WO2022156857A1 - Verfahren zur herstellung von 2,4-dihydroxybutyrat oder l-threonin unter nutzung eines mikrobiellen stoffwechselweges - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 2,4-dihydroxybutyrat oder l-threonin unter nutzung eines mikrobiellen stoffwechselweges Download PDF

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mdh
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ohb
dehydrogenase
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Thomas Walther
Claudio Frazao
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Technische Universität Dresden
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Definitions

  • the invention relates to a process for the production of 2,4-dihydroxybutyrate (DHB), which can be present in the form of a 2,4-dihydroxybutyrate salt or in the form of the acid 2,4-dihydroxybutyric acid, or L-threonine using a microbial metabolic pathway .
  • DVB 2,4-dihydroxybutyrate
  • the amino acid methionine and the methionine analogue (D/L)-2-hydroxy-4-(methylthio)butyrate (HMTB) are mainly used as feed additives in chicken breeding and generate annual sales of around 3 billion euros on the market.
  • Methionine is currently produced exclusively from the fossil raw materials crude oil and natural gas.
  • the amino acid threonine is used as a feed additive in pig fattening.
  • Manufacturers of methionine have a strong interest in converting their chemical methionine production processes to sustainable microbial production processes, since the rising price of CO 2 emissions from chemical processes is expected to make these processes much more expensive.
  • the amino acid L-threonine is currently produced on an industrial scale by microbial production processes from the sugars glucose or sucrose.
  • the amino acid D/L-methionine and the equivalent applicable analogue D/L-2-hydroxy-4-(methylthio)butyrate (HMTB) are currently produced on an industrial scale exclusively from petroleum and natural gas.
  • the object on which the invention is based is to provide a process which opens the way for a sustainable method for producing the amino acids methionine and threonine.
  • the solution consists in a process for the production of 2,4-dihydroxybutyrate or L-threonine using a microbial metabolic pathway that comprises at least the following steps:
  • a step of enzymatic conversion of threonate into 2-keto-4-hydroxybutyrate (OHB) using a threonate dehydratase the metabolic pathway further comprising a step of enzymatic conversion of OHB into 2,4-dihydroxybutyrate using an OHB reductase or a step of enzymatic conversion of OHB into L- Homoserine using an L-homoserine transaminase, followed by a step of enzymatic conversion of L-homoserine into O-phospho-L-homoserine using a homoserine kinase with ATP consumption and a step of enzymatic conversion of O-phospho- Homoserine to L-threonine using an L-threonine synthase, and wherein the metabolic pathway is expressed in a microbial production strain which has previously been modified in relation to its natural form (wild type) by at least one of the enzymes necessary for the expression of said enzymes Genes are introduced into
  • glycolaldehyde can be provided by a synthetic pathway from xylose as described in Cam et al./2017/ACS Synth Biol/5/607-618.
  • glycol aldehyde can also be prepared from ethylene glycol. This in turn can easily be obtained from synthesis gas, which is also state of the art, as is the production of synthesis gas from CO 2 emissions.
  • ethylene glycol can also be obtained via the chemical hydrogenolysis of sugars, as described by Zheng et al./2017/ACS Catal/7/1939-1954.
  • ethylene glycol is a main component of the plastic polyethylene terephthalate (PET), so that the method according to the invention also opens up a way of recycling plastic waste.
  • PET plastic polyethylene terephthalate
  • a metabolic pathway was developed that allows for the carbon-conservative conversion of glycolaldehyde, which in turn is readily available from ethylene glycol, to L-threonine or HMTB.
  • Another significant advantage is that only a few by-products are produced in ethylene glycol-based production. This is to be expected due to the better separation of the metabolic pathway used for production from natural metabolism. Due to the occurrence of few by-products in ethylene glycol-based processes, the purification of the resulting valuable substances threonine and DHB can be relatively easy.
  • a metabolic pathway can be realized which does not exist in this form in nature.
  • This metabolic pathway is based in part on enzymatic activities that were previously unknown. Surprisingly, these two unknown enzyme activities could be found by screening. In addition, the newly found enzyme activities could be expressed together with already known activities from various other microorganisms in a single production strain. As a result, a previously unknown reaction sequence or a previously unknown metabolic pathway was constructed.
  • the production strain already has one or more enzymes required for the metabolic pathway in its natural form.
  • a strain of the species Escherichia coli can advantageously be used as the production strain, preferably E. coli AyqhD AaldA.
  • This strain is advantageous as a production strain because it has inactivation of the enzymes aldehyde dehydrogenase (AldA) and glycolaldehyde reductase (YqhD), which compete with the conversion of glycolaldehyde to D-threose.
  • AldA aldehyde dehydrogenase
  • YqhD glycolaldehyde reductase
  • glycolaldehyde is converted to D-threose using a D-threose aldolase.
  • D-threose is then enzymatically converted to D-threono-1,4-lactone using a D-threose dehydrogenase.
  • D-threono-1,4-lactone is converted into D-threonate using a D-threono-1,4-lactonase.
  • the enzymatic conversion of D-threonate into 2-keto-4-hydroxybutyrate (OHB) takes place using a D-threonate dehydratase.
  • the genetic information expressing the enzyme D-threo-aldose-1-dehydrogenase from Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) and/or from Xanthomonas campestris ( Xc.Fdh) introduced into the genome of the production strain.
  • D-threo-aldose-1-dehydrogenase from Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) and/or from Xanthomonas campestris ( Xc.Fdh)
  • D-threo-aldose-1-dehydrogenase from Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) and/or from Xanthomonas campestris ( Xc.Fdh)
  • D-threose dehydrogenase can be replaced by one of the amino acid sequences SEQ-ID-No. 113, SEQ-ID-No. 117, SEQ ID no. 123, SEQ ID no. 125 and SEQ ID no. 131 are shown.
  • D-threonate dehydratase in the production strain can advantageously be realized in that the genetic information expressing the enzyme D-arabinonate dehydratase from Acidovorax avenae (Aa.AraD) and/or Herbaspirillum huttiense (Hh.AraD) and/or Paraburkholderia mimosarum (Pm.AraD) and/or the optimized mutant Hh.AraD C434S is introduced into the genome of the production strain.
  • the following amino acid sequences can thus represent D-threonate dehydratase: SEQ-ID-No. 151, SEQ ID no. 153, SEQ ID no. 155 and SEQ ID no.
  • the genetic information from Escherichia coli (Ec.FsaA) expressing the enzyme D-fructose-6-phosphate aldolase and/or the genetic information of the mutated variant Ec.FsaA L107Y is preferably used :A129G (Ec.FsaA TA ) introduced into the genome of the production strain.
  • the D-threose aldolase can be replaced by one of the amino acid sequences SEQ-ID-No. 109 or SEQ ID no. 111 are shown.
  • the genetic information expressing the enzyme gluconolactonase from Thermogutta terrifontis (Tt.Lac11) and/or, particularly preferably, the genetic information of a truncated variant of this enzyme (Tt.Lac11v1), which leads to a significant improvement in expression, are introduced into the genome of the production strain. Therefore, the threono-1,4-lactonase can be replaced by one of the amino acid sequences SEQ-ID-No. 133 and SEQ ID no. 135 are shown.
  • a threonate-importing enzyme is expressed in the production strain in addition to the enzymes of the respective metabolic pathway.
  • This can be realized, for example, by introducing the D-threonate-importing permease-expressing genetic information from Cupriavidus necator (Re.kdgT) into the genome of the production strain. Therefore, the threonate-importing enzyme can be represented, for example, by the amino acid sequence SEQ-ID-No. 165 are represented.
  • an OHB reductase is used to convert OHB to DHB.
  • the NADH-dependent OHB reductase Ec.Mdh 5Q is used as the OHB reductase, which is derived from Frazao, CJR; Topham, CM; Malbert, Y.; Francois, JM; Walther, T. Rational Engineering of a Malate Dehydrogenase for Microbial Production of 2,4-Dihydroxybutyric Acid via the Homoserine Pathway. biochem. J. 2018, 475 (23), 3887-3901.
  • the OHB reductase can be represented by the amino acid sequence SEQ-ID-No. 163 are shown.
  • the reduction of OHB to DHB can be enhanced by using the cofactor NADPH instead of NADH in the reduction of OHB to DHB.
  • NADPH cofactor NADPH
  • an NADPH-dependent variant of the Ec.Mdh 5Q enzyme is expressed in the production strain during the biosynthesis of DHB, which variant has a mutation in at least one of the positions D34 or I35.
  • the genetic information expressing a mutated variant of the enzyme L-malate dehydrogenase from Escherichia coli (Ec.Mdh) is introduced into the genome of the production strain for the expression of the NADPH-preferring OHB reductase in the production strain, with the mutated enzyme in addition to five point mutations of the variant Ec.Mdh 5Q (Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D) which is mutated compared to the wild-type enzyme Ec.Mdh, in which position 12 isoleucine by valine (112V), in position 81 arginine by alanine (R81A), in position 85 methionine is replaced by glutamine (M85Q), in position
  • D34 designates the position which corresponds to position 34 in the wild-type enzyme which is occupied by aspartic acid, and 535 the position which corresponds to the position in the wild-type enzyme which is occupied by isoleucine.
  • the genetic information expressing one of the following enzymes is preferably introduced into the genome of the production strain: Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G (Ec.Mdh 5Q D34G) in which at position 34 aspartic acid is replaced by glycine represented by the amino acid sequence SEQ-ID-No. 173,
  • Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:I35S Ec.Mdh 5Q I35S in which isoleucine is replaced by serine in position 35, represented by the amino acid sequence SEQ-ID-No. 175,
  • Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35K Ec.Mdh 5Q D34G I35K in which 34-position aspartic acid is replaced by glycine and 35-position isoleucine is replaced by lysine represented by the amino acid sequence of SEQ-ID - No. 177,
  • Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35R Ec.Mdh 70
  • glycine replacing aspartic acid at position 34
  • arginine replacing isoleucine at position 35, represented by the amino acid sequence SEQ-ID-No. 179
  • Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35S Ec.Mdh 5Q D34G I35S in which 34-position aspartic acid is replaced by glycine and 35-position isoleucine is replaced by serine represented by the amino acid sequence of SEQ-ID - No. 181 , and
  • Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35T Ec.Mdh 5Q D34G I35T in which 34-position aspartic acid is replaced by glycine and 35-position isoleucine is replaced by threonine represented by the amino acid sequence of SEQ-ID -No. 183
  • Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35R (Ec.Mdh 7Q ) is expressed as an NADPH-dependent OHB reductase.
  • a corresponding NADPH-dependent variant of the Ec.Mdh 5Q enzyme with 2-keto-4-hydroxybutyrate (OHB) reductase activity which converts 2-keto-4-hydroxybutyrate (OHB) to 2,4-dihydroxybutyrate ( DHB) and represents a mutant of Escherichia coli (Ec.Mdh) L-malate dehydrogenase and over the wild-type enzyme in addition to the five Point mutations 112V, R81A, M85Q, D86S and G179D in at least one of positions D34 and I35 has a further mutation also represents an independent subject matter within the invention with the embodiments mentioned.
  • the glycol aldehyde can also be converted to L-threose instead of to D-threose.
  • activities of aldolases can be used, which are selected from enzymes of the known enzyme classes D-threonine aldolase (enzyme class 4.1.2.42), L-allo-threonine aldolase (4.1.2.49), L-threonine aldolase (4.1.2.5 ), 4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase (4.1.3.16) and 2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase (4.1.2.28).
  • a lactonase enzyme with activity on L-threono-1,4-lactone is, for example, in Westlake, A, "Thermostable Enzymes Important For Industrial Biotechnology.” (2019). There, gluconolactonase from Thermogutta terrifontis (Tt.Ara11) showed a corresponding activity.
  • Dehydratase enzymes having activity on L-threonate are known, for example dihydroxyacid dehydratase from Sulfolobus solfataricus as described in Kim, S.; Lee, SB Catalytic Promiscuity in Dihydroxy-Acid Dehydratase from the Thermoacidophilic Archaeon Sulfolobus Solfataricus. J. Biochem. 2006, 139 (3), 591-596.
  • the methods mentioned above comprise at least one further, preceding step for the microbial production of glycolaldehyde, for example from ethylene glycol, methanol or xylose.
  • Glycolaldehyde can be derived from ethylene glycol via a metabolic pathway which, for the conversion of ethylene glycol, uses either the enzyme activities of the pyrroloquinolinequinone (PQQ)-dependent ethylene glycol dehydrogenase (membrane-bound), reported by Mückschel, B.; Simon, O.; Kleberberger, J.; Graf, N.; Rosche, B.; Altenbuchner, J.; Pfannstiel, J.; Huber, A.; Hauer, B.
  • PQQ pyrroloquinolinequinone
  • Glycolaldehyde can also be derived from methanol via a metabolic pathway that sequentially involves the enzymatic activities of methanol dehydrogenase for converting methanol to formaldehyde and glycolaldehyde synthase for converting formaldehyde to Glycolaldehyde, as disclosed in the Lu, X.; Liu, Y.; Yang, Y; Wang, S.; Wang, Q.; Wang, X.; Yan, Z.; Cheng, J.; Liu, C.; Yang, X.; et al.
  • Glycolaldehyde can also be derived from xylose via a multistep metabolic pathway that sequentially involves the enzyme activities of xylose isomerase for the conversion of D-xylose to D-xylulose, xylulose-1-kinase for the conversion of D-xylulose to D-xylulose- 1 P and xylulose-1 P aldolase for the conversion of xylose-1 P aldolase into glycolaldehyde, known from Cam et al./2016/ACS Synth Biol/5/607-61.
  • An advantage of using methanol is that, like ethylene glycol, it can be easily derived from syngas.
  • the biosynthesis of threonine or HMTB via DHB from ethylene glycol can therefore rightly be described as a particularly sustainable production method.
  • Fig. 1 a schematic representation of the design of a five-stage
  • Figure 2 a bar graph showing the results of the screening of
  • Figure 3 a bar graph showing the results of the screening of
  • Fig. 4 a diagram showing the course of growth of E. coli
  • Fig. 5 Bar charts with the results of a 13 C-based metabolic flux analysis showing the biosynthesis of L-threonine from glycolaldehyde (GA) via the synthetic metabolic pathway.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of various processes for the production of 2,4-dihydroxybutyrate (DHB) or L-threonine from glycolaldehyde using microbial metabolic pathways, with all of these microbial metabolic pathways containing the four sequentially running and characterized by threose-aldolase, threose- Dehydrogenase, threono-1, 4-lactonase and threonate dehydratase catalyzed reaction stages are common.
  • DLB 2,4-dihydroxybutyrate
  • the metabolic pathway is expressed in a microbial production strain, preferably of the E. coli species, which has previously been modified in relation to its natural form (wild type) by introducing at least one of the genes necessary for the expression of the enzymes mentioned into the production strain.
  • glycolaldehyde is first converted to 2-keto-4-hydroxybutyrate (OHB) by these four sequential reaction steps, followed by a step of enzymatic conversion of 2-keto-4-hydroxybutyrate to L-homoserine, from a step of enzymatically converting L-homoserine to O-phospho-L-homoserine (OPL-homoserine) and a step of enzymatically converting O-phospho-L-homoserine to L-threonine.
  • OLB 2-keto-4-hydroxybutyrate
  • Glycolaldehyde can be derived from xylose through a multistep metabolic pathway which sequentially involves the enzyme activities of xylose isomerase (I) for the conversion of D-xylose into D-xylulose, xylulose-1-kinase (II) for the conversion of D-xylulose in D-xylulose-1P and xylulose-1P aldolase (III) for the conversion of D-xylulose-1P into glycolaldehyde.
  • xylose isomerase for the conversion of D-xylose into D-xylulose
  • xylulose-1-kinase II
  • xylulose-1P aldolase III
  • Glycolaldehyde can be derived from ethylene glycol via a metabolic pathway that involves the enzymatic activities of either PQQ-dependent ethylene glycol dehydrogenase (membrane-bound) (IV) or NAD(P)-dependent ethylene glycol dehydrogenase (cytosolic) (V ) uses.
  • Glycolaldehyde can be derived from methanol via a metabolic pathway that sequentially utilizes the enzymatic activities of methanol dehydrogenase (VI) to convert methanol to formaldehyde and glycolaldehyde synthase (VII) to convert formaldehyde to glycolaldehyde.
  • VI methanol dehydrogenase
  • VII glycolaldehyde synthase
  • the production of the metabolite DHB from glycolaldehyde in Escherchia coli was made possible by designing a metabolic pathway with five sequential reaction steps, which are driven by the enzyme activities of D-threose aldolase (VIII), D-threose dehydrogenase (IX), D-threono-1,4-lactonase (X), D-threonate dehydratase (XI) and OHB reductase (XV) are catalyzed.
  • VIII D-threose aldolase
  • IX D-threose dehydrogenase
  • X D-threono-1,4-lactonase
  • XI D-threonate dehydratase
  • XI D-threonate dehydratase
  • XV OHB reductase
  • the resulting four-carbon sugar is then oxidized by a D-threose dehydrogenase (IX) to D-threono-1,4-lactone, which is catalyzed in a by a D-threono-1,4-lactonase (X). Reaction is converted to the corresponding sugar acid or D-threonate.
  • D-threonate is dehydrated by a D-threonate dehydratase (XI) to OHB, which is finally reduced to DHB in a reaction catalyzed by OHB reductase (XV).
  • glycolaldehyde is first converted to 2-keto-4-hydroxybutyrate (OHB) by the four sequential reaction steps mentioned, followed by a step of enzymatic conversion of 2-keto-4-hydroxybutyrate to L-homoserine Utilizing an L-homoserine transaminase (XII) followed by a step of enzymatic conversion of L-homoserine to O-phospho-L-homoserine using ATP and utilizing an L-homoserine kinase (XIII) and a step of enzymatic conversion of O-phospho-homoserine to L-threonine using an L-threonine synthase (XIV).
  • L-homoserine transaminase XII
  • XIII L-homoserine kinase
  • XIV L-threonine synthase
  • the mutant malate dehydrogenase Ec.Mdh 5Q obtained by introducing 5 point mutations in the E. coli L-malate dehydrogenase enzyme was also reported in the reference Frazao, CJR; Topham, CM; Malbert, Y.; Francois, JM; Walther, T. Rational Engineering of a Malate Dehydrogenase for Microbial Production of 2,4-Dihydroxybutyric Acid via Homoserine Pathway. biochem. J. 2018, 475 (23), 3887-3901 as highly active. Therefore, this enzyme could be chosen as the OHB reductase to catalyze the final conversion step of the DHB pathway.
