WO2007134817A1 - Biokatalysatoren und verfahren zur herstellung von organischen verbindungen - Google Patents

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WO2007134817A1
WO2007134817A1 PCT/EP2007/004465 EP2007004465W WO2007134817A1 WO 2007134817 A1 WO2007134817 A1 WO 2007134817A1 EP 2007004465 W EP2007004465 W EP 2007004465W WO 2007134817 A1 WO2007134817 A1 WO 2007134817A1
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WO
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enzyme
isolated
phototrophic
electron transport
molecule
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Application number
PCT/EP2007/004465
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dirk Weuster-Botz
Jan Havel
Kathrin HÖLSCH
Original Assignee
Dirk Weuster-Botz
Jan Havel
Hoelsch Kathrin
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Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)

Definitions

  • the present invention is directed to the stereo-selective production of reduced hydrocarbon compounds, especially chiral alcohols, from oxidized hydrocarbon compounds such as prochiral ketones, by means of isolated enzymes, particularly ketoacyl reductases, from phototrophic organisms.
  • ketones For the asymmetric reduction of ketones by means of chemical catalysis different methods are available. These include direct hydrogenation with hydrogen and transfer hydrogenation, both of which are catalyzed by transition metal complexes, as well as borane-based catalysis (WiIIs & Hannedouche, 2002).
  • biocatalysis is the use of whole-cell catalysts.
  • a new approach to whole-cell biocatalysts is described in the German patent application DE 102005021241.7.
  • phototrophic microorganisms are used for whole-cell biocatalysis in standard bioreactors.
  • whole cells prevents proteolytic degradation and can eliminate the need for expensive cofactors since whole cell biocatalysts naturally contain these cofactors.
  • the cofactor regeneration can usually be carried out with the aid of a cosubstrate.
  • whole cells can also be used for asymmetric ketone reduction (Nakamura et al., 2003).
  • Recombinant whole-cell biocatalyst systems are also used here (Kataoka et al., 2003). This does not suggest the use of isolated enzymes, since a regeneration of the cofactors and the stability of the enzyme would not be guaranteed.
  • the cells used can be either killed, dormant or growing applied.
  • the first case occurs in cells where heavy membrane enteric substances are used.
  • Detergents are used for membrane permeabilization.
  • the cells are intact.
  • the enzymes are better protected inside the cells and the catalyst is more frequently reusable than in killed cells.
  • the metabolism of resting cells is not active, while growing cells that metabolize nutrient sources metabolize.
  • Such cells can be used both in free suspension and in immobilized form.
  • the present method enables a repeated reuse of isolated enzymes by regeneration of catalyst systems, in particular cofactors, and therefore offers an advantage over the prior art.
  • the biocatalyst may be inactivated due to the toxic effects of substrates and products. This has the consequence that the problem of low yields exists when using whole-cell catalysts. Furthermore, there may be an intracellular accumulation of the product, which For example, the purification of the product difficult and the risk of chemical modification of the product, eg. B. increased by intermolecular crosslinking reactions. Therefore, it is necessary to select a suitable organism which is resistant to both the substance system to be reacted and allows the product to be discharged. The inventive method eliminates this labor-intensive search for suitable organisms, which also often make complex demands on the cultivation conditions.
  • a whole cell includes a variety of enzymes that it may u.U. makes it difficult to achieve a desired final product in a targeted manner. There is a risk that the desired product will be further modified or even degraded.
  • asymmetric ketone reductions are carried out.
  • alcohol dehydrogenases ADH
  • isoenzymes ADH from wild-type strains or heterologously expressed isoenzymes are used for this purpose.
  • Nakamura et al. 2003 describes the use of isolated dehydrogenases from heterotrophic organisms for asymmetric ketone reductions.
  • the cofactor supply is provided either by the addition of NADPH / NADH or by their less expensive oxdated form.
  • the necessary conversion of the oxidized form of the cofactor from the ADH itself is carried out by oxidation of an alcohol into its corresponding ketone or by a second oxidizing enzyme such as in the oxidation of formic acid by formate dehydrogenase (Seelbach et al., 1996).
  • ketoacyl reductase from heterotrophic organisms usually exhibits an R orientation (Ren et al., 2000) and is fixed with respect to the substrate to a specific fatty acid chain length, as has been shown, for example, for E. coli (Taguchi et al. , 1999).
  • phototrophic organisms such as cyanobacteria
  • enzymes that reduce hydrocarbon compounds (Dittmann et al., 2001), but these are largely unexplored and their use for stereo-selective production of reduced hydrocarbon compounds has not previously been described.
  • the object of the present invention is a cost-effective, effective and yet biotechnologically safe method for the preparation of enantiomerically pure reduced hydrocarbon compounds.
  • This object is achieved by a method according to claim 1 using isolated enzymes from phototrophic organisms or by means of a composition according to claim 16, which comprises such an isolated enzyme.
  • the dependent claims are directed to particular embodiments of this invention.
  • Phototrophic organisms are characterized by easy handling, since they usually make low demands on their environment, in particular the culture medium, and often have low reproduction times.
  • Enzymes from phototrophic organisms, in particular cyanobacterial enzymes are largely unexplored for conventional biocatalysis. It was hitherto unknown which enzyme is responsible for asymmetric syntheses in phototrophic organisms, since, according to the current expert opinion, the use of photoautotrophic organisms for asymmetric synthesis is possible only in special photobioreactors and therefore more extensive investigations in this field have been made.
  • Isolated enzymes from phototrophic organisms have new synthetic pathways / synthesis potentials.
  • S-specificity of the asymmetric reactions with phototrophic organisms is of particular importance.
  • isolated enzymes from phototrophic organisms offer numerous advantages. Since phototrophic organisms make lower demands on the composition of the culture medium than heterotrophic organisms, enzymes from phototrophic organisms can be produced more cheaply. In addition, enzymes from phototrophic organisms can be easily isolated and have a surprisingly high stability and activity outside of the organism. The enzymes of phototrophic organisms have so far been largely unused for the production of fine chemicals. Low space-time yields due to the use of complicated photobioreactors make hitherto an industrial use of enzymes from these organisms unattractive. With, for example, an isolated KR from phototrophic organisms, a novel biocatalyst for asymmetric syntheses is also available with substrates with large side chains to disposal. The frequently pronounced S-specificity in the case of an isolated acyl reductase from phototrophic organisms meets a market gap due to the extensive R-specificity of conventionally used enzymes.
  • ketoacyl reductase which catalyze the reduction of hydrocarbon compounds are capable of asymmetric synthesis of substrates having large side chains and high enantiomeric purity and are characterized by a high stability and Activity outside the cell, which is why they are highly suitable for overexpression, for recombinant expression and for purification.
  • the invention is directed to a process for the preparation of reduced hydrocarbon compounds, characterized in that an enzyme isolated from a phototrophic organism catalyzes the reduction of an oxidized hydrocarbon compound.
  • the enzyme catalyses the reduction in a stereo-selective manner.
  • the oxidized carbon compound reduced by the isolated enzyme is a non-natural substrate of the isolated enzyme such as 2,3,4,5,6-pentafluoroacetophenone, ethyl 4-chloroacetoacetate, 4-chloroacetophenone, ethylbenzoylacetate and others.
  • Preferred oxidized hydrocarbon compounds are carbonyl compounds such as ketones, most preferably prochiral ketones.
  • Preferred reduced hydrocarbon compounds are hydroxy-hydrocarbon compounds. Particularly preferred reduced hydrocarbon compounds are alcohols.
  • the invention is directed to an isolated from a phototrophic organism enzyme for use in the inventive method and to the use of the enzyme for the stereo-selective production of a reduced hydrocarbon compound.
  • the invention is directed to a composition characterized in that it comprises an enzyme isolated from a phototrophic organism and an electron transport molecule and the use of this composition for the stereo-selective production of a reduced hydrocarbon compound.
  • the enzyme isolated from a phototrophic organism is preferably a short chain dehydrogenase or reductase (SDR).
  • SDR short chain dehydrogenase or reductase
  • the isolated enzyme is particularly preferably one Ketoacyl reductase (EC 1.1.1.100), which is also referred to as 3-oxoacyl (ACP) reductase, 3-ketoacyl (acyl carrier protein) reductase or 3-ketoacyl (ACP) reductase.
  • the reduced hydrocarbon compound produced by an enzyme isolated according to the invention is an R or S enantiomer.
  • the reduced hydrocarbon compound is an R- or S-enantiomer with respect to the reduced carbon atom.
  • a chiral hydrocarbon compound is formed from a prochiral hydrocarbon compound.
  • a chiral alcohol is formed from a prochiral ketone.
  • the isolated enzyme is diastereomer selective.
  • the chiral reduced hydrocarbon compound is an intermediate which is further converted to a chiral end product.
  • the chiral end product is a chiral amine.
  • a chiral alcohol is formed from a prochiral ketone which is converted to a chiral amine.
  • the achievable by an isolated enzyme from phototrophic organisms enantiomeric excess is 60% - 70%, preferably 70% - 80%, more preferably 80% - 90% and most preferably 90% - 100%. Furthermore, the enantiomeric excess is preferably 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 100%. Accordingly, the proportion of the R or S enantiomers of the product of the process according to the invention for the preparation of a reduced Hydrocarbon compound 60% - 70%, preferably 70% - 80%, more preferably 80% - 90% and most preferably 90% - 100%. Furthermore, the proportion of R- or S-enantiomers of the product is preferably 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 100%.
  • the phototrophic organism from which the enzyme is isolated for use in the method of the invention or contained in a composition is preferably a phototrophic eukaryote or a phototrophic prokaryote.
  • the phototrophic organism is a phototrophic microorganism.
  • Particularly preferred phototrophic microorganisms are phototrophic eukaryotic microorganisms and phototrophic prokaryotic microorganisms.
  • Preferred phototrophic eukaryotes are plants, phototrophic algae and phototrophic organisms, for example of the genus Euglena. Further preferred phototrophic eukaryotes are phototrophic protozoa, such as, for example, Chlorella and Euglena.
  • Preferred plants according to the invention are, for example, plants of the genera Brassica, Allium, Daucus, Arabidopsis, Carthamus, Cuphea, Hordeum, Persea, Spinacia, Zea, Plantago, Triticum, Nicotiana, Avena and Seeale.
  • preferred plants are selected from the group consisting of Brassica napus , Allium porrum, Daucus carota, Arabidopsis thaliana, Carthamus tinetorius, Cuphea lanceolata, Hordeum vulgaris, Persea americana, Spinacia oleracea, Physcomitrella patens, Zea mays, Plantago major, Triticum aestivum, Nicotiana tabacum, Avena sativa and Seeale cereale.
  • Phototrophic algae preferred according to the invention are, for example, green algae (Chlorophyta), red algae (Rhodophyta) and golden brown algae (Chrysophyta).
  • Preferred green algae include, for example, the genus Ulva, Chlamydomonas, Volvox and Chlorella.
  • a particularly preferred green alga is e.g. Chlamydomonas reinhardtii.
  • Preferred phototrophic prokaryotes are, for example, sulfur pollen bacteria, sulfur-free purple bacteria, green sulfur bacteria, green non-sulfur bacteria, phototrophic archaea, heliobacteria and cyanobacteria.
  • a particularly preferred green non-sulfur bacterium is Chloroflexus aurantiacus J-10-fl.
  • Preferred cyanobacteria which are also called blue-green algae, are, for example, cyanobacteria of the orders Chroococcales, Gloeobacteria, Nostocales, Oscillatoriales, Pleurocapsales, Prochlorales, Stigonematales and also cyanobacteria of the group of unclassified cyanobacteria.
  • Particularly preferred cyanobacteria are cyanobacteria selected from the group consisting of Anabaena sp., Anabaena sp. PCC 7120, Anabaena variabilis, Anabaena variabilis ATCC 29413, Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus), Synechocystis sp., Synechocystis sp. PCC 6803, Synochocystis sp. CC9695, Synochocystis sp.
  • WH8102 Crocosphaera watsonii, Trichodesmium erythaeum, Trichodesmium erythaeum IMS101, Synechococcus sp., Synechococcus PCC6301, Synechococcus PCC 7942, Synechococcus sp. CC9902, Prochlorococcus marinus, Prochlorococcus marinus MIT 9313, Prochlorococcus marinus NATL2A, Gloeobacter violaceus, Lyngbya sp. PCC 8106, Nodularia spumigena CCY9414, Cyanothece sp. CCY0110, Nostoc punctiforme PCC 73102, Prochlorococcus marinus NATL1A.
  • an enzyme isolated from a phototrophic organism according to the present invention is an enzyme which is partially or completely separated from the components of its expression site, i. H. completely or partially purified.
  • the amino acid sequence of the enzyme comprises the amino acid sequence of a short chain dehydrogenase or reductase (SDR) from phototrophic organisms or has homology to the sequence of a short chain dehydrogenase or reductase (SDR) from phototrophic organisms.
  • SDR short chain dehydrogenase or reductase
  • the consensus sequence comprising as such or alternatively the amino acid sequence of all SDRs from phototrophic organisms is shown in Figure 15 and has the sequence designated "consensus sequence 1", the letters following the "one-letter code" for the corresponding Amino acids and X stands for all amino acids.
  • the consensus sequence of the SDRs from phototrophic organisms is the sequence designated "consensus sequence 2", wherein the letters according to the "one-letter code” stand for the corresponding amino acids and X for all amino acids, U for aliphatic amino acids (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine) and Z is charged amino acids (lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate).
  • X all amino acids
  • U aliphatic amino acids (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine)
  • Z charged amino acids (lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate)
  • the consensus sequence of the SDRs from phototrophic organisms is particularly preferably the sequence designated by "consensus sequence 3", wherein the letters according to the "one letter code” represent the corresponding amino acids and X is all amino acids, U is aliphatic amino acids (glycine, alanine, Valine, leucine, isoleucine, proline, methionine), Z for charged amino acids (lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate), ⁇ for polar, uncharged amino acids (serine, threonine, asparagine, glutamine, cysteine) and ⁇ for aromatic amino acids ( Phenylalanine, tyrosine, tryptophan).
  • U aliphatic amino acids (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine)
  • Z charged amino acids (lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate)
  • ⁇ polar, uncharged amino acids (Seh, threonine, asparagine, glutamine, cysteine )
  • ⁇ aromatic amino acids (phenylalanine, tyrosine, tryptophan)
  • the amino acid sequence of the isolated enzyme comprises the amino acid sequence of a ketoacyl reductase from a phototrophic organism such as a cyanobacterium, preferably Synechococcus PCC7942 (SEQ ID NO: 1) or preferably Anabaena ATCC 29413 (SEQ ID NO: 2) Homology to a ketoacyl reductase from a phototrophic organism.
  • a phototrophic organism such as a cyanobacterium, preferably Synechococcus PCC7942 (SEQ ID NO: 1) or preferably Anabaena ATCC 29413 (SEQ ID NO: 2) Homology to a ketoacyl reductase from a phototrophic organism.
