CN108026130B - 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，其是以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸。

Description

一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，特别涉及一种利用生物催化技术制备烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，缩写成NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成生物细胞所赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，又称辅酶I)，并且同时直接参与体内腺苷转移，其在生物细胞内的水平直接影响到NAD的浓度，在生物细胞能量生成中扮演着重要角色，并且对人体无危害。
截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健用途，更多的用途还在不断研发出来。随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认知的增加，以及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用，市场上对烟酰胺单核苷酸的需求量与日俱增。
目前，NMN的制备方法主要包括以下三种：1、酵母菌发酵法；2、化学合成法；3、生物催化法。其中，化学合成法具有成本较高且产生手性化合物的缺点；而酵母菌发酵法生产的NMN含一定有机溶剂残留；生物催化法因不含机溶剂残留，也不存在手性问题且制备的NMN与机体内的同型而成为目前最绿色环保无公害的NMN的制备方法。现有的制备NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和5′- 磷酸核糖基-1′-焦磷酸(PRPP)为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamid e phosphoribosyltransferase，缩写成Nampt)的催化下制备NMN。但是，因PRPP 的市场价格较高且来源受限，导致该生物催化法的生产成本较高，严重制约了其应用和发展。
因此，有必要开发一种无需使用PRPP作为底物的利用生物催化技术制备NMN 的新方法。
技术问题
针对上述背景技术中提到的现有的烟酰胺单核苷酸的制备方法存在的诸多问题，本发明的目的在于提供一种利用生物催化技术制备NMN的新方法，该方法可避开使用价格较高且来源受限的PRPP作为底物，具有价格低廉、绿色环保无公害、适宜大规模工业化生产等优点。
问题的解决方案
技术解决方案
为实验上述目的，发明人经过长期大量的实验摸索，终于开发出一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸。
根据酶的国际系统命名法，上述方法中所使用的酶的EC编号分别为：烟酰胺磷酸核糖转移酶EC 2.4.2.12，核糖磷酸焦磷酸激酶EC 2.7.6.1，核糖激酶EC 2.7.1.15。
上述方法中所使用的各种酶的具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化含酶细胞，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
为提高所使用酶的稳定性和重复利用率，以更好地完成上述催化反应并更进一步降低成本，上述方法中优选使用固定化酶。该固定化酶的制备方法大致为：用洗酶缓冲液(0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA，pH7.0溶液)将酶稀释至蛋白含量为5-10mg/ml，再将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾，pH7.5)等体积混合，然后加入酶固定化载体(50毫克酶/克载体)，于摇床(转速150rpm)中2 5℃反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5-6次，即得固定化酶。其中的酶固定化载体可以选用环氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠以及大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。
优选地，所述反应在温度为30-50℃，pH值为6.5-8.5的条件下进行。
更优选地，所述反应在温度为35-45℃，pH值为7.0-8.0的条件下进行时转化率最高。
优选地，所述反应在Mg2+和K+存在的条件下进行。
优选地，所述反应在Tris-HCl缓冲液中进行。
优选地，所述烟酰胺的浓度为1-150mM，所述ATP的浓度为1-50mM，所述核糖的浓度为1-100mM。
优选地，所述原料中烟酰胺、ATP、核糖的摩尔比为1-4∶1∶1-4。按照此种配比投放原料可使ATP得到充分反应，其转化率为80％-100％。因为在三种原料中，以ATP的售价为最高，故而此种配比可较大程度地降低生产成本。更优选地，所述原料中烟酰胺、ATP、核糖的摩尔比为1.5∶1∶1.5，反应以底物ATP计算的转化率为100％，且成本最低。
反应完成后得到的烟酰胺单核苷酸粗产品溶液可采用本领域已知的常规技术手段进行过滤、纯化和干燥处理，即得烟酰胺单核苷酸成品。
优选地，上述方法中所使用的烟酰胺磷酸核糖转移酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且以烟酰胺和PRPP为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的亲本高的烟酰胺磷酸核糖转移酶催化活性的由(a)衍生的蛋白质。
上述烟酰胺磷酸核糖转移酶是发明人对来自Meiothermus ruber DSM 1279的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因进行定点突变，PCR扩增后插入适当的载体，随后在LB+卡那霉素培养基上筛选而获得的一系列具有高催化活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，这些突变体的高催化活性可极大地降低工业上应用生物催化技术生产烟酰胺单核苷酸的成本，具有较高的工业应用价值。
优选地，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第180位、第182位、第231位、第298位、第338位以及第377位。
更优选地，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶具有至少一个下述突变：F180A、F180 W、A182Y、E231A、E231Q、D298A、D298N、D298E、D338N、D338E、D37 7A、D377N以及D377E。
发明的有益效果
有益效果
1、与现有的烟酰胺单核苷酸的制备方法相比，本发明提供的方法既克服了化学合成法和酵母菌发酵法的缺陷，又成功避免了价格昂贵且来源受限的PRPP的使用，该方法以底物ATP计算的转化率高达100％，属于现今烟酰胺单核苷酸的制备方法中最为绿色环保无公害、适宜大规模工业化生产且价格低廉的一种。
2、本发明提供的方法中使用的烟酰胺磷酸核糖转移酶是一种经人工诱导定点突变获得的突变体，与现有的野生型相比，该突变体的酶活力大大提高，经酶活测定，以烟酰胺和PRPP为底物，该突变体的酶催化活性是亲本的1.2-6.9倍，如此高的催化活性使其可以未经纯化以粗酶形式使用，或者只须部分纯化，这就使得应用本发明提供的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体催化生产NMN的成本大大降低，具有较高的市场竞争力，能够满足将NMN的生物催化方法应用于大规模工业化生产的需求。
