CN115948482B - 一种2,4-二羟基丁酸生物合成途径的构建方法及应用 - Google Patents
一种2,4-二羟基丁酸生物合成途径的构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种2,4‑二羟基丁酸生物合成新途径的构建,属于生物技术领域。所述生物合成途径中包含醛缩酶、HOB还原酶,该途径可以甲醛与丙酮酸为底物,合成2,4‑二羟基丁酸。既可以通过构建体外多酶催化体系,也可以通过在微生物细胞体内通过途径组装,实现以甲醛与丙酮酸为底物或以甲醇与丙酮酸为底物或以甲醛与乳酸为底物或以肌氨酸与丙酮酸或以肌氨酸与乳酸为底物合成2,4‑二羟基丁酸。进一步,丙酮酸在微生物细胞体内可以葡萄糖为底物通过糖酵解合成,可实现以葡萄糖与甲醛或甲醇或肌氨酸为碳源合成2,4‑二羟基丁酸。本发明将高能量密度甲醇、甲醛等一碳化合物引入2,4‑二羟基丁酸合成途径中,成本低廉,具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及2,4-二羟基丁酸生物合成途径的构建方法及应用,更具体以甲醇/甲醛/肌氨酸和丙酮酸/乳酸为共底物成产2,4-二羟基丁酸的方法,属于生物制造与应用领域。
背景技术
2,4-二羟基丁酸(2,4-dihydroxybutyric acid)(即2,4-DHB或DHB),也称为2,4-二羟基丁酸(2,4-dihydroxybutyrate)或3-脱氧-L-甘油-特窗酸(3-deoxy-L-glycero-tetronic acid),是经济价值可观的化合物。其可用作多种大宗化学品和精细化学品合成的前体,包括甲硫氨酸类似物2-羟基-4-(甲基硫代)丁酸酯/盐(HMTB),其具有较大的动物营养品市场(每年大约800,000吨生产)。以及许多其他生物技术产品,包括2-酮基-4(甲基硫代)丁酸酯/盐(KMTB)、γ-丁内酯(GBL)等。
随着生物技术的发展,代替耗时并且昂贵的化学合成路线,发展绿色且可持续的生物合成代谢途径的方法,以更低成本、可持续的方式产生2,4-DHB成为发展趋势。近年来,已开发了几种生物途径用于2,4-二羟基丁酸的合成,包括:1)以(L)-苹果酸为底物经过三步酶反应转化为2,4-二羟基丁酸(Construction of a synthetic metabolic pathwayfor biosynthesis of the non-natural methionine precursor 2,4-dihydroxybutyricacid,ThomasWalther,Christopher M.Topham,Romain Irague,Clément Auriol,AudreyBaylac,Hélène Cordier,ClémentineDressaire,Luce Lozano-Huguet,Nathalie Tarrat,Nelly Martineau,Marion Stodel,Yannick Malbert,Marc Maestracci,Robert Huet,Isabelle André,MagaliRemaud-Siméon,and Jean MarieNat.Commun,2017.)。2)以高丝氨酸为底物经过两步酶反应转化为2,4-二羟基丁酸(Construction of asynthetic metabolic pathway for the production of 2,4-dihydroxybutyric acidfrom homoserine,Thomas Walther,Florence Calvayrac,Yoann Malbert,CerenAlkim,ClémentineDressaire,Hélène Cordier,Jean Marie/>Metab Eng,2018.)。3)1,2,4-丁三醇经过两步酶反应氧化为2,4-二羟基丁酸(A modified microorganism for theoptimized production of2,4-dihydroxybutyrate with enhanced 2,4-dihydroxybutyrateefflux,P.sokayer,G.bestell-carl,L.dimondsag-noville.Pat.WO2016/14244 A1)。然而,上述几种途径由于酶活低或者途径整体较弱,以及中间代谢物难以高产、获取等问题,导致成本较高,上述途径产生2,4-二羟基丁酸的能力普遍不高,大大限制了2,4-二羟基丁酸的生物合成以及应用。
发明内容
为了解决上述技术问题,提高2,4-二羟基丁酸的生物合成能力,降低2,4-二羟基丁酸生物合成成本,本发明人进行了一系列的研究探索。由于甲醛的高反应活性,它可以和多种含酮基的中间代谢物反应,从而合成高级代谢产物。由于酮基是胞内代谢产物最为常见的功能基团之一,所以甲醛引发的醛缩反应为本发明人想到利用甲醇、甲醛等廉价的一碳原料来合成2,4-二羟基丁酸。
基于此,本发明提出了使用化工原料甲醛或甲醇为底物碳源并进行了深入研究,设计了一条新型的2,4-二羟基丁酸生物合成途径。在该条途径中,使用甲醛做为一碳原料,通过甲醛与丙酮酸的醛缩反应,合成中间代谢产物4-羟基-2-酮丁酸,它再通过还原反应合成2,4-二羟基丁酸。其中,底物甲醛可直接添加,或甲醛进一步可以甲醇、甲酸、肌氨酸等化合物为底物通过酶反应获得。同理,底物丙酮酸直接添加,或丙酮酸进一步可以乳酸等为底物通过酶反应获得,或以葡萄糖为碳源进行糖酵解获得。
因此,本发明的目的之一在于设计了以甲醛与丙酮酸为共底物制备2,4-DHB的方法,包含醛缩酶、HOB还原酶的级联酶促催化反应,其包括主要两个步骤(见途径一):
1)醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸;2)HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
其中,由于4-羟基-2-酮-丁酸HOB为非天然化合物因此原先没有HOB还原酶这个命名,HOB还原酶是近来这样命名的,即能够有效催化HOB生成2,4-二羟基丁酸的酶,目前也是基于乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶突变才获得能够较高效催化的突变体,命名为HOB还原酶。
更进一步地,本发明还包括底物甲醛制备方法,在途径一上述两步骤的基础上,进一步可包括甲醇脱氢酶或肌氨酸氧化酶或甲酸脱氢酶等,构成进一步的甲醛供体生成甲醛的级联酶促催化反应,即还可包括下述步骤:
3)甲醇脱氢酶催化甲醇生成甲醛;4)肌氨酸氧化酶催化肌氨酸生成甲醛;5)甲酸脱氢酶催化甲酸生成甲醛;
相应地,4-羟基-2-酮-丁酸制备方法见途径二:
甲醇脱氢酶催化甲醇生成甲醛,醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸,HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
相应地,4-羟基-2-酮-丁酸制备方法见途径四:
肌氨酸氧化酶催化肌氨酸生成甲醛,醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸,HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
更进一步地,本发明还包括底物丙酮酸制备方法,在途径一上述两步骤的基础上,进一步可包括HOB还原酶或微生物糖酵解相关酶等,构成进一步的丙酮酸供体生成丙酮酸的级联酶促催化反应,即还可包括下述步骤:
6)催化乳酸生成丙酮酸。
相应地,4-羟基-2-酮-丁酸制备方法见途径三:
乳酸脱氢酶或其他具有催化乳酸生成丙酮酸的酶元件如本发明中涉及基于乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶突变体获得的HOB还原酶,具有催化乳酸生成丙酮酸的能力,因此可实现乳酸脱氢酶、基于乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶突变体获得的HOB还原酶催化乳酸生成丙酮酸,醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸,HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
相应地,4-羟基-2-酮-丁酸制备方法见途径五:
肌氨酸氧化酶催化肌氨酸生成甲醛,乳酸脱氢酶或具有催化乳酸生成丙酮酸的酶元件如本发明涉及的两种HOB还原酶催化乳酸生成丙酮酸,醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸,HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
