CN116143854A - 一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用，该mRNA帽类似物结构中的五元糖环上与碳原子连接的氢原子选择性的独立的被OH、烷基、O‑烷基、CH2‑O‑烷基、CH2‑N‑烷基、CH2‑S‑烷基、卤素取代修饰，被修饰后的五元糖环分子构象优势，elF4E蛋白活性口袋结合能力更强，同时该结构不容易被脱帽酶识别，使得帽子结构更加稳定，最终表现出更好的mRNA翻译效果。
Description
技术领域
本发明涉及化学及生物工程技术领域，具体涉及一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用。
背景技术
真核mRNA在其5'-末端带有“帽”结构，众所周知，此“帽”结构在翻译中起重要作用。天然存在的帽结构由7-甲基鸟苷组成，该鸟苷通过三磷酸桥连接到第一个转录核苷酸的5'-末端，从而导致7G(5')ppp(5')N，其中N是任何核苷酸。mRNA帽在基因表达中起重要作用。帽结构可以保护mRNA免受外切核酸酶的降解，使RNA可以从细胞核转运到细胞质，并参与翻译起始复合物的组装。m7G(5’)ppp(5’)G(mCAP)已用作体外T7或SP6 RNA聚合酶转录的引物，以获得在其5'末端具有帽结构的RNA。
通过体外转录合成mRNA已经成为引入外源基因并进行表达蛋白的重要工具，并广泛应用于疾病的治疗和预防中，体外转录合成mRNA使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产，例如，在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中，合成进行显著更长的时间，并因此产生更多的蛋白质。
帽子结构与真核起始因子(elF4EELG4E)结合能力的高低决定了该mRNA在细胞内的翻译表达效果。现有的帽类似物结构一般是天然的帽子结构，其mRNA的翻译效果不稳定，对于不同的序列或者不同的表达宿主结果差异较大。
发明内容
本申请提供了一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用，该mRNA帽类似物结构中的五元糖环上与碳原子连接的氢原子独立的被OH、烷基、O-烷基、CH2-O-烷基、CH2-N-烷基、CH2-S-烷基、卤素取代修饰，被修饰后的五元糖环与elF4E蛋白活性口袋结合能力更强，因此可以促进该mRNA的翻译效果。同时该结构由于是非天然结构，无法被生物体内的核酶水解，也不容易被脱帽酶识别，使得帽子结构更加稳定，最终表现出更好的mRNA翻译效果。
一种核糖环修饰的mRNA帽类似物，其包含以下结构：
其中，X1、X2和X3分别独立的为O、CH2或NH；
Y1、Y2和Y3分别独立的为O、S、Se或BH3；
R1、R2、R3、R4、R5、R8、R9、R12、R13、R14独立的为H、OH、烷基、O-烷基、CH2-O-烷基、CH2-N-烷基、CH2-S-烷基、卤素；
且R2、R13不同时为OH、O-烷基，R3、R14不同时为OH、O-烷基；
R6、R7、R10、R11独立的为H、烷基、CH2-O-烷基、CH2-N-烷基、CH2-S-烷基、卤素；
B1、B2独立的为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
上述X1、X2和X3分别独立的为O、CH2或NH；Y1、Y2和Y3分别独立的为O或S。
上述R1、R2、R3、R4、R5、R8、R9、R12、R13、R14独立的为H、OH、甲基、乙基、丙基或丁基；R6、R7、R10、R11独立的为H、甲基、乙基、丙基或丁基。
上述B1、B2独立的为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶。
上述X1、X2、X3、Y1、Y2、Y3均为O；R1、R5、R7、R9、R11均为H；R2、R13中一个为OH、一个为H或CH3；R3、R14中一个为OH、一个为H；R4、R6、R8、R10、R12为H或CH3；B1为腺嘌呤、B2为鸟嘌呤；具体结构如下所示：
上述X1、X2、X3、Y1、Y2、Y3均为O；R1、R5、R7、R9、R10、R11、R12均为H；R2、R13中一个为OH、一个为H或CH3；R3、R14中一个为OH、一个为H；R4、R6、R8为H或CH3；B1为腺嘌呤、B2为鸟嘌呤。
一种核糖环修饰的mRNA帽类似物的制备方法，包括以下步骤：(1)m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐的合成；(2)磷酸酯键连接的二核苷酸的制备；(3)核糖环修饰的mRNA帽类似物的制备。
具体包括以下步骤：(1)m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐的合成：从五碳糖进行修饰上甲基，和碱基对接，脱保护，再依次进行二磷酸化、N7的甲基化、二磷酸的咪唑化反应等合成m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐；(2)磷酸酯键连接的二核苷酸的制备：通过2’OMe-A或其修饰亚磷酰胺单体与保护的鸟苷，在四氮唑的作用下偶联形成第一个磷酸酯键，通过酸作用，脱除保护基，然后引入第二个磷酸，最终水解得到磷酸酯键连接的二核苷酸；(3)核糖环修饰的mRNA帽类似物的制备：m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐和磷酸酯键连接的二核苷酸反应制备核糖环修饰的mRNA帽类似物。
