EP1549744A1 - Verfahren sowie mikroorganismus zur herstellung von d-mannitol - Google Patents

Verfahren sowie mikroorganismus zur herstellung von d-mannitol

Info

Publication number
EP1549744A1
EP1549744A1 EP03757939A EP03757939A EP1549744A1 EP 1549744 A1 EP1549744 A1 EP 1549744A1 EP 03757939 A EP03757939 A EP 03757939A EP 03757939 A EP03757939 A EP 03757939A EP 1549744 A1 EP1549744 A1 EP 1549744A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
mannitol
microorganism
mdh
coding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03757939A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hermann Sahm
Björn KAUP
Stephanie Bringer-Meyer
Claudia Hemmerling
Martin Walter
Dieter Wullbrandt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BRINGER-MEYER, STEPHANIE
HEMMERLING, CLAUDIA
Innosweet GmbH
KAUP, BJOERN
Sahm Hermann
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
BRINGER MEYER STEPHANIE
Bringer-Meyer Stephanie
Kaup Bjorn
Sahm Hermann
Forschungszentrum Juelich GmbH
Nordzucker Innocenter GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BRINGER MEYER STEPHANIE, Bringer-Meyer Stephanie, Kaup Bjorn, Sahm Hermann, Forschungszentrum Juelich GmbH, Nordzucker Innocenter GmbH filed Critical BRINGER MEYER STEPHANIE
Publication of EP1549744A1 publication Critical patent/EP1549744A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Definitions

