DE112013004785T5

DE112013004785T5 - Verfahren zur Herstellung von Acetoin und 2,3-Butandiol unter Verwendung von photosynthetischen Mikroorganismen

Info

Publication number: DE112013004785T5
Application number: DE112013004785.3T
Authority: DE
Inventors: Shota Atsumi; John W. K. Oliver; Iara M. P. Machado
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2015-08-20
Also published as: US20150259711A1; US9428773B2; WO2014052920A2; WO2014052920A3; JP2015530116A; CN104822825A

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Cyanobakterien mit Acetolactatsynthaseaktivität und Acetolactatdecarboxylaseaktivität bereit, sowie rekombinante Cyanobakterien mit Acetolactatsynthaseaktivität, Acetolactatdecarboxylaseaktivität und sekundärer Alkoholaehydrogenaseaktivität. Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Cyanobakterien, sowie Verfahren für deren Verwendung zur Herstellung von Acetoin und 2,3-Butandiol aus Kohlendioxid und Licht werden auch bereitgestellt.

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Die vorliegende Erfindung beansprucht die Priorität der U.S Provisional Application Nr. 61/707,866 , eingereicht am 28. September 2012, deren Inhalt hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit zu jedem Zweck miteinbezogen ist.
GEBIET
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Cyanobakterien mit Acetolactatsynthaseaktivität und Acetolactatdecarboxylaseaktivität bereit, sowie rekombinante Cyanobakterien mit Acetolactatsynthaseaktivität, Acetolactatdecarboxylaseaktivität und sekundärer Alkoholaehydrogenaseaktivität. Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Cyanobakterien, sowie Verfahren für deren Verwendung zur Herstellung von Acetoin und 2,3-Butandiol aus Kohlendioxid und Licht werden auch bereitgestellt.
HINTERGRUND
Inmitten eines wachsenden, globalen Energiebedarfs wächst das Interesse an der Produktion von Kraftstoffen und Chemikalien aus erneuerbaren Ressourcen. Der Erdölverbrauch in den USA im Jahr 2008 erreichte 37,1 Quadrillionen BTU, wovon eine große Mehrheit Flüssigkrafstoff für den Transportsektor war. Erdöl und Erdgas machen 99% der Rohstoffe für Chemikalien wie Kunststoffe, Dünger und Arzneimittel in der chemischen Industrie aus (McFarlane et al., „Survey of Alternative Feedstocks for Commodity Chemical Manufacturing,” Oak Ridge National Laboratory, 2007). In Anbetracht der schnell wachsenden Erdpopulation und der Erschöpfung fossiler Brennstoffe, ist die Entwicklung eines nachhaltigen Verfahrens für die Abscheidung von Energie und Kohlenstoff (ECC) zur Herstellung von Brennstoffen und Chemikalien von entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesellschaft.
Zusätzlich zu einem erhöhten Energiebedarf sind erneuerbare Energieressourcen von Interesse bei der Befassung mit wachsenden Umweltproblemen. Laut der US Energieinformationsverwaltung (Serferlein, „Annual Energy Review, USEIA 2008), betrugen im Jahr 2006 weltweit Energie-verbundene CO₂ Emissionen 29 Billionen metrische Tonnen, was eine Steigung von 35% seit 1990 bedeutet. Die beschleunigte Anhäufung von atmosphärischem CO₂ ist nicht nur durch erhöhte Emissionen aufgrund des Weltwachstums und intensiverem Kohlenstoffverbrauch begründet, sondern auch durch eine mögliche Verminderung der Effizienz weltweiter Kohlenstoffsenken (Raupach et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104: 10288–10293, 2007). Folglich erhöhten sich die atmosphärischen CO₂ Level über die letzten 150 Jahre um ~25%. Daher wurde es zunehmend wichtiger, neue Technologien zur Reduktion der CO₂-Emission zu entwickeln.
Bisherige Methoden zur Produktion erneuerbarer Energien beinhalteten die Umwandlung terrestrischer Pflanzenbiomase in Biochemikalien. Jedoch sind diese Methoden mit nicht erwünschten Komplikationen verbunden, wie harschen chemischen Vorbehandlungen der Biomasse, welche toxische Nebenprodukte und große Landbenutzungsvorraussetzungen für das Wachstum der Pflanzen zur Folge haben. Photosynthetische Mikroorganismen besitzen im Hinblick auf die biochemische Produktion viele Vorteile gegenüber traditionellen terrestrischen Pflanzen. Beispielsweise ist die photosynthetische Effizienz von photosynthetischen Mikroorganismen höher als in Pflanzen und photosynthetische Mikroorganismen können an Standorten kultiviert werden, welche nicht mit den traditioneller Nutzpflanzen konkurrieren (Scharlemann et al., Science, 281: 237–240, 2008).
Ein Beispiel für einen photosynthetischen Mikroorganismus mit Potential für die biochemische Produktion sind Cyanobakterien. Cyanobakterien sind ingesamt für fast 50% der globalen Photosynthese verantwortlich und finden sich in einer Bandbreite an Umgebungen wieder (Field et al., Science, 281: 237–240, 1998). Während Cyanobakterien in diesem Zusammenhang viele ähnliche Merkmale zu Algen besitzen, weisen cyanobakterielle Arten einfachere genetische Strukturen und schneller Wachstumsraten auf (Ruffing, Bioeng Bugs, 2: 136–149, 2011). Folglich sind genetische Manipulationsmethoden für Cyanobakterien ebenfalls fortgeschrittener bezüglich genetischer Manipulationsbestreben als die für Algen (Golden et al., Methods Enzymol, 153: 215–231, 1987; Huang et al., Nucleic Acids Res, 38: 2577–2593, 2010; and Heidorn et al., Methods Enzymol, 497: 539–579, 2011).
Cyanobakterien besitzen die biochemische Maschinerie zur CO2 Fixierung, aber besitzen nicht die für die effiziente Herstellung von Brennstoffen und Chemikalien wesentlichen Komponenten. Um daher wertvolle Chemikalien herzustellen, bedarf es der Ausstattung cyanobakterieller Wirtsstämme mit neuen biosynthetischen Stoffwechselwegen (Keasling, ACS Chem Biol, 3: 64–76, 2008; Ducat et al., Trends Biotechnol, 29: 95–103, 2011; und Machado and Atsumi, J Biotechnol, 2012). Leider ist dieser Ansatz in Cyanobakterien verglichen mit einem Modellorganismus wie Escherichia coli weitaus weniger weit entwickelt. Darüber hinaus können in E. coli erhaltene Ergebnisse nicht direkt auf Cyanobakterien übertragen werden. Beispielsweise produziert ein manipulierter E. coli Stamm, der den 1-Butanol-Stoffwechselweg enthält, mehr als 30 g/L 1-Butanol (Shen et al., Appl Environ Microbiol, 77: 2905–2915, 2011), während ein cyanobakterieller Stamm mit demselben Stoffwechselweg lediglich Spuren an 1-Butanol produziert (Lan et al., Metab Eng, 13: 353–363, 2011). Daher existiert ein Bedarf für die Erstellung eines biosynthetischen Stoffwechselwegs in Cyanobakterien, der zu einer signifikanten Produktion von chemikalischen Grundstoffen aus CO₂ führt.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Offenbarung stellt rekombinante Cyanobakterien mit Acetolactatsynthaseaktivität und Acetolactatdecarboxylaseaktivität, sowie rekombinante Cyanobakterien mit Acetolactatsynthaseaktivität, Acetolactatdecarboxylaseaktivität und sekundärer Alkoholdehydrogenaseaktivität bereit. Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Cyanobakterien, sowie Verfahren für deren Verwendung zur Herstellung von Acetoin und 2,3-Butandiol aus Kohlendioxid und Licht werden auch bereitgestellt.
Die vorliegende Offenbarung stellt Cyanobakterien bereit, die ein rekombinantes (z. B. heterologes) Polynukleotid umfassen, das für eine Acetolactatsynthase (ALS) und eine Acetolactatdecarboxylase (ALDC) kodiert, wobei die Expression der ALS und der ALDC zu einer Erhöhung der Produktion von Acetoin führt, verglichen mit einem entsprechenden Cyanobakterium, dem das Polynukleotid fehlt. Die vorliegende Offenbarung stellt ferner Cyanobakterien bereit, die ein rekombinantes (z. B. heterologes) Polynukleotid umfassen, das für eine Acetolactatsynthase (ALS), ein Acetolactatdecarboxylase (ALDC) und eine sekundäre Alkoholdehydrogenase (sADH) kodiert, wobei die Expression der ALS, der ALDC und der sADH zu einer Erhöhung der Produktion von Acetoin oder 2,3-Butandiol (23BD) oder beiden führt, verglichen mit einem entsprechenden Cyanobakterium, dem das Polynukleotid fehlt. In einigen Ausführungsformen ist das entsprechende Cyanobakterium ein Kontroll-Cyanobakterium wie das Stamm-Cyanobakterium oder eine Zelle der gleichen Gattung oder der gleichen Spezies. In einigen Ausführungsformen ist die ALS eine bakterielle ALS. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die ALS eine Bacillus sp. ALS (z. B., eine Bacillus subtilis ALS). In einigen Ausführungsformen ist die ALDC eine bakterielle ALDC oder eine Pilz-ALDC. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die ALDC ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Enterobacter sp. ALDC, eine Bacillus sp. ALDC, einer Aeromonas sp. ALDC und einer Gluconacetobacter sp. ALDC. In einer Untergruppe dieser Ausführungsformen ist die ALDC ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Enterobacter aerogenes ALDC, einer Enterobacter cloacae ALDC, einer Bacillus licheniformis ALDC, einer Bacillus subtilis ALDC, einer Aeromonas hydrophila ALDC und einer Gluconacetobacter xylinus ALDC. In einigen Ausführungsformen ist die sADH eine bakterielle sADH oder eine Pilz-sADH. In einigen Ausführungsformen ist die sADH ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Ascomyceten sADH, einer Firmicuten sADH und einer Saccharomyceten sADH. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die sADH ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Candida sp. sADH, einer Leuconostoc sp. sADH, einer Clostridium sp. sADH und einer Thermoanaerobacter sp. sADH. In einer Untergruppe dieser Ausführungsformen ist die sADH ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Candida parapsilosis sADH, einer Leuconostoc pseudomesenteroides sADH, einer Clostridium beijerinckii sADH und einer Thermoanaerobacter brockii sADH. In einigen Ausführungsformen wird die Expression der ALS und der ALDC, oder die Expression der ALS, der ALDC und der sADH von einem induzierbaren Promotor angetrieben. In einigen Ausführungsformen wird die Expression der ALS und der ALDC, oder die Expression der ALS, der ALDC und der sADH von einem konstitutiven Promoter angetrieben. In einigen Ausführungsformen ist das Polynukleotid stabil in das Genom des Cyanobakteriums integriert. In einigen Ausführungsformen wird das Polynukleotid transient im Cyanobakterium gehalten (z. B. als Plasmid). In einigen Ausführungsformen ist das Cyanobakterium aus einer Ordnung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chroococcales und Nostocales. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist das Cyanobakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nostoc sp., Synechococcus sp.. Synechocystis sp., und Thermosynechococcus sp. In einer Untergruppe dieser Ausführungsformen ist das Cyanobakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nostoc punctiforme ACCS 074, Synechococcus elongates PCC 7942, Synechococcus sp. WH 8102, Synechocystis sp. PCC 6803 und Thermosynechococcus elongates BP-1. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Produktion von Acetoin oder 2,3-Butandiol (23BD) oder beiden infolge des Kultivierens des Cyanobakteriums unter konstantem Licht. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Produktion von Acetoin oder 2,3-Butandiol (23BD) oder beiden infolge des Kultivierens des Cyanobakteriums in Gegenwart von Natriumbicarbonat. In einigen Ausführungsformen ist die ALDC im Wesentlichen unempfindlich gegenüber Sauerstoff (nicht nachweisbare oder niedrige Sauerstoffempfindlichkeit). In einigen Ausführungsformen ist die sADH im Wesentlichen unempfindlich gegenüber Sauerstoff (nicht nachweisbare oder niedrige Sauerstoffempfindlichkeit) und ist NADPH-abhängig.
Zusätzlich stellt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur Herstellung von Acetoin bereit, umfassend: Bereitstellen eines Cyanobakteriums; und Kultivieren des Cyanobakteriums in einer photosynthetischen Umgebung, die CO₂ und Licht aufweist, wodurch die Expression der ALS und der ALDC zur Produktion von Acetoin führt. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Produktion von Acetoin auf einem höheren Niveau, als unter gleichen Bedingungen durch das Kultivieren des entsprechenden (z. B. Kontroll-)Cyanobakteriums, dem das Polynukleotid fehlt. Die vorliegende Offenbarung stellt außerdem Verfahren zur Herstellung von 2,3-Butandiol bereit, umfassend: Bereitstellen eines Cyanobakteriums; und Kultivieren des Cyanobakteriums in einer photosynthetischen Umgebung, die CO₂ und Licht aufweist, wodurch die Expression der ALS, der ALDC und der sADH zur Produktion von 2,3-Butandiol (23BD) führt. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Produktion von 23BD auf einem höheren Niveau, als unter gleichen Bedingungen durch das Kultivieren des entsprechenden (z. B. Kontroll-)Cyanobakteriums, dem das Polynukleotid fehlt. Das Cyanobakterium, das Acetoin oder 23BD, oder beides, durch die Verwendung dieser Verfahren produziert, ist ein Cyanobakterium des vorherigen Absatzes oder ein rekombinantes Cyanobakterium, wie in der Beschreibung der vorliegenden Offenbarung anderweitig bestimmt ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt, wie CO₂ in der biologischen Synthese von Acetoin und 2,3-Butandiol, sowie anderen technisch wichtigen Chemikalien, verwendet werden kann. ALS: Acetolactatsynthase, ALDC: Acetolactatdecarboxylase, sADH: sekundäre Alkoholdehydrogenase.
2 zeigt, wie sich verschiedene Konzentrationen von Acetoin und 2,3-Butandiol auf die Wachstumsrate der S. elongatus auswirken.
3A ist eine schematische Darstellung der Rekombination zum Einbau von alsS- und alsD-Genen in das S. elongatus-Chromosom. 3B zeigt die Acetoin-Produktion in modifizierten E. coli-Zellen, die für 16 h (im Dunkeln) und 40 h (im Hellen) gewachsen sind. 3C zeigt die Acetoin-Produktion in modifizierten S. elongatus-Zellen nach 72 h Wachstum. alsS zeigt die Einbeziehung von (+) alsS (B. s.) oder die Abwesenheit (–) des Gens. alsD zeigt den Quellorganismus des alsD-Gens (Tabelle 1). 3D zeigt die Wirkung von IPTG (1 mM) auf die Herstellung von Acetoin in S. elongatus enthaltend alsS (B. s.) und alsD (E. a.) unter P_LlacO1. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (s. d.) (n = 3).
4A ist eine schematische Darstellung der Rekombination zum Einbau von alsS-, alsD- und adh-Genen in das S. elongatus-Chromosom. 4B zeigt die Acetoin-Produktion in modifizierten E. coli-Zellen nach 40 Stunden Wachstum. Helle Balken zeigen Acetoin an, während dunkle Balken Butandiol anzeigen (mittlere Balken: meso-23BD, rechte Balken (R,R)-23BD). alsS zeigt die Einbeziehung von (+) alsS (B. s.). alsD, und adh Reihen zeigen den Quellenorganismus für das Gen (Tabelle 1). Die Aktivität ist die der sADH, exprimiert in E. coli und gemessen in Zellextrakt (nmol NADPH min^–1mg^–1). 4C zeigt die 23BD Produktion in modifizierten S. elongatus-Zellen nach 72 h Wachstum. 4D zeigt spezifische Aktivitäten von ALS und ADH in Zellextrakten aus modifizierten S. elongatus-Stämmen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.
5A–C ist eine Zusammenfassung der langfristigen 2,3-Butandiol-Produktion durch rekombinantes S. elongatus in kontinuierlichen Kulturen. Quadrate: S. elongatus enthaltend alsS (B. s.), alsD (A. h.) und adh (C. b.). Kreise: S. elongatus enthaltend alsS (B. s.), alsD (A. h.) und adh (T. b.). Dreiecke: S. elongatus enthaltend alsS (B. s.) und alsD (E. a.). Diamanten: S. elongatus ohne alsS, alsD oder adh. 5A zeigt die Zeitverläufe für das Wachstum. 5B zeigt die gesamte 23BD-Produktion. 5C zeigt die Photosyntheseleistung. 5D zeigt die Gesamtbiomasseproduktion pro Tag. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (n = 3).
6A zeigt die tägliche 2,3-Butandiol-Produktion durch AL757 (mit eingebautem alsS, alsD (A. h.) und adh (C. b.)). 6B zeigt die Acetoinkonzentration in 23BD-Langzeit-Produktionsversuchen. Quadrate: AL757 (mit integriertem alsS (B. s.), alsD (A. h.) und adh (C. b.)). Kreise: AL756 (mit integriertem alsS (B. s.), alsD (A. h.) und adh (T. b.)). 6C zeigt die langfristige Produktion von Acetoin AL763 (mit integriertem alsS und alsD (E. a.)).
7 zeigt einen Vergleich der Produktivitäten für verschiedene Chemikalien, die auf exogenem Wege in Cyanobakterien produziert wurden. 23BD (diese Offenbarung), Isobutyraldehyd und Isobutanol (Atsumi et al., Nat Biotechnol, 27: 1177–1180, 2009), Fettsäuren (Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 108: 6899–6904, 2011), Ethanol (Dexter und Pengcheng, Energie Environ Sci, 2: 857–864, 2009), Aceton (Zhou et al., Metab Eng, 14: 394–400, 2012), Ethylen (Takahama et al., J Biosci Bioeng, 95: 302–305, 2003), Butanol (Lan und Liao, Proc Natl Acad Sci USA, 109: 6018–6023, 2012), Fettalkohol (Tan et al., Metab Eng, 13: 169–176, 2011). Die detaillierten Berechnungen sind in Beispiel 1 beschrieben.