具体步骤如下：
(1)m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐的合成：
1)称取鸟苷或其类似物，溶解在磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)，冰浴下搅拌4小时后，加水淬灭反应，反相色谱纯化得中间体a。2)将中间体a，三苯基膦(1.0eq.)，2,2’二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体b。3)取中间体b溶解DMF中，加入磷酸三丁胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后室温搅拌5小时。反应结束后离子色谱纯化得到中间体c。3)将中间体c溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯，过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后离子色谱纯化得到中间体d。5)；将中间体d，三苯基膦(1.0eq.)，2,2’二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得到m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐。
(2)磷酸酯键连接的二核苷酸的制备：
称取2’OMe-rA或其修饰亚磷酰胺单体于单口瓶中，用二氯甲烷溶解，再加入的2’,3’乙酰基鸟苷或其类似物，降温至25±2℃，氮气鼓吹下加入四氮唑，升温至25±2℃反应。监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中，监测反应结束后旋干，浓缩后的油膏溶解在二氯甲烷中，加入1.1eq.的三氟乙酸，监测反应结束后，旋干，石油醚/二氯甲烷按一定比例打浆，过滤得中间体e；将e溶解在乙腈中，加入1.2eq.的膦试剂、1.2eq.的四氮唑充分搅拌反应，监测反应结束后，再加入1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中，监测反应结束后旋干，在旋瓶中加入3L甲醇和3L浓氨水，室温反应4小时，监测反应，反应结束后旋干，加入20L超纯水，进入反向离子渗透设备，洗涤浓缩，冻干得磷酸酯键连接的二核苷酸。
(3)核糖环修饰的mRNA帽类似物的制备：
将步骤(1)得到的m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐溶解在含有MnCl2的DMF溶液中，并添加到步骤(2)得到的磷酸酯键连接的二核苷酸的DMF溶液中，在室温下搅拌反应，24小时后，用0.25M EDTA溶液终止反应；将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。收集HPLC纯度＞97％的洗脱产物，浓缩完以上分离液，再装载到强阴离子树脂，使用0-1.0M的醋酸钠洗脱液线性梯度洗脱，收集HPLC纯度＞98.5％的洗脱产物，合并高纯度洗脱液，通过纳滤设备去除残留的醋酸钠溶液并浓缩得目标产物核糖环修饰的mRNA帽类似物。
一种核糖环修饰的mRNA帽类似物的应用，该核糖环修饰的mRNA帽类似物用于T7RNA聚合酶体系下的的mRNA加帽。T7RNA聚合酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶，其对噬菌体T7启动子序列有高特异性。该酶从T7启动子插入到转录载体下游的DNA上合成大量RNA。T7RNA聚合酶催化的IVT(体外转录)反应体系是目前最成熟的mRNA制备体系。
通常20ul的IVT反应体系中含有50U的T7RNA聚合酶，同时搭配1ul的帽类似物(100mM)可以获得最佳的转录产量以及加帽效率。
本发明提供了一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用，该核糖环修饰的mRNA帽类似物适用于以DNA序列为模板利用体外共转录方法生产的mRNA，该DNA序列可以来源或改造自病毒、动物、植物等物种，同时其生产的mRNA具有更低的免疫原性、更高的蛋白翻译效率、更好的稳定性。
本发明相比现有技术具有以下优点：
与现有帽结构类似物Cleancap相比，本发明设计的新型帽子结构，含有五元糖环的取代基团，可以有效地固定5’末端帽子的空间结构，并且提高mRNA的5’末端帽子结构与真核起始因子(elF4E)结合能力，进而可以提高mRNA的翻译效果；本发明的核糖环修饰的mRNA帽类似物，由于被修饰后的五元糖环分子构象优势，elF4E蛋白活性口袋结合能力更强，同时该结构不容易被脱帽酶识别，使得帽子结构更加稳定，最终表现出较好的体外转录产量以及加帽效率数据、更好的mRNA翻译效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
术语解释：本发明中“eq.”为当量。
各实施例中所使用的原料名称及来源参见下表1：
表1
以下各实施例中所使用的中间体A反应路线流程均通过方程式(1)所示步骤制备得到：
1)取20g 2,3-O-异亚丙基-β-D-甲基呋喃核糖苷溶解在300mL的乙腈中，室温下将2-碘酰基苯甲酸(1.8eq.)一次性加入到反应液中。得到的混悬液加热回流5小时后室温过夜。混悬液抽滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩得到中间体A1。