  • the invention relates to a method and a microorganism for the production of D-mannitol.
  • D-mannitol The worldwide annual demand for the sugar alcohol D-mannitol (D-mannitol) amounts to 30,000 tons per year.
  • D-mannitol is used in the food sector as a tooth-preserving sweetener, in medicine as a plasma expander and vasodilator (hexanitro derivative), and in the pharmaceutical industry for the production of tablets.
  • D-mannitol The large-scale production of D-mannitol has hitherto been carried out by catalytic hydrogenation on metal catalysts of glucose / fructose mixtures as starting materials. Due to the lack of stereospecificity of the catalytic hydrogenation, the yield of D-mannitol is only 25-30% with a triple excess of D-sorbitol (Makkee M, Kieboom APG, Van Bekkum H (1985), Production methods of D-mannitol. Starch / Thickness 37: 136-140).
  • D-mannitol and D-sorbitol differ only in their configuration at the carbon atom C-2 (stereoisomers), so that a separation of the unwanted sorbitol is difficult and time-consuming.
  • D-mannitol by enzymatic hydrogenation of D-fructose in a microbial biotransformation process in which a recombinant mannitol dehydrogenase (MDH) is isolated from Pseudomonas fluororescens and together with a formate dehydrogenase (FDH)
  • MDH mannitol dehydrogenase
  • Candida boidinü and NADH is incubated in a membrane reactor (Slatner, M. et al. (1998) Biotransf. 16: 351-363).
  • the use of formate dehydrogenase creates a reduction-oxidation cycle for NADH, which is retained by the membrane in the reaction vessel.
  • 70-90% of the fructose could be converted into D-mannitol.
  • the mannitol dehydrogenase used has a poor stability (50 h half-life; after stabilization with dithiothreitol: 100 h), sensitivity against high temperatures> 30 ° C and against shear forces.
  • Another major disadvantage is that membrane reactors are unsuitable for large-scale production due to the high cost of isolated enzymes, required cofactors and membranes.
  • D-mannitol production is offered by a fermentative process, where yields of approx. 85% using D-fructose / D-glucose mixtures as substrates and the heterofermentative lactic acid bacterium Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291 as a catalyzing organism in a fermentation with growing Cells were obtained (Soetaert (1991) Synthesis of D-mannitol and L-sorbose by microbial hydrogenation and dehydrogenation of monosaccharides. PhD Thesis, University of Gent)). The gene of the MDH from Leuconostoc pseudomesenteroides and its characterization is also known (J. Aarnikunnas et.
  • mannitol-2-dehydrogenases Three further mannitol-2-dehydrogenases are known from the literature and are also described with regard to their biochemical properties and nucleotide / amino acid sequences. This includes the mannitol ⁇
  • the object is achieved by a process for the production of D-mannitol by means of an organism expressing mannitol-2-dehydrogenase (MDH), the sugar substrates and / or sugar substrate precursors of the MDH being transported via a non-phosphorylating sugar transport system Organism are transported, solved.
  • MDH mannitol-2-dehydrogenase
  • the sugar to be reacted with the MDH can be converted directly to D-mannitol by the MDH without prior phosphorylation.
  • This direct implementation surprisingly enables improved yields and concentrations of the D-mannitol in the reaction supernatant compared to the prior art.
  • yields of up to 100% based on the substrate (glucose) are obtained with the process according to the invention.
  • concentrations of up to 40 g / L are achieved with the method according to the invention.
  • Organism means both unicellular and multicellular organisms, in particular microorganisms.
  • the object is also achieved by a microorganism which expresses the enzymes MDH according to sequence No. 2 and FDH according to sequence No. 3 for the microbial production of D-mannitol and a non-phosphorylating sugar.
  • Has transport system that transports the sugar substrates and / or sugar substrate precursors of the MDH into the microorganism.
  • D-mannitol is also to be understood below as D-mannitol.
  • nucleotide sequences that code for a formate dehydrogenase are summarized under the name "fcf j gene sequence”.
  • the enzyme formate dehydrogenase is summarized below under the name "FDH”.
  • nucleotide sequence is understood to mean all nucleotide sequences which (i) correspond exactly to the sequences shown; or (ii) comprise at least one nucleotide sequence that corresponds to the sequences shown within the range of degeneration of the genetic code; or (iii) comprises at least one nucleotide sequence which hybridizes with a nucleotide sequence which is complementary to the nucleotide sequence (i) or (ii), and optionally comprises (iiii) functionally neutral sense mutations in (i).
  • function-neutral meaning mutations means the exchange of chemically similar amino acids, such as. B. glycine by alanine or serine by threonine.
  • sequence regions preceding the coding regions are also included.
  • sequence regions with a regulatory function are included here. They can be used for transcription, RNA
  • regulatory sequences include promoters, enhancers, operators, terminators or translation enhancers.
  • the respective enzymes also include isoforms which are understood as enzymes with the same or comparable substrate and activity specificity, but which have a different primary structure.
  • modified forms are understood to mean enzymes in which there are changes in the sequence, for example at the N and / or C terminus of the polypeptide or in the region of conserved amino acids, but without impairing the function of the enzyme. These changes can be made in the form of amino acid exchanges using known methods.
  • the sugar transport system is the glucose facilitator (GLF) according to nucleotide sequence no. 1, which preferably consists of a eukaryote e.g. B. comes from a yeast.
  • German patent application 198 18 541.3 a method for producing substances from the aromatic metabolism is known, in which a microorganism is used which has an increased activity of a glucose-oxidizing enzyme and which oxidizes glucose or glucose-containing substrates Gluconolakton or gluconate and converted by phosphorylation of the gluconate to 6-phosphogluconate, whereby in addition to increasing the enzyme activity of the oxidase and / or the phosphatase to increase the amount of PEP present, the activity of a PEP-independent glucose transport protein is increased, which is can trade the Zymomonas mobilis glucose facilitator (GLF).
  • GLF Zymomonas mobilis glucose facilitator
  • the GLF can also transport glucose or xylose, of which glucose is particularly interesting as an inexpensive fructose precursor.
  • the Glucose as will be described, can be converted to fructose.
  • the sequence coding for MDH from microorganisms of the Lactobacteriaceae family, in particular Leuconostoc pseudomesenteroides, is particularly suitable for conversion to D-mannitol due to the high activity and stability of the MDH synthesized therefrom.
  • the organism preferably expresses sequence No. 2 coding for MDH.
  • Microorganisms from the genus Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterobacteriaceae or methylotrophic yeasts and fungi are particularly suitable as organisms. Furthermore, all microorganisms used in the food industry can also be used.
  • the organism used particularly preferably comes from the group Achromobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec. 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp., Paracoccus sp., Ancylobacter aquaticus, Maxcobacterium vaccae, Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp., Lactobacillus brevis, Glucentomoxides, Leuconostoc boidinii, Candida methylica or also Hansenula polymorpha, Aspergillus nidulans or Neurospora crassa or in particular Escherichia coli or Bacillus subtilis.
  • the analysis of the D-mannitol concentration can be carried out enzymatically / photometrically using the method of K. Horikoshi (Horikoshi K. (1963) Meth. Enzym. Analysis, 3rd ed. Vol. 6. HU Bergmeyer, ed., Verlag Chemie, Weinheim) , or by high pressure liquid chromatography (HPLC), as in Lindroth et al. (Lindroth et al. (1979) Analytical Chemistry 51: 1167-1174).
  • a sequence coding for formate dehydrogenase (FDH) can be used to establish an oxidation-reduction cycle.
  • FDH formate dehydrogenase
  • This preferably comes from Mycobacterium vaccae and has a nucleotide sequence according to sequence no. 3. This is seen in isolation from K. Soda et al, Appl. Microbiol. Biotechnol (1995) 44, 479-483. This enables a considerable increase in the yield or the conversion rate of the fructose to mannitol substrate by creating a cofactor regeneration system.
  • the substrate for the provision of the reduction equivalents necessary for the reduction of fructose to mannitol is no longer used, but is provided by a second enzyme system.
  • the coenzyme NADH is increasingly available for the conversion to mannitol.
  • One of the most commonly used systems is regeneration with a formate dehydrogenase, e.g. B. from Mycobacterium vaccae.
  • This enzyme together with any MDH, preferably from Leuconostoc pseudomesenteroides, creates an oxidation-reduction cycle in which formate acts as an electron donor and D-fructose acts as an electron acceptor.
