WO2014161723A1 - Mikroorganismenstamm und verfahren zur fermentativen herstellung von c4-verbindungen aus c5-zuckern - Google Patents

Mikroorganismenstamm und verfahren zur fermentativen herstellung von c4-verbindungen aus c5-zuckern Download PDF

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WO2014161723A1
WO2014161723A1 PCT/EP2014/055615 EP2014055615W WO2014161723A1 WO 2014161723 A1 WO2014161723 A1 WO 2014161723A1 EP 2014055615 W EP2014055615 W EP 2014055615W WO 2014161723 A1 WO2014161723 A1 WO 2014161723A1
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WO
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strain
production
transketolase
xylose
transaldolase
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PCT/EP2014/055615
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English (en)
French (fr)
Inventor
Rupert Pfaller
Original Assignee
Wacker Chemie Ag
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones

Definitions

  • the invention relates to a microorganism strain and a process for the fermentative production of C4 compounds from C5 sugars (pentoses).
  • Examples of chemical precursors (so-called chemical synthesis building blocks or platform chemicals) from renewable raw materials are ethanol (C2 building block), glycerol, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, lactic acid, 3-hydroxypropionic acid (C3 building blocks ) or succinic acid, 1-butanol, 2-butanol, 1,4-butanediol, acetoin, diacetyl or also 2,3-butanediol (C4 building blocks).
  • These chemical building blocks are the biogenic starting compounds from which further basic chemicals can be produced chemically. The prerequisite for this is the cost-effective fermentative production of the respective synthesis building blocks from renewable raw materials.
  • Decisive cost factors include the availability of suitable cheaper renewable raw materials as well as efficient microbial fermentation processes, which efficiently convert these raw materials into the desired chemical raw material. It is crucial for the economy of these fermentative processes that the microorganisms used can efficiently convert the cheapest available raw materials into the desired product.
  • a C4 building block accessible by fermentation is 2,3-butanediol.
  • the state of the art for fermentative 2,3-butanediol production is summarized in Celinska and Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725 and in Ji et al., Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351-364).
  • 3-butanediol biosynthetic pathway see equations (I) to (III)
  • 2, 3-butanediol further compounds with four carbon atoms fermentatively accessible, namely acetoin and derived by oxidation and diacetyl.
  • 2,3-butanediol, acetoin and diacetyl are therefore also referred to collectively below as C4 products.
  • 2, 3-Butanediol is a possible starting material for petrochemical products with four carbon atoms (C4 building blocks) such as acetoin, diacetyl, 1, 3-butadiene, 2-butanone (methyl ethyl ketone, MEK).
  • C4 building blocks such as acetoin, diacetyl, 1, 3-butadiene, 2-butanone (methyl ethyl ketone, MEK).
  • products with two carbon atoms (C2 units) such as acetic acid (US2012288908 AA) and derived therefrom, acetaldehyde, ethanol and also ethylene are available.
  • C8 compounds are also conceivable, the use of e.g. as a fuel in the aviation sector.
  • the prior art discloses processes for preparing 2,3-butanediol based mainly on the use of glucose as a fermentation raw material (C source) (see for example WO 12104234 A1).
  • C source a fermentation raw material
  • 3-butanediol and also other C4 and C2 platform chemicals such as acetoin, ethanol and acetic acid economically, i. competitive with production from petrochemical raw materials
  • glucose is not the preferred fermentation raw material.
  • Glucose is one of the basic products in the food industry (mainly made of starch, sugar cane or sugar beet) and is now increasingly used for bioethanol production. The resulting increase in demand is expected to lead to a steady increase in the price of glucose.
  • fermentation raw material is one of the cost-determining factors in the production of biogenic platform chemicals, an increasing number of alternatives are being sought. Since large-scale fermentation processes based on glucose as the fermentation raw material represent an unwanted competition to its use as food, there are also important socio-politically motivated reasons for the search for alternative fermentation raw materials.
  • Lignocellulosic biomass consists of the three main components cellulose, hemicellulose and lignin.
  • the focus in the utilization of lignocellulose is the recovery of glucose from cellulose, especially for the fermentative production of bioethanol.
  • the recovery of glucose from cellulose is a relatively expensive and expensive process that currently can not compete with conventional production from food plants.
  • Hemicellulose is, after cellulose, the most abundant naturally occurring polysaccharide (Saha, J. Ind., Microbiol., Biotechnol. (2003) 30: 279-291) and therefore of great interest as a source of sugar for fermentation.
  • the sugars contained in hemicellulose are comparatively easy to access, especially the most abundant xylose and also arabinose.
  • Various methods of extracting sugars from hemicellulose are known to those skilled in the art, including those based on hydrolysis of hemicellulose hydrothermally, thermally at acidic pH, or enzymatically with xylanases (Saha, J. Ind., Microbiol., Biotechnol., (2003) 30 : 279-291).
  • Xylose mainly D-xylose, CAS number 58-86-6
  • the major constituent of hemicellulose is one of the most abundant naturally occurring carbohydrates.
  • Xylose is in itself a waste which finds only limited use in the food industry (eg for the production of the sweetener xylitol, Saha, J. Ind., Microbiol.Biotechnol. (2003) 30: 279-291) and due to lack of metabolism of xylose by the also not suitable for the production of bioethanol on an industrial scale. These factors, cheap and abundant raw material, comparatively simple isolation and low demand for alternative utilization make xylose an attractive fermentation raw material in the production of biogenic plates.
  • Formal chemicals especially in the fermentative production of C4 products 2, 3-butanediol or acetoin, and in particular in the use of the fermentatively produced 2,3-butanediol or acetoin for the production of acetic acid by gas phase oxidation.
  • 2,3-butanediol Various natural producers of 2,3-butanediol are known, e.g. B. from the genera Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Lactococcus, etc. But also yeasts are known as producers (for example baker's yeast).
  • biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories page 9ff. (Table 1), Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
  • the fermentation time to obtain the maximum C4 yield was 6-8 days unusually long, corresponding to a particularly for xylose comparatively low space-time yield of C4 products 2, 3-butanediol and acetoin of about 0.6 gl h 1 (see Figures 3 and 4 in Yu and Saddler, Appl. Environ.Microbiol. (1983) 46: 630-635).
  • significantly lower 2,3-butanediol yields were achieved with xylose than with glucose as fermentation raw material and, moreover, the space-time yield important to the economics of the process was low.
  • US7998722 discloses recombinant strains of the genera Zymomonas and Zymobacter with improved xylose utilization.
  • the improved xylose utilization is achieved primarily by expression of a gene encoding a xylose isomerase.
  • the xylose utilization is further improved.
  • the thus optimized strains can be used for the production of the C2 compound ethanol from xylose.
  • Gene constructs are disclosed which, above all, improve the expression of xylose isomerase and thereby lead to improved xylose utilization.
  • US7998722 discloses that in strains of the genera Zymomomonas and Zymobacter, at least four genes, including the genes of transketolase and transaldolase, must be overexpressed in order to improve xylose utilization and to use such strains for ethanol production, the production of C4 products is not addressed.
  • the object has been achieved by a production strain which can be produced from an initial strain, characterized in that the parent strain is a naturally suitable wild-type strain capable of 2,3-butanediol production and the production strain at the same time an increased expression of a gene coding for a transketolase compared to the starting strain (EC 2.2.1.1) and a gene coding for a transaldolase (EC 2.2.1.2).
  • a distinction is made between a parent strain and a production strain.
  • the parent strain is a wild-type strain naturally capable of 2,3-butanediol production.
  • Such wild-type strains are disclosed, for example, in Celinska and Grajek, Biotechol. Advances (2009) 27: 715-725 (see Chapter 4, "Microorganisms").
  • a production strain in the sense of the present invention is thus understood to be an optimized starting strain with respect to the 2,3-butanediol production, which is characterized by an increased expression of the genes coding for the enzymes transketolase and transaldolase compared to the starting strain.
  • the production strain is preferably prepared from the parent strain.
  • Preferred starting strains are microorganism strains selected from the genera Raoultella, Klebsiella, Bacillus, Paenibacillus, Serratia or Lactobacillus.
  • Particularly preferred starting strains are microorganism strains selected from the genus Raoultella or Klebsiella, particularly preferably Raoultella terrigena. These strains are commercially available, e.g. at the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GbmH (38124 Bhoffnschweig, Inhoffen No 7B). This also applies to the strain Raoultella terrigena DSM 2687 used in the examples, which is a particularly preferred starting strain.
  • the C4 products are preferably 2,3-
  • the sugars obtained from lignocellulose-containing biomass and the hemicellulose isolable therefrom are preferably pentoses (C5-sugars) and particularly preferably xylose.
  • Transketolase (EC 2.2.1.1) and transaldolase (EC 2.2.1.2) are both enzymes from the non-oxidative part of the pentosephosphate pathway. Among other things, they are involved in the metabolism of D-xylose. D-xylose is first converted to D-xylulose-5-phosphate by the enzymes xylose isomerase and xylulokinase. Starting from D-xylulose-5-phosphate then takes place the further metabolism, in addition to the enzymes ribulose-5-phosphate epimerase and ribose-5-phosphate isomerase also
  • transketolase and transaldolase (Tal gene) are genes that code for enzymes of the enzyme classes EC 2.2.1.1 (transketolase) and EC 2.2.1.2 (transaldolase) and according to the equations (VI ), (VII) and (VIII) are involved in the metabolism of D-xylose to fructose-6-phosphate and glyceraldehyde-3-phosphate.
  • the overexpressed genes of transketolase and transaldolase may be either homologous or heterologous genes. Preferably, it is homologous genes.
  • transketolase As disclosed in Examples 4 and 6, the sole expression of either a transketolase or a transaldolase is not sufficient to increase the yield of C4 products. An improvement in the yield of C4 products is only achieved by simultaneous overexpression of a transketolase and transaldonase.
  • the Tkt gene (transketolase) and the Tal gene (transaldolase) are derived from a bacterium of the genus Raoultella.
  • the Tkt gene (transketolase) and the Tal gene (transaldolase) are derived from a strain of the species Raoultella terrigena.
  • the Tkt gene (transketolase) and the Tal gene (transaldolase) from the strain Raoultella terrigena DSM 2687 are particularly preferred.
  • the Tkt gene has the SEQ ID NO: 1 and encodes a transketolase protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2
  • Tal gene has SEQ ID NO: 3 and encodes a transaldolase protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 4. Simultaneous overexpression of transketolase and
  • Transaldolase genes result in production strains with increased enzyme activities of transketolase and transaldolase, as described in Example 3. Strains are preferred in which the simultaneous overexpression of transketolase and
  • Transaldolase genes the enzyme activity of transketolase and transaldolase each increased by at least a factor of 2, preferably by at least a factor of 5, more preferably by at least a factor of 10 and more preferably by at least a factor of 20 compared to the enzyme activity in the parent strain.
  • the simultaneous overexpression of the genes of a transketolase and a transaldolase in the production strain according to the invention is suitable when using xylose as the C source of the fermentation or in the shake flask, the yield of C4 products 2,3-butanediol and acetoin, and preferably 2,3-butanediol, by more than 20%, preferably 40% and more preferably more than 60% in comparison to increase the starting strain.
  • the proportion of by-product acetate in the fermentation decreases by at least 30%, preferably by at least 60%, and more preferably by 80%, compared to the starting strain.
  • the increase in the expression of the transketolase and transaldolase genes in the production strain can be caused by any mutation in the genome of the parent strain (for example, the promoter activity-increasing mutations) or by the simultaneous overexpression of homologous or even heterologous transketolase and transaldolase genes in the parent strain.
  • the parent strain is a wild-type strain naturally capable of 2,3-butanediol production (as summarized in, for example, Celinska and Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725, Chapter 4, "Microorganisms”) may already have been optimized elsewhere in relation to the 2,3-butanediol production
  • the expression of the transketolase and the transaldolase is not affected by the optimization by a wild type strain optimized by a genetic engineering.
  • the increase in the expression of the transketolase and transaldolase genes in the production strain can be caused by any mutation in the genome of the parent strain (for example the promoter activity-increasing mutations) or by simultaneous overexpression of homologous or else heterologous transketolase and transaldolase genes in the starting strain.
  • the production strain according to the invention is preferably prepared by introducing a gene construct into one of the said parent strains.
  • the gene construct consists of the structural genes coding for a transketolase and a transaldolase, which are operatively linked and preceded by a promoter.
  • the gene construct may also comprise a terminator, which is connected downstream of the transketolase or transaldolase structural gene.
  • a strong promoter which leads to a strong transcription.
  • Preferred among the strong promoters is the "Tac promoter" familiar to the person skilled in the art from the molecular biology of E. coli.
  • transketolase and transaldolase can also be arranged together in a gene construct in a so-called operon form (construct pTkt-Tal, see FIG. 6).
  • the gene construct can be present in a manner known per se in the form of an autonomously replicating plasmid, it being possible for the copy number of the plasmid to vary.
  • the skilled person is a variety of Plasmids are known which can replicate autonomously depending on their genetic structure in a given production strain.
  • the gene construct can also be integrated in the genome of the production strain, with each gene locus along the genome being suitable as an integration site.
  • the gene construct is introduced in a manner known per se by genetic transformation into the production strain.
  • Various methods of genetic transformation are known to the person skilled in the art (Aune and Aachmann, Appl. Microbiol. Biotechol. (2010) 85: 1301-1313), including, for example, the
  • the gene construct contains, likewise in a known manner, a selection marker for the selection of transformants with the desired gene construct.
  • Known selection markers are selected from antibiotic resistance markers or from the auxotrophy complementing selection markers.
  • antibiotic resistance markers particularly preferably those which confer resistance to antibiotics selected from ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol, neomycin or zeocin.
  • antibiotic resistance markers conferring resistance to the antibiotics ampicillin and tetracycline.
  • the production strain according to the invention simultaneously contains the gene constructs of a transketolase and a transaldolase, either as individual constructs in a two-plasmid system or in a single-plasmid system.
