CN113265382B - 多聚磷酸激酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，该突变体的酶活力比野生酶提高了至少3倍，能够用于提升微生物再生ATP的能力。

Description

多聚磷酸激酶突变体
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体地说，涉及一种多聚磷酸激酶突变体及其在提升微生物再生ATP能力方面的用途。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)是生物体内最重要的高能磷酸化合物，临床上可用作治疗脑血管疾病、进行性肌萎缩、脑损伤、心机能不全、肾炎、心肌炎及肝炎等疾病的辅酶类药物。在生物催化的过程中，ATP作为生物合成中的能量货币，参与细胞内多酶催化，ATP作为能量供体推动反应的顺利进行，因此工业上常用来参与许多生物催化反应，用于高值化合物的合成。但是，ATP价格较高，限制了其在工业中的应用。
开发可高效进行ATP循环再生的反应体系，是解决工业应用瓶颈的重要策略。其中，以无机多聚磷酸为磷酸供体，使用多聚磷酸激酶作为催化剂，可实现ADP或AMP生成ATP，ATP可进一步用于目标化学反应。因此，通过多聚磷酸酶(PPK)进行ATP再生的极具应用前景。众所周知，不同来源的PPK的酶催化特点各不相同。例如，专利文献CN108795958A报道了来源于大肠杆菌的PPK1(EcPPK)已应用于葡萄糖-6-磷酸的生产及低聚糖合成等；来源于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的PPK2(SmPPK2)可用于ADP的磷酸化形成ATP；来源于约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)的PPK2(AjPPK2)和来源于节杆菌(Arthrobacter sp.CGMCC No.3584)的PPK可用于AMP的磷酸化形成ATP；来源于嗜热生物嗜热蓝细菌(Thermosynechococcus elongates)和嗜热菌(Thermus thermophilus)的重组PPK1被应用于耐高温的ATP依赖型反应中。但目前这些酶的催化效率普遍偏低，因此开发获得较高催化活力的酶具有重要经济性。
发明人对于多种微生物来源的多聚磷酸激酶用于ATP循环再生系统进行了大量研究，例如在之前的专利文献CN111254129A中报道了一种源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)来源的多聚磷酸激酶(PPK2)及其突变体，可作为ATP再生剂可促进谷胱甘肽合成酶催化法生产谷胱甘肽，但该突变体的酶活力仍达不到进行工业化大规模生产谷胱甘肽的要求。
发明内容
发明人在对于多种微生物来源的多聚磷酸激酶进行的研究中，还关注到约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)来源的多聚磷酸激酶(GenBank登录号为AB092983.1，简写为ajPPK2或PPK2)即SEQ ID NO:1的酶分子的分子量和氨基酸数量(475个)比其他来源的多聚磷酸激酶(氨基酸数量一般是300个左右)要大一些，根据生物信息学模拟的酶活性中心结构也与众不同，并且催化特点也与许多其他微生物来源的多聚磷酸激酶不同，能够有效地作为ATP再生剂催化AMP转化为ATP。为了进一步提高其酶活力，对其活性中心进行了研究和突变，并获得了酶活力明显提高的突变体。因此，本发明包括如下技术方案。
一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其为野生型多聚磷酸激酶(AjPPK2)的氨基酸序列SEQ ID NO:1第177位的L(亮氨酸，Leu)替换为H(组氨酸，His)、第214位的F(苯丙氨酸，Phe)替换为P(脯氨酸，Pro)的突变体：
MDTETIASAVLNEEQLSLDLIEAQYALMNTRDQSNAKSLVILVSGIELAGKGEAVKQLREWVDPRFLYVKADPPHLFNLKQPFWQPYTRFVPAEGQIMVWFGNWYGDLLATAMHASKPLDDTLFDEYVSNMRAFEQDLKNNNVDVLKVWFDLSWKSLQKRLDDMDPSEVHWHKLHGHDWRNKKQYDTLQKLRTRFTDDWQIIDGEDEDLRNHNPAQAILTALRHCPEHEKKAALKWQQAPIPDILTQFEVPQAEDANYKSELKKLTKQVADAMRCDDRKVVIAFEGMDAAGKGGAIKRIVKKLDPREYEIHTIAAPEKYELRRPYLWRFWSKLQSDDITIFDRTWYGRVLVERVEGFATEVEWQRAYAEINRFEKNLSSSQTVLIKFWLAIDKDEQAARFKARESTPHKRFKITEEDWRNRDKWDDYLKAAADMFAHTDTSYAPWYIISTNDKQQARIEVLRAILKQLKADRDTD(SEQ ID NO:3)。
根据本发明的第二个方面，提供了编码上述多聚磷酸激酶突变体的基因。
优选地，当大肠杆菌作为宿主表达上述多聚磷酸激酶突变体时，编码多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4：
