CN107109379B - 肌酸激酶突变体、基因及突变体的应用 - Google Patents

肌酸激酶突变体、基因及突变体的应用 Download PDF

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Abstract

一种肌酸激酶突变体、基因及突变体的应用，该突变体以所附的序列2为参考序列，其具有选自第100位、第121位和第33位的至少一个突变，并且以肌酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物其具有比亲本高出至少50%的肌酸激酶催化活性。该肌酸激酶突变体可用于生产磷酸肌酸。

Description

肌酸激酶突变体、基因及突变体的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地说，涉及肌酸激酶突变体、基因及突变体的应用。
背景技术
磷酸肌酸(phosphocreatine)，是在肌肉或其他可兴奋组织(如脑和神经)中的一种高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暂时贮存形式。磷酸肌酸的作用非常多，其主要作用有以下七点：(1)心肌保护剂：磷酸肌酸广泛地分布于身体各组织，90％在肌肉组织中，磷酸肌酸是用来维持ATP水平的，磷酸肌酸通过开放合成通路和减少分解作用，保护肌纤维膜免受缺血损害并维持细胞的核酸储备。临床用于心麻痹症的心脏保护及心肌代谢窘迫的其他状况。适用于心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治疗(辅助治疗)，亦可用作各种心脏手术；(2)缓冲肌肉中酸性物质突然增高；(3)磷酸肌酸(CP)还参与能量运输，即把能量从线粒体运载到肌肉的其它部位；(4)运动员首选的运补剂：磷酸肌酸对于增加运动员的体能，提高运动成绩有明显的效果、安全有效，无副作用。在比赛中，磷酸肌酸(CP)水平的增加能提高训练和比赛成绩；(5)ATP的贮存形式：磷酸肌酸可以把高能磷酸转移给ADP生成ATP，因此磷酸肌酸是ATP的贮存形式；(6)与ADP作用而产生ATP：当体内肌酸磷酸激酶降低至零之前，脑组织缺氧时，磷酸肌酸均能与ADP作用而产生ATP；(7)缓冲剂的作用：磷酸肌酸除提供能量外，在大强度练习中还可以对控制肌肉中的酸性物质起缓冲剂的作用。这是因为磷酸肌酸在合成ATP过程中需要消耗大强度练习中堆积在肌肉中乳酸释放出来的氢离子，而肌肉中氢离子过多会阻碍肌肉收缩，所以磷酸肌酸能起缓冲作用并推迟疲劳的出现。
当前市场上的原料药磷酸肌酸是化学合成的，由于合成过程中需要用到有毒且易燃原料，政府不再颁发生产环保批文，严重引影响磷酸肌酸的应用。
随着生物科技的飞速发展，人类比以往任何时候更加关注自身的健康长寿和环境问题，2015年初，新的《环境保护法》正式施行，这部被誉为史上最严厉的环境保护法的出台，也反应了政府大力改进中国环保现状的决心。2015年3月中央政治局会议首提“绿色化”：“四化”变“五化”。“绿色化”是指“科技含量高、资源消耗低、环境污染少的产业结构和生产方式”。颠覆传统“高污染、高耗能、高碳排放”化学合成产业的绿色生物合成将成为下一轮产业经济新的增长点，并将成为生物经济的发动机。
尽管通过生物催化技术生产磷酸肌酸不仅高效且具有低碳环保，具有很强的竞争力，但用于生物催化技术生产磷酸肌酸的肌酸激酶活力较低，影响着该技术的工业化应用。
因此，提高肌酸激酶催化活力是降低绿色生物合成磷酸肌酸生产成本的关键因素。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术问题
本发明的目的在于提供高催化活性的肌酸激酶突变体。本发明的另一目的还在于提供含有编码本发明所述的肌酸激酶突变体的基因。本发明的再一目的在于将本发明的突变体应用于以肌酸和三磷酸腺苷(ATP)为底物，生产磷酸肌酸。
问题的解决方案
技术解决方案
本发明的技术方案如下：
一种肌酸激酶突变体，其中，以序列表的序列2为参考序列，其具有选自第100位、第121位和第33位的至少一个突变，并且以三磷酸腺苷和肌酸为底物时其具有比亲本高出至少50％的肌酸激酶催化活性。
所述的肌酸激酶突变体，其中，其中第100位的苯丙氨酸突变为酪氨酸。
所述的肌酸激酶突变体，其中，其中第121位的亮氨酸突变为天冬氨酸。
所述的肌酸激酶突变体，其中，其中第33位的缬氨酸突变为丙氨酸。
所述的肌酸激酶突变体，其中，其具有所附序列表中SEQ ID NO.：3至SEQ ID NO.：5之一所示的氨基酸序列。
一种基因，其中，其含有编码上述的肌酸激酶突变体的核苷酸序列。
一种如上述的肌酸激酶突变体的应用，其中，将其应用于以三磷酸腺苷和肌酸为底物制备磷酸肌酸的过程中。
发明的有益效果
有益效果
本发明通过对Oryctolagus cuniculus肌酸激酶基因进行定点突变，PCR扩增后插入适当的载体，随后在LB培养基上筛选，从而获得了一系列具高催化活性的肌酸激酶突变体，该突变体能以肌酸和三磷酸腺苷(ATP)为底物，可高效率催化生成磷酸肌酸。
对附图的简要说明
附图说明
图1为肌酸激酶亲本与突变体F100Y之聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图中从左至右的三条泳道依次为蛋白分子量标准、亲本肌酸激酶粗提蛋白(A)、肌酸激酶突变体F100Y粗提蛋白(B)，箭头指示目的酶位置。
发明实施例
本发明的实施方式