  • Preferred amino acid sequences of ketoacyl reductases from phototrophic organisms derived from the Consensus be included are the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • sequence homology which is also referred to as sequence identity, of the enzyme isolated from phototrophic organisms to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is preferably 10% -30%, preferably 30% -50%, particularly preferably 50% -70%. , more preferably 70% -100%. Furthermore, the homology to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is preferably 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% or 100%.
  • the claimed protein sequences also include those sequences which have a homology greater than 80%, preferably greater than 90%, 91%, 92%, 93% or 94%, particularly preferably greater than 95% or 96% and especially particularly preferred greater than 97%, 98% or 99% to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, provided that the mode of action or the purpose of such a sequence is retained.
  • the invention also encompasses the enzymes isolated from phototrophic organisms or their amino acid sequence as well as nucleic acids coding for homologous amino acid sequences.
  • the nucleic acids of the invention are also referred to as nucleic acid sequences and include nucleobases.
  • Preferred nucleic acids are, for example, DNA and / or RNA or DNA and / or RNA sequences.
  • Preferred nucleic acids are nucleic acids encoding the consensus sequence.
  • Particularly preferred nucleic acids are DNA and / or RNA sequences encoding the consensus sequence.
  • nucleic acids comprising the sequence coding for SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • sequence identities amino acid sequences which have the already described homologies (sequence identities) to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • nucleic acids encoding amino acid sequences includes all sequences that appear possible in accordance with the degeneracy of the genetic code.
  • the DNA sequence according to the invention preferably comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, which are also shown in FIG. 16.
  • Particularly preferred DNA sequences are sequences which are homologous to the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • the homology is 10-99%, preferably 20-90%, more preferably 30-90%, most preferably 40-90%, most preferably 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%.
  • H (%) [1-V / X] x 100, where H is homology, X is the total number of nucleobases / amino acids of the comparison sequence, and V the number of different nucleobases / amino acids of the sequence to be considered is based on the comparison sequence.
  • the enzyme is isolated from a phototrophic organism which is a wild type.
  • the enzyme isolated from a phototrophic organism is recombinantly expressed in a phototrophic organism.
  • the enzyme isolated from a phototrophic organism is overexpressed in a phototrophic organism.
  • the enzyme isolated from a phototrophic organism is heterologous in a phototrophic organism, i. H. foreign, expressed.
  • Preferred phototrophic organisms in which the enzyme isolated from a phototrophic organism is expressible are already listed, whereby the expression in non-natural culture systems, such. As plant cell suspension cultures, plant callus cultures or moss protonema cultures is possible.
  • the enzyme isolated from a phototrophic organism is expressed in a heterotrophic organism.
  • the enzyme isolated from a phototrophic organism is expressed in an organism selected from the group consisting of bacteria, fungi, insect cells and mammalian cells.
  • Particularly preferred heterotrophic organisms for expression of the enzyme isolated from a phototrophic organism are yeasts, such as. B. Saccharomyces cerevisiae or bacteria, such as. B. Escherichia coli.
  • the enzyme isolated from a phototrophic organism is expressed in vitro.
  • a particularly preferred form of in vitro expression is in vitro translation.
  • this is altered from a phototrophic organism in its amino acid sequence other than the wild-type sequence.
  • the changes in the amino acid sequence are preferably directed to altering cofactor specificity, altering substrate specificity, enhancing specific activity, improving enzyme stability, improving topic stability, enhancing activatability by increasing the temperature, improving the stability of the enzyme to altered salt concentrations and an altered pH, increasing the resistance to acids or bases or organic solvents or changing the optimum reaction temperature.
  • the purification of the enzyme can be carried out by the common techniques for protein purification.
  • Preferred purification techniques are ammonium sulfate precipitation, gel filtration, affinity chromatography or electrophoretic purification.
  • an affinity tag can be added to the enzyme.
  • This affinity tag consists for example of a peptide (His-tag) or another molecule, such as. B. GST, biotin or streptavidin tag.
  • the isolated enzyme is added to a reaction mixture containing the oxidized hydrocarbon compound.
  • the enzyme is introduced into the reaction mixture and provided with the oxidized hydrocarbon compound.
  • solubilizers are used for the substrate. Furthermore, preference is given to temperature changes and the use of multiphase systems (liquid or solid-liquid) for accelerating the reaction. Particularly preferably, the substrate is added continuously in order to avoid substrate excess inhibition and thus to increase the conversion.
  • suitable organic solvents are used to alter the conformation of the enzyme and / or to increase the conversion and / or to change the substrate / product spectrum.
  • the protein stabilizing conditions are increased by the choice of salt concentration and salt composition or by the addition of compatible solutes.
  • the reaction mixture is preferably a solution having a pH of 5-6, 6-7, 7-8 or 8-9.
  • the solution is particularly preferably buffered.
  • the buffer used is preferably Na citrate, MES, potassium phosphate, Tris / HCl, MOPS, TRICIN or HEPES buffer.
  • the solution is buffered with MES buffer to a concentration of 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 or 90-100 mM.
  • the Reaction temperature is preferably 20-25, particularly preferably 25-30, particularly preferably 30-35 or 35-40 ° C.
  • the method comprises increasing the reaction temperature using a thermally activated enzyme.
  • Preferred expression vectors are vectors for expression in prokaryotic cells and vectors for expression in eukaryotic cells, as well as vectors for in vitro expression.
  • Particularly preferred expression vectors are plasmid vectors and viral expression vectors.
  • the preferred plasmid vectors are suitable for expression in prokaryotes or eukaryotes.
  • the viral expression vectors are preferably selected from the group consisting of adenoviral, adeno-associated or retroviral vectors.
  • the expression vectors preferably comprise, in addition to the DNA sequence coding for the enzyme according to the invention, further functional DNA sequences.
  • Preferred further functional DNA sequences are regulatory sequences, such as promoter and enhancer sequences and / or antibiotic resistance genes.
  • the promoters are inducible promoters.
  • the promoters are particularly preferably inducible by means of IPTG, temperature changes or doxycycline.
  • the invention is directed to host cells which express the enzyme isolated from phototrophic bacteria.
  • the host cell according to the invention is preferably a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • Preferred prokaryotic cells are bacterial cells.
  • Preferred eukaryotic cells are yeast cells, mammalian cells, insect cells or plant cells.
  • the isolated enzyme is either isolated from a phototrophic organism and added to a starting product or, alternatively, the nucleic acid sequence encoding the enzyme is cloned into a vector which is then used and expressed in the method of the invention.
  • isolated sequence usually remains in the vector, in eukaryotic vectors, the isolated sequence is often integrated into the genome.
  • a host cell is transformed or transfected with an expression vector.
  • the expression vector is not integrated into the genome of the host cell.
  • the expression vector or parts thereof is integrated into the genome of the host cell.
  • the DNA sequence coding for the enzyme isolated from a phototrophic organism is preferably integrated into the genome of the host cell.
  • the process according to the invention for the preparation of a reduced hydrocarbon compound preferably comprises the cloning of the DNA sequence coding for the enzyme isolated from a phototrophic organism into an expression vector, the expression of the sequence in a host cell and the purification of the enzyme. More preferably, the process according to the invention for the preparation of a reduced hydrocarbon compound comprises the integration of the DNA sequence coding for the enzyme isolated from a phototrophic organism into a genome of a host cell, the expression of the sequence and the purification of the enzyme.
  • a composition comprising an isolated enzyme from a phototrophic organism and an electron transport molecule is used for the stereo-selective production of reduced hydrocarbon compounds.
  • the electron transport molecule is a natural electron transport molecule.
  • the electron transport molecule is an electron donor.
  • the electron transport molecule is a cofactor, wherein cofactors include coenzymes or prosthetic groups.
  • the cofactor NADH is preferred.
  • Particularly preferred is the cofactor NADPH.
  • the electron transport molecule is a non-natural electron transport molecule.
  • the electron transport molecule is a non-natural electron mediator.
  • the composition comprises a molecule or a system for regenerating the electron transport molecule.
  • the molecule for regenerating the electron transport molecule is an enzyme.
  • the enzyme for regeneration of the electron transport molecule is not identical to the enzyme catalyzing the reduction of the hydrocarbon compound.
  • a preferred enzyme for the regeneration of the electron transport molecule is formate dehydrogenase.
  • the enzyme for regenerating the electron transport molecule is identical to the enzyme catalyzing the reduction of the hydrocarbon compound.
  • the molecule for the regeneration of the electron transport molecule is covalently linked to the enzyme catalyzing the reduction of the hydrocarbon compound.
  • the molecule for regeneration of the electron transport molecule and the enzyme which catalyzes the reduction of the hydrocarbon compound form an enzyme having a plurality of reactive centers.
  • the system for regenerating the electron transport molecule is a multi-enzyme complex.
  • the system for regeneration of the electron transport molecule comprises a formate dehydrogenase and formate.
  • the nucleic acid sequence coding for the enzyme for the regeneration of the electron transport molecule is preferably cloned together with the nucleic acid sequence coding for the enzyme isolated from phototrophic organisms into an expression vector and is expressed together with the nucleic acid sequence coding for the enzyme isolated from phototrophic organisms in a host cell.
  • the nucleic acid sequence coding for the enzyme for the regeneration of the electron transport molecule and the nucleic acid sequence coding for the enzyme isolated from phototrophic organisms are cloned in different expression vectors.
  • the nucleic acid sequence coding for the enzyme for the regeneration of the electron transport molecule and the nucleic acid sequence coding for the enzyme isolated from phototrophic organisms are expressed in a host cell.
  • the nucleic acid sequence coding for the enzyme for regeneration of the electron transport molecule and the nucleic acid sequence coding for the enzyme isolated from phototrophic organisms are expressed separately and / or expressed in different host cells.
  • the electron transport molecule regeneration system comprises the regeneration of the electron transport molecule by an electron donating or electron donating agent.
  • the electron-donating element is a metal and the electron-donating substance is a metal compound.
  • the system for regeneration of the electron transport molecule comprises parts of an electrochemical arrangement.
  • the system for regeneration of the electron transport molecule comprises the regeneration of the electron transport molecule by electrolysis.
  • the system for regeneration of the electron transport molecule comprises the cathode of an electrochemical cell.
  • the invention is directed to a process for the preparation of a reduced hydrocarbon compound using an enzyme isolated from phototrophic organisms and an electron transport molecule and optionally a molecule or a system for regeneration of the electron transport molecule.
  • KR ketoacyl reductase
  • SDR short chain dehydrogenase / reductase
  • KR ketoacyl reductase
  • ACP acyl carrier protein
  • Polyketide synthases are also large enzyme complexes of up to 1700 kDa that produce non-ribosomally synthesized peptides.
  • FIG. 3 shows application examples for asymmetric syntheses of KR isolated from phototrophic organisms with non-natural substrates.
  • the isolated KR is also active without the acyl carrier protein (ACP) required for the physiological reaction.
  • ACP acyl carrier protein
  • the KR from heterotrophic organisms usually exhibits an R orientation (Ren et al., 2000) and is fixed to a specific fatty acid chain length with respect to the substrate, as has been demonstrated, for example, for E. coli (Taguchi et al., 1999).
  • isolated KR from phototrophic organisms preferentially catalyzes S-specific reactions and shows great variability in the size of the chain length.
  • Table 1 Examples of asymmetric syntheses according to the invention with KR product ee,% KR
  • Enantiomers of e.g. produce perfluorinated compounds. Substances of this kind are important starting substances for the drug expansion or new development of medicaments for the pharmaceutical industry. Many pharmaceuticals are effective only as S-enantiomers.
  • analgesic 2-arylpropionic acid derivatives such as e.g. Ibuprofen
  • S-enantiomers have an antiinflammatory effect by inhibiting the
  • FIG. 1 Example of a mycrocystin-forming polyketide synthase. KR equals one
  • Ketoacyl reductase The arrows mark points of attack of the reacting subunits (Dittmann et al., 2001).
  • FIG. 2 Bacterial fatty acid synthesis: Reaction 4 is catalyzed by the KR (Schujman & de Mendoza, 2005)
  • FIG. 3 Application examples for asymmetric syntheses of phototrophic KR with non-natural substrates.
  • Figure. 5 Diaphorase activities of the eluates of the last purification step.
  • SOD superoxide dismutase
  • Phy phycobilisome structural protein
  • KR 3-oxoacyl (ACP-carrier-protein) reductase.
  • FIG. 7 Hydrophathy diagram of KR, calculated according to the method of Kyte & Doolittle (1982).
  • FIG. 8 Restriction analysis of fabG.
  • Figure 9 Obtained FabG fragments separated on a 1% agarose gel electrophoresis.
  • FIG. 10 SDS-PAGE (15% polyacrylamide gel) of cell disruption before and after membrane extraction.
  • FIG. 11 Dependence of the enzymatic activity of the KR on the pH value and the buffer substance. Shown is the relative activity relative to the highest value of the measurement series in different 50 millimolar buffers: Na citrate O; MES ⁇ ; K-phosphate B; Tris / HCI ⁇ ; MOPS A; TRICIN O; HEPES O.
  • FIG. 12 Dependence of the enzymatic activity of KR on the concentration of MES buffer. Shown is the relative activity related to the highest value of the measurement series.
  • FIG. 13 Dependence of the enzymatic activity of KR on the temperature. Shown is the relative activity related to the highest value of the measurement series.
  • FIG. 14 Michaelis-Menten kinetics of the reduction of PFAP by the KR.
  • FIG. 15 Sequence alignment and consensus sequence of the amino acid sequence of the keto reductases from Synechococcus PCC 7942 (SEQ ID NO: 1) and Anabaena ATCC 29413 (SEQ ID NO: 2)
  • FIG. 16 DNA sequence of the keto-reductases from (A) Synechococcus PCC 7942 and (B) Anabaena ATCC 29413
  • On-concentrated cyanobacterial cells are diluted in a digestion buffer consisting of 50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA and 0.1 mM PMSF to a concentration of 0.1 g B ⁇ M / L.
  • a digestion buffer consisting of 50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA and 0.1 mM PMSF to a concentration of 0.1 g B ⁇ M / L.
  • the following is an enzymatic digestion of the cell wall by the addition of 1 mg / ml lysozyme from egg white, and incubation for two hours at 35 0 C and 60 rpm in a shake flask.
  • the cell disruption is carried out by means of ultrasound pulsed for 60 sec with 57% energy input with cooling.
  • the recovered cell homogenate is sedimented for 30 sec at 27500 X g at 4 0 C.
  • the supernatant can either be further processed directly or lyophilized.
  • a protein solution of 0.1 g / L is centrifuged in an ultracentrifugation for 1 hour at 100,000 X g to remove microsomes and small cell fragments. The supernatant is used for further purification
  • the chromatographic purification of the protein is carried out by means of a run in a gel filtration, followed by an ion exchanger and a new gel filtration.
  • the highly purified protein mixture thus obtained contains KR as the only dehydrogenase.