  • the trans-tolase and transaldolase gene constructs can be arranged separately or in operon structure (see Example 1 and FIG. 6, plasmid pTkt-valley). at Separate arrangement, the transcription of the two genes is carried out in each case by its own promoter, in an operon structure, both genes are transcribed together by a promoter.
  • transketolase and transaldolase gene constructs must contain different selection markers, preferably different antibiotic resistance markers to select for strains which simultaneously contain the transketolase and transaldolase gene constructs.
  • a production strain according to the invention simultaneously contains the transketolase and transaldolase gene constructs, either as individual constructs or in operon form. These constructs are present in the production strain, either in plasmid form or integrated into the genome, and at the same time produce a transketolase enzyme and a transbalase enzyme, each in recombinant form.
  • the plasmid form is preferred.
  • the recombinant transketolase and transaldolase enzymes are able to convert C-5 sugars, preferably xylose, into C6 and C3 compounds via the pentose phosphate route and to infect the glycolysis pathway. It has now surprisingly been found that by simultaneous recombinant expression of the transketolase and transaldolase enzymes in the production strain, the yield of C4 products, in particular 2,3-butanediol, can be significantly increased compared to the starting strain.
  • the invention further relates to a fermentative process for the production of C4 products from C5-uckern.
  • the method is characterized in that a production strain according to the invention is cultivated in a growth medium.
  • biomass of the production strain and, on the other hand, the C4 products, including preferably 2,3-butanediol, are formed.
  • the formation of biomass and the C4 Products can be time correlated or temporally decoupled from each other.
  • the cultivation takes place in a manner familiar to the person skilled in the art. This can be done in shake flasks (laboratory scale) or by fermentation (production scale).
  • Cultivation media are familiar to the person skilled in the art of microbial cultivation. They typically consist of a carbon source (C source), a nitrogen source (N source) and additives such as vitamins, salts and trace elements, through which cell growth and C4 product formation, including preferably 2,3-butanediol, are optimized.
  • C source carbon source
  • N source nitrogen source
  • additives such as vitamins, salts and trace elements
  • Preferred C sources for growing the production strains are pentoses such as e.g. Xylose, arabinose, or ribose, as well as pentose-containing vegetable hydrolysates derived from lignocellulosic biomass such as e.g. Sugar cane bagasse, cereal straw or waste of maize or wood processing, or the hemicellulose contained therein can be obtained.
  • the hydrolysis of the lignocellulose-containing biomass can be connected upstream of the production process according to the invention or else take place in situ during the production process according to the invention.
  • Particularly preferred C source is xylose, either in isolated form or as part of a vegetable hydrolyzate.
  • C sources which are suitable for the production process according to the invention thus comprise both the isolated pure substances and, to increase the economic efficiency, not further purified mixtures of the individual C sources, such as those obtained as hydrolyzates by thermal, chemical or enzymatic digestion of the vegetable raw materials can be.
  • the use of the preferred and particularly preferred C sources thus does not exclude that the C sources according to the invention occur in admixture with other non-inventive C sources in the growth medium.
  • These include all forms of monosaccharides, including C6 sugars such as. As glucose, mannose or fructose.
  • the C sources also include disaccharides, in particular sucrose, lactose, maltose or cellobiosis.
  • C sources in the form of higher saccharides, glycosides or carbohydrates with more than two sugar units such.
  • maltodextrin, starch, cellulose, pectin or by hydrolysis (enzymatically or chemically) released monomers or oligomers As maltodextrin, starch, cellulose, pectin or by hydrolysis (enzymatically or chemically) released monomers or oligomers.
  • N sources are those that can be used by the production strain for biomass production. These include ammonia, gaseous or in aqueous solution as NH 4 OH or else its salts such. For example, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate or ammonium nitrate. Furthermore, suitable N-source are the known nitrate salts such. B. KN0 3 , NaN0 3 , ammonium nitrate, Ca (N0 3 ) 2 , Mg (N0 3 ) 2 and other N-sources such as urea.
  • the N sources also include complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or dried as so-called CSD) as well as NZ amines and Yeast Nitrogen Base.
  • complex amino acid mixtures such as yeast extract, proteose peptone, malt extract, soy peptone, casamino acids, corn steep liquor (corn steep liquor, liquid or dried as so-called CSD) as well as NZ amines and Yeast Nitrogen Base.
  • the cultivation can take place in the so-called batch mode, wherein the growth medium is inoculated with a starter culture of the production strain and then the cell growth takes place without further feeding of nutrient sources.
  • Cultivation can also take place in the so-called fed-batch mode, with additional nutrient sources being fed in after an initial phase of growth in batch mode (feed) in order to compensate for their consumption.
  • the feed can consist of the C-source, the N-source, one or more vitamins or trace elements, or a combination nation of the aforementioned.
  • the feed components can be used together as a mixture or else separately
  • Feed lines are added.
  • other media components as well as additives that specifically increase the C4 production can also be added to the feed.
  • the feed can be fed continuously or in portions (batchwise) or else in a combination of continuous and discontinuous feed. Preference is given to the cultivation according to the fed-batch mode.
  • Preferred C sources in the feed are xylose or xylose-containing plant hydrolysates which can be obtained from lignocellulosic biomass waste.
  • Particularly preferred C source in the feed is xylose.
  • N sources in the feed are ammonia, gaseous or in aqueous solution as NHOH and its salts ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium acetate and ammonium chloride, furthermore urea, KN0 3 , NaN0 3 and ammonium nitrate, yeast extract, proteose peptone, malt extract, soya peptone, casamino acids, corn steep liquor (Corn Steep Liquor) as well as N -Amine and Yeast Nitrogen Base.
  • Particularly preferred N sources in the feed are ammonia, or ammonium salts, urea, yeast extract, soya peptone, malt extract or corn steep liquor (in liquid or in dried form).
  • the cultivation takes place under pH and temperature conditions which favor the growth and the 2,3-BDL production of the production strain.
  • the suitable pH range is from pH 5 to pH 8.
  • Preferred is a pH range of pH 5.5 to pH 7.5.
  • Particularly preferred is a pH range of pH 6.0 to pH 7.
  • the preferred temperature range for the growth of the production onsstammes is 20 ° C to 40 ° C.
  • Particularly preferred is the temperature range of 25 ° C to 35 ° C.
  • the growth of the production strain can optionally take place without oxygen supply (anaerobic cultivation) or else with oxygen supply (aerobic cultivation).
  • Preference is given to aerobic cultivation with oxygen, the oxygen supply being ensured by introduction of compressed air or pure oxygen.
  • Particularly preferred is the aerobic cultivation by entry of compressed air.
  • the cultivation time for C4 production is between 10 h and 200 h. Preferred is a cultivation period of 20 h to 120 h. Particularly preferred is a cultivation time of 30 h to 100 h.
  • Cultivation batches obtained by the method described above contain the C4 product, including preferably 2,3-butanediol, preferably in the culture supernatant.
  • the C4 product contained in the cultivation mixtures can either be used directly further without further processing or else be isolated from the cultivation mixture.
  • known process steps are available, including centrifugation, decantation, filtration, extraction (see, for example, DE
  • FIG. 1 shows the 2.9 kb expansion vector pKKj used in Example 1.
  • Fig. 2 shows the 5 kb produced in Example 1
  • FIG. 4 shows the 4.3 kb transaldolase expression vector pTal-tet prepared in Example 1.
  • Fig. 5 shows the 3.3 kb expansion vector pKKj-tet used in Example 1.
  • Fig. 6 shows the 6 kb large expansion vector pTkt-valley prepared in Example 1 for the g. timely expression of transketolase and transaldola; e gene.
  • Raoultella (Klebsiella) terrigena DSM 2687 (commercially available from the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) was used as a starting strain for gene isolation and strain development.
  • transketolase and transaldolase genes from R. terrigena were used.
  • the DNA sequences of the genes from R. terrigena are disclosed in SEQ ID NO: 1 (tansketolase), coding for a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, and in SEQ ID NO: 3 (transaldolase), coding for a protein with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4.
  • Transketolase (Tkt gene) and transaldolase (Tal gene) genes were isolated in PCR reactions (Taq DNA polymerase, Qiagen) from genomic R. terrigena DNA (strain DSM 2687,).
  • the genomic DNA used for the PCR reactions was previously isolated in a manner known per se with a DNA isolation kit (Qi agen) from cells of the cultivation of R. terrigena DSM 2687 in LB medium (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 NaCl).
  • transketolase (Tkt gene): primers Tkt-lf (SEQ ID NO: 5) and Tkt-2r (SEQ ID NO: 6)
  • the primers had the following DNA sequences: SEQ ID NO: 5:
  • Transaldolase (Tal gene): primer Tal-lf (SEQ ID NO: 7) and Tal-2r (SEQ ID NO: 8)
  • the primers had the following DNA sequences:
  • the tansketolase gene was isolated in the PCR reaction as a 2100 bp DNA fragment.
  • the Tkt PCR product was post-digested with Mfe I (contained in primer Tkt-lf, compatible with Eco RI) and Hind III (contained in primer Tkt-2r).
  • Expression vector pKKj is disclosed in
  • pKKj is a derivative of the expression vector pKK223-3.
  • the DNA sequence of pKK223-3 is disclosed in the "GenBank" gene database under accession number M77749.1 Approximately 1.7 kb were removed from the 4.6 kb plasmid (bp 262-1947 of the DNA disclosed in M77749.1 Sequence), resulting in the 2.9 kb expression vector pKKj ( Figure 1).
  • Transketolase gene is functionally linked to the tac promoter and is suitable for expression of the transketolase gene in R. terrigena.
  • the Tanzaldolase gene was isolated in the PCR reaction as a 950 bp DNA fragment.
  • the valley PCR product with Eco RI (contained in primer Tal-lf) and Pst I (contained in primer Tal-2r) was digested.
  • the result was the 3.8 kb vector pTal (FIG. 3), in which the transaldolase gene is functionally linked to the tac promoter and which is suitable for expressing the transaldolase gene in R. terrigena.
  • the post-digested with Eco RI and Pst I 950 bp PCR product of the transaldolase gene was additionally cloned into the previously cut with Eco RI and Pst I expression vector pKKj-tet. This resulted in the 4.3 kb expression vector pTal-tet (FIG. 4).
  • pKKj-tet is disclosed in DE102011003386.
  • the ampicillin resistance gene was first removed from pKKj as a 1 kb fragment by digestion with Ex HI. In the remaining 1.9 kb vector fragment, the tetracycline resistance gene was cloned as a 1.45 kb fragment.
  • the expression vector pTal was digested with Eco RI and the 3.8 kb linearized vector fragment isolated.
  • the Tkt gene fragment was, as described in the expression vector pTkt, in a PCR reaction from genomic R. terrigena DNA with the primers Tkt-lf (SEQ ID NO: 5) and Tkt-3r (SEQ ID NO: 9) as 2.1 kb fragment isolated.
  • Primer Tkt-3r also contained a ribosome binding site (RBS, see FIG. 6) for the production of the .beta. I interface (compatible with Eco RI for subsequent cloning into the vector pTal) and the 3 'end of the Tkt gene in the vector pTkt valley subsequent valley gene (so-called artificial operon).
  • Primer Tkt-3r (SEQ ID NO: 9) had the following DNA sequence:
  • the transketolase and the transaldolase gene are arranged as an artificial operon. Their expression is under the control of the tac promoter.
  • Example 2 Comparative fermentation of the starting strain Raoultella (Klebsiella) terrigena DSM 2687 with glucose and xylose as C source
  • Feed medium (73% glucose, w / v or 75% xylose, w / v) was metered in according to the consumption of glucose or xylose via a peristaltic pump.
  • an alkoxylated fatty acid ester on a tetrabilizable basis commercially available under the name Struktol J673 from Schill & Seilacher (20-25% v / v diluted in water) was used.
  • the strain used in the fermentation was Raoultella
  • FM2-G medium contained glucose 40 g / L; CSD (Corn Steep Liquor dried) 10 g / l; Ammonium sulfate 5 g / l; NaCl 0.5 g / l; FeS0 4 x 7 H 2 O 75 mg / l; Na 3 citrate x 2 H 2 0 1 g / l; CaCl 2 ⁇ 2 H 2 O 14.7 mg / 1; MgS0 4 x 7 H 2 0 0.3 g / l; KH 2 P0 4 1.5 g / l; Trace element mix 10 ml / 1.
  • the pH of the FM2-G medium was adjusted to 6.0 before starting the culture.
  • FM2-X medium contained the same composition as FM2-G medium. However, glucose was replaced by xylose (40 g / L).
  • the trace element mix had the composition H 3 B0 3 2.5 g / l; CoCl 2 x 6 H 2 O 0.7 g / l; CuSO 4 ⁇ 5 H 2 O 0.25 g / l; MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O 1.6 g / l; ZnS0 4 x 7 H 2 0 0.3 g / l and Na 2 Mo0 4 x 2 H 2 0 0.15 g / l.
  • 1.35 1 FM2-G or FM2-X medium were inoculated with 150 ml preculture.
  • the preculture of the strains to be fermented was prepared by 24 h shake flask growing in glucose containing FM2-G medium. The fermentation conditions were: temperature 30 ° C., stirrer speed 1000 rpm, aeration with 1 vvm, pH 6.3.
  • the fermenter was sampled periodically to analyze the following parameters:
  • the cell density OD 600 as a measure of the biomass formed was determined photometrically at 600 nm (BioRad photometer SmartSpec TM 3000). To determine the dry biomass, 1 ml of fermentation batch was centrifuged per measurement point in a triple determination, the cell pellet was washed with water and dried at 80 ° C. to constant weight. The glucose or xylose content of fermenter samples was determined using the analyzer 7100MBS from YSI equipped with measuring stations for both glucose and xylose.
  • feed solutions of glucose (73% w / v) or xylose (75% w / v) were each pumped (Watson Marlow peristaltic pump 101 U / R). v) fed.
  • the feeding rate was determined by the current glucose or xylose consumption rate.
  • Table 1 shows the time dependent formation of C2 and C4 products in R. terrigena control strain R.t. WT with glucose and xylose as C source of fermentation.
