BR112020012577A2 - método para aumentar a produção de aminoácidos em cultura de corynebacterium submersa - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para melhorar a produção de aminoácidos glutamato e lisina em cultura de Corynebacterium submersa que compreendem adicionar, a uma cultura de Corynebacterium submersa, uma fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto, em que a Corynebacterium cultivada na presença da fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto produz uma quantidade aumentada de moléculas pequenas em comparação com a Corynebacterium cultivada em uma cultura submersa idêntica de outro modo na ausência da fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto, em que o aumento na produção dos aminoácidos glutamato e lisina não se deve à atividade enzimática no caldo de fermentação de Trichoderma gasto.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO
PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDOS EM CULTURA DE CORYNEBACTERIUM SUBMERSA". CAMPO DA TÉCNICA
[0001] Os presentes métodos se referem ao aumento da produção de moléculas pequenas em uma cultura de Corynebacterium submersa mediante o suplemento do meio de crescimento de Corynebacterium com a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto.
ANTECEDENTES
[0002] Corynebacterium são bacilos aeróbicos gram-positivos que incluem membros úteis para aplicações industriais, bem como patógenos humanos. As espécies não patogênicas de Corynebacterium são usadas para a produção de aminoácidos, nucleotídeos, esteroides, bacteriocinas e enzimas. A espécie mais conhecida é C. glutamicum, que produz ácido glutâmico vendido como glutamato monossódico na indústria alimentícia. C. glutamicum geneticamente modificado produz lisina. Corynebacterium é, de modo geral, cultivada em cultura submersa com o uso de glicose, frutose ou glicose mais frutose e sacarose como uma fonte de carbono primária.
[0003] Trichoderma é um gênero de fungos filamentosos que está presente no solo. Muitas espécies são caracterizadas como simbiontes de planta oportunistas e avirulentos. Trichoderma produz uma ampla variedade de enzimas, incluindo celulases e hemicelulases. Trichoderma também tem sido manipulado para produzir e secretar enzimas recombinantes, como catalase, glucoamilase, lacase e similares. A produtividade de Trichoderma é muito alta, e títulos acima de 100 gramas de enzima recombinante por litro de cultura submersa não são incomuns. Alguns produtos de enzima de Trichoderma são vendidos como produtos de caldo integral, normalmente incluindo células exterminadas. Outros produtos de enzima de Trichoderma são vendidos em forma purificada, em tal caso, o meio de crescimento de Trichoderma gasto é descartado.
SUMÁRIO
[0004] Os presentes métodos se referem ao aumento da produção de moléculas pequenas em uma cultura de Corynebacterium submersa mediante o suplemento do meio de crescimento de Corynebacterium com a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto. Os aspectos e modalidades dos métodos são descritos nos parágrafos independentemente numerados a seguir.
1. Em um aspecto, é fornecido um método para melhorar a produção de moléculas pequenas em cultura de Corynebacterium submersa caracterizado pelo fato de que compreende adicionar a uma cultura de Corynebacterium submersa uma fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto, em que a Corynebacterium cultivada na presença da fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto produz uma quantidade aumentada de moléculas pequenas em comparação com Corynebacterium cultivada em uma cultura submersa de outro modo idêntica na ausência da fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto, em que o aumento em produção de molécula pequena não é devido à atividade enzimática no caldo de fermentação de Trichoderma gasto.
2. Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 1, a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto é produzida mediante a filtração de caldo de fermentação de Trichoderma gasto total ou fracionado.
3. Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 1, a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto é produzida mediante o tratamento térmico de caldo de fermentação de Trichoderma gasto total ou fracionado.
4. Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 1, a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto usada para aumentar a produção de molécula pequena é um componente de caldo de fermentação de Trichoderma gasto total ou fracionado que é adicionado à cultura de Corynebacterium submersa.
5. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto é um subproduto de uma fermentação que produz uma enzima recombinante.
6. Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 5, a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma usado para aumentar a produção de molécula pequena compreende adicionalmente a enzima recombinante.
7. Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 5, a enzima recombinante é removida da fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma usada para melhorar a produção de molécula pequena.
8. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 5 a 7, a enzima recombinante é uma enzima de processamento de carboidrato.
9. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, pelo menos uma porção do caldo de fermentação gasto é adicionada no momento da inoculação da cultura de Corynebacterium.
10. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, o caldo de fermentação gasto é coletado a partir de uma cultura de crescimento de Trichoderma pelo menos 29 horas após a inoculação de caldo de Trichoderma.
11. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, o caldo de fermentação gasto é coletado a partir de uma cultura de crescimento de Trichoderma antes da expressão de uma proteína de interesse no caldo.
12. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, a molécula pequena é um aminoácido.
13. Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 12, o aminoácido é ácido glutâmico ou lisina.