  • enzymes having L-homoserine transaminase activity for the step (XII) of enzymatic conversion of 2-keto-4-hydroxybutyrate into L-homoserine are aspartate aminotransferase from E. coli (Ec.AspC) and glutamate-pyruvate aminotransferase the mutant variant Ec.AlaC A142P:Y275D, see Bouzon, M.; Perret, A.; Loreau, O.; Delmas, V.; Perchat, N.; Weissenbach, J.; Taran, F.; Marliere, P. A Synthetic Alternative to Canonical One-Carbon Metabolism. ACS Synth Biol 2017, 6 (8), 1520-1533.
  • Enzymes with L-homoserine kinase activity for the step (XIII) of converting L-homoserine into O-phospho-L-homoserine are also known, in particular homoserine kinase from E. coli (EcThrB).
  • E. coli threonine synthase (Ec.ThrC) has L-threonine synthase activity for the step (XIV) of the enzymatic conversion of O-phospho-L-homoserine to L-threonine.
  • RBS ribosome binding sequence
  • Escherichia coli K-12 substr. MG1655 AyqhD AaldA was used as a starting strain for the construction of threonine-producing strains.
  • Expression of the endogenous thrBC and rhtB genes was made constitutive by replacing the native chromosomal 5' UTR of each operon or gene with the synthetic constitutive and isolated promoter proD Davis, JH; Rubin, AJ; Sauer, R.T: Design, construction and characterization of a set of insulated bacterial promoters. In: Nucleic Acid Res., 2011, 3, pp. 1131-1141.
  • the proD sequence was assigned a chloramphenicol Resistance cassette (FRT-cat-FRT-PproD) in front, the elements of which were initially amplified from the plasmids pTOPO-proD and pKD3 using the primers listed in Table 2.
  • the PCR products were digested with DpnI, purified and assembled by fusion PCR using primers that shared approximately 50 bp of homology with the flanking region of the target genomic locus.
  • the resulting DNA fragment was transformed into the respective target strains expressing the X-Red recombinase from the pKD46 plasmid so as to replace the natural gene promoter in these strains.
  • Chloramphenicol-resistant clones were selected on LB agar plates supplemented with the antibiotic and confirmed by PCR analysis (primers see Table 2) to contain the appropriate insert size.
  • the integrated promoter sequences were checked for correct sequencing by DNA sequencing.
  • the cat cassette was removed from the genome using FLP recombinase from the pCP20 plasmid Cherepanov PP; Wackernagel, W.: Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.
  • Gene, 1995, 158(1), pp. 9-14 and the correct excision of the cassette was checked by PCR using locus-specific primers (Table 2).
  • the plasmids were transformed into the target E. co// strains using standard protocols.
  • the high copy plasmid pEXT20 was amplified using the primer pair 209/284.
  • the PCR products were digested with XhoI/XbaI restriction enzymes and ligated into the vector backbone using T4 DNA ligase (NEB company).
  • the plasmids pEXT20-Ec.fsaA and pEXT20-Ec.fsaA TA were constructed by amplifying the Ec.feaA-1/1/11d type and Ec.fsaA L107Y:A129G gene using the primer pair 326/327. Escherichia coli MG1655 genomic DNA and synthetic genes each served as template DNA. The resulting PCR products and the pEXT20 expression vector were digested with BamHI/XbaI and ligated. The plasmid Ec.fsaA TA -Pc.tadH was created by PCR amplification of Ec-fsaA.
  • campestris DSM3586 as well as a synthetic gene for Ppi.tadH served as templates.
  • the resulting PCR products and the vector pACT3-Ec.fsaA TA -Pc.tadH-Tt.lac11 v1 were digested with Swal / XbaI and then ligated.
  • the plasmid pEXT22-Ec.mdh 5Q was constructed by PCR amplification of the OHB reductase-encoding gene Ec.mdh 5Q (synthetic gene) using the primer pair 305/258. The resulting PCR product and the low-copy vector pEXT22 were then digested with SacI/BamhI and ligated.
  • the plasmid pEXT22-Ec.mdh ⁇ Q was generated by PCR amplification of the OHB reductase-encoding gene Ec. mdh 7Q generated by mutation of Ec.mdh5Q as described below using the primer pair 305/258 designed.
  • the plasmid pET28-Ec.mdh 7Q served as template DNA.
  • the resulting PCR product and the low-copy vector pEXT22 were then digested with SacI/BamhI and ligated.
  • the plasmids pEXT22-Ec.mdh 5Q -Aa.araD, pEXT22-Ec.mdh 5Q -Hh.araD and pEXT22-Ec.mdh 7Q -Hh.araD were generated by amplification of Aa. araD and Hh.araD genes were constructed using primer pairs 551/552 and 553/554, respectively. Acidovorax avenae DSM7227 and Herbaspirillum huttiense DSM10281 genomic DNAs were used as the respective template DNAs.
  • the resulting PCR products were digested with BamHI/XbaI and ligated individually into the appropriate sites in the BamHI/XbaI digested pEXT22-Ec.mdh 5Q or pEXT22-Ec.mdh 7Q vectors .
  • the plasmid pEXT21-Re.kdgT was constructed by amplifying the Re.kc/gT gene from Cupriavidus necator H16 DSM428 genomic DNA using the primer pair 454/455.
  • the PCR product and the pEXT21 vector backbone were digested with BamHI/HindIII restriction enzymes and ligated.
  • the plasmid pEXT22-Ec.mdh 5Q -Hh.araD C434S was constructed by inverse PCR on the template pEXT22-Ec.mdh 5Q -Hh.araD which generated a cysteine to serine mutation at position 434 using the primer pair 718/719 .
  • the genes Ca.araD and Pm.araD were PCR-amplified using the primer pairs 724/725 and 732/733, respectively.
  • the genomic DNAs of Clostridium acetobutylicum DSM1731 and Paraburkholderia mimosarum DSM21841 served as templates.
  • the resulting PCR products and the plasmid pEXT22-Ec.mdh 5Q -Hh.araD were digested with BamHI/XbaI, purified and ligated.
  • the protein concentrations were determined before the enzymatic tests (assays) by the Bradfort method (Roti®-Quant, Roth). Unless otherwise stated, all enzymatic assays were performed in 96-well microtiter plates in a total volume of 250 pL at 37°C for 20 minutes.
  • the maximum reaction speed (v max ) and the values for the Michaelis constant (K m ) were determined by fitting the kinetic data for at least five different substrate concentrations to the Michaelis-Menten equation. The fitting was done by non-linear regression in Matlab® R2015a.
  • the reaction mixture for activity determination contained 100 mM sodium glycine (pH 9.5), 0.5 mM NAD+ and appropriate amounts of purified enzyme or crude protein extract. Reactions were started by adding appropriate concentrations of substrate.
  • One unit U of ethylene glycol dehydrogenase activity was defined as the amount of enzyme catalyzing the conversion of 1.0 pmol of NAD+ per minute.
  • the enzyme activity was determined by coupling the homo-aldol addition of glycolaldehyde to the NAD-dependent oxidation of D-threose catalyzed by purified D-threo-aldose-1-dehydrogenase from Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH).
  • the reaction mixture for activity determination contained 60 mM 2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid (HEPES) at pH 8, 10 mM NAD+, 100 ⁇ g mL-1 auxiliary enzyme and appropriate amounts of purified enzyme or vom protein crude extract. Reactions were started by adding appropriate concentrations of substrate.
  • One unit U of D-threose aldolase activity was defined as the amount of enzyme catalyzing the conversion of 1.0 pmol of D-threose per minute.
  • the enzyme activity was determined in the oxidative direction by measuring the reduction of NAD(P)+ at 340 nm during the oxidation of candidate sugars.
  • the reaction mixture for activity determination contained 50 mM HEPES (pH 8), 10 mM NAD(P)+ and appropriate amounts of purified enzyme or crude protein extract. Reactions were started by the addition of various concentrations of (D)-arabinose or (D)-threose (Carbosynth, UK).
  • a unit U of the sugar dehydrogenase activity was defined as the amount of enzyme that catalyses the conversion of 1.0 pmol of sugar per minute.
  • the reaction was started by adding different amounts of (L)-fucono-1,4-lactone or (D)-threono-1,4-lactone.
  • a unit U of the lactonase activity was defined as the amount of enzyme that catalyzes the hydrolysis of 1.0 pmol of lactone per minute.
  • the reaction mixture for activity determination contained 60 mM HEPES (pH 7.3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl 2 and appropriate amounts of purified enzyme or crude protein extract.
  • the 1 mL reaction was started by adding different sugar acids (L-fuconate, 2R-dihydroxyvalerate, D-altronate, D-tartrate, D-arabinonate or D-threonate) and incubated at 37 °C.
  • the enzyme activity was determined by coupling the dehydration of D-threonate to the NADH-dependent reduction of 2-keto-4-hydroxybutyrate (OHB) by purified OHB reductase Ec.Mdh 5Q described in Frazao, CJR; Topham, CM; Malbert, Y.; Francois, JM; Walther, T. Rational Engineering of a Malate Dehydrogenase for Microbial Production of 2,4-Dihydroxybutyric Acid via Homoserine Pathway. biochem. J. 2018, 475 (23), 3887-3901.
  • the reaction mixture contained 60 mM HEPES (pH 7.3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.25 mM NADH, 100 ⁇ g mL-
  • the enzyme activity was determined in the reductive direction by measuring the oxidation of NAD(P)H at 340 nm during the reduction of OHB to DHB.
  • the reaction mixture for the activity determination contained 60 mM HEPES (pH 7), 5 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 0.25 mM NADH or NADPH,
  • OHB 2mM OHB and appropriate amounts of purified enzyme.
  • the reactions were started by the addition of OHB.
  • a unit U of the OHB reductase activity was defined as the amount of enzyme that catalyses the conversion of 1.0 pmol of NAD(P)H per minute.
  • the initial concentration of one substrate was suitably varied while the initial concentration of the other substrate was kept constant.
  • Table 3 also indicates whether codon optimization was carried out. The following describes the cloning, expression and purification of candidate enzymes:
  • the corresponding coding genes were amplified by PCR and cloned into the corresponding sites of the expression vector pET28a (Novagen) using the cloning techniques and primer pairs listed in Table 4, with an N-terminal hexa-His tag being attached to the target sequence.
  • the resulting plasmids were transformed into competent E. coli DH5a cells (NEB). The correct insertion was verified by isolation of the plasmids and DNA sequencing before the so obtained Plasmids were transformed into the expression strain E. coli BL21 (DE3) (NEB).
  • the proteins were expressed in 50 mL LB medium or in autoinduction medium (Studier FW/2005/Prot Expr Purif/41/207-234/Protein production by auto-induction in high density shaking cultures). After a sufficient incubation time, the cells were separated from the medium by centrifugation, which was carried out at 1700 ⁇ g and 4° C. for 15 minutes. The cell pellets obtained in this way were stored at ⁇ 20° C. until further processing. The enzymes were purified by taking up the cell pellets in 1 mL HEPES buffer (50 mM, pH 7) and subsequent ultrasonic treatment at four intervals of 20 s each (UDS 751, Topas GmbH, power 40%).
  • the target proteins were purified from the crude protein extract obtained in this way using affinity chromatography in accordance with the manufacturer's instructions for the cobalt resin (Talon). The purified enzymes were then characterized with regard to their activity on the natural substrate (positive control) and the target substrate. Protein purification was performed from the frozen cell beads.
  • Table 4 Primer sequences, techniques and restriction sites used for cloning the target genes into the pET28 expression vector
  • the identification of enzymes with D-threose dehydrogenase activity was carried out as follows: To identify D-threose dehydrogenase activity, the enzymes D-threo-aldose-1-dehydrogenase from Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH), D-arabinose dehydrogenases from Saccharomyces cerevisiae, Sc.Aral and Sc.Ara2, Scy//o-inositol-2-dehydrogenase from Paracoccus laeviglucosivorans (PI.LgdA), D-threo-aldose-1-dehydrogenase from Pseudomonas sp.
  • Pc.TadH Paraburkholderia caryophylli
  • PI.LgdA Paracoccus laeviglucosivorans
  • Bm.Fdh D-arabinose dehydrogenase from Sulfolobus solfataricus
  • Bm.BmulJ04919 L-fucose dehydrogenase from Burkholderia multivorans
  • Figure 2 shows schematically the results of screening candidate enzymes for NAD(P)-dependent D-threose dehydrogenase activity in the form of a bar graph. Substrate concentrations of 10 mM cofactor and sugar were adjusted for screening. In the absence of activity, the enzymes in FIG. 2 were marked with an asterisk (*). The enzyme activities are presented on a logarithmic scale in the bar graph. Results are the mean of at least two independent biological experiments. The error bars correspond to the standard deviation from the mean. The exact values are shown in Table 5.
  • Table 5 shows the specific activities of the N-His-tagged enzyme candidate as D-threose dehydrogenase expressed in U per mg of the purified enzyme reacted with a fixed amount (10 mM) of the substrate, D-arabinose or D-threose, and the co-factors, NAD + or NADP + , was measured.
  • the abbreviation “nd” is synonymous with “not detected”.
  • Table 5 Dehydrogenase activity of candidate enzymes on D-arabinose and D-threose From a total of seven candidate enzymes, Sc.Aral, Pc.TadH and Bm.Fdh showed a measurable activity on D-threose with one of the cofactors NAD + or NADP + , which can also be seen from FIG. 2 and Table 5. Since Pc.TadH showed the highest specific activity with 0.27 U* mg' 1 , further kinetic analyzes were carried out with this enzyme. A K m value of 26.63 mM was determined for the substrate D-threose. Since Pc.TadH had the highest activity on D-threose and showed prominent expression in E. coli, this enzyme was preferred for the design of the pathway for synthesis.
  • the selection of candidate enzymes included the L-fuconate dehydratases from Xanthomonas campestris (Xc.FucD) and Pseudomonas putida (Pp.FucD), D-arabinonate dehydratases from Acidovorax avenae (Aa.AraD) and Herbaspirillum huttiense (Hh.AraD) , D-tartrate dehydratase from Bradyrhizobium japonicum (Bj.TarD) and D-altronate dehydratase from Escherichia coli (Ec.UxaA). In addition, D-hydroxy acid dehydratases from E.
  • Substrate concentrations were adjusted to 10 mM except for Aa.AraD and Hh.AraD where 1 mM natural substrate was applied. In the absence of activity, the enzymes are marked with an asterisk (*). The enzyme activities are shown on a logarithmic scale in the bar graph. The exact values of the activities are shown in Table 6.
  • Table 6 shows the specific activities of the N-His tagged enzymes tested. Results are reported as the mean (+/- standard deviation) of at least two biological replicates. The abbreviation “nd” is synonymous with “not detected”. Table 6: Activity of various dehydratases on D-threonate and their natural substrates Among the enzymes tested, Hh.Arad and Aa.AraD showed significant activity on D-threonate, having specific activities of 0.30 U mg-1 and 0.18 U mg-1 , respectively, as shown in Table 6 and FIG.
  • Tt.Lac11 N-terminally shortened variants of this protein were produced and tested with regard to their ability to be expressed in E. coli. It could be shown that using a variant of the enzyme (A1-38) shortened by 38 amino acids, an expression increased by a factor of 34 can be achieved, as can be seen from Table 7. This variant is called Tt.Lac11v1 below, while a variant shortened by 51 amino acids is called Tt.Lac11v2 and a variant shortened by 76 amino acids is called Tt.Lac11v3.
  • Table 7 shows yields and activities of truncated variants of the poly-His tagged Tt. Lad 1 lactonase when expressed with pET28 in E. coli BL21 (DE3). Results represent the mean and standard deviation from two independent biological replicates.
  • Table 7 Yields and activities of truncated variants of the poly-His-tagged Tt.
  • the biosynthesis of DHB from glycolaldehyde was demonstrated by the simultaneous expression of the entire pathway in one production strain.
  • E. coli TW64 MG1655 LyqhD LaldA
  • plasmids which ensured the expression of the synthetic metabolic pathway either in whole or in part.
  • the cells were cultured in 250 mL shake flasks on mineral salt medium which was supplemented with 10% (v/v) LB medium at 37° C. and 220 rpm in an incubator (Infors). IPTG (0.5mM) was added after the cultures reached an OD 600 of approximately 0.6.
  • Glycolaldehyde (20 mM) was added to the cultures when the OD 600 of the cultures was approximately 2.0.
  • the incubation time was 48 hours. Results were presented as the mean (+/-SD) of at least two biological replicates.
  • concentrations of DHB and the metabolic intermediates and glycolaldehyde were determined on an HPLC system (K-2600, Knaur) equipped with a UV-Vis detector (HP 1047A, Hewlett-Packard, USA).
  • the injection volume was 20 pL and the substances were separated on a Rezex RoA-organic acid H+ column equipped with a SecurityGuard cartridge (Phenomenex, USA) using 0.5 mM H 2 SO 4 as the eluent at a flow rate of 0.5 mL/min .
  • the determination of D-glucose, D-threose, glycolaldehyde, D-threonate and acetate was carried out at 35 °C, while DHB and ethylene glycol at
  • TtLac11 Three truncated forms of TtLac11 were generated from which different lengths of their N-terminal sequences were removed (Table 7).
  • the lactonase variant Tt.Lac11vi (A1-38 aa) showed a 34-fold improved expression in E. coli and a ten-fold improved specific activity of D-threono-1,4-lactone. Therefore, this construct was chosen to provide the required cytoplasmic lactonase activity in the synthesis pathway in this embodiment.
  • the strain (TW354) expressing the improved lactonase was able to accumulate 0.16 mM DHB.
  • the identification of D-threonate dehydratases is possible by quantifying the DHB formation on glycolaldehyde after replacing the Hh.AraD with other candidate enzymes in the production strain.
  • Another criterion for identifying improved D-threonate dehydratases is the rate of D-threonate degradation.
  • the mutant Hh.AraD C434S, the Ca.AraD and the enzyme Pm.AraD were expressed instead of the previously used Hh.AraD in the production strains TW452, TW453 and TW454 and their influence on the rates of threonate degradation and DHB Education examined.
  • the pathway In order to achieve the conversion of ethylene glycol (EG) to DHB or threonine using the described pathway, the pathway must be augmented with a reaction that allows for the oxidation of ethylene glycol to glycolaldehyde.
  • EG ethylene glycol
  • several enzymes are known that catalyze an NAD-dependent oxidation of ethylene glycol to glycolaldehyde.