  • a HiLoad 26/60 Superdex 200 column from Amersham with an Amersham Gradi-Frac unit was used for the gel filtration.
  • This column has a separation range between 10-600 kDa and was operated with a buffer comprising 20 m M Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl and 1 mM EDTA.
  • the ion exchanger used is a DEAE-52 anion exchanger.
  • the sample obtained from the dialysis is sedimented for 30 min at 47800 X g and 4 0 C to remove aggregated protein.
  • the flow rate in this chromatography step remains constant at 0.5 mUmin with 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA.
  • the protein is applied, followed by two column volumes for washing the order. Elution is by means of a gradient of 0-3 M NaCl. Active eluate from the ion exchanger is combined and directly re-subjected to gel filtration as described.
  • the ketone reduction assay is the direct detection of the desired protein activity.
  • the diaphorase assay according to Nakajima et al. (2002) is a method for detecting a defined dye reduction for the ferrodoxin NADP + oxidoreductase, which is also caused by weak activity by the KR.
  • the SDS-PAGE serves to analyze the protein composition of the obtained eluate fractions.
  • This assay is a biotransformation, during which the reaction of the starting material pentafluoroacetophenone (PFAP) into the product S- Pentafluorophenyletha ⁇ ol (SPFE) takes place.
  • PFAP pentafluoroacetophenone
  • SPFE Pentafluorophenyletha ⁇ ol
  • the screw cap is applied and added, for example, through a rubber septum 0.2 ul PFAP.
  • the mixture is incubated overnight in a cold incubator at, for example, 20 0 C in the dark at 600 rpm for 24 h and then extracted.
  • the extraction was carried out by means of -20 ° C cold 500 .mu.l dry ethyl acetate with 36 mM acetophenone in, for example, a vibrating mill for 10 min at 30 Hz.
  • Acetophenone serves as an internal standard for gas chromatography.
  • the samples are then stored for 10 h at -20 0 C and then sedimented for 30 min at 16 0 C with 5000 X g.
  • 100 ⁇ l of the ethyl acetate phase are diluted, for example, in 400 ⁇ l of dry ethyl acetate
  • This analytical method detects the diaphorase activity of an enzyme such as KR.
  • composition of the protein samples obtained is examined by means of 15% SDS gels.
  • a P8DS electrophoresis chamber (OwI) is used which is operated with a tris-glycine rotiphoresis running buffer (Roth).
  • Roth tris-glycine rotiphoresis running buffer
  • 75 .mu.l of the respective protein sample were mixed with 25 .mu.l 4X Roti-load buffer (Roth) and boiled at 95 0 C for 5 min. The separation of the samples was carried out at 30 mA / gel over 70 min. All gels were then silver stained.
  • the identification of the isolated enzyme was carried out by means of a protein fingerprint.
  • a purified protein sample is separated by SDS-PAGE and the protein band to be analyzed is punched out after a collodial comassie staining.
  • the resulting sample is then tryptically digested and the resulting peptide fragments analyzed in a mass spectrometer.
  • the resulting peptide pattern is probed with all accessible protein databases, e.g. NCBI and Swiss-Prot, compared with the protein sequences stored there and identified the corresponding enzyme.
  • One of the identified protein sequences corresponds, for example, to the 3-ketoacyl reductase of Synechococcus PCC7942 (Table 2).
  • ketoacyl reductase fabG was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Restriction analysis revealed the cleavage sites shown in Figure 8 in the target gene. The following cloning strategies were used:
  • the resulting 750 bp amplificates are cut with the restriction enzymes EcoRI and Ndel.
  • the seven base pair overhangs serve to efficiently bind these enzymes to their target sequence.
  • the gene sequences thus generated are ligated into the expression plasmid pET21a (Novagen).
  • genomic DNA from cyanobacteria takes place, for example, according to a protocol by Wu et al. (2000) from 50 ml cyanobacteria culture. The following mix is used for the PCR:
  • the enzymatic reaction is started by means of a hot start, in which the polymerase is added only when the PCR mixture has reached 94 ° C.
  • the PCR is operated with the following operating parameters: Temperature Time [min] Temperature ramp
  • the PCR fragments obtained are subsequently purified, for example using a QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), and are available for further processing.
  • PCR fragments as well as the vector, are cut in separate reaction mixtures with the restriction enzymes EcoRI and Ndel.
  • Each reaction batch contains the following components:
  • Restriction enzymes is carried out by heating the sample to 60 0 C.
  • the PCR fragments are prepared for ligation.
  • the vector reaction is then desphosphorylated with 2 ⁇ l of alkaline phosphatase and the appropriate buffer in a volume of 70 ⁇ l at 37 ° C for 30 min in two rounds.
  • the removal of alkaline phosphatase was achieved by a purification step using the QIAquick PCR Purification Kit.
  • the reaction mixture comprises the following components:
  • the reaction is incubated at 4 ° C. for 8 hours.
  • the resulting construct is transformed by heat shock into E. coli XL-GOLD Ultrakompetente cells by DNA uptake. 45 ⁇ l of the cells are thawed on ice and mixed with 8 ⁇ l of ligation mixture and incubated on ice for 30 minutes. After a heat shock of 42 ° C for 60 sec, the cells are mixed with 1 ml of LB medium and incubated for 4 h at 37 ° C at 300 rpm in a sterile Eppendorf tube. The cells obtained are isolated by sedimentation and then taken up in 50 ⁇ l of fresh medium and plated on antibiotic, for example, ampicillin-containing LB solid medium.
  • the seeded solid medium plate is incubated for 12 h at 37 ° C. Selection of the FabG-carrying colonies is done by colony PCR.
  • a swab is run from each colony of the selection solid under sterile conditions into a PCR reaction vessel and a PCR is carried out.
  • the volume for the genomic DNA is replaced by water.
  • Positive (FabG-carrying) clones when separated on 1% agarose gel electrophoresis, show the amplified 750 bp FabG gene.
  • Positive clones are grown for plasmid amplification with antibiotic-containing, for example, ampicillin-containing medium to an optical density (660 nm) of 1 and the plasmids isolated according to the QIAquik Plasmid purification Kit.
  • the expression plasmids thus obtained can be used in any desired expression strain via transformation.
  • a freshly transformed expression strain such as E. coli BL21 (DE3) is transferred from the selection plate sterile into a 50 ml liquid culture (ampicillin LB medium with 10 g / L glucose).
  • the cultivation is carried out at 37 ° C in 1000 ml flask at 250 rpm until an optical density of 1 is reached.
  • the production of the enzyme for example ketoacyl reductase, is achieved by adding 50 ⁇ l of sterile-filtered 4 mM IPTG. 4 hours after induction, a sufficient amount of enzyme is produced to start biocatalysis.
  • Example 6 Localization of ketoacyl reductase from a phototrophic organism after overexpression in E. coli with the vector pET21a
  • the cultures were washed after harvest by centrifugation with potassium phosphate buffer, 100 mM pH 7.0.
  • the cell pellet was taken up in lysis buffer consisting of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 5% glycerol, 1 mM DTT and 1 mM PMSF using one milliliter of lysis buffer per gram of wet mass.
  • lysis buffer consisting of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 5% glycerol, 1 mM DTT and 1 mM PMSF using one milliliter of lysis buffer per gram of wet mass.
  • 300 ⁇ g / mL lysozyme the cells were digested for 4 h at 4 ° C.
  • DNase digestion with 2 U / mL DNase and 5 mM MgCl 2 at 4 ° C for 30 min
  • cell debris was sedimented by centrifugation at 45,000
  • ketoacyl reductase The majority of the isolated, cloned and expressed protein was in the membrane fraction after cell disruption (FIG. 10A).
  • the isolated enzyme, ketoacyl reductase could be solubilized by Triton X-100 from the membrane fraction. Both the soluble and the membrane-associated protein showed catalytic activity.
  • Example 7 Biochemical characterization of the isolated ketoacyl reductase from a phototrophic organism
  • the biochemical characterization is carried out, for example, with washed membrane fractions from cell disruptions of E. coli expressing the isolated enzyme heterologously by means of a pET21a vector.
  • a pH optimum for a ketoacyl reductase in the range of pH 4.0 to 10.0 was measured. Seven buffer systems were tested in the pH range, which is relevant due to the pKs value of the respective substance.
  • Figure 11 shows an optimum of ketone reduction by the isolated ketoacyl reductase from phototrophic organisms at pH 8.4.
  • ketoacyl reductase The influence of the ionic strength of a buffer on an isolated ketoacyl reductase was examined in a buffer concentration range between 25 mM and 100 mM.
  • the ketoacyl reductase showed optimal activity in a buffer concentration range between 37.5 mM and 87.5 mM. At buffer concentrations below or above this range, enzyme activity decreased (Figure 12).
  • the reaction temperature of the ketoacyl reductase was tested in a range between 20 and 40.4 0 C.
  • An optimal reaction temperature of the isolated ketoacyl reductase for the ketone reduction of 31, 4 0 C resulted ( Figure 13).
  • the quantification was carried out using the Perfect Protein Marker (10-225 kDa) from Novagen with concentrations of 0.1 to 0.25 g L "1 .
  • the specific activity of the membrane-associated ketoacyl reductase with PFAP as substrate is, for example, 1.2 U / mg protein.
  • the K M value for NADPH is 0.16 mM ( Figure 14).
  • a gene coding for the ketoacyl reductase for example Synechococcus PCC 7942 or ATCC 29413, was cloned into the vector pGEX-4T-1 via primers introduced into the interfaces EcoRI and Xhol in the vector cut with the corresponding restriction enzymes, as already described in Example 4.
  • the resulting plasmids contain the complete gene sequence of fabG from the respective phototrophic organism in an N-terminal fusion with a glutathione S-transferase (GST) affinity anchor encoded on the pGEX-4T-1 vector.
  • GST glutathione S-transferase
  • the plasmids were transformed into the E. coli strain BL21 tuner (DE3) of Novagen. Expression was analogous to E. coli strain JM 109 (DE3). Both proteins are active as fusion proteins in the gas chromatographic activity assay. In addition, the GST tag prevents association with the membrane of E. coli.

Abstract

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur stereo-selektiven Herstellung von reduzierten Kohlenwasserstoff-Verbindungen, insbesondere chiralen Alkoholen, aus oxidierten Kohlenwasserstoff-Verbindungen wie beispielsweise prochiralen Ketonen, mittels isolierter Enzyme, insbesondere Ketoacyl-Reduktase aus phototrophen Organismen gerichtet. Weiterhin ist die Erfindung auf ein isoliertes Enzym und / oder die Klonierung der für das Enzym kodierenden DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor und Expression des Enzyms in einer Wirtszelle gerichtet, sowie auf ein aus phototrophen Organismen isoliertes Enzym und eine Zusammensetzung, die ein solches Enzym umfasst, für die Herstellung von reduzierten Kohlenwasserstoff-Verbindungen.

Description

Biokatalysatoren und Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen
Die vorliegende Erfindung ist auf die stereo-selektive Herstellung von reduzierten Kohlenwasserstoff-Verbindungen, insbesondere chiralen Alkoholen, aus oxidierten Kohlenwasserstoff-Verbindungen wie beispielsweise prochiralen Ketonen, mittels isolierter Enzyme, insbesondere Ketoacyl-Reduktasen, aus phototrophen Organismen gerichtet.
Die im Stand der Technik bekannten Herstellungsverfahren von chiralen Alkoholen gliedern sich in asymmetrische Ketonreduktionen über chemische Synthesen oder enzymatische Synthesen mit isolierten Enzymen und ganzen Zellen.
Zur asymmetrischen Reduktion von Ketonen mittels chemischer Katalyse stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Hierzu gehören die direkte Hydrogenierung mit Wasserstoff und die Transferhydrogenierung, die beide von Übergangsmetallkomplexen katalysiert werden, als auch die boran-basierte Katalyse (WiIIs & Hannedouche, 2002).
In der chemischen Katalyse wurden zuletzt vor allem Prozesse mit Übergangsmetall- katalysierter Transferhydrogenierung entwickelt (WiIIs & Hannedouche, 2002 ; Rautenstrauch et al., 2003; Himeda et al., 2003). Gründe hierfür sind die zum Teil hohen Aktivitäten der Katalysatoren und die hohen erzielten Produkteinheiten. Es können Produkte mit 99% ee und 100% Ausbeute gewonnen werden (Okhuma et al., 2002).
Des Weiteren stehen unspezifische Reaktionen mit Racematen als Produkte zur Verfügung. In den überwiegenden Fällen müssen in Aufarbeitungsschritten, die der Synthese nachfolgen, die Produkte aufgereinigt werden, z. B. durch Umkristallisation oder Reaktion des gewünschten Enantiomers mit aggressiven Säuren (Ruske, 1970), um einen ausreichenden Enantiomerenüberschuss zu erlangen (Hage et al., 2001).
Für viele interessante Produkte ist somit die Biokatalyse mit enantiomeren-reinen Produkten geeigneter als die chemische Katalyse (Hage et al., 2001). Neben den ökonomischen Vorteilen bietet die so genannte weiße Biotechnologie viele ökologische Vorteile (EuropaBio, 2003). Die Kosten für die Herstellung von Enzymen und der benötigten Cofaktoren schränken dieses Herstellungsverfahren auf Substrate und Produkte mit sehr hoher Wertschöpfung ein. Des Weiteren entstehen hohe Ansprüche an den Reinheitsgrad des Reaktionsmediums, um Vergiftungen der Katalysatoren durch Schwermetalle und Zersetzung von Enzymen durch proteolytischen Abbau zu verhindern.
Eine Möglichkeit der Biokatalyse ist die Verwendung von Ganzzellkatalysatoren. Ein neuer Zugang zu Ganzzellbiokatalysatoren ist in der deutschen Patentanmeldung DE 102005021241.7 beschrieben. Hier werden phototrophe Mikroorganismen für die Ganzzeilbiokatalyse in Standard-Bioreaktoren eingesetzt.
Bei Verwendung von ganzen Zellen ist der proteolytische Abbau verhindert und eine Zugabe von teuren Cofaktoren kann entfallen, da Ganzzellbiokatalysatoren diese Cofaktoren natürlichweise enthalten. Die Cofaktorregenerierung kann in der Regel mit Hilfe eines Cosubstrates erfolgen. Damit können auch ganze Zellen zur asymmetrischen Ketonreduktion verwendet werden (Nakamura et al., 2003). Hierbei finden auch rekombinante Ganzzellbiokatalysesysteme Verwendung (Kataoka et al., 2003). Dies legt eine Verwendung von isolierten Enzymen nicht nahe, da hier eine Regeneration der Cofaktoren und die Stabilität des Enzyms nicht gewährleistet wäre.
Allgemein können die eingesetzten Zellen entweder abgetötet, ruhend oder wachsend appliziert werden. Der erste Fall erfolgt bei Zellen, bei denen schwermembrangängige Substanzen eingesetzt werden. Detergenzien finden hierbei zur Membranpermeabilisierung Anwendung.
