fördernde Bü- rette mit einem Titrator (Schott) verbunden, so dass die Biotransformation unter pH-stat-Bedingungen bei einem konstanten pH von 6,5 durchgeführt werden konnte. Die Reaktion wurde nach 21 h gestoppt. Zur Aufarbeitung wurde der gesamte Biotransformationsansatz dreimal mit einem gleichen Volumen Essigester extrahiert, die Essigesterphasen vereinigt und in einem Rotationsverdampfer das Lösungsmittel entfernt. Die so gewonnene (R) -3-Hydroxybuttersäuremethylester (R-HBMe) Rohfraktion wurde durch chirale Gaschromatographie analysiert. Es wurde ein quantitativer Umsatz des eingesetzten ACMe erzielt. Der durch Gaschromatographie bestimmte R-HBMe Gehalt der Rohfraktionen war > 99 %, der Enantiomerenüberschuss ee betrug 100 %.

Claims

Patentansprüche:
1. Glucose Dehydrogenase mit einer Aminosäuresequenz die der A- minosäuresequenz einer GDH von Bacillus subtilis umfassend einen Glutaminsäurerest an Position 96 entspricht mit dem Unterschied, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine unpolare bzw. hydrophobe Aminosäure oder Glycin ausgetauscht ist.
2. Glucose Dehydrogenase gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der Bacillus subtilis GDH umfassend einen Glutaminsäurerest an Position 96 SEQ. ID. NO: 1 entspricht.
3. Glucose Dehydrogenase gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Glycin, Alanin, Va- lin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin, Phenylalanin, Ty- rosin, und Tryptophan ausgetauscht ist.
4. Glucose Dehydrogenase gemäß Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine A- minosäure ausgewählt aus der Gruppe Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin ausgetauscht ist.
5. Glucose Dehydrogenase gemäß Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen die Ami- nosäure Alanin ausgetauscht ist.
6. Glucose Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei einer Behandlung mit 10 %
(v/v) S-CHBE für 2,5 h bei 300C, pH 7, eine Abnahme < 30 %, vorzugsweise < 20 % besonders bevorzugt < 10 % ihrer enzyma- tischen Aktivität im Vergleich zum unbehandelten Enzym zeigt.
7. Gen codierend für eine Glucose Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
8. Verfahren zur Herstellung von chiralen Alkoholen oder chira- len Aminen durch eine Carbonylreduktase dadurch gekennzeichnet, dass eine Glucose Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Regenerierung von NADH oder NADPH-Cofaktoren eingesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Carbonylreduktase ausgewählt ist aus Gruppe der Alkohldehydrogenasen, der Aldo- Ketoreduktasen, der Glycerindehydrogenasen, der Aldehydreduk- tasen und der Fettsäuresynthasen.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung eines chiralen Alkohols der allgemeinen Formel (I) .
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