ATGGATACCGAAACCATTGCGAGCGCGGTGCTGAACGAAGAACAGCTGAGCCTGGATCTGATTGAAGCGCAGTATGCGCTGATGAACACCCGCGATCAGAGCAACGCGAAAAGCCTGGTGATTCTGGTGAGCGGCATTGAACTGGCGGGCAAAGGTGAAGCGGTGAAACAGCTGCGCGAATGGGTGGATCCGCGCTTTCTGTATGTTAAGGCGGATCCGCCGCATCTGTTTAACCTGAAACAGCCGTTTTGGCAGCCGTATACCCGCTTTGTGCCGGCGGAAGGTCAGATTATGGTGTGGTTTGGCAACTGGTATGGCGATCTGCTGGCGACCGCGATGCATGCGAGCAAACCGCTGGATGATACCCTGTTTGATGAATATGTGAGCAACATGCGCGCGTTTGAACAAGATCTGAAAAACAATAACGTGGATGTGCTGAAAGTGTGGTTTGATCTGAGCTGGAAAAGCCTGCAGAAACGCCTGGATGATATGGATCCGAGCGAAGTGCATTGGCATAAACTGCATGGCCATGATTGGCGCAACAAAAAACAGTATGATACCCTGCAGAAACTGCGCACCCGCTTTACCGATGATTGGCAGATTATTGATGGCGAAGATGAAGATCTGCGCAACCATAACCCGGCGCAAGCGATTCTGACCGCGCTGCGCCATTGCCCGGAACATGAAAAAAAAGCGGCGCTGAAATGGCAGCAAGCGCCGATTCCGGATATTCTGACGCAGTTTGAAGTGCCGCAAGCGGAAGATGCGAACTATAAAAGCGAACTGAAAAAACTGACCAAACAAGTGGCGGATGCGATGCGCTGCGATGATCGCAAAGTGGTGATTGCGTTTGAAGGCATGGATGCGGCGGGCAAGGGTGGTGCCATTAAACGCATTGTGAAAAAACTGGATCCGCGCGAATATGAAATTCATACCATTGCGGCGCCGGAAAAATATGAACTGCGCCGCCCGTATCTGTGGCGCTTTTGGAGCAAACTGCAGAGCGATGATATTACCATTTTTGATCGCACCTGGTATGGCCGCGTGCTGGTGGAACGCGTGGAAGGCTTTGCGACCGAAGTGGAATGGCAGCGCGCGTATGCGGAAATTAACCGCTTTGAAAAAAACCTGAGCAGTAGTCAGACCGTGCTGATTAAATTTTGGCTGGCGATTGATAAAGATGAACAAGCGGCGCGCTTTAAAGCGCGCGAAAGCACCCCGCATAAACGCTTTAAAATTACCGAAGAAGATTGGCGCAATCGCGATAAATGGGATGATTATCTGAAAGCGGCCGCGGATATGTTTGCGCATACCGATACGAGCTATGCGCCGTGGTATATTATTAGCACCAACGATAAACAGCAAGCGCGCATTGAAGTGCTGCGCGCGATTCTGAAACAGCTGAAGGCGGATCGCGATACCGAT(SEQ ID NO:4)。
根据本发明的第三个方面，提供了包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。
根据本发明的第四个方面，提供了表达上述多聚磷酸激酶突变体的微生物。例如，转化子是转化了上述质粒、可表达上述多聚磷酸激酶突变体的微生物。
应当理解，上述微生物需要ATP再生系统，以便将ADP或AMP转化为ATP。优选该微生物是能够作为生物催化剂用于催化依赖于ATP的特定反应的工业微生物。更优选微生物具有催化底物谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成L-谷胱甘肽的能力。
优选地，上述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
优选地，当大肠杆菌作为宿主时，所述多聚磷酸激酶突变体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
本发明构建的多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:3能够以六聚偏磷酸钠作为底物，高效地催化高能磷酸键转移至AMP上，生成ADP，并进一步产生ATP，实现以多聚偏磷酸为底物的ATP再生系统的工业化应用、尤其是在依赖于ATP的微生物催化或者酶催化反应体系中的应用，值得进一步开发利用。
附图说明
图1为用于表达多聚磷酸激酶ajPPK2的质粒pET24-ajPPK2图谱。
具体实施方式
发明人为了提高野生型多聚磷酸激酶SEQ ID NO:1的酶活力，应用易错PCR技术对其编码基因SEQ ID NO:2进行突变，构建随机突变体库，并从中筛选出酶活力提高2倍以上的突变体。通过两轮随机突变，获得几株酶活力明显提高的突变体，其中L177H、F214P突变体的酶活力提高了3倍多。
突变体酶活力的提高预示着表达该酶的微生物内ATP再生能力的提高或者赋予微生物ATP再生能力。为此，可将多聚磷酸激酶突变体基因构建到pET系统质粒中，并转化入微生物宿主中，实现突变酶的在微生物细胞内的表达，从而促进依赖于ATP的生物催化反应。