14. Em algumas modalidades do método, de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, o aumento em produção de molécula pequena não é o resultado de massa celular aumentada na cultura de Corynebacterium.
15. Em um outro aspecto, é fornecida uma molécula pequena produzida em cultura de Corynebacterium submersa produzida pelo método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a
14.
16. Em um outro aspecto, é fornecido o uso de uma fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto para aumentar a quantidade de moléculas pequenas produzidas em uma cultura de Corynebacterium submersa.
17. Em algumas modalidades, o uso de uma fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto conforme no parágrafo 16 é combinado com os recursos de qualquer um dos parágrafos 1 a 14.
[0005] Esses e outros aspectos e modalidades dos presentes métodos ficarão evidentes a partir da descrição, incluindo as Figuras anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0006] A Figura 1 é um gráfico que mostra o consumo de glicose (g/l) e produção de glutamato (g/l) ao longo do tempo (h) em uma cultura de
Corynebacterium à qual foi adicionado o caldo de fermentação de Trichoderma gasto.
[0007] A Figura 2 é um gráfico que mostra a produção de proteína secretada total (g/l) e peso seco celular (g/kg) em uma cultura de Trichoderma a partir da qual o caldo de fermentação de Trichoderma gasto foi periodicamente amostrado.
[0008] A Figura 3 é um gráfico que mostra o efeito de caldo de fermentação de Trichoderma gasto tomado de uma cultura de Trichoderma como pontos de tempo diferentes (h) em produção de glutamato (g/l) em uma cultura de Corynebacterium.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. Introdução
[0009] Os presentes métodos se referem ao aumento da produção de moléculas pequenas em uma cultura de Corynebacterium submersa mediante o suplemento do meio de crescimento de Corynebacterium com a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto. II. Definições e Abreviaturas
[0010] Antes de descrever os métodos em detalhes, os seguintes termos são definidos para maior clareza. Os termos não definidos devem ser acordados com seus significados comuns conforme usados na técnica relevante.
[0011] Como usado aqui, "cultura submersa" se refere a um método para cultivar culturas de micro-organismos em que os micro-organismos são incubados em um meio líquido submetido à agitação vigorosa e contínua.
[0012] Como usado aqui, um "organismo de fermentação" é um micro-organismo com capacidade para produzir um produto de interesse, como um aminoácido ou uma proteína, quando cultivado em cultura submersa.
[0013] Como usado aqui, um "caldo gasto" se refere ao meio de crescimento de cultura submerso no qual um micro-organismo foi cultivado. O caldo gasto contém compostos químicos secretados no meio. O caldo "gasto total" inclui adicionalmente os micro-organismos (células) cultivados no meio. O "caldo gasto fracionado" foi processado de alguma maneira para remover pelo menos alguns dos componentes no caldo gasto.
[0014] Como usado aqui, uma "fração não enzimática" de um caldo gasto é substancialmente livre de proteína enzimática ou é substancialmente livre de atividade enzimática, mesmo que proteínas enzimáticas desnaturadas possam estar presentes.
[0015] Como usado aqui, uma "molécula pequena" é um composto orgânico de baixo peso molecular (<900 Da) que não é um polímero.
[0016] Como usado aqui, "Trichoderma" é o gênero de um organismo que tem a seguinte linhagem a partir de 2017, de acordo com o Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI, Bethesda MD, EUA): Eucariota; Opisthokonta; Fungos; Dikarya; Ascomicota; saccharomyceta; Pezizomycotina; leotiomyceta; sordariomyceta; Sordariomicetos; Hypocreomycetidae; Hipocreales; Hipocreaceae.
[0017] Como usado aqui, "Corynebacterium" é o gênero de um organismo que tem a seguinte linhagem a partir de 2017, de acordo com o NCBI: Bactérias; Grupo Terrabacteria; Actinobactérias; Actinobactérias; Corynebacteriales; Corynebacteriaceae.
[0018] Conforme usado no presente documento, os artigos singulares "um", "uma", "o" e "a" abrangem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Todas as referências aqui citadas estão incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0019] As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes significados, a não ser que especificado de outro modo:
Da Dalton p/v peso/volume p/p peso/peso v/v volume/volume C graus centígrados g ou gm grama μg micrograma mg miligrama kg quilograma μL e µl microlitro mL e ml mililitro mm milímetro μm micrômetro mol mol mmol milimol M molar mM milimolar μM micromolar nm nanômetro ppm partes por milhão h hora RPM revoluções por minuto SLPM litros padrões por minuto III. Caldo de Trichoderma gasto
[0020] Trichoderma é amplamente usado para produzir e secretar enzimas recombinantes em uma escala industrial (consultar, por exemplo, Keränen, S. e Penttilä, M. (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:534 a 537; Ahamed, A. e Vermette, P. (2009) Bioresource Technology 100:5.979 a 5.987; e Helena Nevalainen, H e Petersonl, R. (2014) Front Microbiol. 5:75). As cepas, componentes de meio e condições de cultura são bem conhecidos.