In den übrigen Fällen sind die Zellen intakt. Dadurch sind die Enzyme im Inneren der Zellen besser geschützt und der Katalysator ist häufiger wiederverwendbar als bei abgetöteten Zellen. Der Metabolismus ruhender Zellen ist nicht aktiv, während wachsende Zellen die zur Verfügung stehen Nährstoffquellen metabolisieren. Derartige Zellen können sowohl in freier Suspension also auch in immobilisierter Form Anwendung finden. Das vorliegende Verfahren ermöglicht unter anderem eine mehrmalige Wiederverwendung isolierter Enzyme durch Regeneration von Katalysatorsystemen, insbesondere Cofaktoren, und bietet daher einen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik.
Bei Ganzzellkatalysen kann es jedoch auf Grund toxischer Effekte von Substraten und Produkten zu einer Inaktivierung des Biokatalysators kommen. Dies hat zur Folge, dass bei der Verwendung von Ganzzellkatalysatoren das Problem geringer Ausbeuten existiert. Des Weiteren kann es zu einer intrazellulären Akkumulation des Produktes kommen, was beispielsweise die Aufreinigung des Produkts erschwert und das Risiko der chemischen Modifikation des Produktes, z. B. durch intermolekulare Vernetzungsreaktionen erhöht. Daher ist es notwendig, einen geeigneten Organismus auszuwählen, der sowohl bezüglich des umzusetzenden Stoffsystems resistent ist, als auch ein Ausschleusen des Produktes ermöglicht. Durch das erfindungsgemäße Verfahren entfällt diese arbeitsintensive Suche nach geeigneten Organismen, die zudem häufig komplexe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen stellen.
Darüber hinaus umfasst eine Ganzzelle eine Vielfalt von Enzymen, die es u.U. schwierig macht, gezielt ein gewünschtes Endprodukt zu erreichen. Es besteht die Gefahr, dass das gewünschte Produkt weiter modifiziert oder gar abgebaut wird.
Aufgrund der hohen Sensibilität von Zellkulturen gegenüber Veränderungen im Kulturmedium, ist bei der Verwendung von Ganzzellkatalysen eine permanente Überwachung der Kulturbedingungen erforderlich. Dies ist nur mit aufwendigen und kostenintensiven Biokatalysator-Apparaturen zu gewährleisten. Suboptimale Kulturbedingungen haben eine erhöhte Rate an absterbenden Zellen zur Folge. Durch eine hohe Rate an absterbenden Zellen wird einerseits die Effektivität des Katalysators reduziert und andererseits auch Moleküle, wie z. B. Enzyme, in das Kulturmedium freigesetzt, die die Beschaffenheit des erwünschten Produkts verändern, so dass die Reinheit und Qualität des Produkts verschlechtert wird.
Die Verwendung von Ganzzellkatalysatoren ist weiterhin mit dem Nachteil verbunden, dass das Produkt aus einem Reaktionsansatz mit komplexer Zusammensetzung aufgereinigt werden muss. Zellen, Bestandteile abgestorbener Zellen, ausgeschiedene Stoffwechselprodukte und Bestandteile des Nährmediums müssen vom Produkt getrennt werden. Dies ist sehr zeit- und kostenaufwendig und es besteht die Gefahr, dass bei einer unvollständigen Aufreinigung toxische Stoffwechselprodukte im Endprodukt verbleiben und so die Sicherheit des Produkts gefährdet ist.
In einem technischen Prozess zur asymmetrischen Synthese muss eine ausreichende Reinheit des Produkts, beispielsweise aufgrund eines Enantiomeren-Überschusses, ein kosteneffizienter Biokatalysatoreinsatz in einem Standardreaktor und auch eine einfache Produktaufarbeitung gewährleistet werden. Hierzu ist die Verwendung isolierter Enzyme bzw. isolierter Enzyme, die überexprimiert werden, wie beispielsweise Oxidoreduktasen in Standardbiokatalysatoren vorteilhaft. Die chemische Synthese von derartigen Stereoisomer-reinen Molekülen ist meist nur unter sehr hohem Kostenaufwand und mit geringen Ausbeuten möglich. Eine Alternative ist der Einsatz von Enzymen, welche aufgrund ihrer natürlichen Eigenschaften nur ein gewünschtes Enantiomer produzieren oder bevorzugt produzieren. Der Gebrauch von Enzymen ist jedoch durch teure Herstellungsverfahren des Biokatalysators, also des Enzyms, als auch der benötigten Cofaktoren, beschränkt.
In Form von immobilisierten oder frei im Reaktionsmedium vorliegenden Enzymen werden asymmetrische Ketonreduktionen durchgeführt. Hierzu werden beispielsweise Alkoholdehydrogenasen (ADH) aus Wildtypstämmen oder heterolog exprimierte Isoenzyme eingesetzt (Hummel et al., 2003). Auch Nakamura et al. 2003 beschreibt den Einsatz von isolierten Dehydrogenasen aus heterotrophen Organismen zur asymmetrischen Ketonreduktionen.
Die Cofaktorversorgung erfolgt entweder über die Zugabe von NADPH / NADH oder über deren kostengünstigere oxdierte Form. Im letzteren Fall wird die notwendige Überführung der oxidierten Form des Cofaktors von der ADH selbst durch Oxidation eines Alkohols in sein korrespondierendes Keton oder durch ein zweites oxidierendes Enzym durchgeführt wie beispielsweise bei der Oxidation von Ameisensäure durch Formiatdehydrogenase (Seelbach et al., 1996).
Die Verwendung von zur Reduktion von oxidierten Kohlenwasserstoff-Verbindungen fähigen Enzymen aus heterotrophen Organismen ist jedoch mit einigen Nachteilen verbunden. So zeigt beispielsweise die Ketoacyl-Reduktase aus heterotrophen Organismen in der Regel eine R-Orientierung (Ren et al., 2000) und ist bezüglich des Substrats auf eine bestimmte Fettsäurenkettenlänge festgelegt, wie dies beispielsweise für E. coli gezeigt wurde (Taguchi et al., 1999).
Auch phototrophe Organismen, wie beispielsweise Cyanobakterien, verfügen über Enyzme, welche Kohlenwasserstoff- Verbindungen reduzieren (Dittmann et al., 2001), diese sind jedoch weitgehend unerforscht und deren Verwendung zur stereo-selektiven Herstellung von reduzierten Kohlenwasserstoff-Verbindungen ist bisher nicht beschrieben.
Ausgehend von dem zitierten Stand der Technik ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein kostengünstiges, effektives und dabei unter biotechnologischen Gesichtspunkten sicheres Verfahren zur Herstellung von Enantiomer-reinen reduzierten Kohlenwasserstoff- Verbindungen. Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 unter Verwendung von isolierten Enzymen aus phototrophen Organismen bzw. mittels einer Zusammensetzung nach Anspruch 16, die ein solches isoliertes Enzym umfasst. Die abhängigen Ansprüche sind auf besondere Ausführungsformen dieser Erfindung gerichtet.
Weitere Aufgaben sind die Bereitstellung eines isolierten Enzyms und / oder die Klonierung der für das Enzym kodierenden DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor und Expression des Enzyms in einer Wirtszelle. Diese Aufgaben werden durch die Ansprüche 15, 21 und 23 gelöst.
Phototrophe Organismen zeichnen sich durch einfache Handhabung aus, da sie meist geringe Ansprüche an ihre Umgebung, insbesondere das Kulturmedium, stellen und weisen oftmals geringe Reproduktionszeiten auf.
Enzyme aus phototrophen Organismen, insbesondere cyanobakterielle Enzyme sind für herkömmliche Biokatalysen weitgehend unerforscht. Es war bislang unbekannt, welches Enzym für asymmetrische Synthesen in phototrophen Organismen verantwortlich ist, da laut bisheriger Fachmeinung ein Einsatz von photoautotrophen Organismen zur asymmetrischen Synthese nur in speziellen Photobioreaktoren möglich ist und daher weitergehende Untersuchungen auf diesem Gebiet eingestellt wurden.
Mit isolierten Enzymen aus phototrophen Organismen erschließen sich bisher ungeahnte Möglichkeiten, die bislang nicht technisch genutzt werden. Isolierte Enzyme aus phototrophen Organismen weisen neue Synthesewege / Synthesepotentiale auf. Insbesondere ist vor allem die ausgeprägte S-Spezifität der asymmetrischen Reaktionen mit phototrophen Organismen von Bedeutung.
Allgemein bieten isolierte Enzyme aus phototrophen Organismen zahlreiche Vorteile. Da phototrophe Organismen geringere Anforderungen an die Zusammensetzung des Kulturmediums stellen als heterotrophe Organismen, lassen sich Enzyme aus phototrophen Organismen kostengünstiger erzeugen. Darüber hinaus lassen sich Enzyme aus phototrophen Organismen einfach isolieren und weisen eine überraschend hohe Stabilität und Aktivität auch außerhalb des Organismus auf. Die Enzyme phototropher Organismen sind bisher für die Produktion von Feinchemikalen weitgehend ungenutzt. Geringe Raum- Zeit-Ausbeuten aufgrund des Einsatzes von komplizierten Photobioreaktoren machen bisher eine industrielle Nutzung von Enzymen aus diesen Organismen unattraktiv. Mit beispielsweise einer isolierten KR aus phototrophen Organismen steht ein neuartiger Biokatalysator für asymmetrische Synthesen auch mit Substraten mit großen Seitenketten zur Verfügung. Die häufig ausgeprägte S-Spezifität im Falle einer isolierten Acyl-Reduktase aus phototrophen Organismen trifft aufgrund der weitgehenden R-Spezifität herkömmlich eingesetzter Enzyme eine Marktlücke.
Die erfindungsgemäßen Enzyme aus phototrophen Organismen, welche, wie beispielsweise die Ketoacyl-Reduktase (KR), die Reduktion von Kohlenwasserstoff-Verbindungen katalysieren, sind zur asymmetrischen Synthese von Substraten mit großen Seitenketten und hoher Enantiomer-Reinheit befähigt und zeichnen sich durch eine hohe Stabilität und Aktivität auch außerhalb der Zelle aus, weshalb sie zur Überexpression, zur rekombinanten Expression und zur Aufreinigung im hohen Maße geeignet sind.
Die Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Herstellung von reduzierten Kohlenwasserstoff-Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus einem phototrophen Organismus isoliertes Enzym die Reduktion einer oxidierten Kohlenwasserstoffverbindung katalysiert. Bevorzugt katalysiert das Enzym die Reduktion stereo-selektiv. Besonders bevorzugt ist die vom isolierten Enzym reduzierte oxidierte Kohlenstoffverbindung ein nicht natürliches Substrat des isolierten Enzyms, wie beispielsweise 2,3,4,5,6-Pentafluoracetophenon, Ethyl-4-chloracetoacetat, 4- Chloracetophenon, Ethylbenzoylacetat und andere.
Bevorzugte oxidierte Kohlenwasserstoffverbindungen sind Carbonyl-Verbindungen, wie beispielsweise Ketone, insbesondere bevorzugt prochirale Ketone. Bevorzugte reduzierte Kohlenwasserstoffverbindungen sind Hydroxy-Kohlenwasserstoffverbindungen. Besonders bevorzugte reduzierte Kohlenwasserstoffverbindungen sind Alkohole.
Weiterhin richtet sich die Erfindung auf ein aus einem phototrophen Organismus isoliertes Enzym zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie auf die Verwendung des Enzyms zur stereo-selektiven Herstellung einer reduzierten Kohlenwasserstoffverbindung.
Darüber hinaus richtet sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein aus einem phototrophen Organismus isoliertes Enzym und ein Elektronentransportmolekül umfasst sowie auf die Verwendung dieser Zusammensetzung zur stereo-selektiven Herstellung einer reduzierten Kohlenwasserstoffverbindung.
Das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym ist bevorzugt eine Short chain Dehydrogenase oder Reduktase (SDR). Das isolierte Enzym ist besonders bevorzugt eine Ketoacyl-Reduktase (EC 1.1.1.100), welche auch als 3-Oxoacyl (ACP) Reduktase, 3- Ketoacyl-(acyl-carrier protein)-Reduktase oder 3-Ketoacyl-(ACP)-Reduktase bezeichnet wird.
Bei der durch das aus phototrophen Organismen isolierte Enzym katalysierten Reduktion von Kohlenwasserstoffverbindungen entsteht bevorzugt eine chirale Kohlenwasserstoffverbindung. Ein aus einem phototrophen Organismus isoliertes Enzym ist bevorzugt stereo-spezifisch und katalysiert die Reduktion von oxidierten Kohlenwasserstoffverbindungen Stereomer-selektiv, besonders bevorzugt ist das isolierte Enzym enantio-spezifisch und katalysiert die Reduktion von oxidierten Kohlenwasserstoffverbindungen Enantiomer-selektiv. Bevorzugt ist die durch ein erfindungsgemäß isoliertes Enzym erzeugte reduzierte Kohlenwasserstoffverbindung ein R- oder ein S-Enantiomer. Dabei ist die reduzierte Kohlenwasserstoffverbindung bezüglich des reduzierten Kohlenstoffatoms ein R- oder S-Enantiomer. Alternativ zu der Bezeichnung mit den Präfixen „R" und „S" wird die optische Aktivität eines chiralen Zentrums auch mit den aus der Fischer-Projektion stammenden Präfixen „D" und „L" gekennzeichnet. Bevorzugt ensteht bei der durch das isolierte Enzym katalysierten Reduktion eine chirale Kohlenwasserstoffverbindung aus einer prochiralen Kohlenwasserstoffverbindung. Besonders bevorzugt entsteht ein chiraler Alkohol aus einem prochiralen Keton.
In einer alternativen Ausführungsform ist das isolierte Enzym Diastereomer-selektiv.
In einer alternativen Ausführungsform ist die chirale reduzierte Kohlenwasserstoffverbindung ein Zwischenprodukt, welches weiter zu einem chiralen Endprodukt umgewandelt wird. Bevorzugt ist das chirale Endprodukt ein chirales Amin. Besonders bevorzugt entsteht ein chiraler Alkohol aus einem prochiralen Keton, welcher zu einem chiralen Amin umgewandelt wird.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform ist die von der SDR katalysierte Reaktion die asymmetrische Reduktion einer C=C Doppelbindung. Abhängig davon welcher Rest zuvor an einem der Kohlenstoffatome der C=C Doppelbindung gebunden war, werden als Ergebnis dadurch bevorzugt chirale Organochlorverbindungen oder Nitro-olefine erhalten.
Der durch ein isoliertes Enzym aus phototrophen Organismen erzielbare Enantiomerenüberschuss beträgt 60 % - 70 %, bevorzugt 70 % - 80%, besonders bevorzugt 80 % - 90 % und insbesondere bevorzugt 90 % - 100 %. Des Weiteren ist der Enantiomerenüberschuss bevorzugt 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder 100%. Entsprechend ist der Anteil der R- oder S-Enantiomere des Produktes des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer reduzierten Kohlenwasserstoffverbindung 60 % - 70 %, bevorzugt 70 % - 80%, besonders bevorzugt 80 % - 90 % und insbesondere bevorzugt 90 % - 100 %. Des Weiteren ist der Anteil der R- oder S-Enantiomere des Produktes bevorzugt 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder 100%.