通过以上新途径组合,构建了以甲醇/甲醛等一碳化合物生物合成2,4-二羟基丁酸的新型合成途径。该新型途径创新性的将高能量密度的甲醇/甲醛等一碳化合物引入2,4-二羟基丁酸合成途径中,从而实现降低生产成本,提高摩尔转化率。基于该新型途径建立的2,4-二羟基丁酸多酶反应体系以及微生物细胞工厂将具有重要应用前景。
由此,本发明提供5种途径的体外多酶催化体系,所有途径体系均包含:醛缩酶,HOB还原酶。进一步衍生的途径优选地还包括甲醇脱氢酶或肌氨酸氧化酶。
具体地,途径一反应体系为利用上述反应体系所提到的醛缩酶、HOB还原酶,以甲醛与丙酮酸为原料,在一个反应器中进行级联酶促催化反应生成2,4-二羟基丁酸,具体反应过程为:
1)醛缩酶(UniProtKB W0PEX6,SEQ ID NO.2),催化甲醛与丙酮酸缩合反应生成4-羟基-2-酮-丁酸;
2)HOB还原酶(EC:1.1.1.37,SEQ ID NO.3),(EC:1.1.1.27,SEQ ID NO.4),催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸;
优选地,上述2,4-二羟基丁酸的合成途径一,所述途径一的多酶反应体系还含有以下各成分:辅酶NAD H,缓冲液和二价镁离子。优选地,上述2,4-二羟基丁酸的非天然合成途径,缓冲液为HEPES缓冲液,但不限于HEPES缓冲液。
优选地,上述HEPES缓冲液浓度为10mM,pH值7.5;二价镁离子浓度为2mM,NADH浓度为10mM。
由此,本发明提供所述途径一的体外多酶反应体系以甲醛和丙酮酸为底物合成2,4-二羟基丁酸的方法如下:反应体系中含有HEPES,甲醛,丙酮酸,HOB还原酶所需辅酶NADH;醛缩酶所需辅酶MgCl2,以及醛缩酶、HOB还原酶,进行催化反应获得2,4-二羟基丁酸。
优选地,途径一反应体系中含有8-12mM HEPES(pH=7.5),2-200mM甲醛,20-200mM丙酮酸,HOB还原酶所需辅酶NADH:1-50mM,醛缩酶所需辅酶MgCl2:1-10mM,1-20μM醛缩酶,1-20μMHOB还原酶,在25-37℃进行催化反应,反应时间为12-24个小时。
更优选地,途径一反应体系中含有10mM HEPES(pH=7.5),20mM甲醛,50mM丙酮酸,10mM NADH,2mM MgCl2,10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶,在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时。
更优选地,途径一反应体系中可引入葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶等酶,实现辅酶NADH的原位再生,使得NADH实现内循环。
具体地,途径二反应体系为利用上述反应体系所提到的甲醇脱氢酶、醛缩酶、HOB还原酶,以甲醇与丙酮酸为原料,在一个反应器中进行级联酶促催化反应生成2,4-二羟基丁酸,具体反应过程为:
1)甲醇脱氢酶(EC:1.1.1.6,SEQ ID NO.1),催化甲醇生成甲醛;
2)醛缩酶(UniProtKB W0PEX6,SEQ ID NO.2),催化甲醛与丙酮酸缩合反应生成4-羟基-2-酮-丁酸;
3)HOB还原酶(EC:1.1.1.37,SEQ ID NO.3),(EC:1.1.1.27,SEQ ID NO.4),催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸;
优选地,上述2,4-二羟基丁酸的合成途径二,所述途径二的多酶反应体系还含有以下各成分:辅酶NAD+,缓冲液和二价镁离子。优选地,上述2,4-二羟基丁酸的非天然合成途径,缓冲液为HEPES缓冲液,但不限于HEPES缓冲液。
优选地,上述HEPES缓冲液浓度为10mM,pH值7.5;二价镁离子浓度为2mM,NAD+浓度为5mM。
由此,本发明提供所述途径二的体外多酶反应体系以甲醇和丙酮酸为底物合成2,4-二羟基丁酸的方法如下:反应体系中含有HEPES,甲醇,丙酮酸,甲醇脱氢酶所需的辅酶NAD+,HOB还原酶所需辅酶NADH;醛缩酶所需辅酶MgCl2,以及甲醇脱氢酶、醛缩酶、HOB还原酶,进行催化反应获得2,4-二羟基丁酸。
优选地,途径二反应体系中含有8-12mM HEPES(pH=7.5),0.1-1M甲醇,20-200mM丙酮酸,甲醇脱氢酶所需的辅酶NAD+:1-50mM,HOB还原酶所需辅酶NADH:1-50mM,醛缩酶所需辅酶MgCl2:1-10mM,5-40μM甲醇脱氢酶,1-20μM醛缩酶,1-20μMHOB还原酶,在25-37℃进行催化反应,反应时间为12-24个小时。
更优选地,途径二反应体系中含有10mM HEPES(pH=7.5),0.5M甲醇,50mM丙酮酸,5mM NAD+,2mM MgCl2,25μM甲醇脱氢酶、10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶,在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时。
更优选地,途径二反应体系中NAD+依赖型的甲醇脱氢酶与HOB还原酶所需的NADH可使该途径反应体系实现还原力平衡,可实现NAD+/NADH循环。
优选地,途径二中所述的甲醇脱氢酶MDH可以是吡咯喹啉醌(PQQ)依赖型的甲醇脱氢酶、NAD依赖型的甲醇脱氢酶或甲醇氧化酶(AOX,alcohol oxidase)。
更优选地,途径二反应体系中当甲醇脱氢酶MDH为非NAD依赖型的甲醇脱氢酶时,可引入葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶等酶,实现辅酶NADH的原位再生,使得NADH实现内循环。
具体地,途径三反应体系为利用上述反应体系所提到的醛缩酶、HOB还原酶或乳酸脱氢酶,以甲醛与乳酸为原料,在一个反应器中进行级联酶促催化反应生成2,4-二羟基丁酸,具体反应过程为:
1)乳酸脱氢酶(EC:1.1.1.27)或HOB还原酶(EC:1.1.1.37,SEQ ID NO.3),(EC:1.1.1.27,SEQ ID NO.4),催化乳酸生成丙酮酸;
2)醛缩酶(UniProtKB W0PEX6,SEQ ID NO.2),催化甲醛与丙酮酸缩合反应生成4-羟基-2-酮-丁酸;
3)HOB还原酶(EC:1.1.1.37,SEQ ID NO.3),(EC:1.1.1.27,SEQ ID NO.4),催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸;
优选地,上述2,4-二羟基丁酸的合成途径三,所述途径三的多酶反应体系还含有以下各成分:辅酶NAD+,缓冲液和二价镁离子。优选地,上述2,4-二羟基丁酸的非天然合成途径,缓冲液为HEPES缓冲液,但不限于HEPES缓冲液。
优选地,上述HEPES缓冲液浓度为10mM,pH值7.5;二价镁离子浓度为2mM,NAD+浓度为5mM。
由此,本发明提供所述途径三的体外多酶反应体系以甲醛和乳酸为底物合成2,4-二羟基丁酸的方法如下:反应体系中含有HEPES,甲醛,乳酸,HOB还原酶催化乳酸生成丙酮酸所需的辅酶NAD+,HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸所需辅酶NADH;醛缩酶所需辅酶MgCl2,以及醛缩酶、HOB还原酶,进行催化反应获得2,4-二羟基丁酸。
优选地,途径三反应体系中含有8-12mM HEPES(pH=7.5),2-200mM甲醛,20-200mM乳酸,HOB还原酶催化乳酸生成丙酮酸所需的辅酶NAD+:1-50mM,HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸所需辅酶NADH:1-50mM,醛缩酶所需辅酶MgCl2:1-10mM,51-20μM醛缩酶,1-20μMHOB还原酶,在25-37℃进行催化反应,反应时间为12-24个小时。
更优选地,途径三应体系中含有10mM HEPES(pH=7.5),20mM甲醛,50mM乳酸,5mMNAD+,2mM MgCl2,10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶,在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时。
更优选地,途径三应体系中HOB还原酶催化乳酸生成丙酮酸所需的辅酶NAD+与HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸所需辅酶NADH可使该途径反应体系实现还原力平衡,可实现NAD+/NADH循环。
具体地,途径四反应体系为利用上述反应体系所提到的醛缩酶、HOB还原酶、肌氨酸氧化酶,以肌氨酸与丙酮酸为底物,在一个反应器中进行级联酶促催化反应生成2,4-二羟基丁酸,具体反应过程为:
1)肌氨酸氧化酶(EC:1.5.3.1,SEQ ID NO.5),催化肌氨酸生成甘氨酸与甲醛;
2)醛缩酶(UniProtKB W0PEX6,SEQ ID NO.2),催化甲醛与丙酮酸缩合反应生成4-羟基-2-酮-丁酸;