发明实施例
本发明的实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供的烟酰胺单核苷酸的制备方法可以是将所有原料及酶一并加入的一步投料方式也可以是分步投料方式，一步投料方式具有操作简单、反应时间短的优点，分步投料方式具有反应彻底、转化率高的优点，其具体实施过程如下：
一步投料方式：
将各原料溶解于水中配制底物溶液，该底物溶液的组成为1-150mM的烟酰胺、 1-50mM的ATP、1-100mM的核糖、1-30mM的MgCl2、1-20mM的KCl以及50-100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至6.5-8.5。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶，各种酶的加入量分别为：烟酰胺磷酸核糖转移酶1- 100g/L底物溶液，核糖磷酸焦磷酸激酶1-100g/L底物溶液，核糖激酶1-100g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为30-50℃，维持pH值为6.5-8.5。反应1-8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
分步投料方式：
将各原料溶解于水中配制底物溶液，该底物溶液的组成为1-50mM的ATP、1-10 0mM的核糖、1-30mM的MgCl2、1-20mM的KCl以及50-100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至6.5-8.5。然后向底物溶液中加入以下催化用酶：核糖磷酸焦磷酸激酶1- 100g/L底物溶液，核糖激酶1-100g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为30-50℃，维持pH值为6.5-8.5。
待上述反应进行1-8h后，分离出反应液，再向反应液中加入1-100mM的烟酰胺、1-30mM的MgCl2、50-100mM的Tris-HCl缓冲液以及烟酰胺磷酸核糖转移酶1-100g/L底物溶液，搅拌均匀后继续反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为 30-50℃，维持pH值为6.5-8.5，再反应1-8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
以下实施例中所使用的酶，除烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体是从来自Meiothermus ruber DSM 1279的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶经人工诱导定点突变获得的之外，其余烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶均是从市场上直接购入的酶冻干粉。
实施例1
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含1mM的烟酰胺、1mM的ATP、1mM的核糖、1m M的MgCl2、1mM的KCl以及50mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至6.5-7.0。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶，各种酶的加入量分别为：烟酰胺磷酸核糖转移酶1g/L底物溶液，核糖磷酸焦磷酸激酶1g/L底物溶液，核糖激酶1g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为30℃，维持pH值为6.5-7.0。反应1h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NM N0.5mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例2
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含15mM的ATP、100mM的核糖、10mM的MgCl2、10mM的KCl以及70mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至7.0-7.5。然后向底物溶液中加入以下催化用酶：核糖磷酸焦磷酸激酶20g/L底物溶液，核糖激酶20g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为35℃，维持pH值为7.0-7.5。
待上述反应进行3h后，分离出反应液，并将反应液送入另一反应釜中，再向反应液中加入60mM的烟酰胺、10mM的MgCl2、70mM的Tris-HCl缓冲液以及烟酰胺磷酸核糖转移酶20g/L底物溶液，搅拌均匀后继续反应，反应过程中持续搅拌 (搅拌速度50rpm)，控制反应温度为35℃，维持pH值为7.5-8.0，再反应3h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN7.3mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例3
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含35mM的ATP、70mM的核糖、20mM的MgCl2、15mM的KCl以及100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至7.5-8.0。然后向底物溶液中加入以下催化用酶：核糖磷酸焦磷酸激酶50g/L底物溶液，核糖激酶50g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为40℃，维持pH值为7.5-8.0。
待上述反应进行5h后，分离出反应液，并将反应液送入另一反应釜中，再向反应液中加入60mM的烟酰胺、20mM的MgCl2、100mM的Tris-HCl缓冲液以及烟酰胺磷酸核糖转移酶50g/L底物溶液，搅拌均匀后继续反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为40℃，维持pH值为7.5-8.0，再反应5h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN17.2mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例4
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含150mM的烟酰胺、50mM的ATP、100mM的核糖、30mM的MgCl2、20mM的KCl以及100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至8.0-8.5。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶，各种酶的加入量分别为：烟酰胺磷酸核糖转移酶100g/L底物溶液，核糖磷酸焦磷酸激酶100g/L底物溶液，核糖激酶10 0g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm) ，控制反应温度为50℃，维持pH值为8.0-8.5。反应8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN24.9mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例5
烟酰胺单核苷酸的制备