  • R. t. pTkt valley transketolase transaldolase operon construct
  • R. t. -pTkt-pTal In the trunk R. t. pTkt-pTal was a two-plasmid system for the simultaneous expression of transketolase and transaldolase in a strain obtained by transformation of R. terrigena with the vectors pTkt (ampicillin selection) and pTal-tet (tetracycline selection).
  • Transformants were isolated and the recombinant expression of the Tkt and Tal genes by Schatbelkolbenanzucht was examined by on the one hand the respective enzyme activity and on the other hand the production of C4 products 2, 3-butanediol and acetoin and the C2 products acetate and ethanol was determined.
  • the media contained as selective antibiotics either ampicillin (FM2-G-amp, or FM2-X-amp) or tetracycline (FM2-G-tet, or FM2-X-tet), and ampicillin and tetracycline ( FM2-G-tet + amp, or FM2-X-tet + amp).
  • FM2-G medium and FM2-X medium are described in Example 2.
  • the media contained ampicillin (200 mg / l, FM2-G-amp and FM2-X-amp), tetracycline (15 mg / l, FM2-G-tet and FM2-X-tet), and both antibiotics together (FM2-G-tet + amp and FM2 -X-tet + amp).
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
  • the remaining cells of the shake flask cultures (approximately 50 ml volume) were used in a second experiment to determine the enzyme activities of the recombinantly expressed transketolase and transaldolase compared to the control strain.
  • the determination of the enzyme activities of the transketolase and transaldolase was carried out according to the prior art (Josephson and Fraenkel, J. Bacteriol. (1969) 100: 1289-1295).
  • the transketolase enzyme assay is based on equation (VI), in which D-xylulose-5-phosphate and D-ribose-5-phosphate form one of the reaction products glyceraldehyde-3-phosphate.
  • Glycerol aldehyde-3-phosphate is converted to dihydroxyacetone phosphate by the enzyme triosephosphate isomerase contained in the test, which is finally reduced by the enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase likewise contained in the test with stoichiometric consumption of NADH.
  • the transaldolase enzyme assay is based on the reverse reaction of equation (VII), in which glyceraldehyde-3-phosphate is formed from fructose-6-phosphate and erythrose-4-phosphate as one of the reaction products. Glyceraldehyde-3-phosphate is converted by the enzyme Triosephosphatisomerase contained in the test to dihydroxyacetone phosphate, which is finally reduced by the enzyme also contained in the test glycerol-3-phosphate dehydrogenase with stoichiometric consumption of NADH.
  • Spectrophotometric determination of the transketolase activity The measurement batch of 1 ml volume for the photometric determination of the transketolase activity (components of the enzyme assay all from Sigma-Aldrich) was composed of Tris buffer, 0.5 mM ribose-5-phosphate, 0.5 mM xylulose-5-phosphate, 0.2 mM NADH and 10 g of an enzyme mixture consisting of ⁇ -glycerol-3-phosphate dehydrogenase and triosephosphate isomerase (Sigma-Aldrich) and transketolase-containing cell extract. Measuring temperature was 25 ° C.
  • a unit transketolase activity is defined as the consumption of 1 ⁇ NADH / min under assay conditions.
  • Spectrophotometric determination of transaldolase activity The measurement batch of 1 ml volume for the photometric determination of transaldolase activity (components of the enzyme assay all from Sigma-Aldrich) was composed of Tris buffer, 0.3 mM erythrose-4-phosphate, 0.4 mM fructose-6-phosphate, 0.2 mM NADH and 10 ⁇ g of an enzyme mixture consisting of ⁇ -glycerol-3-phosphate dehydrogenase and triosephosphate isomerase (Sigma-Aldrich) and transaldolase-containing cell extract. Measurement temperature was 25 ° C.
  • a unit transaldolase activity is defined as the consumption of 1 pmol NADH / min under test conditions.
  • the protein concentration of the cell extracts was determined in a manner known per se using the so-called “BioRad protein assay” from BioRad.
  • the transketolase activity in recombinant R. terrigena strains is increased by a factor of 24.5-27.2 by overexpression, the transaldolase activity activity in recombinant R. terrigena strains by a factor of 18, 9-24, 5.
  • Example 4 Comparative Schuttel piston culture of recombinant R. terrigena strains with glucose and xylose as C source
  • Table 6 Production process of the recombinant Raoultella terrigena strains R.t.-pKKj and R. t. -Pkt-valley with glucose, or xylose as C source
  • the FM2-X-amp medium was inoculated with 150 ml preculture.
  • the preculture of the strains to be fermented was prepared by 24 h shake flask cultivation in glucose-containing FM2-G-amp (see Example 2).
  • the fermentation conditions were: temperature 30 ° C, stirrer speed 1000 rpm, aeration with 1 vvm, pH 6.3.
  • Transketolase or transaldolase
  • the yield of 2,3-butanediol or other products could not be significantly improved.
  • the product yield in the transaldolase overexpressing strain R.t. pTal was rather reduced.
  • the fed-batch fermentation of the strains R. t. pTkt-pTal and Rt-pTkt valley with xylose as C source was performed as described in Example 6.
  • the control strain used was Rt-pKKj.
  • the preparation of the recombinant strains used was described in Example 3.
  • Preculture (FM2-G-tet + amp) and batch medium (FM2-X-tet + amp) in the fermentation of the strain R transformed with the two plasmids pTkt and pTal-tet. t. pTkt-pTal contained both ampicillin and tetracycline (see 3rd example).
  • Table 8 shows the time-dependent formation of C2 and C4 products in the R. terrigena control strain R.t. pKKj and in the recombinant, transketolase and transaldolase overproducing Raoultella terrigena strains R. t. -pTkt-pTal and R. t. -Pkt valley.
  • the strains according to the invention were characterized. t. pTkt-pTal and R. t. pTkt valley in which both the transketolase and transaldolase gene were overexpressed fermentation with xylose as C source by significantly improved C4 production. It was, especially with respect to 2, 3-butanediol, the increase over the control strain Rt-pKKj for the strain R. t. ptkt valley 54% and for the strain R. t. -Pkt-pTal 80%.
  • the space yield for the C4 products (sum of 2,3-butanediol and acetoin) was also significantly improved, namely (after 72 h of fermentation) of 1.09 ⁇ g / lf 1 for the control strain Rt- pKKj to 1.49 ⁇ g / h "1 for strain R, t -pTkt-pTal and 1.46 ⁇ g / h " 1 for strain R. t. -Pkt valley.
  • the strains according to the invention are distinguished not only by markedly improved C4 productivity over the control strain Rt-pkkj, but are also significantly improved over that of Yu and Saddler, Ap. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630-635 disclosed prior art (about 0.6 gl _1 h _1 , as taken there from Figs. 3 and 4).
  • Table 8 thus shows that the spectrum of C4 and C2 production is due to the simultaneous overexpression of the transketolase and transaldolase genes in the strains Rt-pTkt-pTal and R. t. ptkt valley, whereby the proportion of 2,3-butanediol in the total production (sum of the C2 and C4 products) from 52.7% for the control strain Rt-pKKj to 86% for the strain R. t. -pTkt-pTal, or 70.6% for the strain Rt-pTkt-Tal increased.
  • the production strains according to the invention are thus characterized not only by an overall higher C4 production, but also by a higher proportion of 2,3-butanediol in the total amount of C2 and C4 compounds produced (selectivity).
  • This surprising shift of the product spectrum in favor of 2,3-butanediol in the fermentation of xylose is unexpected, since on the one hand the respective overexpression of tansketolase and transaldolase alone had no influence on the 2,3-butanediol production (6th example) and after the prior art for other microorganisms (US7998722 and US8034591) at least two additional genes had to be overexpressed in order to improve the xylose utilization in these strains and to increase the production of ethanol.
  • transketolase and transaldolase are two enzymes of the pentose phosphate pathway, which are involved in the metabolism of the C source xylose and of which a direct effect on the biosynthesis of 2,3-butanediol was not expected .
  • the starting point of 2, 3-butanediol biosynthesis is pyruvate, the end product of glycolysis. Pyruvate is also the starting material for the other products acetoin, acetate and ethanol, so any conceivable direct influence of transketolase and transaldolase overexpression on the availability of pyruvate would also have affected the production of these compounds.
  • strain Raoultella terrigena R.t.-pTkt-pTal which contained both the transketolase expression vector pTkt and the transaldolase expression vector pTal-tet, was fermented (see Examples 3 and 7).
  • an inoculum of Rt -pTkt -pTal in LBtet + amp medium (LB medium, which additionally contained 15 mg / l tetracycline and 200 mg / l ampicillin). de prepared by adding 2 ⁇ 100 ml LBtet + amp medium, each in a 1 1 Erlenmeyer flask, each containing 0.25 ml of a glycerol culture (overnight culture of the strain in LBtet + amp medium, with glycerol in a final concentration of 20 % v / v and stored at -20 ° C) were inoculated.
  • LB medium which additionally contained 15 mg / l tetracycline and 200 mg / l ampicillin
  • the cultivation was carried out for 7 h at 30 ° C and 120 rpm on an infus orbital shaker (cell density OO 600 / ml of 0.5 - 2.5). 100 ml of the preculture were used to inoculate 8 liters of fermentation medium. Inoculated were two Vorfermenter with 8 1 fermenter medium.
  • Prefermenters The fermentation was performed three fermenters the company Sartorius BBI Systems GmbH in two Biostat ® C-DCU. Fermentation medium was FM2-G-tet + amp (see 3rd example). The fermentation took place in the so-called batch mode.
  • Main fermenter The fermentation was carried out in a Biostat® D 500 fermenter (working volume 330 l, boiler volume 500 l) from Sartorius BBI Systems GmbH. Fermentation medium was FM2-X-tet + amp with xylose as C source (see 3rd example). The fermentation took place in the so-called fed-batch mode. 180 l of FM2-Tet + amp were inoculated with 16 l of inoculum. Fermentation temperature was 30 ° C. pH of the fermentation was 6.3 and was kept constant with the correction agents 25% NH 4 OH, or 6 NH 3 P0 4 . The ventilation was carried out with compressed air at a constant Flow of 1 vvm, based on the initial volume.
  • the oxygen partial pressure pO 2 was adjusted to 50% saturation.
  • the regulation of the oxygen partial pressure was carried out via the stirring speed (stirrer speed 200-500 rpm).
  • Struktol J673 (20-25% v / v in water) was used.
  • the xylose consumption was determined by off-line xylose measurement with an analyzer from YSI (see Example 2).
  • the metered addition of a 75% w / v xylose feed solution was started.
  • the flow rate of the feed was chosen so that a xylose concentration of 10 - 20 g / 1 could be maintained during the production phase.
  • the volume in the fermenter was 300 1.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Produktionsstamm zur fermentativen Herstellung von C4 -Produkten der in der Lage ist als C-Quelle bei der Fermentation aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnene Zucker zu verwerten, herstellbar aus einem Ausgangsstamm, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ein natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigter Wildtypstamm ist und der Produktionsstamm gleichzeitig eine im Vergleich zum Ausgangsstamm verstärkte Expression eines Gens kodierend für eine Transketolase (EC 2.2.1.1) und eines Gens kodierend für eine Transaldolase (EC 2.2.1.2) aufweist.

Description

Mikroorganismenstamm und Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern
Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm und ein Ver- fahren zur fermentativen Herstellung von C4 -Verbindungen aus C5-Zuckern (Pentosen) .
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstellungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthese- bausteine oder auch Plattformchemikalien genannt) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2-Baustein) , Glycerin, 1,3- Propandiol, 1, 2-Propandiol, Milchsäure, 3 -Hydroxypropionsäure (C3 -Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2-Butanol, 1,4- Butandiol, Acetoin, Diacetyl oder auch 2 , 3 -Butandiol (C4- Bausteine) . Diese chemischen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits effiziente mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Für die Wirtschaftlichkeit dieser fermentativen Verfahren ist dabei entscheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen die billigsten verfügbaren Rohstoffe effizient in das gewünschte Produkt umsetzen können.
Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4 -Baustein (C4- Plattformchemikalie) ist 2 , 3 -Butandiol . Der Stand der Technik zur fermentativen 2 , 3 -Butandiol Herstellung ist zusammengefasst in Celinska und Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725 und in Ji et al . , Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351-364) . Aus dem mikrobiellen 2 , 3 -Butandiol Biosyntheseweg (siehe Gleichungen (I) bis (III)) sind neben 2 , 3 -Butandiol noch weitere Verbindungen mit vier C-Atomen fermentativ zugänglich, nämlich Acetoin und davon durch Oxidation abgeleitet auch Diacetyl . 2 , 3 -Butandiol , Acetoin und Diacetyl werden daher im Folgenden zusammenfassend auch als C4 -Produkte bezeichnet.
2 , 3 -Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen (C4 -Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1, 3-Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, MEK) . Außerdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2 -Bausteine) wie Essigsäure (US2012288908 AA) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2 , 3-Butandiol sind auch C8 -Verbindungen denkbar, die Verwendung z.B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosynthetische Weg zu 2 , 3 -Butandiol ist bekannt (siehe Reviews von Ce- linska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715-725 und Ji et al., Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351-364) und führt vom zentralen StoffWechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2 , 3 -Butandiol : Reaktion der Acetolactatsynthase : Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von C02.
Figure imgf000003_0001
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase : Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
(II)
Figure imgf000003_0002
Reaktion der Acetoinreduktase (2 , 3 -Butandioldehydrogenase] NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2 , 3 -Butandiol .