[0021] Os presentes métodos se referem ao uso de caldo de fermentação de Trichoderma gasto total ou fracionado, necessariamente incluindo a fração não enzimática do caldo gasto, para aumentar a quantidade de moléculas pequenas produzidas por Corynebacterium cultivada em cultura submersa.
[0022] Em algumas modalidades, apenas a fração não enzimática de caldo de Trichoderma gasto é adicionada à cultura de Corynebacterium. Essa fração pode ser substancialmente livre de enzimas, o que significa que a proteína que tem atividade enzimática não está presente no caldo, ou pode ser substancialmente livre de enzimas ativas, o que significa que a atividade enzimática no caldo foi destruída por tratamento químico ou físico do caldo.
[0023] A atividade enzimática pode ser eliminada por meio da filtração de caldo de Trichoderma gasto para separar componentes responsáveis pelo efeito benéfico em culturas de Corynebacterium a partir de proteínas que têm atividade enzimática. Tal filtração pode abranger a filtração para remover proteínas que têm um peso molecular maior que cerca de 30K Da.
[0024] A atividade enzimática pode ser, alternativa ou adicionalmente, destruída mediante o aquecimento do caldo de Trichoderma gasto a uma temperatura acima de cerca de 70°C, acima cerca de 75°C, acima de cerca de 80°C, acima de cerca de 85°C, acima de cerca de 90°C ou até acima de cerca de 95°C, durante tempo suficiente para desnaturar a enzima, por exemplo, pelo menos cerca de 10 min, pelo menos cerca de 15 min, pelo menos cerca de 20 min, pelo menos cerca de 30 min ou pelo menos cerca de 40 min, ou mais.
[0025] A atividade enzimática pode ser, alternativa ou adicionalmente, destruída mediante a incubação do caldo de Trichoderma gasto com inibidores de protease de molécula pequena, ou outras moléculas pequenas que inibem a atividade de classes particulares de enzimas.
[0026] A atividade enzimática pode ser, alternativa ou adicionalmente, destruída mediante a incubação do caldo de Trichoderma gasto com proteases ativas, que podem ser exógenas ao caldo de Trichoderma gasto de modo que proteínas presentes no caldo de Trichoderma gasto sejam digeridas e substancialmente nenhuma atividade enzimática permaneça no caldo de Trichoderma gasto.
[0027] A atividade enzimática pode ser, alternativa ou adicionalmente, destruída submetendo-se o caldo de Trichoderma gasto a métodos de cromatografia rotineiramente usados para separar proteínas de outros componentes no caldo de Trichoderma gasto, sendo que as proteínas separadas são a fonte de atividade enzimática no caldo de Trichoderma gasto.
[0028] A atividade enzimática pode ser, alternativa ou adicionalmente, destruída mediante a redução ou eliminação da expressão e/ou secreção de proteínas nativas ou não nativas (isto é, recombinantes), que podem ser enzimas, selecionando uma cepa particular de Trichoderma, ou modificando geneticamente Trichoderma para eliminar ou reduzir a expressão ou secreção de enzimas no caldo de Trichoderma gasto.
[0029] A fração não enzimática de caldo de Trichoderma gasto pode ser incluída em caldo de Trichoderma gasto total ou de outro modo fracionado como um produto especializado. Alternativamente, a fração não enzimática de caldo de Trichoderma gasto pode ser fornecida como um produto fracionado especializado de um caldo de Trichoderma gasto.
[0030] Em algumas modalidades, apenas a fração não enzimática de caldo de Trichoderma gasto inclui adicionalmente uma ou mais proteínas de interesse, por exemplo, enzimas de processamento de carboidrato e outros polipeptídeos comercialmente relevantes, incluindo, porém sem limitação uma desidrogenase, uma trans-
cetolase, uma fosfocetolase, uma transladolase, uma epimerase, uma fitase, uma xilanase, uma β-glucanase, uma fosfatase, uma protease, uma α-amilase, uma β-amilase, uma glucoamilase, uma pululanase, uma isoamilase, uma celulase, uma trealase, uma lipase, uma pectinase, uma poliesterase, uma cutinase, uma oxidase, uma transferase, uma redutase, uma hemicelulase, uma mananase, uma esterase, uma isomerase, uma pectinase, uma lactase, uma peroxidase e uma lacase.
[0031] Em outras modalidades, apenas a fração não enzimática de caldo de Trichoderma gasto exclui especificamente qualquer proteína particular de interesse, incluindo uma proteína enzimática de interesse, e particularmente uma proteína recombinante de interesse.