  • a growth-dependent test system was used in which the growth rate of the test strain depends on the in vivo activity of ethylene glycol dehydrogenase. It is known that E. coli does not naturally express ethylene glycol dehydrogenase and therefore cannot grow on the substrate ethylene glycol as the sole carbon source.
  • the expression of an ethylene glycol dehydrogenase enables the conversion of ethylene glycol to glycolaldehyde and thus growth on this substrate. Therefore, the three candidate enzymes Go.Adh, Ec.FucO and Ec.FucO I6L:L7V were expressed in the E. coli strains using a pEXT20 vector E. coli LyqhD and E. coli LyqhD expressed LaldA.
  • the constructs based on the double mutant E. coli LyqhD LaldA served as a control, since these strains cannot grow on ethylene glycol as a result of the deletion of the glycolaldehyde dehydrogenase AldA.
  • test strains were incubated on mineral salts medium having the same composition as in the experiments described above. In this medium, only the glucose as sole carbon source was replaced by 100 mM ethylene glycol.
  • the test strains were incubated in microtiter plates (250 pL medium per well) at a shaking frequency of 880 rpm and a temperature of 37°C in a microtiter plate reader (Tecan). The growth rates were determined by regularly measuring the OD 6 oo.
  • ethylene glycol dehydrogenase Go.Adh enabled the fastest growth, followed by Ec.FucO 16L.L7V and Ec.FucO. For this reason, Go.Adh was subsequently used as ethylene glycol dehydrogenase for the conversion of ethylene glycol to DHB using the described metabolic pathway.
  • the biosynthesis of DHB from ethylene glycol was demonstrated by the simultaneous expression of the entire pathway including ethylene glycol dehydrogenase in one production strain.
  • the starting strain E. coli TW64 (MG1655 ⁇ yqhD ⁇ aldA) was used in all experiments and transformed with plasmids which ensured the expression of the synthetic metabolic pathway including the ethylene glycol dehydrogenase Go.Adh.
  • the production strain TW363 constructed in this way was cultivated and the substrate and product concentrations were measured as in the above exemplary embodiment for the synthesis of DHB from glycolaldehyde.
  • the specific activities were determined at constant initial concentrations of the substrates OHB (2 mM) and NAD(P)H (0.25 mM).
  • the enzyme Ec.Mdh 5Q is the previously described NADH-dependent OHB reductase Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D.
  • Ec.Mdh 70 has a specificity for NADPH that is 8600 times greater than the starting enzyme Ec.Mdh 5Q .
  • the kinetic parameters K m and V max were determined by fitting the measured initial reaction rates to the Michaelis-Menten model using Matlab.
  • Table 15 Results of the bioconversion of 10 mM glycolaldehyde to DHB by E. coli strains expressing either an NADH- or an NADPH-dependent OHB reductase nd - not detectable
  • the biosynthesis of L-threonine from glycolaldehyde was achieved through the simultaneous expression of the entire metabolic pathway including the enzymes converting OHB to threonine.
  • the starting strain E. coli TW64 (MG1655 ⁇ yqhD ⁇ aldA) was used in all experiments and transformed with plasmids which ensured the expression of the synthetic metabolic pathway including the homoserine transaminase Ec.AspC.
  • the resulting strain was designated TW612.
  • the threonine-exporting permease RhtB, the homoserine kinase Ec.ThrB and the threonine synthase Ec.ThrC were overexpressed in this strain.
  • Threonine can be synthesized in the production strain via both the synthetic pathway and the natural pathway.
  • threonine was synthesized according to the invention via the synthetic metabolic pathway.
  • a control experiment was carried out using strain TW619, which only expresses an incomplete and therefore non-functional variant of the synthetic metabolic pathway.
  • this strain contained no genetic information for the expression of a threonate dehydratase.
  • fully 13 C-labelled glycolaldehyde Omicron Biochemicals
  • was used as the substrate was used as the substrate, and the proportion of labeled and unlabeled threonine in the culture medium was compared. By detecting fully labeled threonine, it can be demonstrated that the corresponding carbon originates from glycolaldehyde.
  • the strain cultivations were carried out at 37°C on a rotary shaker (Infors HT, Germany) at 220 rpm.
  • the precultures were incubated in 5 mL LB in 50 mL Falcon tubes. After approximately 10 hours, 500 ⁇ L of these cultures were used to inoculate a second preculture (10 mL of 90% v/v M9 mineral medium and 10% v/v LB in 50 mL Falcon tubes), which was grown overnight.
  • the biomass required to establish main cultures with a starting OD600 of 0.2 was transferred to a medium consisting of 90% (v/v) mineral M9 medium and 10% (v/v) LB.
  • Antibiotics were added to all media at standard concentrations (chloramphenicol, 35 ⁇ g mL-1; kanamycin, 50 ⁇ g mL-1; spectinomycin, 100 ⁇ g mL-1).
  • IPTG 0.5mM
  • Fully 13 C-labeled glycolaldehyde was added after an OD600 of 2 had been reached.
  • Samples for analysis of extracellular metabolites were taken regularly. A 1 mL culture sample was centrifuged (at 13,000 g for 5 min) and the supernatant stored at -20 °C until further use. Samples were filtered with 0.2 ⁇ m PTFE membrane syringe filters prior to measurement.
  • LC/MS analysis The cell-free supernatant was diluted 100-fold in a solution of 10 mM ammonium acetate (pH 9.2) dissolved in 60% (v/v) acetonitrile and 40% (v/v) water.
  • the LC-MS platform consisted of a Vanquish and a Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Focus (all from ThermoFisher Scientific, San Jose, CA) controlled by Xcalibur 2.1 software.
  • the separation by liquid chromatography was carried out with a SeQuant® ZIC®- pHILIC (5pm polymer 150 x 2.1 mm) column with a flow rate of 0.15 mL min-1.
  • a gradient of A (5% ACN, 10mM ammonium acetate, pH 9.2 by NH4OH) and B (90% ACN, 10mM ammonium acetate, pH 9.2 by NH4OH) was used.
  • the gradient was 0 min, 95% B; 2 min, 95% B; 3 min, 89.4% B; 5 min, 89.4% B; 6 min, 83.8% B; 7 min, 83.8% B; 8 min, 78.2% B; 9 min, 78.2% B; 10 min, 55.9% B; 12 min, 55.9% B; 13 min, 27.
  • the sampler temperature was maintained at 6 °C, the injection volume was 5 ⁇ L, and the oven temperature was maintained at 25 °C.
  • the device settings for electrospray ionization were optimized for a flow rate of 0.15 mL min-1. Other parameters were set as follows: sheath gas flow rate 32 (device-specific units), auxiliary gas flow rate 8 (device-specific units), sweep gas flow rate 0 (device-specific units), spray voltage -3.5 kV, capillary temperature 250 °C, and auxiliary gas temperature 200 °C .
  • FIG. 5 includes bar graphs with the results of a 13 C-based metabolic flux analysis, which the biosynthesis of L-threonine from Glycolaldehyde (GA) via the synthetic pathway.
  • M+0 unlabeled threonine
  • M+4 fully labeled threonine
  • the control strain TW619 produced only small amounts of threonine.
  • no labeled threonine was detectable in the culture medium of this strain, showing that threonine was produced exclusively from glucose in this strain.
  • fully labeled threonine was found in the culture medium of strains TW612 and TW613, which express the entire synthetic pathway.
  • Table 16 lists the SEQ ID numbers of the DNA sequences of genes encoding specific enzymes and the SEQ ID numbers of the amino acid sequences of the corresponding enzymes.
  • Table 17 lists the SEQ ID numbers of the DNA sequences for various plasmids.
  • Table 17 DNA sequences for plasmids
  • Table 18 lists the SEQ ID numbers of the DNA sequences of genes encoding various OHB reductase mutants and the SEQ ID numbers of the amino acid sequences of the corresponding OHB reductase mutants.
  • the DNA sequence for the plasmid pEXT22-Ec.mdh 7Q -Hh.araD is SEQ ID no. 184 assigned.
  • LB Lysogeny broth (LB) medium LB Lysogeny broth (LB) medium, complex nutrient medium for LB Lysogeny broth (LB)
  • NADPH profaned or reduced form of nicotinamide adenine

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) oder L-Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges, wobei der Stoffwechselweg in einem mikrobiellen Produktionsstamm exprimiert wird, der zuvor gegenüber seiner natürlichen Form (Wildtyp) modifiziert wird, indem mindestens eines der für die Expression der genannten Enzyme notwendigen Gene in den Produktionsstamm eingebracht wird.

Description

Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat oder L- Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB), das in Form eines 2,4-Dihydroxybutyrat-Salzes oder in Form der Säure 2,4-Dihydroxybuttersäure vorliegen kann, oder L-Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges.
Es besteht ein zentrales bioökonomisches und ökologisches Interesse daran, die Abhängigkeit von fossilen Rohstoffen durch das Ermöglichen einer biologisch nachhaltigen Produktion von Kraftstoffen und Chemikalien auf biologischer Basis zu verringern. In diesem Zusammenhang ist auch ein enormer Anstieg der Bemühungen der Industrie an der Biosynthese von (L)-2,4- Dihydroxybutyrat (DHB) aufgrund seiner Bedeutung als Ausgangsstoff für die Synthese von Methioninanaloga für Tiernahrung zu verzeichnen.
Die Aminosäure Methionin sowie das Methionin-Analogon (D/L)-2-Hydroxy-4- (Methylthio)butyrat (HMTB) werden vorwiegend als Futtermittelzusatzstoff in der Hühnerzucht eingesetzt und erzeugen auf dem Markt einen Umsatz von jährlich zirka 3 Milliarden Euro. Methionin wird gegenwärtig ausschließlich aus den fossilen Rohstoffen Erdöl und Erdgas hergestellt. Die Aminosäure Threonin wird als Futtermittelzusatzstoff in der Schweinemast eingesetzt. Hersteller von Methionin haben ein starkes Interesse daran, ihre chemischen Methionin- Herstellungsprozesse auf nachhaltige mikrobielle Produktionsprozesse umzustellen, da mit der ansteigenden Bepreisung von CO2-Emissionen aus chemischen Prozessen eine starke Verteuerung dieser Prozesse zu erwarten ist.
Die Aminosäure L-Threonin wird im industriellen Maßstab gegenwärtig durch mikrobielle Produktionsprozesse aus den Zuckern Glukose beziehungsweise Saccharose hergestellt. Die Aminosäure D/L-Methionin und das gleichwertig einsetzbare Analogon D/L-2-Hydroxy-4-(Methylthio)butyrat (HMTB) werden gegenwärtig im industriellen Maßstab ausschließlich aus Erdöl und Erdgas hergestellt.
Die chemische Synthese von Methionin aus Erdöl und Erdgas ist nicht nachhaltig und muss durch Prozesse, die nachwachsende Rohstoffe nutzen, ersetzt werden. Die mikrobielle Synthese von Threonin und Methionin aus Zuckern ist deutlich nachhaltiger. Allerdings konkurrieren diese Prozesse mit der Herstellung von Nahrungsmitteln.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, welches den Weg für eine nachhaltige Methode zur Herstellung der Aminosäuren Methionin und Threonin eröffnet.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Die Lösung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von 2,4- Dihydroxybutyrat oder von L-Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges, der zumindest folgende Schritte umfasst:
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Glykolaldehyd zu Threose unter Nutzung einer Threose-Aldolase,
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Threose zu Threono- 1 ,4-Lacton unter Anwendung einer Threose-Dehydrogenase,
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Threono-1 ,4-Lacton in Threonat unter Nutzung einer Threono-1 ,4-Lactonase und
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Threonat in 2-Keto-4- Hydroxybutyrat (OHB) unter Nutzung einer Threonat-Dehydratase, wobei der Stoffwechselweg ferner einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von OHB zu 2,4-Dihydroxybutyrat unter Nutzung einer OHB- Reduktase oder einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von OHB in L- Homoserin unter Nutzung einer L-Homoserin-Transaminase, gefolgt von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von L-Homoserin in O-Phospho-L- Homoserin unter Nutzung einer Homoserin-Kinase unter ATP-Verbauch und einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von O-Phospho-Homoserin zu L-Threonin unter Nutzung einer L-Threonin-Synthase, umfasst, und wobei der Stoffwechselweg in einem mikrobiellen Produktionsstamm exprimiert wird, der zuvor gegenüber seiner natürlichen Form (Wildtyp) modifiziert wird, indem mindestens eines der für die Expression der genannten Enzyme notwendigen Gene in den Produktionsstamm auf geeignete Weise eingebracht wird. Gemäß der Konzeption der Erfindung verläuft der Stoffwechselweg über Glykolaldehyd, welches über verschiedene Wege erhältlich ist. So kann Glykolaldehyd durch einen synthetischen Stoffwechselweg aus Xylose bereitgestellt werden, wie bei Cam et al./2016/ACS Synth Biol/5/607-618, beschrieben ist. Darüber hinaus ist Glykolaldehyd aber auch aus Ethylenglycol darstellbar. Dieses kann wiederum leicht aus Synthesegas gewonnen werden, was ebenso Stand der Technik ist wie die Gewinnung von Synthesegas aus CO2-Emissionen. Zudem ist Ethylenglycol auch über die chemische Hydrogenolyse von Zuckern erhältlich, wie durch Zheng et al./2017/ACS Catal/7/1939-1954, beschrieben wurde. Die Hydrogenolyse von Zuckern zu Ethylenglycol ist eine innovative Methode zum chemischen Aufschluss von pflanzlichen Abfällen, die potenziell effizienter sein kann als herkömmliche Säure- oder Enzym-basierte Aufschlussmethoden. Nicht zuletzt ist Ethylenglycol ein Hauptbestandteil des Kunststoffs Polyethylenterephthalat (PET), so dass das erfindungsgemäße Verfahren auch einen Weg zur stofflichen Verwertung von Plastikabfällen eröffnet.
Gemäß der Konzeption der Erfindung wurde ein Stoffwechselweg entwickelt, der die Kohlenstoff-konservierende Umwandlung von Glykolaldehyd, welches wiederum leicht aus Ethylenglycol erhältlich ist, zu L-Threonin oder HMTB ermöglicht. Ein weiterer wesentlicher Vorteil besteht darin, dass nur wenig Nebenprodukte bei der Ethylenglycol-basierten Herstellung entstehen. Dies ist aufgrund der besseren Trennung des zur Herstellung genutzten Stoffwechselweges vom natürlichen Metabolismus zu erwarten. Durch das Vorkommen von wenigen Nebenprodukten bei Ethylenglycol-basierten Prozessen kann sich die Aufreinigung der resultierenden Wertstoffe Threonin und DHB relativ einfach gestalten.
In der Erfindung kann ein Stoffwechselweg realisiert werden, den es in dieser Form in der Natur nicht gibt. Dieser Stoffwechselweg basiert zum Teil auf enzymatischen Aktivitäten, die bisher nicht bekannt waren. Überraschenderweise konnten diese zwei unbekannten Enzymaktivitäten durch Screenings gefunden werden. Darüber hinaus konnten die neu gefundenen Enzymaktivitäten zusammen mit bereits bekannten Aktivitäten aus verschiedenen anderen Mikroorganismen gemeinsam in einem einzigen Produktionsstamm exprimiert werden. Mithin wurde eine bisher unbekannte Reaktionsabfolge beziehungsweise ein bisher unbekannter Stoffwechselweg konstruiert. Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist der Produktionsstamm in seiner natürlichen Form bereits ein oder mehrere für den Stoffwechselweg erforderliche Enzyme auf. Als Produktionsstamm kann vorteilhaft ein Stamm der Art Escherichia coli verwendet werden, bevorzugt E. coli AyqhD AaldA. Dieser Stamm eignet sich in vorteilhafter Weise als Produktionsstamm, weil er eine Inaktivierung der Enzyme Aldehyd- Dehydrogenase (AldA) und Glykolaldehydreduktase (YqhD) aufweist, welche mit der Umwandlung von Glykolaldehyd zu D-Threose konkurrieren. Des Weiteren eignet sich auch ein Stamm der Art Pseudomonas putida, zumal Stämme dieser Art eine sehr geeignete Ethylenglycol-Dehydrogenase besitzen.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird Glykolaldehyd unter Nutzung einer D-Threose-Aldolase zu D-Threose umgewandelt. Entsprechend wird dann D- Threose unter Anwendung einer D-Threose-Dehydrogenase zu D-Threono-1 ,4- Lacton enzymatisch umgewandelt. Es folgt ein Schritt der enzymatischen Umwandlung von D-Threono-1 ,4-Lacton in D-Threonat unter Nutzung einer D- Threono-1 ,4-Lactonase. In nächsten Schritt erfolgt in dieser Ausführungsform die enzymatische Umwandlung von D-Threonat in 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) unter Nutzung einer D-Threonat-Dehydratase.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für die Expression der D-Threose-Dehydrogenase im Produktionsstamm die das Enzym D-Threo-Aldose-1 -Dehydrogenase exprimierende genetische Information aus Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) und/oder aus Xanthomonas campestris (Xc.Fdh) in das Genom des Produktionsstamms eingebracht. Ebenso kann für die Bereitstellung der D- Threose-Dehydrogenase im Produktionsstamm auch eine das Enzym D- Arabinose-Dehydrogenase exprimierende genetische Information aus Saccharomyces cerevisiae (Sc. Aral) oder aus Acidovorax avenae (Aa.TadH) oder eine das Enzym L-Fucose-Dehydrogenase exprimierende genetische Information aus Burkholderia Multivorans (Bm.Fdh) in das Genom des Produktionsstammes eingebracht werden. So kann die D-Threose- Dehydrogenase durch eine der Aminosäuresequenzen SEQ-ID-No. 113, SEQ- ID-No. 117, SEQ-ID-No. 123, SEQ-ID-No. 125 und SEQ-ID-No. 131 dargestellt werden.
Die Expression der D-Threonat-Dehydratase im Produktionsstamm kann vorteilhafterweise dadurch realisiert werden, dass die das Enzym D-Arabinonat- Dehydratase exprimierende genetische Information aus Acidovorax avenae (Aa.AraD) und/oder Herbaspirillum huttiense (Hh.AraD) und/oder Paraburkholderia mimosarum (Pm.AraD) und/oder die der optimierten Mutante Hh.AraD C434S in das Genom des Produktionsstamms eingebracht wird. Folgende Aminosäuresequenzen können die D-Threonat-Dehydratase somit repräsentieren: SEQ-ID-No. 151 , SEQ-ID-No. 153, SEQ-ID-No. 155 und SEQ-ID-No. 159. Für die Expression der D-Threose-Aldolase im Produktionsstamm wird vorzugsweise die das Enzym D-Fruktose-6-Phosphat-Aldolase exprimierende genetische Information aus Escherichia coli (Ec.FsaA), und/oder die genetische Information der mutierten Variante Ec.FsaA L107Y:A129G (Ec.FsaATA) in das Genom des Produktionsstamms eingebracht. Somit kann die D-Threose- Aldolase durch eine der Aminosäuresequenzen SEQ-ID-No. 109 oder SEQ-ID- No. 111 dargestellt werden.