3)HOB还原酶(EC:1.1.1.37,SEQ ID NO.3),(EC:1.1.1.27,SEQ ID NO.4),催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸;
优选地,上述2,4-二羟基丁酸的合成途径四,所述途径四的多酶反应体系还含有以下各成分:辅酶NADH,缓冲液和二价镁离子。
优选地,上述2,4-二羟基丁酸的非天然合成途径,缓冲液为HEPES缓冲液,但不限于HEPES缓冲液。
优选地,上述HEPES缓冲液浓度为10mM,pH值7.5;二价镁离子浓度为2mM,NADH浓度为10mM。
由此,本发明提供所述途径四的体外多酶反应体系以肌氨酸和丙酮酸为底物合成2,4-二羟基丁酸的方法如下:反应体系中含有HEPES,肌氨酸,丙酮酸,HOB还原酶所需辅酶NADH;醛缩酶所需辅酶MgCl2,以及肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶,进行催化反应获得2,4-二羟基丁酸。
优选地,途径四反应体系中含有8-12mM HEPES(pH=7.5),5-100mM肌氨酸,20-200mM丙酮酸,HOB还原酶所需辅酶NADH:1-50mM,醛缩酶所需辅酶MgCl2:1-10mM,1-20μM肌氨酸氧化酶,1-20μM醛缩酶,1-20μMHOB还原酶,在25-37℃进行催化反应,反应时间为12-24个小时。
更优选地,途径四应体系中含有10mM HEPES(pH=7.5),20mM肌氨酸,50mM丙酮酸,10mM NADH,2mM MgCl2,5μM肌氨酸氧化酶,10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶,在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时。
更优选地,途径四反应体系中葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶等酶,实现辅酶NADH的原位再生,使得NADH实现内循环。
其中所述各酶通过构建重组菌株,例如大肠杆菌,并通过表达并纯化获得,纯化方法收集培养后的重组菌株的菌体,超声破碎后,使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
本发明进一步提供一种生产2,4-二羟基丁酸的基因工程重组菌株,所述重组菌在宿主细胞中过表达醛缩酶、HOB还原酶,因而可以制备2,4-二羟基丁酸。更进一步可包括在所述重组菌株中过表达甲醇脱氢酶或肌氨酸氧化酶,因而可以实现将甲醇或肌氨酸等化合物转化为甲醛。同时,还可包括在所述重组菌株中过表达糖酵解途径中的酶,用于丙酮酸合成能力。
在本发明的一种实施方式中,所述的醛缩酶根据分类不同,可以是I类醛缩酶:2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶(EC:4.1.3.16)、也可以为4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶(UniProtKBW0PEX6,SEQ ID NO.2)、4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶(UniProtKBA0A1Y0N802,SEQ ID NO.6)、4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶(UniProtKBA0A7X8PF03,SEQ ID NO.7)、4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶(UniProtKB A0A4S0ZMA9,SEQ ID NO.8)、4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶(UniProtKBA0A254U9J8,SEQ ID NO.9)、2-脱氢-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶(EC:4.1.2.53)和5-酮-4脱氧-D-戊二酸醛缩酶(EC:4.1.2.20)等II型醛缩酶,以及其他以丙酮酸作为供体,甲醛为受体的醛缩酶。
在本发明的一种实施方式中,所述的HOB还原酶(SEQ ID NO.3)是大肠杆菌中苹果酸脱氢酶(EC:1.1.1.37,UniProtKB P61889)的突变体,其能催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
在本发明的一种实施方式中,所述的HOB还原酶(SEQ ID NO.4)是乳酸脱氢酶(EC:1.1.1.27,UniProtKB code P00344)的突变体,其能催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
在本发明的一种实施方式中,所述的甲醇脱氢酶MDH可以是吡咯喹啉醌(PQQ)依赖型的甲醇脱氢酶、NAD依赖型的甲醇脱氢酶或甲醇氧化酶(AOX,alcohol oxidase)。
在本发明的一种实施方式中,所述的肌氨酸氧化酶,其能催化肌氨酸生成甲醛。
在本发明的一种实施方式中,选用的宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamnicum)、谷草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸菌(Lactic acid bacteria)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、甲基营养菌(Methylorubrumextorquens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等微生物细胞。优选大肠杆菌,更优选的是大肠杆菌W3110。
本发明的一种实施方式中,醛缩酶、HOB还原酶以质粒pTrc99a为表达载体进行共表达。
在本发明的一种实施方式中,甲醇脱氢酶、醛缩酶、HOB还原酶,以质粒pTrc99a为表达载体进行共表达。
在本发明的一种实施方式中,肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶,以质粒pTrc99a为表达载体进行共表达。
在本发明的一种实施方式中,采用本发明所述的重组菌以甲醇或甲醛或肌氨酸为底物生产2,4-二羟基丁酸方法如下:
1)种子培养:
根据质粒抗性向LB培养基添加羧苄霉素(50μg/mL),挑取单克隆接种至含LB培养基试管,37℃,220r/min过夜培养;
2)发酵培养:
过夜培养获得种子液,以初始OD600=0.1转接无机盐培养基,同时添加羧苄霉素(50μg/mL),待菌体OD600达到0.4-0.6时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,30℃下继续过夜培养。
3)全细胞转化:
离心收集菌体后用无机盐培养基洗涤3次后重悬,菌体浓度稀释为OD600=5,将30mL重悬菌转移至无菌250mL摇瓶中,同时添加羧苄霉素(50μg/mL),添加初始浓度为0.5M甲醇或5mM甲醛或10mM肌氨酸,葡萄糖浓度为30g/L,培养条件:37℃,220rpm,培养24h。
在一个实施例中,结果表明添加5mM甲醛可生成1.49mM的2,4-二羟基丁酸。添加0.5M甲醇可生成0.42mM的2,4-二羟基丁酸。
本发明提供了一种新型2,4-二羟基丁酸生物合成方法。该方法涉及一种基本途径包含醛缩酶、HOB还原酶元件,通过体外多酶反应体系,以及在重组菌在宿主细胞中过表达2种元件酶:醛缩酶、HOB还原酶两种方案,成功构建了甲醛到2,4-二羟基丁酸转化新型途径。
基于上述基本途径,进一步可包含催化合成甲醛的酶元件:甲醇脱氢酶,或肌氨酸氧化酶、或甲酸脱氢酶等;通过体外多酶反应体系,以及在重组菌在宿主细胞中过表达3种基本元件酶:甲醇脱氢酶、醛缩酶、HOB还原酶两种方案,成功构建了甲醇到2,4-二羟基丁酸转化新型途径。同理,通过体外多酶反应体系,以及在重组菌在宿主细胞中过表达3种基本元件酶:肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶两种方案,成功构建了肌氨酸到2,4-二羟基丁酸转化新型途径。
综上,本发明将高能量密度,价格低廉的甲醇、甲醛等一碳化合物引入2,4-二羟基丁酸合成途径中,成本低廉,具有重要的应用前景。
附图说明
图1、2,4-二羟基丁酸的新合成途径。
图2、体外多酶体系实现以甲醛与丙酮酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
图3、体外多酶体系实现以甲醇与丙酮酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