2)取20g中间体A1和甲醛水溶液(37％，76mL)溶解在380mL的1,4-二氧六环中，0℃下将NaOH水溶液(2.0M，188mL)加入到反应液中，随后室温搅拌过夜后用10％的醋酸中和，浓缩后柱层析得到中间体A2。
3)取20g中间体A2和4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(1.2eq.)溶解在吡啶中(400mL)，室温搅拌过夜。反应完全后在0℃下用甲醇(40mL)淬灭反应。浓缩后柱层析得到中间体A3。
4)取20g中间体A3溶解在200.0mL的无水吡啶中，冰浴下将苯甲酰氯(1.2eq.)滴加到反应液中，室温搅拌3小时，反应完全。浓缩得到中间体A4的粗品。
5)将中间体A4的粗品溶解在80％的醋酸水溶液中，室温搅拌过夜，反应完全。浓缩后柱层析得到中间体A5。
6)将15g中间体A5，DMAP(3.0eq.)和硫代氯甲酸苯酯(1.2eq.)溶解在150.0mL的乙腈中，室温搅拌3小时，反应完全。浓缩后溶解在二氯甲烷中，用0.5M稀盐酸洗涤2次后有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩得到中间体A6粗品。
7)将中间体A6粗品溶解在150.0mL的甲苯中，将三(三甲基硅基)硅烷(1.5eq.)和1,1'-偶氮(氰基环己烷)(0.25eq.)加入到反应液中后升温至100℃，搅拌15小时后反应完全。反应液浓缩后柱层析得到中间体A7。
8)取5g中间体A7溶解在冷的三氟乙酸/水(9：1，50.0mL)中，随后0℃下搅拌1小时，反应完全。低温下浓缩除去溶剂，随后溶解在50.0mL的冰醋酸和乙酸酐(3.0eq.)中，冰浴下缓慢滴加浓硫酸(0.1eq.)。室温搅拌过夜，反应完全。将反应液倒入冰水中，用二氯甲烷萃取。有机相干燥后浓缩，柱层析得到中间体A。
以下各实施例中所使用的中间体B反应路线流程均通过方程式(2)所示步骤制备得到：
1)取40g戴斯-马丁氧化剂悬浮在200.0mL的二氯甲烷中，降温至冰浴，20g 1,3,5-三苯甲酰基-D-呋喃核糖加入到反应液中。室温搅拌过夜，反应完全。反应液浓缩后悬浮在甲基叔丁基醚中打浆，抽滤。滤液分别用15％硫代硫酸钠，冷的饱和碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后无水硫酸钠干燥，浓缩得到中间体B1。
2)取17.5g中间体B1溶解在175.0mL的四氢呋喃中，-78℃下将甲基溴化镁(3M inEt2O,3.0eq.)滴加到反应液中。随后-78℃下搅拌2小时，反应完全。将反应液倒入饱和氯化铵溶液中进行淬灭，随后用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥，浓缩得到中间体B2的粗品。
3)取18g中间体B2的粗品，DMAP(2.0eq.)，三乙胺(3.0eq.)溶解在180.0mL二氯甲烷中，降温至0℃后将异丁酰氯(3.0eq.)滴加到反应液中，室温搅拌过夜。反应液用饱和碳酸氢钠洗涤，水相用二氯甲烷萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥后浓缩，柱层析纯化得到中间体B。
实施例1：以中间体C和D为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体C(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中，随后将中间体D(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后，用10L的0.25MEDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物，反应路线流程，如方程式(3)所示：
其中，化合物C通过以下步骤得到：1)将BSA(2.0eq.)室温下滴加到N2-异丁酰鸟嘌呤(1.2eq.)的甲苯悬浮液中，升温至回流搅拌1小时后得到澄清溶液。降至室温，将中间体A(50g)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.5eq.)加入后升温至回流继续反应1小时。反应结束后，将反应液降至室温后用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取后浓缩。粗品用柱层析纯化得到中间体C1。2)取30g中间体C1溶解在300.0mL的氨水/甲醇(1：1)中，室温搅拌过夜。反应结束后浓缩，反相色谱纯化得到中间体C2。3)将中间体C2溶解在150ml的磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，缓慢滴加1.2eq.三氯氧磷，冰浴下搅拌4小时后，加水淬灭反应，反相色谱纯化得中间体C3。4)将中间体C3，三苯基膦(1.0eq.)，2,2’二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体C4。5)取10g中间体C4溶解DMF中，加入磷酸三丁胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后室温搅拌5小时。反应结束后离子色谱纯化得到中间体C5。6)将中间体C5溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯，过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后离子色谱纯化得到中间体C6。7)；将中间体C6，三苯基膦(1.0eq.)，2,2’二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体C。反应路线流程，如方程式(4)所示：