[0032] Em algumas modalidades, o caldo de Trichoderma gasto ou fração do mesmo é formulado, por exemplo, para estabilidade em armazenamento ou facilidade de manuseio. Os componentes da formulação incluem, porém sem limitação, glicerol, sorbitol, sais, polímeros, conservantes e similares. IV. Culturas de Corynebacterium submersas
[0033] Conforme descrito no presente documento, os presentes métodos envolvem a adição de caldo de Trichoderma gasto a culturas de Corynebacterium que produzem moléculas pequenas. Corynebacterium produz naturalmente quantidades significativas de glutamato e pode ser prontamente modificado geneticamente para produzir outros produtos, incluindo, porém sem limitação, lisina (consultar, por exemplo, de Graaf, A.A. et al. (2001) Adv Biochem Eng Biotechnol. 73:9 a 29 e Wendisch, V.F. et al. (2016) World J Microbiol Biotechnol. 32:105). Inúmeras cepas de Corynebacterium estão comercialmente disponíveis, sendo que o mais comum são os derivados de C. glutamicum. A sequência genômica completa de C. glutamicum S9114 é conhecida.
[0034] As condições para o crescimento de Corynebacterium em cultura submersa para o propósito de produzir produtos comercialmente valiosos são bem conhecidas, conforme é descrito, por exemplo, em Kusumoto, I. (2001) J. Nutr. 131:2552S-55S; Hermann, T. (2003) J Biotechnol. 104:155 a 172; Zhiting Luo, Z. et al. (2016) Biotechnology for Biofuels 9:134; e Zahoora, A. et al. (2012) CSBJ. 3:e201210004.
[0035] O meio de crescimento de Corynebacterium inclui, em geral, uma fonte de carbono primária como glicose, frutose ou sacarose, embora as fontes de carbono como melaços de cana, xilose, refugos agroindustriais, farinha de semente de colza, resíduo de soja, fibras de espiga de milho e glicerol, também tenham sido usadas. O extrato de levedura é uma fonte de nitrogênio adequada, mas o sulfato de amônio e cloreto de amônio têm custo mais baixo. Os sais inorgânicos e particularmente manganês podem afetar a produtividade de Corynebacterium.
[0036] Em algumas modalidades, a quantidade de caldo de Trichoderma gasto total ou fracionado como uma porcentagem da quantidade total de meio de crescimento de Corynebacterium pelo menos 0,01%, pelo menos 0,02%, pelo menos 0,03%, pelo menos 0,04%, pelo menos 0,05%, pelo menos 0,06%, pelo menos 0,07%, pelo menos 0,08%, pelo menos 0,09%, pelo menos 0,10%, pelo menos 0,12%, pelo menos 0,14%, pelo menos 0,16%, pelo menos 0,18%, pelo menos 0,2%, pelo menos 0,3%, pelo menos 0,4%, pelo menos 0,5%, pelo menos 0,6%, pelo menos 0,7%, pelo menos 0,8%, pelo menos 0,9%, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 5% ou mais (v/v).
[0037] O caldo de Trichoderma gasto total ou fracionado é, de preferência, adicionado no momento da inoculação da cultura de Corynebacterium. Entretanto, durante a fermentação de batelada alimentada, pode ser desejável deslocar a adição do caldo de Trichoderma gasto. Por exemplo, 50% da dose de caldo de Trichoderma podem ser adicionados no momento da inoculação da cultura de Corynebacterium, seguido da adição de 25% em cerca de 10 horas, e os 25% restantes em cerca de 16 horas após a inoculação.
[0038] Esses e outros aspectos e modalidades dos presentes métodos ficarão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição. Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar adicionalmente, mas não a limitar, os métodos.
EXEMPLOS Exemplo 1. Organismos, meio de cultura e caldo gasto
[0039] As cepas de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e ATCC15990 da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) foram usadas para todos os experimentos de L-glutamato.
[0040] A cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC 21513, da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) foi usada para todos os experimentos de produção de L-lisina.
[0041] A cepa de Trichoderma reesei Morph, descrita no pedido PCT n° WO 05/001036, foi usada para todos os experimentos.
[0042] O caldo gasto total de Trichoderma reesei continha (em p/p) água (80 a 98%), e (%) a um pH de 4,5 a 5,0.
[0043] O caldo gasto total de Trichoderma reesei formulado continha (em p/p) água (33 a 45%), glicerol (47 a 53%) e cloreto de sódio (3 a 4%) em um pH de 4,5 a 5,0.
[0044] O meio CGXII continha (por litro) 50 g de glicose, 20 g de sulfato de amônio, 5 g de ureia, 1 g de fosfato de potássio (monobásico), 1 g de fosfato de potássio (dibásico), 0,25 g de sulfato de magnésio, 42 g de ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS), 10 µg de cloreto de cálcio, 35 µg de ácido 3,4-di-hidroxibenzoico, elementos-traço (1 mg de FeSO4, 1 mg de MnSO4, 0,1 mg de ZnSO4, 0,02 mg de CuSO4 e 0,002 mg de NiCl2), 1,0 µg de biotina ajustado para pH 7,0 com o uso de hidróxido de sódio.