BESCHREIBUNG
Es besteht der Bedarf, CO₂-Emissionen in die Atmosphäre zu bremsen und/oder die bereits in der Atmosphäre befindlichen CO₂-Konzentration zu reduzieren. Photosynthetische Mikroorganismen verfügen über die Fähigkeit, diese Verbindung aus der Atmosphäre zu entfernen, aber in der Regel nicht über die Fähigkeit, chemische Grundstoffe unter Verwendung von CO₂ als Ausgangsmaterial zu synthetisieren. Ein nützlicher chemischer Grundstoff ist die Verbindung Acetoin. Acetoin wird als einer der Top 30 wertvollsten chemischen Bausteine für den Einsatz in Bioraffinerien (US Department of Energy) genannt. Zusätzlich ist Acetoin ein weit verbreiteter Duft- und Aromastoff mit wichtigen Anwendungen in der Lebensmittelindustrie. Vor der Entwicklung der vorliegenden Offenbarung gab es weder bekannte Verfahren zur Herstellung von Acetoin aus CO₂, noch gab es bekannte Verfahren zur Herstellung von Acetoin aus CO₂ und Sonnenlicht unter Verwendung von photosynthetischen Mikroorganismen.
Ein weiterer nützlicher chemischer Grundstoff ist 2,3-Butandiol (23BD); ein vielseitiger Molekülbaustein für die Synthese von wertvollen Chemikalien. 23BD kann durch Dehydrierung zu Methylethylketon (MEK) umgewandelt werden, das ein flüssiges Kraftstoffadditiv und ein nützliches industrielles Lösungsmittel ist (Tran et al., Biotechnol Bioeng, 29: 343–351, 1987). Darüber hinaus hat sich die katalytische Umwandlung von 23BD zu 1,3-Butadien, das ein Vorläufer für eine Vielzahl von Polymeren und Copolymer-Materialien ist, gut etabliert (van Haveren et al., Biofules Bioprod Bioref, 2: 41–57, 2008). 23BD wurde auch bei der Herstellung von Weichmachern, Farben, Begasungsmittel und Sprengstoff verwendet (Syu, Appl Microbiol Biotechnol, 55: 10–18, 2001). Wichtig ist, dass 23BD aus der Ausgangsverbindung Acetoin synthetisiert werden kann. Während sich mikrobielle Fermentation von 23BD auch seit vielen Jahren entwickelt hat (Ji et al., Biotechnol Adv, 29: 351–364, 2011; und Celinska und Grajek, Biotechnol Adv,. 27: 715–725, 2009), adressieren bereits bestehende Methoden nicht zusätzlich die Notwendigkeit, die CO₂-Emissionen in der Atmosphäre zu reduzieren.
Die Umwandlung von CO₂ durch photosynthetische Organismen ist ein attraktives Ziel, um eine Synthese von Chemikalien zu etablieren, die unabhängig von fossilen Brennstoffreserven ist. Wie hier beschrieben, wurde systematisch ein 2,3-Butandiol(23BD)-Biosyntheseweg in Synechococcus elongatus PCC7942 entwickelt. Dieses Modellsystem zeigt, dass Cyanobakterien für eine effiziente Produktion von chemischen Grundstoffen eingesetzt werden können. 23BD wurde als Zielchemikalie mit niedriger Wirtstoxizität ausgewählt, was die Entwicklung eines sauerstoffunempfindlichen, Cofactor-angepassten Biosynthesewegs erlaubt, der mit irreversiblen enzymatischen Schritten gekoppelt ist, um eine Antriebskraft für die Produktion von 23BD zu schaffen. Beispielhafte Verfahren resultierten in der Produktion von bis zu 2,38 g/l 23BD aus CO₂, was eine signifikante Zunahme bei der chemischen Produktion auf exogenen Wegen in Cyanobakterien darstellt.
Rekombinante Polynukleotide, Vektoren, Quelle und Wirtsorganismen
Die vorliegende Offenbarung stellt Cyanobakterien für die Verwendung bei der Herstellung von Acetoin und 2,3-Butandiol (23BD) bereit. Diese Cyanobakterien enthalten ein rekombinantes Polynukleotid, das für eine Acetolactatsynthase (ALS) und eine Acetolactatdecarboxylase (ALDC) kodiert. Die Expression der ALS und der ALDC führt zu einer Erhöhung der Produktion von Acetoin, verglichen mit einem Cyanobakterium, dem dieses Polynukleotid fehlt.
Die vorliegende Offenbarung stellt weiterhin Cyanobakterien für die Verwendung in der Produktion von Acetoin und/oder 2,3-Butandiol bereit. Diese Cyanobakterien enthalten eine rekombinantes Polynukleotid, das für eine Acetolactatsynthase (ALS), eine Acetolactatdecarboxylase (ALDC) und eine sekundäre Alkoholdehydrogenase (sADH) kodiert. Die Expression der ALS, der ALDC und der sADH führt zu einer Erhöhung der Produktion von Acetoin und/oder 2,3-Butandiol, verglichen mit einem Cyanobakterium, dem dieses Polynukleotid fehlt.
Ebenfalls hier bereitgestellt werden rekombinante Vektoren, Expressionskassetten und Polynukleotide, die kodierende Sequenzen von einem oder mehreren der ALS, ALDC und sADH unfassen. In einigen Ausführungsformen werden diese Nukleinsäuren verwendet, um Bakterien (beispielsweise Cyanobakterien), die wiederum zur Produktion von Acetoin oder 2,3-Butandiol, oder beiden, verwendet werden können.
Polynukleotide, die kodierende Sequenzen für eine Acetolactatsynthase und eine Acetolactatdecarboxylase umfassen, sind hier beschrieben. Ebenfalls beschrieben sind Polynukleotide, die kodierende Sequenzen für eine Acetolactatsynthase, eine Acetolactatdecarboxylase, und eine sekundären Alkoholdehydrogenase umfassen. In einigen Ausführungsformen sind die kodierende Sequenzen als Teil eines Vektors oder einer Expressionskassette funktionsfähig mit einen Promotor verbunden.
Der hier verwendete Begriff „Vektor” bezieht sich auf eine Polynukleotidverbindung und/oder -zusammensetzung, die wenn sie einmal in eine Wirtszelle eingeführt wird, eine Wirtszelle transformiert, wodurch die Zelle Polynukleotide und/oder Polypeptide exprimiert, die nicht den Organismus-eigenen entsprechen, oder in einer Weise, die nicht der Organismus-eigenen entspricht. Bevorzugte Vektoren sind Plasmide oder ähnliche genetische Konstrukte, insbesondere solche mit Restriktionsstellen, die gut dokumentiert sind, um den Klonierungsschritt zur Einführung der Polynukleotidsequenzen von Interesse in das Plasmid zu erleichtern. Solche Plasmide, sowie andere Vektoren sind dem Durchschnittsfachmann auf dem techischen Gebiet bekannt und können in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet verwendet werden.
Der hier verwendete Begriff „kodierende Sequenz” bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, die, wenn sie exprimiert wird, in ein Polypeptid übersetzt werden kann.
Der hier verwendete Ausdruck „funktionsfähig verbunden” bezieht sich auf eine Konfiguration, in welcher eine Kontrollsequenz in einer geeigneten Position relativ zu der kodierenden Sequenz der Polynucleotidsequenz angeordnet ist, so dass die Kontrollsequenz die Expression des Polynukleotids steuert.
In bevorzugten Ausführungsformen entspricht die kodierende Sequenz der Acetolactatsynthase der vorliegenden Offenbarung einem alsS-Polynukleotid oder einem Homolog davon. In bevorzugten Ausführungsformen entspricht die kodierende Sequenz der Acetolactatdecarboxylase einem alsD-Polynukleotid oder einem Homolog davon. In bevorzugten Ausführungsformen entspricht die kodierende Sequenz der sekundären Alkoholdehydrogenase einem adh-Polynukleotid oder einem Homolog davon.
In bevorzugten Ausführungsformen produziert das alsS-Polynukleotid ein Polypeptid mit Acetolactatsynthaseaktivität. In bevorzugten Ausführungsformen produziert das alsD-Polynukleotid ein Polypeptid mit Acetolactatdecarboxylaseaktivität. In bevorzugten Ausführungsformen produziert das adh-Polynukleotid ein Polypeptid mit sekundärer Alkoholdehydrogenaseaktivität.
Acetolactatsynthase (ALS) ist Teil eines Aminosäure-Biosynthesewegs, der für die Synthese von Valin, Leucin und Isoleucin verantwortlich ist. Allgemein katalysieren Acetolactatsynthase-Enzyme die Umwandlung von zwei Pyruvat-Molekülen in 2-Acetolacat und CO₂. Insbesondere katalysiert das Enzym die Aldo-Kondensation von zwei Molekülen Pyruvat zu 2-Acetolactat. Die durch ALS katalysierte Gesamtreaktion ist wegen der CO₂-Entwicklung irreversibel. Der erste Schritt in der Katalyse ist die Ionisierung des Thiazoliumrings von Thiaminpyrophosphat (TPP). Insgesamt ist TPP bei der Verknüpfung der beiden Pyruvatmoleküle beteiligt. Zunächst bildet sich das hochreaktive tricyclische Intermediat und reagiert mit dem ersten Pyruvat, das dann decarboxyliert, um das relativ unreaktive Enamin zu bilden. Da dieses Intermediat stabil ist, kann das Enzym in der Mitte des katalytischen Zyklus unter Freisetzung von CO₂ und Zuführen des zweiten Moleküls Pyruvat verweilen. Dann bildet sich das tricyclische Carbanion, gefolgt von einer Umsetzung mit dem zweiten Pyruvat. Deprotonierung gefolgt von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsbruch vervollständigen die Reaktion, wodurch 2-Acetolactat gebildet wird (siehe z. B. US 2011/0262982 ).
Enzymatische Reaktionen können nach ihrer Enzyme-Commission(EC)-Nummer klassifiziert werden. Die EC-Nummer, die mit einem bestimmten Enzym assoziiert ist, spezifiziert die Klassifizierung des Typs der enzymatischen Reaktion, die ein bestimmtes Enzym katalysieren kann. EC-Nummern spezifizieren nicht die Identitäten von Enzymen, sondern die Identität der chemischen Reaktion, die ein bestimmtes Enzym katalysiert kann. Auf ähnliche Weise können Proteinen auch Gene Ontology(GO)-Begriffe zugeschrieben werden. GO-Begriffe versuchen, die jeweilige Aufgabe und/oder Funktion eines Proteins in einem lebenden Organismus zu definieren, indem die Proteinfunktion durch eine Zellkomponente, ein biologisches Verfahren, und/oder eine molekulare Funktion spezifiziert wird. Beispielsweise könnten zwei Enzyme aus zwei verschiedenen Arten von Organismen, die die gleiche chemische Reaktion katalysieren, der gleichen EC-Klassifizierung und GO-Begriffsnotierung zugeordnet werden, obwohl die jeweiligen Enzyme endogen aus verschiedenen Organismen stammen. EC- und GO-Begriffklassifizierungen sind für den Fachmann bei der Identifizierung der molekularen Funktion und/oder Aktivität eines bestimmten Proteins hilfreich, ohne seine eindeutige Identifikationsklassifizierung im Hinblick auf den Organismus, aus dem es stammt, wie seine NCBI (National Council for Biotechnology) Kennung, zu kennen.
Acetolactatsynthase-Enzyme katalysieren die enzymatische Reaktion mit der Klassifizierung EC 2.2.1.6 (Acetolactatsynthaseaktivität) und dem Gene-Ontology(GO)-Begriff mit der ID GO: 0003984. Die GO-Begriffs-ID legt fest, dass jedes Protein, dem dieser GO-Begriff zugeordnet ist, ein Enzym mit katalytischer Acetolactatsynthaseaktivität kodiert.
Verschiedene Acetolactatsynthase(alsS)-Gene, die Acetolactatsynthase-Enzyme kodieren, sind in der Technik bekannt. Beispiele von alsS-Genen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, gi|83644996|ref|YP_433431.1| Acetolactatsynthase [Hahella chejuensis KCTC 2396]; gi|32141318|ref|NP_733719.1| Acetolactatsynthase [Streptomyces coelicolor A3(2)]; gi|238917299|ref|YP_002930816.1| Acetolactatsynthase [Eubacterium eligens ATCC 27750]; gi|312136848|ref|YP_004004185.1| Acetolactatsynthase [Methanothermus fervidus DSM 2088]; gi|311224567|gb|ADP77423.1| Acetolactatsynthase [Methanothermus fervidus DSM 2088]; gi|238872659|gb|ACR72369.1| Acetolactatsynthase [Eubacterium eligens ATCC 27750]; gi|119671178|emb|CAL95091.1| Acetolactatsynthase [Azoarcus sp. BH72]; gi|384250777|gb|EIE24256.1| Acetolactatsynthase [Coccomyxa subellipsoidea C-169]; gi|365857129|ref|ZP_09397126.1| Acetolactatsynthase [Acetobacteraceae bacterium AT-5844]; gi|363716653|gb|EHM00051.1| Acetolactatsynthase [Acetobacteraceae bacterium AT-5844]; gi|357547224|gb|EHJ29116.1| Acetolactatsynthase [Lactobacillus rhamnosus ATCC 21052]; gi|312898921|ref|ZP_07758309.1| Acetolactatsynthase [Megasphaera micronuciformis F0359]; gi|310620083|gb|EFQ03655.1| Acetolactatsynthase [Megasphaera micronuciformis F0359]; gi|392978028|ref|YP_006476616.1| Acetolactatsynthase [Enterobacter cloacae subsp. dissolvens SDM]; gi|387878229|ref|YP_006308533.1| acetolactate synthase [Mycobacterium sp. MOTT36Y]; gi|387619850|ref|YP_006127477.1| Acetolactatsynthase [Escherichia coli DH1]; gi|386760231|ref|YP_006233448.1| Acetolactatsynthase [Bacillus sp. JS]; gi|386732742|ref|YP_006206238.1| Acetolactatsynthase [Listeria monocytogenes 07PF0776]; gi|386035198|ref|YP_005955111.1| Acetolactatsynthase [Klebsiella pneumoniae KCTC 2242]; gi|384259770|ref|YP_005403704.1| Acetolactatsynthase [Rahnella aquatilis HX2]; gi|384267136|ref|YP_005422843.1| Acetolactatsynthase [Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum YAU B9601-Y2]; gi|384170312|ref|YP_005551690.1| Acetolactatsynthase [Bacillus amyloliquefaciens XH7]; gi|379741437|ref|YP_005333406.1| Acetolactatsynthase [Vibrio cholerae IEC224]; gi|375364038|ref|YP_005132077.1| Acetolactatsynthase [Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CAU B946]; gi|375261263|ref|YP_005020433.1| Acetolactatsynthase [Klebsiella oxytoca KCTC 1686]; gi|375009759|ref|YP_004983392.1| Acetolactatsynthase [Geobacillus thermoleovorans CCB_US3_UF5]; gi|374323653|ref|YP_005076782.1| Acetolactatsynthase [Paenibacillus terrae HPL-003]; gi|344207293|ref|YP_004792434.1| Acetolactatsynthase [Stenotrophomonas maltophilia JV3]; gi|338534039|ref|YP_004667373.1| Acetolactatsynthase [Myxococcus fulvus HW-1]; gi|336249979|ref|YP_004593689.1| Acetolactatsynthase [Enterobacter aerogenes KCTC 2190]; gi|334144738|ref|YP_004537894.1| Acetolactatsynthase [Thioalkalimicrobium cyclicum ALM1]; gi|333895383|ref|YP_004469258.1| Acetolactatsynthase [Alteromonas sp. SN2]; gi|332297456|ref|YP_004439378.1| Acetolactatsynthase [Treponema brennaborense DSM 12168]; gi|330838389|ref|YP_004412969.1| Acetolactatsynthase [Selenomonas sputigena ATCC 35185]; gi|328950467|ref|YP_004367802.1| Acetolactatsynthase [Marinithermus hydrothermalis DSM 14884]; gi|326780667|ref|ZP_08239932.1| Acetolactatsynthase [Streptomyces griseus XylebKG-1]; gi|325298954|ref|YP_004258871.1| Acetolactatsynthase [Bacteroides salanitronis DSM 18170]; gi|321313145|ref|YP_004205432.1| Acetolactatsynthase [Bacillus subtilis BSn5]; gi|311070109|ref|YP_003975032.1| Acetolactatsynthase [Bacillus atrophaeus 1942]; gi|53721452|ref|YP_110437.1| Acetolactatsynthase [Burkholderia pseudomallei K96243]; gi|21221221|ref|NP_627000.1| Acetolactatsynthase [Streptomyces coelicolor 43(2)]. Jede Sequenz, die den vorstehenden Zugangsnummern zugeordnet ist, ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Acetolactatdecarboxylase (ALDC) ist ein Enzym, das der Familie der Carboxy-Lyasen angehört, die für die Spaltung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen verantwortlich sind. Die Acetolactatdecarboxylase katalysiert die Umwandlung von 2-Acetolactat (auch als 2-Hydroxy-2-methyl-3-oxobutanoat bezeichnet) zu 2-Acetoin und CO₂.
Acetolactatdecarboxylase-Enzyme katalysieren die enzymatische Reaktion mit der Klassifizierung EC 4.1.1.5 (Acetolactatdecarboxylaseaktivität) und dem Gene-Ontology(GO)-Begriff mit der ID GO: 0047605. Die GO-Begriffs-ID legt fest, dass jedes Protein, dem dieser GO-Begriff zugeordnet ist, ein Enzym mit katalytischer Acetolactatdecarboxylaseaktivität kodiert.