  • the enzyme formate dehydrogenase catalyzes the oxidation of formate to CO 2 and the enzyme MDH the reduction of D-fructose to D-mannitol (see FIG. 1).
  • the intracellular nicotinic acid amide adenine dinucleotide (NAD) pool serves as an electron shuttle between the two enzymes.
  • the oxidation of formate to CO 2 is thermodynamically favorable, since the free standard formation energy ⁇ G 0 is clearly negative for CO 2 and the CO 2 is removed from the reaction equilibrium by outgassing.
  • the increased intracellular NADH concentration resulting, among other things, from formate oxidation, increases the reducing power for the reduction of D-fructose to D-mannitol, catalyzed by MDH.
  • D-glucose is used in addition to the carbon sources already mentioned as a substrate for the production.
  • D-glucose can be converted to D-fructose by conversion with the enzyme D-glucose / xylose isomerase (EC 5.3.1.5) (2).
  • the transformation is possible both inside and outside the organism.
  • D-glucose as a substrate in a process for the production of D-mannitol brings about a significant improvement in the economy of the process.
  • microorganisms suitable for the described method into which a formate dehydrogenase and an MDH are introduced and / or strengthened, but also microorganisms which already have a formate dehydrogenase or, if appropriate, an MDH, such as, for. B. Achromobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec. 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp., Paracoccus sp., Ancylobacter aquaticus.
  • microorganisms such as Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp., Lactobacillus brevis, Gluconobacter oxydans and preferably also Leuconostoc pseudomesenteroides or microorganisms that already have both enzymes and are each enhanced in their activity.
  • methylotrophic yeasts such as Candida boidinii, Candida methylica or also Hansenula polymorpha
  • fungi such as Aspergillus nidulans and Neurospora crassa and all microorganisms also used in the food industry.
  • the invention also includes the use of nucleotide sequences according to sequences Nos. 1, 2 and 3 coding for GLF, MDH and FDH for use in one of the microorganisms described above.
  • the invention also includes a gene structure containing at least one or more of the above nucleotide sequences.
  • a vector containing at least one or more of the above nucleotide sequences or one or more of the aforementioned gene structures is also included in the invention.
  • the invention also includes the use of the aforementioned nucleotide sequences, gene structures and vectors in the microorganisms described or microorganisms that contain these nucleotide sequences, gene structures and vectors.
  • Fig. 1 Oxidoreduction cycle with formate dehydrogenase and MDH schematically in a cell.
  • Fig. 2 Derivation of a degenerate 24 base oligonucleotide probe from the N-terminal amino acid sequence of the MDH subunit from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.
  • Sequence No. 1 shows the nucleotide sequence coding for GLF from Zymomonas mobilis.
  • Sequence No. 2 shows the nucleotide sequence coding for MDH from Leuconostoc pseudomesenteroides.
  • Sequence No. 3 shows the nucleotide sequence coding for FDH from Mycobacterium vaccae N10.
  • ATCC 12291 purification and characterization of the enzyme; Cloning and functional expression of the mdh gene in Escherichia coli
  • Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 was used as the source for the isolation of the MDH.
  • E. coli JM 109 (DE 3) (Promega) served as the host organism for the production of a partial plasmid bank for the isolation of the genomic DNA from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.
  • a part of the plasmid bank was genomically made by ligation of a 4.0 - 4.5 kb Eco Rl fragment DNA prepared from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 in pUC18.
  • E. coli JM109 (DE 3) was run at 170 rpm at 37 ° C in Luria-Bertani medium with the addition of ampicillin (100 ⁇ g / ml) or carbenicillin (50 ⁇ g / ml) cultured.
  • the enzyme activity is measured photometrically via the decrease in the NADH concentration for the reduction reaction D-fructose + NADH + H + -> D-mannitol + NAD + certainly.
  • the approach for measuring the activity of the MDH contained 200 ⁇ M NADH and 200 mM D-fructose in 100 mM potassium phosphate buffer at pH 6.5.
  • the specific activities of the crude extracts and the partially purified enzyme isolates are given as units per milligram of protein (U / mg), 1 U being defined as 1 ⁇ mol substrate decrease per minute.
  • a 2048-fold degenerate oligonucleotide probe for the detection of the mannitol-2-dehydrogenase gene on genomic DNA was derived from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 (see FIG. 2).
  • the 24 bp DNA probe was provided with a digoxigenin-11 dUTP tail at the 3 'end and was used for the immunoscreening of partial plasmid banks of genomic DNA from L. pseudomesenteroides ATCC 12291. 2 kb DNA fragment isolated (Fig. 3).
  • the mdh gene from this fragment was amplified with suitable primers, ligated into the vector pET24a (+) and transformed and expressed in E. coli BL21 (DE3).
  • Cell extracts from E. coli BL21 (DE3) pET24a (+) Lm ⁇ 77 showed a strong overexpression band at 43 kDa and specific activity of mannitol-2-dehydrogenase of 70 U / mg protein after induction in SDS polyacrylic electrophoresis, while the controls (cells without plasmid, cells with empty plasmid) showed no activity.
  • nucleotide sequence of the mdh gene from L. pseudomesenteroides ATCC 12291 is shown in Sequence No. 2.
  • the enzymes formate dehydrogenase (EC 1.2.1.2) and mannitol 2-dehydrogenase (EC 1.1.1.67) were overexpressed in a recombinant E. coli strain in order to establish an oxidation-reduction cycle in the cells.
  • hydrogen is transferred from formate via cellular NAD + to D-fructose, whereby D-fructose is reduced to D-mannitol (see FIG. 1).
  • the glucose facilitator was expressed in the cells in order to improve the availability of the substrate fructose.
  • the strains E. coli BL21 (DE3) Star (Invitrogen) were used.
  • the vectors used were pET-24a (+) fo , / 7 / md /?, Coding for the ORF of the formate Dehydrogenase from Mycobacterium vaccae, the mannitol-2-dehydrogenase from Leuconostoc pseudomesenteroides and coding for pZY507g / f for the glucose facilitator from Zymomonas mobilis.
  • E. coli BL21 (DE 3) star was co-transformed with pET-24a (+) f ⁇ n ⁇ 77 and pZY507g / f and selected on LB agar plates with 25 ⁇ g / ml chloramphenicol and 30 ⁇ g / ml kanamycin.
  • E. coli BL21 (DE 3) Star was transformed with either pET-24a (+) f ⁇ nc / 7 or pZY507g / f alone.
  • the transformants were selected on LB agar plates with either 25 ⁇ g / ml chloramphenicol (pZY507g / f) or with 50 ⁇ g / ml kanamycin (pET-24a (+) ft / ⁇ mcfh).
  • LB agar plates for E. coli BL21 (DE 3) Star transformed with p pET-24a (+) fcftVrr? O77 additionally contained 1% (v / v) D-glucose to reduce the basal expression of mannitol-2-dehydrogenase and the formate -Dehydrogenas.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie Organismus zur Herstellung von D-Mannitol. Durch Bereitstellung eines Verfahrens und eines Mikroorganismus zur Produktion von D-Mannitol mittels eines Mannitol-2-Dehydrogenase (MDH) und Formiat-Dehydrogenase (FDH, zur Cofaktor-Regenerierung) exprimierenden Organismus, wobei die Zucker-Substrate und/oder Zucker-Substratvorläufer der MDH über ein nicht-phosphorylierendes Zucker-Transportsystem in den Organismus transportiert werden, kann eine verbesserte D-Mannitol Produktion erreicht werden. Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Zucker-Transportsystem um den Glukosefacilitator (GLF) aus Zymomonas mobilis.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren sowie Mikroorganismus zur Herstellung von D-Mannitol
Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie einen Mikroorganismus zur Herstellung von D-Mannitol.
Der weltweite Jahresbedarf am Zuckeralkohol D-Mannitol (D-Mannit) beläuft sich auf 30.000 Tonnen im Jahr. D-Mannitol findet Verwendung im Lebensmittelbereich als zahnschonender Süßstoff, in der Medizin als Plasmaexpander und Va- sodilator (Hexanitroderivat), sowie in der pharmazeutischen Industrie zur Produktion von Tabletten.
Die großtechnische Produktion von D-Mannitol erfolgt bisher über die katalyti- sche Hydrierung an Metallkatalysatoren von Glucose/Fructose-Gemischen als Ausgangsmaterialien. Aufgrund der fehlenden Stereospezifität der katalytischen Hydrierung beträgt die Ausbeute an D-Mannitol nur 25-30% mit einem dreifachen Überschuß an D-Sorbitol (Makkee M, Kieboom APG, Van Bekkum H (1985), Production methods of D-mannitol. Starch/Stärke 37: 136-140).
D-Mannitol und D-Sorbitol unterscheiden sich nur durch ihre Konfiguration am Kohlenstoffatom C-2 (Stereoisomere), so dass eine Abtrennung des unerwünsch- ten Sorbitols mit Schwierigkeiten verbunden und aufwändig ist.
Eine Alternative bietet die Herstellung von D-Mannitol durch enzymatische Hydrierung von D-Fructose in einem mikrobiellen Biotransformationsverfahren, bei dem eine rekombinante Mannitol-Dehydrogenase (MDH) aus Pseudomonas fluo- rescens isoliert wird und zusammen mit einer Formiat-Dehydrogenase (FDH) aus