化合物D通过以下步骤得到：1)称取1kg的2’OMe-rA亚磷酰胺单体溶解在二氯甲烷(6.0L)中，室温下将2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中，冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入，室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后，反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩，经柱层析得到中间体D1。2)将D1溶解在4L二氯甲烷中，室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时，TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在3L甲醇和3L浓氨水，室温反应14小时，监测反应，反应结束后浓缩，粗品装载到DEAESephadex柱上，使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物。反应路线流程，如方程式(5)所示：
实施例2：
以中间体D和E为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体E(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中，随后将中间体D(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后，用10L的0.25M EDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物，反应路线流程，如方程式(6)所示：
其中，化合物E通过以下步骤得到：1)将BSA(2.0eq.)室温下滴加到N2-异丁酰鸟嘌呤(1.2eq.)的甲苯悬浮液中，升温至回流搅拌1小时后得到澄清溶液。降至室温，将中间体B(50g)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.5eq.)加入后升温至回流继续反应1小时。反应结束后，将反应液降至室温后用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取后浓缩。粗品用柱层析纯化得到中间体E1。2)取30g中间体E1溶解在300.0mL的氨水/甲醇(1：1)中，室温搅拌过夜。反应结束后浓缩，反相色谱纯化得到中间体E2。3)将中间体E2溶解在150ml的磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，缓慢滴加1.2eq.三氯氧磷，冰浴下搅拌4小时后，加水淬灭反应，反相色谱纯化得中间体E3。4)将中间体E3，三苯基膦(1.0eq.)，2,2’二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体E4。5)取10g中间体E4溶解DMF中，加入磷酸三丁胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后室温搅拌5小时。反应结束后离子色谱纯化得到中间体E5。6)将中间体E5溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯，过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后离子色谱纯化得到中间体E6。7)；将中间体E6，三苯基膦(1.0eq.)，2,2’二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体E。反应路线流程，如方程式(7)所示：
实施例3：
以中间体F和G为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体F(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中，随后将中间体G(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后，用10L的0.25M EDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物，反应路线流程，如方程式(8)所示：
其中，中间体F通过以下步骤得到：1)称取5g鸟苷，溶解在70.0ml的磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)，冰浴下搅拌4小时后，加水淬灭反应，反相色谱纯化得中间体F1。2)将中间体F1，三苯基膦(1.0eq.)，2,2’二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体F2。3)取10g中间体F2溶解DMF中，加入磷酸三丁胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后室温搅拌5小时。反应结束后离子色谱纯化得到中间体F3。3)将中间体F3溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯，过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5，HPLC监测反应，反应结束后离子色谱纯化得到中间体F4。5)；将中间体F4，三苯基膦(1.0eq.)，2,2’二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时，反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体F。反应路线流程，如方程式(10)所示：
