WO2014146881A1 - Mikroorganismenstamm und verfahren zur fermentativen herstellung von c4-verbindungen aus c5-zuckern - Google Patents

Mikroorganismenstamm und verfahren zur fermentativen herstellung von c4-verbindungen aus c5-zuckern Download PDF

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WO2014146881A1
WO2014146881A1 PCT/EP2014/053831 EP2014053831W WO2014146881A1 WO 2014146881 A1 WO2014146881 A1 WO 2014146881A1 EP 2014053831 W EP2014053831 W EP 2014053831W WO 2014146881 A1 WO2014146881 A1 WO 2014146881A1
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xylose
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butanediol
fermentation
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PCT/EP2014/053831
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Rupert Pfaller
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Wacker Chemie Ag
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    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
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    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts

Definitions

  • the invention relates to a microorganism strain and a process for the fermentative production of C compounds from C5 sugars (pentoses) with the aid of this strain.
  • Examples of chemical precursors (so-called chemical synthesis building blocks or platform chemicals) from renewable raw materials are ethanol (C2 building block), glycerol, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, lactic acid, 3-hydroxypropionic acid (C3 building blocks ) or succinic acid, 1-butanol, 2-butanol, 1,4-butanediol, acetoin, diacetyl or even 2,3-butanediol (C4 building blocks).
  • These chemical building blocks are the biogenic starting compounds, from which then chemically become further basic chemicals can be produced. The prerequisite for this is the cost-effective fermentative production of the respective synthesis building blocks from renewable raw materials.
  • Decisive cost factors include the availability of suitable cheaper renewable raw materials as well as microbial fermentation processes, which efficiently convert these raw materials into the desired chemical raw material. It is crucial for the economy of these fermentative processes that the microorganisms used can efficiently convert the cheapest available raw materials into the desired product.
  • a C4 building block accessible by fermentation is 2,3-butanediol.
  • the state of the art for fermentative 2,3-butanediol production is summarized in Celinska and Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725 and in Ji et al., Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351-364 ).
  • 3-butanediol biosynthetic pathway see equations (I) to (III) in addition to 2, 3-butanediol further compounds with four carbon atoms fermentatively accessible, namely acetoin and derived thereof by oxidation and diacetyl.
  • 3-butanediol is a possible starting material for petrochemical products with four carbon atoms ⁇ C building blocks) such as acetoin, diacetyl, 1, 3-butadiene, 2-butanone (methyl ethyl ketone, MEK).
  • products with two carbon atoms (C2 units) such as acetic acid (US2012288908 AA) and derived therefrom, acetaldehyde, ethanol and also ethylene are available.
  • acetic acid US2012288908 AA
  • acetaldehyde acetaldehyde
  • ethanol ethylene
  • dimerization of 2, 3-butanediol and C8 compounds are conceivable, the use, for example, as a fuel in the aviation sector.
  • 3-butanediol The biosynthetic pathway of various microorganisms is known as 2, 3-butanediol is known (see, for example, Review by Celinska and Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725) and leads to the central metabolite pyruvate via the following three enzymatic steps 2, 3-butanediol:
  • the prior art discloses processes for preparing 2,3-butanediol based mainly on the use of glucose as a fermentation raw material (C source) (see for example WO 12104234 A1). To 2,3-butanediol and also other C4 and C2
  • glucose is not the preferred fermentation raw material.
  • Glucose is one of the basic products in the food industry (mainly made from starch, sugar cane or sugar beet) and is now increasingly being used for bioethanol production. The resulting increase in demand is expected to lead to a steady increase in the price of glucose. Since the fermentation raw material is one of the cost-determining factors in the production of biogenic platform chemicals, more and more alternatives are being sought. Since large-scale fermentation processes based on glucose as a fermentation raw material represent an unwanted competition to its use as food, there are also important socio-politically motivated reasons for the search for alternative fermentation raw materials.
  • lignocellulosic biomass is of central importance. In agriculture or forestry, it is produced as straw, bagasse or as a waste of wood processing in large quantities without corresponding exploitation possibilities. Accordingly, there are great efforts to find value-increasing uses for components of lignocellulose.
  • Lignocellulosic biomass consists of the three main components cellulose, hemicellulose and lignin. Focus at the Utilization of lignocellulose is the recovery of glucose from cellulose, especially for the fermentative production of bioethanol, The production of glucose from cellulose is a relatively complex and expensive process, which is currently not konkur ⁇ Center, with the conven- tional production of food crops,
  • Hemicellulose is, after cellulose, the most abundant naturally occurring polysaccharide (Saha, J. Ind., Microbiol., Biotechnol. (2003) 30: 279-291) and therefore of great interest as a source of sugar for fermentation.
  • the sugars contained in hemicellulose are comparatively easy to access, especially the most abundant xylose and also arabinose.
  • Various methods of extracting sugars from hemicellulose are known to those skilled in the art, including those based on hydrolysis of hemicellulose hydrothermally, thermally at acidic pH, or enzymatically with xylanases (Saha, J. Ind., Microbiol., Biotechnol., (2003) 30 : 279-291).
  • Xylose (mainly D-xylose, CAS number 58-86-6), the major constituent of hemicellulose, is one of the most abundant naturally occurring carbohydrates. Xylose is in itself a waste material which finds only limited use in the food industry (eg for the production of the sweetener xylitol, Saha, J. Ind. Microbiol.Biotechnol. (2003) 30: 279-291) and because of lack of metabolism of xylose is not suitable for the production of bioethanol on an industrial scale by the fermentation yeasts used industrially.
  • 2,3-butanediol Various natural producers of 2,3-butanediol are known, eg. B, from the genera Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus or Lactococcus. But yeasts are also known as producers ⁇ e.g. Baker's yeast). Most bacterial producers are microorganisms of biological safety level S2, so they can not be used on a large scale without elaborate and expensive technical safety measures (for this and for other microbial 2, 3-butanediol producers, see Review by Celinska and Grajek, Biotechnol Advances (2009) 27 : 715-725). This would also apply to hitherto undescribed genetically optimized production strains based on these strains.
  • biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories p. 9ff, (Table 1), Centers for Disease Control and Prevention (US Pat ) (Editor), Public Health Service (US) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
  • the fermentation time to obtain the maximum C4 yield was 6-8 days unusually long, corresponding to a particularly for xylose comparatively low space-time yield of C4 products 2, 3-butanediol and acetoin of about 0.6 gl h "1 (see Figures 3 and 4 in Yu and Saddler, Ap Environ Microbiol. (1983) 46: 630-635).
  • significantly lower 2,3-butanediol yields were achieved with xylose than with glucose as fermentation product.
  • the space-time yield which is important for the economic efficiency of the process, was low.
  • the object of the present invention is to provide an improved microbial strain for the fermentative production of C4 products which is able to utilize, as a C source in the fermentation, sugars which are present in lignocellulosic biomass, among which preference is given Xylose from the hemicellulose contained therein.
  • the object was achieved by a microorganism strain of the genus Raoultella, Klebsiella, Bacillus, or Paenibacillus containing a poxB gene, characterized in that the poxB gene is inactivated and it is occurring in the lignocellulosic biomass occurring sugar is a pentose which is hemicellulose was won.
  • it is a strain of the genus Raoultella, more preferably R. terrigena.
  • the C4 products are preferably 2,3-butanediol or acetoin and more preferably 2,3-butanediol.
  • the sugar preferably obtained from lignocellulosic biomass and the hemicellulose isolable therefrom is preferably xylose,
  • the poxB gene is preferably inactivated such that it is no longer responsible for a protein with a
  • Pyruvate encoded by ubiquinone oxidoreductase enzyme activity.
  • the poxB gene encodes the enzyme pyruvate: ubiquinone oxidoreductase (EC 1.2.5.1, formerly EC 1.2.2.2), also named
  • Pyruvate oxidase or pyruvate dehydrogenase oxidizes pyruvate to acetate according to equation (IV):
  • Acetate + C0 2 + ubiquinone (reduced) (IV) It is any gene encoding an enzyme that oxidizes pyruvate to acetate according to equation (IV), thereby reducing ubiquinone and liberating one molecule of C0 2 .
  • the poxB gene is derived from a bacterium of the genus Raoultella,
  • the poxB gene is derived from a strain of the species Raoultella terrigena.
  • poxB gene from the strain Raoultella terrigena DSM 2687 as disclosed in SEQ ID NO: 1 encoding a pyruvate oxidase protein characterized by an amino acid sequence as disclosed in SEQ ID NO: 2.
  • the strain according to the invention makes possible an improved metabolism of C5-sugars particularly preferably xylose, to C-products, particularly preferably to 2,3-butanediol.
  • Bacterial strains with inactivated poxB gene are described, e.g. for E. coli (Chang and Cronan, J. Bacteriol, (1983) 154: 756-762). There is, however, no evidence of suitability for the production of C4 products such as acetoin and 2,3-butanediol or the fermentative utilization of C5-sugars.
  • the inactivation of the poxB gene causes that pyruvate is no longer degraded via the pyruvate oxidase reaction to acetate.
  • more pyruvate is available for other metabolic pathways (e.g., for the formation of acetolactate, see equation (I)).
  • less reduction equivalents are available from the oxidation of the pyruvate, such as e.g. for the reduction of acetoin to 2,3-butanediol (see equation (III)). Therefore, it was not expected that inactivation of the poxB gene should lead to an improvement in 2,3-butanediol production.
  • the inactivation of the poxB gene in the microorganism strain according to the invention is suitable for the use of xylose as the C source of fermentation or cultivation in the shaking flask, the yield of C4 products 2,3-butanediol and acetoin, and preferably 2 thereof , 3-butanediol to increase more than 20%, preferably 40% and most preferably by more than 60%, at the same time the proportion of the acetate by-product is reduced by at least 10%, preferably 25% and most preferably by 50%.
  • the microorganism strain according to the invention also called the production strain, is preferably produced from a parent strain.
  • the starting strain is a wild-type strain of the named genera capable of 2,3-butanediol production.
  • the parent strain is in a known manner of mutagenesis (eg chemically by mutagenic chemicals such as N-methyl-N 'nitro-N-nitrosoguanidine or physically by UV irradiation) subjected to random mutations are generated in the genomic DNA and the desired poxB mutant then from the Variety of mutants generated is selected, for example, in each case after separation of the mutants, by the lack of a based on the enzyme activity color reaction or genetically by detecting a defective poxB gene.
  • mutagenesis eg chemically by mutagenic chemicals such as N-methyl-N 'nitro-N-nitrosoguanidine or physically by UV irradiation
  • the targeted inactivation of the poxB gene by the known mechanism of homologous recombination is preferred.
  • Cloning systems for targeted gene inactivation by means of homologous recombination are commercially available, as disclosed, for example, in the user manual of the "Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", based on the Red® / ET® technology of the company Gene Bridges GmbH ⁇ see " Technical proto- col, Quick & Easy e, coli Gene deletion Kit, by Red ® / ET ® Recom- bination, Cat. No. K006, version 2.3 June 2012 "and references cited therein)
  • the poxB gene or a part of the gene is isolated and a foreign DNA is cloned into the poxB gene by means of homologous recombination, whereby the protein-defining reading frame of the poxB gene is interrupted.
  • a DNA construct suitable for targeted inactivation of the poxB gene consists of a 5 'DNA portion homologous to the genomic poxB gene, followed by a gene portion comprising the foreign DNA and attached to a 3 1 -DNA portion which in turn is homologous to the genomic poxB gene.
  • the region of the poxB gene which is suitable for homologous recombination does not only include the region coding for the pyruvate oxime.
  • the area in question also includes the DNA sequences flanking the poxB gene, namely in the 5 'region before the beginning of the coding region ⁇ promoter of gene transcription) and in the 3 * region after the end of the coding gene.