Candida boidinü und NADH in einem Membranreaktor inkubiert wird (Slatner, M. et al. (1998) Biotransf. 16: 351-363). Durch den Einsatz der Formiat- Dehydrogenase wird ein Reduktions-Oxidationszyklus für NADH geschaffen, welches durch die Membran im Reaktionsgefäß zurückgehalten wird. Dadurch konnten lediglich 70-90% der Fructose in D-Mannitol umgewandelt werden. Ferner besitzt die eingesetzte Mannitol-Dehydrogenase eine mangelnde Stabilität (50 h Halbwertszeit; nach Stabilisierung mit Dithiothreitol: 100h), Empfindlichkeit gegenüber hohen Temperaturen >30°C sowie gegenüber Scherkräften. Ein weiterer großer Nachteil liegt darin, dass Membranreaktoren auf Grund der hohen Kosten für isolierte Enzyme, benötigte Cofaktoren und Membranen für eine großtechnische Produktion ungeeignet sind.
Eine weitere Möglichkeit der D-Mannitol Produktion bietet ein fermentatives Verfahren, wobei Ausbeuten von ca. 85% unter Einsatz von D-Fructose/D-Glucose- Gemischen als Substrate und dem heterofermentativen Milchsäurebakterium Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291 als katalysierenden Organismus in einer Fermentation mit wachsenden Zellen erhalten wurden (Soetaert (1991) Synthesis of D-mannitol and L-sorbose by microbial hydrogenation and dehydro- genation of monosaccharides. PhD Thesis, University of Gent)). Das Gen der MDH aus Leuconostoc pseudomesenteroides und dessen Charakterisierung ist ebenfalls bekannt (J. Aarnikunnas et. al., Applied Microbiology and Biotechnolo- gy, 13. Juli 2002). Die hierbei für die Reduktion von Fructose zu D-Mannitol notwendigen Reduktionsäquivalente stammen aus der Oxidation von Glucose zu organischen Säuren. Neben dem Problem der nur 85%igen Umsetzung des Substrates Fructose zu D-Mannitol ist der Einsatz von D-Glucose nachteilig, da eine Kontamination des Zielproduktes mit organischen Säuren während der Fermen- tation auftritt und diese organischen Säuren durch aufwendige Prozeßschritte entfernt werden müssen. Bei Fermentationen mit wachsenden Zellen kann keine 100%ige Umsetzung des Substrates zum Produkt erzielt werden, da ein Teil des Substrates zum Zellaufbau bzw. zur Neubildung von Biomasse verbraucht wird. Zudem ist die Fermentation von Leuconostoc mesenteroides schwierig (Schleim- bildung) und teuer aufgrund der komplexen Medien und die Aufarbeitung des Überstandes daher ebenfalls aufwändig.
Aus der Literatur sind drei weitere Mannitol-2-Dehydrogenasen bekannt und auch hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften und Nukleotid- /Aminosäuresequenzen beschrieben. Hierzu gehört die Mannitol-¬
Dehydrogenase aus Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (Brünker P, Altenbuchner J, Mattes R (1998) Structure and function of the genes involved in mannitol, arabitol and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM 50106. Gene 206: 117-126.), aus Rhodobacter sphaeroides Si4 (Schneider KH, Giffhorn F, Kaplan S (1993) Cloning, nucleotide sequence and characterization of the mannitol dehydrogenase gene from Rhodobacter sphaeroides. J. Gen. Microbiology 139: 2475-2484) sowie aus Agaricus bisporus (Stoop JM, Mooibroeck H (1998) Cloning and characterization of NADP-mannitol dehydrogenase cDNA from the button mushroom Agaricus bisporus, and its expression in response to NaCI stress. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4689 - 4696.). Die beiden Erstgenannten gehören zur Gruppe der langkettigen De- hydrogenase/Reduktase Protein Familie (LDR), die letztgenannte zur Gruppe der kurzkettigen Dehydrogenase/Reduktase Protein Familie (SDR).
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von D-Mannitol bereitzustellen, das die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik vermeidet.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Produktion von D-Mannitol mittels ei- nes Mannitol-2-Dehydrogenase (MDH) exprimierenden Organismus, wobei die Zucker-Substrate und/oder Zucker-Substratvorläufer der MDH über ein nicht- phosphorylierendes Zucker-Transportsystem in den Organismus transportiert werden, gelöst.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erreicht, dass der mit der MDH um- zusetzende Zucker ohne eine vorherige Phosphorylierung direkt durch die MDH zu D-Mannitol umgesetzt werden kann. Durch diese direkte Umsetzung werden überraschenderweise gegenüber dem bisherigen Stand der Technik verbesserte Ausbeuten und Konzentrationen des D-Mannitol im Reaktionsüberstand ermöglicht. Teilweise werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren schon Ausbeuten von bis 100 % bezogen auf das Substrat (Glukose) erhalten. Ferner werden Konzentrationen bis zu 40 g/L mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt.
Unter Organismus werden sowohl ein - als auch mehrzellige Organismen, insbesondere Mikroorganismen verstanden.
Ferner wird die Aufgabe durch einen Mikroorganismus gelöst, der die Enzyme MDH gemäß Sequenz Nr. 2 und FDH gemäß Sequenz Nr. 3 zur mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol exprimiert und ein nicht-phosphorylierendes Zucker- Transportsystem aufweist, das die Zucker-Substrate und/oder Zucker- Substratvorläufer der MDH in den Mikroorganismus transportiert.
Unter der Bezeichnung D-Mannitol soll nachfolgend auch D-Mannit verstanden werden.
Im Rahmen dieser Erfindung werden alle Nukleotidsequenzen, die für eine Mannitol-Dehydrogenase codieren unter der Bezeichnung "mαft-Gensequenz" zusammengefasst. Das Enzym Mannitol-2-Dehydrogenase wird im Folgenden unter der Bezeichnung „MDH" zusammengefasst.
Entsprechend werden alle Nukleotidsequenzen, die für eine Formiat- Dehydrogenase codieren unter der Bezeichnung "fcf j-Gensequenz" zusammengefasst. Das Enzym Formiat-Dehydrogenase wird im Folgenden unter der Bezeichnung „FDH" zusammengefasst.
Auch werden alle Nukleotidsequenzen, die für einen Glukosefacilitator codieren unter der Bezeichnung "g/f-Gensequenz" zusammengefasst. Das Protein Glukosefacilitator wird im Folgenden unter der Bezeichnung „GLF" zusammengefasst.
Ferner werden unter Nukleotidsequenz alle Nukleotidsequenzen verstanden, die (i) exakt den dargestellten Sequenzen entsprechen; oder (ii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfaßen, die innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes den dargestellten Sequenzen entspricht; oder (iii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit einer zur Nukleotidsequenz (i) oder (ii) komplemetären Nukleotidsequenz hybridisiert, und gegebenenfalls (iiii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfasst. Dabei bedeutet der Begriff funktionsneutrale Sinnmutationen den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z. B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threonin.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'-oder upstream) und/oder nachfolgenden (3"-oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-
Stabilität oder das RNA Processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Te- minatoren oder Translationsverstärker.
Unter die jeweiligen Enzyme fallen auch Isoformen, die als Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität verstanden werden, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach bekannten Methoden vorgenommen werden.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Zucker-Transportsystem um den Glu- kosefacilitator (GLF) gemäß Nukleotidsequenz Nr. 1 , der bevorzugterweise aus einem Eukaryonten z. B. einer Hefe stammt. Bevorzugterweise kann auch der GLF aus Zymomonas mobilis eingesetzt werden, der von T. Conway et al (Journal of Bacteriology, Dec. 1990, p. 7227 - 7240) kloniert wurde.
Aus der Deutschen Patentanmeldung 198 18 541.3 ist zwar ein Verfahren zur Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel bekannt, bei dem ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der eine erhöhte Aktivität eines Gluko- se-oxidierenden Enzyms aufweist und Glukose oder Glukose-haltige Substrate durch Oxidation zu Glukonolakton oder Glukonat sowie durch Phosphorylierung des Glukonats zu 6-Phosphoglukonat umgesetzt, wobei neben der Erhöhung der Enzymaktivität der Oxidase und / oder der Phosphatase zur Erhöhung der vorhandenen Menge PEP die Aktivität eines PEP-unabhängigen Glukose- Transportproteins erhöht werden, bei dem es sich um den Glukosefacilitator (GLF) aus Zymomonas mobilis handeln kann. Ein Verfahren zur Herstellung von Mannitol ist allerdings daraus nicht zu entnehmen.
Der GLF kann neben Fructose auch Glukose oder Xylose transportieren, wovon insbesondere Glukose als preiswerter Fructose-Vorläufer interessant ist. Die Glukose kann, wie noch beschrieben werden wird, in Fructose umgewandelt werden.
Die für MDH codierende Sequenz aus Mikroorganismen der Familie der Lacto- bacteriaceae, insbesondere Leuconostoc pseudomesenteroides eignet sich be- sonders für die Umsetzung zu D-Mannitol aufgrund der hohen Aktivität und Stabilität der daraus synthetisierten MDH.
Bevorzugt exprimiert der Organismus die Sequenz Nr. 2 codierend für MDH.
Als Organismus eignen sich besonders Mikroorganismen aus der Gattung Bacil- lus, Pseudomonas, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen und Pilzen. Weiterhin können auch alle in der Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt stammt der eingesetze Organismus aus der Gruppe Ach- romobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec. 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacteri- um sp., Paracoccus sp., Ancylobacter aquaticus, Maxcobacterium vaccae, Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp., Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Gluco- nobacter oxydans, Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Aspergillus nidulans oder Neurospora crassa oder insbesondere Escherichia coli oder Bacillus subtilis.
