CN114672530B - 一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学与生物联合催化技术领域，尤其涉及一种化学与生物联合催化制备β‑烟酰胺单核苷酸的方法。针对现有制备β‑烟酰胺核糖和式(I)化合物NMN报道的技术中存在的缺陷，提供了一种操作简便、产品纯度高、收率高、能够进行吨位级工业化生产的制备β‑烟酰胺核糖和NMN的新方法。本方法通过3步高收率地制备了式(V)化合物氯化β‑烟酰胺核糖后，在制备的磷酸转移酶催化下将无机焦磷酸的磷酸根转移到氯化β‑烟酰胺核糖5′‑位的羟基上，方便地制备了NMN。该过程并不需要ATP的参与，且具有选择性高和反应条件温和等特点，因此在NMN的生产中具有显著的潜力和优势。
Description
技术领域
本发明属于化学与生物联合催化技术领域，尤其涉及一种化学与生物联合催化制备β-烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸是维生素B3(也称为烟酸)的一种衍生物，简称NMN，是用来合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I)的关键中间体，也用于治疗糖尿病，还因其在防止干细胞衰老、维持干细胞功能等方面初步显示的显著成效，以及还未观察到在使用NMN甚至是高剂量时后有任何的副作用。因此，近年来已成为受到广泛研究和关注的保健品。
目前文献报道的制备NMN的方法主要是通过先制备β-烟酰胺核糖，然后再磷酸化的方法。对于β-烟酰胺核糖的制备，主要有微生物发酵、合成、以及从植物提取等方法，其中合成方法为最主要的方法，代表性的合成方法都是以四酰基β-D-核糖为起始原料的方法，具体有以下三种：
第一种方法的合成路线为：
第二种方法的合成路线为：
这两条路线都是通过脱去四乙酰β-D-核糖中的1位OAc基团，生成三氟甲磺酸基β-烟酰胺核糖中间体，由于1位OAc基团不易脱去，都需要用昂贵的TMSOTf活化四乙酰核糖中的1位OAc，使其更容易离去，另外，得到的三氟甲磺酸基β-烟酰胺核糖中间体极性较大，分离纯化比较难，需要通过活性炭色谱分离，因此，收率较低，工艺放大难。
第三种方法的合成路线为：
这种方法的第一步是将四酰基-β-D-核糖与乙酰氯+甲醇或易制毒气体氯化氢反应，制备1-氯-2,3,5-三酰基-β-D-核糖，首先这步会得到1-氯-2,3,5-三酰基-β-D-核糖和1-氯-2,3,5-三酰基-α-D-核糖的混合物，这两个非对映异构体一同参与后面的氨解反应和脱保护反应，得到β-烟酰胺核糖和α-烟酰胺核糖的混合物，然后经有机溶剂浆洗以除去α-烟酰胺核糖杂质。由于β-烟酰胺核糖和α-烟酰胺核糖为非对映异构体，通过有机溶剂浆洗的方法很难完全除去α-烟酰胺核糖杂质，该杂质会参与后面的磷酸化反应，导致产生目标产物NMN的异构体α-烟酰胺单核苷酸，这个异构体与目标产物NMN也为非对映异构体，很难分离，影响了目标产物NMN的质量。其次，由于1位OAc基团不易被取代，且在盐酸体系中分子中的保护基R容易部分脱去，因此，需用大过量(10个当量以上)酰氯在低温(-25～-20℃)下反应。另外工艺的第二步以昂贵的TMSOTf为催化剂，生成三氟甲磺酸基β-烟酰胺三乙酰核糖再脱去三酰基后也得到难以分离纯化的三氟甲磺酸基β-烟酰胺核糖；脱保护中需用甲醇钠等强碱在较低温度(-5℃)下较长时间(24h)等条件才能脱去三个酰基。因此，这个方法不仅收率低，操作繁琐，产品质量也难以保证。
将β-烟酰胺核糖盐磷酸化制备NMN也主要有两种方法：
第一种：采用化学方法，用磷酸三甲酯和三氯氧磷为磷酸化试剂，由于β-烟酰胺核糖中有三个羟基，磷酸化时除了发生一元磷酸化生成NMN外，还易产生二元和三元磷酸化的副产物，这些副产物与NMN的结构相近，很难分离除去，需严格控制反应在-10～-5℃下进行以抑制副产物的产生。另外，三氯氧磷有强腐蚀性，易水解为磷酸和氯化氢，产生白烟，并放出大量热；后处理过量的三氯氧磷也产生大量的工业废水，因此，这种方法反应条件苛刻，操作较难控制，对环境不友好，不利于工业化生产。
第二种：采用生物催化法，主要是利用生物酶催化β-烟酰胺核糖的磷酸化。这种生产NMN的方法因具有高效、特异性好、反应条件温和等优势，具有很好的发展潜力。但文献报道的其反应过程都是将来自ATP的磷酸基团转移到β-烟酰胺核糖，这种方法生产存在一些不足：首先由于对酶的底物作用范围有一定的限制，因此，催化性能好的生物酶难以筛选到；其次，该方法是以ATP为磷酸化试剂，在催化过程中，需要一直消耗ATP，所以，必须同时培养可再生反应中消耗的ATP的微生物，或购买昂贵的ATP，使得此法收到限制。因此找到一种收率高、适用于工业化批量生产NMN的制备方法显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有制备β-烟酰胺核糖和式(I)化合物NMN报道的技术中存在的缺陷，提供了一种原料价廉、操作简便、产品纯度高、收率高、能够进行吨位级工业化生产的制备β-烟酰胺核糖和NMN的新方法。通过3步高收率地制备了式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖后，在制备的磷酸转移酶催化下将无机焦磷酸的磷酸根转移到氯化β-烟酰胺核糖5′-位的羟基上，方便地制备了NMN。该过程并不需要ATP的参与，且具有选择性高和反应条件温和等特点，因此在NMN的生产中具有显著的潜力和优势。
为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案为：一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，包括如下步骤：
步骤(1)，将廉价式(II)化合物β-D-核糖与酰氯在Lewis酸和相转移催化剂作用下1步发生氯代和三酰化反应制备了式(III)化合物1-氯-2,3,5-三酰基-β-D-核糖；
步骤(2)，式(III)化合物与β-烟酰胺发生氨解反应，制得式(IV)化合物氯化β-烟酰胺2,3,5-三乙酰基-β-D-核糖；