图4、体外多酶体系实现以甲醛与乳酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
图5、体外多酶体系实现以肌氨酸与丙酮酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
图6、体外多酶体系实现以肌氨酸与丙酮酸、乳酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
图7、体内实现以甲醛为底物合成2,4-二羟基丁酸。
图8、体内实现以甲醇为底物合成2,4-二羟基丁酸。
图9、体内实现以肌氨酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,实施例将有助于理解本发明,但是本发明的保护范围不限于下述的实施例,即不构成对本发明的限制。
其中,本发明所采用的2,4-二羟基丁酸、丙酮酸与乳酸的HPLC分析测定方法如下:
从反应混合物中取出样品并用去离子水或相应培养基稀释,得到0.1mM-20mM浓度范围。利用配有Aminex HPX-87H色谱(300*7.8mm)HPLC分析。其中,流动相为5mMH2SO4,流速:0.8mL/min,柱温:15℃,检测使用RID,温度:35℃。
本发明所采用的培养以及反应体系如下:
1)无机盐培养基:
基本成分包含(1L):47.8mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,93mM NH4Cl,2mMMgSO4 100μM CaCl2;微量元素(1L):134μM EDTA,31μM FeCl3,6.2μM ZnCl2,0.76μM CuCl2,0.42μM CoCl2,1.62μM H3BO3,0.081μM MnCl2;葡萄糖:30g/L,其他如抗生素、氨基酸等根据情况添加。
2)LB培养基(1L):
蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母粉5g,pH=7.0。
3)酶反应体系缓冲液:
HEPES缓冲液(100mM):100mM HEPES,1500mM KCl,100mM KH2PO4,pH=7.5。
本发明设计了利用甲醛或甲醇等一碳单位为碳源的新型合成2,4-二羟基丁酸非天然生物合成途径见图1,主要包括主要途径一,以及基于途径一延伸的四种途径。主要通路途径一包含2种酶:醛缩酶、HOB还原酶。以甲醛与丙酮酸为底物生成2,4-二羟基丁酸。涉及2步反应,其基本反应过程为:
按下述反应过程进行:
1)醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸;
2)HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
基于途径一,可进一步引入甲醛供体化合物(包括甲醇、肌氨酸、甲酸等化合物)以及相应的酶元件(包括甲醇脱氢酶、肌氨酸氧化酶、甲酸脱氢酶等)。
相应地,延伸的途径二包括3种酶:甲醇脱氢酶、醛缩酶、HOB还原酶。以甲醇与丙酮酸为底物生成2,4二羟基丁酸。涉及3步反应,其基本反应过程为:
按下述反应过程进行:
1)甲醇脱氢酶催化甲醇生成甲醛;
2)醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸;
3)HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
相应地,延伸的途径四包括3种酶:肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶。以肌氨酸与丙酮酸为底物生成2,4-二羟基丁酸。涉及3步反应,其基本反应过程为:
按下述反应过程进行:
1)肌氨酸氧化酶催化肌氨酸生成甘氨酸与甲醛;
2)醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸;
3)HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
由于乳酸脱氢酶或基于乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶突变获得的HOB还原酶可催化乳酸生成丙酮酸,因此基于途径一,可延伸途径三,包含2种酶:醛缩酶、HOB还原酶。以甲醛与乳酸为底物生成2,4二羟基丁酸。涉及3步反应,其基本反应过程为:
按下述反应过程进行:
1)HOB还原酶催化乳酸生成丙酮酸;
2)醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸;
3)HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
进一步,基于上述途径一、二、三可延伸途径五,四包括3种酶:肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶。以肌氨酸、乳酸、丙酮酸为底物生成2,4-二羟基丁酸。涉及4步反应,其基本反应过程为:
按下述反应过程进行:
1)肌氨酸氧化酶催化肌氨酸生成甘氨酸与甲醛;
2)HOB还原酶催化乳酸生成丙酮酸;
3)醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸;
4)HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸。
进一步,可基于上述途径进行进一步扩展,合成2,4-二羟基丁酸,其中涉及途径一的延伸途径均在本发明包含之内。
进一步上述途径可在微生物内通过过表达途径中的关键酶可实现2,4-二羟基丁酸的合成。
实施例一合成途径的构建方案
本发明途径将高能量密度的甲醇/甲醛等一碳化合物引入2,4-二羟基丁酸合成途径中,通过甲醛与丙酮酸的醛缩反应,合成中间代谢产物4-羟基-2-酮丁酸,它再通过HOB还原酶催化反应合成2,4-二羟基丁酸。基本合成路线见图1中途径一:以甲醛与丙酮酸为底物,通过醛缩酶(能够催化甲醛与丙酮酸缩合反应)、HOB还原酶两步酶催化,合成2,4二羟基丁酸。
其中,醛缩酶为可有效催化甲醛与丙酮酸缩合反应生成4-羟基-2-酮-丁酸的醛缩酶。由于4-羟基-2-酮-丁酸为非天然产物,因此以往研究缺乏有效催化甲醛与丙酮酸缩合反应的醛缩酶,目前已报道少量能够有效催化甲醛与丙酮酸缩合反应的醛缩酶只有2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶(EC:4.1.3.16)、2-脱氢-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶(EC:4.1.2.53)和5-酮-4脱氧-D-戊二酸醛缩酶(EC:4.1.2.20)。为挖掘高效催化甲醛与丙酮酸缩合生成4-羟基-2-酮-丁酸的醛缩酶,我们基于底物相似性以及酶元件功能结构域原理,对现有数据库Uniprot以及NCBI数据库中的醛缩酶蛋白库,筛选同时具有HpcH功能域以及功能注释为可以催化乙醛与丙酮酸缩合反应的蛋白元件,满足筛选条件的醛缩酶蛋白序一共为960个醛缩酶蛋白序列,进一步进行进化树分析,进一步从进化树中主要分支中各选择一个蛋白序列进行合成,共初选20个蛋白序列的进行基因合成并完成反应活性评价。反应体系包含丙酮酸钠(50mM)和甲醛(20mM),5μM醛缩酶作为催化剂,在30℃进行催化反应,反应时间为1h。结果如表1所示,醛缩酶CsAld、AmAld、TtAld、LmAld、RsAld、BtAld、AnAld、BlAld,可高效催化丙酮酸与甲醛缩合生成4-羟基-2-酮丁酸,转化率为9-99%。表1中其余醛缩酶则催化甲醛与丙酮酸缩合反应效率较低或未检测到有产物生成,因此我们选择醛缩酶(UniProtKBW0PEX6,SEQ ID NO.2)进行途径验证。
另外,由于4-羟基-2-酮-丁酸(HOB)为非天然化合物,因此需要对于催化4-羟基-2-酮-丁酸(HOB)生成2,4-二羟基丁酸的酶元件进行挖掘评价。基于底物相似性,对能够催化4-羟基-2-酮-丁酸(HOB)相似化合物丙酮酸酮基还原反应的酶元件:乳酸脱氢酶以及苹果酸脱氢酶以及相应突变体进行反应活性评价。反应体系:10mM HEPES(pH=7.5),5mM4-羟基-2-酮-丁酸(HOB),5mM NADH,2μM乳酸脱氢酶以及苹果酸脱氢酶以及相应突变体,在30℃进行催化反应,反应时间为1个小时。结果如表2所示,乳酸脱氢酶(EC:1.1.1.27,UniProtKBcode P00344)与苹果酸脱氢酶(EC:1.1.1.37,UniProtKB P61889)的转化率为均较低,且对原始底物丙酮酸活性较高,不能满足应用要求,相比之下,构建的突变体对于4-羟基-2-酮-丁酸(HOB)的催化效率显著提高,1h内反应转化率均达到90%以上,因此后续实验选择两个酶元件突变体(EC:1.1.1.37,SEQ ID NO.3),(EC:1.1.1.27,SEQ ID NO.4)作为HOB还原酶进行途径验证。
