CN117987401A - 用于合成维生素b5的醛缩酶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种醛缩酶及其在合成维生素B5中的用途，酶催化制备维生素B5的方法包括如下步骤：以甲酸和2,2‑二甲基‑3‑羟基丙醛为底物，用醛缩酶和泛酸合成酶联合催化反应，得到维生素B5。本发明开辟了一条生物催化合成维生素B5的新途径，产物光学纯度高，具有开发前景。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，涉及一种醛缩酶突变体，还涉及一种利用醛缩酶和泛酸合成酶例如泛酸-β-丙氨酸连接酶偶联催化甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛反应制备维生素B5的方法。
背景技术
维生素B5(VB5)又称遍多酸或泛酸，CAS号137-08-6，是一种水溶性维生素，它是能量代谢所必需的微量营养素，且是合成辅酶A和酰基载体蛋白的关键前体，辅酶A对脂肪酸代谢和柠檬酸循环至关重要。维生素B5属维生素类药物，是人和动物体内辅酶A的成分之一。在泛酸的异构体中，只有D型具有维生素活性，参与蛋白质、脂肪、碳水化合物的新陈代谢，治疗维生素B缺乏症、周围神经炎以及手术后的肠绞痛等。
维生素B5的合成方法主要是化学法，主要有以下几种：1)将D-泛解酸内酯与3-氨基丙酸钙混合在甲醇介质中发生酰化反应得到维生素B5。2)采用草酸二乙酯-异丁醛-甲醛法合成酮基泛内酯，酮基泛内酯加氢后再用碳酸胍拆分出D-泛酸胍，制得D-泛解酸内酯，与3-氨基丙酸和金属钙反应制备维生素B5。3)采用3-氨基丙腈与氢氧化钠或氢氧化钾反应，后用盐酸中和进行钙离子树脂交换，再与D-泛解酸内酯酰化反应制备维生素B5。以上合成维生素B5的方法耗费时间长，需要大量的化学试剂并对环境造成污染，原料价格昂贵，产物收率低，不利于大规模的工业化生产。
利用生物催化技术制备维生素B5的研究近年来已有报道，例如专利文献CN114657221A报道了使用包含L-氨基酸脱氨酶、甲酸脱氢酶、醛缩酶、酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶的五种酶的复合酶为生物催化剂体系，以缬氨酸、甲醛、β-丙氨酸和甲酸铵四种化合物为底物，合成D-泛酸即维生素B5。基于同样的原理，CN114657199A报道了以缬氨酸、甲醛、甲酸铵、β-丙氨酸为底物，使用分别表达L-氨基酸脱氨酶、甲酸脱氢酶、醛缩酶、酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶的混合菌体为生物催化剂体系，催化合成D-泛酸。发明人对这些方法进行了研究，实验发现这该方法都存在底物转化率低、产物光学纯度低的缺陷；而且，由于底物种类多、酶/菌株种类多且非常用酶类，导致原料成本高昂，不具有工业化可能。
发明内容
为了探索一种高效、经济的VB5生产方法，本研究从生物合成方法改进着手，改变了反应途径，相应地改变了反应底物种类和酶类型，开发出一种新的VB5制备方法。以甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛二种化合物为底物，通过醛缩酶与泛酸合成酶两种酶的联合催化，成功实现了维生素B5的制备，而且D-泛酸产品具有高光学纯度。进一步地，发明人还对该天然酶基因进行定向进化改造，筛选获得了酶活性显著提高的突变体，提高了新制备方法的可行性。因此，本发明包括如下技术方案。
一种醛缩酶突变体，其为选自下组的多肽：
(1)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；
(2)与SEQ ID NO:3有90％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。
MLFFIDTANIDEIKEAYELGTLAGVTTNPSLVAKEADVSFHDRLREITEVVKGSVSAEVISLNAEEMIEEGAELAKIAPNITVKIPMTSEGLKAVKALSDLNIKTNVTLIFSANQALLAARAGATYVSPFLGRLDDIGHNGLELISEIRQHFDLHDIDTQIIAASIRHAQHVTEAALRGAHIGTMPLKFIHQLTKHPLTDKGIEQFLADWNK(SEQ IDNO:3)。
其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的野生醛缩酶SEQ ID NO:1第21位的V替换为T、第72位的K替换为A、第151位的I替换为H、第189位的V替换为F的突变体。野生醛缩酶的氨基酸序列为：
MLFFIDTANIDEIKEAYELGVLAGVTTNPSLVAKEADVSFHDRLREITEVVKGSVSAEVISLNAEEMIEEGKELAKIAPNITVKIPMTSEGLKAVKALSDLNIKTNVTLIFSANQALLAARAGATYVSPFLGRLDDIGHNGLELISEIRQIFDLHDIDTQIIAASIRHAQHVTEAALRGAHIGTMPLKVIHQLTKHPLTDKGIEQFLADWNK(SEQ IDNO:1)。
本发明的第二个方面提供了一种编码上述醛缩酶突变体的基因。例如，编码SEQID NO:3的基因可以是核苷酸序列SEQ ID NO:4。
上述的醛缩酶SEQ ID NO:1及其突变体例如SEQ ID NO:3可以用于合成维生素B5。
本发明的另一个方面提供了一种酶催化制备维生素B5的方法，包括如下步骤：以甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛为底物，用醛缩酶SEQ ID NO:1或者醛缩酶突变体例如SEQID NO:3与泛酸合成酶联合催化反应，得到维生素B5。