本发明提供肌酸激酶突变体、基因及突变体的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明一种肌酸激酶突变体，其以所附的序列2为参考序列，其具有选自第100位、第121位和第33位的至少一个突变，并且以三磷酸腺苷(ATP)和肌酸为底物其具有比亲本高出至少50％的肌酸激酶催化活性。
优选的是，所述亲本序列中的第100位的苯丙氨酸(Phe)突变为酪氨酸(Tyr)；所述亲本序列中的第121位的亮氨酸(Leu)突变成天冬氨酸(Asp)；和/或所述亲本序列中的第33位的缬氨酸(Val)突变成丙氨酸(Ala)。
这些突变体可以通过常规Histag纯化，并具有高的催化活性。例如，在本发明获得的一系列突变体中，一个具有单点突变的突变体F100Y的比活性较亲本高出111％。
另一方面，本发明还提供了一种基因，其含有编码本发明的肌酸激酶突变体的核苷酸序列。
又一方面，本发明还涉及肌酸激酶突变体的应用，其应用于以三磷酸腺苷(ATP)和肌酸为底物制备磷酸肌酸。
所述的肌酸激酶突变体可以未经纯化以粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶。如果需要，还可利用本领域已知的固化技术将本发明肌酸激酶突变体制成固相酶或固相细胞形式的固化酶。
为了获得本发明的突变体，先构建含有亲本肌酸激酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，再合成适当的引物，以所述的含亲本肌酸激酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。也可合成全长突变基因，然后将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有肌酸激酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。在本发明肌酸激酶突变体的制备方法中，可采用任何适当的载体。例如，适用的载体包括但不限于原核表达载体，如pRSET和pES21等；包括但不限于克隆载体，如pUC18/19和pBluscript-SK。
在本发明制备肌酸激酶突变体的方法中，所获得的肌酸激酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。
在本发明制备肌酸激酶突变体的方法中，所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌。所述真核细胞包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母。
本发明中所用的术语“亲本”系指来自Oryctolagus cuniculus的肌酸激酶(CKM)，其核苷酸序列如序列1所示(参考GenBank NM_001082239)，氨基酸序列如序列2所示(参考GenBank NP_001075708)。
本发明中所用的术语“参考序列”，当其为核苷酸序列时，系指序列表中的序列1，当其为氨基酸序列时，是指序列表中的序列2。在将参考序列和突变的肌酸激酶序列进行排序比较时，可以手工进行，也可以用计算机进行(目前有许多可供利用的计算机软件，例如CLUSTALW程序等)。
本发明中所用的术语“肌酸激酶突变体”是指这样一种以序列表中序列2所示氨基酸序列为参考序列，存在选自第100位、第121位和第33位的至少一个突变，并且以肌酸和三磷酸腺苷(ATP)为底物生产磷酸肌酸时其具有比亲本高出至少50％的肌酸激酶催化活性的酶。因此，在本发明中，所述肌酸激酶突变体的变体，包括对序列2所示氨基酸序列中除第100位、第121位和第33位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式、以及序列2的部分或全部串联重复形式，也包括在本发明的范围内。
在发明中所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138：9-37，1984)。
以下用具体的实施例对本发明制备的突变体及其性能进行说明。下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1：肌酸激酶编码基因的扩增与克隆
根据基因库(GenBank NM_001082239)基因序列设计引物ckm-F和ckm-R(见表1)。用引物对ckm-F和ckm-R从Oryctolagus cuniculus cDNA文库中扩增肌酸激酶编码基因。
扩增条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，400nM引物ckm-F，400nM引物ckm-R，100ng cDNA，1.0U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，再用无菌水调反应体积至50ml。
PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，最后72℃ 10分钟。扩增的产物经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和BamHI酶切的载体pRSET-A(源自Invitrogen，USA)连接，得质粒pRSET-ckm。经DNA测序，确定该被克隆的肌酸激酶的核苷酸序列，具体示于序列表中序列1，相应的氨基酸序列为序列表中的序列2。
表1
Figure GPA0000233263920000081
实施例2：肌酸激酶位点100的定点突变
具体过程如下：