Der phototrophe Organismus, aus dem das Enzym zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert wird bzw. das in einer Zusammensetzung enthalten ist, ist bevorzugt ein phototropher Eukaryont oder ein phototropher Prokaryont. Alternativ ist der phototrophe Organismus ein phototropher Mikroorganismus. Besonders bevorzugte phototrophe Mikroorganismen sind phototrophe eukaryontische Mikroorganismen und phototrophe prokaryontische Mikroorganismen.
Bevorzugte phototrophe Eukaryonten sind Pflanzen, phototrophe Algen und phototrophe Organismen beispielsweise der Gattung Euglena. Weiterhin bevorzugte phototrophe Eukaryonten sind phototrophe Protozoen, wie beispielsweise Chlorella und Euglena. Erfindungsgemäß bevorzugte Pflanzen sind beispielsweise Pflanzen der Gattungen Brassica, Allium, Daucus, Arabidopsis, Carthamus, Cuphea, Hordeum, Persea, Spinacia, Zea, Plantago, Triticum, Nicotiana, Avena und Seeale, insbesondere sind bevorzugte Pflanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Brassica napus, Allium porrum, Daucus carota, Arabidopsis thaliana, Carthamus tinetorius, Cuphea lanceolata, Hordeum vulgäre, Persea americana, Spinacia oleracea, Physcomitrella patens, Zea mays, Plantago major, Triticum aestivum, Nicotiana tabacum, Avena sativa und Seeale cereale. Erfindungsgemäß bevorzugte phototrophe Algen sind beispielsweise Grünalgen (Chlorophyta), Rotalgen (Rhodophyta) und Goldbraune Algen (Chrysophyta). Bevorzugte Grünalgen gehören beispielsweise zur Gattung Ulva, Chlamydomonas, Volvox und Chlorella. Eine besonders bevorzugte Grünalge ist z.B. Chlamydomonas reinhardtii.
Bevorzugte phototrophe Prokaryonten sind beispielsweise Schwefelpupurbakterien, schwefelfreie Purpurbakterien, grüne Schwefelbakterien, grüne Nichtschwefelbakterien, phototrophe Archaea, Heliobakterien und Cyanobakterien. Ein besonders bevorzugtes grünes Nichtschwefelbakterium ist Chloroflexus aurantiacus J-10-fl. Bevorzugte Cyanobakterien, welche auch als Blaualgen bezeichnet werden, sind beispielsweise Cyanobakterien der Ordnungen Chroococcales, Gloeobacteria, Nostocales, Oscillatoriales, Pleurocapsales, Prochlorales, Stigonematales sowie Cyanobakterien der Gruppe der unklassifizierten Cyanobakterien. Besonders bevorzugte Cyanobakterien sind Cyanobakterien ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anabaena sp., Anabaena sp. PCC 7120, Anabaena variabilis, Anabaena variabilis ATCC 29413, Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus), Synechocystis sp., Synechocystis sp. PCC 6803, Synochocystis sp. CC9695, Synochocystis sp. WH8102, Crocosphaera watsonii, Trichodesmium erythaeum, Trichodesmium erythaeum IMS101 , Synechococcus sp., Synechococcus PCC6301, Synechococcus PCC 7942, Synechococcus sp. CC9902, Prochlorococcus marinus, Prochlorococcus marinus MIT 9313, Prochlorococcus marinus NATL2A, Gloeobacter violaceus, Lyngbya sp. PCC 8106, Nodularia spumigena CCY9414, Cyanothece sp. CCY0110, Nostoc punctiforme PCC 73102, Prochlorococcus marinus NATL1A.
Die Verwendung eines isolierten Enzyms aus einem phototrophen Organismus hat im Gegensatz zum Ganzzellkatalysator den Vorteil, dass aufgrund der Abwesenheit weiterer möglicher Reaktionspartner bereits eine vergleichsweise hohe Produktreinheit bei der
Katalyse erreicht werden kann. Demzufolge ist die Aufreinigung des Produkts aus dem
Reaktionsansatz erheblich erleichtert und das Problem der Verunreinigung des Produkts durch toxische oder anderweitig störende Zellstoffwechselprodukte verringert oder sogar eliminiert.
Ein aus einem phototrophen Organismus isoliertes Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Enzym, welches partiell oder vollständig von den Komponenten seines Expressionsortes getrennt, d. h. vollständig oder partiell aufgereinigt ist. Des Weiteren umfasst die Aminosäuresequenz des Enzyms die Aminosäuresequenz einer Short chain Dehydrogenase oder Reduktase (SDR) aus phototrophen Organismen oder weist Homologie zu der Sequenz einer short chain Dehydrogenase oder Reduktase (SDR) aus phototrophen Organismen auf. Die Konsensussequenz, die als solche oder in Abwandlung die Aminosäure-Sequenz aller SDRs aus phototrophen Organismen umfasst, ist in Figur 15 dargestellt und hat die mit „Konsensussequenz 1" bezeichnete Sequenz, wobei die Buchstaben nach dem „one-letter code" für die entsprechenden Aminosäuren stehen und X für alle Aminosäuren steht.
Konsensussequenz 1 LXXXXAXVTGASRGIGRAIALELAXXGAXVXVNYASSXXAADEWAXIXXAGGEAXAXXADV SQXXXVXXLXXXXIXXXXXXDXLVNNAGITRDTLLLRMKXXDWQXVXDLNLXGVFLCXRAXX KXMLKQRSGRIINIXSVXGXMGNPGQANYSAAKAGVIGXTKTVAKELASRGITVNAVAPGFIA TDMTSXLXXEXXLXXIPLGRYGXXXEXAGXVRFLAADPAAAYITGQVXNXDGGXVMA
X = alle Aminosäuren
Bevorzugt ist die Konsensussequenz der SDRs aus phototrophen Organismen die mit „Konsensussequenz 2" bezeichnete Sequenz, wobei die Buchstaben nach dem „one-letter code" für die entsprechenden Aminosäuren stehen und X für alle Aminosäuren, U für aliphatische Aminosäuren (Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin) und Z für geladene Aminosäuren (Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat, Glutamat) steht.
Konsensussequenz 2 LXXXXAUVTGASRGIGRAIALELAXXGAXVUVNYASSXXAADEWAXIXXAGGEAXAUXADV SQXXXVXXLXXXXIXXXXZUDULVNNAGITRDTLLLRMKXXDWQXVUDLNLXGVFLCXRAUX KXMLKQRSGRIINIXSVXGXMGNPGQANYSAAKAGVIGXTKTVAKELASRGITVNAVAPGFIA TDMTSXLXXEXULXXIPLGRYGXUXEUAGXVRFLAADPAAAYITGQVXNUDGGXVMA
X = alle Aminosäuren U = aliphatische Aminosäuren (Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin) Z = geladene Aminosäuren (Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat, Glutamat)
Besonders bevorzugt ist die Konsensussequenz der SDRs aus phototrophen Organismen die mit „Konsensussequenz 3" bezeichnete Sequenz, wobei die Buchstaben nach dem „one- letter code" für die entsprechenden Aminosäuren stehen und X für alle Aminosäuren, U für aliphatische Aminosäuren (Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin), Z für geladene Aminosäuren (Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat, Glutamat), α für polare, ungeladene Aminosäuren (Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Cystein) und ß für aromatische Aminosäuren (Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan) steht.
Konsensussequenz 3
Lα/ZU/Zα/ZUAUVTGASRGIGRAIALELAα/Uß/UGAα/ZVUVNYASSα/Uα/UAADEWAU/Zlα/U UAGGEAß/UAUα/ZADVSQU/Zα/Zα/ZVZα/ULß/UU/ZUUlZZßU/ZZUDULVNNAGITRDTLLLR MKU/ZZDWQα/UVUDLNLα/UGVFLCαRAUα/UKUMLKQRSGRIINIα/USVUGα/ZMGNPGQA NYSAAKAGVIGß/UTKTVAKELASRGITVNAVAPGFIATDMTSα/ZLU/Zα/UEU/ZULα/Zß/UIPL GRYGα/ZUU/ZEUAGUVRFLAADPAAAYlTGQVß/UNUDGGUVMA X = alle Aminosäuren
U = aliphatische Aminosäuren (Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin) Z = geladene Aminosäuren (Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat, Glutamat) α = polare, ungeladene Aminosäuren (Sehn, Threonin, Asparagin, Glutamin, Cystein) ß = aromatische Aminosäuren (Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan)
In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz des isolierten Enzyms die Aminosäuresequenz einer Ketoacyl-Reduktase aus einem phototrophen Organismus wie z.B. einem Cyanobakterium, bevorzugt Synechococcus PCC7942 (SEQ ID NO: 1) oder bevorzugt Anabaena ATCC 29413 (SEQ ID NO: 2), oder weist Homologie zu einer Ketoacyl-Reduktase aus einem phototrophen Organismus auf. Bevorzugte Aminosäuresequenzen von Ketoacyl-Reduktasen aus phototrophen Organismen, die von der Konsensussequenz umfasst werden, sind die in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen.
Bevorzugt beträgt die Sequenzhomologie, die auch als Sequenzidentität bezeichnet wird, des aus phototrophen Organismen isolierten Enzyms zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 10% - 30 %, bevorzugt 30% - 50%, besonders bevorzugt 50% - 70%, insbesondere bevorzugt 70% - 100%. Weiterhin beträgt die Homologie zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 bevorzugt 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% oder 100%.
Insbesondere werden von den beanspruchten Proteinsequenzen auch solche Sequenzen umfasst, die eine Homologie größer als 80 %, bevorzugt größer als 90 %, 91 %, 92 %, 93 % oder 94 %, besonders bevorzugt größer als 95 % oder 96 % und insbesondere besonders bevorzugt größer als 97 %, 98 % oder 99 % zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 aufweisen, sofern die Wirkungsweise bzw. der Zweck einer solchen Sequenz erhalten bleibt.
Die Erfindung umfasst neben den aus phototrophen Organismen isolierten Enzymen auch die für die aus phototrophen Organismen isolierten Enzyme bzw. für deren Aminosäuresequenz sowie für dazu homologe Aminosäure-Sequenzen kodierenden Nukleinsäuren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren werden auch als Nukleinsäure- Sequenzen bezeichnet und umfassen Nukleobasen. Bevorzugte Nukleinsäuren sind beispielsweise DNA und / oder RNA bzw. DNA- und / oder RNA-Sequenzen. Bevorzugte Nukleinsäuren sind für die Konsensussequenz kodierende Nukleinsäuren. Besonders bevorzugte Nukleinsäuren sind für die Konsensussequenz kodierende DNA- und / oder RNA-Sequenzen. Weiterhin bevorzugt sind Nukleinsäuren, die die für SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 kodierende Sequenz umfassen. Insbesondere bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für Amiπosäuresequenzen kodieren, welche zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 die bereits beschriebenen Homologien (Sequenzidentitäten) aufweisen. Auf jeden Fall sind mit dem Begriff Nukleinsäuren, welche für Aminosäuresequenzen kodieren, alle Sequenzen umfasst, die nach Maßgabe der Degeneration des genetischen Codes möglich erscheinen.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz umfasst bevorzugt die in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Sequenz, welche auch in Figur 16 abgebildet sind. Besonders bevorzugte DNA-Sequenzen sind Sequenzen die zu der in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Sequenz homolog sind. In Abwandlung beträgt die Homologie 10 - 99%, bevorzugt 20 - 90%, besonders bevorzugt 30 - 90%, insbesondere bevorzugt 40 - 90%, ganz besonders bevorzugt 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% oder 100% von SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4.
Der Ausdruck "Homologie" (oder Identität) wie hierin verwendet, ist durch die Gleichung H (%) = [1 - V/X] x 100 definiert, wobei H Homologie bedeutet, X die Gesamtzahl an Nukleobasen/Aminosäuren der Vergleichssequenz ist und V die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen/Aminosäuren der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist.
Bevorzugt wird das Enzym aus einem phototrophen Organismus, welcher eine Wildtypform ist, isoliert. Besonders bevorzugt wird das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym in einem phototrophen Organismus rekombinant exprimiert. Weiterhin besonders bevorzugt wird das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym in einem phototrophen Organismus überexprimiert. Insbesondere bevorzugt wird das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym in einem phototrophen Organismus heterolog, d. h. artfremd, exprimiert. Bevorzugte phototrophe Organismen, in welchen das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym exprimierbar ist, sind bereits aufgelistet, wobei auch die Expression in nicht-natürlichen Kultursystemen, wie z. B. Pflanzenzellsuspensionskulturen, pflanzlichen Kalluskulturen oder Moosprotonema-Kulturen möglich ist.
In einer alternativen Ausführungsform wird das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym in einem heterotrophen Organismus exprimiert. Bevorzugt wird das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym in einem Organismus exprimiert, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pilzen, Insektenzellen und Säugerzellen. Besonders bevorzugte heterotrophe Organismen zur Expression des aus einem phototrophen Organismus isolierten Enzyms sind Hefen, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Bakterien, wie z. B. Escherichia coli.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym in vitro exprimiert. Eine besonders bevorzugte Form der in vitro Expression ist die in vitro Translation.
In einer alternativen Ausführungsform ist das aus einem phototrophen Organismus in seiner Aminosäure-Sequenz abweichend von der Wildtyp-Sequenz verändert. Die Veränderungen der Aminosäure-Sequenz sind bevorzugt gerichtet auf Veränderung der Cofaktor-Spezifität, Veränderung der Substratspezifität, Verbesserung der spezifischen Aktivität, Verbesserung der Enzymstabilität, Verbesserung der Themostabilität, Verbesserung der Aktivierbarkeit durch Temperaturerhöhung, Verbesserung der Stabilität des Enzyms gegenüber veränderten Salzkonzentrationen und einem veränderten pH-Wert, Erhöhung der Resistenz gegenüber Säuren oder Laugen oder organischen Lösungsmitteln oder Veränderung der optimalen Reaktionstemperatur.
Die Aufreinigung des Enzyms kann durch die gängigen Techniken zur Proteinaufreinigung erfolgen. Bevorzugte Aufreinigungstechniken sind Ammoniumsulfat-Fällung, Gelfiltration, Affinitätschromatographie oder eine elektrophoretische Aufreinigung.
Um die Aufreinigung des Enzyms, z.B. durch Affinitätschromatographie, zu erleichtern, wird das Enzym durch rekombinante DNA-Technologien in geeigneter Weise modifiziert. Beispielsweise kann dem Enzym ein Affinitäts-Tag angefügt werden. Dieser Affinitäts-Tag besteht beispielsweise aus einem Peptid (His-Tag) oder einem anderen Molekül, wie z. B. GST-, Biotin- oder Streptavidin-Tag.