Figure imgf000004_0001
Der Stand der Technik offenbart Verfahren zur Herstellung von 2 , 3 -Butandiol, die hauptsächlich auf der Verwendung von Glucose als Fermentationsrohstoff (C-Quelle) beruhen (siehe z.B. WO 12104234 AI) . Um 2 , 3 -Butandiol und auch andere C4- und C2- Plattformchemikalien wie Acetoin, Ethanol und Essigsäure wirt- schaftlich, d.h. konkurrenzfähig zur Produktion aus petrochemi- schen Rohstoffen, herstellen zu können, ist Glucose nicht der bevorzugte Fermentationsrohstoff. Glucose ist eines der Basisprodukte in der Nahrungsmittelindustrie (vor allem hergestellt aus Stärke, Zuckerrohr oder Zuckerrübe) und wird mittlerweile auch verstärkt zur Bioethanol Herstellung eingesetzt. Bei der dadurch hervorgerufenen steigenden Nachfrage ist mit einer stetigen Verteuerung des Rohstoffs Glucose zu rechnen. Da der Fermentationsrohstoff einer der kostenbestimmenden Faktoren bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien ist, wird ver- stärkt nach Alternativen gesucht. Da großtechnische, auf Glucose als Fermentationsrohstoff beruhende Fermentationsverfahren eine unerwünschte Konkurrenz zu dessen Verwendung als Nahrungsmittel darstellen, gibt es auch gewichtige sozialpolitisch motivierte Gründe für die Suche nach alternativen Fermentations- rohstoffen.
Unter den alternativen Fermentationsrohstoffen fällt lignozel- lulosehaltiger Biomasse eine zentrale Bedeutung zu. Sie fällt in der Land- oder Forstwirtschaft als Stroh, Bagasse oder als Abfall der Holzverarbeitung in großen Mengen ohne entsprechende Verwertungsmöglichkeiten an. Entsprechend gibt es große Anstrengungen, wertsteigernde Verwendungsmöglichkeiten für Bestandteile der Lignozellulose zu finden. Lignozellulosehaltige Biomasse besteht aus den drei Hauptkomponenten Cellulose, Hemicellulose und Lignin. Schwerpunkt bei der Verwertung von Lignozellulose ist die Gewinnung von Glucose aus Cellulose, v.a. zur fermentativen Gewinnung von Bioethanol . Die Gewinnung von Glucose aus Cellulose ist ein vergleichsweise aufwendiger und teurer Prozess, der gegenwärtig mit der konventionellen Herstellung aus Nahrungsmittelpflanzen nicht konkurrieren kann.
Hemicellulose ist nach der Cellulose das am häufigsten in der Natur vorkommende Polysaccharid (Saha, J. Ind. Microbiol . Bio- technol. (2003) 30:279-291) und daher als Quelle zur Gewinnung von Zucker für die Fermentation von großem Interesse.
Vergleichsweise einfach zugänglich sind die in der Hemicellulose enthaltenen Zucker, darunter vor allem die am häufigsten vorkommende Xylose und auch Arabinose. Verschiedene Verfahren der Extraktion von Zuckern aus Hemicellulose sind dem Fachmann bekannt, darunter solche, die auf hydrothermal, thermisch bei saurem pH oder enzymatisch mit Xylanasen durchgeführter Hydrolyse der Hemicellulose beruhen (Saha, J. Ind. Microbiol. Bio- technol. (2003) 30:279-291). Xylose (vor allem D-Xylose, CAS Nummer 58-86-6) als Hauptbestandteil der Hemicellulose ist eines der am häufigsten in der Natur vorkommenden Kohlenhydrate. Xylose ist an sich ein Abfallstoff, der nur begrenzt Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie findet (z.B. zur Herstellung des Süßstoffes Xylitol, Saha, J. Ind. Microbiol. Biotechnol . (2003) 30:279-291) und wegen fehlender Verstoffwechslung der Xylose durch die industriell eingesetzten Fermentationshefen auch nicht zur Herstellung von Bioethanol im großtechnischen Maßstab geeignet ist. Diese Faktoren, billiger und in großen Mengen verfügbarer Rohstoff, vergleichsweise einfache Isolierung und geringe Nachfrage nach alternativer Verwertung machen Xylose zu einem attraktiven Fermentationsrohstoff bei der Herstellung biogener Platt- formchemikalien, besonders bei der fermentativen Herstellung der C4-Produkte 2 , 3 -Butandiol oder Acetoin und hier insbesondere bei der Verwendung des fermentativ hergestellten 2,3- Butandiols oder Acetoins zur Gewinnung von Essigsäure durch Gasphasenoxidation .
Verschiedene natürliche Produzenten von 2 , 3 -Butandiol sind bekannt, z. B. aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacil- lus , Lactobacillus , Lactococcus etc. Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt (z.B. Bäckerhefe) .
Die meisten bakteriellen Produzenten sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also großtechnisch nicht ohne aufwendige und kostenintensive technische Sicherheitsmaßnahmen eingesetzt werden (dazu und zu weiteren mikro- biellen 2 , 3 -Butandiolproduzenten siehe Review von Celinska und Grajek, Biotechnol . Advances (2009) 27: 715-725). Dies würde ebenso für bisher nicht beschriebene gentechnisch optimierte Produktionsstamme basierend auf diesen Stämmen gelten.
Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicherheitsstufe" und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z.B. in „Biosafety in Microbiological and Bio- medical Laboratories", S. 9ff. (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) (Editor), Public Health Service (U.S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor),
Herausgeber: U.S. Dept . of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010) ; ISBN- 10: 0160850428.
Für eine kosteneffiziente großtechnische Produktion von C4- Produkten, insbesondere 2 , 3 -Butandiol , sind Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe Sl bevorzugt. Für diese wur- den jedoch bisher keine ausreichend hohen Produktausbeuten beschrieben. Bekannte 2 , 3 -Butandiol ProduktionsStämme aus der biologischen Sicherheitsstufe Sl sind Stämme der Art Raoultella terrigena oder Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Paenibacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis . In der Fachliteratur (Drancourt et al . , Int. J. Syst. Evol . Microbiol. (2001) , 51: 925-932) wurden verschiedene, ursprünglich der Gattung Klebsiella zugeordnete Bakterienspezies genetisch analy- siert. Aufgrund der gefundenen Heterogenität (siehe Abb. 1 in Drancourt et al . , Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001) , 51: 925-932) wurden Stämme der ursprünglich Klebsiella terrigena benannten Art taxonomisch neu eingeordnet und innerhalb der neu geschaffenen Gattung Raoultella in die Art Raoultella terrigena umbenannt, Bakterienstämme der Arten Klebsiella terrigena und Raoultella terrigena bezeichnen somit Stämme der gleichen Art, sind aber verschieden von anderen Stämmen der Gattung Klebsiella.
Nur für wenige der bekannten 2 , 3 -Butandiol produzierenden Stämme ist eine fermentative Herstellung aus Xylose beschrieben. Für Klebsiella pneumoniae, einem Mikroorganismus der biologischen Sicherheitsstufe 32, wurde die fermentative Herstellung der C4-Produkte 2 , 3 -Butandiol und Acetoin aus den C-Quellen Xylose und Glucose verglichen (Yu and Saddler, Appl . Environ. Microbiol. (1983) 46: 630-635) . Die dabei erzielten C4- Ausbeuten betrugen 88 g/1 für Xylose als C-Quelle und 112 g/1 für Glucose als C-Quelle. Dabei war die Fermentationsdauer zur Erlangung der maximalen C4 -Ausbeute mit 6 - 8 Tagen ungewöhnlich lange, entsprechend einer vor allem für Xylose vergleichsweise niedrigen Raum-Zeitausbeute der C4 -Produkte 2 , 3 -Butandiol und Acetoin von ca. 0,6 gl^h"1 (siehe Fig. 3 und 4 in Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630-635) . Mit Xylose wurden also einerseits deutlich niedrigere 2,3- Butandiolausbeuten erzielt als mit Glucose als Fermentations- rohstoff und darüber hinaus war die für die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens wichtige Raum- Zeitausbeute niedrig.
Aufgrund der Stöchiometrie der biochemischen Stoffwechselwege , Glykolyse im Falle von Glucose, Pentosephosphatweg im Falle von Xylose, beträgt die maximal erzielbare Ausbeute jeweils 0,5 g 2 , 3 -Butandiol je g Glucose, bzw. Xylose (Jansen et al . , Bio- technol . Bioeng. (1984) 26: 362-369) . Offensichtlich führt die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentosephosphatweg nicht so effizient zu den C4-Produkten Acetoin und 2 , 3 -Butandiol als die Verstoffwechslung von Glucose über die Glykolyse . US7998722 offenbart rekombinante Stämme der Gattungen Zymomonas und Zymobacter mit verbesserter Xylose Verwertung. Die verbesserte Xylose Verwertung wird primär erreicht durch Expression eines Gens codierend eine Xyloseisomerase . Durch zusätzliche Expression der Gene einer Xylulokinase , sowie der Gene für eine Transketolase und eine Transaldolase wird die Xylose Verwertung weiter verbessert. Die so optimierten Stämme können für die Produktion der C2 -Verbindung Ethanol aus Xylose verwendet werden. Offenbart werden Genkonstrukte , die vor allem die Expression der Xyloseisomerase verbessern und dadurch zu einer ver- besserten Xylose Verwertung führen. US7998722 offenbart, dass in Stämmen der Gattungen Zymomomonas und Zymobacter mindestens vier Gene, darunter die Gene der Transketolase und Transaldolase, überexprimiert werden müssen, um die Xylose Verwertung zu verbessern und solche Stämme für die Ethanolproduktion zu ver- wenden, die Produktion von C4-Produkten wird nicht angesprochen .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Produktions- stamm zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten zur Verfü- gung zu stellen, der in der Lage ist als C-Quelle bei der Fermentation aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnene Zucker zu verwerten.
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen Produktionsstamm der aus einem Ausgangsstamm herstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ein natürlicherweise zur 2,3- Butandiolproduktion befähigter Wildtypstamm ist und der Produktionsstamm gleichzeitig eine im Vergleich zum Ausgangsstamm verstärkte Expression eines Gens kodierend für eine Transketo- läse (EC 2.2.1.1) und eines Gens kodierend für eine Transaldolase (EC 2.2.1.2) aufweist. In der vorliegenden Erfindung wird unterschieden zwischen einem Ausgangsstamm und einem Produktionsstamm. Beim Ausgangsstamm handelt es sich um einen natürlicherweise zur 2,3- Butandiolproduktion befähigten Wildtypstamm. Solche Wild- typstämme sind z.B. offenbart in Celinska und Grajek, Biotech- nol. Advances (2009) 27: 715-725 (siehe Kapitel 4, „Microorga- nisms") .
Unter einem Produktionsstamm im Sinne der vorliegenden Erfin- dung ist somit ein bezüglich der 2 , 3 -Butandiolproduktion optimierter Ausgangsstamm zu verstehen, der durch eine im Vergleich zum Ausgangsstamm verstärkte Expression der für die Enzyme Transketolase und Transaldolase kodierenden Gene gekennzeichnet ist. Der Produktionsstamm wird vorzugsweise aus dem Ausgangs- stamm hergestellt.
Bevorzugte AusgangsStämme sind Mikroorganismenstämme ausgewählt aus der Gattung Raoultella, Klebsiella, Bacillus, Paenibacil- lus, Serratia oder Lactobacillus .
Besonders bevorzugte AusgangsStämme sind Mikroorganismenstämme ausgewählt aus der Gattung Raoultella oder Klebsiella, insbesondere bevorzugt Raoultella terrigena. Diese Stämme sind käuflich erhältlich z.B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikro- Organismen und Zellkulturen GbmH (38124 Bräunschweig, Inhoffen- straße 7B) . Dies gilt auch für den in den Beispielen verwendeten Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, welcher ein insbesondere bevorzugter Ausgangsstamm ist. Bei den C4-Produkten handelt es sich vorzugsweise um 2,3-
Butandiol, Acetoin oder Diacetyl, bevorzugt um 2 , 3 -Butandiol oder Acetoin und besonders bevorzugt um 2 , 3 -Butandiol .
Bei den aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnenen Zuckern handelt es sich bevorzugt um Pentosen (C5-Zucker) und insbesondere bevorzugt um Xylose . Transketolase (EC 2.2.1.1) und Transaldolase (EC 2.2.1.2) sind beides Enzyme aus dem nicht-oxidativen Teil des Pentosephos- phatwegs . Sie sind unter anderem beteiligt an der Verstoff- wechslung von D-Xylose. D-Xylose wird zuerst durch die Enzyme Xyloseisomerase und Xylulokinase zu D-Xylulose-5-Phosphat umgewandelt. Von D-Xylulose- 5 -Phosphat ausgehend erfolgt dann die weitere Verstoffwechslung, an der neben den Enzymen Ribulose-5- Phosphat Epimerase und Ribose-5 -Phosphat Isomerase auch
Transketolase und Transaldolase beteiligt sind. Es laufen fol- gende, in den Gleichungen (IV) bis (VIII) geschilderte Reaktionen ab.
Ribulose- 5 -Phosphat Epimerase:
D-Xylulose-5-Phosphat -> D-Ribulose-5-Phosphat (IV)
Ribose- 5-Phosphat Isomerase:
D-Ribulose-5-Phosphat -> D-Ribose-5-Phosphat (V)
Transketolase :
D-Xylulose- 5 -Phosphat + D-Ribose-5-Phosphat ->
D-Seduheptulose-7-Phosphat + Glycerinaldehyd- 3 -Phosphat
(VI)
Transaldolase :
D-Seduheptulose-7-Phosphat + Glycerinaldehyd-3 -Phosphat ->
Fructose- 6-Phosphat + Erythrose- -Phosphat
(VII)
Transketolase :
Erythrose-4 -Phosphat + D-Xylulose-5-Phosphat ->
Fructose- 6-Phosphat + Glycerinaldehyd-3 -Phosphat
(VIII)
In Summe entstehen bei der Transketolase und Transaldolase be- inhaltenden Reaktionssequenz also aus drei Molekülen D-Xylose (C5-Zucker) zwei Moleküle Fructose- 6 -Phosphat (C6-Zucker) und ein Molekül Glyerinaldehyd- 3 -Phosphat (C3 -Verbindung) , beides Zwischenstufen der Glykolyse und somit dem zentralen Stoffwechsel verfügbar.