为了将亲本氨基酸序列中第100位点的Phe(F)突变为Tyr(Y)获得突变体F100Y，以质粒pRSET-ckm(见实施例1)为模板，设计引物对100YF和100YR(见表1)。
用引物对ckm-F和100YR，扩增F-YR片段，用引物对100YF和ckm-R，扩增YF-R片段。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng pRSET-ckm，以及400nM引物ckm-F和400nM引物100YR(或者，400nM引物100YF和400nM引物ckm-R)，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，分别得到F-YR片段和YF-R片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，400nM引物ckm-F和400nM ckm-R，1.5UPfu DNA聚合酶，20ng F-YR片段与20ng YF-R片段，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，得到全长突变基因F100Y。将F100Y片段回收并经酶切再回收后与载体pRSET-A连接(参考实施例1)，得质粒pRSET-F100Y。将质粒pRSET-F100Y转入感受态细菌细胞E.coli BL21。经DNA测序确定引入的点突变无误。F100Y的氨基酸序列见序列表中的序列3。
实施例3：对肌酸激酶突变体位点121的定点突变
为了将亲本氨基酸序列中第121位点的Leu(L)突变为Asp(D)获得突变体L121D，以质粒pRSET-ckm(见实施例1)为模板，设计引物对121DF和121DR(见表1)。
用引物对ckm-F和121DR，扩增F-DR片段，引物对121DF和ckm-R，扩增DF-R片段。引物ckm-F和ckm-R的具体序列，见表1。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mMdGTP，400nM引物ckm-F和400nM引物121DR，或400nM引物121DF和400nM引物ckm-R，1.5U PfuDNA聚合酶(Promega，USA)，20ng pRSET-ckm，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，分别得到F-DR片段和DF-R片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，400nM引物ckm-F和400nM ckm-R，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng F-DR片段与20ng DF-R片段，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％
琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，得到全长突变基因L121D。将L121D与载体pRSET-A连接(参考实施例1)，得质粒pRSET-L121D。将质粒pRSET-L121D转入感受态细菌细胞E.coli BL21。经DNA测序确定引入的点突变无误。L121D的氨基酸序列见序列表中的序列4。
实施例4：肌酸激酶位点33的定点突变
为了将亲本氨基酸序列中第33位点的Val(V)突变为Ala(A)获得突变体V33A，以质粒pRSET-ckm(见实施例1)为模板，设计引物对33AF和33AR(见表1)。
用引物对ckm-F和33AR，扩增F-AR片段，引物对33AF和ckm-R，扩增AF-R片段。引物ckm-F和ckm-R的具体序列，见表1。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mMdGTP，400nM引物ckm-F和400nM引物33AR，或400nM引物33AF和400nM引物ckm-R，1.5U PfuDNA聚合酶(Promega，USA)，20ng pRSET-ckm，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，分别得到F-AR片段和AF-R片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，400nM引物ckm-F和400nM ckm-R，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ng F-AR片段与20ng AF-R片段，用无菌水调反应体积至50微升。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，得到全长突变基因V33A。将V33A与载体pRSET-A连接，得质粒pRSET-V33A。将质粒pRSET-V33A转入感受态细菌细胞E.coli BL21。经DNA测序确定引入的点突变无误。所得突变体的氨基酸序列见序列表中的序列5。
实施例5：亲本肌酸激酶的提取与纯化
具体过程如下：
将含肌酸激酶基因的质粒pRSET-ckm转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luriabroth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中于30℃培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mMTris盐酸缓冲液(pH 7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17,800g，10分钟)并收集上清液，即为粗提蛋白(或称粗提物)。