  • the region (terminator of gene transcription) whose alteration by homologous recombination, as well as the alteration of the coding region, may lead to inactivation of the poxB gene.
  • the foreign DNA is preferably a selection marker expression cassette.
  • This consists of a promoter of gene transcription, which is functionally connected to the actual selection marker gene and optionally followed by a terminator of gene transcription.
  • the selection marker contains 5 l and 3 4 flanking homologous sequences of the poxB gene, each at least 30 bp in length, preferably each at least 50 bp in length.
  • the DNA construct for inactivating the poxB gene thus consists, starting from the 5 ⁇ end, of a poxB gene homologous sequence of at least 30 bp length, preferably at least 50 bp length, followed by the expression cassette of the selection marker, selected from the class of Antibiotic resistance genes and followed by a further, homologous to the poxB gene sequence of at least 30 bp length, preferably at least 50 bp in length.
  • the selection marker genes are generally genes whose gene product allows the parent strain to grow under selective conditions under which the original parent strain can not grow.
  • Preferred selection marker genes are selected from the group of antibiotic resistance genes such as e.g. the ampicillin resistance gene, the tetracycline resistance gene, kanamycin
  • selection marker genes allow the parent strains with a metabolic defect (eg, amino acid red tootrophies) to grow under selective conditions, as their expression corrects the metabolic defect.
  • selection marker genes are also possible whose gene product chemically alters a compound which is toxic in itself for the starting strain and thus inactivates it (eg the gene the enzyme acetamidase, which cleaves the compound toxic to many microorganisms acetamide into the non-toxic products acetate and ammonia).
  • the selection marker genes are the ampicillin resistance gene, the tetracycline resistance gene, the kanamycin resistance gene, the chloramphenicol resistance gene.
  • Particularly preferred are the tetracycline resistance gene and the kanamycin resistance gene,
  • Preferred is a method for targeted gene inactivation of the poxB gene based on the Red ® / ET ® technology
  • the parent strain is a 2,3-butanediol producing strain of the genus Raoultella, Klebsiella, Bacillus, or Paenibacillus. These strains are all commercially available, e.g. at the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GbmH (Braunschweig), among which is also commercially available from DSMZ GmbH the strain Raoultella terrigena DSM 2687 used in the examples.
  • it is a starting strain and a production strain classified in the security level Sl and of these, again preferably, to strains of the species Raoultella terrigena.
  • Particularly preferred is a production strain in which the poxB gene INAK ⁇ tivator from Raoultella terrigena originates.
  • the production strain according to the invention can be further optimized in order to additionally improve C4 production.
  • the optimization can be carried out by genetic engineering by additional expression of one or more genes which are suitable for improving the production properties.
  • genes are e.g. 2, 3-butanediol biosynthesis genes such as acetolactate synthase (DE 102011003394), acetolactate decarboxylase (DE 102011003383) and acetoin reductase (DE 102011003387).
  • acetolactate synthase DE 102011003394
  • acetolactate decarboxylase DE 102011003383
  • acetoin reductase DE 102011003387
  • the production strain can be optimized by inactivating, in addition to the poxB gene, further genes whose gene products adversely affect C4 production, including preferably 2,3-butanediol production.
  • genes whose gene products are responsible for by-product formation include z. B, the lactate dehydrogenase (lactic acid formation) or the acetaldehyde dehydrogenase (ethanol formation),
  • the invention further relates to a fermentative process for the production of C4 products from sugars which occur in a lignocellulosic biomass containing by means of a microorganism strain according to the invention.
  • the sugar is preferably a sugar obtained from hemicellulose, preferably a pentose, particularly preferably a xylose.
  • biomass of the production strain and, on the other hand, the C4 products, including preferably 2, 3-butanediol, are formed.
  • the formation of biomass and the C4 products can be correlated in time or decoupled from each other in terms of time.
  • the cultivation takes place in a manner familiar to the person skilled in the art. This can be done in shake flasks (laboratory scale) or by fermentation (production scale).
  • Cultivation media are familiar to those skilled in the practice of microbial cultivation. They typically consist of a carbon source (C source), a nitrogen source (N source) and additives such as vitamins, salts and trace elements, by means of which cell growth and C4 product formation, including preferably 2, 3-butanediol, be optimized.
  • C source carbon source
  • N source nitrogen source
  • additives such as vitamins, salts and trace elements
  • Preferred C sources for growing the production strains are pentoses such as e.g. Xylose, arabinose or ribose, as well as pentose-containing vegetable hydrolysates, which consist of lignocellulosic biomass such as e.g. Sugar cane bagasse, cereal straw or waste of maize or wood processing, or the hemicellulose contained therein can be obtained.
  • pentoses such as e.g. Xylose, arabinose or ribose
  • pentose-containing vegetable hydrolysates which consist of lignocellulosic biomass such as e.g. Sugar cane bagasse, cereal straw or waste of maize or wood processing, or the hemicellulose contained therein can be obtained.
  • the hydrolysis of the lignocellulose-containing biomass may precede the production process according to the invention or take place in situ during the production process according to the invention.
  • a particularly preferred C source is xylose, either in isolated form or as part of a vegetable hydrolyzate.
  • the C sources used in the production process according to the invention thus comprise both the isolated pure substances also, to increase the economic efficiency, not further purified mixtures of the individual C sources, as they can be obtained as hydrolysates by thermal, chemical or enzymatic digestion (or any combination of these digestion methods) of the vegetable raw materials.
  • C sources thus does not exclude that the C sources according to the invention occur in admixture with other non-inventive C sources in the growth medium.
  • C sources include all forms of monosaccharides, including C6 sugars such as glucose, mannose or fructose.
  • the C sources also include disaccharides, in particular sucrose, lactose, maltose or cellobiosis.
  • Further affected are all C sources in the form of higher saccharides, glycosides or carbohydrates with more than two sugar units such. As maltodextrin, starch, cellulose, pectin or by hydrolysis (thermally, enzymatically or chemically) released monomers or oligomers.
  • Other possible C sources other than sugars or carbohydrates are acetic acid (or acetate salts derived therefrom), ethanol, glycerol, citric acid (and salts thereof) or
  • N sources are those that can be used by the production strain for biomass production. These include ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH or else its salts such. As ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, on oniumacetat or ammonium nitrate. Furthermore, as N-
  • the N sources also include complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soya peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or dried as so-called CSD) as well as NZ amines and yeast nitrogen bases.
  • the cultivation can take place in the so-called batch mode, wherein the growth medium is inoculated with a starter culture of the production strain and then the cell growth takes place without further feeding of nutrient sources.
  • Cultivation can also take place in the so-called fed-batch mode, with additional nutrient sources being fed in after an initial phase of growth in batch mode (feed) in order to compensate for their consumption.
  • the feed can consist of the C source, the N source, one or more important for the production of vitamins, or trace elements or a combination of the aforementioned.
  • the feed components can be used together as a mixture or else separately
  • Feed lines are to be dosed.
  • other media components as well as specific C production enhancing additives may be added to the feed.
  • the feed can be fed continuously or in portions (batchwise) or else in a combination of continuous and discontinuous feed. Preference is given to the cultivation according to the fed-batch mode.
  • Preferred C sources in the feed are xylose or xylose-containing plant hydrolysates which can be obtained from lignocellulosic biomass waste.
  • Particularly preferred C source in the feed is xylose.
  • Preferred N sources in the feed are ammonia, gaseous or in aqueous solution as NHOH and its salts ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium acetate and ammonium chloride, furthermore urea, KNO 3 , NaNO 3 and ammonium nitrate, yeast extract, proteose peptone, malt extract, soya peptone, casamino acids Corn Steep Liquor as well as N -Amine and Yeast Nitrogen Base.
  • N sources in the feed are ammonia, or ammonium salts, urea, yeast extract, soya peptone, malt extract or corn steep liquor (in liquid or in dried form).
  • the cultivation takes place under pH and temperature conditions, which favor the growth and the C-production of the production strain.
  • the useful pH range is from pH 5 to pH 8.
  • Preferred is a pH range of pH 5.5 to pH 7.5.
  • Particularly preferred is a pH range of pH 6.0 to pH 7.
  • the preferred temperature range for the growth of the production strain is 20 ° C to 40 ° C. Particularly preferred is the temperature range of 25 ° C to 35 ° C.
  • the growth of the production strain can optionally take place without oxygen supply (anaerobic cultivation) or else with oxygen supply (aerobic cultivation). Preference is given to aerobic cultivation with oxygen, the oxygen supply being ensured by introduction of compressed air or pure oxygen. Particularly preferred is the aerobic cultivation by entry of compressed air.
  • the cultivation time for C4 production is between 10 h and 200 h. Preferred is a cultivation period of 20 h to 120 h. Particularly preferred is a cultivation time of 30 h to 100 h.
  • Cultivation batches obtained by the method described above contain the C4 product, including preferably 2, 3-butanediol, preferably in the culture supernatant.
  • the C product contained in the cultivation mixtures can either be re-used directly without further processing or else be isolated from the culture mixture.
  • known process steps are available, including centrifugation, decantation, filtration, extraction (see, for example, DE
  • Fig. 1 shows the 3.4 kb vector pKD13 used in Example 1.
  • Fig. 2 shows the 6.3 kb vector pKD46 used in Example 1.
  • Example 1 Production of poxB knock out mutants in Raoultella terrigena
  • Raoultella terrigena DSM 2687 (commercially available from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) was used as a starting strain for gene isolation and for strain development.
  • the aim of gene inactivation was the poxB gene from R. terrigena.
  • the DNA sequence of the R. terrigena poxB gene is disclosed in SEQ ID NO: 1, which encodes a pyruvate oxidase protein having the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 2.
  • the R. terrigena poxB gene ® with the known from the E. coli molecular biology Red ® / ET technology of the company. Gene Bridges GmbH inactivated (as described in the user manual for the "Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", see “Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene deletion Kit, by Red ® / ET ® Recombina- tion, No. Cat. Be K006, version 2.3, June 2012 and literature cited therein, for example Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. . USA 97 (2000): 6640-6645).
  • the plasmids pKD13 ( Figure 1), pKD46 ( Figure 2), and pCP20 were used.
  • the 6.3 kb plasmid pKD46 ( Figure 2) is disclosed in the "GenBank” gene database under accession number AY048746.1
  • the 9.4 kb plasmid pCP20 is disclosed in Cherepanov and Wackernagel, Gene 158 (1995): 9 -14.
  • primers pdh-2f SEQ ID NO: 3
  • pdh-3r SEQ ID NO: 4
  • the primers pdh-lf SEQ ID NO: 5
  • pdh-4r SEQ ID NO: 6
  • Primer pdh-lf contained the 5 ⁇ - ⁇ (bp 1-25 in SEQ ID NO: l), primer pdh-4r the 3 * end of the poxB gene (bp 1695-1719 in SEQ ID NO: l, in reverse complementary Shape) .
  • Primer pdh-2f contained 50 bp from the 5 "region of the poxB gene (bp 111-160 in SEQ ID NO: 1) and attached 20 bp specific for the plasmid pKD13 (termed “priming site 1" in Figure 1)
  • Primer pdh-3r contained 50 bp from the 3 * region of the poxB gene (bp 1551-1600 in SEQ ID NO: 1, in reverse complementary form) and connected thereto 20 bp specific for the plasmid pKD13 ⁇ referred to as "priming site 2" in Fig. 1).
  • R, terrigena was transformed with the plasmid pKD46 (so-called “Red Recombinase” plasmid, Fig. 2) and an ampicillin-resistant clone isolated (designated Rt-pKD46) .
  • the transformation of R. terrigena was carried out as described in DE 102011003394.