Verschiedene Acetolactatdecarboxylase(alsD)-Gene, die Acetolactatdecarboxylase-Enzyme kodieren, sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele von alsD-Genen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, gi|375143627|ref|YP_005006068.1| Acetolactatdecarboxylase [Niastella koreensis GR20-10]; gi|361057673|gb|AEV96664.1| Acetolactatdecarboxylase [Niastella koreensis GR20-10]; gi|218763415|gb|ACL05881.1| Acetolactatdecarboxylase [Desulfatibacillum alkenivorans AK-01]; gi|220909520|ref|YP_002484831.1| Acetolactatdecarboxylase [Cyanothece sp. PCC 7425]; gi|218782031|ref|YP_002433349.1| Acetolactatdecarboxylase [Desulfatibacillum alkenivorans AK-01]; gi|213693090|ref|YP_002323676.1| Acetolactatdecarboxylase [Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 = JCM 1222]; gi|189500297|ref|YP_001959767.1| Acetolactatdecarboxylase [Chlorobium phaeobacteroides BS1]; gi|189423787|ref|YP_001950964.1| Acetolactatdecarboxylase [Geobacter lovleyi SZ]; gi|172058271|ref|YP_001814731.1| Acetolactatdecarboxylase [Exiguobacterium sibiricum 255-15]; gi|163938775|ref|YP_001643659.1| Acetolactatdecarboxylase [Bacillus weihenstephanensis KBAB4]; gi|158522304|ref|YP_001530174.1| Acetolactatdecarboxylase [Desulfococcus oleovorans Hxd3]; gi|157371670|ref|YP_001479659.1| Acetolactatdecarboxylase [Serratia proteamaculans 568]; gi|150395111|ref|YP_001317786.1| Acetolactatdecarboxylase [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH1]; gi|150394715|ref|YP_001317390.1| Acetolactatdecarboxylase [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH1]; gi|146311679|ref|YP_001176753.1| Acetolactatdecarboxylase [Enterobacter sp. 638]; gi|109900061|ref|YP_663316.1| Acetolactatdecarboxylase [Pseudoalteromonas atlantica T6c]; gi|219866131|gb|ACL46470.1| Acetolactatdecarboxylase [Cyanothece sp. PCC 7425]; gi|213524551|gb|ACJ53298.1| Acetolactatdecarboxylase [Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 = JCM 1222]; gi|189420046|gb|ACD94444.1| Acetolactatdecarboxylase [Geobacter lovleyi SZ]; gi|158511130|gb|ABW68097.1| Acetolactatdecarboxylase [Desulfococcus oleovorans Hxd3]; gi|157323434|gb|ABV42531.1| Acetolactatdecarboxylase [Serratia proteamaculans 568]; gi|145318555|gb|ABP60702.1 Acetolactatdecarboxylase [Enterobacter sp. 638]; gi|149947563|gb|ABR53499.1| Acetolactatdecarboxylase [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH1]; gi|149947167|gb|ABR53103.1| Acetolactatdecarboxylase [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH1]; gi|163860972|gb|ABY42031.1| Acetolactatdecarboxylase [Bacillus weihenstephanensis KBAB4]; gi|109702342|gb|ABG42262.1| Acetolactatdecarboxylase [Pseudoalteromonas atlantica T6c]; gi|189495738|gb|ACE04286.1| Acetolactatdecarboxylase [Chlorobium phaeobacteroides BS1]; gi|171990792|gb|ACB61714.1| Acetolactatdecarboxylase [Exiguobacterium sibiricum 255-15]; gi|223932563|ref|ZP_03624564.1| Acetolactatdecarboxylase [Streptococcus suis 89/1591]; gi|194467531|ref|ZP_03073518.1| Acetolactatdecarboxylase [Lactobacillus reuteri 100-23]; gi|223898834|gb|EEF65194.1| Acetolactatdecarboxylase [Streptococcus suis 89/1591]; gi|194454567|gb|EDX43464.1| Acetolactatdecarboxylase [Lactobacillus reuteri 100-23]; gi|384267135|ref|YP_005422842.1| Acetolactatdecarboxylase [Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum YAU B9601-Y2]; gi|375364037|ref|YP_005132076.1| Acetolactatdecarboxylase [Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CAU B946]; gi|340793231|ref|YP_004758694.1| Acetolactatdecarboxylase [Corynebacterium variabile DSM 44702]; gi|336325119|ref|YP_004605085.1| Acetolactatdecarboxylase [Corynebacterium resistens DSM 45100]; gi|148269032|ref|YP_001247975.1| Acetolactatdecarboxylase [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]; gi|148268650|ref|YP_001247593.1| Acetolactatdecarboxylase [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]; gi|148543372|ref|YP_001270742.1| Acetolactatdecarboxylase [Lactobacillus reuteri DSM 20016]; gi|380500488|emb|CCG51526.1| Acetolactatdecarboxylase [Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum YAU B9601-Y2]; gi|371570031|emb|CCF06881.1| Acetolactatdecarboxylase [Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CAU B946]; gi|340533141|gb|AEK35621.1| Acetolactatdecarboxylase [Corynebacterium variabile DSM 44702]; gi|336101101|gb|AEI08921.1| Acetolactatdecarboxylase [Corynebacterium resistens DSM 45100]; gi|148530406|gb|ABQ82405.1| Acetolactatdecarboxylase [Lactobacillus reuteri DSM 20016]; gi|147742101|gb|ABQ50399.1| Acetolactatdecarboxylase [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]; gi|147741719|gb|ABQ50017.1| Acetolactatdecarboxylase [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]; gi|392529510|ref]ZP_10276647.1| Acetolactatdecarboxylase [Carnobacterium maltaromaticum ATCC 35586]; gi|366054074|ref|ZP_09451796.1| Acetolactatdecarboxylase [Lactobacillus suebicus KCTC 3549]; gi|339624147|ref|ZP_08659936.1| Acetolactatdecarboxylase [Fructobacillus fructosus KCTC 3544]; gi|336393727|ref|ZP_08575126.1| Acetolactatdecarboxylase [Lactobacillus coryniformis subsp. torquens KCTC 3535]. Jede Sequenz, die den vorstehenden Zugangsnummern zugeordnet ist, ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Alcoholdehydrogenase (ADH) ist ein Enzym, das die Reduktion von Aldehyden und/oder Ketonen zu Alkoholen katalysiert. Sekundäre Alkoholdehydrogenasen haben spezielle katalytische Aktivität bei Substraten, die in der Lage sind, sekundäre Alkohole zu produzieren. Sekundäre Alkohole sind diejenigen Alkohole, in denen der Kohlenstoff, der an die funktionelle Hydroxyl(Alkohol)-Gruppe gebunden ist, kovalent an zwei andere Kohlenstoffatome gebunden ist. Abhängig von der spezifischen ADH können einige Alkoholdehydrogenasen auch die Rückreaktion, die Oxidation von Alkoholen zu Aldehyden und/oder Ketonen, katalysieren. Alkoholdehydrogenasen verwenden typischerweise NAD-enthaltende Moleküle (wie NAP+, NADH und NADPH) als Cofaktoren in der enzymatischen Redoxreaktion mit ihren Substraten. Im Hinblick auf die Verfahren der vorliegenden Offenbarung, katalysiert die sekundäre Alkoholdehydrogenase die Reduktion eines Aldehyds und/oder Ketons zu einem Alkohol.
Alkoholdehydrogenase-Enzyme katalysieren die enzymatische Reaktion mit der Klassifizierung EC 1.1.1.1 (Alkoholdehydrogenaseaktivität) und dem Gene-Ontology(GO)-Begriff mit der ID GO: 0004025. Die GO-Begriffs-ID legt fest, dass jedes Protein, dem dieser GO-Begriff zugeordnet ist, ein Enzym mit katalytischer Alkoholdehydrogenaseaktivität kodiert.
Verschiedene Alkoholdehydrogenase(adh)-Gene, die Alkoholdehydrogenase-Enzyme kodieren, sind in der Technik bekannt. Beispiele von adh-Genen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, gi|2235 87866|emb|CAX36647.1| Alkoholdehydrogenase [Arthrobacter sp. JEK-2009]; gi|343083017|ref|YP_004772312.1| Alkoholdehydrogenase [Cyclobacterium marinum DSM 745]; gi|375146863|ref|YP_005009304.1| Alkoholdehydrogenase [Niastella koreensis GR20 10]; gi|332296134|ref|YP_004438057.1| Alkoholdehydrogenase [Thermodesulfobium narugense DSM 14796]; gi|327403757|ref|YP_004344595.1| Alkoholdehydrogenase (NADP(+)) [Fluviicola taffensis DSM 16823]; gi|325287739|ref|YP_004263529.1|Alkoholdehydrogenase [Cellulophaga lytica DSM 7489]; gi|325295143|ref|YP_004281657.1|Alkoholdehydrogenase [Desulfurobacterium thermolithotrophum DSM 11699]; gi|325289753|ref|YP_004265934.1| Alkoholdehydrogenase [Syntrophobotulus glycolicus DSM 8271]; gi|325289499|ref|YP_004265680.1| Alkoholdehydrogenase [Syntrophobotulus glycolicus DSM 8271]; gi|325110410|ref|YP_004271478.1| Alkoholdehydrogenase [Planctomyces brasiliensis DSM 5305]; gi|325108594|ref|YP_004269662.1| Alkoholdehydrogenase [Planctomyces brasiliensis DSM 5305]; gi|319955560|ref|YP_004166827.1| Alkoholdehydrogenase [Cellulophaga algicola DSM 14237]; gi|325065591|gb|ADY73598.1 Alkoholdehydrogenase [Desulfurobacterium thermolithotrophum DSM 11699]; gi|332179237|gb|AEE14926.1| Alkoholdehydrogenase [Thermodesulfobium narugense DSM 14796]; gi|324970678|gb|ADY61456.1| Alkoholdehydrogenase [Planctomyces brasiliensis DSM 5305]; gi|324968862|gb|ADY59640.1| Alkoholdehydrogenase [Planctomyces brasiliensis DSM 5305]; gi|324965154|gb|ADY55933.1| Alkoholdehydrogenase [Syntrophobotulus glycolicus DSM 8271]; gi|324964900|gb|ADY55679.1| Alkoholdehydrogenase [Syntrophobotulus glycolicus DSM 8271]; gi|374373821|ref|ZP_09631481.1| Alkoholdehydrogenase [Niabella soli DSM 19437]; gi|373234794|gb|EHP54587.1| Alkoholdehydrogenase [Niabella soli DSM 19437]; gi|361060909|gb|AEV99900.1 Alkoholdehydrogenase [Niastella koreensis GR20-10]; gi|375144658|ref|YP_005007099.1| Alkoholdehydrogenase [Niastella koreensis GR20-10]; gi|332981006|ref|YP_004462447.1| Alkoholdehydrogenase Zink-bindendes Domäne-enthaltendes Protein [Mahella australiensis 50-1 BON]; gi|332666040|ref|YP_004448828.1| Alkoholdehydrogenase [Haliscomenobacter hydrossis DSM 1100]; gi|330837587|ref|YP_004412228.1| Alkoholdehydrogenase [Sphaerochaeta coccoides DSM 17374]; gi|330837463|ref|YP_004412104.1| Alkoholdehydrogenase [Sphaerochaeta coccoides DSM 17374]; gi|330836315|ref|YP_004410956.1| Alkoholdehydrogenase [Sphaerochaeta coccoides DSM 17374]; gi|327405514|ref|YP_004346352.1| Alkoholdehydrogenase Zink-bindendes Domäne-enthaltendes Protein [Fluviicola taffensis DSM 16823]; gi|325298359|ref|YP_004258276.1| Alkoholdehydrogenase [Bacteroides salanitronis DSM 18170]; gi|325291396|ref|YP_004267577.1| Alkoholdehydrogenase [Syntrophobotulus glycolicus DSM 8271]; gi|325281283|ref|YP_004253825.1| Alkoholdehydrogenase (NADP(+)) [Odoribacter splanchnicus DSM 20712]; gi|325299524|ref|YP_004259441.1| Alkoholdehydrogenase [Bacteroides salanitronis DSM 18170]; gi|325106236|ref|YP_004275890.1| Alkoholdehydrogenase [Pedobacter saltans DSM 12145]; gi|320333315|ref|YP_004170026.1| Alkoholdehydrogenase [Deinococcus maricopensis DSM 21211]; gi|329749366|gb|AEC02722.1| Alkoholdehydrogenase [Sphaerochaeta coccoides DSM 17374]; gi|324319077|gb|ADY36968.1| Alkoholdehydrogenase [Bacteroides salanitronis DSM 18170]; gi|324317912|gb|ADY35803.1| Alkoholdehydrogenase [Bacteroides salanitronis DSM 18170]; gi|384129895|ref|YP_005512508.1| Alkoholdehydrogenase [Hydrogenobacter thermophilus TK-6]; gi|357419011|ref|YP_004932003.1| Alkoholdehydrogenase [Thermovirga lienii DSM 17291]; gi|332981068|ref|YP_004462509.1| Alkoholdehydrogenase Zink-bindendes Domäne-enthaltendes Protein [Mahella australiensis 50-1 BON]; gi|330837556|ref|YP_004412197.1| Alkoholdehydrogenase [Sphaerochaeta coccoides DSM 17374]; gi|330836856|ref|YP_004411497.1| Alkoholdehydrogenase [Sphaerochaeta coccoides DSM 17374]; gi|327398952|ref|YP_004339821.1| Alkoholdehydrogenase [Hippea maritima DSM 10411]; gi|325290821|ref|YP_004267002.1| Alkoholdehydrogenase [Syntrophobotulus glycolicus DSM 8271]; gi|322833567|ref|YP_004213594.1| Alkoholdehydrogenase [Rahnella sp. Y9602]; gi|308049202|ref|YP_003912768.1| Alkoholdehydrogenase [Ferrimonas balearica DSM 9799]; gi|302392706|ref|YP_003828526.1| Alkoholdehydrogenase [Acetohalobium arabaticum DSM 5501]; gi|302336054|ref]YP_003801261.1| Alkoholdehydrogenase [Olsenella uli DSM 7084]; gi|302335092|ref|YP_003800299.1| Alkoholdehydrogenase [Olsenella uli DSM 7084]; gi|152966730|ref|YP_001362514.1| Alkoholdehydrogenase [Kineococcus radiotolerans SRS30216]. Jede Sequenz, die den vorstehenden Zugangsnummern zugeordnet ist, ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Acetolactatdecarboxylase-Polypeptid unempfindlich gegenüber Sauerstoff. In dieser Ausführungsform würde die Acetolactatdecarboxylase selbst in Abwesenheit von Sauerstoff in der Umgebung Enzymaktivität bezüglich ihrer Substrate zeigen. In einigen Ausführungsformen ist die sekundäre Alkoholdehydrogenase im Wesentlichen unempfindlich gegenüber Sauerstoff. In dieser Ausführungsform würde die sekundäre Alkoholdehydrogenase selbst in Abwesenheit von Sauerstoff in der Umgebung Enzymaktivität bezüglich ihrer Substrate zeigen.
In manchen Ausführungsformen erfordert das sekundäre Alkoholdehydrogenase-Polypeptid NADPH als Cofaktor. Dies bedeutet, dass die sekundäre Alkoholdehydrogenase (sADH) NADPH-abhängig ist.
In manchen Ausführungsformen induziert das sekundäre Alkoholdehydrogenase-Polypeptid S-Chiralität in seinen Substraten. In einigen Ausführungsformen induziert das sekundäre Alkoholdehydrogenase-Polypeptid R-Chiralität in seinen Substraten.
Wie hier verwendet, bezieht sich „chiral” auf eine molekulare Verbindung, die mit ihrem Spiegelbild nicht deckungsgleich ist. Das Molekül und sein Spiegelbild werden daher mit ihrer ”Chiqralität”, häufig mit S oder R, genannt. Verschiedene Enzyme haben die Fähigkeit, eine S-Konfiguration auf dem Substrat zu induzieren, um ein S-Produkt zu bilden, oder eine R-Konfiguration auf seinem Substrat zu induzieren, um ein R-Produkt zu bilden. Wenn ein gegebenes Molekül mehr als einen asymmetrischen Kohlenstoff hat, dann können verschiedene Enzyme mehrere S- und R-Konfigurationen an den verschiedenen asymmetrischen Kohlenstoffatomen in dem Zielmolekül induzieren.
Die vorliegende Offenbarung identifiziert spezifische Polynukleotide/Gene, die für die Verfahren, Zusammensetzungen und Organismen der Offenbarung geeignet sind. Es sollte jedoch erkannt werden, dass die absolute Identität solcher Gene nicht notwendig ist, da im Wesentlichen ähnliche Polynukleotide/Gene, die im Wesentlichen ähnliche Funktionen ausführen können, auch in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können. Zum Beispiel können Änderungen in einem bestimmten Gen oder Polynukleotid, das eine Sequenz enthält, die ein Polypeptid oder Enzym kodiert, durchgeführt werden und auf die Aktivität hin untersucht werden. Typischerweise beinhalten solche Änderungen konservative Mutation und stille Mutationen. Solche modifizierten oder mutierten Polynukleotide und Polypeptide können für die Expression oder Funktion von Enzymen unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren untersucht werden. Zusätzlich sind Homologe der Polynukleotide/Gene der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in den hierin offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren geeignet.