制备固定化酶：用洗酶缓冲液(0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA，pH7.0溶液) 分别将烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶稀释至蛋白含量为5-10mg/ml，再将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾，pH7.5)等体积混合，然后加入酶固定化载体环氧型LX-3000(50毫克酶/克载体)，于摇床( 转速150rpm)中25℃反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5- 6次，即分别得到固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶、固定化核糖磷酸焦磷酸激酶以及固定化核糖激酶。
向反应釜中加入底物溶液，含30mM的烟酰胺、20mM的ATP、30mM的核糖、 15mM的MgCl2、15mM的KCl以及100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至7.0-7.5。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶，各种酶的加入量分别为：固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶10g/L底物溶液，固定化核糖磷酸焦磷酸激酶10g/L底物溶液，固定化核糖激酶10g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为37℃，维持pH值为7.0-7.5。反应4h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN10mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。
实施例6
烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备
本发明提供的方法中用到的人工诱导定点突变的烟酰胺磷酸核糖转移酶的制备过程大致为：首先构建含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，再合成适当的引物，以含亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。然后将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变，在确定目的片段插入到载体上后，通过LB+卡那霉素培养基筛选，从而获得一系列具有高催化活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
在上述制备方法中，可采用任何适用的载体，例如：可以为原核表达载体，如pRSET和pES21等；可以为克隆载体，如pUC18/19和pBluscript-SK等。本发明优先选用pRSET-A为载体，载体的宿主细胞可以是包括大肠杆菌在内的原核细胞，也可以是包括酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母在内的真核细胞。
一、含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒的构建
对基因库公布的来自Meiothermus ruber DSM 1279的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因序列(GenBank登录号：CP001743.1)进行全序列人工合成(由商业合成公司完成)。合成的的产物经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和BamHI酶切的载体pRSET-A(源自Invitrogen，USA)连接，得质粒pRSET-nampt。经DNA测序，确定该被克隆的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
二、烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备
PCR扩增反应体系为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2 SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng DNA模板，以及400nM上游引物和400nM下游引物，用无菌水调反应体积至50微升。
PCR扩增反应条件为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3 分钟，最后72℃ 5分钟。
1、F180A突变体的制备
用如下引物对F180A-F：5′ GTTCAAACTGCACGACGCGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3′和F180A-R：5′ GAAACACCACGAGCACCCGCGTCGTGCAGTTTGAAC 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增F180A突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-F180A。将质粒pRSET-F180A转化感受态细菌细胞E. coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-F180A的DNA，经DN A测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，F180A突变体的氨基酸序列在第180位点由Phe(F)突变为Ala(A)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2、F180W突变体的制备
用如下引物对F180W-F：5′ GTTCAAACTGCACGACTGGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3′和F180W-R：5′ GAAACACCACGAGCACCCCAGTCGTGCAGTTTGAAC 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增F180W突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-F180W。将质粒pRSET-F180W转化感受态细菌细胞 E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-F180W的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，F180W突变体的氨基酸序列在第180位点由Phe(F)突变为Trp(W)。
3、A182Y突变体的制备
用如下引物对A182Y-F：5′ CAAACTGCACGACTTCGGTTATCGTGGTGTTTCTTCTCTG 3′和A182Y-R：5′ CAGAGAAGAAACACCACGATAACCGAAGTCGTGCAGTTTG 3′，以实施例6 第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增A182Y突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-A182Y。将质粒pRSET-A182Y转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-A182Y的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，A182Y突变体的氨基酸序列在第182位点由Ala(A)突变为Tyr(Y) 。
4、E231A突变体的制备