步骤(3)，式(IV)化合物在碱作用下脱去3个酰基，制得式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖；
步骤(4)，式(V)化合物在磷酸转移酶的催化下与磷酸化试剂发生磷酸化反应，即制得式(I)化合物NMN。
所述的步骤(4)的磷酸转移酶的核苷酸序列如序列表1(SEQ ID NO:1)或序列表2(SEQ ID NO:2)所示。
优选的，所述的步骤(1)中的酰氯R-COCl中的R为芳基、C1～C6的直链状及支链状的烷基中任意一种；且酰氯与式(II)化合物物质的量的比为5～8:1；
优选的，所述步骤(1)中的Lewis酸为金属氯化物，选自氯化锌、氯化钴、氯化钠、氯化钾或氯化锂，其用量为式(II)化合物物质的量的5～12％；相转移催化剂选自TMAB、TBAC、TEBAC或TPAB，其用量为式(II)化合物物质的量的2～5％；
优选的，所述的步骤(2)中的反应溶剂为乙醇、乙腈、二氯乙烷、异丙醇、四氢呋喃中的一种或多种；所述的步骤(2)中的反应温度为在选定的溶剂中回流。
优选的，式(III)化合物、β-烟酰胺和反应溶剂，搅拌均匀后，加热至回流，反应完成后，静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到式(IV)化合物。
优选的，所述的步骤(2)中的式(III)化合物与β-烟酰胺的物质的量的比为1:1.1～1.5。
优选的，将式(IV)化合物溶解在乙醇中，搅拌下加入碱，在室温下超声反应，反应完全后，加入甲基叔丁基醚，搅拌析出(V)化合物。
优选的，所述的步骤(3)中的碱为碱金属或碱土金属的碳酸盐或碳酸氢盐。
优选的，所述的步骤(4)具体步骤为：加入三乙醇胺缓冲液，磷酸化试剂，MgCl2溶液，式(V)化合物，磷酸转移酶，再加入ddH2O到反应体系，混合均匀后，一定温度下搅拌反应，后处理后得到NMN；
优选的，所述的步骤(4)的磷酸转移酶是利用基因工程技术获得重组大肠杆菌表达菌株，然后将重组大肠杆菌进行PCR扩增，制备得到表达烟酰胺核糖激酶的重组细胞，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min。
所述的步骤(4)的磷酸化试剂为无机焦磷酸盐，其用量为式(V)化合物物质的量的1-3倍；所述的步骤(4)的反应在温度为4℃～50℃；所述的步骤(4)的反应在pH 5.0～9.0的水相体系中进行。
优选的，所述的步骤(1)中的酰氯为苯甲酰氯，其用量为式(II)化合物物质的量的8倍；Lewis酸为氯化锌，其用量为式(II)化合物物质的量的12％；相转移催化剂为TEBAC，其用量为式(II)化合物物质的量的5％；所述的步骤(2)中的反应溶剂为乙醇，所述的步骤(2)中的式(III)化合物与β-烟酰胺的物质的量的比为1:1.5，所述的步骤(3)的脱乙酰化反应用超声辅助，所述的步骤(3)中的碱为碳酸钾；所述的步骤(4)的磷酸转移酶的核苷酸序列如序列表1(SEQ ID NO:1)，所述的步骤(4)的磷酸化试剂为焦磷酸钠盐，其用量为式(V)化合物物质的量的3倍；所述的步骤(4)的反应温度为37℃。
有益效果：
本方法以廉价的式(II)化合物β-D-核糖为原料，通过3步反应高收率地制备了式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖后，在制备的磷酸转移酶催化下将无机焦磷酸的磷酸根转移到氯化β-烟酰胺核糖5′-位的羟基上，方便地制备了NMN。该过程并不需要ATP的参与，且具有选择性高和反应条件温和等特点，因此在NMN的生产中具有显著的潜力和优势。
所述的步骤(4)的磷酸转移酶的核苷酸序列如序列表1(SEQ ID NO:1)和序列表2(SEQ ID NO:2)所示。
用序列表1(SEQ ID NO:1)和序列表2(SEQ ID NO:2)所示的核苷酸序列的磷酸转移酶，在酶纯化和未纯化下，其都能较好地催化式(V)与磷酸化试剂的磷酸化反应，NMN的收率大于70％；另外，式(V)化合物分子中虽然有3个羟基，但这两种磷酸转移酶只催化式(V)化合物分子中5-羟基的磷酸化，没有二元和三元磷酸化产物，也没有除NMN以外的一元磷酸化产物，得到的NMN的纯度可达99％。纯化酶的催化效果更好，用纯化酶催化，NMN的收率可大于90％。
以无机焦磷酸盐为磷酸化试剂，较好地克服了以ATP为磷酸化试剂，须同时培养可再生反应中消耗的ATP的微生物，或购买昂贵的ATP以提供催化过程中需要一直消耗ATP的缺陷。
所述步骤(1)通过廉价的式(II)化合物β-D-核糖和酰氯在Lewis和相转移催化剂作用下1步实现了氯代和三酰化反应，如酰氯选用苯甲酰氯，以氯化锌为催化剂，TEBAC为相转移催化剂，如实施例1，这一步的收率可达到90％以上，没有产生式(III)化合物的非对映异构体1-氯-2,3,5-三酰基-α-D-核糖，因而也不会导致生成β-烟酰胺核糖的非对映异构体——α-烟酰胺核糖。α-烟酰胺核糖会导致目标产物NMN的难以分离的非对映异构体异构体α-烟酰胺单核苷酸的产生。这一步中也没有部分脱保护基的产物。
所述的步骤(3)的脱酰基反应在超声波辅助下进行，反应在室温下10～15min即可完成，也无需采用强碱，只需碳酸盐或碳酸氢盐等碱，收率可达90％以上。分子中的三个酰基迅速脱去，基本没有脱一个或二个酰基的产物。对比实施例24-26，脱酰基反应是没有超声辅助下的反应，在乙醇为溶剂中回流反应时间是5-7h，需要的反应时间和反应温度是远远超过用超声辅助脱酰基反应的条件，同时实施例24-26所示反应收率均低于80％，也不如超声辅助下的脱酰基反应的收率。
所述的步骤(2)中的最佳反应溶为乙醇，所述的步骤(2)中的式(III)化合物与β-烟酰胺的物质的量的比为1:1.5为最佳，通过实施例10-19对比可知，应用实施例12中式(III)化合物与β-烟酰胺的物质的量的比，(IV)化合物的收率最高，为81％。
所述的步骤(3)中的碱为碳酸钾时最佳。通过实施例20-22对比可知，所述的步骤(3)中的碱为碳酸钾，式(V)化合物收率最高，为95％。