  • a poxB-specific DNA fragment suitable for its inactivation was prepared in a PCR reaction (Taq DNA polymerase, Qiagen) with DNA from plasmid pKD13 ( Figure 1)
  • DNA from plasmid pKD13 was used to bind to the primers pdh-2f (SEQ ID NO: 3) and pdh-3r (SEQ ID NO: 4) produce a 1.3 kb PCR product which has a DNA segment from each of the 5 1 and 3 ⁇ ends
  • the PCR product contained the expression cassette of the kanamycin resistance gene contained in pKD13 and, flanking to the 5 'and 3' ends of the kanamycin expression cassette, respectively, containing 50 bp which was specific for the R.
  • FRT direct repeats 11 referred to as “natural FRT site” and “distal 35 nt o f natural FRT site “in Fig. 1), short DNA sections which served in a later step to remove the kanamycin antibiotic marker as a recognition sequence for the" FLP recombinase "(contained on the plasmid pCP20).
  • the 1.3 kb PCR product was isolated and incubated with the restriction reagent known to the person skilled in the art, which only cuts through methylated DNA. kitonsendonuclease Dpn I treated to remove residual pKD13 plasmid DNA. Non-methylated DNA from the PCR reaction is not degraded.
  • the 1.3 kb PCR product which is specific for the poxB gene and contains an expression cassette for the kanamycin resistance gene was transformed in a known manner (DE 102011003394) into RtpKD46 and isolated on LBkan plates at 30 ° C. kanamycin-resistant clones, LBkan plates contained LB medium (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl), 1.5% agar and 15 mg / 1 kanamycin.
  • kanamycin resistant clones Five of the obtained kanamycin resistant clones were purified on LBkan plates and tested in a PCR reaction to see if the kanamycin resistance cassette was correctly integrated into the poxB gene.
  • the genomic DNA used for the PCR reaction was previously in a manner known per se with a DNA isolation kit (Qiagen) from cells of the culture of kanamycin-resistant clones of R. terrigena DSM 2687 in LBkan Medium (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl, 15 mg / 1 kanamycin).
  • Genomic DNA of the R. terrigena wild-type strain DSM 2687 served as control.
  • the primers used for the PCR reaction were pdh-lf (SEQ ID NO: 5) and pdh-4r (SEQ ID NO: 6).
  • terrigena wild-type DNA yielded a DNA fragment of 1700 bp in the PCR reaction, as expected for the intact gene.
  • the five kanamycin-resistant clones yielded a DNA fragment of 1600 bp in the PCR reaction.
  • the clones were examined in a PCR reaction with the primers pdh-if and Kan2r (SEQ ID NO: 7).
  • Primer Kan2r (SEQ ID NO: 7) was derived from the kanamycin Resis ⁇ tenzgen the plasmid pKD13 (hereinafter in Figure 1 as "primer Kan2r.) And had the following DNA sequence: SEQ ID NO: 7:
  • the R. terrigena ild-type DNA containing no kanamycin resistance gene revealed no PCR product in the PCR reaction, as expected.
  • the five kanamycin-resistant clones revealed a DNA fragment of 850 b in the PCR reaction. This result showed that the kanamycin resistance gene could be successfully integrated at the locus of the poxB gene and thus the poxB gene had been inactivated.
  • the five clones with inactivated poxB gene were designated R. t. ⁇ :; kan- 1 to
  • the 9.4 kb vector pCP20 is disclosed in Cherepanov and Wackernagel, Gene 158 (1995): 9-14.
  • the pCP20 vector contains the FLP recombininase gene.
  • the FLP recombininase recognizes the FRT sequences flanking the expression cassette of the kanamycin resistance gene and causes the removal of the kanamycin expression cassette.
  • the clones obtained at 30 ° C were incubated at 37 ° C. Under these conditions, on the one hand the expression of FLP recombinase was induced and on the other hand the replication of the pCP20 vector was suppressed.
  • R. t, ⁇ :: kan-5 were all kanamycin-sensitive after treatment with pCP20 plasmid, as detected by plating on LB and LBkan plates. While all five strains grew on LB plates, no one could on LBkan plates Growth, indicating the successful removal of the kanamycin cassette from the genome.
  • genomic DNA was isolated from the kanamycin-sensitive clones (Qiagen DNA isolation kit) and in a PCR reaction (Taq DNA polymerase, Qiagen) with the primers pdh-lf ⁇ SEQ ID NO; 5, which includes the 5 X end of the poxB gene) and pdh-4r (SEQ ID NO: 6, which includes the 3 1 end of the poxB gene).
  • R. terrigena wild-type DNA yielded a DNA fragment of 1700 bp in the PCR reaction as expected for the intact poxB gene.
  • the five kanamycin-sensitive clones produced a DNA fragment of 340 bp in the PCR reaction, which corresponded to the expected size of the 5 'and 3 1 fragments of the inactivated poxB gene remaining after homologous recombination.
  • the strains isolated from this step were designated R.t. ApoxB-1 to R.t. ApoxB-5. These strains are characterized by the fact that in them the poxB gene was inactivated and that these strains were again sensitive to the antibiotic kanamycin.
  • Example 2 Fermentation of the Starting Strain Raoultella Terrigena DSM 2687 with Glucose and Xylose as C Source (Not According to the Invention; Comparative Example)
  • Feed medium (73% glucose, w / v or 75% xylose, w / v) was metered in according to the consumption of glucose or xylose via a peristaltic pump.
  • a vegetable based alkoxylated fatty acid ester commercially available under the name Struktol J673 from Schill & Seilacher (diluted 20-25% v / v in water) was used.
  • the strain used in the fermentation was Raoultella terrigena DSM 2687 (control strain R.t. WT).
  • Baten fermentation media were FM2-G (C source glucose) and FM2-X (C source xylose).
  • FM2-G medium contained glucose 40 g / l; CSD (Corn Steep Liquor dried) 10 g / 1; Ammonium sulfate 5 g / 1; NaCl 0.5 g / 1; FeS0 4 x 7 H 2 O 75 mg / l; Na 3 citrate x 2 H 2 0 1 g / 1; CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O 14.7 mg / 1; MgS0 4 x 7 H 2 0 0.3 g / 1; KH 2 P0 4 1.5 g / 1; Trace element mix 10 ml / 1.
  • the pH of the FM2-G medium was adjusted to 6.0 before starting the culture.
  • FM2-X medium contained the same composition as FM2-G medium. However, glucose was replaced by xylose (40 g / l).
  • the trace element mix had the composition H 3 B0 3 2.5 g / l; CoCl 2 x 6 H 2 O 0.7 g / 1; CuSO 4 ⁇ 5 H 2 O 0.25 g / 1; MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O 1.6 g / 1; ZnS0 4 ⁇ 7 H 2 0 0.3 g / 1 and Na 2 Mo0 4 ⁇ 2 H 2 0 0.15 g / 1. 1.35 1 FM2-G or FM2-X medium were inoculated with 150 ml preculture.
  • the preculture of the strains to be fermented was prepared by 24 h shake flask growing in glucose containing FM2-G medium. The fermentation conditions were: temperature 30 ° C, stirrer speed 1000 rpm, aeration with 1 vvm, pH 6.3.
  • the fermenter was sampled periodically to analyze the following parameters: The cell density OD 6 oo as a measure of the biomass formed was determined photometrically at 600 nm (BioRad photometer SmartSpec TM 3000 ⁇ .
  • the glucose or xylose content of fermenter samples was determined using the analyzer 7100MBS from YSI equipped with measuring stations for both glucose and xylose, the determination of the content of C4 products (2,3-butanediol and acetoin) and C2 -Shen (acetate and ethanol) in culture supernatants was carried out in a conventional manner by 1 H-NMR (see, for example, DE102011003394). For this purpose, in each case an aliquot of the culture was centrifuged (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) and 0.1 ml of the culture supernatant with 0.6 ml of TSP (3
  • feed solutions of glucose (73% w / v) or xylose (75% w / v) were each pumped (Watson Marlow peristaltic pump 101 U / R) / v) fed.
  • the feeding speed was determined by the current glucose or xylose consumption rate.
  • Table 1 shows the time-dependent formation of C2 and C4 products in R. terrigena control strain R.t. WT with glucose and xylose as C source of fermentation
  • Example 3 Comparative shake flask culture of R.t. ApoxB mutants with glucose (comparative example) and xylose (according to the invention) as source of C 2
  • the strains were tested by shake flask breeding for production of the C products 2,3 butanediol and acetoin as well as the C2 products acetate and ethanol.
  • 50 ml of FM2-G or FM2-X medium were inoculated and incubated at 30 ° C and 140 rpm (Infors shaker).
  • the culture time was 96 h.
  • the glucose and xylose concentrations were determined at intervals of 24 h (Analyzer 7100MBS from YSI, see Example 2) and glucose or xylose were re-fed from 40% (w / v) stock solutions if necessary.
  • At intervals of 24 h samples were examined for their content of C4 and C2 products (see Example 2).
  • the production curves for the C source glucose are shown in Table 2, for the C source xylose in Table 3.
  • Table 3 Production process in recombinant Raoultella terrena strains with xylose as C source; (R.t. -WT: Comparative Example: R.t., ⁇ -l, R. t.ApoxB-2, R.t. ⁇ -3 Invented)
  • the fermentation was carried out as described in Example 2. Strains used in the fermentation were R.t. WT (control strain) and R.t. ApoxB-l. Batch fermentation medium was the FM2-X medium described in Example 2.
  • the fermentation conditions were: temperature 30 ° C., stirrer speed 1000 rpm, aeration with 1 vvm, pH 6.3,
  • the xylose content and the content of C4 and C2 products were determined as described in Example 2. After the xylose present in the batch medium was consumed, a 75% (w / v) xylose feed solution was fed in via a pump (peristaltic pump 101 U / R from atson Marlow). The feeding rate was determined by the current xylose consumption rate.
  • Table 4 shows the time-dependent formation of C2 and C4 products in R. terrigena control strain R.t. WT and in the poxB knock out strain R.t. ApoxB-i.
  • Table 4 Production process in the fed-batch fermentation with xylose as C source (R.t. WT: Comparative Example; R.t. ApoxB-l according to the invention)
  • Example 5 Fermentation with the C source xylose in the 330 l scale The aoultella terrigena knock out mutant RtApoxB-1, in which the poxB gene had been inactivated, was fermented.
  • An inoculum of RtApoxB-1 in LB medium was prepared by adding 2 ⁇ 100 ml LB medium, in each case in a 1 1 Erlenmeyer flask, each with 0.25 ml of a glycerol culture (overnight culture of the strain in LB medium supplemented with glycerol at a final concentration of 20% v / v and stored at -20 ° C). The cultivation was carried out for 7 h at 30 ° C and 120 rpm on an infus orbital shaker (cell density
  • OD 60 o / ml of 0.5-2.5 100 ml of the preculture were used to inoculate 8 liters of fermentation medium. Inoculated were two Vorfermenter with 8 1 fermenter medium. Prefermenters: The fermentation was performed three fermenters the company Sartorius BBI Systems GmbH in two Biostat ® C-DCU. Fermentation medium was FM2-G (see Example 2), the fermentation was carried out in the so-called batch mode. 2 8 1 FM2-G were inoculated with 100 ml of inoculum. Fermentation temperature was 30 ° C. pH of the fermentation was 6.3 and was kept constant with the correction agents 25% NH 4 OH, or 6 NH 3 P0 4 .
  • Aeration was carried out with compressed air at a constant flow rate of 1 vvm.
  • the oxygen partial pressure pO 2 was adjusted to 50% saturation.
  • the regulation of the oxygen partial pressure was carried out via the stirring speed (stirrer speed 450-1,000 rpm).
  • Struktol J673 (20-25% v / v in water) was used.
  • the two pre-fermenters were used as the inoculum for the main fermenter.
  • Main fermentor The fermentation was ® in a Biostat D 500 fermenter (working volume 330 1, 500 1 tank volume) of the company Sartorius BBI Systems GmbH performed.