图1中A显示了重组的亲本肌酸激酶粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，表明肌酸激酶(目标带大小约为42kD)在大肠杆菌BL21中有表达。
实施例6：肌酸激酶突变体的提取与纯化
具体过程如下：
将含肌酸激酶基因的质粒pRSET-F100Y转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中于30℃培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17,800g，10分钟)并收集上清液，即为粗提蛋白(或称粗提物)。
图1中B显示了重组的肌酸激酶突变体F100Y粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，表明肌酸激酶(目标带大小约为42kD)在大肠杆菌BL21中有较高的表达水平。
实施例7：亲本肌酸激酶活性的测定
配制底物溶液：含100mM的肌酸(Creatine)、5mM之ATP、20mM之MgCl2、40mM Poly(P)和100mM Tris盐酸缓冲液，调pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升的亲本肌酸激酶，于37℃进行10分钟反应。离心(10℃，17,800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中磷酸肌酸的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度，测定结果如表2所示。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔肌酸为磷酸肌酸所需之酶量。肌酸激酶特异性活力为3.5U/mg。
实施例8：肌酸激酶突变体活性的测定
配制底物溶液：含100mM的肌酸(Creatine)、5mM之ATP、20mM之MgCl2、40mM Poly(P)和100mM Tris盐酸缓冲液，调pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升肌酸激酶突变体F100Y，于37℃进行10分钟反应。离心(10℃，17,800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中磷酸肌酸的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度，测定结果如表2所示。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔肌酸为磷酸肌酸所需之酶量。肌酸激酶特异性活力为7.4U/mg。
表2肌酸激酶亲本与突变体酶比活性之差异
[表1]
酶的名称 氨基酸序列的序列号 酶比活性
亲本 SEQ ID NO.：2 100
突变体F100Y SEQ ID NO.：3 211
突变体L121D SEQ ID NO.：4 152
突变体V33A SEQ ID NO.：5 180
实施例9：肌酸激酶固定化
取肌酸激酶粗酶，用洗酶缓冲液(0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA，pH7.0溶液)稀释至蛋白含量5-10mg/ml。将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾，pH7.5)等体积混合，加入固定化酶载体LX-3000(10毫克酶/克载体)，于摇床(转速100rpm)中25℃反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5-6次，得到固定化肌酸激酶。
实施例10：用固定化肌酸激酶制备磷酸肌酸
配制底物溶液：含100mM的肌酸(Creatine)、5mM之ATP、20mM之MgCl2、40mM Poly(P)和100mM Tris盐酸缓冲液，调pH至7.5。取底物溶液1毫升，然后加入0.05克固定化肌酸激酶。于37℃进行反应2-20小时。离心(10℃，17,800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中磷酸肌酸的含量。结果，肌酸转化为磷酸肌酸的转化率超过85％。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
核苷酸和/或氨基酸序列表
<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司、江西安泽麦生物科技有限公司
<120> 肌酸激酶突变体、基因及突变体的应用
<150> CN201510196296.3
<151> 2015-04-23
<160> 5
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> 兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 1
atgccgttcg gcaacaccca caacaagtac aagctgaact acaagtccga ggaggagtac 60