可选地，上述泛酸合成酶是一种泛酸-β-丙氨酸连接酶(pantoate-beta-alanineligase)。在一种实施方式中，上述泛酸合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5：MLIIETLPLLRQQIRRLRMEGKRVALVPTMGNLHDGHMKLVDEAKARADVVVVSIFVNPMQFDRPEDLARYPRTLQEDCEKLNKRKVDLVFAPSVKEIYPNGTETHTYVDVPGLSTMLEGASRPGHFRGVSTIVSKLFNLVQPDIACFGEKDFQQLALIRKMVADMGFDIEIVGVPIMRAKDGLALSSRNGYLTAEQRKIAPGLYKVLSSIADKLQAGERDLDEIITIAGQELNEKGFRADDIQIRDADTLLEVSETSKRAVILVAAWLGDARLIDNKMVELA(SEQ ID NO:5)。
可选地，所述维生素B5呈盐形式例如呈泛酸钙形式。
反应体系中，所述醛缩酶、醛缩酶突变体和泛酸合成酶既可以是游离酶，也可以是固定化酶，甚至可以呈表达微生物菌体形式。
反应体系pH值为6.5-8.5，反应温度为15-45℃。
与现有技术相比，本发明开发的联合酶催化法制备维生素B5的工艺所需酶种类少、底物种类少，显著降低了生产成本，而且产物光学纯度高，ee值不低于99％，具有开发应用价值。
具体实施方式
人工设计的级联催化引起了越来越多的关注，因为能够从简单、廉价和容易获得的起始底物出发一锅法高效地合成目标化合物。例如，默克公司使用五酶体外级联反应合成抗病毒核苷类似物islatravir就是一个突出案例。采用多酶偶连或级联反应的两种以上酶联合催化是开发维生素B5生产工艺的一个研究方向。
要在级联催化中实现高效的靶向化合物生产，需要很好地解决生物催化路线设计、酶选择和酶组装三个问题。随着计算生物学、酶学和合成生物学的快速发展，已经开发出越来越多的技术来解决上述三个问题，包括(i)已经建立的计算工具，如逆转录合成、RetroPath2.0和RetroBioCat指导逆向合成并促进路线设计过程；(ii)有效的酶筛选方法，如文献挖掘和基因组挖掘，以及先进的酶工程方法，如半理性设计和机器学习，已用于鉴定具有所需特性的适当酶；(iii)酶表达调控策略，例如启动子/RBS优化、多质体系统、基因拷贝修饰和微生物菌群介导的途径重构，已用于解决组装时酶活性或表达比不平衡的问题、设计的一锅体内/体外生物催化级联中的酶。最后，通过优化反应条件，可以实现目标化合物的高效生产。
在本研究中，我们设计了一种基于逆合成分析的VB5生物催化合成途径。级联路线是使用RetroBioCat(https://retrobiocat.com/)在通路浏览器模式或网络浏览器模式下设计的。在Pathway Explorer模式下，发现了一条VB5合成路线。这种生物催化级联通过使用市场上容易获得的甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛作为底物、醛缩酶和泛酸合成酶两酶组合进行催化，成功实现了维生素B5的制备。
发明人对于醛缩酶和泛酸合成酶进行了广泛筛选，最终发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的醛缩酶SEQ ID NO:1和大肠杆菌(Escherichia coli(strainK12))来源的泛酸合成酶SEQ ID NO:5能够用于催化甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛反应合成VB5。
野生型醛缩酶SEQ ID NO:1的酶活力较低，有必要进行突变来提高其酶活力，以便获得酶活大幅度提高的突变酶。
在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQID NO:1的醛缩酶。相应地，野生酶的突变体可以称为“突变酶”。为了表述方便起见，在本文中可以将野生型醛缩酶与其突变体统称为“醛缩酶”。
本文中，上述所用术语“(酶活力)提高”或“增加”表示相较于参考水平提高至少10％，例如相较于参考水平提高至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或最高达并包括100％的提高，或者在10％-100％之间的任意提高，或相较于参考水平的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的提高。
所述的“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。
“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。
“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％或多达构成参考酶的氨基酸总数的20％，同时保留酶活性和/或保留工程化醛缩酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。
“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化醛缩酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的醛缩酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的醛缩酶多肽中。插入可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
突变酶SEQ ID NO:3是野生酶SEQ ID NO:1的V21T、K72A、I151H、V189F的突变体，酶活力提高了近50倍。
醛缩酶及其突变体可以通过基因工程菌发酵方法得到，基于SEQ ID NO:1或其突变体SEQ ID NO:3的氨基酸序列，本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
本领域技术人员通过所熟知的基因工程构建方式可以容易地获得这些基因、表达盒、质粒、转化体。