[0045] O meio de fermentação batelada alimentada de ácido glutâmico continha (por litro) 15 g de concentrado de agua de lavagem do milho Sigma, 10 g de (NH4)2PO4, 2,0 g de K2HPO4, 0,5 ml de antiespumante Sigma 204, 50 ml de solução de elementos-traço 100 x (que contém 80 g de MGSO4·7H2O, 2,2 g de FeSO4·7H2O e 2,2 g de MnSO4·H2O) e 5 ml de solução de vitamina 1.000 x (que contém 0,2 g de vitamina B1 tiamina), 545 g de 55% em p/p de glicose.
[0046] O meio de frasco de inoculação de lisina continha por litro 5,0 g de extrato de levedura Difco, 10 g de Difco select soytone, 10 g de NaCl e 10,0 g de glicose.
[0047] O meio de fermentação de lisina continha por litro 52,5 g de hidrolisado de farelo de soja, 2,4 g de melaços, 12,4 g de (NH4)2SO4, 0,7 g de monoidrato de ácido cítrico, 2,2 g de H3PO4 a 85%, 1,24 g de MgSO4·7H2O, 1,24 g de MnSO4·H2O, 0,002 g de ZnSO4·7H2O, 0,038 g de FeSO4·7H2O, 0,55 g de L-treonina, 0,60 g de L-metionina, 0,0006 g de biotina, 0,00024 g de cloridrato de tiamina, 0,5 ml de antiespumante Sigma 204, batelada em bolus inicial de 545 g de 55% em p/p de 95DE (Cargill 95DE dextrose).
[0048] A alimentação de fonte de carbono de lisina continha: 55% em p/p de 95DE (Cargill 95DE dextrose) Exemplo 2. Estimulação de produção de glutamato por Corynebacterium
[0049] O caldo gasto total de Trichoderma reesei formulado foi adicionado a ensaios de frasco de agitação que contém uma dentre duas cepas de C. glutamicum diferentes para determinar o efeito no título de ácido glutâmico e reduzir o tempo de fermentação. As cepas de C. glutamicum ATCC13032 e ATCC15990 foram cultivadas a partir de estoques de glicerol em placas de ágar LB mediante a incubação a 30 °C. As células foram transferidas para meio CGXII líquido e incubadas de um dia para o outro a 30 °C com agitação (250 RPM). As células foram transferidas pela segunda vez e cultivadas de um dia para o outro em meio CGXII antes do uso em frascos de produção.
[0050] As células ATCC13032 Corynebacterium foram, então, inoculadas em meio CGXII fresco em um OD inicial de 0,025 a 0,1 (600 nm) e o caldo de Trichoderma gasto foi adicionado (ou água como um controle negativo) em concentrações/dosagens diferentes. Uma dosagem de 1 X representa uma diluição de 1.250 vezes de caldo de Trichoderma gasto em meio de Corynebacterium (0,08% do volume total). Uma dosagem de 5 X representa uma diluição de 625 vezes (isto é, 0,4% do volume total) e uma dosagem de 10 X representa uma diluição de 125 vezes (0,8% do volume total).
[0051] Os frascos foram incubados a 30 °C com agitação (250 RPM) durante cerca de 48 h. No final dessa incubação, a massa celular final foi determinada com o uso da absorbância a 600 nm e a concentração de ácido glutâmico foi determinada com o uso de análise por HPLC (derivatização pré-coluna com o-ftalaldeído, coluna C18 e um gradiente de metanol/acetonitrila como a fase móvel). Cada concentração foi testada em duplicata com os resultados médios mostrados na Tabela 1. Tabela 1. Efeito de caldo de Trichoderma gasto em massa celular de ATCC13032 e produção de glutamato Controle 1X 5X 10X OD (A600nm) 16,85 18,20 22,65 25,80 % de aumento versus controle - 7% 26% 35% Ácido glutâmico (g/l) 5,77 6,73 10,02 10,18 % de aumento versus controle - 14% 42% 43%
[0052] Os resultados mostram um aumento de resposta dependente de dose em massa celular e produção de ácido glutâmico na presença de caldo de Trichoderma gasto até um ponto de saturação em que nenhum aumento adicional possível, provavelmente devido à conversão completa de açúcar disponível.