化合物G通过以下步骤得到：1)将BSA(2.0eq.)室温下滴加到腺嘌呤(1.2eq.)的甲苯悬浮液中，升温至回流搅拌1小时后得到澄清溶液。降至室温，将中间体A(50g)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.5eq.)加入后升温至回流继续反应1小时。反应结束后，将反应液降至室温后用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取后浓缩。粗品用柱层析纯化得到中间体G1。2)取30g中间体G1溶解在300.0mL的氨水/甲醇(1：1)中，室温搅拌过夜。反应结束后浓缩，反相色谱纯化得到中间体G2。3)将中间体G2溶解在150ml的DMF中，冰浴下将氢化钠(60％，2.0eq.)缓慢加入后室温搅拌0.5小时，随后将碘甲烷(1.8eq.)加入。室温搅拌2小时结束反应。冰浴下用饱和氯化铵水溶液淬灭反应后将溶液浓缩后柱层析纯化得到中间体G3。4)将中间体G3溶解在100.0mL的吡啶中，冰浴下将三甲基氯硅烷(5.0eq.)加入后继续搅拌5小时。0℃下将苯甲酰氯(1.5eq.)滴加到反应液中，升温至室温搅拌2小时。降温至0℃，将氨水(30％，6.5eq.)滴加到反应液中，10℃以下搅拌2小时。浓缩后先后用二氯甲烷和水打浆得到中间体G4。5)将中间体G4溶解在吡啶中，冰浴下将4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(1.2eq.)加入到反应液中。升温至室温搅拌4小时。反应结束后用甲醇(5.0eq.)淬灭反应。将反应液浓缩后柱层析得到中间体G5。6)将中间体G5和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(1.5eq.)溶解在二氯甲烷中，冰浴下将四氮唑(1.2eq.)加入，升至室温后搅拌2小时。反应结束后，用饱和碳酸氢钠将反应液洗涤后，有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得到中间体G6。7)将中间体G6溶解在二氯甲烷中，室温下将2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中，冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入，室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后，反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩，经柱层析得到中间体G7。8)将G7溶解在4L二氯甲烷中，室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时，TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在10倍体积的甲醇/浓氨水(1：1)中，室温反应14小时，监测反应，反应结束后浓缩，粗品装载到DEAESephadex柱上，使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得中间体G。反应路线流程，如方程式(11)所示：
实施例4：
以中间体F和H为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体F(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中，随后将中间体H(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后，用10L的0.25M EDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物，反应路线流程，如方程式(12)所示：
其中，化合物H通过以下步骤得到：1)将BSA(2.0eq.)室温下滴加到腺嘌呤(1.2eq.)的甲苯悬浮液中，升温至回流搅拌1小时后得到澄清溶液。降至室温，将中间体B(50g)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.5eq.)加入后升温至回流继续反应1小时。反应结束后，将反应液降至室温后用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取后浓缩。粗品用柱层析纯化得到中间体H1。2)取30g中间体H1溶解在300.0mL的氨水/甲醇(1：1)中，室温搅拌过夜。反应结束后浓缩，反相色谱纯化得到中间体H2。3)将中间体H2溶解在150ml的DMF中，冰浴下将氢化钠(60％，2.0eq.)缓慢加入后室温搅拌0.5小时，随后将碘甲烷(1.8eq.)加入。室温搅拌2小时结束反应。冰浴下用饱和氯化铵水溶液淬灭反应后将溶液浓缩后柱层析纯化得到中间体H3。