  • Fermentation medium was FM2-X with xylose as C source (see Example 2). Fermentation took place in the so-called fed-batch mode.
  • the oxygen partial pressure pO 2 was set at 50% saturation.
  • the regulation of the oxygen partial pressure was effected via the stirring speed (stirrer speed 200-500 rpm).
  • Struktol J673 (20-25% v / v in water) was used.
  • the xylose consumption was determined by off-line xylose measurement with an analyzer from YSI (see Example 2).
  • the metered addition of a 75% w / v xylose feed solution was started.
  • the flow rate of the feed was chosen so that a xylose concentration of 10 - 20 g / 1 could be maintained during the production phase.
  • the volume in the fermenter was 295 1.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern (Pentosen). Der Mikroorganismenstamm der Gattung Raoultella, Klebesiella, Bacillus oder Paenibacillus enthaltend ein poxB Gen ist dadurch gekennzeichnet, dass das poxB Gen inaktiviert ist und es sich bei dem in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommenden Zucker um eine Pentose handelt welche aus Hemicellulose gewonnen wurde.

Description

Mikroorganismenstamm und Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern
Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm und ein Ver- fahren zur fermentativen Herstellung von C -Verbindungen aus C5-Zuckern (Pentosen) mit Hilfe dieses Stammes.
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstellungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe,
Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthese- bausteine oder auch Plattformchemikalien genannt) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2-Baustein) , Glycerin, 1,3- Propandiol, 1 , 2-Propandiol , Milchsäure, 3 -Hydroxypropionsäure (C3 -Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2-Butanol, 1,4- Butandiol, Acetoin, Diacetyl oder auch 2 , 3 -Butandiol (C4- Bausteine) , Diese chemischen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits mikrobiel- le Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Für die Wirtschaftlichkeit dieser fermentativen Verfahren ist dabei ent- scheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen die billigsten verfügbaren Rohstoffe effizient in das gewünschte Produkt umsetzen können.
Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4 -Baustein (C4- Platt ormchemikalie) ist 2 , 3 -Butandiol . Der Stand der Technik zur fermentativen 2 , 3 -Butandiol Herstellung ist zusammengefasst in Celinska und Graj ek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725 und in Ji et al., Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351-364). Aus dem mikrobiellen 2 , 3-Butandiol Biosyntheseweg (siehe Gleichungen (I) bis (III)) sind neben 2 , 3 -Butandiol noch weitere Verbindungen mit vier C-Atomen fermentativ zugänglich, nämlich Acetoin und davon durch Oxidation abgeleitet auch Diacetyl. , 3-Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen {C -Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1, 3 -Butadien, 2-Butanon (Methyl -Ethylketon, MEK) . Au- ßerdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2 -Bausteine) wie Essigsäure (US2012288908 AA) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2 , 3-Butandiol sind auch C8 -Verbindungen denkbar, die Verwendung z.B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosynthet sehe Weg zu 2 , 3 -Butandiol ist bekannt (siehe z.B. Review von Celinska und Grajek, Biotechnol . Advances (2009) 27: 715-725) und führt vom zentralen Stoffwechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2 , 3 -Butandiol :
Reaktion der Acetolactatsynthase : Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von C02.
Figure imgf000003_0001
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase : Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
(II)
Figure imgf000003_0002
Reaktion der Acetoinreduktase (2 , 3 -Butandioldehydrogenase) : NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2 , 3 -Butandiol ,
Figure imgf000004_0001
Der Stand der Technik offenbart Verfahren zur Herstellung von 2 , 3 -Butandiol, die hauptsächlich auf der Verwendung von Glucose als Fermentationsrohstoff (C-Quelle) beruhen (siehe z.B. WO 12104234 AI) . Um 2 , 3 -Butandiol und auch andere C4- und C2-
Plattformchemikalien wie Acetoin, Ethanol und Essigsäure wirtschaftlich, d.h. konkurrenzfähig zur Produktion aus petrochemi- schen Rohstoffen, herstellen zu können, ist Glucose nicht der bevorzugte Fermentationsrohstoff. Glucose ist eines der Basis - produkte in der Nahrungsmittelindustrie (vor allem hergestellt aus Stärke, Zuckerrohr oder Zuckerrübe) und wird mittlerweile auch verstärkt zur Bioethanol Herstellung eingesetzt. Bei der dadurch hervorgerufenen steigenden Nachfrage ist mit einer stetigen Verteuerung des Rohstoffs Glucose zu rechnen. Da der Fer- mentationsrohstoff einer der kostenbestimmenden Faktoren bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien ist, wird verstärkt nach Alternativen gesucht. Da grosstechnische, auf Glucose als Fermentationsrohstoff beruhende Fermentationsverfahren eine unerwünschte Konkurrenz zu dessen Verwendung als Nahrungs- mittel darstellen, gibt es auch gewichtige sozialpolitisch motivierte Gründe für die Suche nach alternativen Fermentations- rohstoffen.
Unter den alternativen Fermentationsrohstoffen fällt lignozel- lulosehaltiger Biomasse eine zentrale Bedeutung zu. Sie fällt in der Land- oder Forstwirtschaft als Stroh, Bagasse oder als Abfall der HolzVerarbeitung in großen Mengen ohne entsprechende Verwertungsmöglichkeiten an. Entsprechend gibt es große Anstrengungen, wertsteigernde Verwendungsmöglichkeiten für Be~ standteile der Lignozellulose zu finden.
Lignozellulosehaltige Biomasse besteht aus den drei Hauptkomponenten Cellulose, Hemicellulose und Lignin. Schwerpunkt bei der Verwertung von Lignozellulose ist die Gewinnung von Glucose aus Cellulose, v.a. zur fermentativen Gewinnung von Bioethanol , Die Gewinnung von Glucose aus Cellulose ist ein vergleichsweise aufwendiger und teurer Prozess, der gegenwärtig mit der konven- tionellen Herstellung aus Nahrungsmittelpflanzen nicht konkur¬ rieren kann,
Hemicellulose ist nach der Cellulose das am häufigsten in der Natur vorkommende Polysaccharid (Saha, J. Ind. Microbiol. Bio- technol . (2003) 30:279-291) und daher als Quelle zur Gewinnung von Zucker für die Fermentation von großem Interesse.
Vergleichsweise einfach zugänglich sind die in der Hemicellulose enthaltenen Zucker, darunter vor allem die am häufigsten vorkommende Xylose und auch Arabinose . Verschiedene Verfahren der Extraktion von Zuckern aus Hemicellulose sind dem Fachmann bekannt, darunter solche, die auf hydrothermal, thermisch bei saurem pH oder enzymatisch mit Xylanasen durchgeführter Hydrolyse der Hemicellulose beruhen (Saha, J. Ind. Microbiol. Bio- technol. (2003) 30:279-291).
Xylose (vor allem D-Xylose, CAS Nummer 58-86-6) als Hauptbestandteil der Hemicellulose ist eines der am häufigsten in der Natur vorkommenden Kohlenhydrate. Xylose ist an sich ein Ab- fallstoff, der nur begrenzt Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie findet (z.B. zur Herstellung des Süßstoffes Xylitol, Saha, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2003) 30:279-291) und wegen fehlender Verstoffwechslung der Xylose durch die industriell eingesetzten Fermentationshefen auch nicht zur Herstellung von Bioethanol im großtechnischen Maßstab geeignet ist.
Diese Faktoren, billiger und in großen Mengen verfügbarer Rohstoff, vergleichsweise einfache Isolierung und geringe Nachfra¬ ge nach alternativer Verwertung machen Xylose zu einem attrak- tiven Fermentationsrohstoff bei der Herstellung biogener Platt - formchemikalien, besonders bei der fermentativen Herstellung der C4-Produkte 2 , 3-Butandiol oder Acetoin und hier insbesonde¬ re bei der Verwendung des fermentativ hergestellten 2,3- Butandiols oder Acetoins zur Gewinnung von Essigsäure durch Gasphasenoxidation .
Verschiedene natürliche Produzenten von 2 , 3 -Butandiol sind be- kannt, z. B, aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacil- lus, Lactobacillus oder Lactococcus . Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt {z.B. Bäckerhefe). Die meisten bakteriellen Produzenten sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also großtechnisch nicht ohne aufwendige und kostenintensive technische Sicherheitsmaßnahmen eingesetzt werden (dazu und zu weiteren mikro- biellen 2, 3-Butandiolproduzenten siehe Review von Celinska und Grajek, Biotechnol . Advances (2009) 27: 715-725) . Dies würde ebenso für bisher nicht beschriebene gentechnisch optimierte Produktionsstämme basierend auf diesen Stämmen gelten.
Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicher- heitsstufe" und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z.B. in „Biosafety in Microbiological and Bio- medical Laboratories", S. 9ff, (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
Herausgeber; U.S. Dept . of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010); ISBN- 10: 0160850428.
Für eine kosteneffiziente großtechnische Produktion von C4- Produkten, insbesondere 2 , 3 -Butandiol , sind Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe Sl bevorzugt. Für diese wurden jedoch bisher keine ausreichend hohen Produktausbeuten beschrieben. Bekannte 2 , 3 -Butandiol Produktionsstämme aus der biologischen Sicherheitsstufe Sl sind Stämme der Arten Raoultella terrigena, Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Paenibacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis . In der Fachliteratur (Drancourt et al . , Int. J. Syst. Evol . Microbiol. (2001), 51: 925-932) wurden verschiedene, ursprünglich der Gat- tung Klebsiella zugeordnete Bakterienspezies genetisch analysiert. Aufgrund der gefundenen Heterogenität (siehe Abb. 1 in Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925-932) wurden Stämme der ursprünglich Klebsiella terrigena benannten Art taxonomisch neu eingeordnet und innerhalb der neu geschaffenen Gattung Raoultella in die Art Raoultella terrigena umbenannt. Bakterienstämme der Arten Klebsiella terrigena und Raoultella terrigena bezeichnen somit Stämme der gleichen Art, sind aber verschieden von anderen Stämmen der Gattung Klebsiel- la.
Nur für wenige der bekannten 2 , 3-Butandiol produzierenden Stämme ist eine fermentative Herstellung aus Xylose beschrieben. Für Klebsiella pneumoniae, einem Mikroorganismus der biologi- sehen Sicherheitsstufe S2, wurde die fermentative Herstellung der C4-Produkte 2 , 3 -Butandiol und Acetoin aus den C-Quellen Xylose und Glucose verglichen (Yu and Saddler, Appl . Environ. Microbiol, (1983) 46: 630-635). Die dabei erzielten C4 - Ausbeuten betrugen 88 g/1 für Xylose als C-Quelle und 112 g/1 für Glucose als C-Quelle. Dabei war die Fermentationsdauer zur Erlangung der maximalen C4 -Ausbeute mit 6 - 8 Tagen ungewöhnlich lange, entsprechend einer vor allem für Xylose vergleichsweise niedrigen Raum-Zeitausbeute der C4 -Produkte 2 , 3-Butandiol und Acetoin von ca. 0,6 gl^h"1 (siehe Fig. 3 und 4 in Yu and Saddler, Ap l. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630-635). Mit Xylose wurden also einerseits deutlich niedrigere 2,3- Butandiolausbeuten erzielt als mit Glucose als Fermentations- rohstoff und darüberhinaus war die für die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens wichtige Raum-Zeitausbeute niedrig.