所述的步骤(4)的磷酸转移酶的核苷酸序列如序列表1(SEQ ID NO:1)为最佳，通过实施例(34、35)对比可知，步骤(4)的磷酸转移酶的核苷酸序列如序列表1时，NMN的收率高于磷酸转移酶的核苷酸序列如序列表2。
所述的步骤(4)的磷酸化试剂为焦磷酸钠盐，其用量为式(V)化合物物质的量的3倍；所述的步骤(4)的反应温度为37℃为最佳。通过实施例34-42对比可知，实施例41得到NMN的收率为92％，纯度大于99％，均高于其它实施例。
具体实施方式
下面结合实施具体实施例，进一步说明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例中所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
实施例1式(III)化合物1-氯-2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将100mmol式(II)化合物、12mmol氯化锌、5mmol TEBAC和250mL二氯甲烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，冷却反应液至5～10℃，再将800mmol苯甲酰氯加入，保温反应6h后，升温至40℃，再保温反应2h。反应完成后停止加热，冷却至室温，向反应液中加入300mL水，搅拌后再加入250mL二氯甲烷分两次萃取，有机萃取液分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后减压干燥得式(III)化合物，收率91％。该化合物无需纯化，可直接进行下一步的实验。
实施例2式(III)化合物1-氯-2,3,5-三丁酰基-β-D-核糖的制备
将10mmol式(II)化合物、1.2mmol氯化锌、0.5mmol TEBAC和30mL二氯甲烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，冷却反应液至5～10℃，再将80mmol丁酰氯加入，保温反应6h后，升温至40℃，再保温反应2h。反应完成后停止加热，冷却至室温，向反应液中加入30mL水，搅拌后再加入30mL二氯甲烷分两次萃取，有机萃取液分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后减压干燥得式(III)化合物，收率78％。该化合物无需纯化，可直接进行下一步的实验。
实施例3式(III)化合物1-氯-2,3,5-三特戊酰基-β-D-核糖的制备
将10mmol式(II)化合物、1.2mmol氯化锌、0.5mmol TEBAC和30mL二氯甲烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，冷却反应液至5～10℃，再将80mmol特戊酰氯加入，保温反应6h后，升温至40℃，再保温反应2h。反应完成后停止加热，冷却至室温，向反应液中加入30mL水，搅拌后再加入30mL二氯甲烷分两次萃取，有机萃取液分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后减压干燥得式(III)化合物，收率82％。该化合物无需纯化，可直接进行下一步的实验。
实施例4式(III)化合物1-氯-2,3,5-三(2-甲基苯甲酰基)-β-D-核糖的制备
将10mmol式(II)化合物、1.2mmol氯化锌、0.5mmol TEBAC和30mL二氯甲烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，冷却反应液至5～10℃，再将80mmol 2-甲基苯甲酰氯加入，保温反应6h后，升温至40℃，再保温反应2h。反应完成后停止加热，冷却至室温，向反应液中加入30mL水，搅拌后再加入30mL二氯甲烷分两次萃取，有机萃取液分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后减压干燥得式(III)化合物，收率87％。该化合物无需纯化，可直接进行下一步的实验。
实施例5式(III)化合物1-氯-2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将10mmol式(II)化合物、1.2mmol氯化锂、0.5mmol TMAC和30mL二氯甲烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，冷却反应液至5～10℃，再将50mmol苯甲酰氯加入，保温反应6h后，升温至40℃，再保温反应2h。反应完成后停止加热，冷却至室温，向反应液中加入30mL水，搅拌后再加入30mL二氯甲烷分两次萃取，有机萃取液分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后减压干燥得式(III)化合物，收率81％。
实施例6式(III)化合物1-氯-2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将10mmol式(II)化合物、1.2mmol氯化钴、0.5mmol TBAC和30mL二氯甲烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，冷却反应液至5～10℃，再将50mmol苯甲酰氯加入，保温反应6h后，升温至40℃，再保温反应2h。反应完成后停止加热，冷却至室温，向反应液中加入30mL水，搅拌后再加入30mL二氯甲烷分两次萃取，有机萃取液分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后减压干燥得式(III)化合物，收率76％。