Aufgrund der inhärenten Degeneriertheit des genetischen Codes, können Polynukleotide, die für das im Wesentlichen gleiche oder ein funktionell äquivalentes Polypeptid kodieren, auch zur Klonierung und Expression der gleichen Polypeptide oder Enzyme verwendet werden. Wie es von einem Fachmann auf dem Gebiet verstanden wird, kann es vorteilhaft sein, eine kodierende Sequenz zu modifizieren, um ihre Expression in einem bestimmten Wirt zu verstärken. Der genetische Code ist redundant mit 64 möglichen Codons, aber die meisten Organismen verwenden typischerweise einen Teilsatz dieser Codons. Die Codons, die am häufigsten in einer Art verwendet werden, werden als optimale Codons bezeichnet und diejenigen, die nicht sehr oft genutzt werden als seltene oder geringverwendete Codons eingestuft. Codons können ersetzt werden, um die bevorzugte Codon-Verwendung von E. coli oder S. elongatus widerzuspiegeln, ein Prozess, der manchmal auch als ”codon optimization” oder ”controlling for species codon bias” bezeichnet wird (siehe Murray et al. 1989 Nucl. Acids Res. 17: 477–508). Ein Beispiel der Codon-Optimierung eines Polynukleotids ist in Beispiel 1 der vorliegenden Offenbarung vorhanden (siehe auch Tabelle 4).
Der Fachmann wird erkennen, dass, aufgrund der degenerierten Natur des genetischen Codes, eine Vielzahl von DNA-Verbindungen, die sich in ihren Nucleotidsequenzen unterscheiden, verwendet werden können, um ein gegebenes Polypeptid oder Enzym der Offenbarung zu kodieren. Die vorliegende Offenbarung schließt DNA-Verbindungen jeder Sequenz ein, die die Aminosäuresequenzen der Polypeptide und Proteine der Enzyme, die in den Zusammensetzungen und Verfahren der Offenbarung verwendet werden, kodieren. In ähnlicher Weise kann ein Polypeptid typischerweise eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, Deletionen und Insertionen in seiner Aminosäuresequenz ohne Verlust oder signifikanten Verlust der gewünschten Aktivität tolerieren.
Homologe von Polypeptiden oder Enzymen, die zur Erzeugung von Metaboliten geeignet sind, sind durch die hierin bereitgestellten Mikroorganismen und Verfahren umfasst. Der in Bezug auf ein ursprüngliches Enzym oder Gen einer ersten Familie oder Spezies verwendete Begriff „Homologe” bezieht sich auf verschiedene Enzyme oder Gene einer zweiten Familie oder Spezies, die durch funktionelle, strukturelle oder Genomanalysen bestimmt werden, ein Enzym oder Gen der zweiten Familie oder Spezies zu sein, die dem ursprünglichen Enzym bzw. Gen der ersten Familie oder Spezies entspricht. In den meisten Fällen haben Homologe funktionelle, strukturelle oder genomische Ähnlichkeiten. Es sind Techniken bekannt, durch die Homologe eines Enzyms oder Gens ohne Weiteres unter Verwendung genetischer Sonden und PCR kloniert werden können. Homologe können durch Bezugnahme auf verschiedene Datenbanken identifiziert werden und die Identität der klonierten Sequenzen als Homologe kann mit funktionellen Assays und/oder durch genomische Kartierung der Gene bestätigt werden.
Ein Protein besitzt „Homologie” oder ist „homolog” zu einem zweiten Protein, wenn die Nukleinsäuresequenz, die für das Protein kodiert, eine ähnliche Sequenz zu der Nukleinsäuresequenz hat, die für das zweite Protein kodiert. Alternativ dazu besitzt ein Protein Homologie zu einem zweiten Protein, wenn die beiden Proteine „ähnliche” Aminosäuresequenzen haben. Somit ist der Begriff „homologe Proteine” so definiert, dass die beiden Proteine ähnliche Aminosäuresequenzen haben.
Wie hierin verwendet, sind zwei Proteine (oder eine Region der Proteine) im Wesentlichen homolog, wenn die Aminosäuresequenzen mindestens etwa 30%, 40%, 50% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität beitzen. Ebenso sind zwei Polynukleotide (oder eine Region der Polynukleotide) im Wesentlichen homolog, wenn die Nukleinsäuresequenzen mindestens etwa 30%, 40%, 50% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität besitzen. Um die prozentuale Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuresequenzen zu bestimmen, werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke abgeglichen (z. B. können Lücken in eine oder beide einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz für das optimale Alignment eingeführt werden und nicht-homologe Sequenzen können für Vergleichszwecke außer Acht gelassen werden). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das Nucleotid wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz besetzt ist, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch (wie hierin verwendet ist eine Aminosäure- oder Nukleinsäure-„Identität” äquivalent zu einer Aminosäure- oder Nukleinsäure-„Homologie”). Die prozentuale Identität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die die Sequenzen gemeinsam haben, unter Berücksichtigung der Anzahl der Lücken und der Länge jeder Lücke, die für ein optimales Alignment der zwei Sequenzen eingeführt werden müssen.
In manchen Ausführungsformen der Offenbarung werden die kodierenden Sequenzen der Polynukleotide funktionsfähig an einen Promotor gebunden. In einigen Ausführungsformen ist der Promotor ein induzierbarer Promotor. In einigen Ausführungsformen ist der Promotor ein konstitutiver Promotor.
Wie hier verwendet, bezeichnet „induzierbarer Promotor” einen Promotor, der die Expression eines Polynukleotids, mit dem er operativ verbunden ist, nach zellulärer Wahrnehmung eines Reizes antreibt. Ebenso können induzierbare Promotoren die Expression eines Polynukleotids, mit dem er operativ verbunden ist, bei Entfernung des Reizes beenden. Ein Beispiel für einen induzierbaren Promotor der vorliegenden Offenbarung ist der Isopropyl-β-D-thiogalactosid(IPTG)-induzierbare Promotor, wobei dieser Promotor die Expression eines Polynukleotids, mit dem er operativ verbunden ist, nach Wahrnehmung des IPTG, einer exogenen Chemikalie, antreibt. Jeder geeignete induzierbare Promotor, der Verwendung findet in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung kann entsprechend verwendet werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass viele charakterisierte induzierbare Promotoren existieren und entsprechend den hierin offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden können.
Konstitutive Promotoren sind solche Promotoren, die im Wesentlichen unempfindlich gegenüber einer Steuerung durch externe Reize sind und die die Expression eines bestimmten Polynukleotids in einer im Wesentlichen konstanten Art und Weise fördern.
Die vorliegende Offenbarung stellt rekombinante Vektoren bereit, die rekombinante Polynukleotide zur Verwendung in Wirtsmikroorganismen, wie Cyanobakterien, enthalten.
Der hier verwendete Begriff „rekombinant” oder „heterolog” oder „heterologes Polynukleotid” oder „rekombinantes Polynukleotid” bezeichnet ein Polynukleotid, wobei die genaue Nukleotidsequenz des Polynukleotids einem gegebenen Wirt fremd ist (d. h. in diesem nicht natürlich vorkommt). Diese Begriffe können sich auch auf eine Polynukleotidsequenz beziehen, die natürlicherweise in einem bestimmten Wirt zu finden ist, aber in einer unnatürlichen (z. B. größer als oder kleiner als erwartet) Menge, oder zusätzlich, wenn die Sequenz eines Polynukleotids zwei oder mehrere Subsequenzen umfasst, die in derselben Beziehung zueinander in der Natur nicht gefunden werden. Zum Beispiel könnte, in Bezug auf das Letztere, ein rekombinantes Polynukleotid zwei oder mehr Sequenzen von nicht verwandten Polynukleotiden oder homologe Nukleotide angeordnet haben, um ein neues Polynukleotid machen. Insbesondere beschreibt die vorliegende Offenbarung die Einführung eines rekombinanten Vektors in einen Mikroorganismus, wobei der Vektor eine Polynukleotid-Kodierung für ein Polypeptid enthält, das normalerweise nicht in dem Mikroorganismus zu finden ist oder eine fremde Polynukleotid-Kodierung für ein im Wesentlichen homologes Polypeptid, das normalerweise im Wirtsorganismus vorkommt, enthält. In Bezug auf das Genom der Wirtszelle ist die Polynukleotidsequenz, die für das Polypeptid kodiert, dann rekombinant oder heterolog.
In manchen Ausführungsformen werden die rekombinanten Polynukleotide der vorliegenden Offenbarung stabil in das Genom des Wirtsorganismus integriert. In einigen Ausführungsformen ist der Wirtsorganismus ein Cyanobakterium, bei dem die rekombinanten Polynukleotide der vorliegenden Offenbarung stabil in seinem Genom integriert wurden. Wie hier verwendet, bezieht sich „stabil integriert”, wie in Bezug auf die stabile Integration eines rekombinanten Polynukleotids in ein Genom verwendet, auf das Phänomen, bei dem das rekombinante Polynukleotid physikalisch in die genomische DNA des Organismus integriert wurde, so dass mitotische und reproduktiven Vorgänge, die genomische DNA-Replikation erfordern, die genetische Information, die in dem rekombinanten Polynukleotid als physische Einheit des Wirtsgenoms enthaltenen ist, weitergeben.
In weiteren Ausführungsformen sind die rekombinanten Polynukleotide der vorliegenden Offenbarung nicht stabil in dem Wirtsorganismus, wie einem Cyanobakterium, integriert. In diesem Sinne wird das rekombinante Polynukleotid in einer Wirtszelle exprimiert, ohne stabil in das Wirtsgenom integriert zu werden.
In einigen Ausführungsformen umfasst der rekombinante Vektor oder die Expressionskassette kodierende Sequenzen für eine Acetolactatsynthase und eine Acetolactatdecarboxylase, die funktionsfähig an einen Promotor gebunden sind. In bevorzugten Ausführungsformen entspricht die kodierende Sequenz der Acetolactatsynthase der vorliegenden Offenbarung einem alsS-Polynukleotid oder einem Homologen davon. In bevorzugten Ausführungsformen entspricht die kodierenden Sequenz der Acetolactatdecarboxylase einem alsD-Polynukleotid oder einem Homologen davon.
Es sei darauf hingewiesen, dass im Hinblick auf rekombinante Moleküle die Polynukleotide und kodierende Sequenzen immer mit ihren entsprechenden Polypeptiden in Zusammenhang stehen. Ein Acetolactatsynthase-alsS-Polynukleotid wird ein ALS-Polypeptid produzieren. Ein Acetolactatdecarboxylase-alsD-Polynukleotid wird ein ALDC-Pulypeptid produzieren. Ein sekundäres Alkoholdehydrogenase-adh-Polynukleotid wird ein sADH-Polypeptid produzieren. Ein Polynukleotid oder eine kodierende Sequenz aus einem gegebenen Organismus impliziert, dass auch das jeweilige Polypeptid aus dem gegebenen Organismus stammt.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das alsS-Polynukleotid von Bacillus subtilis abgeleitet. In einigen Ausführungsformen, ist das alsD-Polynukleotid abgeleitet von einem Quellorganismus ausgewählt aus Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Aeromonas hydrophila, und Gluconacetobacter xylinus.
In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter aerogenes. In einigen Ausführungsformen enthält der rekombinante Vektor ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter cloacae. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus licheniformis. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus subtilis. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein alsD-Polynukleotid aus Aeromonas hydrophila. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein alsD-Polynukleotid aus Gluconacetobacter xylinus.
In einigen Ausführungsformen umfasst das rekombinante Polynukleotid kodierende Sequenzen für eine Acetolactatsynthase, eine Acetolactatdecarboxylase, und eine sekundäre Alkoholdehydrogenase. In bevorzugten Ausführungsformen entspricht die kodierende Sequenz der Acetolactatsynthase einem alsS-Polynukleotid oder einem Homologen davon. In bevorzugten Ausführungsformen entspricht die kodierenden Sequenz der Acetolactatdecarboxylase einem alsD-Polynukleotid oder einem Homologen davon. In bevorzugten Ausführungsformen entspricht die kodierenden Sequenz der sekundären Alkoholdehydrogenase einem adh-Polynukleotid oder einem Homologen davon.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das alsS-Polynukleotid abgeleitet von Bacillus subtilis. In einigen Ausführungsformen ist das alsD-Polynukleotid abgeleitet von einem Quellorganismus ausgewählt aus Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Aeromonas hydrophila, und Gluconacetobacter xylinus. In einigen Ausführungsformen ist das adh-Polynukleotid abgeleitet von einem Quellorganismus ausgewählt aus Candida parapsilosis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Clostridium beijerinckii, and Thermoanaerobacter brockii.
In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter aerogenes und ein adh-Polynukleotid aus Candida parapsilosis. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter aerogenes und ein adh-Polynukleotid aus Leuconostoc pseudomesenteroides. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter aerogenes und ein adh-Polynukleotid aus Clostridium beijerinckii. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter aerogenes und ein adh-Polynukleotid aus Thermoanaerobacter brockii.
In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter cloacae und ein adh-Polynukleotid aus Candida parapsilosis. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter cloacae und ein adh-Polynukleotid aus Leuconostoc pseudomesenteroides. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter cloacae und ein adh-Polynukleotid aus Clostridium beijerinckii. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Enterobacter cloacae und ein adh-Polynukleotid aus Thermoanaerobacter brockii.
In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus licheniformis und ein adh-Polynukleotid aus Candida parapsilosis. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus licheniformis und ein adh-Polynukleotid aus Leuconostoc pseudomesenteroides. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus lichenformis und ein adh-Polynukleotid aus Clostridium beijerinckii. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus licheniformis und ein adh-Polynukleotid aus Thermoanaerobacter brockii.
In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein adh-Polynukleotid aus Candida parapsilosis. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein adh-Polynukleotid aus Leuconostoc pseudomesenteroides. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein adh-Polynukleotid aus Clostridium beijerinckii. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Bacillus subtilis und ein adh-Polynukleotid aus Thermoanaerobacter brockii.
In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Aeromonas hydrophila und ein adh-Polynukleotid aus Candida parapsilosis. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Aeromonas hydrophila und ein adh-Polynukleotid aus Leuconostoc pseudomesenteroides. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Aeromonas hydrophila und ein adh-Polynukleotid aus Clostridium beijerinckii. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Aeromonas hydrophila und ein adh-Polynukleotid aus Thermoanaerobacter brockii.
In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Gluconacetobacter xylinus und ein adh-Polynukleotid aus Candida parapsilosis. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Gluconacetobacter xylinus und ein adh-Polynukleotid aus Leuconostoc pseudomesenteroides. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Gluconacetobacter xylinus und ein adh-Polynukleotid aus Clostridium beijerinckii. In einigen Ausführungsformen enthält das rekombinante Polynukleotid ein alsS-Polynukleotid aus Bacillus subtilis, ein alsD-Polynukleotid aus Gluconacetobacter xylinus und ein adh-Polynukleotid aus Thermoanaerobacter brockii.
In einigen Ausführungsformen werden rekombinante Polynukleotide der vorliegenden Offenbarung in einen Wirtsorganismus eingeführt. In einigen Ausführungsformen ist der Wirtsorganismus E. coli. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Wirtsorganismus ein Cyanobakterium. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Wirtsorganismus S. elongatus. Die Einführung der rekombinanten Polynukleotide in den Wirtsorganismus führt zu einer Transformation des Wirts, der einen transformierten Organismus erzeugt.
Wie hier verwendet, sind ”transformierte” Organismen diejenigen Organismen, denen ein rekombinantes Polynukleotid-Molekül zur Verfügung gestellt wurde. Transformierte Organismen unterscheiden sich daher dadurch von Wildtyp-Organismen, dass sie exogene genetische Information enthalten. Transformierte Organismen sind gemäß dieser Definition auch rekombinante Organismen. Verfahren zur Transformation von Wirtsorganismen sind nach Beispiel 1 weiter ausgeführt. Jedoch wird ein Fachmann erkennen, dass zusätzliche Transformationsverfahren bestehen können und in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung gegebenenfalls verwendet werden können.
In bevorzugten Ausführungsformen der Offenbarung produzieren die transformierten Organismen Acetoin. In bevorzugten Ausführungsformen produzieren die transformierten Organismen höhere Mengen an Acetoin im Vergleich zu einem Wildtyp-Organismus. In bevorzugten Ausführungsformen der Offenbarung produzieren die transformierten Organismen 2,3-Butandiol. In bevorzugten Ausführungsformen produzieren die transformierten Organismen höhere Mengen an 2,3-Butandiol im Vergleich zu einem Wildtyp-Organismus.
Verfahren zur Herstellung von Acetoin und 2,3-Butandiol
In manchen Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Herstellung von Acetoin in der Offenbarung bereitgestellt. Das Verfahren beinhaltet den Schritt des Bereitstellens eines Cyanobakteriums mit einem rekombinanten Vektor, der kodierende Sequenzen für eine Acetolactatsynthase (ALS) und eine Acetolactatdecarboxylase (ALDC) enthält, die funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft sind, um transformierte Cyanobakterien zu bilden. Das Verfahren beinhaltet weiterhin das Kultivieren der transformierten Cyanobakterien in einer photosynthetischen Umgebung, die CO₂ und Licht umfasst, wodurch die Expression der ALS und der ALDC zu der Produktion von Acetoin führt.
In manchen Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Herstellung von 2,3-Butandiol in der Offenbarung bereitgestellt. Das Verfahren beinhaltet den Schritt des Bereitstellens eines Cyanobakteriums mit einem rekombinanten Vektor, der kodierende Sequenzen für eine Acetolactatsynthase (ALS), eine Acetolactatdecarboxylase (ALDC) und eine sekundäre Alkoholdehydrogenase (sADH) enthält, die funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft sind, um transformierte Cyanobakterien zu bilden. Das Verfahren beinhaltet weiterhin das Kultivieren der transformierten Cyanobakterien in einer photosynthetischen Umgebung, die CO₂ und Licht umfasst, wodurch die Expression der ALS, der ALDC und der sADH zu der Produktion von 2,3-Butandiol führt.