基于途径一,可进一步引入甲醛供体化合物(包括甲醇、肌氨酸、甲酸等化合物)以及相应的酶元件(包括甲醇脱氢酶、肌氨酸氧化酶、甲酸脱氢酶等)。相应地,可实现图1中途径二:以甲醇与丙酮酸为底物,通过甲醇脱氢酶、醛缩酶、HOB还原酶催化反应合成2,4-二羟基丁酸。相应地,可实现图1中途径四:以肌氨酸与丙酮酸为底物,通过肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶催化反应合成2,4-二羟基丁酸。由于HOB还原酶或乳酸脱氢酶可催化乳酸生成丙酮酸,因此基于途径一,可实现图1中途径三:以甲醛与乳酸为底物,通过醛缩酶、HOB还原酶催化反应生成2,4-二羟基丁酸。进一步,可实现图1中途径五:以肌氨酸、乳酸、丙酮酸为共底物,通过肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶催化反应合成2,4-二羟基丁酸。上述途径可以通过体外多酶催化体系或构建重组菌株来将途径一:甲醛与丙酮酸、途径二:甲醇与丙酮酸、途径三;甲醛与乳酸、途径四:肌氨酸与丙酮酸、途径五:肌氨酸与乳酸、丙酮酸转化为2,4-二羟基丁酸。进一步,丙酮酸在微生物细胞体内可以葡萄糖为底物通过糖酵解合成,可实现以葡萄糖与甲醛或甲醇或肌氨酸为碳源生物合成2,4-二羟基丁酸。
表1为醛缩酶筛选检测结果
序号 | 醛缩酶名称 | Accession Nr. | 底物甲醛转化率(%) |
1 | CsAld | A0A1Y0N802 | 95.1 |
2 | AmAld | W0PEX6 | 96.2 |
3 | AaAld | A0A6N1WYS6 | 4.8 |
4 | PwAld | A0A4V2HEG7 | 1.9 |
5 | TtAld | A0A231VDW6 | 9.7 |
6 | PbAld | A0A2E8FHG5 | 0 |
7 | CbAld | A0A6B1DZS0 | 0.1 |
8 | RjAld | Q0SEY1 | 0 |
9 | ViAld | A0A0B8Q5A0 | 0 |
10 | LmAld | A0A2S9QNT1 | 10.4 |
11 | AsAld | A0A0Q6EGC6 | 0 |
12 | RsAld | A0A7X8PF03 | 54.8 |
13 | BtAld | A0A4S0ZMA9 | 51.2 |
14 | AfAld | B8NVI0 | 2.8 |
15 | AnAld | A0A254U9J8 | 30.7 |
16 | BlAld | A0A0B9A3F1 | 9.7 |
17 | SfAld | C3KN71 | 0.1 |
18 | PsAld | A0A399JAF6 | 0.5 |
19 | XcAld1 | A0A8I0IAQ6 | 1.4 |
20 | XcAld2 | A0A6M2XH49 | 1.9 |
表2为HOB还原酶筛选检测结果
序号 | 酶名称 | Accession Nr. | 底物甲醛转化率(%) |
1 | EcMdh | UniProtKB P61889 | 2.1% |
2 | GsLdh | UniProtKB code P00344 | 6.5% |
3 | MdhE | EcMdh突变体 | 98.2% |
4 | LdhQ | GsLdh突变体 | 90.5% |
实施例二体外多酶体系实现以甲醛与丙酮酸为底物合成2,4-二羟基丁酸
选择来源于菌属(Advenellamimigardefordensis(strain DSM 17166/LMG22922/DPN7))的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶(UniProtKBW0PEX6,SEQ ID NO.2),来源于大肠杆菌的(Escherichia coli)的HOB还原酶Ecmdh编码基因(EC:1.1.1.37)的突变体MdhE(SEQID NO.3),来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的乳酸脱氢酶GsLdh编码基因(EC:1.1.1.27)LdhQ的突变体(SEQ ID NO.4),构建到表达载体pET16b上,获得相应载体:pET16b-AmAld,pET16b-mdhE,pET16b-LdhQ。
将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中,37℃培养至OD600=0.5时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,16℃过夜诱导培养后收集菌体,超声破碎后,使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
通过表达纯化获得通路中2种活性蛋白酶,即醛缩酶AmAld、HOB还原酶mdhE或LdhQ。进一步地,对途径一反应进行了体外催化验证:将途径一中地两步功能元件酶组合在一起,组建体外多酶反应体系,以甲醛以及丙酮酸为底物经两步功能元件酶催化生成2,4-二羟基丁酸。
体外多酶反应体系包含10mM HEPES(pH=7.5),20mM甲醛,50mM丙酮酸,10mMNADH,2mM MgCl2,10μM醛缩酶AmAld,5μMHOB还原酶mdhE或LdhQ,在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时。反应后添加10% TCA终止反应,离心取上清,并0.22μM过滤膜过滤,制备样品进行液相检测。检测结果如图2,实验结果表明以20mM甲醛为底物,经过通路2步元件酶催化反应,LdhQ组最终可生成9.82mM的2,4-二羟基丁酸,MdhE组最终可生成9.78mM的2,4-二羟基丁酸,实现了2,4-二羟基丁酸非天然合成途径一的体外搭建。
实施例三体外多酶体系实现以甲醇与丙酮酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
选择来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的醇脱氢酶BsMdh编码基因(EC:1.1.1.6,SEQ ID NO.1),选择来源于菌属(Advenellamimigardefordensis(strainDSM 17166/LMG 22922/DPN7))的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶AmAld(UniProtKB W0PEX6,SEQID NO.2),来源于大肠杆菌的(Escherichia coli)的天HOB还原酶Ecmdh编码基因(EC:1.1.1.37)的突变体MdhE(SEQ ID NO.3),来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的乳酸脱氢酶GsLdh编码基因(EC:1.1.1.27)LdhQ的突变体(SEQ IDNO.4),构建到表达载体pET16b上,获得相应载体:pET16b-BsMdh,pET16b-AmAld,pET16b-mdhE,pET16b-LdhQ。
将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中,37℃培养至OD600=0.5时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,16℃过夜诱导培养后收集菌体,超声破碎后,使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
通过表达纯化获得通路中3种活性蛋白酶,即甲醇脱氢酶BsMdh、醛缩酶AmAld、HOB还原酶mdhE或LdhQ。进一步地,对途径二反应进行了体外催化验证:将途径二中地3步功能元件酶组合在一起,组建体外多酶反应体系,以甲醇以及丙酮酸为底物经3步功能元件酶催化生成2,4-二羟基丁酸。
体外多酶反应体系包含10mM HEPES(pH=7.5),0.5M甲醇,50mM丙酮酸,5mM NAD+,2mM MgCl2,25μM甲醇脱氢酶、10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶,在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时。反应后添加10% TCA终止反应,离心取上清,并0.22μM过滤膜过滤,制备样品进行液相检测。检测结果如图3,实验结果表明以0.5M甲醇为底物,经过通路3步元件酶催化反应,LdhQ组最终可生成0.38mM的2,4-二羟基丁酸,MdhE组最终可生成0.44mM的2,4-二羟基丁酸,实现了2,4-二羟基丁酸非天然合成途径二的体外搭建。
实施例四体外多酶体系实现以甲醛与乳酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