[0053] O experimento foi repetido com o uso da cepa ATCC15990 com o uso de uma dose de 10 X (0,8% de volume) de caldo de Trichoderma gasto no meio CGXII de Corynebacterium. Os resultados são mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Efeito de caldo de Trichoderma gasto em massa celular de ATCC15990 e produção de glutamato Controle 10X OD (A600nm) 15,6 25,45 % de aumento versus controle - 39% Ácido glutâmico (g/l) 6,83 10,1 % de aumento versus controle - 32%
[0054] As amostras adicionais de caldo de Trichoderma gasto foram testadas em duplicata para determinar se o efeito positivo em produção de ácido glutâmico foi um fenômeno isolado. Um total de cinco caldos totais de Trichoderma gastos (A a E) foi testado conforme descrito acima, em uma dose de 10 X, com o uso da cepa ATCC13032. Os resultados mostram um aumento consistente em produção de ácido glutâmico na presença de qualquer um dos caldos de Trichoderma gastos testados (Tabela 3). Tabela 3. Efeito de caldos de Trichoderma gastos diferentes em massa celular e produção de glutamato Controle A B C D E OD (A600nm) 15,2 19,2 17,3 17,0 17,4 27,6 % de aumento versus controle - 21% 12% 11% 13% 45% Ácido glutâmico (g/l) 5,6 6,6 7,1 7,0 7,4 11,0 % de aumento versus controle - 16% 21% 21% 25% 50%
[0055] O efeito do meio e componentes de formulação associados ao caldo de Trichoderma gasto foi excluído mediante a adição de meio de Trichoderma fresco (isto é, não inoculado), ácido cítrico ou glicerol a culturas de Corynebacterium da mesma maneira em que o caldo de Trichoderma gasto foi adicionado. Nenhum aumento em massa celular ou ácido glutâmico foi detectado (dados não mostrados). Exemplo 3. Experimento de cultura de Corynebacterium de curso do tempo
[0056] A análise de consumo de glicose e produção de ácido glutâmico ao longo do tempo foi realizada em um ensaio de frasco de agitação similar com o uso de doses 1 X e 10 X de caldo de Trichoderma gasto formulado. As amostras das culturas de Corynebacterium (cepa ATCC13032) foram tomadas periodicamente durante um período de cerca de 70 h. Os resultados são mostrados na Figura 1. Os resultados mostram que a adição de caldo de Trichoderma gasto produz um aumento em produção de ácido glutâmico que persiste ao longo do curso do tempo. Exemplo 4. Tratamento de caldo de Trichoderma gasto para anular a atividade enzimática
[0057] O caldo de Trichoderma gasto contém inúmeras enzimas que poderiam afetar o crescimento de Corynebacterium. Para testar se qualquer uma dessas enzimas poderia ser responsável por efeitos observados nos Exemplos anteriores, o caldo de Trichoderma gasto foi tratado para inativar as enzimas. Especificamente, o caldo de Trichoderma gasto foi centrifugado a 14 K x g durante 20 minutos e o sobrenadante coletado. O sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de 30 kDa (marcada, "<30K") e o permeado coletado para o teste em culturas de Corynebacterium. Uma porção da amostra filtrada foi adicionalmente tratada com calor a 90 °C durante 30 minutos (marcado, "Calor"). As amostras tratadas foram constatadas como contendo níveis muito menores de proteína total em comparação com o caldo de Trichoderma gasto bruto quando visualizadas por análise SDS- PAGE. A atividade de uma enzima conhecida por ser superexpressa no caldo de Trichoderma gasto bruto foi analisada no caldo de Trichoderma gasto tratado, e nenhuma atividade foi detectada (dados não mostrados). Tabela 4. Efeito de caldo de Trichoderma gasto tratado em massa celular e produção de glutamato Controle 10X 10X<30 kD 10X Calor OD (A600nm) 18,5 29,9 30,2 29,3 % de aumento versus controle - 38% 39% 37% Ácido glutâmico (g/l) 5,7 10,6 10,5 10,8 % de aumento versus controle - 46% 46% 47%
[0058] Apesar da falta de atividade enzimática e ausência quase completa de proteína, o caldo de Trichoderma gasto tratado ainda melhorou a produção de ácido glutâmico em uma dosagem de 10 X, conforme demonstrado pelo ensaio de frasco de agitação resumido na Tabela 4. Exemplo 5. Experimento de cultura de Trichoderma de curso do tempo
[0059] Para determinar quando os componentes não enzimáticos que aumentam a produção de glutamato por Corynebacterium aparecem no caldo de Trichoderma gasto, um experimento de curso do tempo que envolve uma cultura de Trichoderma foi realizado. Trichoderma foi cultivado em cultura durante até 213 h e as amostras de caldo gasto foram tomadas periodicamente. O peso seco celular ("DCW") e os níveis de proteína secretada na cultura são mostrados na Figura 2. A amostra de cada ponto de tempo foi filtrada através de um filtro de 0,2 µM para remover células.
