CN105671096A - 一种通过生物催化生产磷酸肌酸的方法 - Google Patents

一种通过生物催化生产磷酸肌酸的方法 Download PDF

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Abstract

一种通过生物催化生产磷酸肌酸的方法，涉及磷酸肌酸的制备方法的技术领域。本发明提供的方法主要解决磷酸肌酸现有的生物催化生产方法产率低、成本高的技术问题，该方法具体为以肌酸和三磷酸腺苷为底物，在肌酸激酶突变体的催化作用下生产磷酸肌酸，所述肌酸激酶突变体具有如SEQ？ID？NO：3所示的氨基酸序列，该氨基酸序列的特点是将肌酸激酶亲本的氨基酸序列中第33位点的Val突变为Ala。该肌酸激酶突变体的比活性较肌酸激酶亲本高出80%，该方法使肌酸转化为磷酸肌酸的转化率超过85%，适于大规模工业化生产。

Description

一种通过生物催化生产磷酸肌酸的方法
技术领域
本发明涉及磷酸肌酸的制备方法的技术领域，特别涉及一种利用生物酶催化技术生产磷酸肌酸的生物催化方法。
背景技术
磷酸肌酸(phosphocreatine)是在肌肉或其他可兴奋组织(如脑和神经)中的一种高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暂时贮存形式。磷酸肌酸的作用非常多，其主要作用有以下七点：(1)心肌保护剂：磷酸肌酸广泛地分布于身体各组织，90％在肌肉组织中，磷酸肌酸是用来维持ATP水平的，磷酸肌酸通过开放合成通路和减少分解作用，保护肌纤维膜免受缺血损害并维持细胞的核酸储备。临床用于心麻痹症的心脏保护及心肌代谢窘迫的其他状况。适用于心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治疗(辅助治疗)，亦可用作各种心脏手术；(2)缓冲肌肉中酸性物质突然增高；(3)磷酸肌酸(CP)还参与能量运输，即把能量从线粒体运载到肌肉的其它部位；(4)运动员首选的运补剂：磷酸肌酸对于增加运动员的体能，提高运动成绩有明显的效果、安全有效，无副作用。在比赛中，磷酸肌酸(CP)水平的增加能提高训练和比赛成绩；(5)ATP的贮存形式：磷酸肌酸可以把高能磷酸转移给ADP生成ATP,因此磷酸肌酸是ATP的贮存形式；(6)与ADP作用而产生ATP：当体内肌酸磷酸激酶降低至零之前,脑组织缺氧时，磷酸肌酸均能与ADP作用而产生ATP；(7)缓冲剂的作用：磷酸肌酸除提供能量外，在大强度练习中还可以对控制肌肉中的酸性物质起缓冲剂的作用，这是因为磷酸肌酸在合成ATP过程中需要消耗大强度练习中堆积在肌肉中乳酸释放出来的氢离子，而肌肉中氢离子过多会阻碍肌肉收缩，所以磷酸肌酸能起缓冲作用并推迟疲劳的出现。
现有技术中，磷酸肌酸的生产方法包括化学合成法和生物催化法。化学合成法具有反应条件苛刻、激烈、不易控制，生成产物复杂，污染环境，合成过程中需要用到有毒且易燃的原料等缺点；而生物催化法则是以肌酸和ATP为底物，在肌酸激酶的催化下，专一生成磷酸肌酸，具有反应条件温和、反应速度快、专一性强及低碳环保等优点。但是，由于肌酸激酶的活力较低，且来源受限，致使磷酸肌酸的生产成本过高，严重制约了磷酸肌酸生物催化法的规模化和产业化生产。
发明内容
针对上述背景技术中提到的磷酸肌酸现有生产方法存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种产率高、成本低、适于大规模工业化生产的磷酸肌酸的生物催化生产方法。
为实现上述目的，发明人对具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的Oryctolaguscuniculus肌酸激酶亲本基因进行定点突变，PCR扩增后插入适当的载体，随后在LB培养基上筛选，从而获得了具有高催化活性的肌酸激酶突变体，因此，本发明提供了一种通过生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷为底物，在肌酸激酶突变体的催化作用下生产磷酸肌酸，所述肌酸激酶突变体具有如SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。
上述肌酸激酶突变体可以是未经纯化的粗酶形式；也可以是经部分纯化或完全纯化的酶，纯化过程可采用常规的Histag法；如果需要，还可以是利用固化技术制成的固相酶或者固相细胞形式的固化酶。
优选地，所述肌酸与所述三磷酸腺苷的摩尔比为20:1。
优选地，所述催化过程还需加入MgCl2和三聚磷酸钠。
优选地，所述催化过程是在pH值为7～8的缓冲溶液中进行。
所述缓冲溶液优选为Tris-HCl缓冲溶液。
优选地，所述肌酸激酶突变体为固定在酶固定化载体上的固定化肌酸激酶突变体。
所述酶固定化载体优选为环氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠或者大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯。
优选地，所述固定化肌酸激酶突变体的加入量为0.01-0.5g/ml缓冲溶液。
优选地，所述固定化肌酸激酶突变体的制备方法包括以下步骤：
(1)制备洗酶缓冲液：0.02MTris-HCl和0.001MEDTA的混合溶液，pH值为7.0；
(2)制备PB溶液：2.0mol/L磷酸二氢钾，pH值为7.5；
(3)用步骤(1)制备的洗酶缓冲液将所述肌酸激酶突变体稀释至5-10mg/ml，并将得到的酶稀释液与步骤(2)制备的PB溶液等体积混合，再加入所述酶固定化载体，于摇床中反应，所述酶固定化载体的加入量为10毫克酶/克载体；