ccggacttga gcaaacacaa caaccacatg gccaaggtgc tgacccccga cctctacaag 120
aagctgcgcg acaaggagac gccctccggc ttcaccctgg acgatgtcat ccagacaggc 180
gtggacaacc cagggcaccc tttcatcatg accgtgggct gcgtggccgg tgacgaggag 240
tcctacacgg tgttcaagga cctgttcgac cccatcatcc aggaccgcca cgggggcttc 300
aaacccaccg acaagcacaa gaccgacctc aaccacgaga acctcaaagg tggggacgac 360
ttggaccccc actacgtgct cagcagccgc gtgcgcaccg gccgcagcat caagggctac 420
acgctgcccc cgcactgctc ccgtggcgag cgccgggccg tggagaagct ctccgtggaa 480
gccctcaaca gcctgacggg cgagttcaag gggaagtact accccctgaa gagcatgacc 540
gagcaggagc agcagcagct catcgacgac cacttcctgt tcgacaagcc cgtgtccccg 600
ctgctgctgg cctcggggat ggcccgcgat tggcccgacg cccgcggtat ctggcacaac 660
gacaacaaga gcttcctggt gtgggtcaac gaggaggacc acctccgggt catctccatg 720
gagaagggcg gcaacatgaa ggaggtcttc cgccgcttct gcgtggggct gcagaagatt 780
gaggagatct ttaagaaagc tggccacccc ttcatgtgga atgagcacct gggctacgtg 840
ctcacctgcc cgtccaacct gggcaccggg ctgcgtgggg gcgtgcacgt gaagctggcg 900
cacctgagca agcaccccaa gttcgaggag attctcaccc gcctgcgcct gcagaagcgg 960
ggcacagggg gcgtggacac ggctgccgtg ggctcggtgt tcgacatttc caacgccgac 1020
cggctgggct cgtccgaggt cgagcaggtg cagctggttg tggacggtgt gaagctcatg 1080
gtggagatgg agaagaagct ggagaaaggc cagtccatcg acgacatgat ccccgcccag 1140
aagtag 1146
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> 兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 2
Met Pro Phe Gly Asn Thr His Asn Lys Tyr Lys Leu Asn Tyr Lys Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Ser Lys His Asn Asn His Met Ala Lys
20 25 30
Val Leu Thr Pro Asp Leu Tyr Lys Lys Leu Arg Asp Lys Glu Thr Pro
35 40 45
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Val Ile Gln Thr Gly Val Asp Asn Pro
50 55 60
Gly His Pro Phe Ile Met Thr Val Gly Cys Val Ala Gly Asp Glu Glu
65 70 75 80
Ser Tyr Thr Val Phe Lys Asp Leu Phe Asp Pro Ile Ile Gln Asp Arg
85 90 95
His Gly Gly Phe Lys Pro Thr Asp Lys His Lys Thr Asp Leu Asn His
100 105 110
Glu Asn Leu Lys Gly Gly Asp Asp Leu Asp Pro His Tyr Val Leu Ser
115 120 125
Ser Arg Val Arg Thr Gly Arg Ser Ile Lys Gly Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
His Cys Ser Arg Gly Glu Arg Arg Ala Val Glu Lys Leu Ser Val Glu
145 150 155 160
Ala Leu Asn Ser Leu Thr Gly Glu Phe Lys Gly Lys Tyr Tyr Pro Leu
165 170 175
Lys Ser Met Thr Glu Gln Glu Gln Gln Gln Leu Ile Asp Asp His Phe
180 185 190
Leu Phe Asp Lys Pro Val Ser Pro Leu Leu Leu Ala Ser Gly Met Ala
195 200 205