[0060] As amostras de caldo de Trichoderma gasto tomadas nos pontos no tempo diferentes foi, então, adicionada a culturas de frasco de agitação de Corynebacterium em uma dosagem de 10X e a quantidade de glutamato produzido foi medida conforme descrito acima. Os resultados são mostrados na Figura 3. Os resultados mostram que o componente não enzimático presente no caldo de Trichoderma gasto que melhora a produção de glutamato através de Corynebacterium não está presente no ponto no tempo de 0,3 hora durante o crescimento da cultura de Trichoderma. Entretanto, o componente está presente muito precoce no tempo de fermentação, pelo menos em 29 horas, e permanece durante toda a fermentação. Notavelmente, os níveis de proteína secretada são muito baixos no ponto no tempo de 29 horas. Esse organismo Trichoderma particular também superexpressou uma proteína diferente em comparação com aquela usada nos Exemplos anteriores, enfatizando adicionalmente que o efeito observado nas culturas de Corynebacterium não é dependente do gene de interesse que Trichoderma pode expressar. Exemplo 6. Estimulação de produção de ácido glutâmico em fermentação de batelada alimentada
[0061] O caldo total de T. reesei formulado ou caldo processado foi adicionado aos fermentadores que contêm C. glutamicum para determinar o efeito no rendimento, título e taxa de produção de ácido glutâmico. A cepa C. glutamicum ATCC 13032 foi cultivada a partir de estoques de glicerol em meio de frasco de inoculação de ácido glutâmico e incubada de um dia para o outro a 30 °C com agitação (200 RPM). As células foram transferidas para frascos de inoculação e cultivadas de um dia para o outro no mesmo meio antes do uso nos fermentadores de produção. As culturas de inoculação de um dia para o outro foram usadas para inocular meio de fermentação de ácido glutâmico em um OD inicial de 0,1 (600 nm).
[0062] As fermentações foram realizadas a 30°C com misturação para manter um oxigênio dissolvido de 30% controlado por agitação com um ponto de ajuste mínimo de 300 rpm ao máximo de 1.200 rpm, seguido de superpressurização a um máximo de 1,5 bar e aeração a um máximo de 10,0 (litro padrão por minuto) durante a duração da execução de fermentação.
[0063] Uma alimentação de fonte de carbono, contendo 55% em p/p de 95DE (Cargill 95DE dextrose), que tem uma taxa de alimentação constante de 0,75 g/min, foi usada começando no tempo de fermentação decorrido de 14 horas. Uma dose de 1 X ou 5 X de caldo de Trichoderma gasto total ou uma dose de 1 X de caldo gasto tratado com calor (ou sem caldo como um controle) foi adicionada às fermentações de Corynebacterium. Metade da dose total de caldo de Trichoderma foi adicionada no momento da inoculação com Corynebacterium, 25% em 10 horas, e os 25% restantes em 16 horas após a inoculação.
[0064] No final dessa incubação, a concentração de ácido glutâmico final foi determinada com o uso da análise por HPLC (derivatização pré- coluna com o-ftalaldeído, coluna C18 e um gradiente de metanol/acetonitrila como a fase móvel) com o uso de um detector de fluorescência 1200 Series Agilent Technologies. Os resultados na Tabela X resumem os resultados em termos de aumento percentual na taxa, título e rendimento de ácido glutâmico no final da fermentação, em comparação com o tanque de controle não tratado. Os resultados mostram que o título de ácido glutâmico (relatado como ácido) no fermentador de controle foi menor, em comparação com os tanques de teste. Os fermentadores que contêm uma dose de 1 X ou 5 X de caldo de Trichoderma gasto total ou dose de 1 X de caldo de Trichoderma gasto total tratado com calor mostram níveis maiores de ácido glutâmico em relação ao controle. Os resultados mostram, também, uma taxa e rendimento aumentado de ácido glutâmico no final da fermentação, em comparação com o tanque de controle não tratado. Tabela 5. Efeito de caldo de Trichoderma gasto tratado em produção de ácido glutâmico em fermentação de batelada alimentada Parâmetros de Título de Taxa volumétrico Rendimento de fermentação glutamato de glutamato glutamato Controle 0,0 0,0 0,0 Dose de 1X 9,5 8,6 5,2 Dose de 1X tratada 4,6 4,5 5,9 com calor Dose de 5X 12,9 11,9 6,8 Exemplo 7. Estimulação de produção de lisina por Corynebacterium
[0065] O caldo total de Trichoderma formulado ou caldo tratado com calor foi adicionado aos fermentadores contendo a cepa C. glutamicum ATCC 21513 para determinar o efeito em título de L-lisina e tempo de fermentação reduzido. A cepa C. glutamicum ATCC 21513 foi cultivada a partir de meio de estoque de glicerol e incubada de um dia para o outro a 30°C com agitação (250 RPM) em meio de inoculação de lisina. As células foram transferidas para frascos de inoculação maiores e cultivadas de um dia para o outro em meio de frasco de inoculação líquido antes do uso em fermentadores de produção. As células foram, então, inoculadas em meio de fermentação de lisina fresco em um OD inicial de 0,1 (600 nm) e o caldo de Trichoderma gasto ou caldo processado foi adicionado em concentrações/dosagens diferentes. Uma dosagem de 1 X representa 0,10% em peso de meio de fermentação.