为了在微生物宿主例如基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:3，本发明对其表达基因进行了密码子优化。
密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
经过密码子优化，野生型多聚磷酸激酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ IDNO:2，而多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。
在本发明中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多聚磷酸激酶aiPPK2。类似地，可以将多聚磷酸激酶突变体简称为“突变酶”。有时为了表述方便起见，在本发明中可以将野生型多聚磷酸激酶与其突变体统称为“多聚磷酸激酶”。
本发明的多聚磷酸激酶突变体的氨基酸数量只有475个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
酶活力测定
酶反应体系及反应条件：0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，20mM MgCl2，1.5mM AMP，1.5mM六聚偏磷酸钠，溶解完全后，用氢氧化钠校正pH8.0，定容至10ml。然后加入10mg多聚磷酸激酶，在30℃的条件下，反应15min，通过HPLC检测ATP含量。
酶活定义：30℃下，每分钟生成1微摩尔ATP所需要的酶量定义为一个酶活单位U。
ATP含量HPLC检测条件：
仪器 安捷伦1260
色谱柱 C18(4.6mm*250mm*5μm)
流动相A 磷酸三乙胺水溶液(磷酸含量0.6％(v/v))，用三乙胺调pH至6.6
流动相B 甲醇
A：B 90：10
流速 1mL/min
柱温 30℃
波长 254nm
进样量 20μL
实施例1：表达野生型多聚磷酸激酶的重组大肠杆菌的构建
对于Acinetobacter johnsonii来源的多聚磷酸激酶(GenBank登录号为AB092983.1)的氨基酸序列SEQ ID NO:1，进行密码子优化，优化后的基因序列为SEQ IDNO:2。全基因合成核苷酸序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点XhoI和Nde I，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-ajPPK2，如图1所示。
将重组质粒pET24a-ajPPK2电转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达野生型多聚磷酸激酶的重组大肠杆菌PET24a-ajPPK2/BL21(DE3)。
实施例2：多聚磷酸激酶的诱导表达与纯化
对于实施例1中构建的大肠杆菌ajPPK2，在其LB培养平板上挑取单菌落，接种至含有4ml的50μg/mL硫酸卡那霉素LB培养基的试管中，37℃培养15h后为一级种子液，将一级种子液按1v/v％接种量接种至装有100ml TB培养基的三角瓶中，至OD600为0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG，于28℃，200rpm培养过夜。然后于4℃，10000rpm，离心10min，分别收集菌体，-20℃冷冻过夜。
将收集到的菌体用10ml，0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬菌体，超声破碎(200W，超1.5s，停3.5s，共10min)。4℃，10000rpm，离心30min，得到PPK2粗酶液。
粗酶液采用Ni-NTG亲和层析柱(南京金瑞斯生物，产品编号：L00250/L00250-C)纯化目的蛋白，纯化后的ajPKK2蛋白大小约为55.8kDa。
经测定，ajPKK2纯酶的酶活大约为2500U/mg。
实施例3：粗酶催化ATP再生的考察
为了考察采用低成本粗酶液催化ATP再生的实用性，对实施例2中的PKK2粗酶进行考察。
酶反应体系及反应条件：0.1M Tris-HCl缓冲液(PH8.0)，20mM MgCl2，2.5mM AMP，2.5mM六聚偏磷酸钠，溶解完全后，用氢氧化钠校正PH8.0，定容至8ml。然后加入2ml实施例2中的PKK2粗酶，在30℃的条件下，反应2h，通过HPLC对AMP、ADP和ATP定量分析，其中AMP1mM，ADP 1M，ATP 0.5mM，即ATP生成率为20％。
该检测结果证明多聚磷酸激酶能够以六聚偏磷酸钠为底物，催化高能磷酸键转移至AMP上，生成ADP，并进一步产生ATP。
实施例4：易错PCR法构建随机突变库及筛选
为了提高野生型多聚磷酸激酶的酶活力，通过基因工程进行氨基酸序列改造，筛选酶活力提高的突变体。
4.1第一轮易错PCR法构建随机突变库
以野生酶的基因为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。针对基因序列SEQID NO:2，设计下述引物对：
正向引物ajPPK2-F：ggtggtggtgctcgagATCGGTATC，
反向引物ajPPK2-R：catATGGATACCGAAACCATTGCG。