4)将中间体H3溶解在100.0mL的吡啶中，冰浴下将三甲基氯硅烷(5.0eq.)加入后继续搅拌5小时。0℃下将苯甲酰氯(1.5eq.)滴加到反应液中，升温至室温搅拌2小时。降温至0℃，将氨水(30％，6.5eq.)滴加到反应液中，10℃以下搅拌2小时。浓缩后先后用二氯甲烷和水打浆得到中间体H4。5)将中间体H4溶解在吡啶中，冰浴下将4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(1.2eq.)加入到反应液中。升温至室温搅拌4小时。反应结束后用甲醇(5.0eq.)淬灭反应。将反应液浓缩后柱层析得到中间体H5。6)将中间体H5和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(1.5eq.)溶解在二氯甲烷中，冰浴下将四氮唑(1.2eq.)加入，升至室温后搅拌2小时。反应结束后，用饱和碳酸氢钠将反应液洗涤后，有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得到中间体H6。7)将中间体H6溶解在二氯甲烷中，室温下将2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中，冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入，室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后，反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩，经柱层析得到中间体H7。8)将H7溶解在4L二氯甲烷中，室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时，TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在10倍体积的甲醇/浓氨水(1：1)中，室温反应14小时，监测反应，反应结束后浓缩，粗品装载到DEAESephadex柱上，使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得中间体H。反应路线流程，如方程式(13)所示：
实施例5：
以中间体F和I为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体F(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中，随后将中间体I(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后，用10L的0.25M EDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物，反应路线流程，如方程式(14)所示：
其中，化合物I通过以下步骤得到：1)取20g中间体C2溶解在200.0mL的吡啶中，随后将乙酸酐(4.0eq.)和DMAP(1.0eq.)加入到反应液中。升温至70℃搅拌3小时，反应结束后浓缩除去吡啶。粗品经柱层析得到中间体I1。2)取20g中间体I1溶解在200.0mL的碘(3.0eq.)/甲醇溶液中，升温至67℃搅拌30小时。反应结束后浓缩。将浓缩后的反应液溶解在二氯甲烷中，分别用5％的硫代硫酸钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤、浓缩、柱层析得到中间体12。3)将中间体I2溶解在二氯甲烷中，室温下将2’OMe-rA亚磷酰胺单体(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中，冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入，室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后，反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩，经柱层析得到中间体I3。4)将I3溶解在4L二氯甲烷中，室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时，TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在10倍体积的甲醇/浓氨水(1：1)中，室温反应14小时，监测反应，反应结束后浓缩，粗品装载到DEAESephadex柱上，使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得中间体I。反应路线流程，如方程式(15)所示：
实施例6：
以中间体F和J为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体F(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中，随后将中间体J(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后，用10L的0.25M EDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物，反应路线流程，如方程式(16)所示：