用如下引物对E231A-F：5′CTATCCCGGCTATGGCGCACTCTACCGTTAC 3′和E231A-R：5′GTAACGGTAGAGTGCGCCATAGCCGGGATAG 3′，以实施例6 第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231A突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-E231A。将质粒pRSET-E231A转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-E231A的DN A，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231A突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Ala(A) 。
5、E231Q突变体的制备
用如下引物对E231Q-F：5′CTCTATCCCGGCTATGCAGCACTCTACCGTTACC 3′和E231Q-R：5′GGTAACGGTAGAGTGCTGCATAGCCGGGATAGAG 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和P CR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-E231Q。将质粒pRSET-E231Q转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-E231Q 的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln( Q)。
6、D298A突变体的制备
用如下引物对D298A-F：5′TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3′和D298A-R： 5′GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D298A突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-D298A。将质粒pRSET-D298A 转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET -D298A的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D298A突变体的氨基酸序列在第298位点由Asp(D)突变为Ala(A)。
7、D298N突变体的制备
用如下引物对D298N-F：5′GTTGTTATCCGTCCGAATTCTGGTGACCCGCCG 3′和D298N-R：5′CGGCGGGTCACCAGAATTCGGACGGATAACAAC 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PC R扩增反应条件进行高保真PCR扩增D298N突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-D298N。将质粒pRSET-D298N转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D298N的D NA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D298N突变体的氨基酸序列在第298位点由Asp(D)突变为Asn( N)。
8、D298E突变体的制备
用如下引物对D298E-F：5′ GTTGTTATCCGTCCGGAATCTGGTGACCCGCCGTTC 3′和D298E-R：5′ GAACGGCGGGTCACCAGATTCCGGACGGATAACAAC 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D298E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-D298E。将质粒pRSET-D298E转化感受态细菌细胞E .coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D298E的DNA，经DN A测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D298E突变体的氨基酸序列在第298位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
9、D338N突变体的制备
用如下引物对D338N-F：5′ GTTCGTGTTATCCAGGGTAATGGTGTTAACGCTGACTC 3′和D338N-R：5′ GAGTCAGCGTTAACACCATTACCCTGGATAACACGAAC 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D338N突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6 第一部分)，得到质粒pRSET-D338N。将质粒pRSET-D338N转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D338N的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D338N突变体的氨基酸序列在第338位点由Asp(D)突变为Asn(N)。
10、D338E突变体的制备
用如下引物对D338E-F：5′GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC 3′和D338E-R：5′GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D338E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-D338E。将质粒pRSET-D338E转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D338E的DNA ，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D338E突变体的氨基酸序列在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)。 l1、D377A突变体的制备
用如下引物对D377A-F：5′CACCCGCACCGTGCGACCCAGAAATTC 3′和D377A-R：5′GAATTTCTGGGTCGCACGGTGCGGGTG 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D377A突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-D377A。将质粒pRSET-D377A转化感受态细菌细胞 E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D377A的DNA，经 DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D377A突变体的氨基酸序列在第377位点由Asp(D)突变为Ala(A)。
12、D377N突变体的制备