Arg Asp Trp Pro Asp Ala Arg Gly Ile Trp His Asn Asp Asn Lys Ser
210 215 220
Phe Leu Val Trp Val Asn Glu Glu Asp His Leu Arg Val Ile Ser Met
225 230 235 240
Glu Lys Gly Gly Asn Met Lys Glu Val Phe Arg Arg Phe Cys Val Gly
245 250 255
Leu Gln Lys Ile Glu Glu Ile Phe Lys Lys Ala Gly His Pro Phe Met
260 265 270
Trp Asn Glu His Leu Gly Tyr Val Leu Thr Cys Pro Ser Asn Leu Gly
275 280 285
Thr Gly Leu Arg Gly Gly Val His Val Lys Leu Ala His Leu Ser Lys
290 295 300
His Pro Lys Phe Glu Glu Ile Leu Thr Arg Leu Arg Leu Gln Lys Arg
305 310 315 320
Gly Thr Gly Gly Val Asp Thr Ala Ala Val Gly Ser Val Phe Asp Ile
325 330 335
Ser Asn Ala Asp Arg Leu Gly Ser Ser Glu Val Glu Gln Val Gln Leu
340 345 350
Val Val Asp Gly Val Lys Leu Met Val Glu Met Glu Lys Lys Leu Glu
355 360 365
Lys Gly Gln Ser Ile Asp Asp Met Ile Pro Ala Gln Lys
370 375 380
<210> 3
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲本氨基酸序列中第100位点的Phe突变为Tyr
<400> 3
Met Pro Phe Gly Asn Thr His Asn Lys Tyr Lys Leu Asn Tyr Lys Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Ser Lys His Asn Asn His Met Ala Lys
20 25 30
Val Leu Thr Pro Asp Leu Tyr Lys Lys Leu Arg Asp Lys Glu Thr Pro
35 40 45
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Val Ile Gln Thr Gly Val Asp Asn Pro
50 55 60
Gly His Pro Phe Ile Met Thr Val Gly Cys Val Ala Gly Asp Glu Glu
65 70 75 80
Ser Tyr Thr Val Phe Lys Asp Leu Phe Asp Pro Ile Ile Gln Asp Arg
85 90 95
His Gly Gly Tyr Lys Pro Thr Asp Lys His Lys Thr Asp Leu Asn His
100 105 110
Glu Asn Leu Lys Gly Gly Asp Asp Leu Asp Pro His Tyr Val Leu Ser
115 120 125
Ser Arg Val Arg Thr Gly Arg Ser Ile Lys Gly Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
His Cys Ser Arg Gly Glu Arg Arg Ala Val Glu Lys Leu Ser Val Glu
145 150 155 160
Ala Leu Asn Ser Leu Thr Gly Glu Phe Lys Gly Lys Tyr Tyr Pro Leu
165 170 175
Lys Ser Met Thr Glu Gln Glu Gln Gln Gln Leu Ile Asp Asp His Phe
180 185 190
Leu Phe Asp Lys Pro Val Ser Pro Leu Leu Leu Ala Ser Gly Met Ala
195 200 205
Arg Asp Trp Pro Asp Ala Arg Gly Ile Trp His Asn Asp Asn Lys Ser
210 215 220
Phe Leu Val Trp Val Asn Glu Glu Asp His Leu Arg Val Ile Ser Met
225 230 235 240
Glu Lys Gly Gly Asn Met Lys Glu Val Phe Arg Arg Phe Cys Val Gly
245 250 255
Leu Gln Lys Ile Glu Glu Ile Phe Lys Lys Ala Gly His Pro Phe Met
260 265 270
Trp Asn Glu His Leu Gly Tyr Val Leu Thr Cys Pro Ser Asn Leu Gly
275 280 285
Thr Gly Leu Arg Gly Gly Val His Val Lys Leu Ala His Leu Ser Lys