其中，化合物J通过以下步骤得到：1)取20g中间体E2溶解在200.0mL的吡啶中，随后将乙酸酐(4.0eq.)和DMAP(1.0eq.)加入到反应液中。升温至70℃搅拌3小时，反应结束后浓缩除去吡啶。粗品经柱层析得到中间体J1。2)取20g中间体J1溶解在200.0mL的碘(3.0eq.)/甲醇溶液中，升温至67℃搅拌30小时。反应结束后浓缩。将浓缩后的反应液溶解在二氯甲烷中，分别用5％的硫代硫酸钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤、浓缩、柱层析得到中间体12。3)将中间体J2溶解在二氯甲烷中，室温下将2’OMe-rA亚磷酰胺单体(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中，冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入，室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后，反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩，经柱层析得到中间体J3。4)将J3溶解在4L二氯甲烷中，室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时，TLC监测反应结束后，将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5％的硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在10倍体积的甲醇/浓氨水(1：1)中，室温反应14小时，监测反应，反应结束后浓缩，粗品装载到DEAESephadex柱上，使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得中间体J。反应路线流程，如方程式(17)所示：
对比例1：m7GpppA2’OmepG
m7GpppA2’OmepG的合成方法参考上述实施例的合成方法(所使用的原料参考各实施例中的制备方法)，反应路线流程，如方程式(18)所示：
各实施例所得到的帽类似物以及对比例所得到的帽类似物结构如下表2所示，
表2
测试例1：mRNA体外转录产量及加帽效率的测定
利用核糖环修饰的mRNA帽类似物进行mRNA的体外合成：先用NotI线性化质粒，4℃酶切过夜；DNA模板抽提；体外转录合成mRNA，分别使用实施例1-6及对比例1的mRNA帽类似物作为帽结构。
反应体系如表3：
表3
| 体系 | 用量 |
| T7 RNA聚合酶 | 50U |
| 10X buffer | 2μl |
| 100mM ATP | 1μl |
| 100mM GTP | 1μl |
| 100mM CTP | 1μl |
| 100mM N1-Me-pUTP | 1μl |
| 100mM帽类似物 | 1μl |
| 无机焦磷酸酶 | 0.05U |
| 核酸酶抑制剂 | 20U |
| 无菌无酶水 | 补足至20μl |
| 模板 | 1μg |
备注：在实验过程中，首先计算好体系所需物料体积，然后进行加样。首先在体系中加入无菌无酶水，随后依次加入10X buffer、NTPs、帽类似物，混匀后轻轻离心，随后加入核酸酶抑制剂、无机焦磷酸酶、T7 RNA聚合酶、线性化DNA模板，充分混匀后轻轻离心，于37℃下孵育。2小时后加入DNase I 1U，37℃继续孵育30分钟以去除DNA模板，然后进行RNA纯化，通常使用磁珠纯化方法。纯化的mRNA用无菌无酶水进行溶解，随后利用Nanodrop One进行定量检测。
液相色谱质谱法(LC-MS)被用来检测不同起始帽类似物的mRNA的IVT加帽率；首先需要设计一段与转录产物mRNA起始碱基匹配的具有标记的DNA探针，通常的标记为biotin标记，将链霉亲和素标记的磁珠清洗后与合成的DNA探针、mRNA及10×RNase H reactionbuffer室温室温孵育30分钟，边孵育边缓慢混匀，随后加入20ul RNase H(5U/ul)孵育37度3h，每半个小时混匀一次。孵育结束后对磁珠进行清洗，清洗完成后的磁珠加入100μL加热到80℃的75％甲醇，混合物在加热板上加热到80℃，保持3分钟，然后放置磁力架上吸取上清，使用蒸发离心机在室温下干燥45分钟至10μl。然后将样品重新悬浮在50μl的100μMEDTA/1％ MeOH中，即可用于LC-MS分析，确定转录反应中RNA的加帽情况。由于加帽与非加帽的碱基在分子量上有明显区别，利用分子质量差别即可判定不同帽类似物起始的mRNA转录的加帽率。具体结果见表4。
表4
| 编号 | 产量(μg) | 加帽率(％) |
| 实施例1 | 118 | 95.4％ |
| 实施例2 | 121 | 96.1％ |
| 实施例3 | 106 | 92.1％ |
| 实施例4 | 110 | 90.4％ |
| 实施例5 | 103 | 91.2％ |
| 实施例6 | 98 | 89.3％ |
| 对比例1 | 120 | 95.3％ |
由表4实验结果可知，实施例1-6均能够通过IVT转录出相应的目标mRNA。其中实施例1-4与对比例1的产量相当，同时实施例1和2的加帽效率优于对比例1。实施例5和实施例6的体外转录产量以及加帽效率明显低于对比例1。这可能是和帽类似物结构相关，实施例5和实施例6在第三个核苷酸的五元糖环上进行修饰的刚性结构影响了帽类似物与模板起始转录位点的结合，最终也影响了体外转录产量以及加帽效率。同时发明人发现对两个五元糖环或三个五元糖环同时修饰，体外转录产量以及加帽效率明显低于实施例5和实施例6。
测试例2：mRNA翻译效率