实施例7式(III)化合物1-氯-2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将10mmol式(II)化合物、1.2mmol氯化钠、0.5mmol TPAB和30mL二氯甲烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，冷却反应液至5～10℃，再将65mmol苯甲酰氯加入，保温反应6h后，升温至40℃，再保温反应2h。反应完成后停止加热，冷却至室温，向反应液中加入30mL水，搅拌后再加入30mL二氯甲烷分两次萃取，有机萃取液分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后减压干燥得式(III)化合物，收率70％。
实施例8式(III)化合物1-氯-2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将10mmol式(II)化合物、1.2mmol氯化钾、0.5mmol TEBAC和30mL二氯甲烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，冷却反应液至5～10℃，再将80mmol苯甲酰氯加入，保温反应6h后，升温至40℃，再保温反应2h。反应完成后停止加热，冷却至室温，向反应液中加入30mL水，搅拌后再加入30mL二氯甲烷分两次萃取，有机萃取液分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后减压干燥得式(III)化合物，收率73％。
实施例9式(III)化合物1-氯-2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将10mmol式(II)化合物、0.5mmol氯化锌、0.2mmol TEBAC和20mL二氯甲烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，冷却反应液至5～10℃，再将50mmol苯甲酰氯加入，保温反应6h后，升温至40℃，再保温反应2h。反应完成后停止加热，冷却至室温，向反应液中加入20mL水，搅拌后再加入20mL二氯甲烷分两次萃取，有机萃取液分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后减压干燥得式(III)化合物，收率70％。
实施例10式(IV)化合物氯化β-烟酰胺-2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将实施例1得到的50mmol式(III)化合物、60mmolβ-烟酰胺和100mL无水乙醇加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约8h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率80％(以式(II)化合物计)。
实施例11式(IV)化合物氯化β-烟酰胺-2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将实施例1得到的50mmol式(III)化合物、55mmolβ-烟酰胺和100mL无水乙醇加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约8h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率71％(以式(II)化合物计)。
实施例12式(IV)化合物氯化β-烟酰胺2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将实施例1得到的50mmol式(III)化合物、75mmolβ-烟酰胺和100mL无水乙醇加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约8h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率81％(以式(II)化合物计)。
实施例13式(IV)化合物氯化β-烟酰胺2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将实施例1得到的50mmol式(III)化合物、60mmolβ-烟酰胺和100mL乙腈加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约10h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率76％(以式(II)化合物计)。
实施例14式(IV)化合物氯化β-烟酰胺2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将实施例1得到的50mmol式(III)化合物、60mmolβ-烟酰胺和100mL二氯乙烷加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约12h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率58％(以式(II)化合物计)。
实施例15式(IV)化合物氯化β-烟酰胺2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将实施例1得到的50mmol式(III)化合物、60mmolβ-烟酰胺和100mL四氢呋喃加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约14h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率52％(以式(II)化合物计)。
实施例16式(IV)化合物氯化β-烟酰胺2,3,5-三苯甲酰基-β-D-核糖的制备
将实施例1得到的50mmol式(III)化合物、60mmolβ-烟酰胺和100mL异丙醇加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约14h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率70％(以式(II)化合物计)。
实施例17式(IV)化合物氯化β-烟酰胺-2,3,5-三丁酰基-β-D-核糖的制备