290 295 300
His Pro Lys Phe Glu Glu Ile Leu Thr Arg Leu Arg Leu Gln Lys Arg
305 310 315 320
Gly Thr Gly Gly Val Asp Thr Ala Ala Val Gly Ser Val Phe Asp Ile
325 330 335
Ser Asn Ala Asp Arg Leu Gly Ser Ser Glu Val Glu Gln Val Gln Leu
340 345 350
Val Val Asp Gly Val Lys Leu Met Val Glu Met Glu Lys Lys Leu Glu
355 360 365
Lys Gly Gln Ser Ile Asp Asp Met Ile Pro Ala Gln Lys
370 375 380
<210> 4
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲本氨基酸序列中第121位点的Leu突变为Asp
<400> 4
Met Pro Phe Gly Asn Thr His Asn Lys Tyr Lys Leu Asn Tyr Lys Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Ser Lys His Asn Asn His Met Ala Lys
20 25 30
Val Leu Thr Pro Asp Leu Tyr Lys Lys Leu Arg Asp Lys Glu Thr Pro
35 40 45
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Val Ile Gln Thr Gly Val Asp Asn Pro
50 55 60
Gly His Pro Phe Ile Met Thr Val Gly Cys Val Ala Gly Asp Glu Glu
65 70 75 80
Ser Tyr Thr Val Phe Lys Asp Leu Phe Asp Pro Ile Ile Gln Asp Arg
85 90 95
His Gly Gly Phe Lys Pro Thr Asp Lys His Lys Thr Asp Leu Asn His
100 105 110
Glu Asn Leu Lys Gly Gly Asp Asp Asp Asp Pro His Tyr Val Leu Ser
115 120 125
Ser Arg Val Arg Thr Gly Arg Ser Ile Lys Gly Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
His Cys Ser Arg Gly Glu Arg Arg Ala Val Glu Lys Leu Ser Val Glu
145 150 155 160
Ala Leu Asn Ser Leu Thr Gly Glu Phe Lys Gly Lys Tyr Tyr Pro Leu
165 170 175
Lys Ser Met Thr Glu Gln Glu Gln Gln Gln Leu Ile Asp Asp His Phe
180 185 190
Leu Phe Asp Lys Pro Val Ser Pro Leu Leu Leu Ala Ser Gly Met Ala
195 200 205
Arg Asp Trp Pro Asp Ala Arg Gly Ile Trp His Asn Asp Asn Lys Ser
210 215 220
Phe Leu Val Trp Val Asn Glu Glu Asp His Leu Arg Val Ile Ser Met
225 230 235 240
Glu Lys Gly Gly Asn Met Lys Glu Val Phe Arg Arg Phe Cys Val Gly
245 250 255
Leu Gln Lys Ile Glu Glu Ile Phe Lys Lys Ala Gly His Pro Phe Met
260 265 270
Trp Asn Glu His Leu Gly Tyr Val Leu Thr Cys Pro Ser Asn Leu Gly
275 280 285
Thr Gly Leu Arg Gly Gly Val His Val Lys Leu Ala His Leu Ser Lys
290 295 300
His Pro Lys Phe Glu Glu Ile Leu Thr Arg Leu Arg Leu Gln Lys Arg
305 310 315 320
Gly Thr Gly Gly Val Asp Thr Ala Ala Val Gly Ser Val Phe Asp Ile
325 330 335
Ser Asn Ala Asp Arg Leu Gly Ser Ser Glu Val Glu Gln Val Gln Leu
340 345 350
Val Val Asp Gly Val Lys Leu Met Val Glu Met Glu Lys Lys Leu Glu
355 360 365
Lys Gly Gln Ser Ile Asp Asp Met Ile Pro Ala Gln Lys
370 375 380
<210> 5
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲本氨基酸序列中第33位点的Val突变为Ala