Aufgrund der Stöchiometrie der biochemischen Stoffwechselwege, Glykolyse im Falle von Glucose, Pentosphosphatweg im Falle von Xylose, beträgt die maximal erzielbare Ausbeute jeweils 0,5 g 2 , 3-Butandiol je g Glucose, bzw. Xylose {Jansen et al . , Bio- technol. Bioeng. (1984) 26: 362-369). Offensichtlich führt die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentosephosphatweg nicht so effizient zu den C4- Produkten Acetoin und 2 , 3 -Butandiol als die Verstoffwechslung von Glucose über die Glykolyse. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen verbesserten Mikroorganismenstamm zur fermentativen Herstellung von C4- Produkten zur Verfügung zu stellen, der in der Lage ist als C- Quelle bei der Fermentation Zucker zu verwerten, die in Lig- nozellulose-haltiger Biomasse vorkommen, darunter bevorzugt Xy- lose aus der darin enthaltenen Hemicellulose .
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen Mikroorganismenstamm der Gattung Raoultella, Klebsiella, Bacillus, oder Paenibacillus enthaltend ein poxB Gen, dadurch gekennzeichnet, dass das poxB Gen inaktiviert ist und es sich bei dem in Lignozellulose- haltiger Biomasse vorkommenden Zucker um eine Pentose handelt welche aus Hemicellulose gewonnen wurde.
Bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Gattung Raoultella, besonders bevorzugt um R. terrigena.
Bei den C4- Produkten handelt es sich vorzugsweise um 2,3- Butandiol oder Acetoin und besonders bevorzugt um 2,3- Butandiol .
Bei dem vorzugsweise aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnenen Zucker handelt es sich bevorzugt um Xylose ,
Im erfindungsgemäßen Stamm ist das poxB Gen vorzugsweise derart inaktiviert, dass es nicht mehr für ein Protein mit einer
Pyruvat : Ubichinon Oxidoreductase Enzymaktivität kodiert.
Das poxB Gen kodiert für das Enzym Pyruvat : Ubichinon Oxidoreductase (EC 1.2.5.1, ehemals EC 1.2.2.2), auch benannt
Pyruvatoxidase oder Pyruvatdehydrogenase . Pyruvatoxidase oxi- diert Pyruvat zu Acetat nach der Gleichung (IV) :
Pyruvat + Ubichinon (oxidiert) + H20 ->
Acetat + C02 + Ubichinon (reduziert) (IV) Es handelt sich um jedes Gen, welches für ein Enzym kodiert, das entsprechend der Gleichung (IV) Pyruvat zu Acetat oxidiert, wobei Ubichinon reduziert und ein Molekül C02 freigesetzt wird. In einer bevorzugten Ausführung stammt das poxB Gen aus einem Bakterium der Gattung Raoultella,
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das poxB Gen aus einem Stamm der Art Raoultella terrigena.
Insbesondere bevorzugt ist das poxB Gen aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, wie in SEQ ID NO : 1 offenbart, kodierend für ein Pyruvatoxidase Protein, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO : 2 offenbart.
Der erfindungsgemäße Stamm ermöglicht eine verbesserte fermen- tative Verstoffwechslung von C5- uckern besonders bevorzugt Xy- lose, zu C -Produkten, besonders bevorzugt zu 2 , 3 -Butandiol , Bakterielle Stämme mit inaktiviertem poxB Gen sind beschrieben, z.B. für E. coli (Chang and Cronan, J. Bacteriol , (1983) 154: 756-762) . Es findet sich dort allerdings keine Hinweise auf eine Eignung zur Produktion von C4- Produkten wie Acetoin und 2,3- Butandiol oder die fermentative Verwertung von C5- uckern.
Ein aktives poxB Gen, kodierend für das Enzym Pyruvat : Ubichinon Oxidoreductase (EC 1.2.5,1, ehemals EC 1.2.2.2), wirkt sich nicht grundsätzlich negativ auf die Produktion der C4- rodukte 2, 3 -Butandiol und Acetoin aus. Dies ist im 3. Beispiel (Tabelle 2) dokumentiert. Demnach wiesen poxB Mutanten von Raoultella terrigena in der Schüttelkolbenanzucht mit Glucose als C-Quelle ein vergleichbares Produktspektrum auf wie der Wildtypstamm. Aufgrund dieser Beobachtung war es für den Fachmann nicht zu erwarten, dass sich die Inaktivierung des poxB Gens vorteilhaft auf die Produktion von 2 , 3 -Butandiol oder Acetoin auswirken könnte. Daher war es überraschend, dass bei Verwendung von Xy- lose als C-Quelle poxB Mutanten deutlich mehr 2 , 3 -Butandiol und Acetoin bildeten als der Wildtypstamm, und zwar sowohl in Schüttelkolbenanzuchten (3. Beispiel, Tabelle 3) wie in der Fermentation (4. Beispiel, Tabelle 4) .
Die Inaktivierung des poxB Gens bewirkt, dass kein Pyruvat mehr über die Pyruvatoxidase Reaktion zu Acetat abgebaut wird. Dies hat zur Folge, dass einerseits mehr Pyruvat für andere Stoff - wechselwege (z.B. zur Bildung von Acetolactat, siehe Gleichung (I)) verfügbar ist. Andererseits stehen weniger Reduktionsequi- valente aus der Oxidation des Pyruvats zur Verfügung, wie z.B. für die Reduktion von Acetoin zu 2 , 3 -Butandiol (siehe Gleichung (III) ) . Auch von daher war nicht zu erwarten, dass die Inaktivierung des poxB Gens zu einer Verbesserung der 2 , 3 -Butandiol Produktion führen sollte. Wie im 3. Beispiel gezeigt, war dies auch nicht der Fall, sofern Glucose als C-Quelle verwendet wur- de. Bei Verwendung von Xylose als C-Quelle zeigte sich jedoch überraschend eine Verbesserung der C4- Produktion, insbesondere der 2 , 3 -Butandiol Produktion, sowohl in Schüttelkolben wie in der Fermentation (siehe 3. bis 5. Beispiel) , Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist die Inaktivierung des poxB Gens im erfindungsgemäßen Mikroorganismenstamm dazu geeignet, bei der Verwendung von Xylose als C- Quelle der Fermentation oder der Anzucht im Schüttelkolben die Ausbeute der C4-Produkte 2 , 3 -Butandiol und Acetoin, und davon bevorzugt 2, 3 -Butandiol, um mehr als 20 %, bevorzugt 40 % und insbesondere bevorzugt um mehr als 60 % zu steigern, wobei gleichzeitig der Anteil des Acetat Nebenprodukts um mindestens 10 %, bevorzugt 25 % und insbesondere bevorzugt um 50 % reduziert wird.
Der erfindungsgemäße Mikroorganismenstamm, auch Produktionsstamm genannt, wird vorzugsweise aus einem Ausgangsstamm hergestellt. Beim Ausgangsstamm handelt es sich um einen zur 2,3- Butandiol Produktion befähigten Wildtypstamm der genannten Gat- tungen.
Zur Inaktivierung des poxB Gens sind dem Fachmann verschiedene Methoden bekannt. Im einfachsten Fall wird der Ausgangsstamm in bekannter Weise einer Mutagenese (z.B. chemisch durch mutagen wirkende Chemikalien wie N-Methyl-N' -Nitro-N-Nitrosoguanidin oder physikalisch durch UV-Bestrahlung) unterzogen, wobei zufällig Mutationen in der genomischen DNS erzeugt werden und die gewünschte poxB Mutante dann aus der Vielzahl erzeugter Mutanten selektiert wird, z.B., jeweils nach Vereinzelung der Mutanten, durch Fehlen einer auf der Enzymaktivität basierenden Farbreaktion oder genetisch durch Nachweis eines fehlerhaften poxB Gen .
Im Gegensatz zur aufwendigen, zufälligen Mutagenese und Selektion der gesuchten poxB Mutante ist die gezielte Inaktivierung des poxB Gens durch den bekannten Mechanismus der homologen Rekombination bevorzugt. Kloniersysteme zur gezielten Geninakti- vierung mittels homologer Rekombination sind kommerziell erhältlich, wie z.B. offenbart im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", basierend auf der Red®/ET®- Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH {siehe „Technical Proto- col, Quick & Easy E , coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recom- bination, Cat . No. K006, Version 2.3, Juni 2012" und darin zitierter Literatur) ,
Dem Stand der Technik entsprechend wird das poxB Gen oder ein Teil des Gens isoliert und eine Fremd-DNS in das poxB Gen mit- tels homologer Rekombination kloniert, wodurch der das Protein definierende Leserahmen des poxB Gens unterbrochen wird. Ein für die gezielte Inaktivierung des poxB Gens geeignetes DNS- Konstrukt besteht also aus einem 5 ' -DNS-Abschnitt, der zum genomischen poxB Gen homolog ist, gefolgt von einem die Fremd-DNS umfassenden Genabschnitt und daran angeschlossen einem 31 -DNS- Abschnitt, der wiederum zum genomischen poxB Gen homolog ist.
Der für die homologe Rekombination in Frage kommende Bereich des poxB Gens umfasst dabei nicht nur den für die Pyruvatoxi- dase kodierenden Bereich. Der in Frage kommende Bereich umfasst auch das poxB Gen flankierende DNS-Sequenzen, nämlich im 5'- Bereich vor Beginn des kodierenden Bereichs {Promotor der Gentranskription) sowie im 3 * -Bereich nach dem Ende des kodieren- den Bereichs (Terminator der Gentranskription) , deren Veränderung durch homologe Rekombination ebenso wie die Veränderung des kodierenden Bereichs zur Inaktivierung des poxB Gens führen kann.
Bei der Fremd-DNS handelt es sich bevorzugt um eine Selektions- marker-Expressionskassette . Diese besteht aus einem Promoter der Gentranskription, der funktionell verbunden ist mit dem eigentlichen Selektionsmarkergen und gegebenenfalls gefolgt von einem Terminator der Gentranskription, Vorzugsweise enthält der Selektionsmarker 5l- und 34 - flankierende homologe Sequenzen des poxB Gens von jeweils mindestens 30 bp Länge, bevorzugt jeweils mindestens 50 bp Länge. Das DNS-Konstrukt zur Inaktivierung des poxB Gens besteht also, beginnend vom 5 λ -Ende, aus einer zum poxB Gen homologen Sequenz von mindestens 30 bp Länge, bevorzugt mindestens 50 bp Länge, gefolgt von der Expressionskassette des Selektionsmarkers, ausgewählt aus der Klasse der Antibiotikaresistenzgene sowie ge- folgt von einer weiteren, zum poxB Gen homologen Sequenz von mindestens 30 bp Länge, bevorzugt mindestens 50 bp Länge.
Bei den Selektionsmarkergenen handelt es sich im Allgemeinen um Gene, deren Genprodukt dem Ausgangsstamm das Wachstum unter se- lektiven Bedingungen ermöglicht, unter denen der ursprüngliche Ausgangsstamm nicht wachsen kann.
Bevorzugte Selektionsmarkergene sind ausgewählt aus der Gruppe der Antibiotika-Resistenzgene wie z.B. das Ampicillin- Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin-
Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen oder aber auch das Neomycin-Resistenzgen, Andere bevorzugte Selektionsmarkergene ermöglichen Ausgangsstämmen mit einem Stoffwechseldefekt (z.B. Aminosäureauxotrophien) das Wachstum unter selektiven Be- dingungen, indem ihre Expression den Stoffwechseldefekt korrigiert. Schließlich sind auch Selektionsmarkergene möglich, deren Genprodukt eine an sich für den Ausgangsstamm toxische Verbindung chemisch verändert und somit inaktiviert (z.B. das Gen des Enzyms Acetamidase, welches die für viele Mikroorganismen toxische Verbindung Acetamid in die ungiftigen Produkte Acetat und Ammoniak spaltet) . Unter den Selektionsmarkergenen besonders bevorzugt sind das Ampicillin-Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Ka- namycin-Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen . Insbesondere bevorzugt sind das Tetracyclin-Resistenzgen und das Ka- namycin-Resistenzgen,
Auf Basis der homologen Rekombination gibt es käuflich erwerbliche Systeme, die zusätzlich zur gezielten Geninaktivierung auch die Möglichkeit bieten, den Selektionsmarker wieder aus dem Genom zu entfernen, womit die Möglichkeit der Herstellung von Doppel- und Mehrfachmutanten gegeben ist. Ein solches System ist z.B. der käuflich erhältliche „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", basierend auf der Red®/ET®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH (siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat . No. K006, Version 2.3, Juni 2012" und darin zitierte Literatur) .