Die Analyse der D-Mannitol-Konzentration kann enzymatisch / photometrisch nach der Methode von K. Horikoshi (Horikoshi K. (1963) Meth. Enzym. Analysis, 3rd ed. Vol.6. H. U. Bergmeyer, Hrsg., Verlag Chemie, Weinheim), oder durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Lindroth et al. (1979) Analytical Chemistry 51 : 1167-1174) beschrieben.
Zur Etablierung eines Oxidations-Reduktionszyklus kann eine Formiat- Dehydrogenase (FDH) codierende Sequenz eingesetzt werden. Vorzugsweise stammt diese aus Mycobacterium vaccae und besitzt eine Nukleotidsequenz gemäß Sequenz Nr. 3. Diese ist für sich gesehen aus K. Soda et al, Appl. Microbiol. Biotechnol (1995) 44, 479-483 bekannt. Hierdurch wird eine erhebliche Steigerung der Ausbeute bzw. der Umsatzrate des Substrates Fructose zu Mannitol durch Schaffung eines Cofaktor- Regenerationssystems ermöglicht. Dabei wird nicht mehr das Substrat für die Bereitstellung der für die Reduktion von Fructose zu Mannitol notwendigen Re- duktionsäquivalente verbraucht, sondern durch ein zweites Enzymsystem bereitgestellt. Folglich steht das Coenzym NADH in erhöhtem Maße für die Umsetzung zu Mannitol zur Verfügung. Eines der am häufigsten eingesetzten Systeme ist die Regenerierung mit einer Formiat-Dehydrogenase, z. B. aus Mycobacterium vaccae. Durch den Einsatz dieses Enzyms zusammen mit einer beliebigen MDH, bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroides, wird ein Oxidations- Reduktionszyklus geschaffen, in dem Formiat als Elektronendonator und D- Fructose als Elektronenakzeptor fungiert. Dabei katalysiert das Enzym Formiat- Dehydrogenase die Oxidation von Formiat zu CO2 und das Enzym MDH die Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol (s. Fig. 1). Der intrazelluläre Nicotinsäu- reamid-Adenin-Dinucleotid (NAD)-Pool dient als Elektronen-Shuttle zwischen beiden Enzymen. Die Oxidation von Formiat zu CO2 ist thermodynamisch günstig, da die freie Standardbildungsenergie ΔG0, für CO2 deutlich negativ ist und das CO2 durch Ausgasen aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt wird. Die erhöhte intrazelluläre NADH-Konzentration, resultierend u. a. aus der Formiatoxida- tion, steigert die Reduktionskraft für die Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol, katalysiert durch MDH.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird neben den bereits genannten Kohlenstoffquellen als Substrat für die Herstellung D-Glucose eingesetzt. D-Glucose kann durch Umwandlung mit dem Enzym D- Glucose/Xylose-Isomerase (EC 5.3.1.5) zu D-Fructose umgewandelt werden (2). Die Umwandlung ist sowohl innerhalb als auch außerhalb des Organismus möglich. Der Einsatz von D-Glucose als Substrat in einem Verfahren zur Produktion von D-Mannitol bewirkt eine deutliche Verbesserung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens. Für das beschπebene Verfahren eignen sich nicht nur Mikroorganismen, in die eine Formiat-Dehydrogenase und eine MDH eingebracht und/oder verstärkt wird, sondern auch Mikroorganismen, die bereits über eine Formiat-Dehydrogenase oder gegebenenfalls eine MDH verfügen, wie z. B. Achromobacter parvolus, Me- thylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec. 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp., Paracoccus sp., Ancylobacter aquaticus. Dazu gehören Mikroorganismen wie z.B. Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp., Lactobacillus brevis, Gluconobacter oxydans sowie bevorzugt auch Leuconostoc pseudomesenteroides oder Mikroorganismen, die bereits über bei- de Enzyme verfügen und jeweils in ihrer Aktivität verstärkt werden. Weiterhin geeignet sind beispielsweise auch methylotrophe Hefen wie Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Pilze wie Aspergillus nidu- lans und Neurospora crassa sowie alle auch in der Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem Mikroorganismus ist es nunmehr möglich, eine verbesserte Umsetzung des Substrates in das Produkt D- Mannitol zu erreichen. Es wird gegenüber bisher bekannten Verfahren eine erhöhte Produktivität, sowie eine erhöhte Ausbeute (bis zu 100 %) an D-Mannitol erreicht. Es wurden schon Konzentrationen bis zu 40 g/L erzielt. Das Verfahren ist daher für eine großtechnisch rentable Herstellung von D-Mannitol besonders geeignet. Durch die Schaffung des Regenerationssystems mit Hilfe der Formiat- Dehydrogenase kann für die NADH verbrauchende MDH in erhöhtem Maße ohne eine nachteilige Bildung von stoffwechselbedingten Nebenprodukten mit ruhen- den Zellen eine erhöhte Umsetzung des Substrates in das Produkt D-Mannitol ermöglicht werden.
Unter die Erfindung fallen auch die Verwendung von Nukleotidsequenzen gemäß Sequenzen Nr. 1 , 2 und 3 codierend für GLF, MDH und FDH zur Verwendung in einem der oben beschriebenen Mikroorganismen.
Ebenso umfasst die Erfindung eine Genstruktur enthaltend mindestens eine oder mehrere der obigen Nukleotidsequenzen.
Ein Vektor enthaltend mindestens eine oder mehrere der obigen Nukleotidsequenzen oder eine oder mehrere der vorgenannten Genstrukturen ist ebenfalls in der Erfindung enthalten.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der vorgenannten Nukleotidsequenzen, Genstrukturen und Vektoren in den beschriebenen Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen, die diese Nukleotidsequenzen, Genstrukturen und Vektoren enthalten.
Die Zeichnungen zeigen beispielhaft Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfah- rens sowie eine schematische Darstellung der wichtigsten Stoffwechselwege, die für das Verfahren eine Rolle spielen. Es zeigt:
Fig. 1 : Oxidoreduktionszyklus mit Formiat-Dehydrogenase und MDH schematisch in einer Zelle. Fig. 2: Ableitung einer degenerierten 24 Basen-Oligonukleotid-Sonde von der N-terminalen Aminosäuresequenz der MDH Untereinheit von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.
Fig. 3: Genkarte des 4,191 bp Eco Rl Fragments isoliert aus der genomischen DNA-Plasmidbank von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 nach Immuno-Screeening des mdh-Gens. Die Pfeile zeigen die Richtung der Translation des mdh ORF sowie 4 ORFs an.
Sequenz Nr. 1 zeigt die Nukleotidsequenz codierend für GLF aus Zymomonas mobilis. Sequenz Nr. 2 zeigt die Nukleotidsequenz codierend für MDH aus Leuconostoc pseudomesenteroides.
Sequenz Nr. 3 zeigt die Nukleotidsequenz codierend für FDH aus Mycobacterium vaccae N10.
Im Folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden.
I) Mannitol-2-Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides
ATCC 12291: Reinigung und Charakterisierung des Enzyms; Klonie- rung und funktioneile Expression des mdh-Gens in Escherichia coli
a) Bakterienstämme und Plasmide
Als Quelle für die Isolierung der MDH wurde Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 eingesetzt. E. coli JM 109 (DE 3) (Promega) diente als Wirtsorganismus zur Herstellung einer partiellen Plasmidbank für die Isolierung der geno- mischen DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291. Ein Teil der Plasmidbank wurde durch Ligation eines 4.0 - 4.5 kb Eco Rl Fragments genomischer DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 in pUC18 hergestellt.
b) Kultivierungsbedingungen
Zur Kultivierung von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 wurde folgendes Kultivierungsmedium verwendet:
Trypton 10 g/l, Hefeextrakt 10 g/l, K2HPO4 10 g/l, D-Fructose 20 g/l, D-Glucose 10 g/l, Vitamin / Mineral-Lösung 10 ml/l, in destilliertem Wasser; pH-Wert auf 7,5 unter Verwendung von Ortho-Phosphorsäure.
Zur Subklonierung und Präparation der Plasmidbank der genomischen Leuconostoc DNA, wurde E. coli JM109(DE 3) mit 170 Upm bei 37°C in Luria-Bertani Medium unter Zusatz von Ampicillin (100 μg/ml) oder Carbenicillin (50 μg/ml) kultiviert.
c) Bestimmung der Aktivität von MDH aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291
Die Enzymaktivität wird in der vorliegenden Erfindung photometrisch über die Abnahme der NADH-Konzentration für die Reduktionsreaktion D-Fructose + NADH + H+ -> D-Mannitol + NAD+ bestimmt. Der Ansatz zur Messung der Aktivität der MDH enthielt 200 μM NADH und 200 mM D-Fructose in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer bei pH 6,5. Die spezifischen Aktivitäten der Rohextrakte und der partiell gereinigten Enzymisolate werden als Units pro Milligramm Protein (U/mg) angegeben, wobei 1 U als 1 μmol Substratabnahme pro Minute definiert wird.
d) Bestimmung der Proteinkonzentrationen
Alle Proteinkonzentrationsbestimmungen wurden nach der Methode von Bradford durchgeführt.
e) Auftrennung von Proteinen mittels Polyacrylamidgelelektrophorese
Reinheitsanalysen von Rohextrakten und partiell gereinigten Enzymisolaten, sowie Präparationen vorbereitend auf Western-Blots wurden elektrophoretisch in diskontinuierlichen 12 %igen SDS-Polyacrylamidgelen durchgeführt nach der Methode von Lämmli.
f) Isolierung der Mannitol-2-Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291
Zur Isolierung der Mannitol-2-Dehydrogenase wurden nach einem Zellaufschluß folgende Verfahrensschritte durchgeführt: Ammoniumsulfat-Präzipitation, Hydrophobe Interaktionschromatographie, Anionentauscherchromatographie I, Anio- nentauscherchromatographie II, Größenausschlusschromatographie, sowie ein Chromato-focusing pH 5 - 4.