Bei den gleichzeitig überexprimierten Genen der Transketolase (Tkt Gen) und Transaldolase (Tal Gen) handelt es sich um Gene, die für Enzyme der Enyzmklassen EC 2.2.1.1 (Transketolase) und EC 2.2.1.2 (Transaldolase) kodieren und entsprechend der Gleichungen (VI) , (VII) und (VIII) an der Verstoffwechslung von D- Xylose zu Fructose- 6 -Phosphat und Glycerinaldehyd-3 -Phosphat beteiligt sind. Dabei kann es sich bei den überexprimierten Genen der Transketolase und Transaldolase entweder um homologe oder heterologe Gene handeln. Bevorzugt handelt es sich um homologe Gene . Wie im 4. und 6. Beispiel offenbart, ist die alleinige Expression entweder einer Transketolase noch einer Transaldolase nicht ausreichend, um die Ausbeute an C4-Produkten zu erhöhen. Eine Verbesserung der Ausbeute an C4-Produkten wird erst durch gleichzeitige Überexpression einer Transketolase und Transaldo- läse erreicht.
In einer bevorzugten Ausführung stammen das Tkt Gen (Transketolase) und das Tal Gen (Transaldolase) aus einem Bakterium der Gattung Raoultella.
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammen das Tkt Gen (Transketolase) und das Tal Gen (Transaldolase) aus einem Stamm der Art Raoultella terrigena. Insbesondere bevorzugt sind das Tkt Gen (Transketolase) und das Tal Gen (Transaldolase) aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687. Das Tkt Gen hat die SEQ ID NO: 1 und kodiert für ein Transketolase Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2. Das Tal Gen hat die SEQ ID NO : 3 und kodiert für ein Transaldolase Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4. Die gleichzeitige Überexpression der Transketolase- und
Transaldolasegene führt zu Produktionsstammen mit erhöhten Enzymaktivitäten der Transketolase und Transaldolase , wie im 3. Beispiel beschrieben. Dabei sind Stämme bevorzugt, bei denen die gleichzeitige Überexpression der Transketolase- und
Transaldolasegene die Enzymaktivität der Transketolase und Transaldolase jeweils um mindestens den Faktor 2, bevorzugt um mindestens den Faktor 5, besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 20 im Vergleich zur Enzymaktivität im Ausgangsstamm erhöht.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt (5. und 7. Beispiel), ist die gleichzeitige Überexpression der Gene einer Transketolase und einer Transaldolase im erfindungsgemä- ßen Produktionsstamm dazu geeignet, bei der Verwendung von Xy- lose als C-Quelle der Fermentation oder der Anzucht im Schüttelkolben die Ausbeute der C4-Produkte 2 , 3 -Butandiol und Aceto- in, und davon bevorzugt 2 , 3 -Butandiol , um mehr als 20 %, bevorzugt 40 % und insbesondere bevorzugt um mehr als 60 % im Ver- gleich zum Ausgangsstamm zu steigern. Gleichzeitig verringert sich in der Fermentation der Anteil des Nebenprodukts Acetat um mindestens 30 %, bevorzugt um mindestens 60 % und besonders bevorzugt um 80 % im Vergleich zum Ausgangsstamm . Die Erhöhung der Expression der Transketolase- und Transaldolasegene im Produktionsstamm kann dabei hervorgerufen sein durch eine beliebige Mutation im Genom des Ausgangsstammes (z.B. die Promotoraktivitäten steigernde Mutationen) oder durch gleichzeitige Überexpression homologer oder aber auch heterologer Transketolase- und Transaldolasegene im Ausgangsstamm .
Bevorzugt ist die gleichzeitige Überexpression homologer oder heterologer Transketolase- und Transaldolasegene im Ausgangsstamm .
Insbesondere bevorzugt ist die gleichzeitige Überexpression homologer Transketolase- und Transaldolasegene im Ausgangsstamm . Beim Ausgangsstamm handelt es sich um einen natürlicherweise zur 2 , 3 -Butandiol Produktion befähigten Wildtypstamm (wie z.B. zusammengefasst in Celinska und Grajek, Biotechnol . Advances (2009) 27: 715-725, Kapitel 4, „Microorganisms " ) , der darüber- hinaus bereits anderweitig in Bezug auf die 2 , 3 -Butandiol Produktion optimiert worden sein kann. Bei einem bereits z.B.
durch einen gentechnischen Eingriff optimierten Wildtypstamm ist die Expression der Transketolase und der Transaldolase jedoch nicht von der Optimierung betroffen.
Die Erhöhung der Expression der Transketolase- und Transaldola- segene im Produktionsstamm kann dabei hervorgerufen sein durch eine beliebige Mutation im Genom des Ausgangsstammes (z.B. die Promotoraktivitäten steigernde Mutationen) oder durch gleich- zeitige Überexpression homologer oder aber auch heterologer Transketolase- und Transaldolasegene im Ausgangsstamm.
Der erfindungsgemäße Produktionsstamm wird vorzugsweise hergestellt durch Einbringen eines Genkonstrukts in einen der ge- nannten Ausgangsstämme.
Das Genkonstrukt besteht in seiner einfachsten Form aus den für eine Transketolase und eine Transaldolase kodierenden Strukturgenen, denen operativ verbunden, ein Promotor vorgeschaltet ist. Gegebenenfalls kann das Genkonstrukt auch einen Terminator umfassen, der dem Transketolase, bzw. Transaldolase Strukturgen nachgeschaltet ist. Bevorzugt ist ein starker Promotor, der zu einer starken Transkription führt. Unter den starken Promotoren bevorzugt ist der dem Fachmann aus der Molekularbiologie von E. coli geläufige „Tac-Promotor" .
Die Strukturgene der Transketolase und Transaldolase können in sog. Operonform auch zusammen in einem Genkonstrukt angeordnet sein (Konstrukt pTkt-Tal, siehe Fig. 6) .
Das Genkonstrukt kann in an sich bekannter Weise in Form eines autonom replizierenden Plasmids vorliegen, wobei die Kopienzahl des Plasmids variieren kann. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Plasmiden bekannt, die abhängig von ihrer genetischen Struktur in einem gegebenen Produktionsstamm in autonomer Form replizieren können . Das Genkonstrukt kann jedoch auch im Genom des Produktionsstam- mes integriert sein, wobei jeder Genort entlang des Genoms als Integrationsort geeignet ist.
Das Genkonstrukt , wird in an sich bekannter Weise durch geneti- sehe Transformation in den Produktionsstamm eingebracht. Verschiedene Methoden der genetischen Transformation sind dem Fachmann bekannt (Aune and Aachmann, Appl . Microbiol . Biotech- nol . (2010) 85: 1301 - 1313), darunter beispielsweise die
Elektroporation .
Zur Selektion transformierter ProduktionsStämme enthält das Genkonstrukt, ebenfalls in bekannter Weise, einen Selektions- marker zur Auswahl von Transformanten mit dem gewünschten Genkonstrukt. Bekannte Selektionsmarker sind ausgewählt aus Anti- biotika-Resistenzmarkern oder aus den eine Auxotrophie komplementierenden Selektionsmarkern .
Bevorzugt sind Antibiotika-Resistenzmarker, besonders bevorzugt solche, die Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt aus Ampicil- lin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol , Neomycin oder Ze- ocin verleihen.
Insbesondere bevorzugt sind Antibiotika-Resistenzmarker, die Resistenz gegen die Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin ver- leihen.
In der vorliegenden Erfindung enthält der erfindungsgemäße Produktionsstamm gleichzeitig die Genkonstrukte einer Transketola- se und einer Transaldolase , entweder als Einzelkonstrukte in einem Zweiplasmidsystem oder in einem Einplasmidsystem . Dabei können in einem Einplasmidsystem die Genkonstrukte der Transke- tolase und Transaldolase getrennt oder in Operonstruktur (siehe 1. Beispiel und Fig. 6, Plasmid pTkt-Tal) angeordnet sein. Bei getrennter Anordnung erfolgt die Transkription der beiden Gene jeweils von einem eigenen Promotor, bei einer Operonstruktur werden beide Gene zusammen von einem Promotor transkribiert. Dem Fachmann ist geläufig, dass in einem Zweiplasmidsystem die Transketolase und Transaldolase Genkonstrukte unterschiedliche Selektionsmarker enthalten müssen, bevorzugt unterschiedliche Antibiotika-Resistenzmarker, um Stämme zu selektieren, die gleichzeitig die Transketolase und Transaldolase Genkonstrukte enthalten.
Ein erfindungsgemäßer Produktionsstamm enthält somit in einer bevorzugten Ausführungsform gleichzeitig die Transketolase und Transaldolase Genkonstrukte, entweder als Einzelkonstrukte oder in Operonform. Diese Konstrukte liegen im Produktionsstamm entweder in Plasmidform vor oder in das Genom integriert und produzieren gleichzeitig ein Transketolase Enzym und ein Transal- dolaseenzym, jeweils in rekombinanter Form. Bevorzugt ist die Plasmidform.
Die rekombinanten Transketolase und Transaldolase Enzyme sind in der Lage, C-5 Zucker, bevorzugt Xylose, über den Pento- sephosphatweg in C6- und C3 -Verbindungen umzuwandeln und in den Glykolyse Stoffwechselweg einzuschleusen. Nun wurde überra- sehend gefunden, dass durch gleichzeitige rekombinante Expression der Transketolase- und Transaldolase Enzyme im Produktionsstamm die Ausbeute an C4 -Produkten, insbesondere 2,3- Butandiol, gegenüber dem Ausgangsstamm in signifikanter Weise gesteigert werden kann.
Die Erfindung betrifft ferner ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von C4-Produkten aus C5- uckern.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungs- gemäßer Produktionsstamm in einem Anzuchtsmedium kultiviert wird. Dabei werden einerseits Biomasse des Produktionsstammes und andererseits die C4 -Produkte, darunter bevorzugt 2,3- Butandiol, gebildet. Die Bildung von Biomasse und der C4- Produkte kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormaßstab) erfolgen oder aber auch durch Fermen- tation (Produktionsmaßstab) .
Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmaßstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmaßstab ein Fermentationsvolumen grösser 10 1 besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen grösser 300 1 insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtsmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiel- len Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle) , einer Stickstoffquelle (N- Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die C4 -Produktbildung , darunter bevorzugt 2 , 3 -Butandiol , optimiert werden.
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstämme sind Pentosen wie z.B. Xylose, Arabinose, oder Ribose sowie Pentosen enthaltende pflanzliche Hydrolysate, die aus Lignozellulose- haltiger Biomasse wie z.B. Zuckerrohrbagasse , Getreidestroh o- der Abfällen der Mais- oder Holzverarbeitung, bzw. der darin enthaltenen Hemicellulose gewonnen werden können. Dabei kann die Hydrolyse der Lignozellulose-haltigen Biomasse dem erfindungsgemäßen Produktionsverfahren vorgeschaltet sein oder aber in situ während des erfindungsgemäßen Produktionsverfahrens erfolgen. Besonders bevorzugte C-Quelle ist Xylose, entweder in isolierter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats .
Für das erfindungsgemäße Produktionsverfahren geeignete C- Quellen umfassen somit sowohl die isolierten Reinsubstanzen o- der aber auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufgereinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydrolysate durch thermischen, chemischen oder enzymatischen Aufschluss der pflanzlichen Rohstoffe gewonnen werden können. Die Verwendung der bevorzugten und besonders bevorzugten C- Quellen schließt also nicht aus, dass die erfindungsgemäßen C- Quellen im Gemisch mit anderen, nicht erfindungsgemäßen C- Quellen im Anzuchtsmedium vorkommen. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker wie z. B. Glucose, Mannose oder Fructose. Die C-Quellen umfassen aber auch Disac- charide, insbesondere Saccharose, Lactose, Maltose oder Cello- biose . Weiter betroffen sind alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Maltodextrin, Stärke, Cellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Monomere oder Oligomere.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehört Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH4OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N- Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KN03, NaN03 , Ammoniumnitrat, Ca(N03)2, Mg(N03)2 sowie andere N-Quellen wie z.B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Aminosäuregemische wie z.B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.
Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed) , um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C- Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombi- nation der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen
Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die C4 -Produktion steigern- de Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed- Batch Modus .
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Xylose oder Xylose enthaltende pflanzliche Hydrolysate, die aus Lignozellulose-haltigen Biomasseabfällen gewonnen werden können. Besonders bevorzugte C-Quelle im Feed ist Xylose.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NHOH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KN03 , NaN03 und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch N -Amine und Yeast Nitrogen Base . Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form) .
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die 2,3-BDL Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der geeignete pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7. Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produkti- onsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25 °C bis 35 °C. Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung) . Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die SauerstoffVersorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft.
Die Kultivierungsdauer zur C4- Produktion beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das C4- Produkt, darunter bevorzugt 2 , 3 -Butandiol , vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene C4 -Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet werden oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des C4-Produkts, darunter bevorzugt 2, 3 -Butandiol, stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zentrifuga- tion, Dekantierung, Filtration, Extraktion (siehe z.B. DE
102011004915) , Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebiger Form kombiniert werden, um das C4 -Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quanti- fizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades der C4-Produkte, darunter bevorzugt 2 , 3 -Butandiol , sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden. Die Figuren zeigen die in den Beispielen genannten Plasmide.
Fig. 1 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 2,9 kb großen Expes- sionsvektor pKKj . Fig. 2 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 5 kb großen
Transketolase Expessionsvektor pTkt .
Fig. 3 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 3,8 kb großen Transaldolase Expessionsvektor pTal ,
Fig. 4 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 4,3 kb großen Transaldolase Expessionsvektor pTal-tet .
Fig. 5 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 3,3 kb großen Expes sionsvektor pKKj-tet.
Fig. 6 zeigt den in Beispiel 1 hergestellten 6 kb großen Expes sionsvektor pTkt-Tal für die g. eichzeitige Expression des Transketolase- und Transaldola; e Gens .
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläu
1. Beispiel: Herstellung von Transketolase und Transaldolase Expressionsvektoren
Als Ausgangsstamm für die Genisolierung sowie für die Stamment wicklung wurde Raoultella (Klebsiella) terrigena DSM 2687 verwendet (käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) .
Verwendet wurden die Transketolase und Transaldolase Gene aus R. terrigena. Die DNS-Sequenzen der Gene aus R. terrigena sind offenbart in SEQ ID NO: 1 (Tansketolase) , kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2, und in SEQ ID NO: 3 (Transaldolase), kodierend für ein Protein mit der Amino säuresequenz SEQ ID NO : 4.