Bevorzugt wird das isolierte Enzym zu einem die oxidierte Kohlenwasserstoffverbindung enthaltenden Reaktionsansatz gegeben. In einer alternativen Ausführungsform wird das Enzym in den Reaktionsansatz vorgelegt und mit der oxidierten Kohlenwasserstoffverbindung versehen.
Bevorzugt werden Löslichkeitsvermittler für das Substrat verwendet. Weiterhin bevorzugt werden Temperaturveränderungen und der Einsatz von Mehrphasensystemen (flüssigflüssig oder fest-flüssig) zur Reaktionsbeschleunigung eingesetzt. Besonders bevorzugt wird das Substrat kontinuierlich zugegeben, um eine Substratüberschussinhibierung zu vermeiden und damit den Umsatz zu erhöhen.
In einer alternativen Ausführungsform werden geeignete organische Lösungsmitteln eingesetzt um die Konformation des Enzyms zu verändern und / oder den Umsatz zu erhöhen und / oder um das Substrat/Produkt-Spektrum zu verändern.
Bevorzugt werden durch die Wahl der Salzkonzentration und der Salzzusammensetzung oder durch Zugabe kompatibler Solute die proteinstabilisierenden Bedingungen erhöht.
Bevorzugt ist der Reaktionsansatz eine Lösung mit einem pH-Wert von 5 - 6, 6 -7, 7 - 8 oder 8 - 9. Besonders bevorzugt ist die Lösung gepuffert. Als Puffer wird bevorzugt Na-Citrat-, MES-, Kalium-Phosphat-, Tris/HCI-, MOPS-, TRICIN- oder HEPES-Puffer verwendet. Insbesondere bevorzugt ist die Lösung mit MES-Puffer in eine Konzentration von 20 - 30, 30 - 40, 40 - 50, 50 - 60, 60 - 70, 70 - 80, 80 - 90 oder 90 - 100 mM gepuffert. Die Reaktionstemperatur beträgt bevorzugt 20 - 25, besonders bevorzugt 25 - 30, insbesondere bevorzugt 30 - 35 oder 35 - 40 0C.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren eine Erhöhung der Reaktionstemperatur, bei Verwendung eines thermoaktivierbaren Enzyms.
Bevorzugte Expressionsvektoren sind Vektoren zur Expression in prokaryontischen Zellen und Vektoren zur Expression in eukaryontischen Zellen, sowie Vektoren zur in vitro Expression. Besonders bevorzugte Expressionsvektoren sind Plasmidvektoren und virale Expressionsvektoren. Die bevorzugten Plasmidvektoren eignen sich zur Expression in Prokaryonten oder Eukaryonten. Die viralen Expressionsvektoren sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus adenoviralen, adeno-assoziierten oder retroviralen Vektoren. Bevorzugt umfassen die Expressionsvektoren neben der für das erfindungsgemäße Enzym kodierenden DNA-Sequenz weitere funktionelle DNA-Sequenzen. Bevorzugte weitere funktionelle DNA-Sequenzen sind regulatorische Sequenzen, wie Promotor- und Enhancer- Sequenzen und/oder Antibiotika-Resistenzgene. Bevorzugt sind die Promotoren induzierbare Promotoren. Besonders bevorzugt sind die Promotoren mittels IPTG, Temperaturveränderungen oder Doxycyclin induzierbar.
Weiterhin richtet sich die Erfindung auf Wirtszellen, welche das aus phototrophen Bakterien isolierte Enzym exprimieren. Bevorzugt ist die erfindungsgemäße Wirtszelle eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle. Bevorzugte prokaryontische Zellen sind bakterielle Zellen. Bevorzugte eukaryontische Zellen sind Hefezellen, Säugerzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen.
Das isolierte Enzym ist entweder aus einem phototrophen Organismus isoliert und wird einem Ausgangsprodukt zugegeben, oder alternativ wird die für das Enzym kodierende Nukleinsäuresequenz in einen Vektor kloniert, der dann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet und exprimiert wird. Bei prokaryotischen Vektoren verbleibt isolierte Sequenz meist im Vektor, bei eukaryotischen Vektoren, wird die isolierte Sequenz häufig in das Genom integriert.
Bevorzugt wird eine Wirtszelle mit einem Expressionsvektor transformiert oder transfiziert. In einer Ausführungsform ist der Expressionsvektor nicht in das Genom der Wirtszelle integriert. In einer alternativen Ausführungsform ist der Expressionsvektor oder Teile davon in das Genom der Wirtszelle integriert. Bevorzugt ist die für das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym kodierende DNA-Sequenz in das Genom der Wirtszelle integriert. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer reduzierten Kohlenwasserstoffverbindung umfasst bevorzugt die Klonierung der für das aus einem phototrophen Organismus isolierte Enzym kodierenden DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, die Expression der Sequenz in einer Wirtszelle und die Aufreinigung des Enzyms. Insbesondere bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer reduzierten Kohlenwasserstoffverbindung die Integration der für das aus einem phototrophen Organismus isolierten Enzym kodierende DNA-Sequenz in ein Genom einer Wirtszelle, die Expression der Sequenz und die Aufreinigung des Enzyms.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung, welche ein isoliertes Enzym aus einem phototrophen Organismus und ein Elektronentransportmolekül umfasst, zur stereo-selektiven Herstellung von reduzierten Kohlenwasserstoffverbindungen verwendet. Bevorzugt ist das Elektronentransportmolekül ein natürliches Elektronentransportmolekül. Besonders bevorzugt ist das Elektronentransportmolekül ein Elektronendonator. Insbesondere bevorzugt ist das Elektronentransportmolekül ein Cofaktor, wobei Cofaktoren Coenzyme oder prosthethische Gruppen umfassen. Bevorzugt ist der Cofaktor NADH. Besonders bevorzugt ist der Cofaktor NADPH. In einer alternativen Ausführungsform ist das Elektronentransportmolekül ein nicht-natürliches Elektronentransportmolekül. Besonders bevorzugt ist das Elektronentransportmolekül ein nicht-natürlicher Elektroneπmediator.
Weiterhin bevorzugt umfasst die Zusammensetzung ein Molekül oder ein System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls. Bevorzugt ist das Molekül zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls ein Enzym. Besonders bevorzugt ist das Enzym zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls nicht mit dem die Reduktion der Kohlenwasserstoffverbindung katalysierenden Enzym identisch. Ein bevorzugtes Enzym zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls ist die Formiatdehydrogenase. In einer alternativen Ausführungsform ist das Enzym zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls mit dem die Reduktion der Kohlenwasserstoffverbindung katalysierenden Enzym identisch. In einer weiteren alternativen Ausführungsform ist das Molekül zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls mit dem die Reduktion der Kohlenwasserstoffverbindung katalysierenden Enzym kovalent verbunden. Bevorzugt bilden das Molekül zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls und das die Reduktion der Kohlenwasserstoffverbindung katalysierende Enzym ein Enzym mit mehreren reaktiven Zentren. Bevorzugt ist das System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls ein Multienzym-Komplex. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls eine Formiatdehydrogenase und Formiat. Die für das Enzym zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls kodierende Nukleinsäuresequenz ist bevorzugt zusammen mit der für das aus phototrophen Organismen isolierte Enzym kodierenden Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor kloniert und wird zusammen mit der für das aus phototrophen Organismen isolierte Enzym kodierenden Nukleinsäuresequenz in einer Wirtszelle exprimiert. In einer alternativen Ausführungsform sind die für das Enzym zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls kodierende Nukleinsäuresequenz und die für das aus phototrophen Organismen isolierte Enzym kodierende Nukleinsäuresequenz in unterschiedlichen Expressionsvektoren kloniert. Bevorzugt werden die für das Enzym zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls kodierende Nukleinsäuresequenz und die für das aus phototrophen Organismen isolierte Enzym kodierende Nukleinsäuresequenz in einer Wirtszelle exprimiert. Besonders bevorzugt werden die für das Enzym zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls kodierende Nukleinsäuresequenz und die für das aus phototrophen Organismen isolierte Enzym kodierende Nukleinsäuresequenz getrennt exprimiert und / oder in unterschiedlichen Wirtszellen exprimiert.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst das System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls die Regeneration des Elektronentransportmoleküls durch ein Elektronen-abgebendes Element oder einen Elektronen-abgebenden Stoff. Bevorzugt ist das Elektronen-abgebende Element ein Metall und der Elektronen-abgebende Stoff eine Metallverbindung. Besonders bevorzugt umfasst das System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls Teile einer elektrochemischen Anordnung. Insbesondere bevorzugt umfasst das System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls die Regeneration des Elektronentransportmoleküls durch Elektrolyse. Insbesondere besonders bevorzugt umfasst das System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls die Kathode einer elektrochemischen Zelle.
Weiterhin richtet sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer reduzierten Kohlenwasserstoff-Verbindung unter Verwendung eines aus phototrophen Organismen isolierten Enzyms und eines Elektronentransportmoleküls und optional eines Moleküls oder eines Systems zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls.
Als ein wichtiges Beispiel einer short chain Dehydrogenase / Reduktase (SDR) wurde in einer besonderen Ausführungsform eine Ketoacyl-Reduktase (KR) eines phototrophen Mikroorganismus aufgereinigt, identifiziert, kloniert und in einem klassischen Expressionssystem überexprimiert. Die KR ist ein wichtiges Enzym im Fettsäuresstoffwechsel von allen phototrophen Organismen. Die genaue Lage ist in der Fettsäuresynthase und der Polyketidsynthase. Die Fettsäuresynthase ist ein großer Proteinkomplex bestehend aus vielen Untereinheiten, die einzelne Schritte zur Verlängerung von Fettsäureketten durchführen. Vermittelt wird zwischen den einzelnen Reaktionen durch das Acyl-Carrier-Protein (ACP). Polyketidsynthasen sind ebenfalls große Enzymkomplexe von bis zu 1700 kDa, die nicht- ribosomal synthetisierte Peptide erzeugen.
Bei Studien in Cyanobakterien waren die meisten Untersuchungen auf die Aufklärung des natürlichen Mechanismus der Fettsäureverlängerung und Polyketidsynthasen beschränkt
(Dittmann et al., 2001; Stapleton & Jaworski 1984). Einige Gruppen befassten sich mit der
Nutzung der Fettsäuresynthase zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten (Steinbüchel &
Lütke-Eversloh, 2003). Den Polyketidsynthasen als Komplex wurde in den letzten Jahren aufgrund der biotechnologisch interessanten Produkte eine erweiterte Aufmerksamkeit zuteil, wobei die hier gebildeten Verbindungen sehr große Moleküle darstellen (Figur 1).
Die KR ist direkt an der Verlängerung von Fettsäuren und der Synthese von Polyketiden beteiligt. Einziger Cofaktor für diese Einschrittreaktion ist NADPH. Figur 2 zeigt die Reaktion der Fettsäuresynthase zusammen mit dem Reaktionsschritt der KR.
Die reduzierte KR aus phototrophen Organismen erlaubt die asymmetrische Synthese mit nicht natürlichen Substraten wie in Tabelle 1 gezeigt. Figur 3 zeigt Anwendungsbeispiele für asymmetrische Synthesen von aus phototrophen Organismen isolierten KR mit nicht natürlichen Substraten. Hierbei ist die isolierte KR erstaunlicherweise auch ohne das für die physiologische Reaktion erforderliche Acyl-Carrier-Protein (ACP) aktiv. Damit kann eine isolierte KR aus phototrophen Organismen direkt und ohne Zusatz von ACP zur asymmetrischen Synthese eingesetzt werden.
Die KR aus heterotrophen Organismen zeigt in der Regel eine R-Orientierung (Ren et al., 2000) und ist bezüglich des Substrats auf eine bestimmte Fettsäurenkettenlänge festgelegt, wie dies beispielsweise für E. coli gezeigt wurde (Taguchi et al., 1999). Im Gegensatz dazu katalysiert eine isolierte KR aus phototrophen Organismen bevorzugt S-spezifische Umsetzungen und zeigt eine große Variabilität bezüglich der Größe der Kettenlänge. Tabelle 1 : Beispiele für erfindungsgemäße asymmetrische Synthesen mit KR Produkt ee, % KR aus
(S)-pentafluoro(phenyl)ethanol > 99,8 Anabaena ^nabüis
ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate 96,7 Synechococcus
PCC7942
(S)-1-(4-chlorophenyl)-ethanol 99,0 Nostoc muscorum
(+)-ethyl (S)-3-hydroxy-3-phenylpropionate 99,0 Anabaena vahabilis
Mit konventionellen Enzymen, die nach dem Stand der Technik zur asymmetrischen Synthese von chiralen Verbindung verwendet werden, ist es nicht möglich, neue S-
Enantiomere von z.B. perfluorierten Verbindungen herzustellen. Derartige Stoffe stellen für die Wirkstofferweiterung bzw. Neuentwicklung von Medikamenten für die Pharmaindustrie wichtige Ausgangssubstanzen dar. Viele Pharmaka sind nur als S-Enantiomer wirksam.
Beispielsweise bei analgetisch wirkenden 2-Arylpropionsäurederivaten, wie z.B. Ibuprofen, wirken nahezu ausschließlich S-Enantiomere antiinflammatorisch durch Hemmung der
Prostaglandinsynthese.
Die Rentabilität richtet sich bei einem derartigen Prozess nach der Marktposition des Produktes, da hierzu ein in-vitro Cofaktorregenerierungssystem eingesetzt werden muss, um den verbrauchten Cofaktor (NADPH) zu regenerieren. Prinzipiell lassen sich auf diesem Wege höchst ungewöhnliche Produkte mit extrem großen Seitenketten erzeugen, bzw. direkte Modifikationen an einem fertigen Medikament durchführen.
Weiterhin ermöglicht die Überexpression einer isolierten KR aus phototrophen Organismen in einem rekombinanten Expressionssystem wie z.B. E. coli eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute mit hoher Wertschöpfung. Hohe KR-Proteinkonzentrationen sind aufgrund der Stabilität des Enzyms in einem rekombinanten Biokatalysator möglich.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele und die Figuren näher beschrieben. Als ein Beispiel wird die Aufreinigung einer KR sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Hydroxy-Kohlenwasserstoffen, ihre Überexpression und eine Charakterisierung des Enzyms gewählt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf dieses Beispiel begrenzt. Figuren- und Tabellenbeschreibung
Figur 1 : Beispiel einer mycrocystin bildender Polyketidsynthase. KR entspricht einer
Ketoacyl-Reductase. Die Pfeile markieren Angriffpunkte der reagierenden Untereinheiten (Dittmann et al., 2001).
Figur. 2: Bakterielle Fettsäuresynthese: Reaktion 4 wird durch die KR katalysiert (Schujman & de Mendoza, 2005)
Figur 3: Anwendungsbeispiele für asymmetrische Synthesen von phototrophen KR mit nicht natürlichen Substraten.
Figur 4: Gebildete Konzentrationen an S-Pentafluorphenylethanol durch 1 ml
Proteinlösung der entsprechenden Fraktion aus der Gelfiltration.