Die spezifische Aktivität der MDH betrug bei pH = 5,35 für die Reduktion von D- Fructose zu D-Mannitol 450 U/mg
g) Molekulargenetische Methoden
Die Isolierung von genomischer DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291, die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, die Mar- kierung von DNA-Sonden mit Digoxigenin modifiziertem dUTP und immunologische Detektion und DNA-DNA-Hybridisierung (Southern Blot) wurden durchgeführt. Die aminoterminale Ansequenzierung der 43 kDa-Enzymuntereinheit mittels Ed- man-Abbau und anschließender HPLC-Analyse ergab die oktamere Aminosäureabfolge MEALVLTG. Unter Verwendung einer Codon usage-Statistik für Leuconostoc pseudomesenteroides, wurde eine 2048fach degenerierte Oligonukleo- tid-Sonde zur Detektion des Mannitol-2-Dehydrogenase-Gens an genomischer DNA von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 abgeleitet (siehe Fig. 2). Die 24 bp-DNA-Sonde wurde mit einem Digoxigenin-11-dUTP-Schwanz am 3'-Ende versehen und diente zum Immuno-Screening von partiellen Plasmidban- ken genomischer DNA von L. pseudomesenteroides ATCC 12291. Auf diesem Wege wurde ein 4,2 kb-DNA-Fragment isoliert (Fig. 3). Mit geeigneten Primern wurde das mdh-Gen von diesem Fragment amplifiziert, in den Vektor pET24a(+) ligiert und in E. coli BL21(DE3) transformiert und exprimiert. Zellextrakte von E. coli BL21(DE3)pET24a(+)Lmα77 zeigten nach Induktion in der SDS- Polyacrylelektrophorese eine starke Überexpressionsbande bei 43 kDa und eine spezifische Aktivität der Mannitol-2-Dehydrogenase von 70 U/mg Protein, während die Kontrollen (Zellen ohne Plasmid, Zellen mit leerem Plasmid) keine Aktivität zeigten.
Die Nukleotidsequenz des mdh-Gens aus L. pseudomesenteroides ATCC 12291 ist in Sequenz Nr. 2 gezeigt.
II) Biotransformation von D-Fructose zu D-Mannitol mit einem rekombinanten E. coli-Stamm
In einem rekombinanten E. coli-Stamm wurden die Enzyme Formiat- Dehydrogenase (EC 1.2.1.2) und Mannitol-2-Dehydrogenase (EC 1.1.1.67) übe- rexprimiert, um in den Zellen einen Oxidations-Reduktionszyklus zu etablieren. In diesem Oxidations-Reduktionszyklus wird Wasserstoff von Formiat über zelluläres NAD+ auf D-Fructose übertragen, wobei D-Fructose zu D- Mannitol reduziert wird (s. Fig. 1). Zusätzlich wurde in den Zellen der Glukosefacilitator exprimiert, um die Verfügbarkeit des Substrats Fructose zu verbessern.
(a) Stämme und Vektoren
Es wurden die Stämme E. coli BL21 (DE3) Star (Invitrogen) verwendet. Als Vek- toren wurden pET-24a(+)fo,/7/md/?, kodierend für den ORF der Formiat- Dehydrogenase aus Mycobacterium vaccae, der Mannitol-2-Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides und pZY507g/f kodierend für den Glukosefacilitator aus Zymomonas mobilis verwendet.
Für die Biotransformation wurden chemisch kompetente E. coli BL21 (DE 3) Star mit pET-24a(+)fα nα77 und pZY507g/f kotransformiert und auf LB-Agarplatten mit 25 μg/ml Chloramphenicol und 30 μg/ml Kanamycin selektiert. Als Kontrollen wurden E. coli BL21 (DE 3) Star entweder mit pET-24a(+)fα nc/7 oder pZY507g/f allein transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LB- Agarplatten mit entweder 25 μg/ml Chloramphenicol (pZY507g/f) oder mit 50 μg/ml Kanamycin (pET-24a(+)ft/Λ mcfh). LB-Agarplatten für E. coli BL21 (DE 3) Star transformiert mit p pET-24a(+)fcftVrr?o77 enthielten zusätzlich l% (v/v) D- Glucose zur Verminderung der Basalexpression der Mannitol-2-Dehydrogenase und der Formiat-Dehydrogenas.
(b) Biotransformation
Nach der Überexpression von FDH, MDH und GLF in E. coli, werden nicht wachsende Zellen in einer Biotransformation eingesetzt. Je 1 ,0 g induzierte Zellen von E. coli BL21 (DE 3) Star pET-24a(+)ft /ι/mc_7j / pZY507g/f~ wurden mit 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0 gewaschen und in 50 ml Reaktionslösung mit 500 mM D-Fructose und 500 mM Natriumformiat in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 6,7 resuspendiert. Die Ansätze wurden in 100 ml-Kolben ohne Schikane bei 100 - 120 Upm und 30°C für 24 h geschüttelt. Zu den Zeitpunkten 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 8, 17 und 23 h nach Reaktionsstart wurden 1 - 2 ml-Proben des Überstandes genommen zur Messung der Konzentrationen von Formiat, D-Fructose und D- Mannitol. Die Proben wurden bei 5000g für 1 min zentrifugiert, der Überstand 0,2 μm-filtriert und bis zur Messung durch HPLC bei -20°C gelagert. Als Kontrolle wurden 1 ,0 g nicht induzierte Zellen von E. coli BL21 (DE 3) Star pET- 24a(+)fdh/mdh I pZY507g/f in gleicher weise in der Biotransformation eingesetzt.
Die Konzentrationsbestimmungen von Formiat, D-Fructose und D-Mannitol im
Reaktionsüberstand und im zellfreien Rohextrakt wurden mit einer HPLC-Anlage (Merck/Hitachi) durchgeführt. Tabelle 1 zeigt beispielhaft Ergebnisse, die mit transformierten Mikroorganismen erreicht werden konnten.
Es konnte gezeigt werden, dass die parallele Überexpression der Formiat- Dehydrogenase und der Mannitol-2-Dehydrogenase und des Glukosefacilitators in E. coli zu einer sehr hohen Produktion von D-Mannitol durch diese Zellen in einem Reaktionsmedium mit D-Fructose und Formiat führt. Die bis zu 244 mM Mannitol nach 23 h stehen dem Verfahren ohne GLF mit nur 15 mM nach 17 h und dem Verfahren ohne FDH mit 20 mM nach 17 h gegenüber. Es konnte also eine ca. 12 - 15-fache Verbesserung erzielt werden.
Tabelle 1
SEQUENZ Nr. 1:
ATGAGTTCTGAAAGTAGTCAGGGTCTAGTCACGCGACTAGCCCTAATCGCTGCTA TAGGCGGCTTGCTTTTCGGTTACGATTCAGCGGTTATCGCTGCAATCGGTACACC GGTTGATATCCATTTTATTGCCCCTCGTCACCTGTCTGCTACGGCTGCGGCTTCC CTTTCTGGGATGGTCGTTGTTGCTGTTTTGGTCGGTTGTGTTACCGGTTCTTTGC TGTCTGGCTGGATTGGTATTCGCTTCGGTCGTCGCGGCGGATTGTTGATGAGTTC CATTTGTTTCGTCGCCGCCGGTTTTGGTGCTGCGTTAACCGAAAAATTATTTGGA ACCGGTGGTTCGGCTTTACAAATTTTTTGCTTTTTCCGGTTTCTTGCCGGTTTAG GTATCGGTGTCGTTTCAACCTTGACCCCAACCTATATTGCTGAAATTCGTCCGCC AGACAAACGTGGTCAGATGGTTTCTGGTCAGCAGATGGCCATTGTGACGGGTGCT TTAACCGGTTATATCTTTACCTGGTTACTGGCTCATTTCGGTTCTATCGATTGGG TTAATGCCAGTGGTTGGTGCTGGTCTCCGGCTTCAGAAGGCCTGATCGGTATTGC CTTCTTATTGCTGCTGTTAACCGCACCGGATACGCCGCATTGGTTGGTGATGAAG GGAGGTCATTCCGAGGCTAGCAAAATCCTTGCTCGTCTGGAACCGCAAGCCGATC CTAATCTGACGATTCAAAAGATTAAAGCTGGCTTTGATAAAGCCATGGACAAAAG CAGCGCAGGTTTGTTTGCTTTTGGTATCACCGTTGTTTTTGCCGGTGTATCCGTT GCTGCCTTCCAGCAGTTAGTCGGTATTAACGCCGTGCTGTATTATGCACCGCAGA TGTTCCAGAATTTAGGTTTTGGAGCTGATACGGCATTATTGCAGACCATCTCTAT CGGTGTTGTGAACTTCATCTTCACCATGATTGCTTCCCGTGTTGTTGACCGCTTC GGCCGTAAACCTCTGCTTATTTGGGGTGCTCTCGGTATGGCTGCAATGATGGCTG TTTTAGGCTGCTGTTTCTGGTTCAAAGTCGGTGGTGTTTTGCCTTTGGCTTCTGT GCTTCTTTATATTGCAGTCTTTGGTATGTCATGGGGCCCTGTCTGCTGGGTTGTT CTGTCAGAAATGTTCCCGAGTTCCATCAAGGGCGCAGCTATGCCTATCGCTGTTA CCGGACAATGGTTAGCTAATATCTTGGTTAACTTCCTGTTTAAGGTTGCCGATGG TTCTCCAGCATTGAATCAGACTTTCAACCACGGTTTCTCCTATCTCGTTTTCGCA GCATTAAGTATCTTAGGTGGCTTGATTGTTGCTCGCTTCGTGCCGGAAACCAAAG GTCGGAGCCTGGATGAAATCGAGGAGATGTGGCGCTCCCAGAAGTAG SEQUENZ Nr. 2:
TTAATATTCTATCACATGGTCTACTCCCCTTACTAAAATAAATGTGATAAACGTT TGACTTTATCTTGTTAAAGGTTTACCATTGTCCTCGTAAGTTAATTTAATCACAA AGTAAAAAGGAGAACAAAC
ATGGAAGCACTTGTGTTAACTGGTACAAAAAAATTAGAGGTTGAAAACATTGAAC AACCTGAGGTAAAGCCGAATGAAGTGTTGATTCATACAGCATTCGCTGGTATTTG CGGTACTGATCACGCTTTGTATGCCGGTCTTCCTGGCTCAGCCGATGCTGTGCCA CCAATCGTTTTGGGGCATGAAAATTCTGGTGTTGTAGCTGAAATTGGTTCTGATG TTACAAACGTTGCGGTGGGTGATCGTGTCACAATTGATCCCAATATTTACTGTGG TCAATGCAAGTATTGCCGTACAGCACGTCCAGAGCTTTGCGAAAACTTGTCTGCA GTTGGTGTAACACGCAATGGTGGCTTTGAAGAATACTTTACTGCGCCCGCATCAG TTGTTTACCAAATTCCAGATAATGTTTCACTTAAGTCAGCTGCCGTGGTTGAGCC GATTTCATGTGCTGTTCACGGTATTCAACTTCTTAAAGTGACACCATACCAAAAG GCATTAGTTATTGGTGACGGCTTCATGGGTGAACTCTTTGTTCAAATTCTGCAAG CTTATGGCATTCACCAAGTCGACTTGGCTGGTATTGTTCCTGAAAAGCTTGCTAT GAACAAAGAAAAGTTCGGCGTGAAAAATACGTACAATACAAAAGATGGCGACAAA ATTCCCGAAGGCACTTACGATGTTGTTGTTGAAGCAGTTGGCCTACCACAGACAC AAGAAGCCGCAATTGAAGCCTCAGCTCGTGGCGCTCAGGTTTTGATGTTTGGTGT TGGCGGTCCCGACGCAAAGTTCCAAATGAACACTTACGAAGTCTTCCAAAAGCAA TTGACGATTCAAGGATCATTTATCAATCCAAACGCATTTGAAGACTCATTGGCAT TGTTATCATCAGGCAAGTTAGACGTCGAATCGCTAATGTCACACGAATTAGATTA CCAGACTGTTGATGACTTTGTGAATGGCAAGTTAGGTGTCGTTTCAAAGGCAGTC GTTAAGGTTGGTGGCGAAGAGGCATAA
SEQUENZ Nr.3:
atggcaaaggtcctgtgcgttctttacgatgatccggtcgacggctacccgaa- gacctatgcccgcgacgatcttccgaa gatcgaccactatccgggcggccagatcttgccgacgccgaaggccatcgactt- cacgcccgggcagttgctcggctccgtctccggcgagctcggcctgcgcgaa- tatctcgaatccaacggccacaccctggtcgtgacctccgacaaggacggcccc- gactcggtgttcgagcgcgagctggtcgatgcggatgtcgtcatctcc- cagcccttctggccggcctatctgacgcccgagcgcatcgccaaggccaa- gaacctgaagctcgcgctcaccgccggcatcggttccgaccacgtcgatctt- cagtcggctatcgaccgcaacgtcaccgtggcggaagtcacctactgcaactc- gatcagcgtcgccgagcatgtggtgatgatgatcctg tcgctggtgcgcaactatctgccctcgcacgaatgggcgcggaagggcggctg- gaacatcgccgactgcgtctcccacgcctacgacctcgaggcgatgcatgtcgg- caccgtggccgccggccg- catcggtctcgcggtgctgcgccgtctggcgccgttcgacgtgcacctgcacta- caccgaccgtcaccgcctgccggaatcggtcgagaaggagctcaacct- cacctggcacgcgacccgcgaggacatgtatccggtttgcgacgtggtgacgct- gaactgcccgctgcaccccgaaaccgagcacatgatcaatgacgagacgct- gaagctgttcaagcgtggcgcctacatcgtcaacaccgcccgcgg- caagctgtgcgaccgcgatgccgtggcacgtgcgctc- gaatccggccggctggccggctatgccggcgacgtgtggttcccg- cagccggcgccgaaggaccacccctggcggacgatgccctataacggcat- gaccccgcacatctccggcaccacgctgaccgcgcaggcgcgttatgcggcggg- cacccgcgagatcctggagtgcttcttcgagggccgtccgatccgcgacgaa- tacctcatcgtgcagggcggcgctcttgccggcaccggcgcgcattcctactc- gaagggcaatgccaccggcggttcggaagaggccgccaagttcaa- gaaggcggtctga