将实施例2得到的50mmol式(III)化合物、60mmolβ-烟酰胺和100mL无水乙醇加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约9h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率63％(以式(II)化合物计)。
实施例18式(IV)化合物氯化β-烟酰胺-2,3,5-三特戊酰基-β-D-核糖的制备
将实施例3得到的50mmol式(III)化合物、60mmolβ-烟酰胺和100mL无水乙醇加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约9h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率69％(以式(II)化合物计)。
实施例19式(IV)化合物氯化β-烟酰胺-2,3,5-三(2-甲基苯甲酰基)-β-D-核糖的制备
将实施例4得到的50mmol式(III)化合物、60mmolβ-烟酰胺和100mL无水乙醇加入反应瓶中，搅拌均匀后，加热至回流，TLC检测反应进程，约9h反应完成后，停止加热。静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到粗产物。所得粗产物用乙酸乙酯∶异丙醇∶甲醇＝2∶2∶1的混合溶剂重结晶，过滤析出的固体，减压干燥得式(IV)化合物，收率76％(以式(II)化合物计)。
实施例20式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例10得到的50mmol式(IV)化合物溶解在120mL乙醇中，搅拌下加入碳酸钾15mmol，在室温下超声反应，HPLC检测反应进程，约10min反应完全，过滤，滤液减压浓缩至30mL。向其中加入120mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用120mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率95％。结构通过LC-MS确证。ESI-LRMSm/z:291.6[M+H]+。
实施例21式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例10得到的10mmol式(IV)化合物溶解在25mL乙醇中，搅拌下加入碳酸氢钾3mmol，在室温下超声反应，HPLC检测反应进程，约13min反应完全，过滤，滤液减压浓缩至6mL。向其中加入25mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用25mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率88％。
实施例22式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例10得到的10mmol式(IV)化合物溶解在25mL乙醇中，搅拌下加入碳酸钠5mmol，在室温下超声反应，HPLC检测反应进程，约12min反应完全，过滤，滤液减压浓缩至6mL。向其中加入25mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用25mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率91％。
实施例23式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例10得到的10mmol式(IV)化合物溶解在25mL乙醇中，搅拌下加入碳酸镁3mmol，在室温下超声反应，HPLC检测反应进程，约15min反应完全，过滤，滤液减压浓缩至6mL。向其中加入25mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用25mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率86％。
实施例24式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例10得到的10mmol式(IV)化合物溶解在25mL乙醇中，搅拌下加入碳酸钾4mmol，将反应体系温度升至回流，HPLC检测反应进程，约5h反应完全，过滤，滤液减压浓缩至6mL。向其中加入25mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用25mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率78％。
实施例25式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例10得到的10mmol式(IV)化合物溶解在25mL乙醇中，搅拌下加入碳酸氢钾4mmol，将反应体系温度升至回流，HPLC检测反应进程，约5h反应完全，过滤，滤液减压浓缩至6mL。向其中加入25mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用25mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率70％。
实施例26式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例10得到的10mmol式(IV)化合物溶解在25mL乙醇中，搅拌下加入碳酸氢钠4mmol，将反应体系温度升至回流，HPLC检测反应进程，约7h反应完全，过滤，滤液减压浓缩至6mL。向其中加入25mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用25mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率60％。