为了在微生物宿主例如基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达醛缩酶SEQID NO:1或其突变体SEQ ID NO:3，本发明对其表达基因进行了密码子优化。
密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。例如，经过密码子优化，醛缩酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQID NO:2，突变酶SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。
在反应体系中，醛缩酶既可以呈现酶的形式，也可以呈现菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。
生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH＝7.2，121℃高温高压灭菌20min。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4·3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH＝7.0-7.5(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉)，121℃高温高压灭菌20min。
斜面培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、20g/L琼脂粉，混匀后按30-40mL装液量分装到茄子瓶，竖立放置于121℃高温高压灭菌20min，降温后加入100μg/mL硫酸卡那霉素，摆放成斜面，待冷凝成固体即可。
产物VB5含量液相检测条件：
HPLC检测方法：安捷伦1260；Kromasil100 C18色谱柱(250×4mm，5μm)；流动相A:10mM乙酸钠，pH＝6.00；流动相B:85％乙腈水溶液；衍生剂：0.1372g邻苯二甲醛和0.0589gN-异丁酰-L-半胱氨酸，用0.1M硼酸缓冲液(pH＝10.4)定容至10ml；进样量：5μl；柱温30℃；流速：1ml/min；检测波长：315nm。
实施例1：泛酸合成酶的大肠杆菌表达和提取
1.1菌株构建：根据在NCBI数据库中大肠杆菌(Escherichia coli(strain K12))来源的泛酸合成酶的氨基酸序列SEQ ID NO:5(GenBank:AAA24272.1)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成其编码基因序列SEQ ID NO:6。在基因两端设计限制性内切酶位点EcoR I和Hind II，亚克隆到载体pET 24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒。使用电转法将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中，得到表达泛酸合成酶SEQID NO:5的重组大肠杆菌。
1.2摇瓶发酵：从LB培养平板上挑取单菌落，接种至含有50μg/mL的硫酸卡那霉素LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。按照1％v/v的比例，将过夜培养物分别转接至1L含有50μg/mL硫酸卡那霉素的TB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度0.05mM的IPTG，28℃，180rpm培养过夜。然后于4℃，5000rpm，离心20min，收集菌体。
1.3酶的提取纯化：菌体用50mL平衡缓冲液(20mM磷酸钾盐缓冲液，200mM NaCl，pH7.0)重悬，然后超声破碎，破碎后的菌体于4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。上清以1mL/min的速率加入含10mL Ni-NAT基质的亲和层析柱中，然后用含有50mM咪唑的平衡缓冲液冲洗柱料，洗脱杂质。最后用含有400mM咪唑的平衡缓冲液洗脱目的蛋白，收集峰值洗脱液。对洗脱液进行透析脱盐处理，得纯酶，置2℃冰箱保存备用。
实施例2：野生型醛缩酶的的大肠杆菌表达和提取
2.1根据Bacillus subtilis来源的野生型醛缩酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1，以此为基础进行密码子优化，全基因合成编码基因序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点Hind II和EcoR V，亚克隆到载体pET 24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒。将重组质粒电转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中，得到表达野生型醛缩酶的重组大肠杆菌。
2.2参照实施例1步骤1.2和1.3的方法，提取并纯化野生型醛缩酶。
实施例3：双酶联合催化合成维生素B5
3.1配制反应液：反应底物液包括，150mM 2,2-二甲基-3-羟基丙醛，150mM甲酸。
3.2催化合成维生素B5
在100μl反应底物液中分别加入30μl步骤1.3中获得的脱盐泛酸合成酶纯酶和30μl步骤2.2中获得的脱盐醛缩酶纯酶，70μl纯水，45℃水浴，反应30min，测定酶活力。
泛酸合成酶或醛缩酶的酶活单位(U)定义为1mL底物溶液在1分钟内转化生成1μmol维生素B5的酶量。
HPLC检测结果证实了醛缩酶SEQ ID NO:1和泛酸合成酶SEQ ID NO:5的组合确实能够催化反应底物液中的甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛反应生成维生素B5。
3.3纯酶比活力估计