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Produktion von D-Mannitol unter Einsatz Mannitol-2- Dehydrogenase (MDH) exprimierender Organismen, bei welchen die Zucker-Substrate und/oder Zucker-Substratvorläufer der MDH über ein nicht- phosphorylierendes Zucker-Transportsystem in den Organismus transportiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Organismen, die als Zucker-Transportsystem den Glukosefacilitator (GLF) aus einem
Eukaryonten enthalten, eingesetzt werden
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Organismen, die als Zucker-Transportsystem den Glukosefacilitator (GLF) aus Zymomonas mobilis enthalten, eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass Organismen, die die Sequenz Nr. 1 codierend für GLF enthalten, eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Zucker Glukose und/oder Fructose eingesetzt werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Organismen, die eine für eine MDH codierende Sequenz enthalten, eingesetzt werden
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Organismen, die eine für MDH codierende Sequenz aus Mikroorganismen der Familie der Lactobacteriaceae, insbesondere Leuconostoc pseudomesenteroides enthalten, eingesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass Organismen, die die Sequenz Nr. 2 codierend für MDH enthalten, eingesetzt werden.
. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Organismen, die eine für eine Formiat-Dehydrogenase (FDH) codierende Sequenz enthalten, eingesetzt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Organismen, die eine für FDH codierende Sequenz aus Mycobacterium vaccae enthalten, eingesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass Organismen, die die Sequenz Nr. 3 codierend für FDH enthalten, eingesetzt werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Organismus ein Mikroorganismus eingesetzt wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen und Pilzen eingesetzt werden.
14. Mikroorganismus, der die Enzyme MDH gemäß Sequenz Nr. 2 und FDH gemäß Sequenz Nr. 3 zur mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol exprimiert und ein nicht-phosphorylierendes Zucker-Transportsystem aufweist, das die Zucker-Substrate und/oder Zucker-Substratvorläufer der MDH in den Mikroorganismus transportiert.
15. Mikroorganismus nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Zucker-Transportsystem um den Glukosefacilitator (GLF) aus einem Eukaryonten handelt
16. Mikroorganismus nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Zucker-Transportsystem um den Glukosefacilitator
(GLF) aus Zymomonas mobilis handelt.
17. Mikroorganismus nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus die Sequenz Nr. 1 codierend für GLF aufweist.
18. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass er Glukose, Fructose oder Gemische hiervon zu D-Mannitol umsetzt.
19. Mikroorganismus nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass er eine für MDH codierende Sequenz aus
Mikroorganismen der Familie der Lactobacteriaceae, insbesondere Leuconostoc pseudomesenteroides enthält.
20. Mikroorganismus nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass er eine für FDH codierende Sequenz aus Mycobacterium vaccae enthält.
21. Mikroorganismus nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Gattung Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen und Pilzen sowie aus allen auch in der Lebensmittelindustrie verwendeten Mik- roorganismen stammt.
22. Verwendung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 14 bis 21 zur Herstellung von D-Mannitol.
23. Nukleotidsequenz gemäß Sequenz Nr. 1 codierend für GLF zur Verwendung in einem Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 14 bis 21.
24. Nukleotidsequenz gemäß Sequenz Nr. 2 codierend für MDH zur Verwendung in einem Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 14 bis 21.
25. Nukleotidsequenz gemäß Sequenz Nr. 3 codierend für FDH zur Verwendung in einem Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 14 bis 21.
26. Genstruktur enthaltend mindestens eine oder mehrere Nukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 25.
27. Vektor enthaltend mindestens eine oder mehrere Nukleotidsequenzen gemäß Ansprüchen 23 bis 25 oder eine oder mehrere Genstrukturen gemäß Anspruch 26.
28. Verwendung einer Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25 zur Transformierung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 14 bis 21.
29. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 14 bis 21 enthaltend mindes- tens eine Genstruktur gemäß Anspruch 26.
30. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 14 bis 21 enthaltend mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 27.
EP03757939A 2002-10-09 2003-10-09 Verfahren sowie mikroorganismus zur herstellung von d-mannitol Withdrawn EP1549744A1 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10247147 2002-10-09
DE10247147A DE10247147A1 (de) 2002-10-09 2002-10-09 Verfahren sowie Mikroorganismus zur Herstellung von D-Mannitol
PCT/EP2003/011191 WO2004033676A1 (de) 2002-10-09 2003-10-09 Verfahren sowie mikroorganismus zur herstellung von d-mannitol