Figur. 5: Diaphoraseaktivitäten der Eluate der letzten Reinigungsstufe.
Figur 6. 15%-SDS-PAGE mit Silberfärbung der Fraktion 60. PGK: Phosphoglyceratkinase,
SOD: Superoxiddismutase, Phy: Phycobilisomenstrukturprotein, KR: 3-oxoacyl (ACP-carrier-protein) Reduktase.
Figur 7: Hydrophathie-Digramm der KR, berechnet nach der Methode von Kyte & Doolittle (1982).
Figur. 8: Restriktionsanalyse von fabG.
Figur 9: Erhaltene FabG-Fragmente aufgetrennt in einer 1% Agarosegelelektrophorese.
Figur 10: SDS-PAGE (15% Polyacrylamid-Gel) des Zellaufschlusses vor und nach der Membranextraktion. A: Bahnen: 1. Überstand des Zellaufschlusses 2. Pellet des
Zellaufschlusses 3. Roti®-Mark Standard; B: 1. Überstand des Zellaufschlusses nach Membranextraktion mit 2% Triton X-100; 2. Pellet des Zellaufschlusses nach
Membranextraktion mit 2% Triton X-100 . 3. Roti®-Mark Standard.
Figur 11 : Abhängigkeit der enzymatischen Aktivität der KR vom pH-Wert und der Puffersubstanz. Dargestellt ist die relative Aktivität bezogen auf den höchsten Wert der Messreihe in verschiedenen 50 millimolaren Puffern: Na-Citrat O; MES ▼ ; K-Phosphat B; Tris/HCI ^ ; MOPS A; TRICIN O; HEPES O. Figur 12: Abhängigkeit der enzymatischen Aktivität der KR von der Konzentration an MES- Puffer. Dargestellt ist die relative Aktivität bezogen auf den höchsten Wert der Messreihe.
Figur 13: Abhängigkeit der enzymatischen Aktivität der KR von der Temperatur. Dargestellt ist die relative Aktivität bezogen auf den höchsten Wert der Messreihe.
Figur 14: Michaelis-Menten-Kinetik der Reduktion von PFAP durch die KR.
Figur 15: Sequenz-Alignment und Konsensussequenz von der Aminosäuresequenz der Keto-Reduktasen aus Synechococcus PCC 7942 (SEQ ID NO: 1) und Anabaena ATCC 29413 (SEQ ID NO: 2)
Figur 16: DNA-Sequenz der Keto-Reduktasen aus (A) Synechococcus PCC 7942 und (B) Anabaena ATCC 29413
Beispiele
Beispiel 1: Aufreinigung einer KR aus phototrophen Mikroorganismen
Auf-konzentrierte cyanobakterielle Zellen werden in einem Aufschlusspuffer bestehend aus 50 mM Tris-HCL pH 8, 1 mM EDTA und 0,1 mM PMSF auf eine Konzentration von 0,1 gBτM/L verdünnt. Es folgt ein enzymatischer Verdau der Zellwand durch Zugabe von 1 mg/ml Lysozym aus Hühnereiweiss und einer Inkubation für zwei Stunden bei 350C und 60 Upm in einem Schüttelkolben. Der Zellaufschluss erfolgt mittels Ultraschall für 60 sec gepulst bei 57% Energieeinsatz unter Kühlung.
Zur Entfernung von unaufgeschlossenen Zellen und Zellbruchstücken wird das gewonnen Zellhomogenat für 30 sec bei 27500 X g bei 40C sedimentiert. Der Überstand kann entweder direkt weiter verarbeitet werden oder lyophilisiert werden.
Zur Aufreinigung des Proteins wird eine Proteinlösung von 0.1 g/L in einer Ultrazentrifugation für 1 Stunde bei 100 000 X g zentrifugiert zur Entfernung von Mikrosomen und kleinen Zellfragmenten. Der Überstand wird für die weitere Aufreinigung eingesetzt Die chromatographische Aufreinigung des Proteins erfolgt mittels eines Laufs in einer Gelfiltration, gefolgt von einem Ionenaustauscher und einer erneuten Gelfiltration. Das so erhaltene hoch aufgereinigte Proteingemisch enthält als einzige Dehydrogenase die KR.
Für die Gelfiltration wurde beispielsweise eine HiLoad 26/60 Superdex 200 Säule der Firma Amersham mit einer Amersham Gradi-Frac Einheit verwendet. Diese Säule besitzt einen Trennbereich zwischen 10-600 kDa und wurde mit einem Puffer umfassend 20 m M Tris - HCl pH 8, 200 mM NaCI und 1 mM EDTA betrieben.
5 ml Probenvolumen aus der Ultrazentrifugation wurden verdünnt, um eine Zielkonzentration von 10OmM Tris in der Probe zu erreichen. Mit einer Flussrate von 2ml/min wird die Proteinprobe aufgetrennt. Fraktionen mit KR-Aktivität wurden zusammengeführt und zum Pufferaustausch gegen 20 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM EDTA dialysiert.
Als lonentauscher dient ein DEAE-52 Anionentauscher. Die aus der Dialyse gewonnene Probe wird zur Entfernung von aggregiertem Protein für 30 min bei 47800 X g und 40C sedimentiert. Die Flussrate bei diesem Chromatographieschritt bleibt konstant 0,5 mUmin mit 20 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM EDTA. Nach einer Equilibrierung mit drei Säulenvolumina erfolgt der Proteinauftrag, dem zwei Säulenvolumina zum Waschen des Auftrages folgen. Die Elution erfolgt mittels eines Gradienten von 0-3 M NaCI. Aktives Eluat aus dem lonentauscher wird vereinigt und direkt erneut einer Gelfiltration wie beschrieben unterzogen.
Beispiel 2: Analyse der erhaltenen Proteinfraktion
Der Ketonreduktionsassay ist der direkte Nachweis der gesuchten Protei naktivität. Der Diaphoraseassay nach Nakajima et al. (2002) ist eine Methode zum Nachweis einer definierten Farbstoffreduktion für die Ferrodoxin-NADP+-Oxidoreduktase, die auch mit schwacher Aktivität durch die KR hervorgerufen wird. Die SDS-PAGE dient der Analyse der Proteinzusammensetzung der erhaltenen Eluatfraktionen.
Nachfolgend werden die drei beispielhaft genannten Analysenmethoden ausgeführt:
a) Gaschromatographischer Ketonreduktionsassay
Bei diesem Assay handelt es sich um eine Biotransformation, in deren Verlauf die Umsetzung des Edukts Pentafluoroacetopheπon (PFAP) zum Produkt S- Pentafluorophenylethaπol (SPFE) stattfindet. Hierzu werden folgende Komponenten in ein gasdichtes Probenfläschchen mit Schraubgewinde pipettiert.
900 μl Enzymprobe
50 μl 200 g/l Glucoselösung
50 μl 5 mM NADPH
Anschließend wird der Schraubdeckel aufgebracht und beispielsweise durch ein Gummiseptum 0,2 μl PFAP zugegeben. Der Ansatz wird über Nacht im Kühlbrutschrank bei beispielsweise 200C im Dunkeln mit 600 Upm für 24h inkubiert und anschließend extrahiert.
Die Extraktion erfolgte mittels -20°C kaltem 500 μl trockenem Ethylacetat mit 36 mM Acetophenon in beispielsweise einer Schwingmühle für 10 min bei 30 Hz. Acetophenon dient hierbei als interner Standard für die Gaschromatographie.
Die Proben werden anschließend 10h bei -200C gelagert und anschließend 30 min bei 160C mit 5000 X g sedimentiert.
100 μl der Ethylacetatphase werden zur Analyse beispielsweise in 400μl trockenem Ethylacetat verdünnt
b) Eine weitere Analysemethode zur Bestimmung der Proteinaktivität stellt der photometrische Farbassay mit DCPIP dar:
Mit dieser analytischen Methode wird die Diaphoraseaktivität eines Enzyms wie beispielsweise der KR festgestellt.
Dazu wird bei einer Wellenlänge von 620 nm die Extinktionsänderung in einer Küvette im
Verlauf der ersten 30 sec gemessen und anschließend die Aktivität in Units/gGeSamtprotein bestimmt.
Folgende Komponenten werden in einer 1 mL Küvette gemischt:
600 μL 50 mM Tris-HCI pH 8,0
250 μL 0,19 mM DCPIP
100 μL Enzymprobe 50 μL 0,5 mM NADPH
Die hierbei zugrunde liegende Reaktion ist NADPH + H+ + DCPIP → NADP+ + Leukodye
Die Zusammensetzung der erhaltenen Proteinproben wird mittels 15%igen SDS-Gelen untersucht. Verwendet wird hierbei eine P8DS Elektrophoresekammer (OwI) die mit einem Tris-Glycin Rotiphorese-Laufpuffer (Roth) betrieben wird. Zur Analyse wurden 75 μl der jeweiligen Proteinprobe mit 25 μl 4X Roti-Load-Puffer (Roth) versetzt und bei 950C für 5 min aufgekocht. Die Auftrennung der Proben erfolgte bei 30 mA/Gel über 70 min. Alle Gele wurden anschließend Silbergefärbt.
Die Identifikation des isolierten Enzyms, beispielsweise der Ketoacyl-Reduktase, erfolgte mittels eines Proteinfingerprints. Hierbei wird eine aufgereinigte Proteinprobe mittels SDS- PAGE aufgetrennt und die zu analysierende Proteinbande nach einer Kollodial- Comassiefärbung ausgestanzt. Die so erhaltene Probe wird anschließend tryptisch verdaut und die erhaltenen Peptidfragmente in einem Massespektrometer analysiert. Das so erhaltene Peptid-Muster wird mit allen zugänglichen Proteindatenbanken, z.B. NCBI und Swiss-Prot, mit den dort gespeicherten Proteinsequenzen verglichen und das entsprechende Enzym identifiziert.
Beispiel 3: Identifizierung einer Proteinsequenz
Eine der ermittelten Proteinsequenzen entspricht beispielsweise der 3-Ketoacyl-Reduktase von Synechococcus PCC7942 (Tabelle 2).
Tab. 2: Proteinsequenz der KR 1 mtalpltdri alvtgasrgi graialelaa agakvavnya ssagaadevv aaiaaaggea
61 favkadvsqe sevealfaav ierwgrldvl vnnagitrdt lllrmkrddw qsvldlnlgg 121 vflcsraaak imlkqrsgri iniasvvgem gnpgqanysa akagvigltk tvakelasrg 181 itvnavapgf iatdmtsela aekllevipl grygeaaeva gwrflaadp aaayitgqvi
241 nidgglvma
Ein Homologievergleich der Proteinsequenzen mittels Blast-Recherche zeigte eine große Anzahl ähnlicher Sequenzen vor allem bei phototrophen Organismen (Tabelle 3). Es ist daher ersichtlich, dass bei der Vielzahl angehöriger dieser Organismenklasse die isolierten Enzyme, insbesondere die Ketoacyl-Reduktase eine sehr ähnliche Funktion und Aktivität besitzen. Beispielsweise können die Enzymaktivitäten der Ketoacyl-Reduktase bei Verwendung natürlicher Substrate von über 180.000 U/mg Protein erreichen, wie sie beispielsweise bei Cuphea lanceolata gemessen wurden (64 % Sequenzhomologie mit der Ketoacyl-Reduktase aus Synechococcus PCC7942).
Tab. 3: Ergebnisse des Sequenzhomologievergleiches der Aminosäuresequenzen (nicht phototrophe Organismen: grau)
Stamm % Sequenzidentität
(gemäß BLAST-Algorithmus)
Anabaena sp. (strain PCC 7120) 75 Anabaena variabilis (strain ATCC 29413) 75
Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus BP-1) 7 A
Synechococcus sp. (strain WH8102) 73
Synechococcus sp. (strain CC9605) 73
Synechococcus sp. (strain CC9902) 72 Synechocystis sp. (strain PCC 6803) 71
Trichodesmium erythraeum IMS101 - - 69
Crocosphaera watsonii WH 8501 68
Prochlorococcus marinus (strain MIT 9313) 68
Gloeobacter violaceus PCC 7421 68 Chlamydomonas reinhardtii 66
Heliobacillus mobilis 65
Cuphea lanceolata 64
Geobacillus kaustophiius HTA462 64
Prochlorococcus marinus (strain NATL2A) 64 Prochlorococcus marinus (strain MIT 9211) 64
Chloroflexus aurantiacus J-10-fl 62
Beispiel 4: Klonierung und Überexpression eines isolierten Enzyms in E. coli
Die in-silico-Analyse (ExPASy ProtParam-Tool) der Aminosäuresequenz eines isolierten Enzyms, beispielsweise der Ketoacyl-Reduktase ergab, dass es sich bei diesem Enzym um ein stabiles Enzym handelt. Da die Ketoacyl-Reduktase als Bestandteil der Fettsäuresynthethase bzw. Polyketidsynthase membrangebunden vorliegt, war zu klären, ob das Protein rekombinant exprimiert werden könnte. Hierzu wurde eine Hydropathie-Analyse erstellt (Tabelle 4), um mögliche Transmembran-Anker zu identifizieren (Tabelle 5). Die Ergebnisse zeigen, dass es sich bei der Ketoacyl-Reduktase um ein lösliches Protein ohne Membrananker handelt. Alle Daten der unterschiedlichen in-silico-Hydrophathie-Tools der ExPASy-Site sind in den Tabellen 4 und 5 sowie Figur 7 dargestellt. Wie dem Hydropathie-Diagramm entnommen werden kann, gibt es entlang der gesamten Aminosäuresequenz keinen signifikanten Bereich der besonders hydrophob ist; hingegen einen Bereich bei Position 110 der ausgeprägt hydrophil ist. Somit ist die lösliche Expression der der Ketoacyl-Reduktase KR in allen etablierten Expressionssystemen möglich.
Das Zielgen der Ketoacyl-Reduktase fabG wurde mittels Polymerase Chain Reaction (PCR) amplifiziert. Eine Restiktionsanalyse ergab die in Figur 8 dargestellten Schnittstellen im Ziel- Gen. Folgende Klonierungsstrategien kamen zur Anwendung:
a) Forward Primer 5' Primer 3':
AGAGATCiIIIIgACTGCTUGGCCCCTAACCGAT TM 69.5
b) Backward Primer 5' Primer 3':
AGAGATCBHβl CIAGGCCATCACCAAGCC TM 69.5
Die so erhaltenen Amplifikate von 750 bp werden mit den Restriktionsenymen EcoRI und Ndel geschnitten. Die Überhänge von sieben Basenpaaren dienen hierbei der effizienten Bindung dieser Enzyme an ihre Zielsequenz. Die so erzeugten Gensequenzen werden in das Expressionsplasmid pET21a (Novagen) ligiert.