实施例27式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例17得到的5mmol式(IV)化合物溶解在15mL乙醇中，搅拌下加入碳酸钾1.5mmol，在室温下超声反应，HPLC检测反应进程，约15min反应完全，过滤，滤液减压浓缩至4mL。向其中加入15mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用15mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率90％。
实施例28式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例18得到的5mmol式(IV)化合物溶解在15mL乙醇中，搅拌下加入碳酸钾1.5mmol，在室温下超声反应，HPLC检测反应进程，约14min反应完全，过滤，滤液减压浓缩至4mL。向其中加入15mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用15mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率91％。
实施例29式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖的制备
将实施例19得到的5mmol式(IV)化合物溶解在15mL乙醇中，搅拌下加入碳酸钾1.5mmol，在室温下超声反应，HPLC检测反应进程，约11min反应完全，过滤，滤液减压浓缩至4mL。向其中加入15mL甲基叔丁基醚，搅拌析出白色固体，抽滤。得到的固体再用15mL甲基叔丁基醚搅拌，抽滤，减压干燥得式(V)化合物，收率92％。
实施例30磷酸转移酶的制备
从序列表1中选择核苷酸序列优化密码子后基因合成所需的基因片段，连入pBAD-D载体，得连接产物，取0.1mL连接产物加入冰浴的1mL大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液15mL，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的0.1mL PCR Mix体系中进行PCR扩增，制备得到表达烟酰胺核糖激酶的重组细胞，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min。
PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:1)的大肠杆菌菌株；将该菌破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得粗酶溶液。该粗酶溶液可直接作为制备NMN的磷酸转移酶。
实施例31磷酸转移酶的制备
从序列表2中选择核苷酸序列优化密码子后基因合成所需的基因片段，其余步骤参照实施例30。获得含目标酶序列(SEQ ID NO:2)的的大肠杆菌菌株；将该菌破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得粗酶溶液。该粗酶溶液可直接作为制备NMN的磷酸转移酶。
实施例32磷酸转移酶的制备
将实施例30得到的粗酶溶液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液。该纯化的酶溶液即作为制备NMN的磷酸转移酶。
实施例33磷酸转移酶的制备
将实施例31得到的粗酶溶液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液。该纯化的酶溶液即作为制备NMN的磷酸转移酶。
实施例34 NMN的制备
在反应瓶中，加入1mL三乙醇胺缓冲液(pH＝8.0，1mol/L)，6mL焦磷酸钠(0.05mol/L)，4mLMgCl2溶液(0.5mol/L)，30mL式(V)化合物(0.005mol/L)，10mL(140mg)实施例30得到的粗酶溶液(SEQ ID NO:1)，再加入ddH2O将反应体系补至100mL，混合均匀后，37℃、300rpm搅拌反应，用高效液相色谱检测式(V)化合物的转化情况，约4h，当转化反应完成后加入盐酸终止反应。离心后，取上清液，经离子交换树脂分离、纳滤后加入乙醇，搅拌后，降温析晶。滤出析出的固体，鼓风干燥后得到NMN，收率，85％，纯度大于98％。
实施例35 NMN的制备
在反应瓶中，加入1mL三乙醇胺缓冲液(pH＝8.0，1mol/L)，6mL焦磷酸钠(0.05mol/L)，4mLMgCl2溶液(0.5mol/L)，30mL式(V)化合物(0.005mol/L)，10mL(140mg)实施例31得到的粗酶溶液(SEQ ID NO:2)，再加入ddH2O将反应体系补至100mL，混合均匀后，37℃、300rpm搅拌反应，用高效液相色谱检测式(V)化合物的转化情况，约5h，当转化反应完成后加入盐酸终止反应。离心后，取上清液，经离子交换树脂分离、纳滤后加入乙醇，搅拌后，降温析晶。滤出析出的固体，鼓风干燥后得到NMN，收率，78％，纯度大于98％。
实施例36 NMN的制备
在反应瓶中，加入1mL三乙醇胺缓冲液(pH＝8.0，1mol/L)，6mL焦磷酸钠(0.05mol/L)，4mLMgCl2溶液(0.5mol/L)，30mL式(V)化合物(0.005mol/L)，10mL(140mg)实施例32得到的纯化的酶溶液(SEQ ID NO:1)，再加入ddH2O将反应体系补至100mL，混合均匀后，37℃、300rpm搅拌反应，用高效液相色谱检测式(V)化合物的转化情况，约3h，当转化反应完成后加入盐酸终止反应。离心后，取上清液，经离子交换树脂分离、纳滤后加入乙醇，搅拌后，降温析晶。滤出析出的固体，鼓风干燥后得到NMN，收率，91％，纯度大于99％。
实施例37 NMN的制备