Gene der Transketolase (Tkt-Gen) und Transaldolase (Tal-Gen) wurden in PCR-Reaktionen (Taq DNS-Polymerase, Qiagen) aus geno mischer R. terrigena DNS (Stamm DSM 2687,) isoliert. Die für die PCR-Reaktionen verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit einem DNS- Isolierungskit (Qi- agen) aus Zellen der Anzucht von R. terrigena DSM 2687 in LB- Medium (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 NaCl) gewonnen worden.
Für die PCR-Reaktionen wurden folgende Primer verwendet: Transketolase (Tkt-Gen) : Primer Tkt-lf (SEQ ID NO: 5) und Tkt- 2r (SEQ ID NO: 6)
Die Primer hatten folgende DNS-Sequenzen : SEQ ID NO: 5 :
5 ' -ATA CAA TTG ATG TAC ATG TTT TGT CGC TTG GGT T- 3
SEQ ID NO: 6:
5'-TCT AAG CTT ACT ACA GCA GCG CTT TCG CCT TAG C- 3(
Transaldolase (Tal-Gen) : Primer Tal-lf (SEQ ID NO: 7) und Tal- 2r (SEQ ID NO: 8)
Die Primer hatten folgende DNS-Sequenzen :
SEQ ID NO: 7:
5' -ATA GAA TTC ATG ACG GAT AAA TTG ACT TCT C- 31 SEQ ID NO: 8 :
5' -TCT CTG CAG TTA CAG CAG ATC GCC GAT CAT TT- 3
Das Tansketolase Gen wurde bei der PCR-Reaktion als 2100 bp DNS-Fragment isoliert. Zur nachfolgenden Klonierung in den mit Eco RI und Hind III geschnittenen Expressionsvektor pKKj wurden das Tkt PCR-Produkt mit Mfe I (in Primer Tkt-lf enthalten, kompatibel mit Eco RI) und Hind III (in Primer Tkt-2r enthalten) nachverdaut. Expressionsvektor pKKj ist offenbart in
DE102011003394. pKKj ist ein Derivat des Expressionsvektors pKK223-3. Die DNS-Sequenz von pKK223-3 ist offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugriffnummer M77749.1. Aus dem 4,6 kb Plasmid wurden ca. 1,7 kb entfernt (bp 262 - 1947 der in M77749.1 offenbarten DNS-Sequenz) , wodurch der 2,9 kb Expressionsvektor pKKj (Fig. 1) entstand.
Bei der Klonierung des Transketolase Gens in den pKKj Vektor entstand der 5 kb große Vektor pTkt (Fig. 2) , in dem das
Transketolase Gen funktionell mit dem tac-Promotor verknüpft ist und der zur Expression des Transketolase Gens in R. terri- gena geeignet ist.
Das Tansaldolase Gen wurde bei der PCR-Reaktion als 950 bp DNS- Fragment isoliert. Zur nachfolgenden Klonierung in den mit Eco RI und Pst I geschnittenen Expressionsvektor pKKj wurde das Tal PCR-Produkt mit Eco RI (in Primer Tal-lf enthalten) und Pst I (in Primer Tal-2r enthalten) nachverdaut. Es entstand der 3,8 kb große Vektor pTal (Fig. 3), in dem das Transaldolase Gen funktionell mit dem tac-Promotor verknüpft ist und der zur Ex- pression des Transaldolase Gens in R. terrigena geeignet ist.
Expressionsvektor pTal-tet:
Das mit Eco RI und Pst I nachverdaute 950 bp PCR-Produkt des Transaldolase Gens wurde zusätzlich in den zuvor mit Eco RI und Pst I geschnittenen Expressionsvektor pKKj-tet kloniert . Dabei entstand der 4,3 kb große Expessionsvektor pTal-tet (Fig. 4) . pKKj-tet ist offenbart in DE102011003386. Zu dessen Herstellung wurde zuerst aus pKKj das Ampicillin Resistenzgen als 1 kb Fragment durch Verdau mit Bsp HI entfernt. In das verbliebene 1,9 kb Vektorfragment wurde das Tetracyclin Resistenzgen als 1,45 kb Fragment kloniert. Das Tetracyclin Resistenzgen war vorher aus dem Plasmid pACYC184 durch PCR (Taq DNS Polymerase, Qiagen) isoliert worden. Die DNS-Sequenz von pACYC184 ist zu- gänglich in der „Genbank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer X06403.1. Es entstand der 3,3 kb große Expressionsvektor pKKj - tet (Fig. 5) . Expressionsvektor pTkt-Tal:
Der Expressionsvektor pTal wurde mit Eco RI verdaut und das 3,8 kb linearisierte Vektorfragment isoliert. Das Tkt Genfragment wurde, wie beim Expressionsvektor pTkt beschrieben, in einer PCR-Reaktion aus genomischer R. terrigena DNS mit den Primern Tkt-lf (SEQ ID NO: 5) und Tkt-3r (SEQ ID NO: 9) als 2,1 kb Fragment isoliert. Primer Tkt-3r enthielt neben einer Mfe I Schnittstelle (kompatibel mit Eco RI zur nachfolgenden Klonie- rung in den Vektor pTal) und dem 3 '-Ende des Tkt-Gens auch eine Ribosomenbindestelle (RBS, siehe Fig. 6) für die Produktion des sich im Vektor pTkt-Tal anschließenden Tal-Gens (sog. künstliches Operon) .
Primer Tkt-3r (SEQ ID NO: 9) hatte folgende DNS-Sequenz:
SEQ ID NO: 9:
5'-TCT CAA TTG CCC TCC TCT GCA GAC TAC AGC AGC GCT TTC GCC TTA GC-3 Das 2,1 kb Tkt-Genfragment wurde mit Mfe verdaut und in den mit Eco RI geschnittenen Vektor pTal kloniert . Es entstand der 6 kb große Expressionsvektor pTkt-Tal (Fig. 6) . Von den erhaltenen Klonen wurden solche ausgewählt, bei denen das Transketolase Gen funktionell mit dem tac-Promotor verknüpft war, d.h. das Transketolase Gen war in der gleichen Orientierung wie das Transaldolase Gen eingebaut (siehe Fig. 6) .
In pTkt-Tal sind das Transketolase- und das Transaldolase Gen als künstliches Operon angeordnet. Ihre Expression steht unter Kontrolle des tac-Promotors .
2. Beispiel: Vergleichende Fermentation des Ausgangsstammes Ra- oultella (Klebsiella) terrigena DSM 2687 mit Glucose und Xylose als C-Quelle
Verwendet wurden „Labfors II" Fermenter der Fa. Infors . Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 1 (3 1 Fermentervolumen) . Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des p02 und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlö- sung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fer- mentationsparameter Rührerdrehzahl (rpm) , Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute) , p02 (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100 % kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt) , pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenter- hersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (73 % Glucose, w/v oder 75 % Xylose, w/v) wurde entsprechend dem Verbrauch an Glucose, bzw. Xylose über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vege- tabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei Schill & Seilacher (20-25 % v/v in Wasser verdünnt) , verwendet.
Der in der Fermentation eingesetzte Stamm war Raoultella
(Klebsiella) terrigena DSM 2687 (Kontrollstamm R.t.-WT) . Batch- Fermentationsmedien waren FM2-G (C-Quelle Glucose) und FM2-X (C-Quelle Xylose) .
FM2-G Medium enthielt Glucose 40 g/l; CSD (Corn Steep Liquor getrocknet) 10 g/l; Ammoniumsulfat 5 g/l; NaCl 0,5 g/l; FeS04 x 7 H20 75 mg/1; Na3Citrat x 2 H20 1 g/l; CaCl2 x 2 H20 14,7 mg/1; MgS04 x 7 H20 0,3 g/l; KH2P04 1,5 g/l; Spurenelementemix 10 ml/1. Der pH des FM2-G Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt.
FM2-X Medium enthielt die gleiche Zusammensetzung wie FM2-G Medium. Jedoch wurde die Glucose durch Xylose (40 g/l) ersetzt.
Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H3B03 2,5 g/l; CoCl2 x 6 H20 0,7 g/l; CuS04 x 5 H20 0,25 g/l; MnCl2 x 4 H20 1,6 g/l; ZnS04 x 7 H20 0,3 g/l und Na2Mo04 x 2 H20 0,15 g/l. Je 1,35 1 FM2-G, bzw. FM2-X Medium wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt. Die Fermentationsbedingungen waren: Tempe- ratur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,3.
In regelmäßigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD600 als Maß der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec™ 3000) . Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung j e 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert , das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der Glucose-, bzw. Xylosegehalt von Fermenterproben wurde bestimmt mit dem Analysator 7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit Messstationen sowohl für Glucose wie für Xylose.
Die Bestimmung des Gehalts an C4-Produkten ( 2 , 3 -Butandiol und Acetoin) sowie an C2-Produkten (Acetat und Ethanol) in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch 1H-NMR (siehe z.B. DE102011003394 ) . Dazu wurde jeweils ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5.000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des KulturüberStandes mit 0,6 ml TSP (3- (Trimethylsilyl) Propionsäure-2 , 2 , 3 , 3 -d4 Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/1) in D20 gemischt. Die 1H-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert:
TSP: 0,140 - 0,145 ppm (9H)
2, 3 -Butandiol : 1,155 - 1,110 ppm (6H) Ethanol: 1,205 - 1,157 ppm (3H)
Essigsäure: 2,000 - 1,965 ppm (3H)
Acetoin: 2,238 - 2,200 ppm (3H)
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose, bzw. Xylose verbraucht waren, wurden jeweils über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) Feedlösungen von Glucose (73 % w/v) , bzw. Xylose (75 % w/v) zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose-, bzw. Xylose Verbrauchsrate bestimmt.
Tabelle 1 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4- Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-WT mit Glucose und Xylose als C-Quelle der Fermentation.
Tabelle 1: Produktionsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Glucose und Xylose als C-Quelle
C-Quelle C-Quelle
Glucose Xylose
Zeit (h) Produkt (g/D (g/D
24 2, 3-BDL 72, 5 44 , 6
Acetoin 2,6 13, 1
Acetat 1,5 9,1
Ethanol 6,3 2, 2
48 2 , 3-BDL 109,7 61,8
Acetoin 6,3 16, 0
Acetat 3,5 19,9
Ethanol 5,3 1,7
72 2, 3-BDL 117, 1 62, 1
Acetoin 6,9 17, 7
Acetat 3,7 23, 0
Ethanol 5,4 1,6
Bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle der Fermentation anstelle von Glucose wurde eine deutliche Verschiebung des Produktspektrums beobachtet. Mit Xylose als C-Quelle wurde deut- lieh weniger 2 , 3 -Butandiol gebildet, während sich der Anteil des zweiten C4 -Produkts Acetoin (das dritte mögliche C4 -Produkt Diacetyl war nicht nachweisbar) erhöhte. Jedoch war mit Xylose als C-Quelle die Raum- eitausbeute der C4- Produkte 2,3- Butandiol und Acetoin nach 72 h mit 1,1 gl^h-1 deutlich höher als nach dem Stand der Technik bei Yu and Saddler, Ap l . En- viron. Microbiol. (1983) 46: 630-635 (ca. 0,6 gl"1h"1, wie dort aus Fig . 3 und 4 entnommen) . Bei den C2-Produkten wurde eine starke Zunahme von Acetat beobachtet und eine Abnahme von Ethanol. Die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentose Phosphatweg führt offensichtlich zu einem deutlich anderen Produktspektrum als die von Glucose über die Glykolyse .
3. Beispiel: Expression der Transketolase und Transaldolase Gene in Raoultella terrigena
Ausgangsstamm war Raoultella (Klebsiella) terrigena DSM 2687. Die Transformation mit den Plasmiden pKKj (Leervektor) , pTkt, pTal, pTal-tet und pTkt-Tal erfolgte in an sich bekannter Weise (siehe z.B. DE102011003394) , analog der dem Fachmann geläufigen Methoden zur Transformation von E. coli. Die dabei erhaltenen Stämme erhielten die Bezeichnungen R.t.-pKKj (Kontrollstamm) , R.t.-pTkt (Transketolase), R.t.-pTal (Transaldolase) , R.t.- pTal-tet (Transaldolase) , R . t . -pTkt-Tal (Transketolase- Transaldolase Operonkonstrukt ) sowie R . t . -pTkt-pTal . Beim Stamm R. t . -pTkt-pTal handelte es sich um ein Zweiplasmidsystem zur gleichzeitigen Expression der Transketolase und Transaldolase in einem Stamm, erhalten durch Transformation von R. terrigena mit den Vektoren pTkt (Ampicillin Selektion) und pTal-tet (Tetracyclin Selektion) .
Transformanten wurden isoliert und die rekombinante Expression der Tkt- und Tal Gene durch Schüttelkolbenanzucht untersucht, indem einerseits die jeweilige Enzymaktivität und andererseits die Produktion der C4-Produkte 2 , 3 -Butandiol und Acetoin sowie der C2-Produkte Acetat und Ethanol bestimmt wurde. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2-G, bzw. FM2-X Medium beimpft und bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert. Abhängig vom Stamm enthielten die Medien als selektive Antibiotika entweder Ampicillin (FM2-G-amp, bzw. FM2-X-amp) oder Tetracyclin (FM2-G-tet, bzw. FM2-X-tet) , bzw. Ampicillin und Tetracyclin (FM2-G- tet+amp, bzw. FM2-X-tet+amp) . FM2-G Medium und FM2-X Medium sind im 2. Beispiel beschrieben. Abhängig vom Expressionsvektor enthielten die Medien Ampicillin (200 mg/1, FM2-G-amp und FM2- X-amp) , Tetracyclin (15 mg/1, FM2-G-tet und FM2-X-tet) , bzw. beide Antibiotika zusammen (FM2-G-tet+amp und FM2 -X-tet+amp) .