50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒模板pET24a-ajPPK2，50pmol一对引物ajPPK2-F和ajPPK2-R，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mMMgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(fermentas公司)。
PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min/kbp；30个循环；72℃10min。
胶回收1kbp随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimerPCR：94℃ 5min，；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃ 2min/kbp，25个循环；68℃ 10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的随机突变库。
4.2后续易错PCR法构建随机突变库
以前一轮随机突变库筛选出的最优菌株的质粒作为模板，以ajPPK2-F和ajPPK2-R为引物，再次进行易错PCR突变库的构建，易错PCR反应体系同上述步骤4.1。
4.3突变体库的高通量筛选培养
选取步骤4.2构建的突变体库中的转化子，接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，培养过夜，然后取80μl过夜培养物，转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.4mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。10000rpm离心10min，弃上清，加入100μL含无菌水重悬菌体用于酶活力测定。
4.4高通量筛选
将上述步骤4.3中100μL菌悬液加入100μL底物反应液(0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，40mM MgCl2，5mM AMP，5mM六聚偏磷酸钠，溶解完全后，用氢氧化钠校正pH8.0)，在30℃的条件下，反应1h，4℃，10000rpm离心5min。取离心上清，取20μL上清HPLC检测ATP含量。
通过两轮随机突变，筛选大约6000个突变体克隆，获得二株酶活力明显提高的突变株ajPPK2-Mut1和ajPPK2-Mut2。委托苏州金唯智生物科技有限公司对突变株ajPPK2-Mut2的基因组进行测序，通过与野生型ajPPK2进行序列对比，确认该突变酶的突变位点为L177H、F214P。
4.5突变体酶活力测定
针对突变酶的氨基酸序列SEQ ID NO:3，通过密码子优化设计出编码基因序列SEQID NO:4。
按照实施例1的方法，全基因合成核苷酸序列SEQ ID NO:4，并在基因两端设计限制性内切酶位点XhoI和Nde I，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-ajPPK2-Mut2。
将重组质粒pET24a-ajPPK2-Mut2电转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达突变酶SEQ ID NO:3的重组大肠杆菌PET24a-ajPPK2/BL21(DE3)。
按照实施例2的方法，用重组大肠杆菌PET24a-ajPPK2-Mut2/BL21(DE3)表达突变酶，提取、纯化，测定纯酶的酶活力。
经HPLC法测定，突变体纯酶的酶活力大约为8200U/mg，高于野生酶的3倍。
实施例5：突变体粗酶催化ATP再生的考察
采用重组大肠杆菌PET24a-ajPPK2-Mut2/BL21(DE3)的粗酶液，配制酶反应体系，考察采用突变体粗酶液催化ATP再生的可行性，并以野生酶ajPPK2为对照。
酶反应体系及反应条件：0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，20mM MgCl2，2.5mM AMP，2.5mM六聚偏磷酸钠，溶解完全后，用氢氧化钠校正pH8.0，定容至8ml。然后加入2ml粗酶液，在30℃的条件下，反应2h，通过HPLC对AMP，ADP，ATP定量分析。
结果显示，野生酶ajPPK2的ATP生成量为0.5mM，而突变酶ajPPK2-Mut2的ATP生成量为2.1mM，ajPPK2-Mut2粗酶催化ATP再生能力至少提高了300％。
综上所述，相比野生型多聚磷酸激酶，本发明构建的多聚磷酸激酶突变体SEQ IDNO:3催化ATP再生的能力提升明显，可以将其应用于需要ATP的生物合成体系中，值得进一步开发。
序列表
<110> 洛阳华荣生物技术有限公司
<120> 多聚磷酸激酶突变体
<130> SHPI2110201
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 475
<212> PRT
<213> Acinetobacter johnsonii
<400> 1