选择来源于菌属(Advenellamimigardefordensis(strain DSM 17166/LMG22922/DPN7))的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶(UniProtKB W0PEX6,SEQ ID NO.2),来源于大肠杆菌的(Escherichia coli)的HOB还原酶Ecmdh编码基因(EC:1.1.1.37)的突变体MdhE(SEQ ID NO.3),来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的乳酸脱氢酶GsLdh编码基因(EC:1.1.1.27)LdhQ的突变体(SEQ IDNO.4),构建到表达载体pET16b上,获得相应载体:pET16b-AmAld,pET16b-mdhE,pET16b-LdhQ。
将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中,37℃培养至OD600=0.5时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,16℃过夜诱导培养后收集菌体,超声破碎后,使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
通过表达纯化获得通路中两种活性蛋白酶,即醛缩酶AmALd、HOB还原酶mdhE或LdhQ。进一步地,对途径三反应进行了体外催化验证:将途径三中地两种功能元件酶组合在一起,组建体外多酶反应体系,以甲醛以及乳酸为底物经3步酶催化生成2,4-二羟基丁酸。
体外多酶反应体系包含10mM HEPES(pH=7.5),20mM甲醛,50mM乳酸,5mM NAD+,2mM MgCl2,10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶,在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时。检测结果如图4,实验结果表明以20mM甲醛为底物,经过通路三步元件酶催化反应,LdhQ组最终可生成6.20mM的2,4-二羟基丁酸,MdhE组最终可生成6.54mM的2,4-二羟基丁酸,实现了非天然合成途径三中以甲醛与乳酸为底物合成2,4-二羟基丁酸的体外搭建。
实施例五体外多酶体系实现以肌氨酸与丙酮酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
选择来源于芽孢杆菌(Bacillus sp)的肌氨酸氧化酶Sox编码基因(EC:1.5.3.1,SEQ ID NO.5),选择来源于菌属(Advenellamimigardefordensis(strain DSM 17166/LMG22922/DPN7))的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶(UniProtKB W0PEX6,SEQ ID NO.2),来源于大肠杆菌的(Escherichia coli)的天HOB还原酶Ecmdh编码基因(EC:1.1.1.37)的突变体MdhE(SEQ ID NO.3),来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的乳酸脱氢酶GsLdh编码基因(EC:1.1.1.27)LdhQ的突变体(SEQ ID NO.4),构建到表达载体pET16b上,获得相应载体:pET16b-Sox,pET16b-AmAld,pET16b-mdhE,pET16b-LdhQ。
将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中,37℃培养至OD600=0.5时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,16℃过夜诱导培养后收集菌体,超声破碎后,使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
通过表达纯化获得通路中三种活性蛋白酶,即肌氨酸氧化酶Sox、醛缩酶AmAld、HOB还原酶mdhE或LdhQ。进一步地,对途径四反应进行了体外催化验证:将途径四中地三步功能元件酶组合在一起,组建体外多酶反应体系,以肌氨酸以及丙酮酸为底物经三步功能元件酶催化生成2,4-二羟基丁酸。
途径四体外多酶反应体系中含有10mM HEPES(pH=7.5),20mM肌氨酸,50mM丙酮酸,10mM NADH,2mM MgCl2,5μM肌氨酸氧化酶,10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶,在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时。检测结果如图5,实验结果表明以20mM肌氨酸为底物,经过通路三步元件酶催化反应,LdhQ组最终可生成7.05mM的2,4-二羟基丁酸,MdhE组最终可生成7.25mM的2,4-二羟基丁酸,实现了非天然合成途径三中以肌氨酸与丙酮酸为底物合成2,4二羟基丁酸的体外搭建。
实施例六体外多酶体系实现以肌氨酸与丙酮酸、乳酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
选择来源于芽孢杆菌(Bacillus sp)的肌氨酸氧化酶Sox编码基因(EC:1.5.3.1,SEQ ID NO.5),选择来源于菌属(Advenellamimigardefordensis(strain DSM 17166/LMG22922/DPN7))的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶(UniProtKB W0PEX6,SEQ ID NO.2),来源于大肠杆菌的(Escherichia coli)的天HOB还原酶Ecmdh编码基因(EC:1.1.1.37)的突变体MdhE(SEQ ID NO.3),来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的乳酸脱氢酶GsLdh编码基因(EC:1.1.1.27)LdhQ的突变体(SEQ ID NO.4),构建到表达载体pET16b上,获得相应载体:pET16b-Sox,pET16b-AmAld,pET16b-mdhE,pET16b-LdhQ。
将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中,37℃培养至OD600=0.5时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,16℃过夜诱导培养后收集菌体,超声破碎后,使用镍离子亲和层析方法进行蛋白的纯化。
通过表达纯化获得通路中三种活性蛋白酶,即肌氨酸氧化酶Sox、醛缩酶AmAld、HOB还原酶mdhE或LdhQ。进一步地,对途径五反应进行了体外催化验证:将途径五中地三步功能元件酶组合在一起,组建体外多酶反应体系,以肌氨酸、丙酮酸以及乳酸为底物经三步功能元件酶催化生成2,4-二羟基丁酸。途径五体外多酶反应体系中含有10mM HEPES(pH=7.5),20mM肌氨酸,50mM乳酸,50mM丙酮酸,10mM NADH,2mM MgCl2,5μM肌氨酸氧化酶,10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶,在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时。检测结果如图6,实验结果表明以20mM肌氨酸为底物,经过通路3步元件酶催化反应,LdhQ组最终可生成5.23mM的2,4-二羟基丁酸,MdhE组最终可生成5.36mM的2,4-二羟基丁酸,实现了非天然合成途径三中以肌氨酸、丙酮酸与乳酸为底物合成2,4-二羟基丁酸的体外搭建。
实施例七体内实现以甲醛为底物合成2,4-二羟基丁酸。
以甲醛为底物,通过将途径一中涉及的醛缩酶、HOB还原酶整合至高拷贝质粒pTrc99a中,构建了甲醛转化为2,4-二羟基丁酸功能性质粒pTrc99a-AmAld-LdhA以及pTrc99a-AmAld-mdhE。同时,构建frmA缺陷型菌株:在模式大肠杆菌W3110中敲除基因frmA,构建了功能性菌株W3110△frmA。其中,敲除基因frmA目的在于弱化细胞内存在的天然谷胱甘肽依赖性甲醛解毒系统(frm RAB)作用,该甲醛解毒途径会将胞内甲醛转化为甲酸和CO2,使得胞内甲醛累积微少,敲除基因frmA将有益于非天然合成途径中甲醛利用。
首先,构建功能性质粒以及菌株:
1)构建途径质粒pTrc99a-AmAld-LdhQ以及pTrc99a-AmAld-mdhE:
首先,构建质粒pTra99a-AmAld:利用相应引物进行PCR扩增获得包含质粒pTrc99a同源序列的AmAld基因片段;然后与双酶切后载体pTra99a(NcoI/SacI)进行Gibson组装连接,获得载体质粒pTra99a-AmAld。