在反应瓶中，加入1mL三乙醇胺缓冲液(pH＝8.0，1mol/L)，6mL焦磷酸钠(0.05mol/L)，4mLMgCl2溶液(0.5mol/L)，30mL式(V)化合物(0.005mol/L)，10mL(140mg)实施例32得到的纯化的酶溶液(SEQ ID NO:2)，再加入ddH2O将反应体系补至100mL，混合均匀后，37℃、300rpm搅拌反应，用高效液相色谱检测式(V)化合物的转化情况，约3h，当转化反应完成后加入盐酸终止反应。离心后，取上清液，经离子交换树脂分离、纳滤后加入乙醇，搅拌后，降温析晶。滤出析出的固体，鼓风干燥后得到NMN，收率，85％，纯度大于99％。
实施例38 NMN的制备
在反应瓶中，加入1mL三乙醇胺缓冲液(pH＝8.0，1mol/L)，63mL焦磷酸钠(0.05mol/L)，4mLMgCl2溶液(0.5mol/L)，30mL式(V)化合物(0.005mol/L)，10mL(140mg)实施例32得到的纯化的酶溶液(SEQ ID NO:1)，再加入ddH2O将反应体系补至100mL，混合均匀后，37℃、300rpm搅拌反应，用高效液相色谱检测式(V)化合物的转化情况，约3h，当转化反应完成后加入盐酸终止反应。离心后，取上清液，经离子交换树脂分离、纳滤后加入乙醇，搅拌后，降温析晶。滤出析出的固体，鼓风干燥后得到NMN，收率，71％，纯度大于97％。
实施例39 NMN的制备
在反应瓶中，加入1mL三乙醇胺缓冲液(pH＝8.0，1mol/L)，3mL焦磷酸钠(0.05mol/L)，4mLMgCl2溶液(0.5mol/L)，30mL式(V)化合物(0.005mol/L)，10mL(140mg)实施例32得到的纯化的酶溶液(SEQ ID NO:1)，再加入ddH2O将反应体系补至100mL，混合均匀后，37℃、300rpm搅拌反应，用高效液相色谱检测式(V)化合物的转化情况，约3h，当转化反应完成后加入盐酸终止反应。离心后，取上清液，经离子交换树脂分离、纳滤后加入乙醇，搅拌后，降温析晶。滤出析出的固体，鼓风干燥后得到NMN，收率，75％，纯度大于98％。
实施例40 NMN的制备
在反应瓶中，加入1mL三乙醇胺缓冲液(pH＝8.0，1mol/L)，9mL焦磷酸钠(0.05mol/L)，4mLMgCl2溶液(0.5mol/L)，30mL式(V)化合物(0.005mol/L)，10mL(140mg)实施例30得到的粗酶溶液(SEQ ID NO:1)，再加入ddH2O将反应体系补至100mL，混合均匀后，37℃、300rpm搅拌反应，用高效液相色谱检测式(V)化合物的转化情况，约4h，当转化反应完成后加入盐酸终止反应。离心后，取上清液，经离子交换树脂分离、纳滤后加入乙醇，搅拌后，降温析晶。滤出析出的固体，鼓风干燥后得到NMN，收率，86％，纯度大于98％。
实施例41 NMN的制备
在反应瓶中，加入1mL三乙醇胺缓冲液(pH＝8.0，1mol/L)，9mL焦磷酸钠(0.05mol/L)，4mLMgCl2溶液(0.5mol/L)，30mL式(V)化合物(0.005mol/L)，10mL(140mg)实施例32得到的纯化的酶溶液(SEQ ID NO:1)，再加入ddH2O将反应体系补至100mL，混合均匀后，37℃、300rpm搅拌反应，用高效液相色谱检测式(V)化合物的转化情况，约3h，当转化反应完成后加入盐酸终止反应。离心后，取上清液，经离子交换树脂分离、纳滤后加入乙醇，搅拌后，降温析晶。滤出析出的固体，鼓风干燥后得到NMN，收率，92％，纯度大于99％。
实施例42 NMN的制备
在反应瓶中，加入1mL三乙醇胺缓冲液(pH＝8.0，1mol/L)，6mL焦磷酸钾(0.05mol/L)，4mLMgCl2溶液(0.5mol/L)，30mL式(V)化合物(0.005mol/L)，10mL(140mg)实施例32得到的纯化的酶溶液(SEQ ID NO:1)，再加入ddH2O将反应体系补至100mL，混合均匀后，37℃、300rpm搅拌反应，用高效液相色谱检测式(V)化合物的转化情况，约3h，当转化反应完成后加入盐酸终止反应。离心后，取上清液，经离子交换树脂分离、纳滤后加入乙醇，搅拌后，降温析晶。滤出析出的固体，鼓风干燥后得到NMN，收率，83％，纯度大于98％。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
序列表
<110> 江苏信佑生物有限公司
江苏海洋大学
<120> 一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法
<141> 2022-04-22
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atgcatcatc atcatcacca tagcagcggc aacaactatg gcattccgca gaacgcgatt 60
attaccattg cgggcaccgt gggcgtgggc aaaagcaccc tgacccaggc gctggcggat 120
aaactgaact ttaaaaccag ctttgaaaac gtggaacata acccgtatct ggataaattt 180
tatagcgatt ttgaacgctg gagctttcat ctgcagattt attttctggc ggaacgcttt 240
aaagaacaga aacgcatgtt tgaatatggc ggcggctttg tgcaggatcg cagcatttat 300
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tttaaaacct atagcgatct gtttaacgcg atggtgatga ccccgtattt tccgaaaccg 420
gatgtgatga tttatctgga atgcaactat gatgaagtga ttgatcgcat tattgaacgc 480
ggccgcgaaa tggaaattaa caccgatccg gaatattgga aaaaactgtt taaacgctat 540
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<210> 2
<211> 780