In einem ersten Experiment wurde die Expression der Transketo- lase- und Transaldolase Gene exemplarisch überprüft für R. ter- rigena DSM 2687, transformiert entweder mit pKKj (Stamm R.t.- pKKj , Kontrollstamm), pTkt (Stamm R.t.-pTkt) oder mit pTal
(Stamm R.t.-pTal) . Je 50 ml FM2-G-amp wurden beimpft mit dem Kontrollstamm R.t.-pKKj (Negativkontrolle) sowie mit R.t.-pTkt und R. t . -pTal . Nach 24 h Inkubation bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) wurde das Zellwachstum photometrisch bei 600 nm Wellenlänge
(ODgoo) bestimmt und in an sich bekannter Weise die Proteinzusammensetzung der drei Stämme durch SDS-PAGE bestimmt (SDS- PAGE: Natrium-Dodecylsulfat Polyacrylamidgelelektrophorese) . Verwendet wurde das käuflich erhältliche SDS-PAGE System Novex® NuPAGE mit 12 % Bis-Tris Gelen der Fa. LifeTechnologies .
Zur Probenvorbereitung für die SDS-PAGE wurde aus den Schüttel- kolbenkulturen jeweils ein Aliquot entsprechend einer Zelldich- te ODgoo von 2 entnommen (ca. 0,2 ml), in 0,4 ml SDS- und ß-
Mercaptoethanol-haltigem Probenpuffer (Novex® „Tris-Glycine SDS Sample Buffer" der Fa. Invitrogen) aufgelöst, 3 min bei 94°C inkubiert und dann 10 μΐ einer jeden Probe auf benachbarten Spuren eines Polyacrylamidgels aufgetragen und in bekannter Weise durch Elektrophorese getrennt. Als Größenstandard wurde ein Mix von Proteinen bekannter Größe in einer weiteren Spur aufgetragen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die im Gel entsprechend ihrer Größe getrennten Proteine in bekannter Weise durch den Farbstoff Coomassie Brilliant Blue gefärbt.
Ein Vergleich der Proteinmuster ergab, dass gegenüber dem Kon- trollstamm R.t.-pKKj (Negativkontrolle) bei den Stämmen R.t.- pTkt, R . t . -pTkt-Tal und R. t . -pTkt-pTal die Überexpression des Transketolasegens zur Verstärkung einer Bande bei einem Molekulargewicht von ca. 70 kD (relatives Molekulargewicht von 70.000 Dalton) und bei den Stämmen R. t . -pTal-tet , R . t . -pTkt-Tal und R. t . -pTkt-pTal die Überexpression des Transaldolasegens zur Verstärkung einer Bande bei einem Molekulargewicht von ca. 35 kD (relatives Molekulargewicht von 35.000 Dalton) führte.
Die restlichen Zellen der Schüttelkolbenanzuchten (ca. 50 ml Volumen) wurden in einem zweiten Experiment zur Bestimmung der Enzymaktivitäten der rekombinant exprimierten Transketolase und Transaldolase im Vergleich zum Kontrollstamm verwendet. Die Bestimmung der Enzymaktivitäten der Transketolase und Transaldolase erfolgte entsprechend dem Stand der Technik (Josephson and Fraenkel, J. Bacteriol . (1969) 100: 1289-1295) .
Der Transketolase Enzymtest beruht auf Gleichung (VI) , bei der aus D-Xylulose- 5 -Phosphat und D-Ribose-5 -Phosphat als eines der Reaktionsprodukte Glycerinaldehyd- 3 -Phosphat entsteht. Glyceri- naldehd- 3 -Phosphat wird durch das im Test enthaltene Enzym Tri- osephosphatisomerase zu Dihydroxyacetonphosphat umgewandelt, welches schließlich durch das ebenfalls im Test enthaltene Enzym Glycerin-3 -phosphat Dehydrogenase unter stöchiometrischem Verbrauch von NADH reduziert wird.
Der Transaldolase Enzymtest beruht auf der Rückreaktion von Gleichung (VII) , bei der aus Fructose- 6 -Phosphat und Erythrose- 4 -Phosphat als eines der Reaktionsprodukte Glycerinaldehyd- 3 - Phosphat entsteht. Glycerinaldehyd- 3 -Phosphat wird durch das im Test enthaltene Enzym Triosephosphatisomerase zu Dihydroxyacetonphosphat umgewandelt, welches schließlich durch das ebenfalls im Test enthaltene Enzym Glycerin-3 -phosphat Dehydrogenase unter stöchiometrischem Verbrauch von NADH reduziert wird. Je 50 ml der Zellen aus der Schüttelkolbenanzucht wurden zent- rifugiert (10 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) , das Zellpellet in 2 ml Tris-Puffer (0,05 M Tris-HCl, pH 7,6, 0,01 M MgCl2 x 6 H20) aufgenommen, in an sich bekannter Weise mit einem sog. „French®Press" Hochdruckhomogenisator (SLM-AMINCO) aufgeschlossen und ein Zellextrakt durch Zentrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) isoliert. Aliquots der Zellextrakte wurden zur spektralphotometrischen Bestimmung der Transketolase- , bzw. Transaldolase -Aktivität verwendet.
Spektralphotometrische Bestimmung der Transketolase -Aktivität : Der Messansatz von 1 ml Volumen zur photometrischen Bestimmung der Transketolase-Aktivität (Komponenten des Enzymtests alle von der Fa. Sigma-Aldrich) war zusammengesetzt aus Tris-Puffer, 0,5 mM Ribose- 5 -Phosphat , 0 , 5 mM Xylulose- 5 -Phosphat, 0 , 2 mM NADH und 10 g einer Enyzmmischung bestehend aus a-Glycerin-3 - phosphat Dehydrogenase und Triosephosphatisomerase (Sigma- Aldrich) sowie Transketolase-haltigem Zellextrakt. Messtempera- tur war 25 °C. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe eines Mixes der Substrate Ribose- 5 -Phosphat und Xylulose- 5 -Phosphat (Mix jeweils 20-fach konzentriert) und die Extinktionsabnahme infolge des Verbrauchs von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen (Extinktionskoeffizient von NADH: ε = 0,63 x 104 1 x Mol"1 x cm"1) . Ein Unit Transketolase-Aktivität ist definiert als der Verbrauch von 1 μτηοΐ NADH/min unter Testbedingungen.
Spektralphotometrische Bestimmung der Transaldolase-Aktivität : Der Messansatz von 1 ml Volumen zur photometrischen Bestimmung der Transaldolase-Aktivität (Komponenten des Enzymtests alle von der Fa. Sigma-Aldrich) war zusammengesetzt aus Tris-Puffer, 0,3 mM Erythrose-4 -Phosphat , 0,4 mM Fructose-6 -Phosphat , 0 , 2 mM NADH und 10 pg einer Enyzmmischung bestehend aus a-Glycerin-3 - phosphat Dehydrogenase und Triosephosphatisomerase (Sigma- Aldrich) sowie Transaldolase-haltigem Zellextrakt. Messtemperatur war 25 °C. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe eines Mixes der Substrate Erythrose-4 -Phosphat und Fructose-6- Phosphat (Mix jeweils 20-fach konzentriert) und die Extinkti- onsabnahme infolge des Verbrauchs von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen (Extinktionskoeffizient von NADH: ε = 0,63 x 104 1 x Mol"1 x cm"1) . Ein Unit Transaldolase-Aktivität ist definiert als der Verbrauch von 1 pmol NADH/min unter Test- bedingungen.
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration der Zellextrakte in an sich bekannter Weise mit dem sog. „BioRad Proteinassay" der Fa. BioRad bestimmt.
Die unter Messbedingungen bestimmten Enzymaktivitäten sind in Tabelle 2 und 3 aufgeführt.
Tabelle 2:
Enzymaktivität rekombinanter , Transketolase überexprimierender R. terrigena Stämme
Stamm Konstrukt Transketolase relative Aktivität
(U/mg)
R. t . -pKKj pKKj , Kontrolle 0, 06 1
R. t . -pTkt pTkt 1, 63 27 , 2
R. t . -pTkt -Tal pTkt-Tal 1, 47 24,5
R. t . -pTkt -pTal pTkt + pTal-tet 1, 58 26,3
Tabelle 3 :
Enzymaktivität rekombinanter, Transaldolase überexprimierender R. terrigena Stämme
Figure imgf000031_0001
Wie in den Tabellen 2 und 3 angegeben, wird die Transketolase- aktivität in rekombinanten R. terrigena Stämmen durch Überexpression um den Faktor 24,5 - 27,2 erhöht, die Transaldolaseak- tivität in rekombinanten R. terrigena Stämmen um den Faktor 18, 9 - 24, 5.
4. Beispiel: Vergleichende Schuttelkolbenanzucht rekombinanter R. terrigena Stämme mit Glucose und Xylose als C-Quelle
Die Kultivierung der Stämme R.t.-pKKj, R.t.-pTkt und R.t.-pTal erfolgte wie im 3. Beispiel beschrieben. Kulturmedien (siehe 2. Beispiel) waren jeweils F 2-G-amp (Glucosemedium) , bzw. FM2-X- amp (Xylosemedium) . Die Kultivierungsdauer betrug 96 h. Dabei wurden die Glucose- und Xylosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Analysator 7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit MessStationen sowohl für Glucose wie für Xylose) und Glucose, bzw. Xylose bei Bedarf aus 40 % (w/v) Stocklösungen nachgefüt- tert . In Abständen von 24 h wurden Proben auf ihren Gehalt an C4- und C2- Produkten untersucht. Die Produktionsverläufe für die C-Quelle Glucose sind in Tabelle 4, für die C-Quelle Xylose in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 4 : Produktionsverlauf in rekombinanten Raoultella terrigena Stämmen mit Glucose als C-Quelle
Figure imgf000032_0001
Tabelle 5: Produktionsverlauf in rekombinanten Raoultella ter- rigena Stämmen mit Xylose als C-Quelle
Figure imgf000033_0001
Wie aus den Tabellen 4 und 5 ersichtlich, resultierte die alleinige Überexpression des Transketolase Gens wie auch des Transaldolase Gens in keiner signifikanten Veränderung des Spektrums an C4- Produkten (2 , 3 -Butandiol und Acetoin) sowie an C2- Produkten (Acetat und Ethanol) . Dies war unabhängig davon, welche C-Quelle verwendet wurde. Xylose als C-Quelle führte in der Schuttelkolbenanzucht jedoch zu deutlich niedrigeren Ausbeuten an C4 -Produkten, insbesondere von 2 , 3 -Butandiol , als Glucose (siehe auch 2. Beispiel) . 5. Beispiel: Schuttelkolbenanzucht des rekombinanten R. terri- gena Stammes R . t . -pTkt-Tal mit Glucose und Xylose als C-Quelle
Die Kultivierung der Stämme R.t.-pKKj und R . t . -pTkt-Tal (Operon Konstrukt, siehe 1. Beispiel) erfolgte wie im 4. Beispiel be- schrieben. Kulturmedien (2. Beispiel) waren jeweils FM2-G-amp (Glucosemedium) , bzw. FM2-X-amp (Xylosemedium) . Die Kultivierungsdauer betrug 96 h. Dabei wurden die Glucose- und Xylose - konzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Analysator
7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit Messstationen sowohl für Glucose wie für Xylose) und Glucose, bzw. Xylose bei Bedarf aus 40 % (w/v) Stocklösungen nachgefüttert. In Abständen von 24 h wurden Proben auf ihren Gehalt an C4- und C2- Produkten untersucht. Die Produktionsverläufe sowohl für die C-Quelle Glucose wie für Xylose sind in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6: Produktionsverlauf der rekombinanten Raoultella ter- rigena Stämme R.t.-pKKj und R . t . -pTkt-Tal mit Glucose, bzw. Xylose als C-Quelle
C-Quelle Glucose Xylose
Zeit Produkt R. t . -pKKj R. t . - R. t . -pKKj R. t . -
(h) (g/D pTkt-Tal (g/D pTkt-Tal
(g/D (g/D
48 2, 3-BDL 26, 6 25,9 20, 9 18, 5
Acetoin 6,1 7,6 2,2 4,8
Acetat 2,2 2,4 3,1 2,4
Ethanol 3,3 3,2 3,7 3,4
72 2 , 3-BDL 38, 5 38,9 25,2 29,2
Acetoin 9,1 9,1 3,4 3,7
Acetat 2,3 2,6 4,2 3,9
Ethanol 4,0 4,0 4,0 3,3
96 2, 3-BDL 50, 8 49,1 28,2 37,7
Acetoin 9,3 10, 1 3, 8 3,9
Acetat 2,6 2, 6 4,6 4,1
Ethanol 4,7 4,8 3,6 3,3 e in Tabelle 6 dargestellt , waren die Ausbeuten an C4- und
C2-Produkten des Transketolase und Transaldolase gleichzeitig rekombinant produzierenden Stammes R . t . -pTkt-Tal vergleichbar mit dem Kontrollstamm R.t.-pKKj, sofern Glucose als C-Quelle verwendet wurde. Wurde hingegen Xylose als C-Quelle verwendet war im Ansatz mit Stamm R . t . -pTkt-Tal , in dem gleichzeitig die Gene der Transketolase und Transaldolase überexprimiert wurden (Operonkonstrukt) , eine signifikante Steigerung der 2,3- Butandiol Ausbeute von 30 bis 40 % gegenüber dem Kontrollstamm R.t.-pKKj zu beobachten. Diese unerwartete Steigerung war be- sonders ausgeprägt für die 2 , 3 -Butandiol Produktion, da die Ausbeuten der anderen Produkte, Acetoin, Acetat und Ethanol unter diesen Bedingungen kaum verändert waren. 6. Beispiel:
Produktion von C4- und C2 -Verbindungen mit Transketolase und Transaldolase überexprimierenden R. terrigena Stämmen durch Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle Die Fermentation erfolgte wie im 2. Beispiel beschrieben. In der Fermentation eingesetzte Stämme waren die im 3. Beispiel beschriebenen R.t.-pKKj (Kontrollstamm), R.t.-pTkt (Transketo- lasestamm) und R.t.-pTal (Transaldolasestamm) . Batch- Fermentationsmedium war das im 2. Beispiel beschriebene FM2-X- amp Medium.