Tab. 4: Ergebnisse von HMTOP Vorhersage von Transmembraneinheiten und Topologie von Proteinen (Hυngarian Academy of Sciences)
Länge: 249 N-Terminus: IN
Anzahl von Transmembraneinheiten: 0 Gesamtentropie des Modells: 17.0070 Entropie der besten Anpassung: 17.0070 Best Anpassung: seq MTALPLTDRI ALVTGASRGI GRAIALELAA AGAKVAVNYA SSAGAADEW
50 pred Milium Mlllimi MIMIIMI
seq AAIAAAGGEA FAVKADVSQE SEVEALFAAV lERWGRLDVL VNNAGITRDT 100 pred seq LLLRMKRDDW QSVLDLNLGG VFLCSRAAAK IMLKQRSGRI INIASWGEM 150 p red
seq GNPGQANYSA AKAGVIGLTK TVAKELASRG ITVNAVAPGF lATDMTSELA 200 pred
seq AEKLLEVIPL GRYGEAAEVA GWRFLAADP AAAYITGQVI NIDGGLVMA 249 pred
G.E Tusnädy and I. Simon (1998) J. Mol. Biol. 283, 489-506. G.E Tusnady and I. Simon (2001) Bioinformatics 17, 849-850.
Tab. 5: Ergebnisse von SOSUI Vorhersage von Transmembranregionen (TUAT; Tokyo Univ. of Agriculture & Technology)
Gesamtlänge : 249 A. A.
Durchschnittliche Hydrophobizität: 0.456627
a) Amplifikation von fabG
Die Isolation von genomischer DNA aus Cyanobakterien erfolgt beispielsweise nach einem Protokoll von Wu et al. (2000) aus 50 ml Cyanobakterienkultur. Für die PCR wird folgender Mix eingesetzt:
5 μl 10X PCR Puffer
1 μl dNTM-Mix
1 μl genomische DNA
0,5 μl forward Primer
0,5 μl backward Primer
41,5 μl H2O Die enzymatische Reaktion wird mittels eines Hot-Start begonnen, bei dem die Polymerase erst zugegeben wird, wenn die PCR-Mixtur 94°C erreicht hat. Die PCR wird mit folgenden Betriebsparametern betrieben: Temperatur Zeit [min] Temperaturrampe
Figure imgf000028_0001
720C 5:00 4°C stopp
Die erhaltenen PCR-Fragmente (Figur 9) werden anschließend beispielsweise mit einem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und stehen der weiteren Bearbeitung zur Verfügung.
b) Restriktion der Vektor-DNA und der PCR-Fragmente
Die PCR-Fragmente, als auch der Vektor, werden in getrennten Reaktionsansätzen mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Ndel geschnitten. Jeder Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
2 μl Vector (0,5 μg/μl) 1 μl Ndel 1 μl EcoRI 5 μl 10X NEB-Puffer 4 43 μl H2O
oder
10 μl PCR-Produkt
1 μl Ndel
1 μl EcoRI
1 ,5 μl 10X NEB-Puffer 4
1 ,5 μl H2O
Beide Ansätze werden bei 370C für 3 Stunden inkubiert. Die Deaktivierung der
Restiktionsenzyme erfolgt durch Erhitzen der Probe auf 600C. Die PCR-Fragmente sind so vorbereitet für die Ligation. Der Vektor-Reaktionsansatz wird anschließend mit 2 μl alkalischer Phosphatase und dem entsprechenden Puffer in einem Volumen von 70 μl bei 37°C für 30 min in zwei Durchgängen desphosphoryliert. Die Entfernung der alkalischen Phosphatase wurde durch einen Reinigungsschritt mittels des QIAquick PCR Purification Kit erreicht.
c) Ligation des Expressionsvektors
Bitte das isolierte und restritierte PCR-Fragment wird mittels Ligase in korrekter Orientierung über die beiden unterschiedlichen Schnittstellen in die Multiple-cloning-site beispielsweise des pET21a Vektors eingebaut. Der Reaktionsansatz umfasst folgende Komponenten:
2 μl restrizierte Vektor-DNA von pet21a 1 μl restriziertes PCR-Produkt 0,5 μl Ligase
1 ,5 μl Ligase-Puffer 10 μl H2O.
Die Reaktion wird bei 40C für 8 Stunden inkubiert.
Beispiel 5: Transformation von kompetenten Zellen
Das erhaltene Konstrukt wird mittels DNA-Aufnahme durch Hitzeschock in E. coli XL-GOLD Ultrakompetente Zellen transformiert. 45 μl Der Zellen werden hierfür auf Eis aufgetaut und mit 8 μl Ligationsansatz versetzt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 42°C für 60 sec werden die Zellen mit 1 ml LB-Medium versetzt und für 4 h bei 37°C bei 300 Upm in einem sterilen Eppendorf-Reaktionsgefäß inkubiert. Die erhaltenen Zellen werden durch Sedimentation isoliert und anschließend in 50 μl frischem Medium aufgenommen und auf Antibiotikum beispielsweise Ampicillin-haltigem LB-Festmedium ausplattiert.
Zur Selektion von resistenten Plasmid-tragenden Stämmen wird die beimpfte Festmedienplatte für 12 h bei 37°C inkubiert. Eine Selektion der FabG-tragenden Kolonien erfolgt durch Kolonie-PCR.
Dazu wird von jeder Kolonie des Selektionsfestmediums unter sterilen Bedingungen ein Abstrich in ein PCR-Reaktionsgefäß durchgeführt und eine PCR erfolgt. Hierbei wird das Volumen für die genomische DNA durch Wasser ersetzt. Positive (FabG-tragende) Klone zeigen bei einer Auftrennung in einer 1% Agarose- Gelelektrophorese das amplifizierte FabG-Gen mit 750 bp Länge.
Positive Klone werden zur Plasmidvermehrung mit Antibiotikum-haltigem beispielsweise Ampicillin-haltigem Medium bis zu einer optischen Dichte (660 nm) von 1 angezogen und die Plasmide gemäß dem QIAquik Plasmid purification Kit isoliert. Die so gewonnen Expressioπsplasmide können in jedem gewünschten Expressionsstamm über Transformation eingesetzt werden.
Ein frisch transformierter Expressionsstamm wie E. coli BL21 (DE3) wird von der Selektionsplatte steril in eine 50 ml Flüssigkultur (Ampicillin-LB-Medium mit 10 g/L Glukose) überführt. Die Kultivierung erfolgt bei 37°C in 1000 ml Kolben bei 250 Upm bis ein optische Dichte von 1 erreicht wird. Die Produktion des Enzyms, beispielsweise der Ketoacyl- Reduktase, wird mittels Zugabe von 50 μl sterilfiltriertem 4 mM IPTG erreicht. 4 Stunden nach Induktion ist eine ausreichende Menge an Enzym gebildet, um eine Biokatalyse zu starten.
Beispiel 6: Lokalisation der Ketoacyl-Reduktase aus einem phototrophen Organismus nach Überexpression in E. coli mit dem Vektor pET21a
Die Kulturen wurden nach der Ernte durch Zentrifugation mit Kaliumphosphat-Puffer, 100 mM pH 7,0 gewaschen. Das Zellpellet wurde in Lysepuffer bestehend aus 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 5 % Glycerol, 1 mM DTT und 1 mM PMSF aufgenommen, wobei pro Gramm Feuchtmasse ein Milliliter Lysepuffer verwendet wurde. Nach der Zugabe von 300 μg/mL Lysozym, wurden die Zellen über 4 h bei 4°C aufgeschlossen. Nach einem DNase Verdau mit 2 U/mL DNase und 5 mM MgCI2 bei 4°C über 30 min, wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 45 000 X g und 4°C für 30 min sedimentiert.
Der größte Teil des isolierten, Monierten und exprimierten Proteins befand sich nach dem Zellaufschluss in der Membranfraktion (Figur 10 A). Das isolierte Enzym, die Ketoacyl- Reduktase, ließ sich durch Triton X-100 aus der Membranfraktion soubilisieren. Sowohl das lösliche als auch das membranassoziierte Protein zeigten katalytische Aktivität. Beispiel 7: Biochemische Charakterisierung der isolierten Ketoacyl-Reduktase aus einem phototrophen Organismus
Die biochemische Charakterisierung erfolgt beispielsweise mit gewaschenen Membranfraktionen von Zellaufschlüssen von E. coli, welche das isolierte Enzym heterolog mittels eines pET21a-Vektors exprimierten.
a) pH-Abhängigkeit der Ketonreduktion
Beispielsweise wurde ein pH-Optimum für eine Ketoacyl-Reduktase im Bereich von pH 4,0 bis 10,0 gemessen. Es wurden sieben Puffersysteme in dem pH-Bereich getestet, der aufgrund des pKs-Wertes der jeweiligen Substanz relevant ist. Figur 11 zeigt ein Optimum der Ketonreduktion durch die isolierte Ketoacyl-Reduktase aus phototrophen Organismen bei pH 8,4.
b) Einfluss der lonenstärke auf die Ketonreduktion
Der Einfluss der lonenstärke eines Puffers auf eine isolierte Ketoacyl-Reduktase wurde in einem Pufferkonzentrationsbereich zwischen 25 mM und 100 mM untersucht. Die Ketoacyl- Reduktase zeigte optimale Aktivität in einem Pufferkonzentrationsbereich zwischen 37,5 mM und 87,5 mM. Bei Pufferkonzentrationen unter oder über diesen Bereich, nahm die Enzymaktivität ab (Figur 12).
c) Temperaturabhängigkeit der Ketonreduktion
Die Reaktionstemperatur der Ketoacyl-Reduktase wurde in einem Bereich zwischen 20 und 40,40C getestet. Es ergab sich eine optimale Reaktionstemperatur der isolierten Ketoacyl- Reduktase für die Ketonreduktion von 31 ,40C (Figur 13).
Beispiel 8: Bestimmung der Enzymaktivität der membranassoziierten Ketoacyl- Reduktase
Das Substrat PFAP, das in einem 50 mM MES-Puffer bei pH 8,4 und 31 ,40C zu 1 ,4 mM löslich ist, wurde zu 150 mM eingesetzt. Die Konzentration von NADPH wurde im Bereich von 0,1 mM bis 1 mM variiert. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde durch die Bestimmung der Anfangsreaktions-geschwindigkeit im gaschromatographischen Assay ermittelt. Die Proteinkonzentration wurde densitometrisch mit dem Programm ImageJ der National Institutes of Health (NIH) bestimmt. Dabei erfolgte die Quantifizierung anhand des Perfect Protein Markers (10-225 kDa) der Firma Novagen mit Konzentrationen von 0,1 bis 0,25 g L"1.
Die spezifische Aktivität der membranassoziierten Ketoacyl-Reduktase mit PFAP als Substrat beträgt beispielsweise 1 ,2 U/mg Protein. Der KM-Wert für NADPH ergibt sich zu 0,16 mM (Figur 14).
Beispiel 9: Expression zweier Ketoacyl-Reduktasen mit GST-Affinitätsanker
Ein für die Ketoacyl-Reduktase codierendes Gen beispielsweise Synechococcus PCC 7942 oder ATCC 29413 wurde in den Vektor pGEX-4T-1 über durch die Primer eingeführten Schnittstellen EcoRI und Xhol in den mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnittenen Vektor kloniert, wie bereits bei Beispiel 4 beschrieben. Die resultierenden Plasmide enthalten die komplette Gensequenz von fabG aus dem jeweiligen phototrophen Organismus in einer N-terminalen Fusion mit einem Glutathion-S-Transferase-(GST)- Affinitätsanker, der auf dem pGEX-4T-1 Vektor codiert ist.
Für die heterologe Expression wurden die Plasmide in den E. coli Stamm BL21 Tuner (DE3) von Novagen transformiert. Die Expression erfolgte analog zum E. coli Stamm JM 109 (DE3). Beide Proteine sind als Fusionsproteine im gaschromatographischen Aktivitätsassay aktiv. Zudem verhindert das GST-Tag die Assoziation mit der Membran des E. coli.

Claims

ANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung einer reduzierten Kohlenwasserstoff-Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus einem phototrophen Organismus isoliertes Enzym die Reduktion einer oxidierten Kohlenwasserstoffverbindung, die ein nicht natürliches Substrat des isolierten Enzyms ist, stereo-selektiv katalysiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die stereo-selektive Katalyse enantiomeren-selektiv oder diastereomeren-selektiv ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der phototrophe Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem phototrophen Eukaryonten und einem phototrophen Prokaryonten.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der phototrophe Eukaryont ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Pflanze, einer Grünalge und einer Protozoe.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der phototrophe Prokaryont ein Cyanobakterium ist.
6 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enantiomerenüberschuss 60 % - 70 %, bevorzugt 70 % - 80%, besonders bevorzugt 80 % - 90 % und insbesondere bevorzugt 90 % - 100 % beträgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die oxidierte Kohlenwasserstoff-Verbindung eine Carbonyl- Kohlenwasserstoffverbindung ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die oxidierte Kohlenwasserstoff-Verbindung ein prochirales Keton ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die reduzierte Kohlenwasserstoff-Verbindung ein Alkohol ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die das isolierte Enzym codierende DNA in einen Expressionsvektor kloniert oder in einem Genom integriert ist und exprimiert wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym die Konsensussequenz 1 , Konsensussequenz 2 oder Konsensussequenz 3 umfasst.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Enzym eine short chain Dehydrogenase / Reduktase (SDR) ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die short chain dehydrogenase/reductase (SDR) eine Ketoacyl-Reduktase ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Sequenzhomologie zur SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 von 10% - 30%, bevorzugt 30% - 50%, besonders bevorzugt 50% - 70%, insbesondere bevorzugt 70% - 100% aufweist.
15. Enzym, aus einem phototrophen Organismus isoliert, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 eingesetzt wird.
16. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein isoliertes Enzym nach Anspruch 15 und ein Elektronentraπsportmolekül umfasst.
17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Molekül oder System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls umfasst.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Elektronentransportmolekül ein Cofaktor oder ein nicht-natürlicher Elektronenmediator ist.
19. Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül oder System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls ein Elektronentransportmolekül-regenerierendes Enzym ist oder umfasst oder das System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls Teile einer elektrochemischen Anordnung sind oder umfassen.
20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die für das isolierte Enzym und das Molekül oder System zur Regeneration des Elektronentransportmoleküls codierende DNA in einen Expressionsvektor kloniert ist oder in ein Genom integriert ist und exprimiert wird.
21. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 verwendet wird und ein Gen, welches für das isolierte Enzym codiert, umfasst.
22. Expressionsvektor nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass er ein Gen, welches für ein Molekül zur Regeneration eines Elektronentransportmoleküls codiert, umfasst.
23. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie den Expressionsvektor nach Anspruch 21 oder 22 umfasst.
24. Verwendung eines isolierten Enzyms nach Anspruch 15 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 20 zur stereo-selektiven Herstellung einer reduzierten Kohlenwasserstoff-Verbindung.
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EP0955375A2 (de) * 1998-05-08 1999-11-10 DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, Ltd. Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 4-Halo-3-hydoxybuttersaüre

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