测试方法：采用eGFP编码序列为DNA模板，利用实施例1-6及对比例1的帽类似物为起始进行体外转录。随后将获得的不同的mRNA产物进行293T细胞的转染。293T细胞以(0.5-1)×105个细胞进行铺板(24孔板)。转染时细胞密度一般60-80％为佳，每孔转染2μg mRNA，转染试剂选用Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent(Invitrogen)并参考其使用方法进行操作。转染后的细胞放置在37℃，CO2孵育箱中，转染4-6小时后，更换为新鲜的完全培养基。在37℃的CO2培养箱箱中孵育24小时以后，荧光显微镜观察其中GFP的荧光强度，并且更具荧光强度计算实施例1-6相对于对比例1的荧光强度比例。
表5
| 编号 | 细胞荧光相对强度(相对于对比例1) |
| 实施例1 | 2.1 |
| 实施例2 | 2.3 |
| 实施例3 | 1.6 |
| 实施例4 | 1.4 |
| 实施例5 | 0.7 |
| 实施例6 | 0.8 |
| 对比例1 | 1 |
由上表5的实验数据可知，实施例1-4的帽类似物转录的mRNA在细胞内翻译效果显著优于对比例1，说明实施例1-4与elF4E蛋白的结合能力很强。其中实施例2的帽类似物转录的mRNA在细胞内翻译效果相比于对比例1最高，说明实施例2与elF4E蛋白的结合能力最强。同时我们也发现实施例5以及实施例6与的帽类似物转录的mRNA在细胞内翻译效果相比于对比例1最低，说明实施例5、6与elF4E蛋白的结合能力较弱。因此，当帽类似物结构中含有五元糖环不同修饰取代结构，可能对提高帽类似物与elF4E蛋白的结合能力有一定的提高，并且最终促进了目的mRNA在细胞内的翻译效果。但是实施例5、6在第三个核苷酸的五元糖环取代结构的刚性结构影响了帽类似物与elF4E蛋白的结合能力，最终也影响了体外转录产量以及加帽效率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种核糖环修饰的mRNA帽类似物，其特征在于，其包含以下结构：
其中，X1、X2和X3分别独立的为O、CH2或NH；
Y1、Y2和Y3分别独立的为O、S、Se或BH3；
R1、R2、R3、R4、R5、R8、R9、R12、R13、R14独立的为H、OH、烷基、O-烷基、CH2-O-烷基、CH2-N-烷基、CH2-S-烷基、卤素；
且R2、R13不同时为OH、O-烷基，R3、R14不同时为OH、O-烷基；
R6、R7、R10、R11独立的为H、烷基、CH2-O-烷基、CH2-N-烷基、CH2-S-烷基、卤素；
B1、B2独立的为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
2.根据权利要求1所述的一种核糖环修饰的mRNA帽类似物，其特征在于：所述X1、X2和X3分别独立的为O、CH2或NH；Y1、Y2和Y3分别独立的为O或S。
3.根据权利要求1所述的一种核糖环修饰的mRNA帽类似物，其特征在于：所述R1、R2、R3、R4、R5、R8、R9、R12、R13、R14独立的为H、OH、甲基、乙基、丙基或丁基；R6、R7、R10、R11独立的为H、甲基、乙基、丙基或丁基。
4.根据权利要求1所述的一种核糖环修饰的mRNA帽类似物，其特征在于：所述B1、B2独立的为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶。
5.根据权利要求1所述的一种核糖环修饰的mRNA帽类似物，其特征在于：所述X1、X2、X3、Y1、Y2、Y3均为O；R1、R5、R7、R9、R11均为H；R2、R13中一个为OH、一个为H或CH3；R3、R14中一个为OH、一个为H；R4、R6、R8、R10、R12为H或CH3；B1为腺嘌呤、B2为鸟嘌呤。
6.根据权利要求1所述的一种核糖环修饰的mRNA帽类似物，其特征在于：所述X1、X2、X3、Y1、Y2、Y3均为O；R1、R5、R7、R9、R10、R11、R12均为H；R2、R13中一个为OH、一个为H或CH3；R3、R14中一个为OH、一个为H；R4、R6、R8为H或CH3；B1为腺嘌呤、B2为鸟嘌呤。
7.权利要求1-6任一项所述的一种核糖环修饰的mRNA帽类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐的合成；(2)磷酸酯键连接的二核苷酸的制备；(3)核糖环修饰的mRNA帽类似物的制备。
8.根据权利要求7所述的一种核糖环修饰的mRNA帽类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐的合成：从五碳糖进行修饰上甲基，和碱基对接，脱保护，再依次进行二磷酸化、N7的甲基化、二磷酸的咪唑化反应等合成m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐；(2)磷酸酯键连接的二核苷酸的制备：通过2’OMe-A或其修饰亚磷酰胺单体与保护的鸟苷，在四氮唑的作用下偶联形成第一个磷酸酯键，通过酸作用，脱除保护基，然后引入第二个磷酸，最终水解得到磷酸酯键连接的二核苷酸；(3)核糖环修饰的mRNA帽类似物：m7GDP或其修饰类似物的咪唑盐和磷酸酯键连接的二核苷酸反应制备核糖环修饰的mRNA帽类似物。
9.权利要求1-6任一项所述的一种核糖环修饰的mRNA帽类似物的应用，其特征在于：该核糖环修饰的mRNA帽类似物用于T7 RNA聚合酶体系下的mRNA加帽。
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