[0066] As fermentações foram realizadas a 30°C com misturação para manter um oxigênio dissolvido de 30% controlado por agitação om a um máximo de 1.200 rpm, seguido de superpressurização a um máximo de 1,5 bar e aeração a um máximo de 10,00 SLPM (Standard Liter Per Minute - litro padrão por minuto) durante a duração da execução de fermentação. Uma alimentação de fonte de carbono de lisina, contendo 55% em p/p de 95DE (Cargill 95DE dextrose), que tem uma taxa de alimentação constante de 0,75 g/min, foi usada começando no tempo de fermentação decorrido de 14 horas. Uma dose de 1 X ou 5 X de caldo de Trichoderma gasto total ou uma dose de 1 X de caldo gasto tratado com calor (ou sem caldo como um controle) foi adicionada às fermentações de Corynebacterium. Metade da dose total de caldo de Trichoderma foi adicionada no momento da inoculação com Corynebacterium, 25% em 10 horas, e os 25% restantes em 16 horas após a inoculação.
[0067] No final dessa incubação, a concentração de L-Lisina final foi determinada com o uso da análise por HPLC (derivatização pré-coluna com o-ftalaldeído, coluna C18 e um gradiente de metanol/acetonitrila como a fase móvel) com o uso de um detector de fluorescência 1200 Series Agilent Technologies.
[0068] Os resultados na Tabela 6 resume adicionalmente os resultados em termos de aumentos percentuais na taxa, título e rendimento de lisina na fermentação no final da execução em comparação com o controle. Os títulos de lisina de pico foram observados no final da execução. Os resultados mostram um aumento significativo em rendimento de lisina na presença de caldo de Trichoderma gasto.
Tabela 6. Efeito de caldo de Trichoderma gasto tratado em produção de lisina
Caldo Aumento em Aumento em taxa Aumento em gasto título de lisina volumétrico de lisina rendimento de lisina
Nenhum 0 0 0
1X total 7,79 7,82 6,96
1X aquecido 17,47 17,00 18,27
5X total 20,50 19,98 17,49

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para melhorar a produção de moléculas pequenas em cultura de Corynebacterium submersa, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar, a uma cultura de Corynebacterium submersa, uma fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto, em que a Corynebacterium cultivada na presença da fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto produz uma quantidade aumentada de moléculas pequenas em comparação com Corynebacterium cultivada em uma cultura submersa idêntica na ausência da fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto, em que o aumento na produção de moléculas pequenas não se deve à atividade enzimática no caldo de fermentação de Trichoderma gasto.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto é produzida filtrando-se o caldo de fermentação de Trichoderma gasto total ou fracionado.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto é produzida tratando-se com calor o caldo de fermentação de Trichoderma gasto total ou fracionado.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto usada para aumentar a produção de moléculas pequenas é um componente do caldo de fermentação de Trichoderma gasto total ou fracionado que é adicionado à cultura de Corynebacterium submersa.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto é um subproduto de uma fermentação que produz uma enzima recombinante.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma usada para aumentar a produção de moléculas pequenas compreende adicionalmente a enzima recombinante.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a enzima recombinante é removida da fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma usada para melhorar a produção de moléculas pequenas.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a enzima recombinante é uma enzima de processamento de carboidrato.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção do caldo de fermentação gasto é adicionada no momento da inoculação da cultura de Corynebacterium.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o caldo de fermentação gasto é coletado de uma cultura de proliferação de Trichoderma pelo menos 29 horas após a inoculação do caldo de Trichoderma.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o caldo de fermentação gasto é coletado de uma cultura de proliferação de Trichoderma antes da expressão de uma proteína de interesse no caldo.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a molécula pequena é um aminoácido.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é ácido glutâmico ou lisina.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o aumento na produção de moléculas pequenas não é resultado da massa celular aumentada na cultura de Corynebacterium.
15. Molécula pequena caracterizada pelo fato de que é produzida em cultura de Corynebacterium submersa produzida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. Uso de uma fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto caracterizado pelo fato de que se destina a aumentar a quantidade de moléculas pequenas produzidas numa cultura de Corynebacterium submersa.
17. Uso de uma fração não enzimática de caldo de fermentação de Trichoderma gasto, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que é combinado com os recursos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
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