Für die Expression der Threono-1 ,4-Lactonase im Produktionsstamm kann die das Enzym Gluconolactonase exprimierende genetische Information aus Thermogutta terrifontis (Tt.Lac11 ) und/oder, besonders bevorzugt, die genetische Information einer verkürzten Variante dieses Enzyms (Tt.Lac11v1), die zu einer erheblichen Verbesserung der Expression führt, in das Genom des Produktionsstamms eingebracht werden. Daher kann die Threono-1 ,4- Lactonase durch eine der Aminosäuresequenzen SEQ-ID-No. 133 und SEQ-ID-No. 135 dargestellt werden.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich zu den Enzymen des jeweiligen Stoffwechselweges ein Threonat-im portierendes Enzym im Produktionsstamm exprimiert. Dies kann zum Beispiel dadurch realisiert werden, dass die D-Threonat- importierende Permease exprimierende genetische Information aus Cupriavidus necator (Re.kdgT) in das Genom des Produktionsstamms eingebracht wird. Daher kann das Threonat-importierende Enzym beispielsweise durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID-No. 165 repräsentiert werden.
Zur Umwandlung von OHB zu DHB wird gemäß der Erfindung eine OHB- Reduktase eingesetzt. In einer Ausführungsvariante der Erfindung wird die NADH-abhängige OHB-Reduktase Ec.Mdh5Q als OHB-Reduktase verwendet, die aus Frazäo, C. J. R.; Topham, C. M.; Malbert, Y.; Francois, J. M.; Walther, T. Rational Engineering of a Malate Dehydrogenase for Microbial Production of 2,4-Dihydroxybutyric Acid via Homoserine Pathway. Biochem. J. 2018, 475 (23), 3887-3901 bekannt ist. Die OHB-Reduktase kann durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID-No. 163 dargestellt werden.
Überraschenderweise kann die Reduktion von OHB zu DHB durch die Verwendung des Kofaktors NADPH anstelle von NADH bei der Reduktion von OHB zu DHB verbessert werden. Durch Einbringen von Mutationen in das NADH-abhängige Ec.Mdh5Q-Enzym gelingt es, dessen Kofaktorspezifität zugunsten des NADPH zu verändern. Dies ist insofern bemerkenswert, als dass bisher noch keine NADPH-abhängigen OHB-Reduktasen existierten.
In einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung wird im Produktionsstamm bei der Biosynthese von DHB eine NADPH-abhängige Variante des Ec.Mdh5Q- Enzyms exprimiert, welche in mindestens einer der Positionen D34 oder I35 eine Mutation aufweist. Das heißt, es wird für die Expression der NADPH- bevorzugenden OHB-Reduktase im Produktionsstamm die eine mutierte Variante des Enzyms L-Malat-Dehydrogenase aus Escherichia coli (Ec.Mdh) exprimierende genetische Information in das Genom des Produktionsstamms eingebracht, wobei das mutierte Enzym zusätzlich zu fünf Punktmutationen der gegenüber dem Wildtypenzym Ec.Mdh mutierten Variante Ec.Mdh5Q (Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D), bei der in Position 12 Isoleucin durch Valin (112V), in Position 81 Arginin durch Alanin (R81A), in Position 85 Methionin durch Glutamin (M85Q), in Position 86 Asparaginsäure durch Serin (D86S) und in Position 179 Glycin durch Asparaginsäure (G179D) ersetzt ist, in mindestens einer der Positionen D34 und I35 eine weitere Mutation aufweist. Dabei bezeichnet D34 die Position, die der Position 34 im Wildenzymtyp entspricht, welche mit Asparaginsäure besetzt ist, und 535 die Position, die der Position im Wildtypenzym entspricht, welche mit Isoleucin besetzt ist. Vorzugsweise wird für die Expression der NADPH-bevorzugenden OHB-Reduktase im Produktionsstamm die eines der folgenden Enzyme exprimierende genetische Information in das Genom des Produktionsstamms eingebracht: Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G (Ec.Mdh5Q D34G), bei dem in Position 34 Asparaginsäure durch Glycin ersetzt ist, dargestellt durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID-No. 173,
Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:I35S (Ec.Mdh5Q I35S), bei dem in Position 35 Isoleucin durch Serin ersetzt ist, repräsentiert durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID-No. 175,
Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35K (Ec.Mdh5Q D34G I35K), bei dem in Position 34 Asparaginsäure durch Glycin und in Position 35 Isoleucin durch Lysin ersetzt ist, dargestellt durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID- No. 177,
Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35R (Ec.Mdh5Q D34G I35R = Ec.Mdh70), bei dem in Position 34 Asparaginsäure durch Glycin und in Position 35 Isoleucin durch Arginin ersetzt ist, dargestellt durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID-No. 179,
Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35S (Ec.Mdh5Q D34G I35S), bei dem in Position 34 Asparaginsäure durch Glycin und in Position 35 Isoleucin durch Serin ersetzt ist, dargestellt durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID- No. 181 , und
Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35T (Ec.Mdh5Q D34G I35T), bei dem in Position 34 Asparaginsäure durch Glycin und in Position 35 Isoleucin durch Threonin ersetzt ist, dargestellt durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID-No. 183.
In einer besonders vorteilhaften Ausführung der Erfindung wird dabei das Enzym Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35R (Ec.Mdh7Q) als NADPH-abhängige OHB-Reduktase exprimiert.
Ein entsprechende NADPH-abhängige Variante des Ec.Mdh5Q-Enzyms mit 2- Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB)-Reduktase-Aktivität, welches die Umwandlung von 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) zu 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) katalysiert, und eine Mutante der L-Malat-Dehydrogenase aus Escherichia coli (Ec.Mdh) darstellt und gegenüber dem Wildtypenzym zusätzlich zu den fünf Punktmutationen 112V, R81A, M85Q, D86S und G179D in zumindest einer der Positionen D34 und I35 eine weitere Mutation aufweist, stellt mit den genannten Ausführungsformen auch einen unabhängigen Gegenstand innerhalb der Erfindung dar. Gleiches gilt auch für die Verwendung eines solchen Enzyms für die Umwandlung von OHB in 2,4-DHB, wobei auch die Verwendung des Enzyms bei Verfahren eingeschlossen ist, die andere DHB-produzierende Stoffwechselwege als die oben bereits genannten Stoffwechselwege nutzen, welche wie diese aber ebenfalls eine enzymatische Umwandlung von 2-Keto-4- Hydroxybutyrat (OHB) zu 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) unter Nutzung einer OHB-Reduktase umfassen, wie zum Beispiel das Verfahren nach WO 2014/009435 A1. In der Regel exprimiert ein entsprechend modifizierter Mikroorganismus als Produktionsstamm für die Herstellung von 2,4- Dihydroxybutyrat (DHB) die Gene, die für die Katalyse der Schritte des gewählten DHB-produzierenden Stoffwechselweges erforderlich sind. Da jeder dieser Stoffwechselwege die enzymatische Umwandlung von 2-Keto-4- Hydroxybutyrat (OHB) zu 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) unter Nutzung einer OHB-Reduktase umfasst, kann für die Expression der OHB-Reduktase die eins der oben genannten Enzyme exprimierende genetische Information in das Genom des Mikroorganismus eingebracht werden.
Alternativ kann auch, ausgehend vom Glykolaldehyd, eine Umwandlung des Glykolaldehyds statt zu D-Threose zu L-Threose erfolgen. Dafür können Aktivitäten von Aldolasen genutzt werden, die ausgewählt sind aus Enzymen der bekannten Enzymklassen D-Threonin-Aldolase (Enzymklasse 4.1.2.42), L- Allo-Threonin-Aldolase (4.1.2.49), L-Threonin-Aldolase (4.1.2.5), 4-Hydroxy-2- Oxoglutarat-Aldolase (4.1.3.16) und 2-Dehydro-3-Deoxy-D-Pentonat-Aldolase (4.1.2.28). Alle weiteren Etappen des oben beschriebenen Stoffwechselweges bis zum 2-Keto-4-Hydroxybutyrat sind analog mit der L-Form möglich. So konnte bereits bei Kim, Suk Min, Hyun Senng Lim, and Sun Bok Lee. "Discovery of a RuBisCO-iike Protein that Functions as an Oxygenase in the Novel D-Hamamelose Pathway." Biotechnaiogy and bioprocess engineering 23.5 (2018): 490-499, mit Hamamelose-Dehydrogenase aus Ochrobactrum anthropi (Oa.HamH) L-Threose-Dehydrogenase-Aktivität demonstriert werden. Ein Lactonase-Enzyme mit Aktivität auf L-Threono-1 ,4- Lacton ist beispielsweise bei Westlake, A, "Thermostable Enzymes Important For Industrial Biotechnology." (2019), beschrieben. Dort zeigte Gluconolactonase aus Thermogutta terrifontis (Tt.Ara11 ) eine entsprechende Aktivität. Dehydratase-Enzyme mit Aktivität auf L-Threonat sind bekannt, zum Beispiel Dihydroxysäure-Dehydratase aus Sulfolobus solfataricus, wie in der Druckschrift Kim, S.; Lee, S. B. Catalytic Promiscuity in Dihydroxy-Acid Dehydratase from the Thermoacidophilic Archaeon Sulfolobus Solfataricus. J. Biochem. 2006, 139 (3), 591-596, beschrieben.
Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung umfassen die oben genannten Verfahren mindestens einen weiteren, vorgelagerten Schritt zur mikrobiellen Herstellung von Glykolaldehyd, beispielsweise aus Ethylenglycol, Methanol oder Xylose. Glykolaldehyd kann dabei aus Ethylenglycol über einen Stoffwechselweg abgeleitet werden, welcher für die Umwandlung von Ethylenglycol entweder die Enzymaktivitäten der Pyrrolochinolinchinon (PQQ)- abhängigen Ethylenglycol-Dehydrogenase (Membran-gebunden), berichtet von Mückschel, B.; Simon, O.; Klebensberger, J.; Graf, N.; Rosche, B.; Altenbuchner, J.; Pfannstiel, J.; Huber, A.; Hauer, B. Ethylene Glycol Metabolism by Pseudomonas Putida. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78 (24), 8531-8539, oder der NAD(P)-abhängigen Ethylenglycol-Dehydrogenase (zytosolisch), bekannt aus Lu, Z.; Cabiscol, E.; Obradors, N.; Tamarit, J.; Ros, J.; Aguilar, J.; Lin, E. C. Evolution of an Escherichia Coli Protein with Increased Resistance to Oxidative Stress. J. Biol. Chem. 1998, 273 (14), 8308-8316, und Zhang, X.; Zhang, B.; Lin, J.; Wei, D. Oxidation of Ethylene Glycol to Glycolaldehyde Using a Highly Selectivealcohol Dehydrogenase from Gluconobacter Oxydans. J. Mol. Catalysis B 2015, 112, 69-75, nutzt.
Glykolaldehyd kann auch aus Methanol über einen Stoffwechselweg abgeleitet abgeleitet werden, welcher nacheinander die Enzymaktivitäten der Methanoldehydrogenase für die Umwandlung von Methanol in Formaldehyd und der Glykolaldehyd-Synthase für die Umwandlung von Formaldehyd in Glykolaldehyd nutzt, wie in der Druckschrift Lu, X.; Liu, Y.; Yang, Y; Wang, S.; Wang, Q.; Wang, X.; Yan, Z.; Cheng, J.; Liu, C.; Yang, X.; et al.
Constructing a Synthetic Pathway for Acetyl-Coenzyme A from One- Carbon through Enzyme Design. Nat Commun 2019, 10 (1), 1378, beschrieben.
Glykolaldehyd kann auch über einen mehrstufigen Stoffwechselweg aus Xylose abgeleitet werden, welcher nacheinander die Enzymaktivitäten der Xylose- Isomerase für die Umwandlung von D-Xylose in D-Xylulose, der Xylulose-1- Kinase für die Umwandlung von D-Xylulose in D-Xylulose-1 P und der Xylulose- 1 P-Aldolase für die Umwandlung von Xylose-1 P-Aldolase in Glykolaldehyd nutzt, bekannt aus Cam et al./2016/ACS Synth Biol/5/607-61.
Ein Vorteil der Verwendung von Methanol besteht darin, dass es, ebenso wie Ethylenglycol, leicht aus Synthesegas abgeleitet werden kann. Die Biosynthese von Threonin oder HMTB über DHB aus Ethylenglycol kann daher mit Recht als besonders nachhaltige Herstellungsweise bezeichnet werden.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile von Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Figuren und der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen. Es zeigen die
Fig. 1 : eine schematische Darstellung Entwurf eines fünfstufigen
Stoffwechselweges zur Umwandlung von Glykolaldehyd zu DHB,
Fig. 2: ein Säulendiagramm mit den Ergebnissen des Screenings von
Kandidaten-Enzymen für NAD(P)-abhängige D-Threose- Dehydrogenase-Aktivität,
Fig. 3: ein Säulendiagramm mit den Ergebnissen des Screenings von
Kandidaten-Enzymen für D-Threonat-Dehydratase-Aktivität, Fig. 4: ein Diagramm zur Darstellung des Wachstumsverlaufs von E. coli-
Stämmen, die verschiedene Ethylenglycol-Dehydrogenasen exprimieren, und
Fig. 5: Säulendiagramme mit den Ergebnissen einer 13C-basierten metabolischen Stoffflussanalyse, welche die Biosynthese von L- Threonin aus Glykolaldehyd (GA) über den synthetischen Stoffwechselweg zeigt.
In der Fig. 1 sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von 2,4- Dihydroxybutyrat (DHB) oder L-Threonin aus Glykolaldehyd unter Nutzung von mikrobiellen Stoffwechselwegen schematisch dargestellt, wobei all diesen mikrobiellen Stoffwechselwegen die vier nacheinander ablaufenden und durch Threose-Aldolase, Threose-Dehydrogenase, Threono-1 ,4-Lactonase und Threonat-Dehydratase katalysierten Reaktionsstufen gemeinsam sind.
Der Stoffwechselweg wird in einem mikrobiellen Produktionsstamm, vorzugsweise der Art E. coli, exprimiert, der zuvor gegenüber seiner natürlichen Form (Wildtyp) modifiziert wird, indem mindestens eines der für die Expression der genannten Enzyme notwendigen Gene in den Produktionsstamm eingebracht wird.
Im Falle der Herstellung von L-2,4-Dihydroxybutyrat können zwei Moleküle von Glykolaldehyd durch die oben genannten vier nacheinander ablaufenden Reaktionsstufen zu 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) und durch eine anschließende fünfte Reaktionsstufe schließlich ohne Kohlenstoffverlust in L- 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) umgewandelt werden.
Im Falle der Herstellung von L-Threonin wird Glykolaldehyd durch diese vier nacheinander ablaufenden Reaktionsstufen zunächst zu 2-Keto-4- Hydroxybutyrat (OHB) umgewandelt, gefolgt von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von 2-Keto-4-Hydroxybutyrat in L-Homoserin, von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von L-Homoserin in O-Phospho- L-Homoserin (O-P-L-Homoserin) und einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von O-Phospho-L-Homoserin zu L-Threonin.
Beide Stoffwechselwege sind mit der Nutzung von Ethylenglycol, Methanol oder D-Xylose als Ausgangsstoffe vereinbar. Glykolaldehyd-produzierende Reaktionen sind in Fig. 1 als gestrichelte Pfeile gezeigt. Die unterschiedlichen Enzyme beziehungsweise Enzymaktivitäten der Stoffwechselwege sind in Fig. 1 durch römische Ziffern gekennzeichnet.
Glykolaldehyd kann über einen mehrstufigen Stoffwechselweg aus Xylose abgeleitet werden, welcher nacheinander die Enzymaktivitäten der Xylose- Isomerase (I) für die Umwandlung von D-Xylose in D-Xylulose, der Xylulose-1- Kinase (II) für die Umwandlung von D-Xylulose in D-Xylulose-1 P und der Xylulose-1 P-Aldolase (III) für die Umwandlung von D-Xylulose-1 P in Glykolaldehyd nutzt.
Glykolaldehyd kann aus Ethylenglycol über einen Stoffwechselweg abgeleitet werden, welcher für die Umwandlung von Ethylenglycol entweder die Enzymaktivitäten der PQQ-abhängigen Ethylenglycol-Dehydrogenase (Membran-gebunden) (IV) oder der NAD(P)-abhängigen Ethylenglycol- Dehydrogenase (zytosolisch) (V) nutzt.
Glykolaldehyd kann aus Methanol über einen Stoffwechselweg abgeleitet werden, welcher nacheinander die Enzymaktivitäten der Methanoldehydrogenase (VI) für die Umwandlung von Methanol in Formaldehyd und der Glykolaldehyd-Synthase (VII) für die Umwandlung von Formaldehyd in Glykolaldehyd nutzt.
Die Herstellung des Stoffwechselproduktes DHB aus Glykolaldehyd in Escherchia coli war möglich durch den Entwurf eines Stoffwechselweges mit fünf aufeinanderfolgenden Reaktionsstufen, die durch die Enzymaktivitäten von D-Threose-Aldolase (VIII), D-Threose-Dehydrogenase (IX), D-Threono-1 ,4- Lactonase (X), D-Threonat-Dehydratase (XI) und OHB-Reduktase (XV) katalysiert werden. In der ersten Stufe werden zwei Moleküle von Glykolaldehyd (GA) zu einem Molekül D-Threose verbunden. Der resultierende Vier- Koh lenstoff-Zucker wird dann durch eine D-Threose-Dehydrogenase (IX) zu D- Threono-1 ,4-Lacton oxidiert, welches in einer durch eine D-Threono-1 ,4- Lactonase (X) katalysierten Reaktion zur entsprechenden Zuckersäure beziehungsweise D-Threonat umgewandelt wird. In den letzten zwei enzymatischen Schritten wird D-Threonat durch eine D-Threonat-Dehydratase (XI) zu OHB dehydriert, welches letztlich in einer durch OHB-Reduktase (XV) katalysierten Reaktion zu DHB reduziert wird.