(4)待步骤(3)反应完全后将所得反应液过滤，并用步骤(1)制备的洗酶缓冲液清洗，即得固定化肌酸激酶突变体。
以Oryctolaguscuniculus肌酸激酶亲本的基因为模板制备上述肌酸激酶突变体的方法优选包括以下步骤：
(1)PCR扩增具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的肌酸激酶亲本，扩增引物对如下
ckm-F：5’GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3’，
ckm-R：5’GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT3’；
(2)步骤(1)扩增的产物经限制性内切酶酶切后与载体连接，得质粒A；
(3)(3)以步骤(2)得到的质粒A为模板，PCR扩增得F-AR片段，扩增引物对如下
ckm-F：5’GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3’，
33AR：5’TCTTTAAGAGTTTGTGTTATCATTAAGATTCTCTCA3’；
(4)以步骤(2)得到的质粒A为模板，PCR扩增得AF-R片段，扩增引物对如下
33AF：5’ATAACACAAACTCTTAAAGATTATGATTTAACCTA3’，
ckm-R：5’GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT3’；
(5)以步骤(3)得到的F-AR片段以及步骤(4)得到的AF-R片段为模板，PCR扩增得全长突变体基因V33A，扩增引物对如下
ckm-F：5’GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3’，
ckm-R：5’GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT3’；
(6)步骤(5)得到的V33A经限制性内切酶酶切后与载体连接，得质粒B；
(7)将步骤(6)得到的质粒B转化感受态细菌细胞中，对转化细菌进行增殖培养并诱导表达，然后进行细胞破碎处理，提取即得肌酸激酶突变体。
本发明提供的上述肌酸激酶突变体的制备方法中，载体优选为pRSET-A。当然，其还可采用任何适用的其他载体，例如：包括pRSET和pES21在内的原核表达载体、包括pUC18/19和pBluscript-SK在内的克隆载体等。
本发明提供的上述肌酸激酶突变体的制备方法中，所获得的肌酸激酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。
本发明提供的上述肌酸激酶突变体的制备方法中，载体的宿主细胞可以是包括大肠杆菌在内的原核细胞，也可以是包括酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母在内的真核细胞。
有益效果：
本发明提供的磷酸肌酸的生物催化生产方法除具备传统的生物催化方法所共同具备的反应条件温和、反应速度快、专一性强及低碳环保等优点之外，还兼具目前现有的磷酸肌酸的生物催化方法所不具备的产率高、成本低、适于大规模工业化生产的优点。前述后一部分优点的获得在本发明中主要来源于以下两个方面：1、经酶活性测定，本发明人工诱导获得的具有如SEQIDNO：3所示的氨基酸序列的肌酸激酶突变体的比活性较肌酸激酶亲本高出80％；2、经过固定化的肌酸激酶突变体具有更高的活力和更好的稳定性，可提高酶重复使用率。经试验证实，本发明提供的生物催化方法使肌酸转化为磷酸肌酸的转化率超过85％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1
肌酸激酶亲本基因的扩增与克隆
肌酸激酶亲本系指来自Oryctolaguscuniculus的肌酸激酶(CKM)，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示(参考GenBankNM_001082239)，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示(参考GenBankNP_001075708)。根据肌酸激酶亲本的基因序列设计引物对ckm-F：5’GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3’和ckm-R：5’GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT3’。用引物对ckm-F和ckm-R从OryctolaguscuniculuscDNA文库中扩增肌酸激酶编码基因。
扩增条件为：20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％TritonX-100，50mMdATP，50mMdTTP，50mMdCTP，50mMdGTP，400nM引物ckm-F，400nM引物ckm-R，100ngcDNA,1.0UPfuDNA聚合酶(Promega，USA)，再用无菌水调反应体积至50ml。
PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后72℃10分钟。扩增的产物经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和BamHI酶切的载体pRSET-A(源自Invitrogen,USA)连接，得质粒pRSET-ckm。经DNA测序，确定该被克隆的肌酸激酶的核苷酸序列，具体示于序列表中SEQIDNO：1，相应的氨基酸序列为序列表中的SEQIDNO：2。
实施例2
肌酸激酶突变体的制备
以质粒pRSET-ckm(见实施例1)为模板，设计引物对33AF：5’ATAACACAAACTCTTAAAGATTATGATTTAACCTA3’和33AR：5’TCTTTAAGAGTTTGTGTTATCATTAAGATTCTCTCA3’。
用引物对ckm-F和33AR扩增F-AR片段，用引物对33AF和ckm-R扩增AF-R片段。扩增反应条件为：20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％TritonX-100，50mMdATP，50mMdTTP，50mMdCTP，50mMdGTP，1.5UPfuDNA聚合酶(Promega，USA)，20ngpRSET-ckm，以及400nM引物ckm-F和400nM引物33AR(或者，400nM引物33AF和400nM引物ckm-R)，用无菌水调反应体积至50微升。
PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，分别得到F-AR片段和AF-R片段。
然后扩增全长基因，扩增反应条件为：20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％TritonX-100，50mMdATP,50mMdTTP,50mMdCTP，50mMdGTP，400nM引物ckm-F和400nMckm-R，1.5UPfuDNA聚合酶，20ngF-AR片段与20ngAF-R片段，用无菌水调反应体积至50微升。
PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃30秒和72℃3分钟，最后72℃5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收，得到全长突变基因V33A。
将V33A片段回收并经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和BamHI酶切的载体pRSET-A连接，得质粒pRSET-V33A。将质粒pRSET-V33A转入感受态细菌细胞E.coliBL21，经DNA测序确定V33A的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO：3所示。
实施例3
酶的提取与纯化
将含肌酸激酶亲本基因的质粒pRSET-ckm以及含肌酸激酶突变体基因的质粒pRSET-V33A分别转化感受态细菌细胞E.coliBL21，在Luriabroth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中于30℃培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17,800g，10分钟)并收集上清液，即分别得肌酸激酶亲本以及肌酸激酶突变体的粗提蛋白(或称粗提物)。
实施例4
酶活性的测定
配制底物溶液:含100mM的肌酸(Creatine)、5mM的ATP、20mM的MgCl2、40mM三聚磷酸钠和100mMTris-HCl缓冲液，调pH至7.5。取底物溶液400微升，然后分别加入100微升的肌酸激酶亲本以及100微升的肌酸激酶突变体于37℃进行10分钟反应。离心(10℃，17,800g，15分钟)并收集上清液，通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中磷酸肌酸的含量。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔肌酸为磷酸肌酸所需之酶量。测定结果为：肌酸激酶亲本的特异性活力为3.5U/mg，肌酸激酶突变体的特异性活力为6.3U/mg。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度，测定结果为：肌酸激酶亲本的酶比活性为100，肌酸激酶突变体的酶比活性为180。
实施例5
固定化肌酸激酶突变体的制备
取肌酸激酶突变体粗酶，用洗酶缓冲液(0.02MTris-HCl/0.001MEDTA，pH7.0溶液)稀释至蛋白含量为5-10mg/ml。将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾，pH7.5)等体积混合，加入酶固定化载体LX-3000(10毫克酶/克载体)，于摇床(转速100rpm)中25℃反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5-6次，得到固定化肌酸激酶突变体。
实施例6
用固定化肌酸激酶突变体制备磷酸肌酸
配制底物溶液:含100mM的肌酸(Creatine)、5mM的ATP、20mM的MgCl2、40mM三聚磷酸钠和100mMTris-HCl缓冲液，调pH至7.5。取底物溶液1毫升，然后加入0.05克固定化肌酸激酶突变体。于37℃进行反应2-20小时。离心(10℃，17,800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中磷酸肌酸的含量。结果表明：肌酸转化为磷酸肌酸的转化率超过85％。