用如下引物对D377N-F：5′ GCAACACCCGCACCGTAATACCCAGAAATTCGCTC 3′和D377N-R：5′ GAGCGAATTTCTGGGTATTACGGTGCGGGTGTTGC 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D377N突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-D377N。将质粒pRSET-D377N转化感受态细菌细胞E. coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D377N的DNA，经DN A测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D377N突变体的氨基酸序列在第377位点由Asp(D)突变为Asn(N)。
13、D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F：5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R：5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′，以实施例6第一部分构建的质粒pRSET-nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-D377E。将质粒pRSET-D377E转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-D377E的DNA，经DN A测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D377E突变体的氨基酸序列在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
14、E231Q/D338E突变体的制备
用如下引物对D338E-F：5′GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC 3′和D338E-R：5′GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3′，以实施例6 第二部分的第5小节构建的质粒pRSET-E231Q为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D338E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A 连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-21。将质粒pRSET-21转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素 )上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-2 1的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q/D338E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln(Q)、在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
15、E231Q/D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F：5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R：5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′，以实施例6第二部分的第5小节构建的质粒pRSET-E231Q为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PC R扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-22。将质粒pRSET-22转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-22的DNA ，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q/D377E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E)突变为Gln (Q)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
16、D338E/D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F：5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R：5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′，以实施例6第二部分的第10小节构建的质粒pRSET-D338E为模板，利用上述PCR扩增反应体系和P CR扩增反应条件进行高保真PCR扩增D338E/D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接( 具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-23。将质粒pRSET-23转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-23的DN A，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第338位点由Asp(D)突变为G1 u(E)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
17、E231Q/D338E/D377E突变体的制备
用如下引物对D377E-F：5′CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3′和D377E-R：5′CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3′，以实施例6第二部分的第14小节构建的质粒pRSET-21为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR 扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D338E/D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-31。将质粒pRSET-31转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素) 上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-31 的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E )突变为Gln(Q)、在第338位点由Asp(D)突变为Glu(E)、在第377位点由 Asp(D)突变为Glu(E)。
18、E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的制备
用如下引物对D298A-F：5′TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3′和D298A-R ：5′GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3′，以实施例6第二部分的第17小节构建的质粒pRSET-31为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增E231Q/D298A/D338E/D377E突变体基因，经1％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再将扩增产物用载体pRSET-A连接(具体参考实施例6第一部分)，得到质粒pRSET-41。将质粒pRSET-41转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆，从克隆中提取质粒pRSET-41的DNA ，经DNA测序确定引入的点突变无误。与如SEQ ID NO：2所示的亲本氨基酸序列相比，E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第231位点由Glu(E )突变为Gln(Q)、在第298位点由Asp(D)突变为Ala(A)、在第338位点由 Asp(D)突变为Glu(E)、在第377位点由Asp(D)突变为Glu(E)。