Bevorzugt ist ein Verfahren zur gezielten Geninaktivierung des poxB Gens auf Basis der Red®/ET®-Technologie ,
Bei dem Ausgangsstamm handelt es sich um einen 2 , 3-Butandiol produzierenden Stamm der Gattung Raoultella, Klebsiella, Bacillus, oder Paenibacillus . Diese Stämme sind alle käuflich erhältlich z.B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GbmH (Braunschweig) , darunter ist ebenso bei der DSMZ GmbH käuflich erhältlich der in den Beispielen verwendete Stamm Raoultella terrigena DSM 2687.
Bevorzugt handelt es sich um einen Ausgangsstamm und einen Produktionsstamm eingestuft in der Sicherheitsstufe Sl und von diesen, wiederum bevorzugt, um Stämme der Art Raoultella terri- gena.
Besonders bevorzugt ist ein Produktionsstamm, in dem das inak¬ tivierte poxB Gen aus Raoultella terrigena stammt. Der erfindungsgemäße Produktionsstamm kann darüber hinaus noch weiter optimiert werden, um die C4~Produktion noch zusätzlich zu verbessern.
Die Optimierung kann gentechnisch erfolgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Beispiele solcher Gene sind z.B. 2 , 3 -Butandiol Biosynthesegene wie Acetolactatsynthase (DE 102011003394) , Acetolactatdecarboxylase (DE 102011003383) und Acetoinreduktase (DE 102011003387) . Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Genkonstrukte oder aber auch kombiniert als eine Expressionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. So ist beispielsweise bekannt, dass in Raoultella terrigena alle drei Biosynthesegene des 2 , 3 -Butandiols (sog. BUD-Operon, Blomqvist et al . , J. Bac- teriol. (1993) 175: 1392 - 1404), bzw. in Stämmen der Gattung Bacillus die Gene der Acetolactatsynthase und der Acetolactatdecarboxylase in einem Operon organisiert sind (Renna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863 - 3875).
Der Produktionsstamm kann darüber hinaus dadurch optimiert werden, dass neben dem poxB Gen noch weitere Gene inaktiviert werden, deren Genprodukte sich negativ auf die C4 -Produktion, da- runter bevorzugt die 2 , 3-Butandiol Produktion, auswirken. Beispiele dafür sind Gene, deren Genprodukte für die Nebenproduktbildung verantwortlich sind. Dazu zählen z. B, die Lactatdehyd- rogenase (Milchsäurebildung) oder die Acetaldehyddehydrogenase (Ethanolbildung) ,
Die Erfindung betrifft ferner ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von C4- Produkten aus Zuckern, die in einer Lig- nozellulose-haltigen Biomasse vorkommen mittels eines erfindungsgemäßen Mikrorganismenstammes .
Vorzugsweise ist der Zucker ein aus Hemicellulose gewonnenener Zucker, vorzugsweise eine Pentose, besonders bevorzugt eine Xy- lose . Im erfindungsgemäßen Verfahren werden einerseits Biomasse des ProduktionsStammes und andererseits die C4- Produkte, darunter bevorzugt 2, 3-Butandiol, gebildet. Die Bildung von Biomasse und der C4 -Produkte kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormassstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmassstab) .
Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmassstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmassstab ein Fermentationsvolumen grösser 10 1 besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen grösser 300 1 insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtsmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobieilen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle) , einer Stickstoffquelle (N- Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelemen- ten, durch die das Zellwachstum und die C4 -Produktbildung, da¬ runter bevorzugt 2, 3-Butandiol, optimiert werden.
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der ProduktionsStämme sind Pentosen wie z.B. Xylose, Arabinose oder Ribose sowie Pentosen enthaltende pflanzliche Hydrolysate, die aus Lignozellulose- haltiger Biomasse wie z.B. Zuckerrohrbagasse, Getreidestroh o- der Abfällen der Mais- oder Holzverarbeitung, bzw. der darin enthaltenen Hemicellulose gewonnen werden können. Dabei kann die Hydrolyse der Lignozellulose-haltigen Biomasse dem erfin- dungsgemäßen Produktionsverfahren vorgeschaltet sein oder aber in situ während des erfindungsgemäßen Produktionsverfahrens erfolgen.
Besonders bevorzugte C-Quelle ist Xylose, entweder in isolier- ter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats .
Die im erfindungsgemäßen Produktionsverfahren eingesetzten C- Quellen umfassen somit sowohl die isolierten Reinsubstanzen als auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufgereinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydroly- sate durch thermischen, chemischen oder enzymatischen Auf- schluss (bzw. einer beliebigen Kombination dieser Aufschluss- verfahren) der pflanzlichen Rohstoffe gewonnen werden können.
Die Verwendung der bevorzugten und besonders bevorzugten C- Quellen schließt also nicht aus, dass die erfindungsgemäßen C- Quellen im Gemisch mit anderen, nicht erfindungsgemäßen C- Quellen im Anzuchtsmedium vorkommen. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker wie z, B. Glucose, Mannose oder Fructose. Die C-Quellen umfassen aber auch Disac- charide, insbesondere Saccharose, Lactose, Maltose oder Cello- biose . Weiter betroffen sind alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Maltodextrin, Stärke, Cellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse (thermisch, enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Monomere oder Oligomere. Andere mögliche von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C- Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze) , Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) oder
Pyruvat (und dessen Salze) . Es sind aber auch gasförmige C- Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmonoxid denkbar.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehört Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Am oniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N-
Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KN03, NaN03, Ammoniumnitrat, Ca(N03)2i Mg(N03)2 sowie andere N-Quellen wie z.B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Aminosäuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzex- trakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog, CSD) sowie auch NZ -Amine und Yeast Nitrogen Base, Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.
Die Anzucht kann auch erfolgen im sog, Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed) , um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C- Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen
Feedstrecken zu dosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die C -Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed- Batch Modus .
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Xylose oder Xylose enthaltende pflanzliche Hydrolysate, die aus Lignozellulose-haltigen Biomasseabfällen gewonnen werden können.
Besonders bevorzugte C-Quelle im Feed ist Xylose.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NHOH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Am- moniumphosphat , Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KN03, NaN03 und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch N -Amine und Yeast Nitrogen Base .
Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form) . Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die C -Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25 °C bis 35 °C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen {anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung) . Bevorzugt ist die aero- be Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die SauerstoffVersorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft. Die Kultivierungsdauer zur C4 - Produktion beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h. Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das C4- Produkt, darunter bevorzugt 2, 3-Butandiol, vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene C -Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet werden oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des C4- Produkts, darunter bevorzugt 2 , 3 -Butandiol , stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zentrifuga- tion, Dekantierung, Filtration, Extraktion (siehe z.B. DE
102011004915) , Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung, Diese Verfahrensschritte können dabei in, jeder beliebiger Form kombiniert werden, um das C4 -Produkt in der gewünschten Rein¬ heit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung. Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades der C4- Produkte sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massen- Spektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden .
Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide. Fig. 1 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 3,4 kb großen Vektor pKD13.
Fig. 2 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 6,3 kb großen Vektor pKD46.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert :
1. Beispiel: Herstellung von poxB Knock out Mutanten in Raoul- tella terrigena
Als Ausgangsstamm für die Genisolierung sowie für die Stammentwicklung wurde Raoultella terrigena DSM 2687 verwendet (käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorga- nismen und Zellkulturen GmbH) .
Ziel der Geninaktivierung war das poxB Gen aus R. terrigena. Die DNS-Sequenz des poxB Gens aus R. terrigena ist offenbart in SEQ ID NO:l, kodierend für ein Pyruvatoxidase Protein mit der in SEQ ID NO : 2 offenbarten Aminosäuresequenz.
Das R. terrigena poxB Gen wurde mit der aus der E. coli Molekularbiologie bekannten Red®/ET®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH inaktiviert (beschrieben im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombina- tion, Cat . No. K006, Version 2.3, Juni 2012 und darin zitierter Literatur, z.B. Datsenko and Wanner, Proc . Natl. Acad. Sei. USA 97 (2000) : 6640-6645) . Dazu wurden die Plasmide pKD13 (Fig. 1) , pKD46 (Fig. 2) , und pCP20 verwendet.
Das 3,4 kb große Plasmid pKD13 (Fig. 1) ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048744.1.
Das 6,3 kb große Plasmid pKD46 (Fig. 2) ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048746.1. Das 9,4 kb große Plasmid pCP20 ist offenbart in Cherepanov and Wackernagel, Gene 158 (1995) : 9-14.
Zur Geninaktivierung wurden die Primer pdh-2f (SEQ ID NO: 3) und pdh-3r (SEQ ID NO:4) verwendet. Zum Nachweis des poxB Gens wur- den die Primer pdh-lf (SEQ ID NO: 5) und pdh-4r (SEQ ID NO: 6) verwendet. Die Primer hatten folgende DNS -Sequenzen:
SEQ ID NO : 3 :
5' - CCGCATGGGCACCATTGCATGGATGCCGACGCGCCATGAAGAAGTTGGCGGTGTAGGCTGGAG CTGCTTC-3'
SEQ ID NO: :
5' - TGGCCAGCTCTTCCTTGGCAACCACCACATCGACCAGCACCGGGCCGTCGCCGTCGACCTGCA GTTCGAA-3 '
SEQ ID NO: 5 :
5 ' -ATGAAACAGACCGTGGCCGCATACG- 3 '
SEQ ID NO: 6:
5■ -TTACCTGAGCCAGTTGGTTTTCGCC- 3 '
Primer pdh-lf enthielt das 5Λ-Εηάε (bp 1-25 in SEQ ID NO:l), Primer pdh-4r das 3 * -Ende des poxB Gens (bp 1695-1719 in SEQ ID NO:l, in revers komplementärer Form) . Primer pdh-2f enthielt 50 bp aus dem 5" -Bereich des poxB Gens (bp 111-160 in SEQ ID NO:l) und daran angeschlossen 20 bp spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „priming site 1" in Fig. 1) . Primer pdh-3r enthielt 50 bp aus dem 3 * -Bereich des poxB Gens (bp 1551-1600 in SEQ ID NO:l, in revers komplementärer Form) und daran angeschlossen 20 bp spezifisch für das Plasmid pKD13 {bezeichnet als „priming site 2" in Fig. 1) .
Zur Inaktivierung des poxB Gens in R. terrigena durch homologe Rekombination mit dem Lambda Red System wurden, in an sich bekannter Weise (siehe z.B. „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat, No.
K006, Version 2.3, Juni 2012" der Fa. Gene Bridges GmbH), folgende Schritte durchgeführt:
R, terrigena wurde mit dem Plasmid pKD46 (sog. „Red Recombina- se" Plasmid, Fig. 2) transformiert und ein Ampicillinresistenter Klon isoliert (bezeichnet als R.t.-pKD46). Die Transformation von R. terrigena erfolgte wie in DE 102011003394 beschrieben. Ein poxB-spezifisches, zu dessen Inaktivierung geeignetes DNS- Fragment wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qi- agen) mit DNS des Plasmids pKD13 (Fig. 1) hergestellt. DNS des Plasmids pKD13 wurde verwendet, um mit den Primern pdh-2f (SEQ ID NO: 3) und pdh-3r (SEQ ID NO : 4 ) ein 1,3 kb PCR- Produkt herzu- stellen, das am 51 - und am 3 λ -Ende jeweils einen DNS-Abschnitt von 50 bp enthielt, der spezifisch für das poxB Gen aus R. terrigena war. Darüber hinaus enthielt das PCR-Produkt die Expressionskassette des in pKD13 enthaltenen Kanamycin Resistenzgens und, jeweils flankierend zum 5'- und 3 '-Ende der Kanamycin Ex- pressionskassette, sog. „FRT direct repeats11 (bezeichnet als „natural FRT site" und „distal 35 nt of natural FRT site" in Fig. 1), kurze DNS-Abschnitte, die in einem späteren Arbeitsschritt zur Entfernung des Kanamycin Antibiotikamarkers als Erkennungssequenz für die „FLP Rekombinase" (enthalten auf dem Plasmid pCP20) dienten.