Met Asp Thr Glu Thr Ile Ala Ser Ala Val Leu Asn Glu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Ser Leu Asp Leu Ile Glu Ala Gln Tyr Ala Leu Met Asn Thr Arg Asp
20 25 30
Gln Ser Asn Ala Lys Ser Leu Val Ile Leu Val Ser Gly Ile Glu Leu
35 40 45
Ala Gly Lys Gly Glu Ala Val Lys Gln Leu Arg Glu Trp Val Asp Pro
50 55 60
Arg Phe Leu Tyr Val Lys Ala Asp Pro Pro His Leu Phe Asn Leu Lys
65 70 75 80
Gln Pro Phe Trp Gln Pro Tyr Thr Arg Phe Val Pro Ala Glu Gly Gln
85 90 95
Ile Met Val Trp Phe Gly Asn Trp Tyr Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ala
100 105 110
Met His Ala Ser Lys Pro Leu Asp Asp Thr Leu Phe Asp Glu Tyr Val
115 120 125
Ser Asn Met Arg Ala Phe Glu Gln Asp Leu Lys Asn Asn Asn Val Asp
130 135 140
Val Leu Lys Val Trp Phe Asp Leu Ser Trp Lys Ser Leu Gln Lys Arg
145 150 155 160
Leu Asp Asp Met Asp Pro Ser Glu Val His Trp His Lys Leu His Gly
165 170 175
Leu Asp Trp Arg Asn Lys Lys Gln Tyr Asp Thr Leu Gln Lys Leu Arg
180 185 190
Thr Arg Phe Thr Asp Asp Trp Gln Ile Ile Asp Gly Glu Asp Glu Asp
195 200 205
Leu Arg Asn His Asn Phe Ala Gln Ala Ile Leu Thr Ala Leu Arg His
210 215 220
Cys Pro Glu His Glu Lys Lys Ala Ala Leu Lys Trp Gln Gln Ala Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ile Leu Thr Gln Phe Glu Val Pro Gln Ala Glu Asp Ala
245 250 255
Asn Tyr Lys Ser Glu Leu Lys Lys Leu Thr Lys Gln Val Ala Asp Ala
260 265 270
Met Arg Cys Asp Asp Arg Lys Val Val Ile Ala Phe Glu Gly Met Asp
275 280 285
Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Lys Arg Ile Val Lys Lys Leu Asp
290 295 300
Pro Arg Glu Tyr Glu Ile His Thr Ile Ala Ala Pro Glu Lys Tyr Glu
305 310 315 320
Leu Arg Arg Pro Tyr Leu Trp Arg Phe Trp Ser Lys Leu Gln Ser Asp
325 330 335
Asp Ile Thr Ile Phe Asp Arg Thr Trp Tyr Gly Arg Val Leu Val Glu
340 345 350
Arg Val Glu Gly Phe Ala Thr Glu Val Glu Trp Gln Arg Ala Tyr Ala
355 360 365
Glu Ile Asn Arg Phe Glu Lys Asn Leu Ser Ser Ser Gln Thr Val Leu
370 375 380
Ile Lys Phe Trp Leu Ala Ile Asp Lys Asp Glu Gln Ala Ala Arg Phe
385 390 395 400
Lys Ala Arg Glu Ser Thr Pro His Lys Arg Phe Lys Ile Thr Glu Glu
405 410 415
Asp Trp Arg Asn Arg Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Leu Lys Ala Ala Ala
420 425 430
Asp Met Phe Ala His Thr Asp Thr Ser Tyr Ala Pro Trp Tyr Ile Ile
435 440 445
Ser Thr Asn Asp Lys Gln Gln Ala Arg Ile Glu Val Leu Arg Ala Ile
450 455 460
Leu Lys Gln Leu Lys Ala Asp Arg Asp Thr Asp
465 470 475
<210> 2