三、酶的提取
将含亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的质粒pRSET-nampt以及含烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体基因的质粒pRSET-F180A、pRSET-F180W、pRSET-A182Y、pR SET-E231A、pRSET-E231Q、pRSET-D298A、pRSET-D298N、pRSET-D298E、 pRSET-D338N、pRSET-D338E、pRSET-D377A、pRSET-D377N、pRSET-D377E 、pRSET-21、pRSET-22、pRSET-23、pRSET-31以及pRSET-41分别转化感受态细菌细胞E.coli BL21，在Luria broth(LB)平板(含50mg/L卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于50毫升LB液体培养基(含50 mg/L卡那霉素)中于30℃培养16-20小时。离心收集菌体，称量等同量菌体按照1 ∶4比例悬浮破菌液(pH 7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(4-10℃，12000rpm，10分钟)并收集上清液，即分别得到亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶以及一系列烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的上清蛋白溶液，可用于酶活性的测定以及烟酰胺单核苷酸的的生物催化制备。
四、酶活性的测定
配制底物溶液：含60mM的烟酰胺、25mM的PRPP、18mM的MgCl2、15mM的KCl和100mM的Tris buffer缓冲液，调pH至7.5。分别取底物溶液900微升各19份，然后分别加入100微升等浓度的实施例6第三部分得到的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶以及各烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的上清蛋白溶液，于37℃进行10分钟反应，加入100μL25％三氯乙酸终止反应。通过高效液相色谱仪(HPL C)测定反应液中烟酰胺单核苷酸(NMN)的含量，并计算每种酶的比酶活，以亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的比酶活为参比100，亲本及各突变体的相对比活性如表1所示。
表1烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活
[表1]
酶的名称 相对比活性
亲本 100
F180A突变体 118
F180W突变体 122
A182Y突变体 187
E231A突变体 221
E231Q突变体 529
D298A突变体 236
D298N突变体 238
D298E突变体 149
D338N突变体 194
D338E突变体 516
D377A突变体 204
D377N突变体 279
D377E突变体 274
E231Q/D338E突变体 593
E231Q/D377E突变体 546
D338E/D377E突变体 601
E231Q/D338E/D377E突变体 654
E231Q/D298A/D338E/D377E突变体 691
五、烟酰胺单核苷酸的制备
向反应釜中加入底物溶液，含30mM的烟酰胺、20mM的ATP、30mM的核糖、 15mM的MgCl2、15mM的KCl以及100mM的Tris-HCl缓冲液，调pH至7.0-7.5。然后向底物溶液中加入催化用的各种酶，各种酶的加入量分别为：实施例6第三部分得到的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体(F180A)的上清蛋白溶液10ml/L底物溶液，核糖磷酸焦磷酸激酶20g/L底物溶液，核糖激酶20g/L底物溶液。搅拌均匀后进行反应，反应过程中持续搅拌(搅拌速度50rpm)，控制反应温度为37℃，维持pH值为7.0-7.5。反应4h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液(含NMN10mM)，再经过滤、纯化、干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。

Claims (8)

1.一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸；所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的用量为1-100g/L底物溶液，所述核糖磷酸焦磷酸激酶的用量为1-100g/L底物溶液，所述核糖激酶的用量为1-100g/L底物溶液；所述反应在温度为30-50℃，pH值为6.5-8.5的条件下进行；所述反应在Mg2+和K+存在的条件下进行。
2.根据权利要求1所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述反应在Tris-HCl缓冲液中进行。
3.根据权利要求1所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述烟酰胺的浓度为1-150mM，所述ATP的浓度为1-50mM，所述核糖的浓度为1-100mM。
4.根据权利要求1所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述原料中烟酰胺、ATP、核糖的摩尔比为1-4∶1∶1-4。
5.根据权利要求4所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述原料中烟酰胺、ATP、核糖的摩尔比为1.5∶1∶1.5。
6.根据权利要求1至5任一项所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于所述烟酰胺磷酸核糖转移酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且以烟酰胺和PRPP为底物具有比氨基酸序列如SEQID NO：2所示的亲本高的烟酰胺磷酸核糖转移酶催化活性的由(a)衍生的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于所述烟酰胺磷酸核糖转移酶与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第180位、第182位、第231位、第298位、第338位以及第377位。
8.根据权利要求7所述的制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于所述烟酰胺磷酸核糖转移酶具有至少一个下述突变：F180A、F180W、A182Y、E231A、E231Q、D298A、D298N、D298E、D338N、D338E、D377A、D377N以及D377E。
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