Bei der Herstellung von L-Threonin wird Glykolaldehyd durch die genannten vier nacheinander ablaufenden Reaktionsstufen zunächst zu 2-Keto-4- Hydroxybutyrat (OHB) umgewandelt, gefolgt von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von 2-Keto-4-Hydroxybutyrat in L-Homoserin unter Nutzung einer L-Homoserin-Transaminase (XII), gefolgt von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von L-Homoserin in O-Phospho-L-Homoserin unter ATP-Verbrauch und unter Nutzung einer L-Homoserin-Kinase (XIII) und einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von O-Phospho-Homoserin zu L-Threonin unter Nutzung einer L-Threonin-Synthase (XIV).
Von den genannten enzymatischen Aktivitäten waren bereits die meisten bereits bekannt und es konnten die notwendigen Gene, sofern sie nicht im Produktionsstamm bereits enthalten waren, in den Produktionsstamm auf geeignete Weise eingebracht werden, andere mussten jedoch durch Screening identifiziert werden.
Sowohl D-Threose-Aldolase- als auch OH B-Reduktase-Aktivitäten wurden bereits in der Literatur beschrieben. Insbesondere konnte gemäß der Druckschrift Szekrenyi, A.; Soler, A.; Garrabou, X.; Guerard-Helaine, C.; Parella, T.; Joglar, J.; Lemaire, M.; Bujons, J.; Clapes, P. Engineering the Donor Selectivity of D-Fructose-6-Phosphate Aldolase for Biocatalytic Asymmetrie Cross-Aldol Additions of Glycolaldehyde. Chemistry 2014, 20 (39), 12572-12583, im Falle der D-Fruktose-6-Phosphat-Aldolase aus Escherichia coli (Ec.FsaA) bereits die in vitro Katalyse der reversiblen enzymatischen Homo-Aldoladdition von Glykolaldehyd zu D-Threose gezeigt werden. Darüber hinaus war bekannt, dass die mutierte Variante Ec.FsaA L107Y:A129G (Ec.FsaATA) eine im Vergleich zum Wildtyp um drei Größenordnungen erhöhte Aktivität für die Erzeugung von D-Threose besitzt. Daher konnte dieses mutierte Enzym vorteilhafterweise in dem oben genannten Stoffwechselweg angewendet werden. Darüber hinaus wurde auch die mutierte Malat-Dehydrogenase Ec.Mdh5Q, erhalten durch die Einführung von 5 Punktmutationen in dem L-Malat-Dehydrogenaseenzym von E. coli (Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D), in der Druckschrift Frazäo, C. J. R.; Topham, C. M.; Malbert, Y.; Frangois, J. M.; Walther, T. Rational Engineering of a Malate Dehydrogenase for Microbial Production of 2,4-Dihydroxybutyric Acid via Homoserine Pathway. Biochem. J. 2018, 475 (23), 3887-3901, als hochaktiv beschrieben. Daher konnte dieses Enzym als OHB-Reduktase ausgewählt werden, um den letzten Umwandlungsschritt des DHB- Syntheseweges zu katalysieren.
Es konnte mittels Hinweisen aus der Literatur auch ein Enzym ermittelt werden, welches unter anderem auch D-Threono-1 ,4-Lactonaseaktivität aufwies. Westlake, A. Thermostable Enzymes Important For Industrial Biotechnology. Datum: 10 June 2019, berichtete, dass die Gluconolactonase aus Thermogutta terrifontis, hier abgekürzt als Tt.LacH , auf einer großen Vielzahl von Laktonen aktiv ist. Die Enzyme wurden auch als aktiv auf D- Threono-1 ,4-Lacton beschrieben, wenngleich nur von einer niedrigen Reaktionsgeschwindigkeit berichtet wurde. Die kinetischen Eigenschaften wurden durch die Erfinder neu analysiert und es wurden dabei überraschenderweise vergleichbare katalytische Aktivitäten sowohl für das natürliche Substrat L-Fucono-1 ,4-Lacton als auch für D-Threono-1 , 4-Lacton ermittelt. Da das Enzym eine hohe Affinität zum D-Threono-1 ,4-Lacton (Km = 2,92 mM) aufweist, ist es für den erfindungsgemäß angewendeten Stoffwechselweg geeignet.
Es sind mehrere Enzyme bekannt, die eine NAD-abhängige Oxidation von Ethylenglycol zu Glykolaldehyd katalysieren. Dazu gehören die 1 ,2- Propandioldehydrogenase aus E. coli (Ec. FucO), siehe Boronat, A.; Caballero, E.; Aguilar, J. Experimental Evolution of a Metabolie Pathway for Ethylene Glycol Utilization by Escherichia Coli. J. Bacteriol. 1983, 153 (1), 134-139, sowie die Alcoholdehydrogenase GOX0313 aus Gluconobacter oxidans (Go.Adh), siehe Zhang, X.; Zhang, B.; Lin, J.; Wei, D. Oxidation of Ethylene Glycol to Glycolaldehyde Using a Highly Selectivealcohol Dehydrogenase from Gluconobacter Oxydans. J. Mol. Catalysis B 2015, 112, 69-75. Weiterhin ist bekannt, dass durch die Mutation der Ec. FucO in den Positionen IleßLeu und Leu7Val eine höhere Sauerstoffresistenz des resultierenden Enzyms (Ec. FucO I6LL7V) erreicht werden kann, siehe Lu, Z.; Cabiscol, E.; Obradors, N.; Tamarit, J.; Ros, J.; Aguilar, J.; Lin, E. C. Evolution of an Escherichia Coli Protein with Increased Resistance to Oxidative Stress. J. Biol. Chem. 1998, 273 (14), 8308-8316. Das resultierende Enzym ist auch unter der Bezeichnung Ec.FucO°R bekannt, wobei OR die Abkürzung für sauerstoffresistent (engl. „oxygen resistant“) ist.
Als Enzyme mit L-Homoserin-Transaminase-Aktivität für den Schritt (XII) der enzymatischen Umwandlung von 2-Keto-4-Hydroxybutyrat in L-Homoserin sind Aspartat-Aminotransferase aus E. coli (Ec.AspC) und Glutamat-Pyruvat- Aminotransferase der mutierten Variante Ec.AlaC A142P:Y275D, siehe Bouzon, M.; Perret, A.; Loreau, O.; Delmas, V.; Perchat, N.; Weissenbach, J.; Taran, F.; Marliere, P. A Synthetic Alternative to Canonical One-Carbon Metabolism. ACS Synth Biol 2017, 6 (8), 1520-1533, bekannt. Enzyme mit L- Homoserin-Kinase-Aktivität für den Schritt (XIII) der Umwandlung von L- Homoserin in O-Phospho-L-Homoserin sind ebenfalls bekannt, insbesondere Homoserin-Kinase aus E. coli (EcThrB). Threonin-Synthase aus E. coli (Ec.ThrC) weist L-Threonin-Synthase-Aktivität für den Schritt (XIV) der enzymatischen Umwandlung von O-Phospho-L-Homoserin zu L-Threonin auf.
Von den oben genannten und in Fig. 1 dargestellten Enzymaktivitäten des schematisch dargestellten Stoffwechselweges waren solche mit D-Threose- Dehydrogenase-Aktivität (IX) und D-Threonat-Dehydratase-Aktivität (XI) bisher noch nicht beschrieben worden. Durch Screening einer Auswahl an Kandidaten- Enzymen konnten aber derartige Aktivitäten identifiziert werden.
Zu den verwendeten Materialien und Methoden ist Folgendes zu bemerken:
Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden von der Firma Sigma-Aldrich erworben, soweit keine anderen Firmen genannt sind. Die Restriktionsendonukleasen und die DNA-modifizierenden Enzyme wurden von der Firma New England Biolabs (NEB) erworben und entsprechend der Herstelleranweisungen angewendet. Die DNA-Plasmid-Isolation wurde mittels Monarch®-Plasmid-Miniprep-Kit der Firma NEB durchgeführt. Die DNA- Extraktion aus dem Agarose-Gel und die Reinigung des Produkts der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einer Methode, um Erbsubstanz (DNA) in vitro zu vervielfältigen, erfolgte mittels Monarch®-DNA-Gel-Extraktions-Kit der Firma NEB. Eine DNA-Sequenzierung wurde durch die Firma Eurofins SAS (Ebersberg, Deutschland) durchgeführt.
Alle Plasmide und Wirtsstämme, die konstruiert wurden und für die Untersuchungen eingesetzt wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Primer sind in Tabelle 2 und in Tabelle 12 aufgelistet.
Tabelle 1: Verwendete Stämme und Plasmide
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Tabelle 2: Sequenzen der verwendeten Primer
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In Tabelle 2 sind in den Primersequenzen die Restriktionsstellen unterstrichen, die Codierungsstart-Zstopsequenzen sind fett und die RBS-Sequenzen kursiv gekennzeichnet. Die Plasmide pEXT20-Ec.fucO, pEXT20-Ec.fucO/6L:L7V und pEXT20-Go.adh wurden durch PCR-Amplifizierung des Ec.fucO Wildtyps, Ec. fucO/6L.L7V und des codonoptimierten Go. adh Gens jeweils unter Anwendung der Primerpaare 224/223, 222/223 beziehungsweise 315/226 konstruiert. Genomische DNA von Escherichia coli MG1655 und synthetische Gene dienten jeweils als Template-DNA für von Ec.fucO abgeleitete Gene und Go. gox0313. Alle Primer brachten bestimmte Restriktionsstellen ein, die die jeweiligen Gene flankierten. Zusätzlich brachten die Primer eine Ribosom- Bindungssequenz (RBS) unmittelbar vor der Codierungssequenz ein.
Escherichia coli K-12 substr. MG1655 AyqhD AaldA wurde als Ausgangsstamm für die Konstruktion von Threonin-produzierenden Stämmen verwendet. Die Expression der endogenen thrBC- und rhtB-Gene wurde konstitutiv gemacht, indem die native chromosomale 5'-UTR jedes Operons oder Gens durch den synthetischen konstitutiven und isolierten Promotor proD Davis, J. H.; Rubin, A. J.; Sauer, R. T: Design, construction and characterization of a set of insulated bacterial promoters. In: Nucleic Acid Res., 2011, 3, S. 1131-1141 ersetzt wurde. Der proD-Sequenz wurde eine Chloramphenicol- Resistenzkassette (FRT-cat-FRT-PproD) vorangestellt, deren Elemente zunächst aus den Plasmiden pTOPO-proD und pKD3 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Primern amplifiziert wurden. Die PCR-Produkte wurden mit Dpnl verdaut, gereinigt und durch Fusions-PCR unter Verwendung von Primern zusammengesetzt, die eine Homologie von etwa 50 bp zur flankierenden Region des genomischen Ziellocus aufwiesen. Das resultierende DNA- Fragment wurde in die jeweiligen Zielstämme transformiert, welche die X-Red- Rekombinase aus dem pKD46-Plasmid exprimierten, um so den natürlichen Genpromotor in diesen Stämmen zu ersetzen. Chloramphenicol-resistente Klone wurden auf LB-Agarplatten, die mit dem Antibiotikum angereichert waren, selektiert und durch PCR-Analyse bestätigt (Primer siehe Tabelle 2), dass sie die entsprechende Insertgröße enthielten. Die integrierten Promotorsequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung auf ihre korrekte Sequenzierung überprüft. Die cat-Kassette wurde aus dem Genom entfernt, indem FLP-Rekombinase aus dem pCP20-Plasmid Cherepanov P. P.; Wackernagel, W.: Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. In: Gene, 1995, 158(1), S. 9-14 exprim iert wurde, und die korrekte Exzision der Kassette wurde durch PCR unter Verwendung lokusspezifischer Primer (Tabelle 2) überprüft. Die Plasmide wurden mit Hilfe von Standardprotokollen in die Ziel-E.-co//-Stämme transformiert.
Das High-Copy-Plasmid pEXT20 wurde unter Anwendung des Primerpaars 209/284 amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mit Xhol/Xbal- Restriktionsenzymen verdaut und unter Anwendung von T4-DNA-Ligase (Firma NEB) in das Vektorrückgrat ligiert.
Die Plasmide pEXT20-Ec.fsaA und pEXT20-Ec.fsaATA wurden durch Amplifizierung des Ec.feaA-l/l/ildtyps und Ec.fsaAL107Y:A129G-Ger\e unter Anwendung des Primerpaars 326/327 konstruiert. Die genomische DNA von Escherichia coli MG1655 und synthetische Gene dienten jeweils als TemplateDNA. Die resultierenden PCR-Produkte und der pEXT20-Expressionsvektor wurden mit BamHI/Xbal verdaut und ligiert. Das Plasmid Ec.fsaATA-Pc.tadH wurde durch PCR-Amplifizierung von Ec-fsaA. L107Y:A129G und des codonoptimierten synthetischen Pc.tadH-Gens jeweils unter Anwendung der Primerpaare 326/328 und 303/304 konstruiert. Die resultierenden PCR- Produkte wurden jeweils mit BamHI/Swal- and Swal/Xbai-Restriktionsenzymen verdaut und in den mit BamHI/Xbal verdauten pEXT20-Vektor ligiert.
Eine ähnliche Verfahrensweise erfolgte für die Konstruktion von pACT3- Ec.fsaATA-Pc.tadH, in welcher jedoch das Medium-Copy-Plasmid pACT3 als Rückgrat diente. Das Plasmid pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11 wurde durch Amplifizierung des codonoptimierten synthetischen Tt.lac11-Gens unter Anwendung des Primerpaars 438/439 konstruiert. Das PCR-Produkt und der pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Vektor wurden dann mit Xbal/Sall- Restriktionsenzymen verdaut und ligiert. Kürzere Versionen von Tt.thte1497op- Genen, bei denen die Signalsequenz für den periplasmatischen Export am N- Terminus (1 : 115-1 ,068 nt; 2: 154-1 ,068 nt) fehlt, wurden ebenfalls mit PCR amplifiziert.
Für die Konstruktion der Plasmide pACT3-Ec.fsaATA-Aa.tadH-Tt.lac11v1 , pACT3-Ec.fsaATA-Xc.fdh-Tt. lad 1 v1 und pACT3-Ec.fsaATA-Ppi.tadH-Tt. lad 1 v1 die Gene Aa.tadH, Xc.fdh und Ppi.tadH mit Hilfe der Primerpaare 667/668, 671/672 beziehungsweise 716/717 PCR-amplifiziert. Dabei dienten genomische DNAs der Stämme A. avenae DSM7227, X. campestris DSM3586 sowie ein synthetisches Gen für Ppi.tadH als Template. Die resultierenden PCR-Produkte sowie der Vektor pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11v1 wurden mit Swal / Xbal verdaut und anschließend ligiert.
Für die Konstruktion des Plasmids pACT3-Go.adh-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11v1 wurden die Gene Go. adh, Ec.fsaATA, Pc.tadH und Tt.lac11v1 mit Hilfe der Primerpaare 313/314, 326/328, 303/304 und 600/439 amplifiziert. Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit Kpnl/BamHI, Bamhl/Swal, Swal/Xbal beziehungsweise Xbal/Sall, verdaut und in den Kpnl/Sall verdauten pACT3- Vector ligiert.
Das Plasmid pEXT22-Ec.mdh5Q wurde durch PCR-Amplifizierung des OHB- Reduktase codierenden Gens Ec.mdh5Q (synthetisches Gen) unter Anwendung des Primerpaars 305/258 konstruiert. Das resultierende PCR-Produkt und der Low-Copy-Vektor pEXT22 wurden dann mit Sacl/Bamhl verdaut und ligiert.
Das Plasmid pEXT22-Ec.mdh^Q wurde durch PCR-Amplifizierung des OHB- Reduktase codierenden Gens Ec. mdh7Q erzeugt durch Mutation von Ec.mdh5Q wie nachfolgend beschrieben, unter Anwendung des Primerpaars 305/258 konstruiert. Als Template DNA diente das Plasmid pET28-Ec.mdh7Q. Das resultierende PCR-Produkt und der Low-Copy-Vektor pEXT22 wurden dann mit Sacl/Bamhl verdaut und ligiert.
Die Plasmide pEXT22-Ec.mdh5Q-Aa.araD, pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD und pEXT22-Ec.mdh7Q-Hh.araD wurden durch Amplifizierung von Aa. araD- and Hh.araD-Genen jeweils unter Anwendung der Primerpaare 551/552 and 553/554 konstruiert. Genom ische DNA von Acidovorax avenae DSM7227 und Herbaspirillum huttiense DSM10281 wurden als die jeweiligen Template-DNAs verwendet. Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit BamHI/Xbal verdaut und einzeln in die entsprechenden Stellen in die mit BamHI/Xbal verdauten Vektoren pEXT22-Ec.mdh5Q oder pEXT22-Ec.mdh7Q ligiert. Das Plasmid pEXT21-Re.kdgT wurde durch Amplifizierung des Re.kc/gT-Gens aus der genomischen DNA von Cupriavidus necator H16 DSM428 unter Anwendung des Primerpaars 454/455 konstruiert. Das PCR-Produkt und das pEXT21- Vektor-Rückgrat wurden mit BamHI/Hindlll-Restriktionsenzymen verdaut und ligiert.
Für die Konstruktion des Plasmids pEXT22-Ec.aspC-Hh.araD wurden zunächst die Gene Ec.aspC und Hh.araD mit den Primerpaaren 805/806 bzw. 553/554 PCR-amplifiziert. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Genomische DNA von E. coli MG1655 und Herbaspirillum huttiense DSM10281 wurden als entsprechende Templates verwendet. Die resultierenden PCR- Produkte wurden mit Sacl / BamHI bzw. BamHI / Xbal verdaut und einzeln in die entsprechenden Stellen im mit Sacl / Xbal verdauten Vektor pEXT22 ligiert.
Das Plasmid pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araDC434S wurde durch inverse PCR auf dem Template pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD konstruiert, welche eine Mutation von Cystein zu Serin in Position 434 unter Nutzung des Primerpaars 718/719 erzeugte. Für die Konstruktion der Plasmide pEXT22-Ec.mdh5Q-Ca.araD und pEXT22-Ec.mdh5Q-Pm.araD die Gene Ca.araD und Pm.araD unter Nutzung der Primerpaare 724/725 beziehungsweise 732/733 PCR-amplifiziert. Die genomischen DNAs von Clostridium acetobutylicum DSM1731 und Paraburkholderia mimosarum DSM21841 dienten dabei als Template. Die resultierenden PCR-Produkte und das Plasmid pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD wurden mit BamHI / Xbal verdaut, aufgereinigt und ligiert.