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggataccg aaaccattgc gagcgcggtg ctgaacgaag aacagctgag cctggatctg 60
attgaagcgc agtatgcgct gatgaacacc cgcgatcaga gcaacgcgaa aagcctggtg 120
attctggtga gcggcattga actggcgggc aaaggtgaag cggtgaaaca gctgcgcgaa 180
tgggtggatc cgcgctttct gtatgttaag gcggatccgc cgcatctgtt taacctgaaa 240
cagccgtttt ggcagccgta tacccgcttt gtgccggcgg aaggtcagat tatggtgtgg 300
tttggcaact ggtatggcga tctgctggcg accgcgatgc atgcgagcaa accgctggat 360
gataccctgt ttgatgaata tgtgagcaac atgcgcgcgt ttgaacaaga tctgaaaaac 420
aataacgtgg atgtgctgaa agtgtggttt gatctgagct ggaaaagcct gcagaaacgc 480
ctggatgata tggatccgag cgaagtgcat tggcataaac tgcatggcct ggattggcgc 540
aacaaaaaac agtatgatac cctgcagaaa ctgcgcaccc gctttaccga tgattggcag 600
attattgatg gcgaagatga agatctgcgc aaccataact ttgcgcaagc gattctgacc 660
gcgctgcgcc attgcccgga acatgaaaaa aaagcggcgc tgaaatggca gcaagcgccg 720
attccggata ttctgacgca gtttgaagtg ccgcaagcgg aagatgcgaa ctataaaagc 780
gaactgaaaa aactgaccaa acaagtggcg gatgcgatgc gctgcgatga tcgcaaagtg 840
gtgattgcgt ttgaaggcat ggatgcggcg ggcaagggtg gtgccattaa acgcattgtg 900
aaaaaactgg atccgcgcga atatgaaatt cataccattg cggcgccgga aaaatatgaa 960
ctgcgccgcc cgtatctgtg gcgcttttgg agcaaactgc agagcgatga tattaccatt 1020
tttgatcgca cctggtatgg ccgcgtgctg gtggaacgcg tggaaggctt tgcgaccgaa 1080
gtggaatggc agcgcgcgta tgcggaaatt aaccgctttg aaaaaaacct gagcagtagt 1140
cagaccgtgc tgattaaatt ttggctggcg attgataaag atgaacaagc ggcgcgcttt 1200
aaagcgcgcg aaagcacccc gcataaacgc tttaaaatta ccgaagaaga ttggcgcaat 1260
cgcgataaat gggatgatta tctgaaagcg gccgcggata tgtttgcgca taccgatacg 1320
agctatgcgc cgtggtatat tattagcacc aacgataaac agcaagcgcg cattgaagtg 1380
ctgcgcgcga ttctgaaaca gctgaaggcg gatcgcgata ccgat 1425
<210> 3
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Met Asp Thr Glu Thr Ile Ala Ser Ala Val Leu Asn Glu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Ser Leu Asp Leu Ile Glu Ala Gln Tyr Ala Leu Met Asn Thr Arg Asp
20 25 30
Gln Ser Asn Ala Lys Ser Leu Val Ile Leu Val Ser Gly Ile Glu Leu
35 40 45
Ala Gly Lys Gly Glu Ala Val Lys Gln Leu Arg Glu Trp Val Asp Pro
50 55 60
Arg Phe Leu Tyr Val Lys Ala Asp Pro Pro His Leu Phe Asn Leu Lys
65 70 75 80
Gln Pro Phe Trp Gln Pro Tyr Thr Arg Phe Val Pro Ala Glu Gly Gln
85 90 95
Ile Met Val Trp Phe Gly Asn Trp Tyr Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ala