Das 1,3 kb große PCR- Produkt wurde isoliert und mit der, dem Fachmann geläufigen, nur methylierte DNS schneidenden Restri- kitonsendonuclease Dpn I behandelt, um restliche pKD13 Plasmid DNS zu entfernen. Nicht-methylierte DNS aus der PCR-Reaktion wird dabei nicht abgebaut. Das 1,3 kb große, für das poxB Gen spezifische und eine Expressionskassette für das Kanamycin Resistenzgen enthaltende PCR- Produkt wurde in bekannter Weise (DE 102011003394) in R.t.- pKD46 transformiert und auf LBkan Platten bei 30°C Kanamycin- resistente Klone isoliert, LBkan Platten enthielten LB-Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl) , 1,5 % Agar und 15 mg/1 Kanamycin.
Fünf der erhaltenen Kanamycin-resistenten Klone wurden auf LBkan Platten gereinigt und in einer PCR-Reaktion überprüft, ob die Kanamycin-Resistenz Kassette korrekt im poxB Gen integriert worden war .
Die für die PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit ei- nem DNS- Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von Kanamycin-resistenten Klonen von R. terrigena DSM 2687 in LBkan- Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl, 15 mg/1 Kanamycin) gewonnen worden. Dabei diente genomische DNS des R. terrigena Wildtyp Stammes DSM 2687 als Kontrolle. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer waren pdh-lf (SEQ ID NO: 5) und pdh-4r (SEQ ID NO: 6) .
R , terrigena Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 1700 bp, wie für das intakte Gen erwartet. Die fünf Kanamycin-resistenten Klone hingegen ergaben bei der PCR- Reaktion ein DNS- Fragment von 1600 bp. In einer weiteren PCR- Reaktion wurden die Klone in einer PCR-Reaktion mit den Primern pdh-if und Kan2r (SEQ ID NO: 7) untersucht. Primer Kan2r (SEQ ID NO: 7) war abgeleitet vom Kanamycin Resis¬ tenzgen des Plasmids pKD13 (in Fig. 1 bezeichnet als „Primer Kan2r ) und hatte folgende DNS-Sequenz: SEQ ID NO: 7:
5 λ -CCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATG-31
Die kein Kanamycin Resistenzgen enthaltende R. terrigena ild- typ DNS ergab bei der PCR-Reaktion kein PCR-Produkt, wie erwartet. Die fünf Kanamycin-resistenten Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS- Fragment von 850 b . Dieses Ergebnis zeigte, dass am Genort des poxB Gens erfolgreich das Kanamycin Resistenzgen integriert werden konnte und somit das poxB Gen inaktiviert worden war. Die fünf Klone mit inaktiviertem poxB Gen erhielten die Bezeichnung R . t . ΔροχΒ : ; kan- 1 bis
R . t . ΔροχΒ : : kan-5.
Zur Eliminierung des Kanamycin Selektionsmarkers wurden die Mu~ tanten R , t . ΔροχΒ : : kan- 1 bis R. t . ΔροχΒ : : kan- 5 mit dem Plasmid pCP20 transformiert und Transformanten bei 30°C selektiert. Der 9,4 kb Vektor pCP20 ist offenbart in Cherepanov und Wackernagel, Gene 158 (1995) : 9-14. Auf dem Vektor pCP20 ist das Gen der FLP Recombinase enthalten. Die FLP Recombinase erkennt die FRT Sequenzen, welche die Expressionskassette des Kanamycin Resistenzgens flankieren und bewirkt die Entfernung der Kanamycin Expressionskassette. Dazu wurden die bei 30°C erhaltenen Klone bei 37 °C inkubiert. Unter diesen Bedingungen wurde zum einen die Expression der FLP Recombinase induziert und zum zweiten die Replikation des pCP20 Vektors unterbunden.
Das Resultat dieses Schrittes waren Klone, in denen zum einen das poxB Gen inaktiviert worden war und die zum anderen wieder sensitiv gegen Kanamycin waren (sog, „Curing" des Antibiotika Selektionsmarkers) . Die Entfernung der Kanamycin- assette aus dem Genom der ΔροχΒ Mutanten ermöglicht die Einführung weiterer Mutationen, um Doppel- oder auch Mehrfachmutanten herzustellen. Von den fünf untersuchten Mutanten R. t .ΔροχΒ: : kan-1 bis
R. t ,ΔροχΒ : : kan-5 waren nach der Behandlung mit dem pCP20 Plas- mid alle fünf Stämme Kanamycin-sensitiv, was durch plattieren auf LB- und LBkan-Platten nachgewiesen wurde. Während alle fünf Stämme auf LB-Platten wuchsen, konnte auf LBkan-Platten kein Wachstum mehr beobachtet werden, was auf die erfolgreiche Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom hindeutete.
Die Entfernung der Kanamycin-Kassette wurde zusätzlich in einer PCR-Reaktion verifiziert. Dazu wurde von den Kanamycin- sensitiven Klonen genomische DNS isoliert (Qiagen DNS- Isolierungskit) und in einer PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit den Primern pdh-lf {SEQ ID NO; 5, umfasst das 5X- Ende des poxB Gens) und pdh-4r (SEQ ID NO: 6, umfasst das 31- Ende des poxB Gens) eingesetzt. R. terrigena Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 1700 bp, wie für das intakte poxB Gen erwartet. Die fünf Kanamycin- sensitiven Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von 340 bp, was der erwarteten Größe der nach der homologen Rekombina- tion verbliebenen 5'- und 31 -Fragmente des inaktivierten poxB Gens entsprach.
Die aus diesem Schritt isolierten Stämme erhielten die Bezeichnung R.t.ApoxB-l bis R.t.ApoxB-5. Diese Stämme zeichnen sich dadurch aus, dass in ihnen das poxB Gen inaktiviert war und dass diese Stämme wieder sensitiv gegen das Antibiotikum Kanamycin waren.
2. Beispiel: Fermentation des Ausgangsstammes Raoultella terri- gena DSM 2687 mit Glucose und Xylose als C-Quelle (nicht erfindungsgemäß; Vergleichsbeispiel)
Verwendet wurden „Labfors II" Fermenter der Fa. Infors . Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 1 (3 1 Fermentervolumen) . Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des p02 und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlö- sung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fer~ mentat onsparameter Rührerdrehzahl (rpm) , Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentati¬ onsmedium pro Minute) , p02 (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100 % kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt ) , pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenter- hersteiler bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (73 % Glucose, w/v oder 75 % Xylose, w/v) wurde entsprechend dem Verbrauch an Glucose, bzw. Xylose über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei Schill & Seilacher (20-25 % v/v in Wasser verdünnt), verwendet.
Der in der Fermentation eingesetzte Stamm war Raoultella terri- gena DSM 2687 (Kontrollstamm R.t.-WT) . Baten- Fermentationsmedien waren FM2-G (C-Quelle Glucose) und FM2-X (C-Quelle Xylose) .
FM2-G Medium enthielt Glucose 40 g/1; CSD (Corn Steep Liquor getrocknet) 10 g/1; Ammoniumsulfat 5 g/1; NaCl 0,5 g/1; FeS04 x 7 H20 75 mg/1; Na3Citrat x 2 H20 1 g/1; CaCl2 x 2 H20 14,7 mg/1; MgS04 x 7 H20 0,3 g/1; KH2P04 1,5 g/1; Spurenelementemix 10 ml/1. Der pH des FM2-G Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt.
FM2-X Medium enthielt die gleiche Zusammensetzung wie FM2-G Medium. Jedoch wurde die Glucose durch Xylose (40 g/1) ersetzt.
Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H3B03 2,5 g/1; CoCl2 x 6 H20 0,7 g/1; CuS04 x 5 H20 0,25 g/1; MnCl2 x 4 H20 1,6 g/1; ZnS04 x 7 H20 0,3 g/1 und Na2Mo04 x 2 H20 0,15 g/1. Je 1,35 1 FM2-G, bzw. FM2-X Medium wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,3.
In regelmäßigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter: Die Zelldichte OD6oo als Maß der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec™ 3000} .
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert, das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Glucose-, bzw. Xylosegehalt von Fermenterproben wurde bestimmt mit dem Analysator 7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit Messstationen sowohl für Glucose wie für Xylose, Die Bestimmung des Gehalts an C4 -Produkten (2 , 3 -Butandiol und Acetoin) sowie an C2 -Produkten (Acetat und Ethanol) in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch 1H-NMR (siehe z.B. DE102011003394) . Dazu wurde jeweils ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des Kulturüberstandes mit 0,6 ml TSP (3-
(Trimethylsilyl) ropionsäure- 2 , 2 , 3 , 3 -d4 Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/1) in D20 gemischt. Die iH-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruke . Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert:
TSP : 0, 140 - - or 145 ppm (9H)
2 , 3 -Butandiol : 1, 155 - - 1, 110 ppm (6H)
Ethanol : 1, 205 - - 1, 157 ppm (3H)
Essigsäure : 2, 000 - - 1, 965 ppm (3H)
Acetoin : 2, 238 - - 2, 200 ppm (3H)
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose, bzw. Xylose ver braucht waren, wurden jeweils über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa, Watson Marlow) Feedlösungen von Glucose (73 % w/v) , bzw. Xylose (75 % w/v) zugefüttert. Die Fütterungs geschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose-, bzw. Xylose Verbrauchsrate bestimmt.
Tabelle 1 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4- Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-WT mit Glucose und Xylose als C-Quelle der Fermentation,
Tabelle 1: Produkt onsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Glucose und Xylose als C-Quelle
C-Quelle C-Quelle
Glucose Xylose
Zeit (h) Produkt (g/D (g/D
24 2, 3-BDL 72,5 44, 6
Acetoin 2,6 13,
Acetat 1,5 9,1
Ethanol 6,3 2,2
48 2 , 3-BDL 109, 7 61, 8
Acetoin 6,3 16, 0
Acetat 3,5 19, 9
Ethanol 5,3 1,7
72 2 , 3-BDL 117, 1 62 , 1
Acetoin 6,9 17,7
Acetat 3,7 23,0
Ethanol 5,4 1,6
Bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle der Fermentation anstelle von Glucose wurde eine deutliche Verschiebung des Produktspektrums beobachtet. Mit Xylose als C-Quelle wurde deutlich weniger 2 , 3-Butandiol gebildet, während sich der Anteil des zweiten C4-Produkts Acetoin (das dritte mögliche C4-Produkt Diacetyl war nicht nachweisbar) erhöhte. Jedoch war mit Xylose als C-Quelle die Raum- eitausbeute der C - Produkte 2,3- Butandiol und Acetoin nach 72 h mit 1,1 gl"1*-"1 deutlich höher als nach dem Stand der Technik bei Yu and Saddler, Ap l . En- viron. Microbiol . (1983) 46: 630-635 (ca. 0,6 gl^h"1, wie dort aus Fig, 3 und 4 entnommen) . Bei den C2- Produkten wurde eine starke Zunahme von Acetat beobachtet und eine Abnahme von Ethanol. Die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentose Phosphatweg führt offensichtlich zu ei- nem deutlich anderen Produktspektrum als die von Glucose über die Glykolyse.