Alle resultierenden Konstruktionen wurden in chemisch kompetente E. coli- Zellen (DH5a, NEB) überführt und durch DNA-Sequenzierung hinsichtlich des korrekten Einbaus der Zielgene verifiziert. Die Plasmide wurden dann in den jeweils als Produktionsstamm ausgewählten E. coli -Stamm unter Anwendung von Standardverfahren, wie aus Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Mol. cloning a Lab. manual. 1989, No. Ed. 2 bekannt, transformiert.
Im Folgenden werden die enzymatischen Tests beschrieben:
Die Proteinkonzentrationen wurden vor den enzymatischen Tests (Assays) durch die Methode von Bradfort (Roti® -Quant, Roth) bestimmt. Soweit nicht anders beschrieben, wurden alle enzymatischen Tests 20 Minuten lang bei 37 °C in 96-Well-Mikrotiterplatten in einem Gesamtvolumen von 250 pL durchgeführt. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und die Werte für die Michaelis-Konstante (Km) wurden durch Anpassung der kinetischen Daten für mindestens fünf verschiedene Substratkonzentrationen an die Michaelis- Menten-Gleichung ermittelt. Die Anpassung erfolgte durch nicht-lineare Regression in Matlab® R2015a.
Aktivitätsbestimmunq der Ethylenqlycol-Dehydroqenase:
Die Enzymaktivität wurde in der oxidativen Richtung durch Messung der Reduktion von NAD+ bei 340 nm (s = 6.22 mM-1 cm-1 ) während der Oxidation von Ethylenglycol ermittelt. Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 100 mM Natriumglycin (pH 9.5), 0.5 mM NAD+ und entsprechende Mengen an gereinigtem Enzym oder vom Proteinrohextrakt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von entsprechenden Konzentrationen an Substrat gestartet. Eine Einheit U der Ethylenglycol-Dehydrogenase-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Umwandlung von 1.0 pmol of NAD+ pro Minute katalysiert.
Aktivitätsbestimmung der D-Threose-Aldolase:
Die Enzymaktivität wurde durch Kopplung der Homo-Aldoladdition von Glykolaldehyd mit der NAD-abhängigen Oxidation von D-Threose, katalysiert durch gereinigte D-Threo-Aldose-1 -Dehydrogenase aus Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH), bestimmt. Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 60 mM 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)- ethansulfonsäure (HEPES) mit pH 8, 10 mM NAD+, 100 μg mL-1 Hilfsenzym und geeigneten Mengen an gereinigtem Enzym oder vom Proteinrohextrakt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von entsprechenden Konzentrationen an Substrat gestartet. Eine Einheit U an D-Threose-Aldolase-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Umwandlung von 1.0 pmol von D-Threose pro Minute katalysiert.
Aktivitätsbestimmunq der Zucker-Dehydroqenase:
Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte in oxidativer Richtung durch die Messung der Reduktion von NAD(P)+ bei 340 nm während der Oxidation von Kandidaten-Zuckern. Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 50 mM HEPES (pH 8), 10 mM NAD(P)+ und geeigneten Mengen an gereinigtem Enzym oder vom Proteinrohextrakt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von (D)-Arabinose oder (D)- Threose (Carbosynth, UK) gestartet. Eine Einheit U der Zucker- Dehydrogenase-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Umwandlung von 1 ,0 pmol Zucker pro Minute katalysiert.
Aktivitätsbestimmunq der Lactonase:
Die Enzymaktivität erfolgte durch Messung der Konzentration von Protonen, die aus dem Carboxylatprodukt während der Hydrolyse von Lactonen freigesetzt werden, unter Anwendung des colorimetrischen pH-lndikators Bromthymolblau (s = 1 ,14 mM-1 cm-1 ) bei 616 nm. Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 2.5 mM HEPES (pH 7.1 ), 200 mM NaCI, 1 % (v/v) DMSO, 0.1 mM Bromothymolblau und geeignete Mengen an gereinigtem Enzym. Die Reaktion wurde durch Zugabe von verschiedenen Mengen von (L)- Fucono-1 ,4-Lacton oder (D)-Threono-1 ,4-Lacton gestartet. Eine Einheit U der Lactonase-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Hydrolyse von 1 ,0 pmol Lacton pro Minute katalysiert.
Aktivitätsbestimmung der Zuckersäure-Dehvdratase:
Die Enzymaktivität wurde durch Umwandlung des 2-Ketosäure- Reaktionsproduktes zu einem Semicarbazon bestimmt, dessen Konzentration bei 250 nm gemessen wurde. Eine Kalibrationskurve wurde unter Verwendung von Pyruvat als 2-Ketosäure aufgenommen (s = 2,24 mM-1 cm-1). Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 60 mM HEPES (pH 7,3), 50 mM KCl, 10 mM MgCI2 und geeignete Mengen an gereinigtem Enzym oder Proteinrohextrakt. Die 1-mL- Reaktion wurde durch Zugabe von verschiedenen Zuckersäuren (L-Fuconat, 2R-Dihydroxivalerat, D-Altronat, D- Tartrat, D-Arabinonat or D-Threonat) gestartet und bei 37 °C inkubiert. Aliquote von 200 μl wurden während der Reaktion nach 0, 10, 20 and 40 Minuten entnommen und mit 100 μl 2 M HCl versetzt. Die Proben wurden dann mit 300 pl Semicarbazid-Lösung (10 g*L-1 Semicarbazid-Hydrochlorid und 15 g*L-1 Natriumacetat) ergänzt und bei 30 °C für 10 Minuten inkubiert. Schließlich wurden 500 pL destilliertes Wasser zu dem derivatisierten Produkt hinzugefügt, wobei sofort die Absorption unter Nutzung einer Quarz-Küvette gemessen wurde. Eine Einheit U der Zuckersäure-Dehydratase-Aktivität (II) wurde als die Menge an Enzym definiert, die die Bildung von 1 ,0 μmol 2-Ketosäure pro Minute katalysiert.
Aktivitätsbestimmunq der D-Threonat-Dehydratase:
Die Enzymaktivität wurde durch Kopplung der Dehydration von D-Threonat mit der NADH-abhängigen Reduktion von 2-Keto-4-hydroxybutyrat (OHB) durch gereinigte OHB-Reduktase Ec.Mdh5Q, die aus der Druckschrift Frazäo, C. J. R.; Topham, C. M.; Malbert, Y.; Francois, J. M.; Walther, T. Rational Engineering of a Malate Dehydrogenase for Microbial Production of 2,4- Dihydroxybutyric Acid via Homoserine Pathway. Biochem. J. 2018, 475 (23), 3887-3901 bekannt ist, bestimmt. Das Reaktionsgemisch enthielt 60 mM HEPES (pH 7,3), 50 mM KCl, 10 mM MgCI2, 0,25 mM NADH, 100 μg mL-
1 Hilfsenzym und geeignete Mengen an gereinigtem Enzym. Die Reaktion wurde durch die Zugabe verschiedener Mengen an Substrat gestartet. Eine Einheit U der D-Threonat-Dehydrataseaktivität wurde als die Menge an Enzym definiert, die die Bildung von 1.0 μmol OHB pro Minute katalysiert.
Kandidatenenzyme, die hinsichtlich einer D-Threose-Dehydrogenase oder D- Threonat-Dehydratase-Aktivität getestet wurden, sind in der Tabelle 3 aufgelistet.
Aktivitätsbestimmunq der OHB-Reduktase:
Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte in reduktiver Richtung durch die Messung der Oxydation von NAD(P)H bei 340 nm während der Reduktion von OHB zu DHB. Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 60 mM HEPES (pH 7), 5 mM MgCI2, 50 mM KCl, 0.25 mM NADH oder NADPH,
2 mM OHB und geeignete Mengen an gereinigtem Enzym. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von OHB gestartet. Eine Einheit U der OHB- Reduktase-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Umwandlung von 1 ,0 pmol NAD(P)H pro Minute katalysiert. Zur Bestimmung der Km-Werte für die Kofaktoren und für OHB wurde die Anfangskonzentration des einen Substrats geeignet variiert, während die Anfangskonzentration des anderen Substrats konstant gehalten wurde.
Tabelle 3: Getestete Kandidatenenzyme für D-Threose-Dehydrogenase- und D-Threonat-Dehydratase-Aktivität
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Ebenso ist in Tabelle 3 angegeben, ob eine Codonoptimierung durchgeführt wurde. Im Folgenden werden die Klonierung, Expression und Aufreinigung von Kandidatenenzymen beschrieben:
Die entsprechenden kodierenden Gene wurden durch PCR amplifiziert und in die entsprechenden Stellen des Expessionsvektors pET28a (Firma Novagen) unter Anwendung der in Tabelle 4 aufgeführten Klonierungstechniken und Primer-Paare kloniert, wobei ein N-terminaler Hexa-His-Tag an der Zielsequenz angebracht wurde. Die resultierenden Plasmide wurden in kompetente E. coli DH5a Zellen (NEB) transformiert. Die korrekte Insertion wurde durch Isolation der Plasmide und DNA-Sequenzierung verifiziert, bevor die so erhaltenen Plasmide in den Expressionsstamm E. coli BL21 (DE3) (NEB) transformiert wurden. Die Proteine wurden je nach Eignung in 50 mL LB-Medium oder in Autoinduktionsmedium (Studier F.W./2005/Prot Expr Purif/41/207-234/Protein production by auto-induction in high density shaking cultures) exprimiert. Nach einer ausreichenden Inkubationszeit wurden die Zellen durch Zentrifugation, die 15 Minuten lang bei 1700 x g und 4 °C erfolgte, vom Medium getrennt. Die so erhaltenen Zellpellets wurden bei - 20 °C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt. Die Aufreinigung der Enzyme erfolgte durch Aufnahme der Zellpellets in 1 mL HEPES-Puffer (50 mM, pH 7) und anschließender Ultraschallbehandlung in vier Intervallen von je 20 s (UDS 751 , Topas GmbH, Leistung 40 %). Zelltrümmer wurden durch 15 min Zentrifugation bei 13000 x g und 4 °C sowie die nachfolgende Überführung des klaren Überstands in ein neues Reaktionsgefäß abgetrennt. Die Zielproteine wurden aus dem so erhaltenen Proteinrohextrakt mit Affinitätschromatographie entsprechend der Herstellerangaben des Kobalt-Resins (Talon) aufgereinigt. Die aufgereinigten Enzyme wurden anschließend hinsichtlich ihrer Aktivität auf dem natürlichen Substrat (Positivkontrolle) und dem Zielsubstrat charakterisiert. Die Proteinreinigung wurden ausgehend von den gefrorenen Zellkügelchen durchgeführt.
Tabelle 4: Primersequenzen, Techniken und verwendete Restriktionsschnittstellen für die Klonierung der Zielgene in den pET28- Expressionsvektor
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Die Identifizierung von Enzymen mit D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität wurde folgendermaßen durchgeführt: Zur Identifikation von D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität wurden die Enzyme D-Threo-Aldose-1 -Dehydrogenase aus Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH), D-Arabinose-Dehydrogenasen aus Saccharomyces cerevisiae, Sc.Aral und Sc.Ara2, Scy//o-lnositol-2-Dehydrogenase aus Paracoccus laeviglucosivorans (PI.LgdA), D-Threo-Aldose-1 -Dehydrogenase aus Pseudomonas sp. 1143 (Ps.Fdh), D-Arabinose-Dehydrogenase aus Sulfolobus solfataricus (Ss.Adh4) und L-Fucose-Dehydrogenase aus Burkholderia multivorans (Bm.BmulJ04919), hier als Bm.Fdh bezeichnet, aus genomischer DNA unter Nutzung der in Tabelle 4 gelisteten Primer aus genomischer DNA oder ausgehend von synthetischen Genen (siehe Tabelle 3) amplifiziert. Die Klonierung in den Expressionsvektor pET28a erfolgte unter Anwendung der in Tabelle 4 präzisierten Methoden. In Tabelle 4 sind die Restriktionsstellen unterstrichen, die Kodierungsstart-/Stop-Sequenzen sind Fett gekennzeichnet. Die Fig. 2 zeigt schematisch die Ergebnisse des Screenings der Kandidaten- Enzymen für NAD(P)-abhängige D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität in Form eines Säulendiagramms. Für das Screening wurden Substratkonzentrationen von 10 mM Co-Faktor und Zucker eingestellt. Bei fehlender Aktivität wurden die Enzyme in Fig. 2 mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Die Enzymaktivitäten werden auf einer logarithmischen Skala im Säulendiagramm dargestellt. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von mindestens zwei unabhängigen biologischen Experimenten. Die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung vom Mittelwert. Die genauen Werte sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Tabelle 5 zeigt die spezifischen Aktivitäten des N-His-getaggten, als D-Threose- Dehydrogenase in Frage kommenden Enzyms, ausgedrückt in U pro mg des gereinigten Enzyms, welches mit einer fest eingestellten Menge (10 mM) der Substrate, D-Arabinose oder D-Threose, und der Co-Faktoren, NAD+ oder NADP+, gemessen wurde. Die Abkürzung “n.d.” ist gleichbedeutend mit “nicht detektiert”.
Tabelle 5: Dehydrogenase-Aktivität von Kandidatenenzymen auf D- Arabinose und D-Threose
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Von insgesamt sieben Kandidaten-Enzymen zeigten Sc.Aral , Pc.TadH und Bm.Fdh eine messbare Aktivität auf D-Threose mit einer der Co-Faktoren NAD+ oder NADP+, was auch aus der Fig. 2 und Tabelle 5 hervorgeht. Da Pc.TadH mit 0,27 U* mg'1 die höchste spezifische Aktivität zeigte, wurden mit diesem Enzym weitere kinetische Analysen durchgeführt. Dabei wurde ein Km-Wert von 26,63 mM für das Substrat D-Threose ermittelt. Da Pc.TadH die höchste Aktivität auf D-Threose hatte und eine deutliche Expression in E. coli aufwies, wurde dieses Enzym für die Konstruktion des Stoffwechselweges zur Synthese bevorzugt.
Die Identifizierung von Enzymen mit D-Threonat-Dehydratase-Aktivität war, wie sich zeigte, mit Hilfe von in vitro Tests möglich, deren Ergebnisse im Folgenden beschrieben werden. Während Dehydratase-Enzyme mit Aktiviät auf L- Threonat, wie bereits erwähnt, hinlänglich bekannt sind, wurden derartige Enzymaktivitäten auf dem entsprechenden D-Stereoisomer bisher nicht berichtet. In Analogie zu der Strategie, die für die Demonstration der D- Threose-Dehydrogenase-Aktivitäten angewendet wurden, wurden daher Kandidatenenzyme mit bekannten Aktivitäten auf Zuckersäuren mit (2S,3R)- Konfiguration ausgewählt. Die Auswahl der Kandidatenenzyme schloss dabei die L-Fuconat-Dehydratasen aus Xanthomonas campestris (Xc.FucD) und Pseudomonas putida (Pp.FucD), D-Arabinonat-Dehydratasen aus Acidovorax avenae (Aa.AraD) und Herbaspirillum huttiense (Hh.AraD), D-Tartrat- Dehydratase aus Bradyrhizobium japonicum (Bj.TarD) und D-Altronat- Dehydratase aus Escherichia coli (Ec.UxaA) ein. Zusätzlich wurden D- Hydroxysäuren-Dehydratasen aus E. coli (Ec.llvD) und Sulfolobus solfataricus (Ss.llvD) in die Untersuchungen einbezogen. Die entsprechenden Gene wurden mittels der in den Tabellen 3 und 4 beschriebenen Primer und Techniken in den pET28a Vektor kloniert. Nach Expression und Reinigung der Enzyme entsprechend der oben beschriebenen Methoden wurden diese hinsichtlich ihrer Aktivität auf D-Threonat und anderer Zuckersäuren wie oben beschrieben überprüft. Die Fig. 3 zeigt ein Säulendiagramm mit den Ergebnissen des Screenings der genannten Kandidaten-Enzyme für D-Threonat-Dehydratase-Aktivität. Alle gereinigten Kandidaten-Enzyme wurden an D-Threonat und dem entsprechenden natürlichen Substrat unter Anwendung des genannten Semicarbazid-Tests, welcher 2-Keto-Säuren erkennt, überprüft. Die Substratkonzentrationen wurden mit 10 mM eingestellt, außer für Aa.AraD und Hh.AraD, wo 1 mM natürliches Substrat angewendet wurde. Bei fehlender Aktivität sind die Enzyme mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Die Enzymaktivitäten sind auf einer logarithmierten Skala im Säulendiagramm dargestellt. Die genauen Werte der Aktivitäten sind in der Tabelle 6 dargestellt.
Die Tabelle 6 zeigt die spezifischen Aktivitäten der getesteten N-His-getaggten Enzyme. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+/- Standardabweichung) von mindestens zwei biologischen Replikaten angegeben. Die Abkürzung “n.d.” ist gleichbedeutend mit “nicht detektiert”. Tabelle 6: Aktivität verschiedener Dehydratasen auf D-Threonat und ihren natürlichen Substraten
Figure imgf000044_0001
Unter den getesteten Enzymen zeigten Hh.Arad und Aa.AraD eine signifikante Aktivität auf D-Threonat, wobei sie spezifische Aktivitäten von 0.30 U mg- 1 beziehungsweise 0.18 U mg-1 aufwiesen, wie aus Tabelle 6 und Fig. 3 hervorgeht.
Im Folgenden wird die Konstruktion einer Variante der Threono-1 ,4-Lactonase Tt.Lac11 aus T. terrifontis mit verbesserter Expression in E. coli beschrieben. Die Lactonase Tt.Lac11 aus T. terrifontis ließ sich in E. coli nur sehr schwer exprimieren, was eine geringe Ausbeute an aufgereinigtem Enzym für die kinetische Charakterisierung zur Folge hatte, und eine geringe Aktivität dieses Enzymes im Produktionsstamm erwarten ließ. Durch eine Analyse der Aminosäuresequenz der Lactonase wurde eine N-terminale Signalsequenz identifiziert, welche den Export des Enzyms ins Periplasma bewirken könnte. Um die zytosolische Expression von Tt.Lac11 zu verbessern, wurden N-terminal verkürzte Varianten dieses Proteins hergestellt und hinsichtlich ihrer Exprimierbarkeit in E. coli getestet. Es konnte gezeigt werden, dass unter Verwendung einer um 38 Aminosäuren verkürzten Variante des Enzyms (A1- 38) eine um den Faktor 34 erhöhte Expression erzielt werden kann, wie aus Tabelle 7 hervorgeht. Diese Variante wird im Folgenden mit Tt.Lac11v1 bezeichnet, während eine um 51 Aminosäuren verkürzte Variante mit Tt.Lac11v2 und eine um 76 Aminosäuren verkürzte Variante mit Tt.Lac11v3 bezeichnet wird. Die Tabelle 7 zeigt Erträge und Aktivitäten von verkürzten Varianten der Poly-His-getaggten Tt. Lad 1 -Lactonase bei Expression mit pET28 in E. coli BL21 (DE3). Die Resultate entsprechen Mittelwert und Standardabweichung aus zwei unabhängigen biologischen Replikaten.