100 105 110
Met His Ala Ser Lys Pro Leu Asp Asp Thr Leu Phe Asp Glu Tyr Val
115 120 125
Ser Asn Met Arg Ala Phe Glu Gln Asp Leu Lys Asn Asn Asn Val Asp
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Asp Asp Met Asp Pro Ser Glu Val His Trp His Lys Leu His Gly
165 170 175
His Asp Trp Arg Asn Lys Lys Gln Tyr Asp Thr Leu Gln Lys Leu Arg
180 185 190
Thr Arg Phe Thr Asp Asp Trp Gln Ile Ile Asp Gly Glu Asp Glu Asp
195 200 205
Leu Arg Asn His Asn Pro Ala Gln Ala Ile Leu Thr Ala Leu Arg His
210 215 220
Cys Pro Glu His Glu Lys Lys Ala Ala Leu Lys Trp Gln Gln Ala Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ile Leu Thr Gln Phe Glu Val Pro Gln Ala Glu Asp Ala
245 250 255
Asn Tyr Lys Ser Glu Leu Lys Lys Leu Thr Lys Gln Val Ala Asp Ala
260 265 270
Met Arg Cys Asp Asp Arg Lys Val Val Ile Ala Phe Glu Gly Met Asp
275 280 285
Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Lys Arg Ile Val Lys Lys Leu Asp
290 295 300
Pro Arg Glu Tyr Glu Ile His Thr Ile Ala Ala Pro Glu Lys Tyr Glu
305 310 315 320
Leu Arg Arg Pro Tyr Leu Trp Arg Phe Trp Ser Lys Leu Gln Ser Asp
325 330 335
Asp Ile Thr Ile Phe Asp Arg Thr Trp Tyr Gly Arg Val Leu Val Glu
340 345 350
Arg Val Glu Gly Phe Ala Thr Glu Val Glu Trp Gln Arg Ala Tyr Ala
355 360 365
Glu Ile Asn Arg Phe Glu Lys Asn Leu Ser Ser Ser Gln Thr Val Leu
370 375 380
Ile Lys Phe Trp Leu Ala Ile Asp Lys Asp Glu Gln Ala Ala Arg Phe
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405 410 415
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agctatgcgc cgtggtatat tattagcacc aacgataaac agcaagcgcg cattgaagtg 1380
ctgcgcgcga ttctgaaaca gctgaaggcg gatcgcgata ccgat 1425

Claims (10)

1.一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2.编码如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
4.包含如权利要求2或3所述基因的质粒。
5.如权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒选自下组的PET载体：pET22b、pET24a、pET28a。
6.表达如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的微生物。
7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，转化了如权利要求4或5所述的质粒。
8.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物需要ATP再生系统，以便将ADP或AMP转化为ATP。
9.如权利要求6-8中任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物具有催化底物谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成L-谷胱甘肽的能力。
10.如权利要求6-8中任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。
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