In manchen Ausführungsformen sind die kodierende Sequenz der Acetolactatsynthase, die kodierenden Sequenz der Acetolactatdecarboxylase und die kodierende Sequenz der sekundären Alkoholdehydrogenase in den rekombinanten Polynukleotiden der vorliegenden Offenbarung aus einer bakteriellen oder Pilz-Quelle. In einigen Ausführungsformen ist die Acetolactatsynthase (ALS) eine bakterielle oder eine Pilz-ALS. In einigen Ausführungsformen ist die Acetolactatdecarboxylase (ALDC) eine bakterielle oder eine Pilz-ALDC. In einigen Ausführungsformen ist die sekundäre Alkoholdehydrogenase (sADH) eine bakterielle oder eine Pilz-sADH.
In manchen Ausführungsformen ist die ALS bakteriellen Ursprungs. In einigen Ausführungsformen ist die ALS eine ALS aus einer Bacillus sp. In einigen Ausführungsformen ist die ALS eine ALS aus Bacillus subtilis.
„Bakterien” oder ”Eubakterien”, bezieht sich auf eine Domäne von prokaryotischen Organismen. Die rekombinanten Polynukleotide und kodierende Sequenzen der vorliegenden Offenbarung können bakteriellen Ursprungs sein. Bakterien umfassen mindestens 11 der folgenden verschiedenen Gruppen: (1) Gram-positive(Gram+)-Bakterien, von denen es zwei Hauptunterteilungen gibt: (1) hohe G+C-Gruppe (Actinomycetes, Mycobacteria, Micrococcus, andere) (2) niedrige G+C-Gruppe (Bacillus, Clostridien, Lactobacillus, Staphylokokken, Streptokokken, Mykoplasmen); (2) Proteobakterien, z. B. Lila photosynthetische + nicht-photosynthetische, Gram-negative Bakterien (enthält die meisten ”normalen” Gram-negativen Bakterien); (3) Cyanobakterien, z. B. Sauerstoff-Phototrophe; (4) Spirochäten und verwandte Arten; (5) Planctomyces; (6) Bacteroides, Flavobacteria; (7) Chlamydia; (8) Grüne Schwefelbakterien; (9) Grüne Nichtschwefelbakterien (auch anaerobe Phototrophe); (10) strahlenresistenten Mikrokokken und Verwandte; (11) Thermotoga und Thermosipho thermophiles (siehe z. B. US 2011/0250060 ).
„Pilze” oder „Pilz-” bezieht sich auf Mitglieder einer großen Gruppe von eukaryotischen Organismen wie Hefen, Schimmel und Pilze. Pilze sind ergiebige und vielfältige Organismen, die unter die Klassifizierung der Eumycota fallen. Die rekombinanten Polynukleotide und kodierende Sequenzen der vorliegenden Erfindung können pilzlichen Ursprungs sein. Der pilzliche Ursprung der rekombinanten Polynukleotide können Pilze, einschließlich Arten aus den Gruppen Blastocladiomycetes, Chytridiomycetes, Glomeromycetes, Mikrosporidia, Neocallimastigomycetes, Ascomycetes und Basidiomycetes sein.
In manchen Ausführungsformen ist die sADH eine Pilz-sADH. In einigen Ausführungsformen ist die sADH eine Ascomyceten-sADH, eine firmicutes sADH, oder eine Saccharomyceten-sADH.
Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf Cyanobakterien, die eine Art von photoautotrophen Bakterien sind. Photoautotrophe Bakterien sind in der Regel Gramnegative Stäbchen, die ihre Energie aus Sonnenlicht durch den Prozess der Photosynthese erhalten. In diesem Prozess wird Energie aus Sonnenlicht bei der Synthese von Kohlenhydraten verwendet, die bei der Synthese von Biokraftstoffen weiter als Zwischenprodukte in rekombinanten Photoautotrophen eingesetzt werden können. In anderen Ausführungsbeispielen dienen die Photoautotrophe als Kohlenhydratquelle für die Verwertung durch nicht-photosynthetische Mikroorganismen (z. B. rekombinante E. coli), um Biokraftstoffe durch einen metabolisch organisierten Mikroorganismus zu produzieren. Bestimmte Photoautotrophe, genannt anoxygenen Photoautotrophe, wachsen nur unter anaeroben Bedingungen und benötigen weder Wasser als Wasserstoffquelle, noch produzieren sie Sauerstoff durch Photosynthese. Andere photoautotrophe Bakterien sind Sauerstoff-Photoautotrophe. Diese Bakterien sind in der Regel Cyanobakterien. Sie nutzen Chlorophyll-Pigmente und die Photosynthese in photosynthetischen Prozessen, ähnlich denen in Algen und komplexen Pflanzen. Während des Prozesses nutzen sie Wasser als Wasserstoffquelle und produzieren Sauerstoff als ein Produkt der Photosynthese (siehe z. B. US 2011/0250060 ).
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Offenbarung Cyanobakterien bereit, die rekombinante Polynukleotide zur Verwendung in der Produktion von Acetoin und 2,3-Butandiol enthalten. In einigen Ausführungsformen sind die Cyanobakterien eine Synechococcus sp. In einigen Ausführungsformen ist die Synechococcus sp. Synechococcus elongatus. In einigen Ausführungsformen ist die Synechococcus elongatus Synechococcus elongatus PCC7942. Ein Fachmann wird erkennen, dass andere Cyanobakterien gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können. Beispiele für andere exemplarische Cyanobakterien unfassen marine Cyanobakterien wie Synechococcus sp. WH8102, thermostabile Cyanobakterien, wie Thermosynechococcus elongatus BP-1, photoheterotrophe Canobakterien, wie Synechocystis sp. PCC6803 und filamentöse Cyanobakterien, wie Nostoc punctiforme.
Cyanobakterien umfassen verschiedene Arten von bakteriellen Stäbchen und Kokken, sowie bestimmte filamentöse Formen. Die Zellen enthalten Thylakoide, die Chlorophyll-enthaltende zytoplasmatische, plattenartige Membranen sind. Die Organismen produzieren Heterozysten, spezialisierte Zellen, von denen angenommen wird, dass sie bei der Fixierung von Stickstoff-Verbindungen fungieren (siehe z. B. US 2011/0250060 ).
Der hier verwendete Begriff „photosynthetische Umgebung” bezieht sich auf Umgebungen, in denen die Umgebungsbedingungen für die Photosynthese einer photosynthetischen Zelle geeignet sind. Insbesondere würde eine solche Umgebung ausreichende Mengen an Kohlendioxid (CO₂) und Licht enthalten, damit eine Photosynthese stattfinden kann.
Das CO₂ kann dem Organismus in einer Vielzahl von Arten bereitgestellt werden. CO₂ ist natürlich in der Atmosphäre vorhanden ist, so dass keine zusätzliche Ergänzung dieser Verbindung an den Organismus notwendig ist, solange die Umgebung des Organismus ausreichende Mengen an CO₂ enthält, damit ein photosynthetischer Organismus Photosynthese betreiben kann. Dies wird bevorzugt, da diese Methode CO₂ aus der Umwelt entfernt und es als ein Ausgangsmolekül in der biologischen Synthese eines chemischen Grundstoffs verwendet.
Das in den Verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendete Licht kann von jeglicher Qualität und Quantität sein, und aus jeglicher, in der Technik bekannten Quelle stammen, die einem photosynthetischen Organsimus ausreicht, um Photosynthese zu betreiben. Die Qualität des verwendeten Lichts kann von irgendeiner Wellenlänge im sichtbaren Lichtspektrum sein, wie etwa von 400 nm bis 800 nm, oder einer anderen Qualität des Lichts, die geeignet ist, Photosynthese zu fördern. Die Lichtmenge in der photosynthetischen Umgebung kann von jeder beliebigen Menge sein, solange die Lichtmenge ausreichend ist, damit Photosynthese stattfinden kann. Lichtmengen, die zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet sind, sind in Beispiel 1 bereitgestellt. Jedoch sind diese Lichtmengen lediglich beispielhaft und in keiner Weise einschränkend für die Menge an Licht, die in den offenbarten Verfahren verwendet werden könnten. Ein Fachmann würde den Umfang der Lichtmengen, die zur Verwendung in den offenbarten Verfahren geeignet ist, ohne Weiteres verstehen.
Die Lichtquelle kann aus jeder Lichtemissionsquelle stammen, so dass das Licht ausreichend ist, um Photosynthese in einem photosynthetischen Organismus zu fördern. Das Licht kann von einer Leuchtstofflampe oder eine Leuchtdiode sein. Alternativ dazu kann das Licht von natürlichem Sonnenlicht stammen. Ein Fachmann würde ohne Weiteres verstehen, dass viele verschiedene Lichtquellen in den Verfahren der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können. Mögliche Lichtquellen sind in Beispiel 1 bereitgestellt, diese stellen jedoch lediglich Möglichkeiten dar und begrenzen in keiner Weise den Umfang der Lichtquellen, die für die Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet sind.
In manchen Ausführungsformen erfolgt die Herstellung von Acetoin oder 2,3-Butandiol, oder mehreren, als ein Ergebnis der Kultivierung rekombinanter Cyanobakterien der vorliegenden Offenbarung unter konstantem Licht. Ein Fachmann wird ohne Weiteres erkennen, dass konstante Lichtenergie nur eine Methode zur Bereitstellung von Licht ist, um Photosynthese zu betreiben. Andere Beleuchtungsdauersysteme finden auch Verwendung in der vorliegenden Offenbarung und werden für den Fachmann offensichtlich sein.
In manchen Ausführungsformen erfolgt die Herstellung von Acetoin oder 2,3-Butandiol, oder mehreren, als ein Ergebnis der Kultivierung rekombinanter Cyanobakterien der vorliegenden Offenbarung in Gegenwart von Bicarbonat.
In bevorzugten Ausführungsformen stellen die Verfahren der Offenbarung transformierte Cyanobakterien bereit, die im Vergleich zu Kontroll-Cyanobakterien, denen das rekombinante Polynukleotid fehlt, unter den gleichen Bedingungen höhere Mengen Acetoin produzieren. In bevorzugten Ausführungsformen stellen die Verfahren der Offenbarung transformierte Cyanobakterien bereit, die im Vergleich zu Kontroll-Cyanobakterien, denen das rekombinante Polynukleotid fehlt, unter den gleichen Bedingungen höhere Mengen 2,3-Butandiol produzieren.
Wie hier verwendet, beziehen sich Kontroll-Cyanobakterien auf Cyanobakterien, die im Wesentlichen die gleichen wie die rekombinanten Cyanobakterien sind, jedoch fehlen den Kontroll-Cyanobakterien die rekombinanten Polynukleotide der in der vorliegenden Offenbarung beschriebenen rekombinanten Cyanobakterien. Beispiele für Kontroll-Cyanobakterien umfassen Wildtyp-Cyanobakterien der gleichen Art wie die rekombinante Cyanobakterien. Solche Wildtyp-Cyanobakterien könnten die Vorläufer der rekombinanten Cyanobakterien umfassen. Andere Kontroll-Cyanobakterien umfassen solche, die die Vektoren der vorliegenden Offenbarung tragen, jedoch ohne die im Vektor gelegenen rekombinanten Polynukleotide. Andere Typen von Kontroll-Cyanobakterien oder -Organismen werden für den Fachmann offensichtlich sein.
Beispielhafte Verfahren zum Nachweis von Acetoin- und 2,3-Butandiol-Konzentrationen von Organismen sind in Beispiel 1 bereitgestellt. Jedoch würde ein Fachmann erkennen, dass viele verschiedene Verfahren zum Nachweis von Metaboliten-Konzentrationen bekannt sind und praktiziert werden. Jede Methode, die die Konzentration von Acetoin und/oder 2,3-Butandiol in einer Probe quantifizieren kann, könnte Anwendung in der vorliegenden Offenbarung finden.
Das 2,3-Butandiol-Molekül hat zwei asymmetrische Kohlenstoffe und kann daher unterschiedliche Chiralität an jedem Chiralitätszentrum haben. Das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung produzierte 2,3-Butandiol kann (R,R)-2,3-Butandiol, (S,S)-2,3-Butandiol sein, oder es kann meso-2,3-Butandiol sein, bei dem ein asymmetrisches Kohlenstoffatom des Moleküls eine S-Konfiguration und ein asymmetrisches Kohlenstoffatom des Moleküls eine R-Konfiguration besitzt.
Zusatzinformationen
Die Ausübung der vorliegenden Offenbarung wird, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie, die dem Fachmann bekannt sind, einsetzen. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erläutert, wie Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (Gait, Hrsg., 1984); Animal Cell Culture (Freshney, Hrsg., 1987); Handbook of Experimental Immunology (Weir & Blackwell, Hrsg.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos, Hrsg., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, Hrsg., 1987.); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al, Hrsg., 1994.); Current Protocols in Immunology (Coligan et al, Hrsg., 1991.); The Immunoassay Handbook (Wild Hrsg., Stockton Press NY., 1994); Bioconjugate Techniques (Hermanson, Hrsg., Academic Press, 1996); und Methoden der immunologischen Analyse (Masseyeff, Albert, und Staines, Hrsg., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993).
Die prozentuale Identität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die die Sequenzen gemeinsam haben, unter Berücksichtigung der Anzahl der Lücken und der Länge jeder Lücke, die für das optimale Alignment der beiden Sequenzen eingebracht werden müssen. Für den Sequenzvergleich dient typischerweise eine Sequenz als eine Referenzsequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung eines Sequenzvergleichsalgorithmus werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, Subsequenzkoordinaten bestimmt, falls erforderlich, und Programmparameter für den Sequenzalgorithmus bestimmt. Standardprogrammparameter können verwendet oder alternative Parameter festgelegt werden. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann die prozentuale Sequenzidentitäten für die Testsequenzen relativ zu der Referenzsequenz, basierend auf den Programmparametern. Beim Vergleich zweier Sequenzen für die Identität, ist es nicht erforderlich, dass die Sequenzen zusammenhängend sind, jedoch würde jede Lücke einen Nachteil (penalty) mit sich tragen, der die Gesamtprozentidentität reduzieren würde. Für blastn sind die Standardparameter Gap opening penalty = 5 und Gap extension penalty = 2. Für blastp sind die Standardparameter gap opening penalty = 11 und Gap extension penalty = 1.
Ein „Vergleichsfenster”, wie hierin verwendet, schließt den Bezug auf ein Segment einer Anzahl an zusammenhängenden Positionen ein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus von 20 bis 600, gewöhnlich etwa 50 bis etwa 200, häufiger etwa 100 bis etwa 150, in dem eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit derselben Anzahl an zusammenhängenden Positionen verglichen werden kann, nachdem die zwei Sequenzen optimal ausgerichtet sind. Verfahren zur Anordnung von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem technischen Gebiet gut bekannt. Ein optimals Alignment von Sequenzen zum Vergleich kann mit bekannten Algorithmen durchgeführt werden (z. B. durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, Adv Appl Math 2:482, 1981; durch den Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch, J. Mol Biol, 48: 443, 1970; durch das search for similarity-Verfahren von Pearson und Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85: 2444, 1988; durch computerisierte Implementierungen dieser Algorithmen FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Informationen), GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI), oder durch manuelles Alignment und visuelle Untersuchung.
Ein bevorzugtes Beispiel eines Algorithmus, der zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der FASTA-Algorithmus (Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85: 2444, 1988; und Pearson, Methods Enzymol, 266: 227–258, 1996). Die bevorzugten Parameter, die in einem FASTA-Alignment von DNA-Sequenzen zur Berechnung der prozentualen Identität verwendet wurden, sind optimiert, BL50 Matrix 15:–5, k-tuple=2; joining penalty=40, optimization=28; gap penalty-12, gap length penalty=–2; und width=16.
Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für Algorithmen, die zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit geeignet sind, sind die BLAST- und BLAST 2.0-Algorithmen (Altschul et al., Nuc Acids Res, 25: 3389–3402, 1977; beziehungsweise Altschul et al., J Mol Biol, 215: 403–410, 1990). BLAST und BLAST 2.0 werden verwendet, mit den hier beschriebenen Parameter, um die prozentuale Sequenzidentität für die Nukleinsäuren und Proteinen der Offenbarung zu bestimmen. Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist durch die National Center for Biotechnology Information Website öffentlich zugänglich. Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren von high scoring Sequenzpaaren (HSPs) durch Identifizierung kurzer Wörter der Länge W in der Abfragesequenz, die entweder der positiv bewerteten Grenzwert-Punktzahl T (threshold-score T) entsprechen oder genügen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz abgeglichen werden. T wird als Nachbarschaftswortanzahl-Grenzwert (neighborhood word score treshold) bezeichnet. Diese anfänglichen Nachbarschaftsworttreffer dienen als Ansatz zur Initiierung von Suchen zur Auffindung von längeren HSPs, die diese enthalten. Die Worttreffer werden in beide Richtungen entlang jeder Sequenz, so weit wie das kumulative Alignment Score erhöht werden kann, erweitert. Kumulative Punktzahlen für Nukleotidsequenzen werden berechnet unter Verwendung von Parameter M (Belohnungs Punktzahl für ein Paar von passenden Rückständen, immer > 0) und N (Strafpunktzahl für nichtpassende Reste; immer < 0). Für Aminosäuresequenzen wird eine Bewertungsmatrix verwendet, um die kumulative Punktzahl zu berechnen. Verlängerung der Worttreffer in jede Richtung werden gestoppt, wenn: die kumulative Abgleichpunktzahl (alignment score) um die Menge X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; die kumulative Bewertung, aufgrund der Akkumulation eines oder mehrerer Negativbertungs-Resteabgleiche (negative-scoring residue alignments) auf Null oder darunter geht; oder das Ende einer der beiden Sequenzen erreicht wird. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des Alignments. Das BLASTN-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Vorgaben eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm als Vorgaben eine Wortlänge von 3 und eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Scoring-Matrix (Henikoff und Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89: 10915, 1989), Alignments (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4, und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin und Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90: 5873–5787, 1993). Ein Maß für die Ähnlichkeit, das vom BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit gibt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäure als ähnlich zu einer Referenzsequenz angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Testnukleinsäure zur Referenznukleinsäure weniger als etwa 0,2, bevorzugt weniger als etwa 0,01 und am meisten bevorzugt weniger als etwa 0,001 beträgt.