3. Beispiel: Vergleichende Schüttelkolbenanzucht der R.t.ApoxB Mutanten mit Glucose (Vergleichsbeispiel) und Xylose (erfin- dungsgemäß) als C-Quelle
Ausgangsstamm war Raoultella terrigena DSM 2687 (R.t.-WT, Kontrollstamm) . Knock out Mutanten des poxB Gens wurden hergestellt wie im 1. Beispiel beschrieben. Die verwendeten Mutanten hatten die Bezeichnung R.t.ApoxB-l bis R,t,ApoxB-3.
Die Stämme wurden durch Schüttelkolbenanzucht auf Produktion der C -Produkte 2 , 3 -Butandiol und Acetoin sowie der C2-Produkte Acetat und Ethanol getestet. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2-G, bzw. FM2-X Medium beimpft und bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert.
Die Kultivierungsdauer betrug 96 h. Dabei wurden die Glucose - und Xylosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Analy- sator 7100MBS der Fa. YSI, siehe 2. Beispiel) und Glucose, bzw. Xylose bei Bedarf aus 40 % (w/v) Stocklösungen nachgefüttert. In Abständen von 24 h wurden Proben auf ihren Gehalt an C4- und C2-Produkten untersucht (siehe 2. Beispiel). Die Produktionsverläufe für die C-Quelle Glucose sind in Tabelle 2, für die C- Quelle Xylose in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 2: Produktionsverlauf in rekombinanten Raoultella terrigena Stämmen mit Glucose als C-Quelle (Vergleichsbeispiele)
Figure imgf000028_0001
Acetat 2,4 2,4 2,4 2,3
Ethanol 3,2 3,0 3,0 3,0
72 2,3-BDL 38,0 35,0 36,8 37,0
Acetoin 9,0 8 , 8 9,0 9,3
Acetat 2,8 2, 6 2,5 2,7
Ethanol 4,2 3 , 8 3,8 3,9
96 2 , 3 -BDL 48, 6 46 , 7 47, 7 46,9
Acetoin 9,8 9,6 9,7 10,1
Acetat 3,1 2,9 2,8 2,9
Ethanol 4,7 4,4 4,4 4,4
Tabelle 3 : Produktionsverlauf in rekombinanten Raoultella ter- rigena Stämmen mit Xylose als C-Quelle; (R.t. -WT : Vergleichs- beispiel; R.t, ΔροχΒ-l, R. t.ApoxB-2, R.t. ΔροχΒ - 3 erfindungsge - maß)
Figure imgf000029_0001
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, resultierte die Inaktivierung des poxB Gens in keiner signifikanten Änderung des Produktspektrums gegenüber dem R. terrigena Wildtyp Stamm R.t.-WT, sofern Glucose als C-Quelle verwendet wurde. Wurde hingegen Xylose als C-Quelle eingesetzt, konnte in den poxB Mutanten eine signifikante Verbesserung vor allem der 2,3- Butandiol Ausbeute gegenüber dem R. terrigena Wildtyp Stamm R.t.-WT beobachtet werden (Tabelle 3) . Die Steigerung der 2,3- Butandiol Ausbeute durch Inaktivierung des poxB Gens betrug 60 % oder mehr. Weiterhin konnte auch eine leichte Steigerung der Acetoin Ausbeute um 17 % beobachtet werden. Die Produktion von Acetat hingegen, wie aus der Acetat-bildenden Enzymreaktion des poxB Genprodukts erwartet, wurde um 23 % reduziert. Die Bildung von Ethanol wurde geringfügig erhöht.
Die Inaktivierung des poxB Gens in R. terrigena führt also zu einer signifikanten Ausbeutesteigerung der C4- Produkte 2,3- Butandiol und Acetoin, sofern Xylose als C-Quelle verwendet wird. Diese Beobachtung war unerwartet, da bei Verwendung von Glucose als C-Quelle keine Änderung des Produktspektrums, sowohl der C2- wie der C4~ Produkte beobachtet werden konnte.
4. Beispiel:
Produktion von C4 - und C2 -Verbindungen mit R. terrigena poxB Knock out Stämmen durch Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle
Die Fermentation wurde durchgeführt, wie im 2. Beispiel be- schrieben. In der Fermentation eingesetzte Stämme waren R.t.-WT (Kontrollstamm) und R.t.ApoxB-l. Batch-Fermentationsmedium war das im 2. Beispiel beschriebene FM2-X Medium.
1,35 1 des FM2-X Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h
Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt (siehe 2, Beispiel).
Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührer- drehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,3,
Der Xylosegehalt und der Gehalt an C4- und C2- Produkten wurden bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben. Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Xylose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. atson Marlow) eine 75 % (w/v) Xylose Feedlösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Xylose Verbrauchsrate bestimmt .
Tabelle 4 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4- Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-WT und in dem poxB Knock out Stamm R.t.ApoxB-i.
Tabelle 4 : Produktionsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle (R.t.-WT: Vergleichsbeispiel; R.t.ApoxB-l erfindungsgemäß)
Zeit Produkt R. t . -WT R . t . ΔροχΒ-1
( ) (g/D (g/D
24 2 , 3 -BDL 46,4 55, 6
Acetoin 8,0 3 , 5
Acetat 11, 9 5,5
Ethanol 3 , 2 3,1
48 2 , 3 -BDL 59, 7 77, 8
Acetoin 17, 1 15, 1
Acetat 22, 1 16,0
Ethanol 1,4 2,7
72 2 , 3 -BDL 60,6 79, 5
Acetoin 18, 9 18, 1
Acetat 29,9 22,4
Ethanol 1,9 1,8
Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (3, Beispiel) , führte bei Verwendung von Xylose als C-Quelle die Inaktiv erung des poxB Gens im Stamm R.t.ApoxB-l zu einer signifikanten Steigerung der Produktion von 2, 3-Butandiol um mehr als 30 %. Dagegen wurde die Acetatbildung stark reduziert, und zwar um 25 %. Der Gehalt der beiden anderen Produkte, Acetoin und Ethanol, blieb nahezu unverändert. 5. Beispiel: Fermentation mit der C-Quelle Xylose im 330 1 Maßstab Fermentiert wurde die aoultella terrigena Knock out Mutante R.t.ÄpoxB-l, in der das poxB Gen inaktiviert worden war.
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter: Ein Inokulum von R.t.ÄpoxB-l in LB Medium (siehe 1. Beispiel) wurde herge- stellt, indem 2 x 100 ml LB Medium, jeweils in einem 1 1 Erlen- meyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (ÜberNacht Kultur des Stammes in LB Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20 % v/v versetzt und bei -20 °C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte
OD60o/ml von 0,5 - 2,5) . 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 1 Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 1 Fermentermedium. Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-G (siehe 2. Beispiel), Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus. 2 8 1 FM2-G wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoff- partialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450 - 1.000 rpm) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD60o/ml von 30 - 40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet. Hauptfermenter : Die Fermentation wurde in einem Biostat® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 1, Kesselvolumen 500 1) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-X mit Xylose als C-Quelle (siehe 2. Beispiel), Die Fer- mentation erfolgte im sog, Fed-Batch Modus.
180 1 FM2-X wurden mit 16 1 Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH40H, bzw. 6 N H3P0 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten
Durchfluss von 1 vvm, bezogen auf das Anfangsvolumen. Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartxaldruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200 - 500 rpm) . Zur Kon- trolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Xy- loseverbrauch durch off-line Xylose-Messung mit einem Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 2. Beispiel) . Sobald die Xy- losekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/1 betrug (8 - 10 h nach Inokulation) , wurde die Zudosierung einer 75% w/v Xylose Feedlösung gestartet. Die Flußrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Xylosekonzent- ration von 10 - 20 g/1 eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 295 1.
Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 2. Beispiel beschrieben. Der Produktionsverlauf ist in Tabelle 4 dargestellt , Tabelle 4
Produktion von 2,3-BDL durch Fed-Batch Fermentation im 330 1 Maßstab
Zeit Produkt R . t . ΔροχΒ- 1
(h) (g/D 2 , 3 "BDL 55,4
Acetoin 8,4
Acetat 7,3
Ethanol 3 , 0
2, 3 -BDL 64,2
Acetoin 15 , 0
Acetat 11,3
Ethanol 2,4
2, 3 -BDL 76, 3
Acetoin 20,7
Acetat 23,2
Ethanol 1,6

Claims

Paten anSprüche
1. Mikroorganismenstatnm zur fermentativen Herstellung von C4 Produkten der in der Lage ist als C-Quelle bei einer Fermentation Zucker zu verwerten, die in Lignozellulose- haltiger Biomasse vorkommen, der Gattung Raoultella, Kle- besiella, Bacillus oder Paenibacillus enthaltend ein poxB Gen dadurch gekennzeichnet, dass das poxB Gen inaktiviert ist und es sich bei dem in Lignozellulose-haltiger Biomas se vorkommenden Zucker um eine Pentose handelt welche aus Hemicellulose gewonnen wurde,
2. Mikroorganismenstamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeich net, dass es sich um einen Stamm der Gattung Raoultella, besonders bevorzugt um R. terrigena handelt.
3. Mikroorganismenstamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den C -Produkten um 2,3- Butandiol oder Acetoin handelt.
4. Mikroorganismenstamm gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Pentose um Xylose handelt
5. Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten aus Zuckern, die in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommen mittels eines Mikrorganismenstammes dadurch gekenn zeichnet, dass der Mikrorganimenstamm ein Mikroorganismen stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 ist,
6. Verfahren gemäß Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass der Zucker eine aus Hemicellulose gewonnener Zucker, vorzugsweise eine Pentose, besonders bevorzugt eine Xylose ist .
7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6 dadurch gekennzeichnet, dass es in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und bei ei- ner Temperatur von 20 °C bis 40°C unter aeroben Bedingungen über einen Zeitraum von 10 bis 100 h durchgeführt wird.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164281A (zh) * 2017-07-03 2017-09-15 中国石油大学(华东) 一株芽孢杆菌及其在制备13c标记的乙偶姻中的应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102013216658A1 (de) 2013-08-22 2015-02-26 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme
DE102013223176A1 (de) 2013-11-14 2015-05-21 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme
CN111849806B (zh) * 2020-06-28 2022-03-22 中国科学院南海海洋研究所 一株海草根际促生固氮菌nxt28及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002002778A1 (en) * 2000-07-04 2002-01-10 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the mdha gene from corynebacterium glutamicum
WO2002036797A2 (en) * 2000-11-04 2002-05-10 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
US20060040368A1 (en) * 2004-08-09 2006-02-23 Ka-Yiu San Aerobic succinate production in bacteria

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010001399A1 (de) 2010-01-29 2011-08-04 Wacker Chemie AG, 81737 Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren mit 1-3 Kohlenstoff-atomen aus nachwachsenden Rohstoffen
DE102011003387A1 (de) 2011-01-31 2012-08-02 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol
DE102011003394A1 (de) 2011-01-31 2012-08-02 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol
DE102011003383A1 (de) 2011-01-31 2012-08-02 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol
DE102011004915A1 (de) 2011-03-01 2012-09-06 Wacker Chemie Ag Verfahren zur Extraktion von 2,3-Butandiol aus einer wässrigen Mischung

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002002778A1 (en) * 2000-07-04 2002-01-10 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the mdha gene from corynebacterium glutamicum
WO2002036797A2 (en) * 2000-11-04 2002-05-10 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
US20060040368A1 (en) * 2004-08-09 2006-02-23 Ka-Yiu San Aerobic succinate production in bacteria

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164281A (zh) * 2017-07-03 2017-09-15 中国石油大学(华东) 一株芽孢杆菌及其在制备13c标记的乙偶姻中的应用
CN107164281B (zh) * 2017-07-03 2020-06-23 中国石油大学(华东) 一株芽孢杆菌及其在制备13c标记的乙偶姻中的应用

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