Tabelle 7: Erträge und Aktivitäten von verkürzten Varianten der Poly-His- getaggten Tt. Lad 1 -Lactonase bei Expression mit pET28 in E. coli BL21(DE3)
Figure imgf000046_0001
Die Biosynthese von DHB aus Glykolaldehyd wurde durch die simultane Expression des gesamten Stoffwechselwegs in einem Produktionsstamm demonstriert. Dafür wurde in allen Experimenten der Ausgangsstamm E. coli TW64 (MG1655 LyqhD LaldA) verwendet und mit Plasmiden transformiert, welche die Expression des synthetischen Stoffwechselwegs entweder ganz oder in Teilen gewährleisteten. Die Zellen wurden in 250 mL Schüttelkolben auf Mineralsalzmedium, welches mit 10 % (v/v) LB Medium komplementiert wurde, bei 37 °C und 220 rpm in einem Inkubator (Infors) kultiviert. IPTG (0,5 mM) wurde zugegeben, nachdem die Kulturen einen OD600-Wert von zirka 0,6 erreichten. Glykolaldehyd (20 mM) wurde zu den Kulturen gegeben, als der OD600-Wert der Kulturen zirka 2,0 betrug. Die Inkubationszeit war 48 Stunden. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert (+/-Standardabweichung) von mindestens zwei biologischen Replikaten dargestellt. Die Konzentrationen von DHB sowie der Stoffwechselzwischenprodukte und Glykolaldehyd wurden auf einem HPLC- System (K-2600, Knaur), welches mit einem UV-Vis-Detektor (HP 1047A, Hewlett-Packard, USA) ausgerüstet war, bestimmt. Das Injektionsvolumen betrug 20 pL und die Substanzen wurden auf einer Rezex RoA-organic acid H+ Säule, ausgestattet mit einer SecurityGuard cartrige (Phenomenex, USA), unter Nutzung von 0.5 mM H2SO4 als Laufmittel bei einer Flussrate von 0,5 mL/min aufgetrennt. Die Bestimmung von D-Glukose, D-Threose, Glykolaldehyd, D- Threonat und Acetat erfolgte bei 35 °C, während DHB und Ethylenglycol bei
80 °C gemessen wurden. Da D-Threonolacton und D-Threonat mit dieser Methode nicht aufgelöst werden können, werden die Konzentrationen dieser Metabolite als gepoolte Werte für „D-Threonat/Lacton“ angegeben. Die Ergebnisse der Versuche einer Biokonversion von Glykolaldehyd (GA) zu DHB sind in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8: Ergebnisse der Biokonversion von 20 mM Glykolaldehyd zu
DHB
Figure imgf000047_0001
In Stamm TW293 wurden alle Enzymaktivitäten exprimiert, die entsprechend des vorgeschlagenen Stoffwechselwegs notwendig sind, um Glykolaldehyd zu DHB umzuwandeln. Überraschenderweise konnten nach 48 Stunden Kultivierung zwar die Zwischenstufen D-Threose und D-Threonat/Lacton nachgewiesen werden, aber kein DHB (Tabelle 8).
Da die Lactonase Tt-Lac11 eine Signalsequenz aufweist, die den Transport dieses Enzyms ins Periplasma bewirken könnte, wurde vermutet, dass die Ringspaltung des Lactons zu Threonat im Periplasma stattfindet und somit ein Re-Import des resultierenden D-Threonat notwendig wird. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde zusätzlich zu allen Enzymen des Stoffwechselwegs die D- Threonat-im portierende Permease (Re.kdgT) aus Cupriavidus necator in Stamm TW304 exprimiert. Tatsächlich konnten mit diesem Stamm 0,08 mM DHB aus Glykolaldehyd produziert werden. Damit wird der Beweis für die Funktion des vorgeschlagenen Stoffwechselwegs gemäß Fig. 1 erbracht.
Um die Notwendigkeit eines Exports oder eines Imports von Stoffwechselzwischenprodukten zu beseitigen, wurden drei gekürzte Formen von TtLac11 erzeugt, von denen unterschiedlich lange Abschnitte ihrer N- terminalen Sequenzen entfernt wurden (Tabelle 7). Die Lactonase-Variante Tt.Lac11vi (A1-38 aa) zeigte eine 34-fach verbesserte Expression in E. coli und eine zehnfach verbesserte spezifische Aktivität von D-Threono-1 ,4-Lacton. Daher wurde dieses Konstrukt ausgewählt, um in diesem Ausführungsbeispiel die erforderliche zytoplasmatische Lactonaseaktivität im Syntheseweg bereitzustellen. Der Stamm (TW354), der die verbesserte Lactonase exprimierte, war in der Lage, 0.16 mM DHB zu akkumulieren.
Identifizierung von Enzymen mit D-Threose-Dehydroqenase-Aktivität mit Hilfe von Ganzzell-Biotransformationen von Glykolaldehyd zu DHB
Im vorangegangenen Ausführungsbeispiel wurde gezeigt, dass es mit Hilfe des vorgeschlagenen Stoffwechselwegs möglich ist, Glykolaldehyd zu DHB in einer Ganzzell-Biotransformation umzuwandeln. Die Expression von alternativen Kandidatenenzymen für einzelne Reaktionsschritte im beschriebenen Stoffwechselweg und die gleichzeitige Messung der daraus resultierenden DHB-Konzentration kann daher dazu dienen, zusätzliche oder besser geeignete Enzyme mit den gewünschten Aktivitäten zu identifizieren. Entsprechend dieser Strategie wurde zunächst ein Stamm konstruiert, der keine D-Threose- Dehydrogenase exprimiert, ansonsten aber den gesamten Stoffwechselweg einschließlich der Threonat-Permease enthält. Darüber hinaus wurden die Stämme TW 354, TW444, TW445 und TW446 konstruiert, die zusätzlich verschiedene Kandidatenenzyme für die D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität exprimierten. Die Stämme wurden wie im oben beschriebenen Ausführungsbeispiel kultiviert und die Konzentrationen von DHB und anderer Zwischenprodukte nach 48 Stunden Inkubation gemessen.
Erwartungsgemäß war der Stamm E. coli TW559 ohne D-Threose- Dehydrogenase nicht in der Lage, die aus Glykolaldehyd synthetisierte D- Threose zu DHB oder den Stoffwechselprodukten D-Threonat/Lacton umzuwandeln, wie die in Tabelle 9 dargestellten Ergebnisse zeigen. Wenn zusätzlich die Kandidatenenzyme Pc.TadH, Xc.Fdh oder Aa.TadH exprimiert wurden, konnte die Produktion von DHB nachgewiesen werden, womit gezeigt wurde, dass diese Enzyme eine D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen. Im Gegensatz dazu konnte bei Expression der Ppi.TadH kein DHB gemessen werden, wodurch gezeigt wurde, dass dieses Enzym entweder keine D- Threose-Dehydrogenase-Aktivität aufweist, oder sich nicht ausreichend in E. coli exprimieren lässt.
Tabelle 9: Ergebnisse der Biokonversion von 10 mM Glykolaldehyd zu DHB in Abhängigkeit der variierten Kandidatenenzyme für D-Threose- Dehydrogenase-Aktivität
Figure imgf000049_0001
(*) Die in Klammern gezeigten Werte entsprechen den Konzentrationen dieser Stoffe nach 24 h
Identifizierung von Enzymen mit D-Threonat-Dehydratase-Aktivität mit Hilfe von Ganzzell-Biotransformationen von Glykolaldehyd zu DHB
Ähnlich wie im vorangegangenen Beispiel ist die Identifizierung von D- Threonat-Dehydratasen durch die Quantifizierung der DHB-Bildung auf Glykolaldehyd nach Austausch der Hh.AraD mit anderen Kandidatenenzymen im Produktionsstamm möglich. Ein weiteres Kriterium für die Identifizierung verbesserter D-Threonat-Dehydratasen ist die Geschwindigkeit des D- Threonatabbaus. Entsprechend dieser Strategie wurden die Mutante Hh.AraD C434S, die Ca.AraD und das Enzym Pm.AraD anstelle der bisher genutzten Hh.AraD in den Produktionsstämmen TW452, TW453 beziehungsweise TW454 exprimiert und hinsichtlich ihres Einflusses auf die Geschwindigkeiten des Threonatabbaus und der DHB-Bildung untersucht. Wie aus den in Tabelle 10 dargestellten Ergebnissen hervorgeht, stellt das Enzym Pm.AraD keine D- Threonat-Dehydratase-Aktivität bereit oder kann nicht ausreichend in E. coli exprimiert werden, da bei Nutzung dieses Enzyms im Produktionsstamm keine DHB-Produktion nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu ermöglichen sowohl die Mutante Hh.AraD C434S und Pm.AraD die Produktion von DHB, wodurch ihre D-Threonat-Dehydratase-Aktivität belegt wird. Darüber hinaus wird durch die Ergebnisse gezeigt, dass die Mutante Hh.AraD C434S D-Threonat schneller abbaut, was zu einer verstärkten Produktion von DHB führt.
Tabelle 10: Ergebnisse der Biokonversion von 20 mM Glykolaldehyd zu DHB in Abhängigkeit der variierten Kandidatenenzyme für D-Threonat- Dehydratase-Aktivität
Figure imgf000051_0001
Identifizierung einer geeigneten NAD-abhängigen Ethylenglycol- Dehydrogenase
Um die Umwandlung von Ethylenglycol (EG) zu DHB oder Threonin mit Hilfe des beschriebenen Stoffwechselwegs zu erreichen, muss der Stoffwechselweg um eine Reaktion erweitert werden, welche die Oxidation von Ethylenglycol zu Glykolaldehyd ermöglicht. Wie bereits erwähnt, sind mehrere Enzyme bekannt, die eine NAD-abhängige Oxidation von Ethylenglycol zu Glykolaldehyd katalysieren. Um zu testen, welches Enzym für die Komplementierung des beschriebenen Stoffwechselwegs am geeignetsten ist, wurde ein wachstumsabhängiges Testsystem eingesetzt, bei dem die Wachstumsgeschwindigkeit des Teststammes von der in vivo Aktivität der Ethylenglycol-Dehydrogenase abhängt. Es ist bekannt, dass E. coli natürlicherweise keine Ethylenglycol-Dehydrogenase exprimiert und daher nicht auf dem Substrat Ethylenglycol als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen kann. Die Expression einer Ethylenglycol-Dehydrogenase ermöglicht allerdings die Umwandlung von Ethylenglycol zu Glykolaldehyd und damit ein Wachstum auf diesem Substrat. Daher wurden die drei Kandidatenenzyme Go.Adh, Ec.FucO und Ec.FucO I6L:L7V mit Hilfe eines pEXT20 Vektors in den E. coli Stämmen E. coli LyqhD und E. coli LyqhD LaldA exprimiert. Die Konstrukte auf Basis der Doppelmutante E. coli LyqhD LaldA dienten dabei als Kontrolle, da diese Stämme in Folge der Deletion der Glykolaldehyd-Dehydrogenase AldA nicht auf Ethylenglykol wachsen können. Die Teststämme wurden auf Mineralsalzmedium inkubiert, welches die gleiche Zusammensetzung hatte, wie in den vorangehend beschriebenen Experimenten. In diesem Medium wurde lediglich die Glukose als alleinige Kohlenstoffquelle durch 100 mM Ethylenglycol ersetzt. Die Teststämme wurden in Mikrotiterplatten (250 pL Medium pro Well) bei einer Schüttelfrequenz von 880 rpm und einer Temperatur von 37 °C in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (Tecan) inkubiert. Die Wachstumsgeschwindigkeiten wurden durch regelmäßige Messung der OD6oo ermittelt. Wie in Fig. 4 gezeigt wird, ermöglichte die Ethylenglycol- Dehydrogenase Go.Adh das schnellste Wachstum, gefolgt von Ec.FucO l6L.L7V und Ec.FucO. Aus diesem Grund wurde die Go.Adh nachfolgend als Ethylenglycol-Dehydrogenase für die Umwandlung von Ethylenglycol zu DHB mit Hilfe des beschriebenen Stoffwechselwegs eingesetzt.
Demonstration der Synthese von DHB ausgehend von Ethylenglycol
Die Biosynthese von DHB aus Ethylenglycol wurde durch die simultane Expression des gesamten Stoffwechselwegs einschließlich der Ethylenglycol- Dehydrogenase in einem Produktionsstamm demonstriert. Dafür wurde in allen Experimenten der Ausgangsstamm E. coli TW64 (MG1655 ΔyqhD ΔaldA) verwendet und mit Plasmiden transformiert, welche die Expression des synthetischen Stoffwechselwegs einschließlich der Ethylenglycol- Dehydrogenase Go.Adh gewährleisteten. Die Kultivierung des so konstruierten Produktionsstammes TW363 sowie die Messung der Substrat- und Produktkonzentrationen erfolgte wie im o.g. Ausführungsbeispiel für die Synthese von DHB aus Glykolaldehyd. Im Gegensatz zum genannten Beispiel wurde kein Glykolaldehyd zu den Kulturen gegeben, sondern es wurde Ethylenglycol den Kulturen nach dem Erreichen einer OD von 0,6 in verschiedenen Anfangskonzentrationen zugesetzt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11 : Ergebnisse der Biokonversion von Ethylenglycol (EG) zu DHB durch Stamm TW363
Figure imgf000053_0001
Konstruktion einer OH B-Reduktase mit einer höheren Spezifität für NADPH als für NADH
Um eine OHB-Reduktase mit einer Präferenz für den Kofaktor NADPH zu konstruieren, wurden Aminosäureaustausche in der bereits beschriebenen NADH-abhängigen OHB-Reduktase Ec.Mdh5Q in den Positionen D34 und I35 einzeln oder simultan vorgenommen. Die Konstruktion des Template Plasmids pET28-Ec.Mdh5Q sowie die dafür verwendete Methode wurde in Frazäo, C. J.
R.; Topham, C. M.; Malbert, Y; Frangois, J. M.; Walther, T. Rational Engineering of a Malate Dehydrogenase for Microbial Production of 2,4-Dihydroxybutyric Acid via Homoserine Pathway. Biochem. J. 2018, 475 (23), 3887-3901 beschrieben. Die zusätzlichen Mutationen wurden unter Nutzung der gleichen Methode durch inverse PCR mit den in Tabelle 12 gelisteten Primern eingebracht. Die PCR-Produkte wurden mit Dpnl verdaut um das Template- Plasmid zu entfernen und in E. coli DH5alpha Zellen transformiert. Die resultierenden Plasmide wurden isoliert und die Korrektheit der DNA Sequenz wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Tabelle 12: Verwendete Primer zum Einbringen von Mutationen in das Template-Enzym Ec.Mdh5Q
Figure imgf000054_0001
Die so erhaltenen Enzymvarianten wurden wie oben beschreiben in E. coli exprimiert, aufgereinigt und hinsichtlich ihrer kinetischen Parameter charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutation D35G alleine oder in Kombination mit Mutationen in Position 135 die Kofaktorspezifität der OHB- Reduktase in Richtung NADPH verschiebt, wie die Tabelle 13 zeigt. Die Enzymvariante mit der höchsten Aktivität und Spezifität auf NADPH (Ec.Mdh5Q D35G:I35R) wird im Folgenden als Ec-Mdh7Q bezeichnet. Die kinetischen Parameter dieses Enzyms wurden detailliert bestimmt und sind in Tabelle 14 aufgeführt.
Tabelle 13: Kofaktorspezifität von OHB-Reduktasemutanten
Figure imgf000055_0001
Die spezifischen Aktivitäten wurden bei konstanten Anfangskonzentrationen der Substrate OHB (2 mM) und NAD(P)H (0.25 mM) ermittelt. Das Enzym Ec.Mdh5Q ist die bereits beschriebene NADH-abhängige OHB-Reduktase Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D.
Es zeigte sich, dass Ec.Mdh70 eine um den Faktor 8600 größere Spezifität für NADPH aufweist, als das Ausgangsenzym Ec.Mdh5Q.
Figure imgf000056_0001
(a) Die OHB-Reduktaseaktivität wurde bei konstanter OHB-Konzentration (2 mM) und variierter NAD(P)H-Konzentration (2-0,002 mM) ermittelt.
(b) Die OHB-Reduktaseaktivität wurde bei konstanter NAD(P)H-Konzentration (0.25 mM) und variierter OHB-Konzentration (10-0.05 mM) ermittelt.
Die kinetischen Parameter Km und Vmax wurden durch Anpassung der gemessenen Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten an das Michaelis-Menten- Modell mit Hilfe von Matlab ermittelt.
Gesteigerte DHB-Produktion durch den Einsatz einer NADPH-abhänqiqen OHB-Reduktase Im Folgenden wurde die Eignung des Einsatzes einer NADPH-abhängigen OHB Reduktase zur Verbesserung der DHB-Produktion untersucht. Dazu wurden die Stämme TW354 und TW469, welche sich nur durch die Expression der NADH- bzw. NADPH-abhängigen OHB-Reduktase unterscheiden unter identischen Bedingungen kultiviert (Ausgangssubstrat 10 mM Glykolaldehyd, weitere Angaben zu Versuchs- und Analysebedingungen siehe oben) und die DHB-Akkumulation nach Ablauf von 48 Stunden verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Nutzung einer NADPH-abhängigen OHB Reduktase die DHB- Produktion deutlich verbessert, wie die Tabelle 15 zeigt.