然后,构建包含醛缩酶、HOB还原酶的质粒pTrc99a-AmAld-LdhQ以及pTrc99a-AmAld-mdhE
利用相应引物进行PCR扩增获得包含质粒pTrc99a-AmAld同源序列的HOB还原酶的质粒(LdhQ、mdhE)基因片段;然后与双酶切后载体pTrc99a-AmAld(BamHI/SalI)进行Gibson组装连接,获得载体质粒pTrc99a-AmAld-LdhQ以及pTrc99a-AmAld-mdhE。
2)构建途径重组菌株
将1)中构建的含有醛缩酶基因AmAld,HOB还原酶的基因(LdhQ、mdhE的质粒载体pTrc99a-AmAld-LdhA以及pTrc99a-AmAld-mdhE,分别转入功能性菌株W3110△frmA中,获得重组菌株W3110△frmA(pTrc99a-AmAld-LdhQ)以及重组菌株W3110△frmA(pTrc99a-AmAld-MdhE),抗性为羧苄霉素。
进一步,以甲醛为底物,重组菌株发酵合成2,4二羟基丁酸:
首先在平板上挑取菌株重组菌株W3110△frmA(pTrc99a-AmAld-LdhQ)以及重组菌株W3110△frmA(pTrc99a-AmAld-MdhE)单克隆至含4mL LB培养基的试管中,添加羧苄霉素(50μg/mL),37℃条件下,220rpm/min过夜培养获得种子液。
然后以初始OD600=0.1转接无机盐培养基,同时添加羧苄霉素(50μg/mL)、待菌体OD600=0.5时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,30℃下继续过夜培养。
然后离心收集过夜菌体,用无机盐培养基洗涤3次后重悬,菌体浓度稀释为OD600=5,将30mL重悬菌转移至无菌250mL摇瓶中,同时添加羧苄霉素(50μg/mL)、添加初始浓度为0.5mM甲醛,每2h添加一次,共计添加5mM甲醛,葡萄糖浓度为30g/L,37℃条件下,220rpm培养24h,取1mL样品,离心取上清,并0.22μM过滤膜过滤,制备样品进行液相检测。检测结果如图7,5mM甲醛为底物,LdhQ组最终可生成1.46mM的2,4-二羟基丁酸,MdhE组最终可生成1.49mM的2,4-二羟基丁酸,实现了以甲醛与葡萄糖为底物合成2,4-二羟基丁酸合成通路的体内合成。
实施例八体内实现以甲醇为底物合成2,4-二羟基丁酸。
以甲醇为底物,通过将途径二中涉及的甲醇脱氢酶、醛缩酶、HOB还原酶整合至高拷贝质粒pTrc99a中,构建了甲醇转化为2,4-二羟基丁酸功能性质粒pTrc99a-Bsmdh-AmAld-LdhQ。
首先,构建功能性质粒以及菌株:
1)构建途径质粒pTrc99a-Bsmdh-AmAld-LdhQ与pTrc99a-Bsmdh-AmAld-MdhE:
首先,构建质粒pTra99a-Bsmdh:利用相应引物进行PCR扩增获得包含质粒pTrc99a同源序列的BsMdh基因片段;然后与双酶切后载体pTra99a(Nco I/Sac I)进行Gibson组装连接,获得载体质粒pTra99a-BsMdh。
然后构建质粒pTrc99a-BsMdh-LdhQ与pTrc99a-Bsmdh-MdhE:利用相应引物进行PCR扩增获得包含质粒pTrc99a-BsMdh同源序列的LdhQ基因片段与MdhE基因片段;然后与双酶切后载体pTra99a-BsMdh(BamH I/Sal I)进行Gibson组装连接,获得载体质粒pTra99a-BsMdh-LdhQ与pTra99a-BsMdh-MdhE。
然后构建质粒pTrc99a-BsMdh-AmAld-LdhQ与pTrc99a-Bsmdh-AmAld-MdhE:利用相应引物进行PCR扩增获得包含质粒pTra99a-BsMdh-LdhQ的同源序列的AmAld基因片段;然后与双酶切后载体pTra99a-BsMdh-LdhQ(BamH I/Sac I)进行Gibson组装连接,获得载体质粒pTrc99a-BsMdh-AmAld-LdhQ,同理获得质粒pTrc99a-Bsmdh-AmAld-MdhE。
2)构建途径重组菌株
将1)中构建的含有甲醇脱氢酶基因Bsmdh、醛缩酶基因AmAld,HOB还原酶的基因LdhQ、MdhE的质粒载体pTrc99a-BsMdh-AmAld-LdhQ,pTrc99a-Bsmdh-AmAld-MdhE分别转入功能性菌株W3110△frmA中,获得重组菌株W3110△frmA(pTrc99a-BsMdh-AmAld-LdhQ)以及重组菌株W3110△frmA(pTrc99a-BsMdh-AmAld-MdhE),抗性为羧苄霉素。
进一步,以甲醛为底物,重组菌株发酵合成2,4二羟基丁酸:
首先在平板上挑取菌株重组菌株W3110△frmA(pTrc99a-BsMdh-AmAld-LdhQ)以单克隆至含4mL LB培养基的试管中,添加羧苄霉素(50μg/mL),37℃条件下,220rpm/min过夜培养获得种子液。
然后以初始OD600=0.1转接无机盐培养基,同时添加羧苄霉素(50μg/mL)、待菌体OD600=0.5时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,30℃下继续过夜培养。
然后离心收集过夜菌体,用无机盐培养基洗涤3次后重悬,菌体浓度稀释为OD600=5,将30mL重悬菌转移至无菌250mL摇瓶中,同时添加羧苄霉素(50μg/mL)、添加初始浓度为0.5M甲醇,葡萄糖浓度为30g/L,37℃条件下,220rpm培养24h,取1mL样品,离心取上清,并0.22μM过滤膜过滤,制备样品进行液相检测。检测结果如图7,0.5M甲醇为底物,LdhQ组最终可生成0.38mM的2,4-二羟基丁酸,MdhE组最终可生成0.42mM的2,4-二羟基丁酸,实现了以甲醛与葡萄糖为底物合成2,4-二羟基丁酸合成通路的体内合成。
实施例九体内实现以肌氨酸为底物合成2,4-二羟基丁酸。
以甲醇为底物,通过将途径四中涉及的肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶整合至高拷贝质粒pTrc99a中,构建了甲醇转化为2,4-二羟基丁酸功能性质粒pTrc99a-Sox-AmAld-LdhQ。
首先,构建功能性质粒以及菌株:
1)构建途径质粒pTrc99a-Sox-AmAld-LdhQ:
首先,构建质粒pTra99a-Sox:利用相应引物进行PCR扩增获得包含质粒pTrc99a同源序列的Sox基因片段;然后与双酶切后载体pTra99a(Nco I/Sac I)进行Gibson组装连接,获得载体质粒pTra99a-Sox。
然后构建质粒pTrc99a-Sox-LdhQ:利用相应引物进行PCR扩增获得包含质粒pTrc99a-Sox同源序列的LdhA基因片段;然后与双酶切后载体pTra99a-Sox(BamH I/Sal I)进行Gibson组装连接,获得载体质粒pTra99a-Sox-LdhQ。
然后构建质粒pTrc99a-Sox-AmAld-LdhQ:利用相应引物进行PCR扩增获得包含质粒pTra99a-Sox-LdhQ的同源序列的AmAld基因片段;然后与双酶切后载体pTra99a-Sox-LdhQ(BamH I/Sac I)进行Gibson组装连接,获得载体质粒pTrc99a-Sox-AmAld-LdhQ。
2)构建途径重组菌株
将1)中构建的含有肌氨酸氧化酶基因Sox、醛缩酶基因AmAld,HOB还原酶的基因LdhQ的质粒载体pTrc99a-Sox-AmAld-LdhQ,分别转入功能性菌株W3110△frmA中,获得重组菌株W3110△frmA(pTrc99a-Sox-AmAld-LdhQ),抗性为羧苄霉素。
进一步,以甲醛为底物,重组菌株发酵合成2,4-二羟基丁酸:
首先在平板上挑取菌株重组菌株W3110△frmA(pTrc99a-Sox-AmAld-LdhQ)以单克隆至含4mL LB培养基的试管中,添加羧苄霉素(50μg/mL),37℃条件下,220rpm/min过夜培养获得种子液。
然后以初始OD600=0.1转接无机盐培养基,同时添加羧苄霉素(50μg/mL)、待菌体OD600=0.5时,添加0.1mM IPTG诱导基因表达,30℃下继续过夜培养。
然后离心收集过夜菌体,用无机盐培养基洗涤3次后重悬,菌体浓度稀释为OD600=5,将30mL重悬菌转移至无菌250mL摇瓶中,同时添加羧苄霉素(50μg/mL)、添加初始浓度为5mM肌氨酸,每6h添加一次,共计添加20mM肌氨酸,葡萄糖浓度为30g/L,37℃条件下,220rpm培养24h,取1mL样品,离心取上清,并0.22μM过滤膜过滤,制备样品进行液相检测。检测结果如图9,20mM肌氨酸可生成5.38mM的2,4-二羟基丁酸,实现了以甲醛与葡萄糖为底物合成2,4-二羟基丁酸合成通路的体内合成。
Claims (12)
1.一种2,4-二羟基丁酸的制备方法,其特征在于,包含醛缩酶、HOB还原酶为催化酶,以甲醛与丙酮酸为底物,反应生成2,4-二羟基丁酸;以混合酶催化进行反应或分步催化进行反应,所述反应如下两个反应:
1)醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸;2)HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸;
所述醛缩酶选自氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶;
所述HOB还原酶是氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的苹果酸脱氢酶突变体获得的HOB还原酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的HOB还原酶。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,进一步包括通过甲醛供体作为最初底物合成甲醛的步骤;所述甲醛供体为甲醇、肌氨酸,相应地包括甲醇脱氢酶、肌氨酸氧化酶,经酶促催化反应生成甲醛;
且分别按下述反应过程进行:甲醇脱氢酶催化甲醇生成甲醛;肌氨酸氧化酶催化肌氨酸生成甲醛。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述HOB还原酶是可有效催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2,4-二羟基丁酸的还原酶;
所述甲醇脱氢酶是吡咯喹啉醌依赖型的甲醇脱氢酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NAD依赖型的甲醇脱氢酶、或甲醇氧化酶AOX;
所述肌氨酸氧化酶是氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的肌氨酸氧化酶。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,进一步包括通过丙酮酸供体作为最初底物合成丙酮酸步骤,所述丙酮酸供体是乳酸,相应地包括催化该反应的酶元件:乳酸脱氢酶、或氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的苹果酸脱氢酶突变体获得的HOB还原酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的HOB还原酶,由乳酸经酶促催化反应生成丙酮酸。
5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法,其特征在于,通过包含反应所需的各种酶的体外多酶体系进行催化合成2,4-二羟基丁酸,或者通过过表达反应所需的各种酶的重组菌株制备的催化体系生物合成2,4-二羟基丁酸。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于:
1)通过体外多酶反应体系中含有HEPES,甲醛,丙酮酸,NADH,MgCl2,以及醛缩酶、HOB还原酶,进行催化反应获得2,4-二羟基丁酸;
2)通过体外多酶反应体系中含有HEPES,甲醇,丙酮酸, NAD+,MgCl2,以及甲醇脱氢酶、醛缩酶、HOB还原酶,进行催化反应获得2,4-二羟基丁酸;
3)通过体外多酶反应体系中含有HEPES,甲醛,乳酸,NAD+,MgCl2,以及醛缩酶、HOB还原酶,进行催化反应获得2,4-二羟基丁酸;
4)通过体外多酶反应体系中含有HEPES,肌氨酸,丙酮酸,NADH,MgCl2,以及肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶,进行催化反应获得2,4-二羟基丁酸;
5)通过体外多酶反应体系中含有HEPES,肌氨酸,丙酮酸、乳酸,NADH,MgCl2,以及肌氨酸氧化酶、醛缩酶、HOB还原酶,进行催化反应获得2,4-二羟基丁酸。
7.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于,
1)反应体系中含有8-12 mM HEPES, pH = 7.5,2-200mM甲醛,20-200 mM 丙酮酸,1-50mM NADH,1-10 mM MgCl2 ;1-20μM醛缩酶,1-20μMHOB还原酶; 反应条件为:在25-37℃进行催化反应,反应时间为 12-24个小时;
2)反应体系中含有8-12 mM HEPES, pH = 7.5,0.1-1M甲醇,20-200 mM 丙酮酸,1-50mM NAD+,1-10 mM MgCl2 ;5-40μM甲醇脱氢酶,1-20μM醛缩酶,1-20μMHOB还原酶; 反应条件为:在25-37℃进行催化反应,反应时间为 12-24个小时;
3)反应体系中含有8-12 mM HEPES ,pH = 7.5,2-200mM甲醛,20-200 mM 乳酸,1-50mM NAD+,1-10 mM MgCl2 ;1-20μM醛缩酶,1-20μMHOB还原酶; 反应条件为:在25-37℃进行催化反应,反应时间为 12-24个小时;
4)反应体系中含有8-12 mM HEPES, pH = 7.5,20-200 mM 丙酮酸,5-100mM肌氨酸,1-50mM NADH,1-10 mM MgCl2 ;1-20μM醛缩酶,1-20μMHOB还原酶,1-20μM肌氨酸氧化酶; 反应条件为:在25-37℃进行催化反应,反应时间为 12-24个小时;或;
5)反应体系中含有8-12 mM HEPES, pH = 7.5,20-200 mM 乳酸,5-100mM肌氨酸,1-50mM NADH,1-10 mM MgCl2 ;1-20μM醛缩酶,1-20μMHOB还原酶,1-20μM肌氨酸氧化酶; 反应条件为:在25-37℃进行催化反应,反应时间为 12-24个小时。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,
1)反应体系中含有10 mM HEPES,20mM甲醛,50 mM 丙酮酸,10mM NADH,2mM MgCl2, 10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶; 反应条件为:在30℃进行催化反应,反应时间为 20个小时;
2)反应体系中含有10 mM HEPES,0.5M甲醇,50 mM 丙酮酸,5mM NAD+,2mM MgCl2, 25μM甲醇脱氢酶、10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶; 反应条件为:在30℃进行催化反应,反应时间为20个小时;
3)反应体系中含有10 mM HEPES,20mM甲醛,50 mM 乳酸,5mM NAD+,2mM MgCl2, 10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶; 反应条件为:在30℃进行催化反应,反应时间为 20个小时;
4)反应体系中含有10 mM HEPES,20mM肌氨酸,50 mM 丙酮酸,10mM NADH,2mM MgCl2, 5μM肌氨酸氧化酶, 10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶; 反应条件为:在30℃进行催化反应,反应时间为 20个小时;或者
5)反应体系中含有10 mM HEPES,20mM肌氨酸,50 mM 乳酸,50 mM 丙酮酸,10mM NADH,2mM MgCl2, 5μM肌氨酸氧化酶,10μM醛缩酶,5μMHOB还原酶; 反应条件为:在30℃进行催化反应,反应时间为 20个小时。
9.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,在重组菌株中过表达醛缩酶、HOB还原酶。
10.如权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述重组菌株中进一步过表达甲醇脱氢酶或者肌氨酸氧化酶,由此制备2,4-二羟基丁酸。
11.如权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述重组菌株的出发菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamnicum)、谷草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸菌(Lactic acid bacteria)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、甲基营养菌(Methylorubrum extorquens)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae);由此制备的产品为2,4-二羟基丁酸。
12.如权利要求11所述的制备方法,其特征在于,所述各种酶的表达是在质粒上,或者整合在染色体上。
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