Ein weiteres Beispiel eines nützlichen Algorithmus ist PILEUP. PILEUP erzeugt ein multiples Sequenzalignment von einer Gruppe von verwandten Sequenzen unter Verwendung von progressiven, paarweisen Alignments, um die Beziehung und die prozentuale Sequenzidentität zu zeigen. Es zeichnet auch einen Baum oder ein Dendrogramm, das die Cluster-Beziehungen zeigt, die verwendet wurden, um das Alignment zu schaffen. PILEUP verwendet eine Vereinfachung des progressiven Alignmentverfahrens (Feng und Doolittle, J. Mol Evol, 35: 351–360, 1987), unter Verwendung einer zu einer veröffentlichten Methode ähnlichen Methode (Higgins und Sharp, CABIOS 5: 151–153, 1989). Das Programm kann bis zu 300 Sequenzen abgleichen, jede mit einer maximalen Länge von 5.000 Nukleotiden oder Aminosäuren. Das multiple Alignmentverfahren beginnt mit der paarweisen Gegenüberstellung der zwei ähnlichsten Sequenzen, wodurch ein Cluster von zwei abgeglichenen Sequenzen entsteht. Dieser Cluster wird dann zu der nächsten am meisten verwandten Sequenz oder einem Cluster von abgeglichenen Sequenzen ausgerichtet. Zwei Cluster von Sequenzen werden durch eine einfache Erweiterung des paarweisen Alignments von zwei einzelnen Sequenzen abgeglichen. Das endgültige Alignment wird durch eine Reihe von progressiven, paarweisen Alignments erreicht. Das Programm wird durch Bestimmung spezifischer Sequenzen und ihrer Aminosäure- oder Nucleotid-Koordinaten für Bereiche des Sequenzvergleichs und durch Bestimmung der Programmparameter betrieben. Mit PILEUP wird eine Referenzsequenz mit anderen Testsequenzen verglichen, um die prozentuale Sequenzidentitätsbeziehung unter Verwendung der folgenden Parameter zu bestimmen: default gap weight (3,00), default gap length weight (0,10), und weighted end gaps. PILEUP kann mit dem GCG-Sequenzanalyse-Software-Paket erhalten werden, z. B. Version 7.0 (Devereaux et al, Nuc Acids Res., 12: 387–395, 1984).
Ein weiteres bevorzugtes Beispiel eines Algorithmus, der für multiple DNA- und Aminosäuresequenz-Alignments geeignet ist, ist das CLUSTALW-Programm (Thompson et al., Nucl Acids. Res. 22: 4673–4680, 1994). ClustalW führt mehrere paarweise Vergleiche zwischen Gruppen von Sequenzen durch und montiert sie zu einem multiplen Alignment auf Basis von Homologie. Gap open und Gap extension penalties betrugen 10 bzw. 0,05. Für Aminosäure-Alignments kann der BLOSUM-Algorithmus als eine Proteingewichtsmatrix verwendet werden (Henikoff und Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89: 10915–10919, 1992).
Die Polynukleotide der Offenbarung umfassen ferner Polynukleotide, die konservativ modifizierte Varianten der Polypeptide von Tabelle 4 und der Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der SEQS-ID NOS: 1–23 kodieren. „Konservativ modifizierte Varianten”, wie hier verwendet, umfassen einzelne Mutationen, die zu der Substitution einer Aminosäure durch eine chemisch ähnliche Aminosäure führen. Konservative Substitutionstabellen, die funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind im Stand der Technik bekannt. Solche konservativ modifizierten Varianten sind ein Zusatz zu polymorphen Varianten, Interspezies-Homologen und Allelen der Offenbarung und schließen diese nicht aus. Die folgenden acht Gruppen enthalten Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind: 1. Alanin (A), Glycin (G); 2. Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E); 3. Asparagin (N), Glutamin (Q); 4. Arginin (R), Lysin (K); 5. Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); 6. Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W); 7. Serin (S), Threonin (T); und 8. Cystein (C), Methionin (M).
Die Begriffe „abgeleitet von” oder „von”, verwendet in Bezug auf eine Nukleinsäure oder ein Protein, geben an, dass ihre/seine Sequenz identisch ist, oder im Wesentlichen identisch ist mit der eines Organismus von Interesse.
Der Begriff „entsprechend”, verwendet in Bezug auf ein Cyanobakterium, bezieht sich auf ein Cynaobakterium derselben Gattung und Art wie das Cynaobakterium von Interesse. Im Hinblick auf eine S. elongates, umfassend ein rekombinantes Polynukleotid, das eine ALS und eine ALDC kodiert, ist zum Beispiel ein „entsprechendes Cynaobakterium” eine S. elongates-Zelle (Wildtyp, Vorläufer oder anderweitig vergleichbar), der das rekombinante Polynukleotid fehlt.
Die Begriffe „Abnahme”, „reduzieren”, und „Reduktion”, verwendet in Bezug auf die biologische Funktion (z. B. die enzymatische Aktivität, die Produktion der Verbindung, die Expression eines Proteins, etc.), beziehen sich auf eine messbare Verringerung in der Funktion von vorzugsweise mindestens 10%, bevorzugter mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 90%. In Abhängigkeit von der Funktion, kann die Reduktion von 10% bis 100% betragen. Der Begriff „wesentliche Verminderung” und dergleichen bezieht sich auf eine Reduktion von mindestens 50%, 75%, 90%, 95%, oder 100%.
Die Begriffe „Zunahme”, „erhöhen” und „Erhöhung”, verwendet in Bezug auf die biologische Funktion (z. B. die enzymatische Aktivität, die Produktion der Verbindung, die Expression eines Proteins, etc.), beziehen sich auf eine messbare Steigerung der Funktion von vorzugsweise mindestens 10%, bevorzugter mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 90%. In Abhängigkeit von der Funktion, kann die Erhöhung von 10% bis 100% betragen; oder mindestens das 10-fache, 100-fache, oder 1000-fache bis 100-fache, 1000-fache bzw. 10.000-fache oder mehr. Der Begriff „wesentliche Erhöhung” und dergleichen bezieht sich auf eine Erhöhung von mindestens 50%, 75%, 90%, 95%, oder 100%.
Die Begriffe „isoliert” und „gereinigt”, wie hierin verwendet, bezeichnen ein Material, das aus mindestens einer Komponente, mit dem es natürlicherweise assoziiert ist, entfernt wird (z. B. aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde). Der Begriff „isoliert”, verwendet in Bezug auf eine biosythetisch produzierte Chemikalie, bezieht sich auf eine Chemikalie, die aus dem Kulturmedium der Bakterien, die die Chemikalie hergestellt haben, entfernt wurde. Da eine solche isolierte Chemikale frei von fremden oder unerwünschten Verbindungen ist (z. B. Substratmolekülen, bakteriellen Komponenten, etc.).
Wie hier verwendet, umfasst die Singularform „ein”, „eine” und ”der/die/das” den Plural, sofern nicht anders angegeben. Zum Beispiel umfasst „eine” ALD einen oder mehrere ALDs.
Der Begriff „umfassend”, wie hier verwendet, ist offen, was anzeigt, dass solche Ausführungsformen zusätzliche Elemente enthalten können. Im Gegensatz dazu ist der Ausdruck „bestehend aus” geschlossen, was anzeigt, dass solche Ausführungsformen keine zusätzliche Elemente enthalten (außer Spurenverunreinigungen). Der Ausdruck „im Wesentlichen bestehend aus” ist teilweise geschlossen, was anzeigt, dass solche Ausführungsformen weitere Elemente umfassen können, die die grundlegenden Eigenschaften von solchen Ausführungsformen nicht wesentlich ändern. Es versteht sich, dass Aspekte und Ausführungsformen, die hierin als „umfassend” beschrieben sind, „bestehend aus”- und/oder „im Wesentlichen bestehend aus”-Aspekte und -Ausführungsformen enthalten.
BEISPIELE
Um das bessere Verständnis der Ausführungsformen der Offenbarung zu erleichtern, werden die folgenden Beispiele vorgelegt. Die folgenden Bespiele sind lediglich beschreibend und nicht in irgendeiner Weise als limitierend für irgendeine Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung zu verstehen.

Abkürzungen: ALDC (Acetoalactat Decarboxylase); ALS (Acetolactat Synthase); sADH (zweite Alkohol Dehydrogenase); und 23BD (2,3-Butandiol).

BEISPIEL 1 – Produktion von Acetoin und 2,3-Butandiol in rekombinanten Mikroorganismen
Die folgenden Beispiele beschreiben die Manipulation von heterologen Acetoin- und 2,3-Butandiol-biosynthetischen Stoffwechselwegen in einem beispielhaften photosynthetischen Mikroorganismus (z. B. Synechococcus elongatus), sowie die erfolgreiche Herstellung dieser chemischen Grundstoffe aus Kohlendioxid und Lichtenergie.
Material und Methoden
Reagenzien. Die Chemikalien (R,R)-2,3-Butandiol, meso-2,3-Butandiol, (S,S)-2,3-Butandiol und Acetoin wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. NADH und IPTG wurden von Fischer Scientific (Hanover Park, IL) bezogen. Phusion Polymerase wurde von NEB(Ipswhich, MA) erworben. KOD Polymerase und NADPH wurden von EMD4Biosciences (San Diego, CA) erworben. Gentamicin wurde von Teknova (Hollister, CA) erworben. Oligonukleotide wurden von Integrated DNA Technologies, Inc. (San Diego, CA) synthetisiert.
Stämme und Plasmide. Hier beschriebene Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt, während hier beschriebenen Plasmide in Tabelle 2 aufgeführt sind. Alle Plasmide außer pAL60 wurden mittels Sequenz und Ligase unabhängiger Klonierung (SLIC) (50) in E. coli XL1-Blue (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) konstruiert. Primer für die Konstruktion und die Genotypbestätigung sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 1: Mikroorganismen Stämme
Tabelle 2: Plasmide

Tabelle 3: Für die Plasmidkonstruktion und den Integrationsnachweis verwendete Oligonukleotide
Eine Neutral Site (NS) angesiedelt zwischen Synpcc7942_0893 (903,564–904,283 bp) und Synpcc7942_0894 (904,845–905,417 bp) im S. elongatus Chromosom wurde zur Insertion einer Expressionkassette verwendet. Diese Region wurde mit den Primern MC173 und MC176 amplifiziert. PCR Produkte wurden mit AatII und AvrII verdaut und in mit denselben Enzymen geschnittenen pZE12-luc (51) kloniert, wodurch pAL60 erzeugt wurde.
Das Fragment, das P_LlacO1 und alsS(B. s.)-Gene enthielt, wurde mit den Primern IM103 und IM11 amplifiziert und lacI^q wurde mit den Primern IM39 und AK3 aus pSA69 (52) amplifiziert. Die resuitierenden Fragmente wurden durch SLIC in pAL60 eingebracht, wodurch pAL301 erzeugt wurde.
Um alsD (E. a.) zu klonieren, haben wir genomische DNA von E. aerogenes ATCC13048 (ATCC) als PCR Template mit den Primern IM16 und IM17 verwendet. Um alsD (E. c.) zu klonieren, haben wir genomische DNA von E. cloacae ATCC 13047 (ATCC) mit den Primern IM23 und IM24 als PCR Template verwendet. Um alsD (B. l.) zu klonieren, haben wir genomische DNA von B. licheniformis ATCC 14580 (ATCC) mit den Primern IM16 und IM17 als PCR Template verwendet Um alsD (G. x.) zu klonieren, haben wir genomische DNA von G. xylinus (NBRC 3288) mit den Primern IM21 und IM22 als PCR Template verwendet. alsD (B. s) und alsD (A. h.) wurden chemisch synthetisiert mittels DNA2.0 Inc. (Menlo Park, CA), um die Kodonverwendung für S. elongatus zu optimieren. Jedes alsD Gen wurde mittels SLIC stromabwärts von alsS (B. s.) in pAL301 kloniert, was pAL302, pAL303, pAL304, pAL305, pAL306 und pAL307 erzeugte. Um das Plasmid pAL312 zu konstruieren, wurde Plasmid pAL301 als ein PCR Template verwendet und die Primer IM114 und IM11 verwendet, um das gesamte Plasmid ohne alsS Gen zu amplifizieren. Das resultierende Fragment wurde mittels SLIC zusammengesetzt. Alle vier adh-Gene wurden chemisch mittels DNA2.0 Inc. (Menlo Park, CA) synthetisiert, um die Kodonverwendung für S. elongatus zu optimieren. Jedes adh-Gen wurde durch SLIC stromabwärts von alsD (E. a.) in pAL302 kloniert, wodurch pAL308 pAL309, pAL310 und pAL315 erzeugt wurden. Die adh(T. b.)- und adh(C. b.)-Gene wurden durch SLIC stromabwärts von alsD (A. h.) in pAL306 kloniert, jeweils pAL299 und pAL300 erzeugend.
Transformation von S. elongatus. Transformation von S. elongatus wurde wie beschrieben (53) durchgeführt. Stämme wurden durch mehrmaligen Transfer der Kolonien auf frische, selektive Platten getrennt. Korrekte Rekombinanten wurden mittels PCR bestätigt, um die Integration der zielenden Gene in das Chromosom nachzuweisen. Die verwendeten und hergestellten Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt. NS zwischen Synpcc7942_0893 (903,564–904,283 bp) und Synpcc7942_0894 (904,845–905,417 qbp) auf dem S. elongatus Chromosom wurde als ein Zielort für die Rekombination verwendet. Es wurde bestätigt, dass das Einbringen des Gentamicin-Resistenzgens an dieser Stelle das Wachstum der Zellen nicht beeinflusst.
Sauerstoffentwicklung. O₂ Entwicklung wurde mittels einer Clark-Typ Elektrode mit dem Oxygraphsystem (Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, UK) gemessen. Unter Umgebungslichtbedingungen wurden 1 ml Zellen in 4 ml Borosilikat Glaskammern überführt und Gas im Kopfraum wurde unter Verwendung eines Kontaktstößels mit einer Mittelbohrung mit Gummikappe verdrängt. Die Zellen wurden bei 100 rpm unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt und alle zwei Minuten der Dunkelheit ausgesetzt, um es den Zellen zu ermöglichen, sich mit dem sie umgebenden Wassermantel bei 25°C abzugleichen. Eine konstante Negativrate über mindestens 30 s wurde nach dem Abgleich aufgezeichnet. Die Zellen wurden dann exzessivem Licht ausgesetzt (60 μE s^–1m^–2) und diesen ermöglicht, für mindestens 2 Minuten zu equilibrieren, bis über mindestens 60 s eine konstant Rate gemessen werden konnte.
Enzymassays. S. elongatus Zellen wurden 72 h nach Induktion mittels Zentrifugation geerntet (4000 g, 5 min, gewaschen in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) und im selben Puffer resuspendiert. Rohextrakte wurden mit 0,1-mm Glasperlen und einem Mini bead beater (Mini Bead Beater 8 (BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK)) behandelt. Die Bestimmung des Gesamtproteins wurde mit Avance Protein Assay Reagenz von Cytoskeleton, In. (Denver, CO) durchgeführt.
Acetolactatsynthase(ALS)-Aktivität wurde wie beschrieben bestimmt (54). Die Konzentration von produziertem Acetoin wurde durch eine Standardkurve unter Verwendung von reinem Acetoin gemessen. Eine spezifische Einheit der AlsS-Aktivität entspricht der Bildung von 1 nmol Acetoin pro mg Protein pro Minute.
Alkoholdehydrogenase(ADH)-Aktivität wurde durch die Messung der NAD(P)H Oxidation bestimmt. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM 3-(N-morpholino)Propan Sulfonsäure (MOPS) pH 7,0, 25 mM Acetoin und 0,2 mM NAD(P)H. NAD(P)H Verbrauch wurde bei 340 nm gemessen. Eine spezifische Einheit der ADH-Aktivität entspricht der Oxidation von 1 nmol NAD(P)H pro Minute pro mg Protein.
Berechnung der Produktivitäten. Die folgenden Berichte liefern eine Zusammenfassung, wie die Produktivität für spezifische Verbindungen berechnet wurde ( ).
Für 2,3-Butandiol wurde die Produktivität pro Tag über 3 Tage gemittelt. Die Erträge betrugen pro Tag 175 mgl^–1, 297 mgl^–1 und 237 mgl^–1 für die Zeiträume 24 h–48 h, 48 h – 72 h bzw. 72 h–96 h. Durch Umwandlung der Einheiten erhält man 7292 μgl^–1h^–1, 12375 μgl^–1h^–1 bzw. 9875 μgl^–1h^–1. Das Mittel dieser Raten beträgt 9847 μgl^–1h^–1.
Für Isobutyraldehyd ist die Rate in der Literatur berechnet (55).
Für Fettsäuren betrug der scheinbare maximale Titer 197 mgl^–1, welcher über einen Zeitraum von wenigstens 2 Tagen hergestellt wurde – Umwandlung der Einheiten ergibt 4104,2 μgl^–1h^–1 (56).
Für Ethanol betrug der scheinbare maximale Titer 13 Millimol l^–1 hergestellt in 145 Stunden. Unter Verwendung der molaren Masse von Ethanol (46,07 g mol^–1), resultiert dies in 575,9 mgl^–1 über 145 Stunden. Umwandlung der Einheiten ergibt 3972 μg l^–1h^–1 (57).