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
atgcatcatc atcatcacca tagcagcggc accaccccga ttctgaacag cagcgtgccg 60
ggcaacaaca actatggcat tccgcagaac gcgattatta ccattgcggg caccgtgggc 120
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aactatgatg aagtgattga tcgcattatt gaacgcggcc gcgaaatgga aattaacacc 540
gatccggaat attggaaaaa actgtttaaa cgctatgatg attggattaa cagctttaac 600
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ctgaacccga tgattgataa aattgcgcgc attattcaga cctatcgcca ggtggatacc 720
cgcacctttg gcaacggccc gaccaccaac aaaattatta gcaccccgaa agatctgtaa 780
Claims (10)
1.一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)，将式(II)化合物β-D-核糖与酰氯R-COCl在Lewis酸和相转移催化剂作用下一步发生氯代和三酰化反应得到式(III)化合物1-氯-2,3,5-三酰基-β-D-核糖；
所述的步骤(1)酰氯R-COCl为苯甲酰氯、丁酰氯、特戊酰氯或2-甲基苯甲酰氯，所述酰氯R-COCl与式(II)化合物物质的量的比为5～8:1；
所述步骤(1)中的Lewis酸为金属氯化物，选自氯化锌、氯化钴、氯化钠、氯化钾或氯化锂，其用量为式(II)化合物物质的量的5～12％；相转移催化剂为选自TMAB、TBAC、TEBAC或TPAB，其用量为式(II)化合物物质的量的2～5％；
步骤(2)，式(III)化合物与β-烟酰胺发生氨解反应，制得式(IV)化合物氯化β-烟酰胺-2,3,5-三酰基-β-D-核糖；
步骤(3)，式(IV)化合物加碱，在室温下超声反应，脱去3个酰基，制得式(V)化合物氯化β-烟酰胺核糖；
步骤(4)，式(V)化合物在磷酸转移酶的催化下与磷酸化试剂发生磷酸化反应，即制得式(I)化合物NMN；
所述的步骤(4)的磷酸转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；磷酸化试剂为无机焦磷酸盐，选自焦磷酸钠或焦磷酸钾，其用量为式(V)化合物物质的量的1-3倍。
2.根据权利要求1所述的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤(2)的反应如下：式(III)化合物、β-烟酰胺和反应溶剂，搅拌均匀后，加热至回流，反应完成后，静置冷却至室温，减压蒸去溶剂得到式(IV)化合物。
3.根据权利要求1所述的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤(2)中的反应溶剂为乙醇、乙腈、二氯乙烷、异丙醇、四氢呋喃中的一种或多种；步骤(2)中的反应温度为在选定的溶剂中回流。
4.根据权利要求1所述的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤(2)中的式(III)化合物与β-烟酰胺的物质的量的比为1:1.1～1.5。
5.根据权利要求1所述的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤(3)反应如下：将式(IV)化合物溶解在乙醇中，搅拌下加入碱，在室温下超声反应，反应完全，加入甲基叔丁基醚，搅拌析出式(V)化合物。
6.根据权利要求1所述的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤(3)中的碱为碱金属或碱土金属的碳酸盐或碳酸氢盐。
7.根据权利要求1所述的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤(4)反应如下：加入三乙醇胺缓冲液，磷酸化试剂，MgCl2溶液，式(V)化合物，磷酸转移酶，再加入ddH2O，混合均匀后，一定温度下搅拌反应，后处理后得NMN。
8.根据权利要求1所述的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤(4)的磷酸转移酶是利用基因工程技术获得重组大肠杆菌表达菌株，然后将重组大肠杆菌进行PCR扩增，制备得到表达烟酰胺核糖激酶的重组细胞，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min。
9.根据权利要求1所述的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述的步骤(4)的反应温度为4℃～50℃；所述的步骤(4)的反应在pH 5.0～9.0的水相体系中进行。
10.根据权利要求1-9任一所述的制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤(1)中的酰氯为苯甲酰氯，其用量为式(II)化合物物质的量的8倍；Lewis酸为氯化锌，其用量为式(II)化合物物质的量的12％；相转移催化剂为TEBAC，其用量为式(II)化合物物质的量的5％，步骤(2)中的反应溶剂为乙醇，式(III)化合物与β-烟酰胺的物质的量的比为1:1.5，步骤(3)中的脱酰基反应用超声辅助，碱为碳酸钾；步骤(4)的磷酸转移酶的核苷酸序列如序列表1(SEQ ID NO:1)，磷酸化试剂为焦磷酸钠盐，其用量为式(V)化合物物质的量的3倍。
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