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1549744A1 true EP1549744A1 (de) 2005-07-06

Family

ID=32038413

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP03757939A Withdrawn EP1549744A1 (de) 2002-10-09 2003-10-09 Verfahren sowie mikroorganismus zur herstellung von d-mannitol

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1549744A1 (de)
JP (1) JP2006503559A (de)
AU (1) AU2003273972A1 (de)
CA (1) CA2501391A1 (de)
DE (1) DE10247147A1 (de)
WO (1) WO2004033676A1 (de)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009046456A (ja) * 2007-08-23 2009-03-05 Kikkoman Corp 生殖行動の誘発用組成物
CN102197135B (zh) 2008-11-05 2014-08-13 三井化学株式会社 生产2-脱氧蟹肌醇(doi)的细菌及使用其生产2-脱氧蟹肌醇(doi)的方法
US9902981B2 (en) 2012-02-07 2018-02-27 Annikki Gmbh Process for the production of furan derivatives from glucose
CN105102626B (zh) 2013-03-27 2019-01-01 安尼基有限责任公司 葡萄糖异构化的方法
BR112018072410A2 (pt) 2016-05-23 2019-02-12 Annikki Gmbh processo para a conversão enzimática de d-glicose em d-frutose por meio de d-sorbitol
JP7133472B2 (ja) * 2016-12-15 2022-09-08 三菱商事ライフサイエンス株式会社 乳酸菌発酵調味料

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1023896A (ja) * 1996-05-07 1998-01-27 Unitika Ltd 組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法
FI981615A0 (fi) * 1998-07-15 1998-07-15 Xyrofin Oy Mannitolin valmistusmenetelmä immobilisoituja mikro-organismeja käyttäen
FI20002792A0 (fi) * 2000-12-20 2000-12-20 Hydrios Biotechnology Oy Menetelmä D-mannitolin tuottamiseksi
DE10220848A1 (de) * 2002-05-08 2003-12-04 Forschungszentrum Juelich Gmbh Für eine Mannitol-2-Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz sowie Verfahren zur Herstellung von D-Mannitol

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2004033676A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003273972A1 (en) 2004-05-04
JP2006503559A (ja) 2006-02-02
WO2004033676A1 (de) 2004-04-22
DE10247147A1 (de) 2004-04-22
CA2501391A1 (en) 2004-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AT503017B1 (de) Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von hydroxyketoverbindungen
JP5627546B2 (ja) セコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法
KR101474815B1 (ko) 중간체의 거울상선택적인 효소 환원 방법
EP2857496A1 (de) D-glucarinsäure produzierendes bakterium sowie verfahren zur herstellung von d-glucarinsäure
DE102004059376A1 (de) GDH-Mutante mit verbesserter chemischer Stabilität
EP1549744A1 (de) Verfahren sowie mikroorganismus zur herstellung von d-mannitol
AT501928A1 (de) Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen
JP5649119B2 (ja) シロ−イノシトール産生細胞および当該細胞を用いたシロ−イノシトール製造方法
US20050148055A1 (en) Method for the biotechnological production of xylitol
WO1996037620A2 (de) Verfahren zur gewinnung von acyloinen, dafür geeignete pyruvat-decarboxylase sowie deren herstellung und dna-sequenz des für diese kodierenden pdc-gens
DE60202227T2 (de) Neue Enon Reduktasen isoliert aus Kluyveromyces lactis, Methoden zu deren Herstellung und Methoden zur selektiven Reduzierung von Kohlenstoff-Kohlenstoff Doppelbindungen von Alpha, Beta-ungesättigten Ketonen unter Verwendung der Reduktasen
EP1313870B1 (de) Verfahren zur verbesserten herstellung und isolierung von trans-dihydroxy-cyclohexadien-carbonsäuren und/oder deren folgeprodukte sowie ein dazu geeigneter genetisch veränderter organismus
EP1499728A2 (de) Für eine mannitol-2-dehydrogenase codierende nukleotidsequenz sowie verfahren zur herstellung von d-mannitol
EP0879287A2 (de) Herstellung von l-ascorbinsäure
WO2008074506A1 (en) Optical resolution of a mixture of enantiomers of butynol or butenol
DE102013104418B4 (de) Biokatalytisches Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol
WO2009153325A1 (en) Optical resolution of a mixture of enantiomers of butynol or butenol
EP2193194B1 (de) Verfahren zur herstellung von 2-methyl-1,2-dihydroxypropan
EP2205726A1 (de) Verfahren zur oxidation von methylgruppen in aliphatischen kohlenwasserstoffen unter verwendung eines enzymsystems mit der aktivität einer monooxygenase
WO2007134817A1 (de) Biokatalysatoren und verfahren zur herstellung von organischen verbindungen

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20050215

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LI LU MC NL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: HEMMERLING, CLAUDIA

Owner name: INNOSWEET GMBH

Owner name: BRINGER-MEYER, STEPHANIE

Owner name: KAUP, BJOERN

Owner name: SAHM, HERMANN

Owner name: FORSCHUNGSZENTRUM JUELICH GMBH

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20070503