Für Isobutanol beträgt der veröffentlichte Titer 450 mgl^–1 über 6 Tage. Umwandlung der Einheiten ergibt 3125 μgl^–1h^–1 (55).
Für Aceton betrug der scheinbare maximale Titer 36 mgl^–1 über 4 Tage. Umwandlung der Einheiten ergibt 375 μgl^–1h^–1 (58).
Für Ethylen betrug die scheinbar höchste Rate 240 nlml^–1h^–1. Dies kann unter Verwendung des molaren Volumens eines idealen Gases unter Raumtemperatur und -druck (24,465 lmol^–1 at 25°C und 1 atm) und Umwandlung der Einheiten auf 9,81 μmoll^–1h^–1 geschätzt werden. Unter Verwendung der molaren Masse von Ethylen (28,05 gmol^–1), wird dies 275,17 μgl^–1h^–1 (59).
Für 1-Butanol betrug der scheinbar höchste Titer 19 mgl^–1 über 10 Tage. Umwandlung der Einheiten ergibt 79,2 μgl^–1h^–1 (60).
Für Fettalkohole betrug der scheinbar höchste Toter 137,63 μgl^–1 über 4 Tage. Umwandlung der Einheiten ergibt 0,48 μgl^–1h^–1 (61).
Kulturbedingungen. Wenn nicht anderweitig erwähnt, wurden S. elongatus Stämme in BG-11 medium (45) unter Zusatz von 50 mM NaHCO₃ kultiviert. Die Zellen wurden bei 30°C unter Rotationsschütteln (100 rpm) und Licht (55 μE s^–1m^–1), bereitgestellt von vier, 5 cm über den Zellkulturen befindlichen, 86 cm 20 W fluoreszierenden Röhren, kultiviert. Das Zellwachstum wurde mittels OD₇₃₀ Messung beobachtet.
Für Acetoin und 23BD Produktion in S. elongatus, wurden die Zellen in der exponentiellen Phase auf eine OD₇₃₀ von 0,1 in 25 ml BG-11 medium, 50 mM NaHCO₃, 10 mg/L Thiamin und 10 mg/L Gentamicin enthaltend, in 125 ml Schikanen-Kolben verdünnt. Vor der Induktion mit 1 mM IPTG wurden die Kulturen bis zu einer OD₇₃₀ von 0,4–0,6 kultiviert. Alle 24 Stunden, wurde der pH mit 10N HCl auf 7,5 +/– 0,4 eingestellt. 10% des Kulturvolumens wurde entfernt und ein entsprechendes Volumen von BG-11 enthaltend 0,5 M NaHCO₃ wurde zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 50 mM NaHCO₃ in Kultur erreicht wurde.
Für Acetoin und 2,3-Butandiolproduktion in E. coli wurden Übernacht-Kulturen 1:100 in 5 ml modifiziertem M9 Medium (33) enthaltend 50 g/L Glukose, 5 g/L Hefeextrakt und 5 mg/L Gentamicin in 30 ml Teströhrchen verdünnt. Die Zellen wurden bei 37°C bis zu einer OD von 0,2–0,4 kultiviert, gefolgt von der Zugabe von 0,1 mM IPTG. Die Produktion wurde für 40 Stunden bei 30°C in einem Rotationsschüttler (250 rpm) fortgesetzt.
Acetoin-Quantifizierung. Acetoin wurde mittels der Methode von Voges und Proskauer (46–47), welche auf das kleine Volumen der 96 Napf-Platten angepasst wurde, gemessen. Probenkonzentrationen variierten zwischen 1–10% Endvolumen, um ein Ergebnis im linearen Nachweisbereich zu ermitteln. Dies wurde durch die Verdünnung in H₂O auf 100 μl Anfangsvolumen erreicht. Für einen Assay, welcher 2% Probe (am häufigsten) enthielt, wurden 98 μl Wasser und 2 μl des Überstandes zu den Näpfen hinzugegeben und gemischt. Dazu wurden 100 μl einer zum Zeitpunkt der Verwendung hergestellten Lösung bestehend auf einem Teil 5% Naphthol gelöst in 2,5 N NaOH und einem Teil 0,5% Kreatin in Wasser hinzugegeben. Der Assay wurde alle 5 Minuten ausgelesen und die endgültigen Messungen wurden nach 40 min durchgeführt, als die Steigung der Absorptionskurve mit der Hintergrundoxidationsrate von Napthol übereinstimmte. Triplikatmessungen mit nicht weniger als 3 Standards, einschließlich mindestens je einem Wert über, unter und in dem gewünschten Bereich, wurden in jeden Assay mit einbezogen.
2,3-Butandiol Quantifizierung. Überstandsproben von den Kulturen wurden per Gaschromatography (GC) (Shimadzu), ausgestattet mit einem Flammenionisationsdetektor und einer HP-chiral 20b Säule (30 m, 0,32-mm Innendurchmesser und 0,25-mm Filmdicke; Agilent Technologies) analysiert. Proben wurden vorbereitet, indem 9 Teile Überstand (nach Bedarf mit H₂O verdünnt) mit 1 Teil internem Standard gemischt wurden. Für jede Analyse wurde die GC Ofentemperatur für 4 min bei 40°C gehalten, mit einem Gradienten von 15°C min^–1 bis 235°C erhöht, und für 4 min gehalten. Ultra hochreines Helium wurde als Trägergas verwendet. Die Temperatur der Einspritzdüse und des Detektors waren auf 250°C eingestellt. Die Stereoisomere wurden mittels übereinstimmender Verweilzeiten gegenüber den Standards für (R,R)-23BD, meso-23BD und (S,S)-23BD identifiziert.
Ergebnisse
23BD zeigt eine geringe Toxizität in S. elongatus. Um den Titer und die Dauer der chemischen Produktion zu erhöhen, ist niedrige Toxizität oder eine konstante Abführung des Produktes nötig. Da die konstante Abführung und die Aufreinigung kleiner Konzentrationen während der Produktion in industriellem Maßstab nicht kostengünstig ist, war es eine Voraussetzung dieser Studie, dass das chemische Zielmolekül in einem Volumen größer als 1% (10 g/L) vom produzierenden Stamm toleriert wurde.
Um Acetoin und 23BD Toxizität zu beurteilen, wurde das Wachstum von S. elongatus über 72 h in Gegenwart von 23BD oder Acetoin gemessen. Das Wachstum nahm in Gegenwart von 0,2 g/L Acetoin um ungefähr 50% ab und stoppte bei 1,0 g/L ( ), was eine akute Toxizität diese Vorläufermoleküls bedeutet. Dies ist vergleichbar mit Isobutyraldehyd und Isobutanol, welche das Wachstum in S. elongatus bei 1 g/L verhindern (14). Im Gegensatz dazu wurde das Wachstum von S. elongatus in Gegenwart von 10 g/L 23BD ( ) kaum gehemmt und zeigte in Gegenwart von 30 g/L 23 BD immer noch Wachstum, unseren Zielstandard für die Produktionstoleranz übertreffend. Diese Ergebnisse zeigen, dass 23BD eine geeignetes Ziel für die cyanobakterielle Produktion mit hohem Titer und für lange Zeit ist, solange ein hoher Fluss durch Acetoin beibehalten werden kann, um die Anhäufung von toxischen Zwischenprodukten zu vermeiden.
Konstruktion des Acetoin Biosyntheseweges. Acetoin kann durch die Decarboxylierung von 2-Acetolactat hergestellt werden. In diesem Stoffwechselweg ( ) werden zwei Pyruvatmoleküle durch die von alsS kodierte Acetolactatsynthase (ALS) in 2-Acetolactat umgewandelt. 2-Acetolactat wird anschließend decarboxyliert, um durch die 2-Acetolactatdecarboxylase (ALDC) kodiert durch alsD Acetoin zu erhalten. Pyruvat, die Kohlenstoffquelle für diesen Stoffwechselweg, wird naturgemäß durch die Fixierung dreier CO₂ Moleküle im Calvin-Benson-Bassham Zyklus (32) hergestellt. Umwandlung von Pyruvat zu 2-Acetolactat findet natürlicherweise während der Valin/Leucin Biosynthese statt, wenn auch in kleinen Mengen (33). Vormals wurde das alsS Gen, welches für die ALS aus Bacillus subtilis (B. s.) kodiert, überexprimiert, um den Kohlenstofffluss zu 2-Acetolactat für die Herstellung von Isobutyraldehyd zu erhöhen und es wurde deren relativ hohe Aktivität nachgewiesen (14).
Um aussichtsreiche ALDC Kandidaten zu identifizieren, haben wir das bioinformatische Tool BRaunschweig Enzyme Database (BRENDA) (34) und eine umfangreiche Literaturrecherche verwendet. Wir haben unsere Suche auf O₂-insensitive Enzyme begrenzt und nach Berichten über starke Acetoinproduktion gesucht. Wir waren darüber hinaus dadurch eingeschränkt, dass wir prä-Sequenzierungsliteratur mit den chronologisch einheitlichen Stammnamen vergleichen mussten, welche mit heutzutage verfügbaren Gensequenzen übereinstimmen. Basierend auf diesen Kriterien wurden sechs alsD Gene ausgesucht (Tabelle 4). Tabelle 4: Acetolactatdecarboxylase (ALDC) und sekundäre Alcoholdehydrogenase(ADH)-Gene
Um Acetoinproduktion zu testen, wurde jedes alsD Gen mit alsS (B. s.) unter dem Isopropyl-β-thiogalactosidase (IPTG) induzierbaren Promotor P_LalacO1 (35) in E. coli überexpremiert. Die Zellen wurden in modifiziertem M9 Medium, enthaltend 50 g/L Glukose, bei 30°C für 16 und 40 h kultiviert. Ein Kontrollstamm, welcher nur alsS (B. s.) exprimierte, produzierte 0,2 g/L Acetoin, was nahe legt, dass 2-Acetolactat in kleine Mengen Acetoin abgebaut wird, was mit früheren Beobachtungen (36–37) übereinstimmt. Wenn alsD co-exprimiert wurde, wurden mehr als 20 g/L Acetoin produziert, was nahe legt, dass Autodecarboxylierung keinen Hauptbeitrag zur 2-Acetolactatumwandlung leistet ( ).
Alle ALDC außer die aus Enterobacter cloaceae (E. c..) waren in E. coli aktiv und zeigten ein Aktivitätsmuster, welches über 16 h und 40 h Produktion konsistent war ( ). Der Stamm, welcher alsD aus Aeromonas hydrophila (A. h.) exprimierte, war der größte Produzent (21,0 g/L), gefolgt von den Stämmen, welche alsD aus Gluconacetobacter xylinus (G. x.) (17,8 g/L), alsD aus Bacillus licheniformis (B. l.) (16,7 g/L) und alsD aus Enterobacter aerogenes (E. a.) (16,0 g/L) exprimierten ( ). Der Stamm, welcher Kodon-optimiertes alsD (B. s.) exprimierte, welches der natürliche Genpartner von alsS (B. s.) ist, welches im Produktionsoperon verwendet wird, produzierte am wenigsten Acetoin (6,6 g/L), was zeigt, dass native Stoffwechselwege nicht notwendigerweise ihre Intaktheit beibehalten, wenn sie in neue Wirte überführt werden ( ).
Acetoinproduktion in S. elongatus aus CO₂. Unserer Screeningstrategie zur Stoffwechselwegoptimierung folgend, wurde die ALDC Aktivität im photosynthetischen Zellumfeld von S. elongatus, basierend auf der Herstellung von Acetoin während der heterologen alsS und alsD Expression, verglichen. Jeder Stamm wurde in 125 ml Schüttelkolben mit 25 ml BG-11, 50 mM NaHCO₃ enthalten bei konstantem Licht (55 μEs^–1m^–2) bei 30°C für 72 h kultiviert ( ). Stämme, welche alsD aus E. a., B. l., B. s., A. h. und G. x. expremierten, produzierten jeweils 108 mg/L, 62 mg/L, 35 mg/L, 203 mg/L bzw. 14 mg/L ( ). Kontrollstämme und der Stamm, der alsD (E. c.) exprimierte, stellten keine messbare Menge an Acetoin in diesem Wirt her. Basierend auf diesen Ergebnissen, besaßen wir zwei alsD Gene (aus E. a. und A. h.), welche sich zur moderaten bzw. hohen Produktion von Acetoin in S. elongatus eigneten. Um übermäßige Acetointoxizität zu vermeiden, wählten wir alsD (E. a.) als Startpunkt für die sADH-Analyse.
Um ein induzierbares Expressionssystem zu erzeugen, wurde lacI^q, welches für den E. coli lac Repressor kodiert, stromaufwärts von P_LlacO1 kloniert ( ). Die Effizienz der LacI-Repression in dem S. elongatus Stamm enthaltend alsS (B. s.) und alsD (E. a.) wurde durch Testen der Acetoinproduktion mit oder ohne 1 mM IPTG untersucht ( ). Interessanterweise, war die Acetoinproduktion ohne IPTG ähnlich zu der mit 1 mM IPTG ( ), was nahelegt, dass P_LlacOl in diesem Konstrukt nicht gut durch LacI reprimiert wurde. Die Promotor- und kodierende Region des lacI^q wurde mittels Sangersequenzierung nachgeprüft. Dieses Phänomen wurde für andere IPTG-induzierbare Promotoren in S. elongatus PCC7942 (38–39) und Synechocystis sp. PCC6803 (4) gezeigt.
Konstruktion des 23BD Biosyntheseweges. Acetoin kann durch eine sekundäre Alkoholdehydrogenase (sADH) reduziert werden, um 23BD zu produzieren ( ). Identifikation vielversprechender sADH Kandidaten wurde nach derselben Methode durchgeführt wie für ALDC, aber zusätzlich zur Sauerstoffsensitivität wurden zwei weitere Kriterien hinzugefügt. Erstens, begrenzten wir unsere Suche auf NADPH-abhängiges sADH, da von diesem Cofaktor eine höhere Bioverfügbarkeit während der Synthese erwartet wird (22). Zweitens ist die Reduktion von Acetoin durch die sADH eine diastereoselektive Reaktion, welche uns erlaubte Enzyme auszusuchen, um entweder R oder S Stereozentren anzulegen. Zwei NADPH-verwendende sADH mit R-anlegenden Reaktionszentren wurden vormals in E. coli charakterisiert (41). Die Verfügbarkeit von sADH mit S-anlegenden Reaktionszentren und NADPH als Cofaktor war jedoch begrenzt. Zuletzt wählten wir vier adh Gene, zwei mit R-anlegenden Reaktionszentren, zwei mit S-anlegenden Reaktionszentren (Tabelle 4). Plasmide wurden erzeugt, welche alsS (B. s.), alsD (E. a.) und jedes der vier adh unter P_LlacO1 enthielten ( ).
Die entstandenen E. coli Stämme wurden in modifiziertem M9 Medium enthaltend 50 g/L Glukose bei 30°C für 40 h kultiviert ( ). Die Acetoinkonzentration blieb hoch für drei von vier Stämmen, was zeigte, dass die sADH-Aktivität in dieser Zellumgebung limitiert ist. Der vierte Stamm, adh (C. b.) exprimierend, behielt eine relativ hohe Acetoinkonzentration (weniger als 6% Gesamtproduktion) bei und produzierte 13,8 g/L Gesamt-23BD als eine Mischung aus (R,R)-23BD und meso-23BD Stereoisomeren, 74% bzw. 21% der Gesamtproduktion bildend ( ). Die Stämme, die adh (T. b) und adh (C. p.) exprimierten, produzierten 2,4 g/L bzw. 14, 2 g/L 23BD und bildeten beide Isomeren in jeweils etwa denselben Mengen. Hohe Stereoselektivität wurde in dem Stamm exprimierend adh (L. p.), erhalten, welcher ausschließlich 9,1 g/L meso-23BD produzierte. Enzymaktivitäten, in Rohzelllysaten gemessen, welche während der Herstellung isoliert wurden, waren sowohl für sADH (C. p.) als auch sADH (C. b.) bei 265 und 440 nmol min^–1mg^–1 hoch, wenn Substrat im Überschuss verwendet wurde ( ). Jedoch zeigte für den adh (C. p) exprimierenden Stamm eine Anhäufung von Acetoin im Überstand während der Produktion, dass die Enzymumsatzrate bei den in der Zelle vorhandenen Substratkonzentrationen langsamer als die Sekretionsrate ist. Relativ niedrige sADH (T. b.) Aktivität war in Einklang mit der Acetoinanhäufung in dem Stamm, was nahelegt, dass die sADH Aktivität ein Engpass für die Produktion in diesem E. coli Stamm ist ( ). Das Haupt 23BD Produkt jedes der adh exprimierenden Stämme, entsprach der Stereochemie, welche durch vormalige Charakterisierung vorausgesagt wurde (43).
23BD Produktion in S. elongatus aus CO₂. Um die Differenzen in der 23BD Produktivität von S. elongatus zu screenen, wurde jedes der verwendeten Plasmide für die 23BD Produktion in E. coli für die Transformation von S. elongatus verwendet. Die manipulierten Stämme wurden in 125 ml Schikanenkolben mit 25 ml BG-11 enthaltend 50 mM NaHCO₃ bei konstantem Licht (55 μEs^–1m^–2) bei 30°C kultiviert.