1,35 1 des FM2-X-amp Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2 -G-amp hergestellt (siehe 2. Beispiel). Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30 °C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,3.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Xylose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 ü/R der Fa. Watson Marlow) eine 75 % (w/v) Xylose Feedlösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Xylose Verbrauchsrate bestimmt. Tabelle 7 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4-
Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-pKKj und in den rekombinanten, Transketolase, bzw. Transaldolase überproduzierenden Raoultella terrigena Stämmen R.t.-pTkt, bzw. R.t.-pTal. Tabelle 7: Produktionsverlauf rekombinanter R. terrigena Stämme in der Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle Zeit Produkt R . t . -pKKj R. t . -pTkt R. t . -pTal
( ) (g/D (g/D (g/D
24 2 , 3-BDL 46,4 45 , 56 38,3
Acetoin 8 , 0 7,3 8 , 2
Acetat 11, 9 7,3 10, 3
Ethanol 3 , 2 1,4 0 , 0
48 2, 3-BDL 59,7 53 , 8 52, 7
Acetoin 17, 1 21,4 12, 4
Acetat 22, 1 11, 7 12, 0
Ethanol 1,4 1,3 1,0
72 2 , 3-BDL 60, 6 61, 2 55, 1
Acetoin 18, 9 17, 6 13, 9
Acetat 29, 9 16, 3 15, 2
Ethanol 1,9 2,1 1,5
Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (4. Beispiel) , führte die alleinige Überexpression des Transketolase- bzw. Tansaldolase Gens zu keiner signifikanten Veränderung des Produktspektrums. Durch alleinige Überexpression der
Transketolase, bzw. Transaldolase konnte die Ausbeute an 2,3- Butandiol oder der anderen Produkte nicht signifikant verbessert werden. Im Gegenteil wurde die Produktausbeute im Transaldolase überexprimierenden Stamm R.t.-pTal eher verringert.
7. Beispiel:
Produktion von C4- und C2 -Verbindungen mit den gleichzeitig Transketolase und Transaldolase überexprimierenden rekombinan- ten R. terrigena Stämmen R . t . -pTkt-pTal und R . t . -pTkt-Tal durch Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle
Die Fed-Batch Fermentation der Stämme R . t . -pTkt-pTal und R.t.- pTkt-Tal mit Xylose als C-Quelle wurde durchgeführt wie im 6. Beispiel beschrieben. Als Kontrollstamm wurde R.t.-pKKj verwendet. Die Herstellung der verwendeten rekombinanten Stämme wurde im 3. Beispiel beschrieben. Vorkultur (FM2-G-amp) und Batchme- dium (FM2-X-amp) der Stämme R.t.-pKKj und R . t . -pTkt-Tal ent- hielten Ampicillin (siehe 3. Beispiel) . Vorkultur (FM2-G- tet+amp) und Batchmedium (FM2-X-tet+amp) bei der Fermentation des mit den beiden Plasmiden pTkt und pTal-tet transformierten Stammes R . t . -pTkt-pTal enthielten sowohl Ampicillin und Tetra- cyclin (siehe 3. Beispiel) .
Tabelle 8 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4- Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-pKKj und in den rekombinanten, gleichzeitig Transketolase und Transaldolase überproduzierenden Raoultella terrigena Stämmen R . t . -pTkt-pTal und R. t . -pTkt-Tal .
Tabelle 8
Produktionsverlauf der rekombinanten R. terrigena Stämme R.t.- pTkt-pTal und R . t . -pTkt-Tal in der Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle
Zeit Produkt R. t . -pKKj R. t . -pTkt-pTal R. t . -pTkt-Tal
(h) (g/D (g/D (g/D
24 2,3-BDL 44, 6 43 , 8 58, 8
Acetoin 13, 1 6,9 4,5
Acetat 9,1 7,0 6,8
Ethanol 2,2 2,4 2,9
48 2, 3-BDL 56, 7 69, 7 68, 8
Acetoin 14, 2 16, 0 13 , 3
Acetat 13 , 2 3 , 2 10 , 2
Ethanol 1,9 2 , 2 2,6
72 2, 3-BDL 57, 5 104, 1 89
Acetoin 21,3 10, 1 15, 9
Acetat 28,3 4,7 19,5
Ethanol 2 , 0 2 , 2 1,6
Im Gegensatz zu den rekombinanten Stämmen R.t.-pTkt und R.t.- pTal, in denen jeweils nur eines der beiden Gene überexprimiert war (6. Beispiel), zeichneten sich die erfindungsgemäßen Stämme R . t . -pTkt-pTal und R . t . -pTkt-Tal , in denen sowohl das Transketolase- und das Transaldolase Gen überexprimiert wurden, bei der Fermentation mit Xylose als C-Quelle durch eine signifikant verbesserte C4 -Produktion aus. Dabei betrug, speziell bezogen auf 2 , 3 -Butandiol , die Steigerung gegenüber dem Kontrollstamm R.t.-pKKj für den Stamm R . t . -pTkt-Tal 54 % und für den Stamm R. t . -pTkt-pTal 80 %. Bezogen auf die Summe der C4 -Produkte Ace- toin und 2 , 3 -Butandiol betrug die Steigerung gegenüber dem Kontrollstamm R.t.-pKKj für den Stamm R . t . -pTkt-Tal 33 % und für den Stamm R . t . -pTkt-pTal 45 %. Diacetyl konnte bei keinem der Stämme nachgewiesen werden. Neben der absoluten Ausbeute wurde auch die Raum- eitausbeute für die C4 -Produkte (Summe von 2,3- Butandiol und Acetoin) signifikant verbessert, und zwar (nach 72 h Fermentationsdauer) von 1,09 gl^lf1 für den Kontrollstamm R.t.-pKKj auf 1,49 gl^h"1 für den Stamm R . t . -pTkt-pTal sowie 1,46 gl^h"1 für den Stamm R . t . -pTkt-Tal . Demgemäß zeichnen sich die erfindungsgemäßen Stämme nicht nur durch eine deutlich verbesserte C4-Produktivität gegenüber dem Kontrollstamm R.t.-pkkj aus, sondern sind auch signifikant verbessert gegenüber dem bei Yu and Saddler, Ap l . Environ. Microbiol . (1983) 46: 630-635 offenbarten Stand der Technik (ca. 0,6 gl_1h_1, wie dort aus Fig. 3 und 4 entnommen) .
Weiterhin wurde in der Fermentation die Produktion des Nebenprodukts Acetat deutlich reduziert, und zwar um 31 % für den Stamm R . t . -pTkt-Tal und um 83 % für den Stamm R . t . -pTkt-pTal .
Aus Tabelle 8 geht also hervor, dass sich das Spektrum der C4 und C2-Produktion durch die gleichzeitige Überexpression der Transketolase- und Transaldolase Gene in den Stämmen R.t.-pTkt- pTal und R . t . -pTkt-Tal verändert, wodurch sich der Anteil des 2 , 3 -Butandiols an der Gesamtproduktion (Summe der C2- und C4- Produkte) von 52,7 % für den Kontrollstamm R.t.-pKKj auf 86 % für den Stamm R . t . -pTkt-pTal , bzw. 70,6 % für den Stamm R.t.- pTkt-Tal erhöht. Die erfindungsgemäßen Produktionsstämme zeichnen sich somit nicht nur durch eine insgesamt höhere C4- Produktion aus, sondern auch durch einen höheren Anteil des 2 , 3 -Butandiols an der Gesamtmenge produzierter C2- und C4- Verbindungen (Selektivität) . Diese überraschende Verschiebung des Produktspektrums zugunsten von 2 , 3 -Butandiol bei der Fermentation von Xylose ist unerwartet, da einerseits die jeweilige Überexpression von Tansketola- se und Transaldolase alleine keinen Einfluss auf die 2,3- Butandiol Produktion hatte (6. Beispiel) und nach dem Stand der Technik für andere Mikroorganismen (US7998722 und US8034591) mindestens noch zusätzlich zwei weitere Gene überexprimiert werden mussten, um die Xyloseverwertung in diesen Stämmen zu verbessern und die Produktion von Ethanol zu steigern.
Weiterhin war überraschend, dass es sich bei der Transketolase und Transaldolase um zwei Enzyme des Pentosephosphatwegs handelt, welche an der Verstoffwechslung der C-Quelle Xylose beteiligt sind und von denen ein direkter Einfluss auf die Bio- Synthese von 2 , 3 -Butandiol nicht erwartet wurde. Ausgangspunkt der 2 , 3 -Butandiol Biosynthese ist Pyruvat, das Endprodukt der Glykolyse. Pyruvat ist ebenfalls die Ausgangsverbindung für die anderen Produkte Acetoin, Acetat und Ethanol, sodass ein denkbarer direkter Einfluss der Transketolase- und Transaldolase Überexpression auf die Verfügbarkeit von Pyruvat auch die Produktion dieser Verbindungen beeinflusst haben müsste . Dies wurde nicht beobachtet, sodass die gleichzeitige Überexpression der Transketolase- und Transaldolase Gene in den Produktionsstämmen R.t. -pTkt-pTal und R . t . -pTkt-Tal bei der Fed-Batch Fer- mentation mit der C-Quelle Xylose selektiv die Produktion von 2 , 3 -Butandiol verbesserte.
8. Beispiel: Fermentation mit der C-Quelle Xylose im 330 1 Maßstab
Fermentiert wurde der Stamm Raoultella terrigena R.t.-pTkt- pTal, der sowohl den Transketolase Expressionsvektor pTkt sowie den Transaldolase Expressionsvektor pTal-tet enthielt (siehe 3. und 7. Beispiel) .
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter : Ein Inokulum von R.t. -pTkt -pTal in LBtet+amp Medium (LB Medium, das zusätzlich 15 mg/1 Tetracyclin und 200 mg/1 Ampicillin enthielt) wur- de hergestellt, indem 2 x 100 ml LBtet+amp Medium, jeweils in einem 1 1 Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerin- kultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LBtet+amp Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20 % v/v versetzt und bei -20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte OO600/ml von 0,5 - 2,5) . 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 1 Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 1 Fermentermedium.
Vorfermenter : Die Fermentation wurde in zwei Biostat® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-G- tet+amp (siehe 3. Beispiel) . Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus.
2 8 1 FM2-G-tet+amp wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3P0 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei ei- nem konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450 - 1.000 rpm) . Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD60o/ml von 30 - 40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfer- menter verwendet .
Hauptfermenter : Die Fermentation wurde in einem Biostat® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 1, Kesselvolumen 500 1) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-X- tet+amp mit Xylose als C-Quelle (siehe 3. Beispiel) . Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus. 180 1 FM2 -X- tet+amp wurden mit 16 1 Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25 % NH4OH, bzw. 6 N H3P04 konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstan- ten Durchfluss von 1 vvm, bezogen auf das Anfangsvolumen. Der Sauerstoffpartialdruck p02 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200 - 500 rpm) . Zur Kon- trolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20-25 % v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Xy- loseverbrauch durch off-line Xylose-Messung mit einem Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 2. Beispiel) . Sobald die Xy- losekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/1 betrug (8 - 10 h nach Inokulation) , wurde die Zudosierung einer 75% w/v Xylose Feedlösung gestartet. Die Flussrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Xylosekonzent- ration von 10 - 20 g/1 eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 300 1.
Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 2. Beispiel beschrieben. Der Produktionsverlauf ist in Tabelle 9 dargestellt . Tabelle 9
Produktion von 2 , 3 -Butandiol durch Fed-Batch Fermentation im 330 1 Maßstab
Zeit Produkt R. t . -pTkt-pTal
(h) (g/D
24 2,3-BDL 59,9
Acetoin 8,4
Acetat 3 , 5
Ethanol 3,4
48 2, 3-BDL 79,5
Acetoin 17, 7
Acetat 3 , 8
Ethanol 2,2
72 2, 3-BDL 91, 5
Acetoin 20,7
Acetat 9,9
Ethanol 2,2

Claims

Patentansprüche
1. Produktionsstamm zur fermentativen Herstellung von C4- Produkten der in der Lage ist als C-Quelle bei der Fermentation aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnene Zucker zu verwerten, herstellbar aus einem Ausgangsstamm, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsstamm ein natürlicherweise zur 2,3- Butandiolproduktion befähigter Wildtypstamm ist und der Produktionsstamm gleichzeitig eine im Vergleich zum Ausgangsstamm verstärkte Expression eines Gens kodierend für eine Transketolase (EC 2.2.1.1) und eines Gens kodierend für eine Transaldolase (EC 2.2.1.2) aufweist.
2. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem Ausgangsstamm der Gattung Raoultella, Klebsiella, Bacillus, Paenibacillus , Serratia oder Lacto- bacillus hergestellt wurde.
3. Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den C4-Produkten um 2,3- Butandiol, Acetoin oder Diacetyl handelt.
4. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnenen Zucker um Pentosen (C5-Zucker) , insbesondere bevorzugt um Xylose handelt.
5. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, dass die Überexpression der
Transketolase- und Transaldolasegene derart verstärkt ist, dass die Enzymaktivität der Transketolase und Transaldolase jeweils um mindestens den Faktor 2, bevorzugt um mindestens den Faktor 5 und insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 im Vergleich zur Enzymaktivität im Ausgangsstamm erhöht ist.
6. Produktionsstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle in der Fermentation oder der Anzucht im
Schüttelkolben die Ausbeute der C4- Produkte 2 , 3 -Butandiol und Acetoin, um mehr als 20 % im Vergleich zum Ausgangs- stamm gesteigert ist.
7. Verfahren zur Herstellung von C4-Produkten aus C5-Zuckern, dadurch gekennzeichnet, dass ein Produktionsstamm gemäß Anspruch 1 bis 6 in einem Anzuchtmedium kultiviert wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und einem Temperaturbereich von 20°C bis 40 °C und anaerob oder aerob mit einer SauerstoffVersorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff erfolgt und eine Kultivierungsdauer zur C4 -Produktion zwischen 10 h und 200 h vorliegt .
9. Verfahren gemäß Anspruch 7, oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultivierung in einem Fermentationsvolumen grösser als 300 1 erfolgt.
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