<400> 5
Met Pro Phe Gly Asn Thr His Asn Lys Tyr Lys Leu Asn Tyr Lys Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Ser Lys His Asn Asn His Met Ala Lys
20 25 30
Ala Leu Thr Pro Asp Leu Tyr Lys Lys Leu Arg Asp Lys Glu Thr Pro
35 40 45
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Val Ile Gln Thr Gly Val Asp Asn Pro
50 55 60
Gly His Pro Phe Ile Met Thr Val Gly Cys Val Ala Gly Asp Glu Glu
65 70 75 80
Ser Tyr Thr Val Phe Lys Asp Leu Phe Asp Pro Ile Ile Gln Asp Arg
85 90 95
His Gly Gly Phe Lys Pro Thr Asp Lys His Lys Thr Asp Leu Asn His
100 105 110
Glu Asn Leu Lys Gly Gly Asp Asp Leu Asp Pro His Tyr Val Leu Ser
115 120 125
Ser Arg Val Arg Thr Gly Arg Ser Ile Lys Gly Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
His Cys Ser Arg Gly Glu Arg Arg Ala Val Glu Lys Leu Ser Val Glu
145 150 155 160
Ala Leu Asn Ser Leu Thr Gly Glu Phe Lys Gly Lys Tyr Tyr Pro Leu
165 170 175
Lys Ser Met Thr Glu Gln Glu Gln Gln Gln Leu Ile Asp Asp His Phe
180 185 190
Leu Phe Asp Lys Pro Val Ser Pro Leu Leu Leu Ala Ser Gly Met Ala
195 200 205
Arg Asp Trp Pro Asp Ala Arg Gly Ile Trp His Asn Asp Asn Lys Ser
210 215 220
Phe Leu Val Trp Val Asn Glu Glu Asp His Leu Arg Val Ile Ser Met
225 230 235 240
Glu Lys Gly Gly Asn Met Lys Glu Val Phe Arg Arg Phe Cys Val Gly
245 250 255
Leu Gln Lys Ile Glu Glu Ile Phe Lys Lys Ala Gly His Pro Phe Met
260 265 270
Trp Asn Glu His Leu Gly Tyr Val Leu Thr Cys Pro Ser Asn Leu Gly
275 280 285
Thr Gly Leu Arg Gly Gly Val His Val Lys Leu Ala His Leu Ser Lys
290 295 300
His Pro Lys Phe Glu Glu Ile Leu Thr Arg Leu Arg Leu Gln Lys Arg
305 310 315 320
Gly Thr Gly Gly Val Asp Thr Ala Ala Val Gly Ser Val Phe Asp Ile
325 330 335
Ser Asn Ala Asp Arg Leu Gly Ser Ser Glu Val Glu Gln Val Gln Leu
340 345 350
Val Val Asp Gly Val Lys Leu Met Val Glu Met Glu Lys Lys Leu Glu
355 360 365
Lys Gly Gln Ser Ile Asp Asp Met Ile Pro Ala Gln Lys
370 375 380

Claims (3)

1.一种肌酸激酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3或者SEQ ID NO.:5所示。
2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的肌酸激酶突变体。
3.一种如权利要求1所述的肌酸激酶突变体的应用,其特征在于，将其应用于以三磷酸腺苷和肌酸为底物制备磷酸肌酸的过程中。
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Patentee after: Zhongshan Bangtai Hesheng Biotechnology Co., Ltd

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Patentee before: BONTAC BIO-ENGINEERING (SHENZHEN) Co.,Ltd.

Patentee before: Jiangxi anzemai Biotechnology Co., Ltd