23BD Produktion wurde in drei von vier S. elongatus Stämmen nachgewiesen ( ). Die Messung der sADH Leistung in S. elongatus wurde durch den Vergleich von Acetoin und 23BD Konzentrationen nach 72 Stunden Wachstum gemacht, die weniger aktive ALDC (E. a.) verwendend, um die Toxizität in den Fällen, wo die Acetoinumwandlung gering war, zu senken. Der Stamm, der adh (T. b.) exprimierte, produzierte 301 mg/L (R,R)-23BD mit Spuren von meso-23BD, aber erlaubte auch die Anhäufung von Acetoin ( ). Der Stamm, der adh (C. b.) exprimierte, produzierte 270 mg/L (R,R)-23BD (Hauptanteil) und nicht nachweisbare Mengen von Acetoin, was auf einen hohen Durchfluss durch das Intermediat hindeutet. Der Stamm, der adh (C. p.) exprimierte, produzierte 65 mgL^–1 23BD, mit meso-23BD als Primärprodukt und akkumulierte toxische Mengen an Acetoin. Die weitere S-anlegenden adh (L. p.) war in S. elongatus nicht aktiv, was lediglich zu einer Anhäufung von Acetoin führte. Enzymaktivitäten, die in während der Produktion isolierten Rohzellextrakten gemessen wurden, zeigten eine etwa 10-fach höhere Aktivität für adh (C. b.) als für adh (T. b.), 56,3 beziehungsweise 6,3 nmol min^–1mg^–1, was die Anhäufung von Acetoin in den weniger aktiven Stämmen erklären würde ( und ). Die Aktivität für adh (C. p.) war ungefähr 5-mal höher als die der adh (C. b.), jedoch wurde eine geringere Produktion und Acetoinanhäufung beobachtet, ähnlich zu dem Ergebnis in E. coli. Die Enzymaktivität konnte nicht für den adh (L. p.) exprimierenden Stamm nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass das sADH Enzym für das Fehlen der Produktion verantwortlich ist ( und ). Die beiden sADH mit der höchsten Produktion und der geringsten Acetoinanhäufung wurden weiter mit dem stärkeren ALDC Gen alsD (A. h.) getestet. Beide Stämme erhöhten die Produktion und erreichten Erträge von 568 mgL^–1 von adh (T. b.) und 952 mgL^–1 von adh (C. b.), der Letztere war dreifach höher als die Produktion mit alsD (E. a.) über 72 Stunden ( ). Beide Stämme zeigten auch erhöhte Acetoinkonzentrationen, obwohl keiner mit Anhäufungen von 59 mgL^–1 bzw. 61 mgL^–1 Toxizitätsmengen erreichte.
Langzeitproduktion von 23BD in S. elongatus. Die Stabilität der best produzierenden Stämme wurde nachgewiesen, indem eine kontinuierliche Produktion in 25 ml Kulturen bei 30°C in der Gegenwart von konstantem Licht beibehalten wurde. Der Stamm enthaltend adh (C. b.) erreichte einen Gesamtertrag von 2,38 g/L (R,R)-23BD und eine maximale Produktionsrate von 9847 μgL^–1h^–1 (3 Tagedurchschnitt) ( ). Die Produktion wurde über 21 Tage beibehalten. Der Stamm enthaltend adh (T. b.) zeigte ähnliche Ergebnisse, und erreichte einen Gesamtertrag von 1,97 gL^–1, eine maximale Produktionsrate von 7757 μgL^–1h^–1 (3 Tagedurchschnitt) und eine für 21 Tage anhaltende Produktion ( ). Nach 21 Tagen fiel die Produktion in beiden Kulturen scharf ab und wurde nicht wieder hergestellt als die Zellen in frischem Medium resuspendiert wurden, was anzeigte, dass Veränderungen in der Zellpopulation wie zum Beispiel spontane Mutationen, welche den Fluss zum Stoffwechsel wiederherstellten, die Produktion über die Zeit hinweg behindern. Stämme, die den 23BD Biosyntheseweg enthielten, zeigten verglichen mit Kontrollstämmen reduziertes Wachstum, was wie erwartet die Rate der Kohlenstoffumleitung aus dem zentralen Stoffwechsel, widerspiegelte ( , und ). Eine zweiter Kontrollstamm enthaltend nur alsS (B. s.) und alsD (E. a.) produzierte Acetoin bis zu toxischen Mengen, nachdem die stationäre Phase erreicht wurde und zeigte vermindertes Wachstum über das hinaus, was der Kohlenstoffumleitung zugerechnet werden kann.
Evaluation der photsynthetischen Effizienz der Produktionsstämme. Es wurde die O₂-Entwicklung aus illuminierten Zellen während der kontinuierlichen Produktion gemessen, um zu überprüfen, ob der 23BD Überproduktionsstoffwechselweg das Photosynthesesystem beeinflussen kann ( ). Beide Stämme, die 23BD Biosynthesestoffwechselweg exprimierten, zeigten eine leicht erhöhte Rate der Sauerstoffentwicklung pro μg Chlorophyll verglichen mit den Kontrollstämmen ( ). Diese Rate erhöhte sich während der späten Stadien der Produktion. Beide Kontrollstämme, von denen jeder keinen Produktionsweg, oder nur den Acetoinproduktionsweg exprimierte, zeigten ähnliche Raten der O₂-Entwicklung ( ). Dieser Trend folgt der Menge an fixiertem Kohlenstoff, welcher vom Zentralstoffwechsel umgeleitet wurde, was zeigt, dass die Last, der die Zelle durch die Überproduktion ausgesetzt ist, einen positiven Effekt auf die photosynthetische Effizienz der Zelle haben könnte ( und ).
Schlussfolgerungen
Wie hier zum ersten Mal beschreiben, wurde mit einem manipulierten Cyanobakterium S. elongatus die Produktion von 23BD und Acetoin direkt aus CO₂ und Licht erreicht. Das Design des Stoffwechselweges wurde so gewählt, dass der Produktionsweg an einen photosynthetischen Wirt angepasst wurde. Manipulierte Stämme erreichten eine Produktionsrate von 9847 μgL^–1h^–1 und Endtiter von 2,4 gl^–1 bei über 21 Tage anhaltender Produktion. Diese Werte, die während der kontinuierlichen Produktion von CO₂ und Licht erreicht wurden, sind vorteilhaft, verglichen mit anderen Studien. Die Rate ist 1,6-fach höher als die für Isobutyraldehyd (6230 μgL^–1h^–1) und signifikant höher als andere Produkte, die aus exogenen Stoffwechselwegen überproduziert werden ( ). Der Anteil der Biomasse, welcher als 23BD produziert wurde, befand sich im Bereich von 30% bis 60% ( ), was vorteilhaft ist im Vergleich zu maximal 80%, welche während der endogenen Saccharoseüberproduktion erzielt wird (38).
Um den 23BD-Signalweg zu konstruieren, war geringe Toxizität eine Priorität für verbesserte Dauerhaftigkeit der Kultur und daher chemische Grundstoffproduktion in S. elongatus. Der negative Effekt der Toxizität auf den Stoffdurchfluss wird durch die niedrige Produktion an Acetoin, welche über 0,1 g/L in S. elongatus toxisch ist ( ), aus dem 23BD Stoffwechselweg ohne Coexpression der adh verstärkt ( ). Der Zusatz eines starken adh zu dem Operon, um Acetoin in 23BD umzuwandeln, erhöht die Gesamtproduktion des Stoffwechselweges um das 10-fache ( und ), obwohl die Reduktion durch Adh kein irreversibler Schritt ist, während die Acetoinproduktion dies ist. Daher stellt die Zuordnung von Genen zu ihrem Wirt ein optimales Mittel zur Optimierung der Stoffwechselwegfunktion dar. Alle Gene wurden gleichzeitig für die Produktion in E. coli und mit Cyanobakterien geprüft unter Verwendung identischer Operons. Die von den Genen gezeigten Produktionsmuster waren zwischen den Wirten unterschiedlich. Die Produktivität von Stämmen, die alsD (B. l.) und alsD (G. x.) in S. elongatus exprimierten, war viel weniger (jeweils 30% bzw. 7% der Topproduktion) ( ), als in Stämmen, welche dieselben Gene in E. coli überexprimierten (80% bzw. 85% der Topproduktion) ( ). Im Gegensatz dazu wurde mit sADH (T. b.), welche eine deutlich verminderte Produktion in L. coli zeigte, eine signifikante Produktion in S. elongatus erreicht.
23BD Produktion wurde als ein Modellsystem für den Einbezug der Stereoselektivität als Teil des Stoffwechselwegdesigns verwendet ( ). Die Einstellung von Chiralität kann in der chemischen Synthese teuer werden; jedoch bietet die biologische Kontrolle einen viel einfacheren Weg zu diesen Produkten. In allen in der Natur bekannten Fällen wird Acetoin aus 2-Acetolactat hergestellt, welches ein R-Stereozentrum enthält, so dass (S,S)-23BD nicht beobachtet wurde. Jedoch könnte die Autodecarboxylierung von 2-Acetolactat, oder Enolatracemisierung von Acetoin möglicherweise (S)-Acetoin in der Zelle bilden und in Gegenwart von S-anlegenden sADH-Enzymen zur (S,S)-23BD Produktion führen. Zwei Stoffwechselwege wurden konzipiert, einer für jedes Steroisomer (Tabelle 4). In S. elongatus produzierten beide in einer Langzeitproduktion getesteten R-anlegenden Stämme (R,R)-23BD als Hauptprodukt, obwohl während der Produktion Spuren von meso-23BD durch den adh (T. b) exprimierenden Stamm beobachtet wurden. Zusätzlich produzierte der Stamm, der adh (C. p.) exprimierte, der in E. coli gemischte Isomere produzierte, in S. elongatus nur meso-23BD. In dieser Studie wurde keine (S,S)-23BD Produktion detektiert, was nahelegt, dass Abbauprodukte nicht signifikant zu dem Stoffwechselweg beitragen.
Während der Langzeitproduktion war die O₂ Entwicklung pro μg Chlorophyll in Produktionsstämmen relativ zu Kontrollstämmen, die die Rekombinationskassette, aber kein alsS-, alsD- oder adh-Gen enthielten, erhöht ( ). Dies zeigt, dass die Belastung, welche dem Stoffwechsel während der Produktion auferlegt wird, eine Erhöhung in der Photosyntheseeffizienz hervorruft. Es wurde beobachtet, dass Chlorophyll und O₂-Produktion sich während ähnlicher Überproduktion von Sucrose in ungefähr denselben Mengen in S. elongatus erhöhten. Die Manipulationsprinzipien für photosynthetische Organismen zu definieren ist ein wichtiger Meilenstein auf der Suche nach erneuerbaren Technologien. Für viele Jahre hat die biologische Produktion von 23BD durch heterotrophe Mikroben die Aufmerksamkeit auf sich gezogen, wegen der Existenz natürlicher fermentativer Produzenten und dem Potential der Chemikalie als ein vielseitiges Kohlenstoffeinsatzprodukt für Kunststoff, Lösungsmittel und Brennstoff. Die biosynthetische Produktionsrate und der Titer, welche durch die Verwendung der Werkzeuge der vorliegenden Offenbarung erreicht werden, stellen eine starke Erhöhung in cyanobakteriellen Erträgen dar.
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SEQUENZEN
SEQ ID NO: 1: PLlac01 Promotor
SEQ ID NO: 2: Bacillus subtilis Acetolactatsynthase – alsS Gen Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 3: Bacillus subtilis Acetolactatsynthase – alsS Gen Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 4: Enterobacter aerogenes KCTC 2190/ATCC13048 Acetolactatdecarboxylase – alsD Gen Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 5: Enterobacter aerogenes KCTC 2190/ATCC13048 Acetolactatdecarboxylase – alsD Gen Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 6: Enterobacter cloacae subsp. cloacae ATCC 13047 Acetolactatdecarboxylase – alsD Gen Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 7: Enterobacter cloacae subsp. cloacae ATCC 13047 Acetolactatdecarboxylase – alsD Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 8: Bacillus licheniformis ATCC 14580 Acetolactatdecarboxylase – alsD Gen Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 9: Bacillus licheniformis ATCC 14580 Acetolactatdecarboxylase – alsD Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 10: Bacillus subtilis Acetolactatdecarboxylase – alsD Gen Nukleotidsequenz (Kodonverwendung für S. elongatus optimiert)
SEQ ID NO: 11: Bacillus subtilis Acetolactatdecarboxylase – alsD Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 12: Aeromonas hydrophila Acetolactatdecarboxylase – alsD Gen Nukleotidsequenz (Kodonverwendung für S. elongatus optimiert)
SEQ ID NO: 13: Aeromonas hydrophila Acetolactatdecarboxylase – alsD Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 14: Acetobacter aceti, ssp. xylinum, NBRC 3288 (Gluconacetobacter xylinus) Acetolactatdecarboxylase – alsD Gen Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 15: Acetobacter aceti, ssp. xylinum, NBRC 3288 (Gluconacetobacter xylinus) Acetolactatdecarboxylase – alsD Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 16: Candida parapsilosis M203011 Alkoholdehydrogenase – adh Gen Nukleotidsequenz (Kodonverwendung für S. elongatus optimiert)
SEQ ID NO: 17: Candida parapsilosis M203011 Alkoholdehydrogenase – adh Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 18: Leuconostoc pseudomesenteroides CHCC2114 Alkoholdehydrogenase – adh Gen Nukleotidsequenz (Kodonverwendung für S. elongatus optimiert)
SEQ ID NO: 19: Leuconostoc pseudomesenteroides CHCC2114 Alkoholdehydrogenase – adh Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 20: Clostridium beijerinckii NRRLB593 Alkoholdehydrogenase – adh Gen Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 21: Clostridium beijerinckii NRRLB593 Alkoholdehydrogenase – adh Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 22: Thermoanaerobacter brockii HTD4 Alkoholdehydrogenase – adh Gen Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 23: Thermoanaerobacter brockii HTD4 Alkoholdehydrogenase – adh Gen Aminosäuresequenz

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Cyanobakterium, umfassend ein rekombinantes Polynukleotid, das für eine Acetolactatsynthase (ALS) und eine Acetolactatdecarboxylase (ALDC) kodiert, wobei die Expression der ALS und der ALDC zu einer Erhöhung der Produktion von Acetoin führt, verglichen mit einem entsprechenden Cyanobakterium, dem das Polynukleotid fehlt.
Cyanobakterium, umfassend ein rekombinantes Polynukleotid, das für eine Acetolactatsynthase (ALS), eine Acetolactatdecarboxylase (ALDC) und eine sekundäre Alkoholdehydrogenase (sADH) kodiert, wobei die Expression der ALS, der ALDC und der sADH zu einer Erhöhung der Produktion von Acetoin oder 2,3-Butandiol (23BD), oder beidem führt, verglichen mit einem entsprechenden Cyanobakterium, dem das Polynukleotid fehlt.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 1, wobei die ALS eine bakterielle ALS und die ALDC eine bakterielle oder eine Pilz-ALDC ist; oder das Cyanobakterium gemäß Anspruch 2, wobei die ALS eine bakterielle ALS, die ALDC eine bakterielle ALDC oder eine Pilz-ALDC, und die sADH eine bakterielle sADH oder eine Pilz-sADH ist.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die ALS eine Bacillus sp. ALS ist.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die ALDC ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Enterobacter sp. ALDC, einer Bacillus sp. ALDC, einer Aeromonas sp. ALDC und einer Gluconacetobacter sp. ALDC.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die ALDC ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Enterobacter aerogenes ALDC, EINER Enterobacter cloacae ALDC, einer Bacillus licheniformis ALDC, einer Bacillus subtilis ALDC, einer Aeromonas hydrophila ALDC und einer Gluconacetobacter xylinus ALDC.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die sADH ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Candida sp. sADH, einer Leuconostoc sp. sADH, einer Clostridium sp. sADH und einer Thermoanaerobacter sp. sADH.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die sADH ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Candida parapsilosis sADH, einer Leuconostoc pseudomesenteroides sADH, einer Clostridium beijerinckii sADH und einer Thermoanaerobacter brockii sADH.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die Expression der ALS und der ALDC, oder die Expression der ALS, der ALDC und der sADH von einem induzierbaren Promotor angetrieben wird.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei das Polynukleotid stabil in das Genom des Cyanobakteriums integriert ist.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei das Cyanobakterium ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nostoc sp., Synechococcus sp., Synechocystis sp., and Thermosynechococcus sp.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 11, wobei das Cyanobakterium ein Synechococcus sp. ist.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 12, wobei das Cyanobakterium eine Synechococcus elongates Zelle ist.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die Produktion von Acetoin oder 2,3-Butandiol (23BD), oder beidem, infolge des Kultivierens des Cyanobakteriums unter konstantem Licht erfolgt.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die Produktion von Acetoin oder 2,3-Butandiol (23BD), oder beidem, infolge des Kultivierens des Cyanobakteriums in Gegenwart von Bicarbonat erfolgt.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die ALDC im Wesentlichen unempfindlich gegenüber Sauerstoff ist.
Cyanobakterium gemäß Anspruch 3, wobei die sADH im Wesentlichen unempfindlich gegenüber Sauerstoff ist und NADPH-abhängig ist.
Verfahren zur Herstellung von Acetoin, umfassend: a) Bereitstellen des Cyanobakteriums gemäß Anspruch 1, b) Kultivieren des Cyanobakteriums in einer photosynthetischen Umgebung umfassend CO₂ und Licht, wobei die Expression der ALS und der ALDC zur Produktion von Acetoin führt.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Produktion von Acetoin auf einem höheren Niveau erfolgt, als durch das Kultivieren des entsprechenden Cyanobakteriums, dem das Polynukleotid fehlt, unter gleichen Bedingungen.
Verfahren zur Herstellung von 2,3-Butandiol, umfassend: a) Bereitstellen des Cyanobakteriums gemäß Anspruch 2; b) Kultivieren des Cyanobakteriums in einer photosynthetischen Umgebung umfassend CO₂ und Licht, wobei die Expression der ALS, der ALDC und der sADH zur Produktion von 2,3-Butandiol führt.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Produktion von 2,3-Butandiol auf einem höheren Niveau erfolgt, als durch das Kultivieren des entsprechenden Cyanobakteriums, dem das Polynukleotid fehlt, unter gleichen Bedingungen.