Tabelle 15: Ergebnisse der Biokonversion von 10 mM Glykolaldehyd zu DHB durch E. coli Stämme, welche entweder eine NADH- oder eine NADPH-abhängige OHB-Reduktase exprimierten
Figure imgf000057_0001
n.d. - nicht detektierbar
Demonstration der Synthese von L-Threonin ausgehend von Glvkolaldehvd (GA)
Die Biosynthese von L-Threonin aus Glycolaldehyd wurde durch die simultane Expression des gesamten Stoffwechselwegs einschließlich der Enzyme zur Umwandlung von OHB zu Threonin erreicht. Dafür wurde in allen Experimenten der Ausgangsstamm E. coli TW64 (MG1655 ΔyqhD ΔaldA) verwendet und mit Plasmiden transformiert, welche die Expression des synthetischen Stoffwechselwegs einschließlich der Homoserintransaminase Ec.AspC gewährleisteten. Der resultierende Stamm wurde mit TW612 bezeichnet. Zur weiteren Verbesserung der Threoninproduktion wurde in diesen Stamm die Threonin-exportierende Permease RhtB, sowie die Homoserinkinase Ec.ThrB und die Threoninsynthase Ec.ThrC überexprimiert. Dies wurde erreicht, indem der native Promotor der jeweiligen Gene im Chromosom durch den starken konstitutiven Promotor proD Davis, J. H.; Rubin, A. J.; Sauer, R. T.: Design, construction and characterization of a set of insulated bacterial promoters. In: Nucleic Acid Res., 2011, 3, S. 1131-1141 ausgetauscht wurde. Der so erhaltene Stamm wurde mit TW613 bezeichnet.
Threonin kann im Produktionsstamm sowohl über den synthetischen Stoffwechselweg als auch über den natürlichen Stoffwechselweg synthetisiert werden. Um den eindeutigen Nachweis zu führen, dass Threonin erfindungsgemäß über den synthetischen Stoffwechselweg synthetisiert worden ist, wurde zum einen ein Kontrollexperiment unter Verwendung des Stamms TW619 durchgeführt, welcher nur eine unvollständige und daher nicht funktionelle Variante des synthetischen Stoffwechselwegs exprimiert. Insbesondere enthielt dieser Stamm keine genetische Information für die Expression einer Threonat-Dehydratase. Des Weiteren wurde in den Experimenten vollständig 13C-markiertes Glykolaldehyd (Omicron Biochemicals) als Substrat eingesetzt, und der Anteil von markiertem und unmarkiertem Threonin im Kulturmedium miteinander verglichen. Durch den Nachweis von vollständig markiertem Threonin kann der Nachweis geführt werden, dass der entsprechende Kohlenstoff von Glykolaldehyd stammt.
Die Stammkultivierungen wurden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler (Infors HT, Deutschland) bei 220 U/min durchgeführt. Die Vorkulturen wurden in 5 mL LB in 50 mL Falcon-Röhrchen inkubiert. Nach ca. 10 Stunden wurden 500 μL dieser Kulturen zur Beimpfung einer zweiten Vorkultur (10 mL von 90 % v/v M9 Mineralmedium und 10 % v/v LB in 50 mL Falcon-Röhrchen) verwendet, die über Nacht kultiviert wurde. Die zum Anlegen von Hauptkulturen mit einer Ausgangs-OD600 von 0,2 benötigte Biomasse wurde in ein Medium aus 90 % (v/v) mineralischem M9-Medium und 10 % (v/v) LB überführt. Antibiotika wurden allen Medien in Standardkonzentrationen zugegeben (Chloramphenicol, 35 μg mL-1 ; Kanamycin, 50 μg mL-1 ; Spectinomycin, 100 μg mL-1 ). IPTG (0,5 mM) wurde zugegeben, als die OD600 ~0,6 erreichte. Vollständig 13C-markiertes Glykolaldehyd wurde nach Erreichen einer OD600 von 2 zugegeben. Die Proben für die Analyse der extrazellulären Metaboliten wurden regelmäßig entnommen. Eine 1-mL-Kulturprobe wurde zentrifugiert (bei 13.000 g für 5 min), und der Überstand wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C aufbewahrt. Die Proben wurden vor der Messung mit 0,2 pm PTFE-Membranspritzenfiltern gefiltert.
LC/MS-Analyse: Der zellfreie Überstand wurde 100-fach in einer Lösung von 10 mM Ammoniumacetat (pH 9,2) verdünnt, die in 60 % (v/v) Acetonitril und 40 % (v/v) Wasser gelöst war. Die LC-MS-Plattform besteht aus einem Vanquish und einem Thermo Scientific™ Q Exactive™ Focus (alle von ThermoFisher Scientific, San Jose, CA), die von der Software Xcalibur 2.1 gesteuert wurden. Die Trennung durch Flüssigchromatographie erfolgte mit einer SeQuant® ZIC®- pHILIC (5pm Polymer 150 x 2,1 mm) Säule mit einer Flussrate von 0,15 mL min-1 . Für eine optimale Trenneffizienz wurde ein Gradient aus A (5 % ACN, 10 mM Ammoniumacetat, pH 9,2 durch NH4OH) und B (90 % ACN, 10 mM Ammoniumacetat, pH 9,2 durch NH4OH) verwendet. Der Gradient war 0 min, 95 % B; 2 min, 95 % B; 3 min, 89,4 % B; 5 min, 89,4 % B; 6 min, 83,8 % B; 7 min, 83,8 % B; 8 min, 78,2 % B; 9 min, 78,2 % B; 10 min, 55,9 % B; 12 min, 55,9 % B; 13 min, 27. 9 % B; 16 min, 27,9 % B; 18 min, 0 % B; 23 min, 0 % B; 24 min, 95 % B; 30 min, 95 % B. Die Temperatur des Probenehmers wurde auf 6 °C gehalten, das Injektionsvolumen betrug 5 μL und die Ofentemperatur wurde auf 25 °C gehalten. Die Geräteeinstellungen für die Elektrospray- ionisierung wurden für eine Flussrate von 0,15 mL min-1 optimiert. Weitere Parameter wurden wie folgt eingestellt: Durchflussrate des Mantelgases 32 (gerätespezifische Einheiten), Durchflussrate des Hilfsgases 8 (gerätespezifische Einheiten), Durchflussrate des Sweepgases 0 (gerätespezifische Einheiten), Sprühspannung -3,5 kV, Kapillartemperatur 250 °C und Hilfsgastemperatur 200 °C.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Fig. 5 dargestellt, die Säulendiagramme mit den Ergebnissen einer 13C-basierten metabolischen Stoffflussanalyse beinhalten, welche die Biosynthese von L-Threonin aus Glykolaldehyd (GA) über den synthetischen Stoffwechselweg zeigt. Im Kulturmedium wurde nur unmarkiertes Threonin (M+0) oder vollständig markiertes Threonin (M+4) gefunden. Der Kontrollstamm TW619 produzierte nur geringe Mengen an Threonin. Im Kulturmedium dieses Stamms war darüber hinaus kein markiertes Threonin nachweisbar, wodurch gezeigt wurde, dass Threonin in diesem Stamm ausschließlich aus Glukose hergestellt wurde. Im Gegensatz dazu wurde im Kulturmedium der Stämme TW612 und TW613, welche den gesamten synthetischen Stoffwechselweg exprimieren, vollständig markiertes Threonin gefunden. Durch diese Experimente konnte der zweifelsfreie Nachweis erbracht werden, dass der synthetische Stoffwechselweg für die Herstellung von Threonin geeignet ist. In der Tabelle 16 sind jeweils die SEQ-ID-Nummern der DNA-Sequenzen von bestimmte Enzyme codierenden Genen und die SEQ-ID-Nummern der Aminosäuresequenzen der entsprechenden Enzyme aufgeführt.
Tabelle 16: Sequenzen für Enzyme
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
In der Tabelle 17 sind die SEQ-ID-Nummern der DNA-Sequenzen für verschiedene Plasmide aufgeführt.
Tabelle 17: DNA-Sequenzen für Plasmide
Figure imgf000061_0002
In der Tabelle 18 sind jeweils die SEQ-ID-Nummern der DNA-Sequenzen von verschiedene OHB-Reduktasemutanten codierenden Genen und die SEQ-ID- Nummern der Aminosäuresequenzen der entsprechenden OHB- Reduktasemutanten aufgeführt.
Tabelle 18: Sequenzen für OHB-Reduktasemutanten
Figure imgf000062_0001
Der DNA-Sequenz für das Plasmid pEXT22- Ec.mdh7Q-Hh.araD ist die SEQ-ID- No. 184 zugeordnet.
Sequenzprotokoll - Freier Text:
SEQ-ID-No. Freier Text
1 - 48: Primersequenz für Piasmidkonstruktion
49 - 89: Primersequenz für die Klonierung eines Zielgens in den pET28-Expressionsvektor
90 - 101 : Primersequenz zum Einbringen von Mutationen in
Enzym Ec.Mdh5Q
104: Sequenz für Mutante der Ec.FucO
105: Mutante der Ec.FucO
106: Codonoptimierte Sequenz für Go.Adh
110: Sequenz für Mutante der Ec.FsaA
111 : Mutante der Ec.FsaA
116: Codonoptimierte Sequenz für Pc.TadH
118: Codonoptimierte Sequenz für PI.LgdA
120: Codonoptimierte Sequenz für Ps.Fdh
126: Codonoptimierte Sequenz für Ppi.TadH
128: Codonoptimierte Sequenz für Ss.Adh4
132: Codonoptimierte Sequenz für Tt.lacH
134, 136, 138: Codonoptimierte Sequenz für verkürzte Variante von Tt.lacH
135: Um 38 Aminosäuren verkürzte Variante von
Tt.LacH
137: Um 51 Aminosäuren verkürzte Variante von
Tt.LacH
139: Um 76 Aminosäuren verkürzte Variante von
Tt.LacH
142: Codonoptimierte Sequenz für Ss.livD
144: Codonoptimierte Sequenz für Xc.FucD
154: Sequenz für Mutante der Hh.araD
155: Mutante der Hh.araD mit Mutation von Cystein zu
Serin in Position 434
162, 172, 174, 176, 178,
180, 182: Sequenz für Mutante der Ec.Mdh : Mutante der Ec.Mdh mit den Mutationen 112V R81A
M85Q D86S G179D , 169, 170, 171 , 184: Sequenz für Plasmid : Mutante der Ec.Mdh mit den Mutationen 112V R81A
M85Q D86S G179D D34G : Mutante der Ec.Mdh mit den Mutationen 112V R81A
M85Q D86S G179D I35S : Mutante der Ec.Mdh mit den Mutationen 112V R81A
M85Q D86S G179D D34G I35K : Mutante der Ec.Mdh mit den Mutationen 112V R81A
M85Q D86S G179D D34G I35R : Mutante der Ec.Mdh mit den Mutationen 112V R81A
M85Q D86S G179D D34G S35S : Mutante der Ec.Mdh mit den Mutationen 112V R81A
M85Q D86S G179D D34G I35T
Liste verwendeter Bezugszeichen und Abkürzungen
I Xylose-Isomerase
II Xylulose-1 -Kinase
III Xylulose-1 P-Aldolase
IV Ethylenglycol-Dehydrogenase (Membran-gebunden)
V Ethylenglycol-Dehydrogenase (zytosolisch)
VI Methanoldehydrogenase
VII Glykolaldehyd-Synthase
VIII D-Threose-Aldolase
IX D-Threose-Dehydrogenase
X D-Threono-1 ,4-Lactonase
XI D-Threonat-Dehydratase
XII L-Homoserin-Transaminase
XIII L-Homoserin-Kinase
XIV L-Threonin-Synthase
XV 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB)-Reduktase
ATCC American Type Culture Collection
DH Dehydrogenase
DHB 2,4-Dihydroxybutyrat, 2,4-Dihydroxybuttersäure
EG Ethylenglycol
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1 -piperazinyl)-ethansulfonsäure
HMTB D/L-2-Hydroxy-4-(Methylthio)butyrat
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
LB Lysogeny broth (LB)-Medium, komplexes Nährmedium zur
Kultivierung von Bakterien
NAD Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid
NADH profanierte bzw. reduzierte Form von Nicotinsäureamid-Adenin-
Dinukleotid,
NADP Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
NADPH profanierte bzw. reduzierte Form von Nicotinsäureamid-Adenin-
Dinukleotid-Phosphat
OD optische Dichte
OD600 optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm OHB 2-Keto-4-Hydroxybutyrat in Form eines 2-Keto-4-Hydroxybutyrat-
Salzes oder der Säure 2-Keto-4-Hydroxybuttersäure
PCR Polymerase-Kettenreakton
HiFi High-Fidelity-Polymerase
RBS Ribosombindungssequenz
RE Restriktionsenzyme
UniProt. bioinformatische Datenbank für Proteine aller Lebewesen und Viren (englisch: universal protein database)

Claims

65
Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) oder von L- Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges, umfassend:
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Glykolaldehyd zu Threose unter Nutzung einer Threose-Aldolase,
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Threose zu Threono-1 ,4-Lacton unter Nutzung einer Threose- Dehydrogenase,
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Threono-1 ,4- Lacton in Threonat unter Nutzung einer Threono-1 ,4-Lactonase und
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Threonat in 2- Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) unter Nutzung einer Threonat- Dehydratase, und ferner umfassend
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von 2-Keto-4- Hydroxybutyrat (OHB) zu 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) unter Nutzung einer OHB-Reduktase oder
> einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von 2-Keto-4- Hydroxybutyrat in L-Homoserin unter Nutzung einer L- Homoserin-Transaminase, gefolgt von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von L-Homoserin in O-Phospho-L- Homoserin unter Nutzung einer Homoserin-Kinase unter ATP- Verbrauch und einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von O-Phospho-Homoserin zu L-Threonin unter Nutzung einer L- Threonin-Synthase, 66 wobei der Stoffwechselweg in einem mikrobiellen Produktionsstamm exprimiert wird, der zuvor gegenüber seiner natürlichen Form (Wildtyp) modifiziert wird, indem mindestens eines der für die Expression der genannten Enzyme notwendigen Gene in den Produktionsstamm eingebracht wird. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Gene durch die Nutzung von Plasmiden oder durch Integration der Gene ins Genom erreicht wird. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Produktionsstamm in seiner natürlichen Form bereits eine oder mehrere für den Stoffwechselweg erforderliche Enzyme aufweist. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Produktionsstamm ein modifizierter Stamm der Art Escherichia coli oder der Art Pseudomonas putida verwendet wird. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Produktionsstamm ein Stamm der Art Escherichia coli verwendet wird, der Deletionen in den die Aldehyd-Dehydrogenase (AldA) und/oder die Glykolaldehydreduktase (YqhD) kodierenden Genen aufweist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass für die Expression der D-Threose- Dehydrogenase im Produktionsstamm die das Enzym D-Threo-Aldose- 1 -Dehydrogenase exprimierende genetische Information aus Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) und/oder aus Xanthomonas campestris (Xc.Fdh) oder eine das Enzym D-Arabinose-Dehydrogenase exprimierende genetische Information aus Saccharomyces cerevisiae 67 fSc.Aral ) oder aus Acidovorax avenae (Aa.TadH) oder das Enzym L- Fucose-Dehydrogenase exprimierende genetische Information aus Burkholderia multivorans (Bm.Fdh) in das Genom des Produktionsstammes eingebracht wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass für die Expression der D-Threonat-Dehydratase im Produktionsstamm die das Enzym D-Arabinonat-Dehydratase exprimierende genetische Information aus Acidovorax avenae (Aa- AraD) und/oder Herbaspirillum huttiense (Hh-AraD) und/oder Paraburkholderia mimosarum (Pm.AraD) und/oder die der optimierten Mutante Hh.AraD C434S in das Genom des Produktionsstamms eingebracht wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass für die Expression der D-Threose-Aldolase im Produktionsstamm die das Enzym D-Fruktose-6-Phosphat-Aldolase exprimierende genetische Information aus Escherichia coli (Ec.FsaA) und/oder die der mutierten Variante Ec.FsaA L107Y:A129G (Ec.FsaATA) in das Genom des Produktionsstamms eingebracht wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass für die Expression der Threono-1 ,4-Lactonase im Produktionsstamm die das Enzym Gluconolactonase exprimierende genetische Information aus Thermogutta terrifontis (Tt.Lac11 ) und/oder die einer verkürzten Variante dieses Enzyms (Tt.Lac11v1 ) in das Genom des Produktionsstamms eingebracht wird. 68 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu Enzymen des Stoffwechselweges ein Threonat-importierendes Enzym im Produktionsstamm exprimiert wird. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die D- Threonat-importierende Permease aus Cupriavidus necator (Re.kdgT) im Produktionsstamm exprimiert wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , ferner umfassend mindestens einen vorgelagerten Schritt zur mikrobiellen Herstellung von Glykolaldehyd aus Ethylenglycol, Methanol oder Xylose. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass für die Umwandlung von 2-Keto-4- Hydroxybutyrat (OHB) zu 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) eine OHB- Reduktase eingesetzt wird, die eine höhere Spezifität für NADPH im Vergleich zu NADH besitzt. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass für die Expression der NADPH-bevorzugenden OHB-Reduktase im Produktionsstamm die eine mutierte Variante des Enzyms L-Malat- Dehydrogenase aus Escherichia coli (Ec.Mdh) exprimierende genetische Information in das Genom des Produktionsstamms eingebracht wird, wobei das mutierte Enzym gegenüber dem Wildtypenzym zusätzlich zu den fünf Punktmutationen 112V, R81A, M85Q, D86S und G179D in zumindest einer der Positionen D34 und I35 eine weitere Mutation aufweist. 69 Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass für die Expression der NADPH-bevorzugenden OHB-Reduktase im Produktionsstamm die eines der Enzyme
Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G, Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:I35S, Ec.Mdh I12VR81 A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35K, Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35R (Ec.Mdh7Q), Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35S und Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35T exprimierende genetische Information in das Genom des Produktionsstamms eingebracht wird. Enzym mit 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB)-Reduktase-Aktivität, welches die Umwandlung von 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) zu 2,4- Dihydroxybutyrat (DHB) katalysiert, wobei das Enzym eine Mutante der L-Malat-Dehydrogenase aus Escherichia coli (Ec.Mdh) ist, wobei das mutierte Enzym gegenüber dem Wildtypenzym zusätzlich zu den 5 Punktmutationen 112V, R81A, M85Q, D86S und G179D in zumindest einer der Positionen D34 und I35 eine weitere Mutation aufweist. Enzym nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus den Enzymen
Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G, Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:I35S, Ec. Mdh 112V R81 A: M85Q: D86S: G179D: D34G: I35K, Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35R (Ec.Mdh7Q), Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35S und Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D:D34G:I35T. 70
18. Verwendung eines Enzyms nach Anspruch 16 oder 17 für die Umwandlung von OHB in 2,4-DHB.
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