为了能够直观评估纯酶比活力，可以通过测定反应后溶液在340nm的吸光值变化来判断活力的大小。同时采用Thermo Scientific公司的BCA Protein Assay Kit试剂盒测定纯酶的蛋白浓度，从而获得纯酶的比活力。
实施例4：醛缩酶突变体库的构建和筛选
为了进一步提高醛缩酶的比活力，有必要对野生型醛缩酶进行突变，包括如下步骤。
4.1对于实施例2中构建的野生型醛缩酶表达工程菌，使用试剂盒从发酵菌株中抽提质粒，作为易错PCR模板。设计如下引物对进行易错PCR：
正向引物：5'-AAGCTTTGGAGTTACAACAA-3'，
反向引物：5’-CTATAGCCAACGAAAGGAGAA-3’。
50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒模板，50pmol引物对，1×Taq buffer，0.2mMdGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(Takara)。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。
对PCR产物切胶回收。以质粒为模板，以约1.0kb的回收产物(随机突变片段)作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做Mega Primer PCR。PCR反应条件为：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kb，25个循环；68℃10min。
Dpn I限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化E.coli BL21(DE3)感受态，得到超过104个克隆的随机突变库。
4.2突变体库的高通量筛选
选取突变体库中每个备选菌株的LB平板菌落，接种到含700μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/mL卡那霉素，37℃培养6h后，加入终浓度0.1mM IPTG后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL含50mM Tris-HCl(pH7.5)，重悬菌体，用于活力测定。
按照实施例3中步骤3.3的方法，对突变文库中的菌株进行酶活力测定，筛选酶活最高的菌株进行基因组测序，通过基因比对，确定氨基酸突变位点，且活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株，重复随机突变库建立及高通量筛选。
经过3轮筛选，得到一株酶活力比野生酶提高了近50倍的突变菌株，命名为E.coliALD-2。经基因测序，确定编码醛缩酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，对应的醛缩酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，相对于原始酶SEQ ID NO:1发生了4个位点的氨基酸突变，分别是V21T、K72A、I151H和V189F。
实施例5：维生素B5的合成
参照实施例1步骤1.2和1.3的方法，对于突变菌株E.coli ALD-2进行发酵培养、酶提取和纯化，得到醛缩酶突变体纯酶液，用于维生素B5的合成试验。在如下体系中进行反应。
500ml反应体系：300mM甲酸，300mM 2,2-二甲基-3-羟基丙醛，0.1mg/ml泛酸合成酶纯酶，醛缩酶突变体纯酶10U/ml，用氢氧化钠校正反应体系pH保持7.4，37℃反应3小时后，补加10U/ml醛缩酶突变体纯酶，继续反应至6-10小时，取样离心后，上清过0.22μm膜后，直接进行HPLC分析，最终确定反应7小时，底物2,2-二甲基-3-羟基丙醛转化率超过92％，产物ee值大于99％，提示本发明的合成路线具有工业化开发前景。
Claims (10)
1.一种醛缩酶突变体，其为选自下组的多肽：
(1)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；
(2)与SEQ ID NO:3有90％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。
2.编码如权利要求1所述醛缩酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的基因是核苷酸序列SEQID NO:4。
4.如权利要求1所述的醛缩酶突变体在合成维生素B5中的用途。
5.一种酶催化制备维生素B5的方法，包括如下步骤：以甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛为底物，用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的醛缩酶或者如权利要求1所述的醛缩酶突变体与泛酸合成酶联合催化反应，得到维生素B5。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述泛酸合成酶是一种泛酸-β-丙氨酸连接酶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述泛酸合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，维生素B5呈盐形式例如呈泛酸钙形式。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述醛缩酶、醛缩酶突变体和泛酸合成酶为游离酶或者固定化酶。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系pH值为6.5-8.5，反应温度为15-45℃。
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