Claims (10)

1.一种通过生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷为底物，在肌酸激酶突变体的催化作用下生产磷酸肌酸，所述肌酸激酶突变体具有如SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：所述肌酸与所述三磷酸腺苷的摩尔比为20:1。
3.根据权利要求1所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：所述催化过程还需加入MgCl2和三聚磷酸钠。
4.根据权利要求1所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：所述催化过程是在pH值为7～8的缓冲溶液中进行。
5.根据权利要求4所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：所述肌酸激酶突变体为固定在酶固定化载体上的固定化肌酸激酶突变体。
7.根据权利要求6所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于：所述酶固定化载体为环氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠或者大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯。
8.根据权利要求6所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述固定化肌酸激酶突变体的加入量为0.01-0.5g/ml缓冲溶液。
9.根据权利要求6所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述固定化肌酸激酶突变体的制备方法包括以下步骤：
(1)制备洗酶缓冲液：0.02MTris-HCl和0.001MEDTA的混合溶液，pH值为7.0；
(2)制备PB溶液：2.0mol/L磷酸二氢钾，pH值为7.5；
(3)用步骤(1)制备的洗酶缓冲液将所述肌酸激酶突变体稀释至5-10mg/ml，并将得到的酶稀释液与步骤(2)制备的PB溶液等体积混合，再加入所述酶固定化载体，于摇床中反应，所述酶固定化载体的加入量为10毫克酶/克载体；
(4)待步骤(3)反应完全后将所得反应液过滤，并用步骤(1)制备的洗酶缓冲液清洗，即得固定化肌酸激酶突变体。
10.根据权利要求1至9任意一项所述的生物催化生产磷酸肌酸的方法，其特征在于，所述肌酸激酶突变体的制备方法包括以下步骤：
(1)PCR扩增具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的肌酸激酶亲本，扩增引物对如下
ckm-F：5’GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3’，
ckm-R：5’GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT3’；
(2)步骤(1)扩增的产物经限制性内切酶酶切后与载体连接，得质粒A；
(3)以步骤(2)得到的质粒A为模板，PCR扩增得F-AR片段，扩增引物对如下
ckm-F：5’GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3’，
33AR：5’TCTTTAAGAGTTTGTGTTATCATTAAGATTCTCTCA3’；
(4)以步骤(2)得到的质粒A为模板，PCR扩增得AF-R片段，扩增引物对如下
33AF：5’ATAACACAAACTCTTAAAGATTATGATTTAACCTA3’，
ckm-R：5’GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT3’；
(5)以步骤(3)得到的F-AR片段以及步骤(4)得到的AF-R片段为模板，PCR扩增得全长突变体基因V33A，扩增引物对如下
ckm-F：5’GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3’，
ckm-R：5’GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT3’；
(6)步骤(5)得到的V33A经限制性内切酶酶切后与载体连接，得质粒B；
(7)将步骤(6)得到的质粒B转化感受态细菌细胞中，对转化细菌进行增殖培养并诱导表达，然后进行细胞破碎处理，提取即得肌酸激酶突变体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN102911928A (zh) * 2012-07-06 2013-02-06 西南药业股份有限公司 一种肌酸激酶固定化的方法
CN104357420A (zh) * 2014-12-02 2015-02-18 杭州清科生物科技有限公司 一种适用于磷酸肌酸酶法生产工艺的肌酸激酶突变体
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102911928A (zh) * 2012-07-06 2013-02-06 西南药业股份有限公司 一种肌酸激酶固定化的方法
CN102808006A (zh) * 2012-08-23 2012-12-05 天津启仁医药科技有限公司 微生物酶法生产磷酸肌酸的方法
CN104357420A (zh) * 2014-12-02 2015-02-18 杭州清科生物科技有限公司 一种适用于磷酸肌酸酶法生产工艺的肌酸激酶突变体
CN104480098A (zh) * 2014-12-02 2015-04-01 杭州清科生物科技有限公司 一种适用于磷酸肌酸酶法生产工艺的肌酸激酶固定化方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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